Термодинамические и кинетические особенности ацилирования аминосоединений в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой

Ушаков, Геннадий Александрович

Термодинамические и кинетические особенности ацилирования аминосоединений в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Ушаков, Геннадий Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.15 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Термодинамические и кинетические особенности ацилирования аминосоединений в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой»

Автореферат диссертации на тему "Термодинамические и кинетические особенности ацилирования аминосоединений в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой"

л/

На правах рукописи

УШАКОВ Геннадий Александрович

Термодинамические н кинетические особенности ацилирования аминосоединенни в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой

02.00.15- кинетика и катализ 03.01.06 -биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва 2012

005055506

Работа выполнена в отделе биокинетики Института физико-химической биологии имени Л.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор химических наук, профессор

Швядас В.К.

кандидат химический наук, ст.н.с.

Гуранда Д.Ф.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Заведующий лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук, доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович

Ведущий научный сотрудник лаборатории генетической инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита диссертации состоится «//» декабря 2012 года в 15.00 на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.11, кафедра химической энзимологии Химического факультета МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «03 » ноября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез амидной связи является важной задачей в практике органической и фармацевтической химии. Однако существующие химические способы синтеза амидной связи не соответствуют требованиям «зеленой» химии и имеют ряд недостатков — как правило, они проводятся с использованием органических растворителей, включают стадии предварительной активации реагентов и не обладают достаточной регио- и стереоселективностью. Сокращение использования экологически опасных растворителей является принципиально важной проблемой, так как растворители вносят наибольший вклад в образование отходов фармацевтической промышленности1, которые, по оценкам экспертов, могут на 1-2 порядка превышать количество синтезируемого целевого продукта2. Использование ферментов как катализаторов синтеза амидной связи в водной среде могло бы решить большую часть из перечисленных проблем. В связи с этим изучение кинетических и термодинамических закономерностей ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде представляет собой актуальную научную и практическую задачу.

Цель и задачи исследования. Задачей настоящего исследования явилось изучение термодинамики и кинетики реакций синтеза амидной связи, катализируемого пенициллинацилазами (ПА) из E.coli и A.faecalis в водной среде, с целью выявления факторов, определяющих эффективность ферментативных реакций.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружена линейная корреляция свободной энергии образования амидной связи в водной среде с кислотностью аминогруппы аминокомпонента. Впервые показано, что только время достижения максимального выхода является кинетически контролируемым параметром, в то время как сама величина максимального выхода определяется величиной константы равновесия реакции ферментативного ацильного переноса в водной среде, которую можно рассчитать из термодинамических данных для соответствующих реакций прямой конденсации. Показано, что эффективный ферментативный синтез амидов в водной среде может быть проведен в результате прямой конденсации карбоновой кислоты и аминосоединения, выявлены факторы, определяющие эффективность процесса, проведена оптимизация препаративного ацилирования аминосоединений.

Апробация работы. Результаты были доложены на международных конференциях: «Ломоносов-2004», «Biocatalysis-2005», «Advanced science in organic chemistry» (2006), «Biotechnology-2007», «Biocatalysis in non-convential media» (2008), «BioTrans-2009».

Публикации. По теме работы опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах, 8 тезисов докладов международных конференций.

' J.S. Carey, D. Laffan, C. Thomson, M.T. Williams, Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 2337-2347

2 R.A. Sheldon, Green Chemistry, 2007, 9, 1273-1284

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 138 ссылок. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, включает 43 рисунка, 14 таблиц.

Результаты работы Термодинамика образования амидной связи

В реакции образования амидной связи участвуют карбоксильная и аминогруппы, что определяет сильную зависимость константы равновесия реакции от рН среды. Для упрощения систематизации рассчитывают константы равновесия для реакции незаряженных форм кислоты и аминосоединения. При этом изменение энергии Гиббса при произвольных условиях можно представить в виде суммы трёх величин: термодинамической (или рН-независимой), относящейся к реакции незаряженных форм реагентов, рН-зависимой, учитывающей ионизацию реагентов, и составляющей, связанной с ионной силой среды. Этот подход позволяет рассчитывать рН-профиль энергии Гиббса реакции образования амидной связи.

В простейшем случае, когда субстраты не имеют других функциональных групп (Рис. 1), реакция нейтральных форм — это взаимодействие протонированной карбоксильной группы карбоновой кислоты с депротонированной аминогруппой аминосоединения. В данном случае энергию Гиббса, и каждую из ее составляющих можно представить следующим образом.

£ _ 1_ /5- ' /нт+

к_ч,_J V

Кт

+ К-Ж, =а=

О"

Рис. 1. Реакция нейтральных форм реагентов и ионизагцюнные равновесия.

Соответствующие составляющие энергии Гиббса рассчитываются на основе соответствующих компонент равновесной константы по формуле:

АС = -КТ1п(К)

рН-профиль энергии Гиббса реакции конденсации фенилуксусной кислоты и фенилглицинола имеет характерный параболический вид (Рис. 2А). Снижение концентрации протонированной формы фенилуксусной кислоты приводит к неблагоприятным для конденсации значениям в щелочной области, а в кислой области условия для синтеза неблагоприятны из-за снижения концентрации непротонированного аминосоединения. Рассчитанный рН-профиль совпадает с экспериментально полученными данными, что свидетельствует об адекватности рассматриваемой модели.

Рис. 2. (А) рН-профичь реакции конденсации фенилуксусной кислоты и Ь-фенилглицинола. Равновесие достигалось при помощи катализатора - ПА из Е.соИ — при проведении реакций

в кислой и нейтральной области рН (рН<7.5) и ПА из А./аесаШ при проведении реакций в щелочной области (рН>7.5), (Б) рН-профнлъ реакции конденсации фенилуксусной кислоты с глицином. Сплошная линия соответствует модели, в которойреакционоспособной является аминокислота в нейтральной либо в анионной форме. Пунктирная линия соответствует модели, в которой реакционоспособными являются как нейтральная, так и анионная

формы.

Эту модель можно расширить для более сложного случая с участием полифункциональных соединений, например, для синтеза 1Ч-ацильных производных аминокислот (рис. 3).

В данном случае формула для ионной составляющей энергии Гиббса существенно усложняется за счёт увеличения числа форм аминосоединения, но форма рН-профиля сохраняет параболический вид (рис. 2Б):

д<7° = -«-7Чп

кР,

-[Я+])

[/Г]

Рис. 3. Ионизационные равновесия для реакции конденсации фенилуксусной кислоты с глицином (Я=СН2) и 3-аминобензойной кислотой (Я=Аг).

Зависимость потенциала Гиббса от природы аминосоединения в реакции образования амидной связи в фенилацетильных производных

Для исследования влияния природы аминокомпонента на величину свободной энергии образования амидной связи исследовали реакции синтеза/гидролиза N-ацильных производных широкого круга аминосоединений (рис. 4). н

ОН penicillin acyiasв n

Ц1 + H2N_R Гоогхг Цй

"XX ЧХ

5 ¿Н,

H2N

Ч it

H2N HJN. ^COOH

^oh

h2n "jcH2)3

о ^-' -it

Рис. 4. Реакция прямой конденсации фенилуксусной кислоты с различными аминосоединениями.

В качестве субстратов были выбраны фенилуксусная кислота и аминосоединения, сильно различающиеся по своей структуре и основности аминогруппы (значения рК аминогрупп варьируются в интервале от 1,0 до 10,5).

Для понимания каким образом и в какой степени природа аминосоединения определяет суммарную величину свободной энергии образования амидной связи, рассмотрим каждую из трех составляющих по отдельности (рис. 5).

30 20

1 10 2 о

V10 -20

-30

-40

0 2 4 6 8 10 12 РК,тШ.

Рис. 5. Зависимость свободной энергии Гиббса синтеза амидов от основности аминосоединений. Значения сводобной энергии приведены в соответствии с номером

соединения на рис. 4.

1. Термодинамическая (или рН-независимая) составляющая свободной энергии AG'j, которая соответствует реакции нейтральных форм компонентов. Полученные результаты демонстрируют линейную корреляцию между значениями изменения свободной энергии реакции образования амидной связи из "нейтральных" форм реагентов и основностью аминогрупп (рис. 5). Следует отметить, что стерический и так называемый альфа-эффект заместителей практически не проявляется — в данную зависимость попадают как метоксиамин, анилины, амины, аминоспирты, аминокислоты, так и данные ранних работ по ядрам бета-лактамных антибиотиков. Величина термодинамического потенциала Гиббса меняется в пределах от ~0 до -35 кДж/моль.

2. Ионная (или рН-зависимая) составляющая AG°„, которая отражает влияние ионизации функциональных групп компонентов на равновесие.

Эта величина принимает минимальное значение при рН равной полусумме значений рК карбоксильной и аминогруппы. В случаях, когда pKSii»pK|INü+, величина AG°'„ равно нулю. Как правило, pKSH<<pKHNU+ и увеличение разности между значениями рК двух функциональных групп приводит к

экспоненциальному росту величины ДС°'„. Таким образом, для реакции конденсации ФУК и высокоосновных аминосоединений ДС°'„ при оптимальном для синтеза значении рН достигает +25-И-35 кДж/моль.

3. Третья составляющая свободной энергии ДС°', характеризующая отклонение экспериментальных условий от идеальных, достигает всего нескольких единиц кДж/моль для низких значений ионной силы (на графике не отражена).

Согласно вышесказанному, увеличение основности аминогруппы приводит, с одной стороны, к линейному уменьшению АО", благоприятствуя синтезу, и, с другой стороны, к экспоненциальному росту ДС?°'„, что, в конечном счете, определяет увеличение суммарного потенциала Гиббса Д£7£. Очевидно, большая разница в величинах рК карбоксильной и аминогруппы делают прямую конденсацию неблагоприятной для высокоосновных аминосоединений.

Обнаруженная закономерность позволяет количественно предсказать термодинамику гидролиза/синтеза фенилацетамидов (Рис.5). Равновесие сдвинуто в сторону образования амидной связи (ДС°.<0) для реакции конденсации фенилуксусной кислоты и аминосоединений со значением рК в интервале 1,5-8,5, а наименьшее значение ДО"'=-6.3 кДж/моль достигается для аминов с рЛТ4,5.

