Характеристика новых мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ООЗ1G3

На правах рукописи

ШАПОВАЛОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ МУТАНТНЫХ ФОРМ ПЕНИЦИЛЛИНАДИЛАЗЫ ИЗ Escherichia coli

02 00 15 - катализ 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003163144

Работа выполнена на кафедре химическои энзимологии Химического факультета,

отделе биокинетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А H Белозерского и Факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени M В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Швядас Витаутас-Юозапас Каятоно

Официальные оппоненты Доктор химических наук, профессор Кочетков Константин Александрович Доктор химических наук Ротанова Татьяна Васильевна

Ведущая организация

Институт биохимии им А H Баха РАН

Защита состоится <45» ноября 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, сда^, кандидат химических наук Сакодынская И К

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза из Е coli широко используется в фармацевтической промышленности Появление структурных данных, а также разностороннее исследование каталитических свойств пенициллинацилаз из различных источников позволило задуматься о получении пенициллинацилаз с измененными свойствами Совместный анализ ранее накопленных данных о взаимосвязи строения субстратов и эффективности их каталитического превращения, а также структуры нативной пенициллинацилазы, аналогов фермент-субстратного комплекса и комплексов с ингибиторами позволяет очертить круг тех аминокислотных остатков, которые могут определять специфичность и хиральную дискриминацию субстратов в активном центре, а также участвовать в механизме действия фермента Сайт-направленный мутагенез предоставляет возможность выявления роли этих остатков в механизме действия пенициллинацилазы, понимания природы субстратной специфичности и энантиоселективности ее действия В то же время получение мутантных форм пенициллинацилазы представляет большой интерес для фармацевтической и тонкой химической промышленности, поскольку таким путем могут быть получены катализаторы, превосходящие нативный фермент Таким образом, получение и характеристика мутантных форм пенициллинацилазы имеет как фундаментальное, так и практическое значение

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось исследование каталитических свойств мутантов пенициллинацилазы из Е coli, полученных при сайт-направленном мутагенезе остатков, которые на основании имеющихся структурных данных могут играть важную роль в механизме действия фермента и определять его специфичность (ßPhe71, ßPhe57, txArgl45 и aPhel46) изучение субстратной специфичности полученных мутантных пенициллинацилаз характеристика стереоселективности их действия в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, исследование мутантов как катализаторов ферментативного синтеза ß-лактамных антибиотиков в водной среде, детальная кинетическая характеристика реакций переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил, катализируемых наиболее активными мутантами, их использование в препаративном синтезе ампициллина и цефалексина

Научная новизна и практическая значимость работы В результате проведенных исследований были впервые охарактеризованы каталитические свойства более 30 мутантных форм пенициллинацилазы из Е coli каталитическая активность, субстратная специфичность и энантиоселективность действия, способность катализировать ацильный перенос на ядра пенициллинов и цефалоспоринов Показано, что ряд мутантных ферментов по остатку ßPhe71 обладают измененным субстратным профилем и более высокой специфичностью по отношению к производным D-фенилглицина, причем каталитическую активность фермента к отдельным субстратам удается повысить более чем в 10 раз Введением мутаций в положение ßPhe71 (в зависимости от природы вводимого остатка) можно регулировать (повысить или понизить) стереоселективность фермента в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот Охарактеризована возможность использования мутантных ферментов в качестве катализаторов синтеза ß-лакгамных антибиотиков ампициллина и цефалексина, показано,

что замена остатка pPhe57, являющегося важным составным фрагментом узкого гидрофобного кармана для связывания ацильной части субстрата, может привести к снижению эффективности действия фермента на три порядка В то же время замена остатков aArgl45 и aPhel46 может улучшить эффективность ацильного переноса на ядра пенициллинов и цефалоспоринов, проведено детальное исследование каталитических свойств наиболее активных мутантных форм фермента с целью выявления оптимальных условий синтеза антибиотиков Определены количественные параметры, определяющие эффективность переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил при использовании данных мутантов пенициллинацилазы в качестве катализатора Три мутантных формы фермента по остатку aArgl45 (aArgl45Ser, aArgl45Leu и aArgl45Gly), показавшие наиболее эффективные каталитические свойства при синтезе ампициллина и цефалексина по сравнению с нативной пенициллинацилазой, использованы в качестве катализаторов препаративного процесса Показано, что при использовании этих мутантных форм можно получить более высокий выход целевого продукта с меньшими нецелевыми потерями донора ацильной части при синтезе ампициллина Детально охарактеризована также субстратная и стереоспецифичность действия одного из «улучшенных» мутантных ферментов этой группы - aArgl45Leu в реакциях гидролиза Предложен новый оптически активный тиоловый реагент Ы-фенилацетил-(К)-фенилглицил-(8)-цистеин для хирального анализа аминокислот и определения энантиоселективности действия пенициллинацилазы и ее мутантов