Использование реакции прямой конденсации в биотехнологии.

Эффективное и етереоселективное ацилирование 1-фенилэтиламина в водной среде без активации ацильного донора

Стереоселективное ферментативное ацилирование представляет большой интерес для органического синтеза и фармацевтической химиия, и является важнейшей стадией разделения рацематов аминосоединений. Следует отметить, что первичные амины являются высокоосновными соединениями, и условия их эффективного ацилирования могут быть достигнуты лишь в щелочной водной среде (рН около 10) или в безводной органической среде, где большинство ферментов малоактивны и нестабильны. Однако при проведении ферментативных реакций в органических растворителях приходится использовать активированные ацильные доноры, которые способны спонтанно и нестереоизбирательно ацилировать реакционноспособные аминогруппы, что снижает энантиомерную чистоту продукта. Вышеперечисленные недостатки можно обойти при проведении ферментативного ацилирования аминов в водной среде методом прямой конденсации карбоновой кислоты и амина. В данном случае термодинамически благоприятные условия конденсации достигаются в нейтральной реакционной среде (при рН 6-8), где большинство ферментов являются высокоактивными и стабильными. В этих условиях оба исходных субстрата хорошо растворимы и стабильны, что позволяет создать высококонцентрированные растворы компонентов и обеспечить выгодные термодинамические условия для ферментативного ацилирования амина. Движущей силой реакции, обеспечивающей высокую производительность

процесса, является смещение равновесия в сторону синтеза за счет выпадения в осадок малорастворимого в воде целевого продукта. При проведении прямой конденсации не требуется активация ацильного донора, что упрощает и удешевляет процесс ферментативного ацилирования амина. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность пенициллинацилаз позволяет провести эффективное ацилирование аминов методом прямой конденсации. Синтез продукта ацилирования А^-фенилацетил-(Д)-фенилэтиламина протекает достаточно быстро вплоть до достижения степени превращения 30-35 % от исходных концентраций реагентов (рис. 6А). Затем реакция замедляется, что обусловлено приближением к термодинамическому равновесию. Анализ энантиомерной чистоты целевого продукта на разных степенях конверсии показал высокую стереоселективность ацилирования (рис. 6Б). Энантиомерный избыток целевого продукта составил 98 и 96% при степени конверсии 30 и 40%, соответственно. По завершении реакции целевой продукт, А^-фенилацетил-(Л)-фенилэтиламин, в виде осадка легко выделяется из реакционной смеси. Выход Л'-фенилацетил-(/?)-фенилэтиламина по активному энантиомеру амина составил 80%, энантиомерный избыток - 95%.

100 <

с 80 •

-30 ь * со-

¡г

•20 с-

10 ? 20

■0 е 0 0

гютщь к»нверашрпц««л» (*Л)

Рис. 6. Синтез энантиомерно чистого Ы-феншацетил-(К)-фенилэтиламипа методом стереоселективной прямой конденсации фенилуксусной кислоты и рацемата (±)-а-фенипэтиламина в водной среде, катализируемой пенициллинацилазой из А1саИ§епез/аесаИя: (А) - интегральная кинетика образования продукта синтеза, (Б) - энантиомерный избыток целевого продукта при разных степенях конверсии.

Эффективное и стереоселективное ацилирование эфиров аминокислот в водной среде без активации ацильного донора

Ацилирование путем прямой конденсации, катализируемой пенициллинацилазами в водной среде, может быть использовано для получения фенилацетильных производных сложных эфиров аминокислот. Исследование показало, что чрезвычайно важным для повышения производительности ферментативного ацилирования является повышение концентрации реагентов. Выход продукта ацилирования увеличивается при увеличении количества исходных реагентов в реакционной смеси (рис. 7). Для достижения наибольшей производительности синтеза необходимо перевести реакцию в гетерогенный режим с выпадением целевого продукта в осадок. Зависимость скорости синтеза от соотношения вода/реагенты проходит через максимум, который

соответствует максимально концентрированной, но ещё гетерогенной системе (рис. 8). При переходе к «твердофазной» системе скорость синтеза падает.

0.0 0.2

Исходные количества, М

Рис. 7. Зависимость степени актирования этилового эфира фенилаланипа (РЬеОЕ!) фенилуксусной кислотой (РИас) и ее галогензамещенными производными от концентрации исходных субстратов при их эквимолярном соотношении (слева) и от логарифма концентрации (справа).

50 -

СО

и8 Ч о

О >

40 -

30 -

♦-■- РИгс+ РИеОЕ! Р11ас+ТугО Е1

т-1-1-1-г

100 150 200 250 300 350

НгО/(реагенты)

Рис. 8. Зависимость скоростей ферментативного ацилирования РИеОЕI и ТугОЕ/ фенилуксусной кислотой (РИас) от соотношения вода/реагенты (20°С, рН 6.0, эквимолярные

соотношения реагентов).

Благоприятным с практической точки зрения свойством синтеза в гетерогенных системах является то, что продукт, выпавший в осадок, можно

легко отделить и проводить синтез многократно, добавляя новые порции реагентов, тем самым достигая максимально эффективного использования фермента и субстратов. Важными факторами оптимизации при этом, наряду с концентрацией реагентов, являются температура, структура ацильного донора и условия проведения ферментативного ацилирования, изменение которых влияет как на скорость реакции, так и на растворимость целевого продукта. Пример влияния температуры на растворимость этилового эфира 14-фенилацетилфенилаланина приведен в табл. 1.

Таблица 1. Растворимость этилового эфира И-фентацетшфеиилаланина при различных температурах.

т, "с Растворимость, М

5 0.00058

15 0.00087

20 0.00095

25 0.000128

30 0.000137

Одним из способов повышения выхода при ацилировании аминосоединений в водной среде является увеличение гидрофобности ацилирующего агента, например, применение в качестве ацилирующего агента галогензамещённых производных фенилуксусной кислоты. Растворимость продуктов ацилирования весьма сильно зависит от природы заместителя и варьируется от 1 мМ до 50 мкМ (табл. 2), что существенным образом влияет на эффективность ацилирования. Чем менее растворим продукт ацилирования, тем при более низких концентрациях исходных субстратов удается достичь высоких значений его выхода (см. рис. 7).

Таблица 2. Растворимость продукта агитирования при использовании замещенных фетауксусных кислот (25°С, рН 6).

Продукт ацилирования Растворимость, мМ

№РЬасРЬеОЕ1 1

N-3 -Р-РЬас-РЬеОЕ1 0.2

N-3 -С1-Р1)ас-РЬеОЕ1 0.16

Ы-З-Вг- РЬас-РЬеОЕ! 0.11

№2,6-£НС1- РЬас-РЬеОЕ1 0.05

По реакционной способности ацилирующие агенты располагаются следующим образом (табл. 3): фенилуксусная кислота > 3- фторфенилуксусная кислота > 4-бромфенилуксусная кислота > 3-хлорфенилуксусная кислота > 2, 6-дихлорфенилуксусная кислота.

Дополнительные возможности увеличения эффективности ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде связаны с

использованием систем с высокой высаливающей способностью. Так, при синтезе Ы-фенилацетильных производных этилового эфира фенилаланина можно уменьшить растворимость целевого продукта за счёт применения высаливающих агентов в соответствии с рядом Гофмейстера.

Таблица 3. Скорости ферментативного ацилирования РИеОЕг замещенными фенилуксусными кислотами.

Ацилирующий агент У0. ммоль/час

РЬас 64

З-Е-РЬас 2

4-Вг-РИас 0.8

3-С1-РЬас 0.5

2-Вг-РЬас 0.04

2,6-сНС1-РЬас 0.04

В системах с высокой высаливающей способностью удается провести эффективное ацилирование не только сложных эфиров, но и свободных аминокислот. Примеры влияния сульфата аммония на растворимость и равновесные концентрации компонентов реакции показывают, что при высоких концентрациях соли растворимость продуктов ацилирования меньше их термодинамической равновесной концентрации и реакция переходит в гетерогенный режим, при этом растворимость исходных соединений меняется незначительно. В таких условиях можно достичь достаточно высоких степеней превращения. Следует отметить, что нативный фермент весьма быстро инактивируется в таких системах и синтез в солевых средах требует применения стабилизированных препаратов иммобилизованного фермента.

Обобщая полученные результаты можно сделать вывод о том, что ферментативное ацилирование путем прямой конденсации представляет большой интерес, так как является достаточно технологичным. Это связано с простотой проведения синтеза, легкостью выделения продуктов и высокими степенями конверсии.

Ферментативное ацилирование аминосоединений с использованием активированных ацильных доноров.

Термодинамика реакций ацильного переноса

Реакция ферментативного ацильного переноса на нуклеофил (3) может быть рассмотрена с точки зрения термодинамики как сумма двух реакций -реакции гидролиза ацильного донора (1) и реакции прямой конденсации неактивированного ацильного донора и нуклеофила (2).

ЯСОХ +н20 КСООН + Х (1)

РСООН + Ыи КС0Ми + Н20 (2)

РСОХ + 1Чи т: V КСОЫи + Х (3)

ДО°' (1 + 2) = Ав°'(1) + Авас' (2)

( 1 +1 п{рклт-рн)

Ав"' (1 + 2) = Ав,° (1) + Ав° (2) + Л ■ Г ■ 1п , ,-г

Основываясь на этом можно, исходя из константы равновесия, а также текущих концентраций ацильного донора, продукта X и нуклеофила Ыи, рассчитать равновесную концентрацию продукта в реакционной смеси при проведении реакции ферментативного ацильного переноса в различные моменты времени. Рассмотрим пример реакции ацильного переноса на амид треонина с использованием фенилацетамида в качестве ацильного донора. Результаты расчёта равновесной концентрации продукта и кинетическая кривая накопления продукта представлены на рис. 9.

тш

Рис. 9. Роль термодинамики в протекании ферментативного аг/ильного переноса.

Кривая 1: Термодинамически достижимая концентрация продукта ацильного переноса, рассчитанная исходя из константы равновесия реакции и концентраций исходных субстратов (ацильного донора и нуклеофила) в реакционной смеси в каждый момент времени. Кривая 2: Экспериментальная кинетическая кривая накопления продукта ацильного переноса в реакционной смеси в реакции ацилирования амида треонина, катализируемой пеницшлинацилазой. Экспериментальные условия: начальные концентрации фенилацетамида и треоиинамида 0.025 М, рН8, 25°С, 2мкМПА из

Как следует из графика, экспериментальная кинетическая кривая накопления продукта ацильного переноса возрастает лишь до момента пересечения к расчётной кривой равновесной концентрации этого продукта. Тем самым опровергается широко распространённое представление об ацильном переносе, как о реакции, которая «даёт возможность 'поймать'

промежуточный момент, в котором продукта переноса в системе присутствует больше, чем 'позволено' по термодинамике, т.е. максимум эффективности имеет кинетическую природу». Как видно из графика — концентрация продукта до достижения максимума ни в одной точке не превышает равновесные значения, рассчитанные исходя из константы равновесия реакции ацильного переноса. Характерный вид кинетической кривой накопления продукта с максимумом и последующим снижением концентрации продукта объясняется тем, что фермент катализирует не только реакцию ацильного переноса на нуклеофил, но и реакцию гидролиза ацильного донора, а также образовавшегося продукта ацильного переноса.

Видно, что максимально достижимый выход продукта ферментативного ацильного переноса определяется термодинамикой реакции ацильного переноса. При этом кинетика самой реакции может быть представлена как последовательная смена нескольких режимов протекания. На начальном этапе реакционная система находится в неравновесных условиях (максимальная концентрация субстратов, отсутствие продуктов), благоприятствующих протеканию ацильного переноса. Естественно, на начальном этапе происходит наиболее быстрый синтез продукта ацильного переноса (начальный участок кривой 2). По мере расходования исходных реагентов накопление продукта ацильного переноса замедляется, падает и значение потенциально достижимых с точки зрения термодинамики концентраций продукта ацильного переноса (резко ниспадающий участок кривой 1). В точке пересечения двух кривых достигается максимальный выход продукта ацильного переноса, а далее, пройдя эту точку, реакционная система попадает в другую неравновесную область, где равновесие смещено уже в сторону расходования продукта ацильного переноса. Это расходование продукта ацильного переноса может протекать как гидролиз продукта (реакция 2 в обратном направлении) и как реакция синтеза ацильного донора с последующим его гидролизом (реакция 3 в обратном направлении, а затем реакция 1). Реакционная система будет стремиться к достижению равновесия по всем трём реакциям (1, 2 и 3 — причём в этой тройке только любые две реакции являются независимыми). Максимум кинетической кривой накопления продукта ацильного переноса обусловлен не только скоростями ацильного переноса на нуклеофил, а также скоростями гидролиза ацильного донора и образующегося продукта, но и термодинамикой реакции 3 — реакции ацильного переноса. Кроме того, снижение скорости накопления продукта ацильного переноса при приближении к точке максимума является следствием приближения к положению равновесия в реакции ацильного переноса.

Кинетические схемы ферментативного ацильного переноса

Предложенные ранее кинетические модели ферментативного ацильного переноса, катализируемого ПА в водной среде, включали неравновесные стадии, а именно: стадию образования ацилфермента и его гидролиза в случае «минимальной» кинетической схемы и, помимо перечисленных, - стадию

гидролиза тройного ацилфермент-нуклеофильного комплекса в случае полной схемы, учитывающей образование тройного комплекса ацилфермент-нуклеофил (схема 1).

К5 к2 к, Е + Э - ЕБ -?-- ЕА ---»- Е + Р2

ЕР

Е + Р

Схема 1. Кинетическая схема ферментативного ацшьного переноса от ацильного донора на нуклеофш с образованием комплекса ацшфермент-нуклеофш. Е— фермент, 5— ацшьный донор; нуклеофш /V; ЕБ, ЕР — комплекс фермента с субстратом и продуктом синтеза; ЕА — ацшфермент, ЕАЫ- комплекс ацшфермент-нуклеофш; Р/ - продукт, выделяющийся при образовании ацшфермента; Рг — продукт гидролиза ацшфермента, Р-продукт синтеза. Смысл констант вытекает га приведенной схемы. С помощью прошеных букв К обозначены константы равновесия соответствующих стадий в форме констант диссоциации; с помощью строчных к - кинетические константы.

Поскольку уравнение Холдена, связывающее значения термодинамической и кинетических констант реакции, может быть применено только к равновесной части схемы, при определении взаимосвязи между термодинамическими и кинетическими параметрами ферментативного ацильного переноса необходимо дополнить схему, предусмотреть обратимость стадий образования и гидролиза ацилфермента (включить соответствующие стадии к_2 и к_з) и придать общей кинетической схеме полностью равновесный вид. В полной кинетической схеме ферментативного ацильного переноса (схема 2) за ацилфермент конкурируют три нуклеофила - продукт Рь представляющий собой уходящую группу ацильного донора, вода и добавленный нуклеофил N.

Полностью обратимая кинетическая схема 2, позволяет найти связь кинетических параметров реакции с термодинамическими константами ацильного переноса и гидролиза ацильного донора.

Для того, чтобы оценить как введение новых стадий и ограничений, накладываемых термодинамикой, отразится на кинетической схеме, перед разбором наиболее сложной равновесной схемы (схема 2) рассмотрим в порядке усложнения несколько упрощённых частных случаев ферментативного ацильного переноса. В качестве исходной рассмотрим ситуацию, когда ацильный перенос не осложнён стадией гидролиза — идеальный случай

ферментативного ацильного переноса (схема 3). Подобный вариант протекания ферментативного ацильного переноса возможен, например, в неводных растворителях при использовании липазы в качестве катализатора.

к, к2 к3 к7 к,

Е+Э ЕЭ ЕАР, Р,+ЕА ЕР2 =г=а= Е+Р.

к-. к2 к3 +гд к7 к,

■I'

ЕАЫ ЕР

к^Цкб

Е+Р

Схема 2. Полная кинетическая схема ферментативного ацильного переноса. Е — фермент. 5— ацильный донор, ацилъный остаток которого переносится на нуклеофил Ы;

ЕР, ЕР2 — комплексы фермента с субстратом, продуктом ацильного переноса и продуктом гидролиза, соответственно; ЕЛ — ацилфермент, ЕАЫ— комплекс ацилфермент-нуклеофт; ЕАР/ - комплекс ацшфермент-первый продукт превращения ацильного донора, выделяющийся при образовании ацилфермента, Р/ — первый продукт превращения ацшьного донора, выделяющийся при образовании ацилфермента; Рг - продукт гидролиза ацилфермента, Р - продукт ацильного переноса на нуклеофил Щпродукт синтеза).

к, к2 к3 к4 к5 к6 Е+Б ЕБ —ЕАР, Р,+ЕА+Ы ЕАЫ ЕР ** Е+Р

к.1 к2 к3 к4 к 5 к6

Схема 3. Кинетическая схема ферментативного ацшьного переноса, не осложненного гидролизом ацилфермента. Е - фермент, 5 - ацильный донор, ацильный остаток которого переносится на нуклеофил И; Е5, ЕР - комплексы фермента с субстратом и продуктом ацшьного переноса, ЕА — ацтфермент, ЕАЫ— комплекс ацшфермент-нуклеофш; ЕАР¡ — комплекс ацшфермент-первый продукт превращена ацильного донора, выделяющийся при образовании ацтфермента, Р1 — первый продукт превращения ацшьного донора, выделяющийся при образовании ацшфермента, Р-продукт ацшьного переноса на нуклеофил N (продукт синтеза).

Рассмотрим представленные кинетические схемы в порядке усложнения. При этом задачей рассмотрения будет сравнение новых схем (2 и 3) и ранее предложенной кинетической схемы 1 для выяснения вопроса о том, насколько добавление равновесных стадий и учет термодинамических параметров ацильного переноса меняет существующие представления о параметрах и путях

управления эффективностью ацильного переноса (ранее такими параметрами являлись сочетания кинетических констант, обозначаемые а, р и у)3.

Наиболее простым случаем ферментативного ацильного переноса является реакция без гидролиза (схема 3). В этом виде реакция с точки зрения формальной кинетики похожа на хорошо известную реакцию прямой конденсации. Для иллюстрации последнего утверждения сравним схему реакции прямой конденсации и ацильного переноса без гидролиза (схемы 4 и 3, соответственно) и вытекающие из них кинетические уравнения.

к1 к2 к3 к4 к5 Е+Р2 ЕА+Ы ЕАЫ ЕР Е+Р

. 2 I- 1г I,

Схема 4. Кинетическая «равновесная» схема реакции ферментативной прямой конденсации. Е — фермент, Ргацилъный (неактивированный) донор, используемый для ацилирования нуклеофша Ы; ЕР2, ЕР — комплексы фермента с ацильным донором Рг и продуктом ацилирования Р. соответственно, ЕА — ацшфермент. ЕАЫ-комплекс ацшфермепт-нуклеофил.

Схемы реакции ферментативного ацильного переноса и прямой конденсации отличаются только стадиями, предшествующими образованию ацилфермента. Применение в качестве ацильного донора неактивированной кислоты в прямой конденсации приводит к тому, что вода является для этой реакции не только растворителем, но и уходящим нуклеофилом, что приводит к возникновению единственного отличия от схемы 3 - там не предусмотрена стадия связывания воды в центре связывания нуклеофила.

Рассмотрим взаимосвязь кинетических констант данных реакций с константами равновесия. Для этого запишем уравнения Холдена:

£ _ кх-кг-къ-к^ -к5-к6

к_, • к_2 ■ к_з ■ к_4 ■к_?-к_й (для схемы 3) (4)

к| * к2 ■ к^ • к^ 'ке,

* = Т—I—I—I—V (для схемы 4) (5)

—1 * —2 " —3 ' —4 * — 5

Сравнение уравнений показывает, что значительно более низкое значение константы равновесия прямой конденсации связано с более низким значением константы скорости образования ацилфермента из кислоты по сравнению с активированным ацильным донором.

Если выделить параметры эффективности по аналогии с тем, как делалось ранее для неравновесных кинетических схем, то в приложении к данным

3 Youshko M.I., Chilov G.G., Shcherbakova T.A., Svedas V.K., Biochim. Biophys. Acta: Proteins & Proteomics, 2002, 1599, 134-140

системам параметры эффективности и выражение для константы равновесия для схемы 3 будут выглядеть следующим образом:

(6) (7)

= (8) а

При этом параметр р ранее связывали с относительной реакционной способностью нуклеофила N по отношению к воде, а в нашем случае, в связи с введением обратной стадии ресинтеза донора в схеме 3, этот параметр отражает относительную реакционную способность нуклеофила N по отношению к «уходящему» нуклеофилу Р^ Параметр а ранее интерпретировали как сравнительную реакционоспособность фермента при гидролизе двух субстратов — ацильного донора Б и синтезируемого продукта Р. При рассмотрении равновесной схемы без дополнительных ограничений этот параметр принимает более сложный вид.

Анализ равновесной кинетической модели активированного ацильного переноса с равновесным гидролизом ацилфермента (схема 2)

Согласно соотношению Холдена кинетические константы реакции в прямом и обратном направлении однозначно связаны с величиной константы равновесия реакции. Запишем выражения для констант равновесия ферментативного ацильного переноса (Ка,), прямой конденсации (К^.) и гидролиза донора (К^)'-

Б+КГОР1+Р

^ _ К - к2 • к3 ■ кл • к5 • к6

к-1 * к, 2' • к_4 • к_5 • к_:.

р2+:ыор

^ _ 8 • к_ 7 • к^ • к 5 ■ к6 к%' к1 • • к,5 ■

50Р,+Р2

(9)

(10)

(П) (12)

(13)

X = '(14)

к _1 • к_2 • к_з - к 7 •

Поскольку из приведённых констант лишь две являются независимыми -ограничимся рассмотрением констант равновесия ацильного переноса и гидролиза ацильного донора. С учётом выражений для кинетических параметров, ранее использованных для описания ферментативного ацильного переноса в соответствии со схемой 1, вышеприведённые уравнения будут иметь следующий вид:

К - Р

~~ а • уйР <15>

Для выяснения того, какие сочетания констант оказываются ключевыми для схемы 2, был проведен анализ системы дифференциальных уравнений, описывающих поведение системы, представленной на схеме 2 в предположении о стационарности реакций по ацилферменту. Проведенный кинетический анализ показал, что наряду с параметрами а и ß важными параметрами, определяющими поведение системы, являются константы равновесия прямой конденсации и гидролиза донора. При начальных условиях t=0, S=S0, N=N0, Р1=Р2=Р=0, и малых степенях превращения схемы неразличимы по параметру соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза S/H:

S; = ß-N° (16)

В целом поведение реакции, протекающей в соответствии с равновесной схемой 2, является более сложным, чем представлялось ранее. Тем не менее, основные выводы из проведённого кинетического анализа состоят в том, что, также как и в рамках предыдущей схемы 1, увеличение параметра нуклеофильности ß приводит к повышению эффективности протекания синтеза по отношению к гидролизу.

Для проверки справедливости проведенного кинетического анализа и роли соотношения (15) было проведено сравнение синтеза ампициллина с использованием двух ацильных доноров — амида D-фенилглицина и дипептида D-фенилглицилглицина. Ввиду значительного вклада энергии ионизации в случае реакции гидролиза пептидной связи в сравнении с амидной связью, гидролиз пептидов является термодинамически более выгодным. Это приводит к более глубокому смещению равновесия в реакциях ацильного переноса с использованием дипептида в качестве ацильного донора, что количественно выражается в увеличении значения константы равновесия процесса и, соответственно, кинетических параметров и выхода целевого продукта (табл. 4).

Таблица 4. Сравнение кинетических и термодинамических параметров для реакции ферментативного синтеза ампициллина из амида О-феттглицина и О-фенилглицилглицина при одинаковых условиях — рН 6.5, 25"С.

Донор Ка1 а Р РР Выход, %

БРСТШ2 4.3 5.2 56 - 29

ПРвау 21.2 0.11 120 45.4 57

Ранее предполагалось, что основными факторами, определяющими эффективность реакции ферментативного ацильного переноса, являются кинетические параметры аир, при этом выход продукта прямо пропорционален величине р и обратно пропорционален величине а. Проведенный нами термодинамический и кинетический анализ реакций ферментативного ацильного переноса показал, что параметры а и р не являются независимыми и напрямую связаны с константой равновесия реакции ацильного переноса.

Сравнение ферментативного ацилирования путем прямой конденсации и путем ацильного переноса

Рассмотренные методы ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде (метод прямой конденсации и метод ферментативного ацилирования аминов с использованием активированных ацильных доноров) лишены недостатков ферментативных реакций, проводимых в среде органических растворителей, и пригодны как для биокаталитического синтеза их №ацильных производных, так и для биокаталитического получения энантиомерно чистых соединений в мягких условиях из доступных реагентов. Для выяснения перспектив препаративного использования необходимо сравнение обоих методов. Каждый подход имеет сильные и слабые стороны. При использовании активированных ацильных доноров достигается более высокая скорость и глубина ацилирования, а также энантиомерная чистота целевого продукта. Однако при этом необходимо использовать более дорогие ацильные доноры и проводить процесс в щелочной среде, где фермент является менее стабильным. Принципиальным достоинством метода прямой конденсации является возможность использования дешевых ацильных доноров и проведения реакции в более мягких условиях, где большинство ферментов, в т.ч. и использованные нами ферменты семейства пенициллинацилаз, являются более активными и стабильными. В конечном счете, все эти факторы и

определят экономику биокаталитической технологии в каждом конкретном случае. Можно ожидать, что оба подхода - стереоселективное ферментативное ацилирование аминосоединений методом прямой конденсации и ферментативный ацильный перенос в водной среде станут компонентами интегральной биокаталитической технологии получения энантиомерно чистых аминосоединений и их производных.

Основные результаты и выводы

1. Определены термодинамические параметры реакции ацилирования широкого круга аминосоединений, обладающих различными параметрами основности, различными ацильными донорами в водной среде. Обнаружена линейная зависимость термодинамической энергии Гиббса от рК аминосоединений.

2. Показано, что термодинамика реакции ацильного переноса определяет максимальный выход продукта в реакциях ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде активированными ацильными донорами.

3. Проведён анализ способов повышения выхода в реакциях прямой конденсации карбоновых кислот и аминосоединений в водной среде, изучены возможности увеличения выхода путем подбора ацильного донора, изменения условий проведения реакции (температуры, присутствия высаливающих агентов).

4. Проведен ферментативный синтез Ы-ацилированных аминокислот и их сложных эфиров. Показано, что наиболее высокий выход целевого продукта достигается в гетерогенных высококонцентрированных системах. Найдено оптимальное соотношение вода/реагенты, при котором скорость биокаталитического синтеза максимальна, а выход целевого продукта близок к количественному.

5. Показано, что ферментативное ацилирование аминосоединений в водной среде можно проводить в технологическом режиме с циклическом добавлением реагентов и отделением целевых продуктов, что позволяет максимально эффективно использовать фермент и минимизировать расход исходных субстратов.

Список публикаций

1. D.T.Guranda, G.A.Ushakov, P.G.Yolkin, V.K.Svedas Thermodynamics of phenylacetamides synthesis: Linear free energy relationship with pk of amine, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2012, №1-2, 48-53.

2. Гуранда Д.Ф., Ушаков Г.А., Швядас B.K. Эффективное и стереоселективное ацилирование 1-фенилэтиламина в водной среде без активации ацильного донора, катализируемое пенициллинацилазой, Acta Naturae, 2009, 3, 52-54.

3. Kudryavtsev P.A., Guranda D.T., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Godina A.F., Svedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillinacylase in aqueous medium. Abstracts Int. Conf. "Biotechnology-2007". Moscow, 2007, p. 60.

4. Guranda D.T., Kudiyavtsev P.A., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Sidorova A.V., Svedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillinacylase in aqueous medium. Int. Symp. Advanced Science in Organic Chemistry. Sudak, Crimea, Ukraine. 2006, C-043.

5. Guranda D.T., Ushakov G.A., Yolkin P.G., Kudryavtsev P.A. Thermodynamics of phenylacetamides synthesis/hydrolysis: linear correlation between the Gibbs energy and pK of amine. Abstracts Int. Conf. "Biocatalysis-2005". St. Petersburg, 2005, p. 42.

6. Буданова Ю.А., Химюк А.Я., Ушаков Г.А., Гуранда Д.Т. Введение и снятие N-защитных групп в пептидном синтезе пенициллинацилазой. Материалы XI Межд. конф. "Ломоносов-2004", Москва, 2004,8-9 с.

7. Юшко М.И., Гуранда Д.Ф., Чилов Г.Г., Ямскова О.В., Ушаков Г.А., Суплатов Д.А., Кудрявцев П.А., Емельянов И.И., Саранская О.В.,Швядас В.К. Разработка методов энантиоселекгивного биокаталитического ацилирования в водной среде как основы экологически безопасной технологии получения хиральных аминосоединений. Материалы итоговой конференции ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012 годы», Москва, 2007, стр. 16-17.

8. Svedas V., Ushakov G., Sedlyarov V., Guranda D. Biocatalytic acylation of amino compounds in aqueous medium: optimization based on thermodynamic studies. Abstracts Int. Symp. "BioTrans". Bern, Switzerland. 2009, p.324.

9. Ushakov G.A., Tukhtubaeva N.E., Guranda D.T. Enzymatic synthesis of olygopeptides in aqueous medium. Abstracts Int. Conf. "Biocatalysis in non-cinvential media". Moscow, 2008, p.36.

10.Guranda D., Ushakov G., Panin N., Godina A, Sedlyarov V., Svedas V. Penicillin-acylase catalyzed reactions in aqueous medium: from kinetic and thermodynamic analysis to practical applications for stereoselective synthesis and resolutions. Abstracts of the Int. Conf. "Biocatalysis in non-convential media". Moscow, 2008, p.32.

Подписано в печать 09.11.2012г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № 1427 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Ушаков, Геннадий Александрович

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Пенициллина цпллзл.

1.1.1 Общие сведения.

1.1.2 Стерео- и субстратная специфичность ПА.

1.1.3 Ферментативный гидролиз, катализируемый ПА.

1.1.4 Неактивированный ацильный перенос.

1.1.5 Активированный ацильный перенос.

1.2 Особенности строения и термодинамики амидной связи.

1.2.1 Структурные особенности амидной связи.

1.2.2 Сравнение химических и ферментативных способов синтеза амидной связи.

1.2.3 Термодинамика образования амидной связи. Влияние условий проведения реакции на определяемую константу равновесия.

1.2.4 Термодинамика амидной связи. Линейная корреляция свободной энергии образования амидной связи с основностью аминосоединения.

1.2.5 Термодинамика амидной связи. Синтез антибиотиков.

1.2.6 Связь кинетических и термодинамических параметров.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Список коммерческих реактивов.

3.1.2 Химический синтез амидов.

2.2 Методы.

2.2.1 ВЭЖХ-аналнз.

2.2.2 Определение констант ионизации амниосоединсний.

2.2.3 Определение констант равновесия гидролиза ряда ацильных доноров.

2.2.4 Определение констант равновесия гидролиза амидов, производных фепилуксусной кислоты.

2.2.5 Определение активности пенициллинацилазы.

2.2.6 Изучение растворимости компонентов реакции.

2.2.7 Слежение за реакцией синтеза ацильных производных аминов и аминокислот.

2.2.8 Определение активности пенициллинацилазы.

2.2.9 Синтез Ы-фенилацепитпронзводных сложныхэфиров аминокислот в гетерогенных системах

2.2.10. Синтез этилового эфира М-фенилацеттфенилачанина при различных температурах.

2.2.11 Синтез галогеизамещёниых И-фентацетил производных сложных эфиров аминокислот.

2.2.12 Определение растворимости (Хгфенилаланина и фепилуксусной кислоты при различных концентрациях сульфата аммония.

2.2.13 Определение растворимости Ы-фенилацетичфстталанина при различных концентрациях сульфата аммония.

2.2.14 Определение растворимости этилового эфира СХ-фенилаланина и этилового эфира /V-фенилацетилфенилачанина в растворах с высокой высачивающей способностью.

2.2.15 Синтез М-фенилацетилфеничаланина в растворах с высокой высаливающей способностью.

2.2.16 Определение активности пенициллинацилазы в растворах с различной ионной стой.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Прямая ко! 1ДЕ1 1сация.

3.1.1 Термодинамика прямой конденсации.

3.1.2 Использование реакции прямой конденсации в биотехнологии. Эффективное и стереоселективное ацилирование 1-фенилэтиламина в водной среде без активации ацильного донора.

3.1.3 Эффективное и стереоселективное ацилирование эфиров аминокислот в водной среде без активации ацильного донора.

3.2 АКТИВИРОВАННЫЙ АЦИЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС.

3.2.1 Термодинамика активированного ацильного переноса.

3.2.3 Анализ кинетической модели ферментативного ацильного переноса, не осложнённого гидролизом ацилфермента.

3.2.4 Анализ равновесной кинетической модели активированного ацильного переноса с необратимым гидролизом ацилфермента.¡

3.2.5 Анализ равновесной кинетической модели активированного ацильного переноса с равновесным гидролизом ацилфермента.

3.2.6 Зависимость выхода активированного ацильного переноса от термодинамических и кинетических параметров.

Введение диссертация по химии, на тему "Термодинамические и кинетические особенности ацилирования аминосоединений в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой"

Актуальность проблемы. Синтез амидной связи является важной задачей в практике органической и фармацевтической химии. Однако существующие химические способы синтеза амидной связи не соответствуют требованиям «зеленой» химии и имеют ряд недостатков - как правило, они проводятся с использованием органических растворителей, включают стадии предварительной активации реагентов и не обладают достаточной регио- и стереоселективностью. Сокращение использования экологически опасных растворителей является принципиально важной проблемой, так как растворители вносят наибольший вклад в образование отходов фармацевтической промышленности /'/, которые, по оценкам экспертов, могут на 1-2 порядка превышать количество синтезируемого целевого продукта / /. Использование ферментов как катализаторов синтеза амидной связи в водной среде могло бы решить большую часть из перечисленных проблем. В связи с этим изучение кинетических и термодинамических закономерностей ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде представляет собой актуальную научную и практическую задачу.

Цель и задачи исследования Задачей настоящего исследования явилось изучение термодинамики и кинетики реакций синтеза амидной связи, катализируемого пенициллинацилазами (ПА) из Е.соИ и А./аесаНя в водной среде, с целыо выявления факторов, определяющих эффективность ферментативных реакций.

1 Литературный обзор 1.1 Пенициллинацилаза 1.1.1 Общие сведения

Пенициллинацилаза (ПА) относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз (К.Ф.3.5.1.11). Впервые информация о получении ПА из грибов Pénicillium chrysogenum и Aspergillus oryzae была опубликована в 1950-м году /3/. В дальнейшем этот фермент был найден у различных организмов Л 5/. Специфическая особенность, которая привлекла к новому ферменту пристальное внимание исследователей, состояла в уникальной способности катализировать селективное расщепление более стабильной из двух амидных связей пенициллина, не затрагивая лабильную ß-лактамную связь (Рис. 1). Важность сохранения ß-лактамной связи пенициллинового ядра связана с тем, что её разрушение приводит к полной потере антибиотических свойств. В этом плане прямую противоположность ПА представляют бактериальные ферменты класса ß-лактамаз (К.Ф. 3.5.2.6), способные с высокой эффективностью расщеплять ß-лактамную связь, сведения об обнаружении которых были опубликованы в 1940-м году /6/. Как и антибиотики ß-лактамазы относятся к «арсеналу» биохимического «вооружения» и позволяют бактериям выживать в средах, содержащих ß-лактамные антибиотики, так же как антибиотики позволяют организмам предотвращать распространение бактерий. ПА не участвует в биосинтезе пенициллиновых антибиотиков - циклизация в дипептиде цистеин-валин с образованием двух гетероциклов происходит при участии другого фермента - изопенициллин-Nу синтазы / /.

R—C-NH-II О re—s в и A

4 3

СНЭ 'CH, V

C-OH

II о

Рис. 1. Две амидных связи в пепициллиновых антибиотиках: 1 -стабильная амидная связь, 2-лабильная р-лактамная связь. Для пенициллина Я=РИас

Для ПА из Escherichia coli первичная структура была определена методом секвенирования гена /8/. Зрелый фермент из Escherichia -периплазматический гетеродимер, состоящий из а- и ß- цепей (23.9 кДа и 61.5 кДа, соответственно) /8/, которые получаются в результате активации общего

О Q мембранно-связанного предшественника /' /. н н н

АСУ

I Me

Н О

IPNS Н R N

Н Н

IPN

2 2 Н20

R=L-a-am i n oö~ad i poy I

H COO"

Рис. 2. Схема биосинтеза /3-лактамного кольца под действием фермента изопенициллин-Ы-синтазы/0/

Рис. 3. Общий вид гетеродимера пенициллинацилазы из Escherichia, построенный на основании данных РСА. Усредненные размеры составляют 70x50x55 А. Синим цветом показана а-субъединица, красным - ß-субъединица фермента.

В настоящее время определены первичные структуры ПА из Alcaligenes faecalis /10/, K.citrophila /п/, P.rettgeri A.viscosus /13/, B.megaterium /' / и показано, что эти ферменты высоко гомологичны /,0/. Каталитическим центром во всех случаях является N-концевой серии ß-цепи.

Физиологическая роль ПА до настоящего времени не установлена. Существует несколько предположений: резистентность к пенициллинам /15/ и метаболизирование ФУК в качестве единственного источника углерода и энергии /,6/.

Опубликованные в 1995 году данные по рентгеноструктурному анализу (РСА) ПА из Escherichia, а также комплексов фермента с ФУК, фенилметилсульфонил фторидом /|7/ и другими ингибиторами позволили сформировать основные представления о структуре и гипотезу о механизме каталитического действия данного фермента.

Гетеродимер пенициллинацилазы состоит из двух тесно переплетенных цепей без очевидных дискретных областей с глубокой чашеобразной выемкой в центре (Рис. 3). Из анализа структуры комплекса фермента с ФУК, являющейся сильным конкурентным ингибитором, следует, что связывание субстрата происходит внутри выемки, на дне которой находится гидрофобный "карман", образованный многочисленными ароматическими аминокислотными остатками. Фенильная часть ингибитора направлена внутрь этого "кармана", а карбоксильная группа взаимодействует с серином ßl. Специфичность фермента к фенилацетильной группе объясняется комплементарностыо фенилацетильного остатка и участка связывания ацильной группы субстрата активного центра фермента.

В ранних работах по изучению ПА показано, что ФМСФ (специфический реагент на гидроксильную группу серина) ковалентно

18 19 ^п л 1 модифицирует ПА из Escherichia / ' /, B.megaterium /" /, P.rettgeri I I vi был сделан вывод о том, что реакции, катализируемые ПА, протекают через

1Ä образование ацилферментного комплекса / /. Позднее было найдено, что именно N-концевой Ser ß-цепи является нуклеофилом активного центра ПА: замена Ser ßl на цистеин сайт-направленным мутагенезом (ПА из Escherichia) или химической модификацией (ПА из Escherichia /"/ и K.citrophila /" /) практически полностью подавляет активность фермента. Анализ структуры продукта взаимодействия ПА с ФМСФ, ацилферментного комплекса фенилметилсульфонил-ПА, на основании данных РСА, подтвердил эти

1 7 предположения и позволил авторам / / предложить ранее неизвестный механизм катализа, основанный на самоактивации N-концевого нуклеофила (Рис. 4). Раннее предположение о каталитически значимой роли остатка серина, следовавшее из кинетических данных и необратимом ингибировании фермента ПМСФ, в полной мере подтвердилось данными РСА. Более того, было выявлено, что остаток серина, участвующий в катализе, является N-концевым остатком и не входит в типичную для сериновых гидролаз систему переноса заряда, необходимую для увеличения нуклеофильности атома кислорода. Более детальное рассмотрение позволило отнести ПА к новому семейства Ntn-гидролаз, классу ферментов с общим мотивом активного

25 центра, содержащих каталитически активный Ser или Cys на N-конце /" , /. Каталитический акт у ферментов этого семейства протекает, как и в традиционном случае катализа сериновыми и цистеиновыми гидролазами, через образование промежуточного ковалентного ацилфермента. Однако, в отличие от последних, усиление нуклеофильности килорода/серы происходит не за счет протяженной цепи переноса заряда, а благодаря близ расположенной собственной a-аминогруппе концевой аминокислоты. В дальнейшем ацилфермент через стадию образования тетраэдрического интермедиата, стабилизированного водородными связями с атомами водорода амидных групп аспарагина и аланина /26/, претерпевает последующие превращения (Рис. 4). Изначально предполагалось, что в ходе каталитического акта перенос атома водорода от кислорода гидрокси группы серина к концевому азоту серина происходит через мостиковую молекулу воды. Однако последние данные РСА комплекса ПА с близким аналогом природного субстрата косвенно свидетельствуют о том, что перенос протона от кислорода к азоту серина может проходить напрямую. Моделирование каталитического механизма ПА посредством квантово-механических расчетов подтверждает возможность прямого переноса протона, а также важную роль концевой амидной группы Asn Ь241 и амидной группы Ala Ь69 пептидной цепи в стабилизации оксианионного интермедиата /27/. о

II Е О bSI^^NH^

Рис. 4. Механизм катализа ПА из E.coli.

В отличие от сериновых протеаз, когда усиление нуклеофильности гидроксильной группы серина достигается за счет системы с переносом заряда ло

Ser-His-Asp / /, вблизи N-концевого серина ßl ПА нет оснований, поэтому предполагают, что нуклеофильность гидроксила Ser ßl усиливается

17 собственной a-аминогруппой (Рис. 4) / /. ПА является представителем нового семейства ферментов, названные гидролазами с N-концевым нуклеофилом, в активном центре которых предполагается реализация ранее неизвестного механизма самоактивации нуклеофильного центра.

ПА из различных источников проявляют максимальную каталитическую активность и стабильность при физиологических значениях рН. При этом для отдельных ферментов этого семейства было показано, что падение каталитической активности в кислых и щелочных средах не обусловлено их инактивацией /44/. Уменьшение каталитической активности в кислой области (рК<6) обусловлено, по-видимому, протонированием аминогруппы N-концевого серина, а падение каталитической активности в щелочной области может быть связано с перестройкой в активном центре вследствие депротонирования -ОН группы Tyr(331 /44/. Следует отметить, что ПА из Alcaligenes характеризуется более широким рН-оптимум активности и, в отличие от других ферментов этой группы, в щелочной области (например, при рН 10) обладает высокой каталитической активностью и стабильностью. Не так давно обнаружено, что и ПА из Escherichia сохраняет высокую активность в более широком интервале рН, чем это представлялось ранее, в частности в кислой среде /29/.

Исследование рН-зависимости стабильности ПА из различных бактериальных источников показало, что ферменты этой группы наиболее стабильны в нейтральной среде, однако быстро инактивируются в кислых и щелочных средах. В отличие от ПА из других источников, малоизученные ферменты из Alcaligenes и Bacillus весьма стабильны в щелочной среде. Было показано, в этих работах, что ключевую роль для подержания стабильной конформации ПА играют ионные пары (солевые мостики предположительно образованы карбоксильными группами аспарагиновой/глутаминовой кислот и гуанидиновой и е-аминогруппой боковых радикалов аргинина и лизина). В качестве положительно заряженного центра может выступать также катион Са" , лигандами которого, по данным РСА, являются боковые группы глутамата и трех аспартатов / /, и чье присутствие, по-видимому, необходимо уже на стадии формирования активной конформации ПА.

Именно разрушение "ионных пар" в результате протонирования/депротонирования соответствующих аминокислотных остатков, обуславливает инактивацию за счет образования нестабильных форм фермента. При повышении температуры в структуре фермента, по-видимому, происходят конформационные переходы, связанные с разрушением солевых мостиков, что приводит к изменению каталитических

31 свойств и рН-профиля стабильности / /. Термостабилизация ПА в присутствии высаливающих агентов

32,/ указывает на роль гидрофобных взаимодействий для поддержания третичной структуры, однако влияние солей на стабильность ПА не существенна. Предложенный механизм поддержания третичной структуры согласуется с исследованиями рН-зависимых и температурных конформационных переходов в активном центре ПА и с представлениями относительно перестроек в активном центре фермента на основе РСА.

Задача получения препаратов ПА стабильных и активных в широком

33 интервале рН при помощи методов иммобилизации и генной инженерии / / до настоящего времени не решена. В начале 80-х годов путем включения фермента в полиэлектролитные комплексы, приводящим к целенаправленному изменению микросреды в результате иммобилизации, л « 7 с были получены препараты ПА, стабилизированные в кислых средах / ' /. Однако в связи с отсутствием в то время явных областей применения таких препаратов, эти исследования не получили дальнейшего развития.

Заключение диссертации по теме "Катализ"

Основные результаты и выводы

4. Проведен ферментативный синтез М-ацилированных аминокислот и их сложных эфиров. Показано, что наиболее высокий выход целевого продукта достигается в гетерогенных высококонцентрированных системах. Найдено оптимальное соотношение вода/реагенты, при котором скорость биокаталитического синтеза максимальна, а выход целевого продукта близок к количественному.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Ушаков, Геннадий Александрович, Москва

1. J.S. Carey, D. Laffan, С. Thomson, M.T. Williams, Pharmaceutical manufacture; what chemistry is used, what is difficult and what is needed. // Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 2337-2347

2. R.A. Sheldon, Green Chemistry, 2007, 9, 1273-1284

3. Sakaguchi K. and Murao S. A preliminaiy report on a new enzyme, "penicillin-amidase'V/J. Agr. Chem. Soc. (Japan), v.23, pp.411-414 ( 1950)

4. Кочеткова Е.Ф., Бартошевич Ю.Э. и Романова Н.Б. Биосинтез пенициллинацилаз// Антибиотики мед. биотехнол., в.31(10), стр.729-740 (1986)

5. Virden R. Structure, processing and catalytic action of penicillin acylase// Biotechnol. Gen. Eng. Rev., v.8, pp. 189-218 (1990)

6. Abraham E.P., Chain E. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin//Nature, v.46, pp.837-8371940)

7. Lundberg M., Siegbahn P.E.M. and Morokuma K. The mechanism for isopenicillin N synthase fromdensity-functional modeling. Highlights the similarities with other enzymes in the 2-his-l-carboxylatefamily//Biochemistry, v.47, pp. 1031-1042 (2008)

8. Oh S.-J., Kim Y.-Ch., Park Y.-W., Min S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in E.coli //Gene, v.56, pp.87-97 (1987)

9. Sizmann D., Keilmann C. and Bock A. Primary structure requirements for the maturation in vivo of penicillin acylase from E.coli ATCC 11105// Eur. J. Biochem., v. 192, pp. 143-151 (1990)

10. Verhaert R.M.D., Riemens A.M., van der Laan J.-M., van Duin J. and Quax W.J. Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from A.faecalisll Appl. Environ. Microbiol., v.63(9), pp.3412-3418 (1997)

11. Barbero J.L., Buesa J.M., de Buitrago G.G., Mendez E., Perez-Aranda A. and Garcia J.L. Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila// Gene, v.49, pp.69-80 ( 1986)

12. Ljubijankic G., Konstantinovic M. and Glisin V. The primary structure of Providencia rettgeri penicillin G acylase gene and its relationship to other gram negative amidases// DNA Seq., v.3, pp. 195-200(1992)

13. Ohashi H., Katsuta Y., Hashizume Т., Abe S.N., Kajiura H., Hattori H., Kamei T and Yano M. Molecular cloning of the penicillin G acylase gene from Arthrobacter viscosus// Appl. Environ. Microbiol., v.54, pp.2603-2607 (1988)

14. Martin L., Prieto M.A., Cortes E. and Garcia J.L. Cloning and sequencing of the рас gene encoding the penicillin G acylase of Bacillus megalerium ATCC 14945// FEMS Microbiol. Lett., v. 125, pp.287-292 (1995)

15. Kaufmann W. The possible implication of a bacterial enzyme in the biochemical mode of action of penicillins on gram-negative bacteria// Biochem. Biophys. Res. СомМип., v.14, pp.458-462 (1964)

16. Szentirmai A. Production of penicillin acylase//Appl. Microbiol., v.12, pp.185-187 (1963)

17. Duggleby, H. J., Tolley, S. P., Hill, C. P., Dodson, E. J., Dodson, G„ and Moody, P. С. E„ Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre// Nature, v.373, pp.264-268 (1995)

18. Швядас В.К., Марголин АЛ., Шерстюк С.Ф., Клесов А.А. Березин И.В. Определение абсолютной концентрации активных центров растворимой и иммобилизированной пенициллинамидазы//ДАН, в.232, стр.1127-1129 (1977)

19. Konecny J., Schneider A. and Sieber М. Kinetics and mechanism of acyl transfer by penicillin acylases//Biotechnol. and Bioeng., v.25, pp.451-467 (1983)

20. Daumy G.O., Danley D. and McColl A.S. Role of protein subunits in Proteus rettgeri penicillin G acylase//J. Bacterid., v. 163(3), pp. 1279-1281 (1985)

21. Martin J., Slade A., Aitken A., Arche R. and Virden R. Chemical modification of serine at the active site of penicillin acylase from Kluyvera citrophilall Biochem. J., v,280, pp.659-662 (1991)

22. Brannigan J. A., Dodson G., Duggleby H. J., Moody P. C., Smith J. L., Tomchick D. R., and Murzin, A.G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation// Nature, v.378, pp.416—419 (1995)

23. Jun Yin, Zixin Deng, Guoping Zhao, and Xi Huang, The N-terminal Nucleophile Serine of Cephalosporin Acylase Executes the Second Autoproteolytic Cleavage and Acylpeptide Hydrolysis // The Journal of Biological Chemistry Vol. 286, No. 27, pp. 24476-24486

24. Duggleby H. J., Tolley S. P., Hill C. P., Dodson E. J., Dodson G., and Moody P. C. Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre//Nature, v. 373, pp.264-268 (1995)

25. Чилов Г.Г., Сидорова А.В. и Швядас В.К. Исследование механизма каталитического действия N-концевых гидролаз методами квантово-химического моделирования// Биохимия (Biokhimiya), в.72(5), стр.615-621 (2007)

26. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа// Москва, изд-во "Высшая школа" (1977)

27. Chilov G.G., Svedas V.K. Enzymatic hydrolysis of beta-lactam antibiotics at low pH in a two-phase "aqueous solution water-iMMiscible organic solvent" system"// Can. J. Chem., v.80, pp.699-707 (2002)

28. McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., Wilson K.S., and Brannigan J.A. Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism// J. Mol. Biol., v.313, pp. 139-150 (2001)

29. Azevedo A.M., Fonseca L.P. and Prazeres D.M.F. Stability and stabilization of penicillin acylase// J. Chem. Technol. Biotechnol., v.74, pp.1110-1116 (1999)

30. Yang S., Zhou L., Tang H., Pan J., Wu X., Huang H., Yuan Z. Rational design of a more stable penicillin G acylase against organic cosolvent// J. Mol. Cat. B: Enzymatic, v. 18, pp.285-290 (2002)

31. Margolin A.L., Izumrudov V.A., Svedas V.K., Zenin А.В., Kabanov V.A. and Berezin I.V. Preparation and properties of penicillin amidase ¡MMobilized in polyelectrolytic complexes// Biochem. Biophys. Acta, v.660, pp.359-365 (1981)

32. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков B.A. Координационно-ионная иммобилизация ферментов. Влияние металла и стационарного лиганда на свойства иммобилизированных препаратов пенициллинамидогидролазы// Биохимия, в.46, стр. 1603-1608 (1981)

33. Cole М. Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escherichia colill Nature, v.203(4944), pp.519-520 (1964)

34. Margolin A.L., Svedas V.K. and Berezin I.V. Substrate specificity of penicillin amidase from E.colill Biochem. Biophys. Acta.,v.616, pp.283-289 (1980)

35. Fuganti C., Rosell C.M., Servi S., Tagliani A. and Terreni M. Enantioselective recognition of the phenacetyl moiety in the pen G acylase catalysed hydrolysis of phenylacetate esters// Tetrahedron: AsyMMetry., v.3(3), pp. 383-386 (1992)

36. Van der Mey M. and De Vroom E. Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase// Bioorg. Med. Chem. Lett., v.4(2), pp.345-348 (1994)

37. Daumy G.O., Danley D., McColl A.S., Apostolakos D. and Vinick F.J. Experimental evolution of penicillin G acylases from E.coli and Proteus rettgerill J. Bacteriol., v. 163(3), pp.925-932 (1985)

38. Robak M. and Szewczuk A. Penicillin amidase from Proteus rettgerill Acta Biochimica. Polonica., v.28(3, 4), pp.275-284 (1981)

39. Chiang D. and Bennet R.E. Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaleriumlli. Bacterid., v. 93, pp.302-308 (1967)

40. Чилов Г.Г., Гуранда Д.Т., Швядас В.К. Роль гидрофобности в связывании спиртов активным центром пенициллинацилаз// Биохимия, в.65(8), стр.1135-1139 (2000)

41. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenesfaecalis.ll Канд. дисс. Москва (2000)

42. Svedas V.K. and Beltser A.I. Totally enzymatic synthesis of peptides: penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as important building bloks of this strategy// Ann. N.-Y. Acad. Sci. (1998)

43. Baldaro E., D'Arrigo P., Pedrocchi-Fantoni G., Rossell C.M., Servi S., Tagliani A. and Terreni M. Pen G acylase catalyzed resolution of phenylacetate esters of secondary alcohols// Tetrahedron: AsyMMetry, v.4(5), pp. 1031-1034 (1993)

44. Waldmann Н. The phenylacetyl group as enzymatically removable protecting function for peptides and carbohydrates: selective deprotection with penicillin acylase// Liebig's Annalen der Chemie, v. 12, pp.1175-1180 (1988)

45. Didziapetris R., Drabnig В., Schellenberger V., Jakubke H.-D. and Svedas V. Penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis// FEBS Lett., v.287(l, 2), pp.31-33 (1991)

46. Waldmann H., Heuser A., Reidel A. Selective enzymatic deprotection of hydroxy- and amino groups in carbohydrates and nucleosides. Synlett.,v.l, pp. 65-67 (1994)

47. Dineva M.A., Galunsky В., Kasche V. and Petkov D.D. Phenylacetyl group as enzyme-cleavable aminoprotection of purine nucleosides// Bioorg. Med. Chem. Lett., v.3(12), pp.2781-2784 (1993)

48. Wang Q.-C., Fei J., Cui D.-F., Zhu S.-G. and Xu L.-G. Application of an ¡MMobilized penicillin acylase to the deprotection of N-phenylacetyl insulin// Biopolimers, v.25, pp. 109-114 (1986)

49. Plaskie A., Roets E. and Vanderhaeghe H. Substrate specificity of penicillin acylase of E.coliJI J. Antibiotics, v.31(8), pp.783-788 (1978)

50. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков В.А., Ныс П.С., Савицкая Е.М. Энантиоселективный гидролиз Т^-фенилацетил-О^-С-фенилглицина пенициллинамидогидролазой из E.coli и ее иммобилизированными препаратами// Биоорг. химия, в.5(4), стр.604-610 (1979)

51. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I. and Guranda D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme// Ann. N.-Y. Acad. Sci., v.799, pp.659-669 (1996)58

52. Диджяпетрис Р.И. Физико-химическое исследование реакций синтеза и гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов, катализируемых пенициллинацилазой// Канд. дисс. Хим. ф-т МГУ. М. (1992)

53. Galunsky, B., LuMMer, K. and Kasche, V. Comparative study of substrate- and stereospecificity of penicillin G amidases from different sources and hybrid isoenzymes// Monatsh. Chem., v.131, pp.623-632(2000)

54. K. Kato Further notes on penicillin nucleus, J. Antibiotics, 1953, 6, 184.

55. H.W.O. Weissenburger, M.G. Van der Hoeven, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 1970, 89, 1081-1084.

56. J.G. Shewale, H. Sivaraman, Penicillin acylase: enzyme production and its application in the manufacture of 6-APA, Proc. Biochem. 1989,24, 146-154.

57. J.G. Shewale, B.S. Desphande, V.K. Sudhakaran, S.S. Ambedkar, Penicillin acylases: applications and potentials, Proc. Biochem. 1990, 25, 97-103.

58. C.A. Claridge, A. Gourevitch, J. Lein, Bactarial penicillin amidase, Nature, 1960, 187, 237-238.

59. R.B. Morin, B.G. Jackson, R.A. Mueller, E.R. Lavagnino, W.B. Scanlon, S.L. Andrews, Chemistry of cephalosporin antibiotics. III. Chemical correlation of cephalosporin and penicillin antibiotics, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 1896-1897.

60. J. Velasco, J.L. Adrio, A.M. Moreno, B. Diez, G. Soler, J.L. Barredo, Environmentally safe production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) using recombinant strains of Acremonium chrysogenum, Nature Biotechnol, 2000, 57, 328-332.

61. F. Alfani, M. Cantarella, N. Cutarella, A. Gallifuoco, P. Golini, D. Bianchi, Enzymatic conversion of cephalosporin C into glutaryl 7-aminocephalosporanic acid. A study in different reactor configurations, Biotechnol. Lett. 1997, 19, 175-178.

62. Ospina S., Barzaua E., Ramirez O.T., Lbpez A. Munguia Effect of pH in the synthesis of ampicillin by penicillin acylase// Enzyme Microb. Technol., v.19, p.465 (1996)

63. Швядас В.-Ю.К., Марголин A.J1., Березин И.В. Термодинамические особенности ферментативного синтеза ß-лактамных антибиотиков// ДАН СССР, в.248(2), стр.479-481 (1979)

64. Березин, И.В., Марголин, А.Л., Швядас, В.К., Ферментативный синтез антибиотиков. Исследование реакции гидролиза-синтеза цефалотина, катализируемой пенициллинамидазой// Докл. АН СССР, в.235, стр.961-964 (1977)

65. Семенов, А.Н. Мартинек, К., Швядас, В.К., Марголин, A.J1, Березин, И.В, Ферментативный синтез бензилпенициллина в двухфазной водноорганической системе// Докл. АН СССР, в.258(5), стр.1124-1126 (1981)

66. Topgi R.S., Ng J.S., Landis В., Wang P., Behling J.R.Use of Enzyme Penicillin Acylase in Selective Amidation/Amide Hydrolysis to Resolve Ethyl 3-amino-4-pentynoate Isomers// Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.7, pp.2221-2229 (1999)

67. Cole M. Factors affecting the synthesis of ampicillin and hydroxypenicillins by cell-bound penicillin acylase of Escherichia coliII Biochem. J., v. 115, pp.757-764 (1969)

68. Svedas V.K., Margolin A.L., Borisov I.L. and Berezin I.V. Kinetics of the enzymatic synthesis of benzylpenicillin// Enzyme Microb. Technol., v.2, pp.313-317 (1980)

69. Blinkovsky A.M. and Markaryan A.N. Synthesis of ß-lactam antibiotics containing a-amino-phenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylglycyl-ß-lactamide amidohydrolase// Enzyme Microb. Technol., v. 15, pp.965-973 (1993)

70. Diender M.B., Straathof A.J.J., Van der Wielen L.A.M., Ras С. and Heijnen J.J. Feasibility of the thermodynamically controlled synthesis of amoxicillin// J. Mol. Catal. B: Enzymatic., v.5, pp.249-253 (1998)

71. Березин, И.В., Марголин, A.JI., Швядас, В.К., Ферментативный синтез антибиотиков. Исследование реакции гидролиза-синтеза цефалотина, катализируемой пенициллинамидазой// Докл. АН СССР, в.235, стр. 961-964 (1977)

72. Семенов, А.Н. Мартинек, К,, Швядас, В.К., Марголин, А.Л, Березин, И.В, Ферментативный синтез бензилпенициллина в двухфазной водноорганической системе// Докл. АН СССР, в.258(5), стр.1124-1126 (1981)

73. Cole M. Factors affecting the synthesis of ampicillin and hydroxypenicillins by cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli!I Biochem. J., v.l 15, pp.757-764.(1969)

74. Anisimova V. V., Filippova I. Y., Lysogorskaya E. N., Oksenoit E. S., Kolobanova S. V., Stepanov V. M. Int. J. Proteinase-catalyzed peptide synthesis in concentratcd solutions of urea and other denaturing agents// Pept. Protein Res., v. 47, p.28 (1996)

75. Blinkovsky A.M. and Markaryan A.N. Synthesis of ß-lactam antibiotics containing a-amino-phenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylglycyl-ß-lactamide amidohydrolase// Enzyme Microb. Technol., v. 15, pp.965-973 ( 1993)

76. Illanes A., Cabrera Z., Wilson L., Aguirre C. Synthesis of cephalexin in ethylene glycol with glyoxyl-agarose ¡MMobilised penicillin acylase: temperature and pH optimization// Process Biochemistry., v.39, pp.111-117 (2003)

77. Illanes A., Anjari M.S., Altamirano C., Aguirre C. Optimization of cephalexin synthesis with iMMobilized penicillinacylase in ethylene glycol medium at low temperatures// J. Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.30, pp.95-103 (2004)

78. Aguirre C., Toledo M., Medina V., Illanes A.Effect of cosolvent and pH on the kinetically controlled synthesis of ephalexin with iMMobilised penicillin acylase// Process Biochemistry., v.38, pp.351-360 (2002)

79. Alkema W. B. L., Dijkhuis A., De Vries E., and Janssen D. B.: The role of hydrophobic active-site residues in substratespecificity and acyl transfer activity of penicillin acylase//Eur. J. Biochem., v.269, pp.2093-2100 (2002)

80. Alkema W. B. L., Prins A.K., De Vries E., and Janssen D. B. Role of Argl45 and Arg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli// Biochem. J., v.365, pp.303-309 (2002)

81. Ramachandran G.N., Sasisekharan V. Conformation of polypeptides and proteins //Adv.Protein Chem., v.23, pp. 283-437 (1968)

82. Pauling L. The nature of the chemical bond// Ithaca(N.Y.):Cornell Univ. Press (1962)

83. Benedetti E. Peptides:Proc.5,h Amer.Symp.//N.Y.:Wiley, pp.257-273 (1977)

84. Wiberg K.B., Laidig K.E. Barrier to rotation adjacent to double bonds: the carbon-oxygen barrier in formic acid, methyl formate , acetic acid, and methyl acetate. The origin of ester and amide resonance //JACS, v. 109, pp.5935-5943 (1987)

85. Costain C.C, Dowling J.M. Microwave spectrum and molecular structure of formamide //J.Chem. Phys.,v.32, pp. 158-165 (1960)

86. Hirota E., Sugisaki R., Nielsen C.J., Sorensen G.O. Molecular structure and internal motion of formamide from microwave spectrum //J.Mol.Spectrosc., v.49, pp.251-267 (1974)

87. Levitt M., Lifson S. Refinement of protein conformations using macromolecular energy minimization procedure //J.Mol.Biol., v.46,pp.269-279 (1969)

88. Carlsen N.R., Radom L., Riggs N.V., Rodwell W.R. Is formamide planar or nonplanar //JACS, v.101, pp.2233-2234 (1979)

89. Kolascar A.S., Sarathy K.P. The nonplanat peptide unit. Geometry and nonplanar distortions of the cis-peptide unit//Biopolymers, v.19, pp.1345-1355 (1980)

90. Cieplak A.S. Solid-state confromations of linear oligopeptides and aliphatic amides. A model of chiral perturbation of a conjugated system //JACS, v. 107, pp.271 -273 (1985)

91. Deisenhofer J., Steigemann .W. Crystallographic refinement of the structure of bovine pancreatic trypsin inhibitor at 1.5 A resolution // Acta crystallogr., v.31B, pp.238-250 (1975)

92. Pimentel G.C., McClellan A.L. The hydrogen bond // San Francisco:Freeman (1960)

93. Homer R.B., Johnson C.D. The chemistiy of amides //Ed.J.Zabisky.L.:Interscience, pp. 187-243 (1970)

94. Гершкович А.А, Кибирев B.K. Синтез пептидов. Реагенты и методы. //Киев Наукова думка (1987)1,1 Синтезы органических препаратов//сб. 1 М. стр. 63-64 (1949)

95. Nilsson B.L., Soellner М.В., Raines R.T. Chemical synthesis of proteins // Annual review of biophysics and biomolecular structure, v. 34, pp. 91-118 (2005)

96. Valeur E., Bradley M. Amide bond formation: beyond the myth of coupling reagent // Chem. Sc. Rev. v. 38, pp. 606-631 (2009)

97. Govdi A.I., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Vasilevsky S.F., Tolstikov G.A. Synthesis and biological activity of novel acetylene betulonic acid derivatives // Chemistry of sustainable development, v. 18, pp. 397-402 (2010)

98. Kocienski P.J. Protecting groups // 3rd ed.; Georg Thieme Verlag: New York (2005)

99. Joullie M.M., Lassen K.M. Evolution of amide bond formation // Arkivoc, v. 8, pp. 189-250 (2010)

100. Monalbetti C.A.G.N., Falque V. Amide bond formation and peptide coupling // Tetrahedron, v. 61, pp. 10827-10852 (2005)

101. Bordusa F. Proteases in organic synthesis // Chem. Rev., v.102, pp.4817-4868 (2002)

102. Самойлова II.А., Давидович Ю.А., Рогожин С.В. Синтез пептидов в водной среде // Биоорганическая химия, №6, стр. 725-750 (1984)

103. Lipmann F. Metabolic generation and utilisation of phosphate bond energy // Adv. Enzymol., v.l, p.99 (1941)

104. Meyerhoff O., Green H. Synthetic action of phosphatase I. Equilibria of biological esters// J.Biol.Chem.,v. 178,p.655 (1949)

105. Carpenter F.H. The free energy change in hydrolytic reactions: the non-ionized compound convention //J. Am. Chem. Soc., v.82, pp.1111-1122 (1960).

106. Ulijn R.V., Moore B.D., Janssen A.E.M., and Hailing P.J. A single aqueous reference equilibrium constant for amide synthesis-hydrolysis // J. Chem. Soc. Perkin Trans, v.2, p. 1204 (2002)

107. Debye P., Huckel E. The theory of electrolytes. I. Lowering of freezing point and related phenomena. //Phys. Z, v. 24, pp. 185-206 (1923)

108. Гуггенгейм Э. Статистическая термодинамика, изложенная по методу У.Гиббса // ГНТИ химической литературы, JI.-M. (1941)

109. Stokes R.H., Robinson R.A. The application of volume fraction statistics to the calculation of activities of hydrated electrolytes // Trans.Faraday Soc., v.53, pp. 301-304 (1957)

110. Ныс П.С., Кольцова E.B., Шелленберг H.H., Савицкая Е.М., Левитов М.М. Физикохимические свойства 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты // Антибиотики, в. 5, стр.391-394 (1976)

111. Брунс Б.П., Савицкая Е.М., Шелленберг Н.Н., Либинсон Г.С., Колыгина Т.С., Дружинина Е.Н. Физикохимические свойства 6-аминопенициллановой кислоты кривые титрования и растворимость // Антибиотики, в.7, стр. 440-442 (1962)

112. Hilal S.H., Karickhoff S.W., Carreira L.A. Estimation of microscopic, zwitterionic ionization constants, isoelectric point and molecular speciation of organic compounds // Talanta, v.50, p.827 (1999)

113. Ulijn R.V., Moore B.D., Janssen A.E.M., and Hailing P.J. A single aqueous reference equilibrium constant for amide synthesis-hydrolysis // J. Chem. Soc. Perkin Trans., v. 2, p. 1204 (2002)

114. Дьяченко Е.Д., Козлов JT.B., Антонов В.К. Свободная энергия гидролиза различных амидных связей, образованных а-карбоксильными группа ациламинокислот //Биоорган. Химия, т.З, стр.99-104(1977)

115. Jeneks. W. P. Catalysis in Chemistr> and Enzymology// New York, McGraw-Hill (1969)

116. G.N. Rolinson, F.R. Batchelor, D. Butterworth, J. Cameron-Wood, M. Cole, G.C. Eustace, M.V. Hart, M. Richards, E.B. Chain, Formation of 6-aminopenicillanic acid from penicillin by enzymatic hydrolysis //Nature, v.l87, pp. 236-237 (1960)

117. Huang H.T., English A.R., Seto T.A., Shull G.M., Sobin B.A. Enzymatic hydrolysis of the side chain of penicillins // J. Am. Chem. Soc, v. 82, pp. 3790-3791 (1960)

118. Claridge C.A., Gourevitch A., Lein J. Bacterial penicillin amidase//Nature, v.187, pp.237-238 (1960)

119. Haldane J.B.S. Enzymes // L.:Longmans (1930)

120. Alberty R.A. Relations between biochemical thermodynamics and biochemical kinetics // Biophysical Chemistry, v. 124, pp. 11-17 (2006)