Проведенные исследования позволили получить ряд мутантных пенициллинацилаз с улучшенными свойствами Наибольший практический интерес представляют мутанты pPhe71 с увеличенной энантиоселективностъю действия как катализаторы получения индивидуальных энантиомеров аминокислот, а также мутантные формы фермента по остатку aArgl45, на основании которых могут быть созданы более эффективные биокатализаторы получения полусинтетических (3-лактамных антибиотиков пенициллинового и цефалоспоринового ряда

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на международных конференциях «Biocatalysis-2002 Fundamentals and applications», г Москва, 2002 г и «Biocatalysis-2005 Fundamentals and applications», г Санкт-Петербург, 2005 г, на 1 и 3 Биотехнологических конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития», г Москва, 2002 и 2003 гг, "Ломоносов-2004", г Москва, 2004 г, 2-ой Международной конференции «Инженерия ферментативных реакций», г Цавтат, Хорватия, 2005 г, Научно-практической конференции «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002 - 2006 гг», г Москва, 2006 г, Симпозиуме по сотрудничеству Европейского Союза и России в области пищи, сельского хозяйства и биотехнологии, г Санкт-Петербург, 2006 г, обсуждены на заседаниях кафедры химической энзимологии Химического факультета, семинарах НИИ Физико-химической биологии имени А Н Белозерского и Факультета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 164 ссылки Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 2 схемы и 19 рисунков

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Анализ литературных данных о структуре фермента и его активного центра, полученных при помощи рентгеноструктурного анализа в Университетах Йорка (Англия) и Гронингена (Нидерланды), а также экспериментальных данных, ранее накопленных в нашей лаборатории о взаимосвязи строения субстратов и эффективности их каталитического превращения, и предположений о механизме действия пенициллинацилазы из E.coli позволил выбрать ряд аминокислотных остатков (см. рис. 1), которые могут определять специфичность и хиральную дискриминацию субстратов в активном центре, а также участвовать в механизме действия фермента. Целью данного исследования была детальная характеристика каталитических свойств (субстратной специфичности, энантиоселективности, способности катализировать реакции ацильного

переноса на ядра пенициллинов и цефалоспоринов в водной среде) мутантов пенициллинацилазы из E.coli по остаткам ßPhe71, ßPhe57, aArgl45 и aPhel46, полученных в результате сайт-направленного мутагенеза при сотрудничестве с лабораторией профессора Д.Янссена в Университете Гронингена, Нидерланды. Мы предполагали, что при замене указанных остатков можно будет не только лучше понять их роль в механизме действия пенициллинацилазы из E.coli, но и получить препараты фермента с измененными (возможно улучшенными) каталитическими свойствами.

Рис. 1 Положение остатков ßPhe71, ßPhe57, aArgl45 и oArgl46 (А) при связывании субстрата в активном центре пенициллинацилазы из Е. Coli. Наложение структур (Б) комплекса неактивного мутантного фермента и пенициллина G (серый) и нативного фермента (черный). По данным рентгеноструктурного анализа комплексов фермента с фенилуксусной кислотой (Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill С.P., Dodson, E.J., Dodson, G., and Moody, P.C.E.// Nature, 1995, v. 373, p. 264-268) и с пенициллином G (Alkema, W.B.L., Hensgens, C.M.H., Kroezinga, E.H., De Vries, E., Floris, R., Van der Laan, J.-M., Dijkstra, B.W. and Janssen, D.B.// Protein Eng., 2000, v. 13, p. 857-863).

Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку ßPhe71

Профиль субстратной специфичности и каталитической эффективности действия мутантных ферментов

Рентгеноструктурные данные указывали на то, что в структуре комплекса каталитически неактивного фермента с бензилпенициллином (аналог фермент-субстратного комплекса) остаток ßPhe71 расположен вблизи уходящей группы и таким образом можно было ожидать, что его замена может изменить энантиоселективность действия пенициллинацилазы, а также чувствительность фермента к структуре уходящей группы Для изучения субстратной специфичности мутантных ферментов был выбран ряд «цветных» субстратов, отличающихся структурой уходящей группы п-нитро-м-карбоксианилид фенилуксусной кислоты (I), п-нитро-о-карбоксианилид фенилуксусной кислоты (II), п-нитро-о-оксианилид фенилуксусной кислоты (III), п-карбокси-м-нитроанилид фенилуксусной кислоты (IV), п-нитро-м-карбоксианилид D-фенилглицина (V) Были детально изучены каталитические свойства 8 наиболее активных мутантов фермента по остатку ßPhe71, которые содержали в боковой цепи разнообразные функциональные группы (Glu, Arg, His, Lys, Leu, Pro, Thr и Туг) Было обнаружено, что ранее разработанный в нашей лаборатории метод титрования активных центров пенициллинацилазы пригоден для титрования активных центров мутантных ферментов и таким образом сравнение каталитической активности нативного фермента и мутантов проводили на уровне значений каталитических констант ферментативной реакции (Таблица 1) Характеристика каталитических свойств мутантных ферментов показала, что замена ßPhe71 приводит не только к изменению профиля субстратной специфичности пенициллинацилазы из Е coli, но и позволяет добиться существенного увеличения ее каталитической активности по отношению к отдельным субстратам Примечательно, что «улучшение» каталитических свойств не является абсолютным, т е увеличение каталитической активности происходит избирательно и зависит от строения превращаемого субстрата Так, наибольший эффект «активации» наблюдали при замене остатка фенилаланина на лейцин (мутант ßPhe71Leu), причем мутантный фермент был более активным по отношению практически ко всем исследованным субстратам, хотя степень увеличения каталитической активности различалась при превращении разных субстратов Примечательно, что данная мутация приводила также к улучшению сродства фермента к субстрату, а значение k^/Km в реакции гидролиза субстратов II и III, катализируемой мутантом ßPhe71Leu, увеличивалось в 142 и 154 раза по сравнению с гидролизом, катализируемым нативным ферментом Улучшение сродства фермента к субстрату наблюдали также при замене фенилаланина ßPhe71 на лизин (за исключением субстрата I)

Для других мутантов (ßPhe71Lys, ßPhe71Arg, ßPhe71Glu, ßPhe71Pro и ßPhe71His) каталитическая активность возрастала лишь по отношению к некоторым субстратам Подобное наблюдение не противоречит базовым принципам ферментативного катализа и свидетельствует о наличии взаимосвязи между структурой превращаемого субстрата, а также структурой и каталитической активностью фермента, при внесении изменений в структуру фермента эта взаимосвязь нарушается и сопровождается изменением профиля

Таблица 1 Кинетические параметры гидролиза модельных "цветных" субстратов, катализируемого под действием нативной пенициллинацилазой и ее мутантами по остатку (ЗРЬе71

субстрат '-' СООН ^-' соон >-' но '—' ю, \-' СООН

1 II III IV V

фермент Кш (тМ) С"') кса^т (^'•таМГ1) Кт (тМ) к«1 (Л (^»тМ"1) Кт (тМ) кс»1 (=') кс,(/Кт (з'1*тМГ1) (тМ) кс4( С*"1) кса^т ^-'•тм:1) к» (тМ) С1) (^'"таМ"1)

нативный 0,037 17,7 480 0,083 1.3 15,7 0,038 4.9 130 0,12 105 880 1 и 11

дае71Тгр 0,24 2,4 10 0,072 0,04 0,56 0,056 2 36 0,19 1.5 7.9 1.5 0,26 0.17

0,154 38 250 0,056 7 125 0,008 44 5500 0,029 38 1300 0.7 8,4 12

дам7юь 0,28 13 46 0,78 9 12 0,048 12 250 0,21 16 76 4.8 43 0 89

/ЙРЬе7Иеи 0,008 52 6500 0,032 72 2230 0,009 178 20000 0,087 100 1150 0,61 29 48

|8РЬс71Туг 0,033 5,9 180 0,115 0,42 3,7 0,075 0.58 7 0,26 24 93 1.1 4,2 3.8

дае7Ш5 0,06 14 230 0,052 0,34 6,5 0,085 10 120 0,135 2 50 5.9 12,8 2.6

/9РЬе71Рго 0,3 2,8 9 0,32 1,9 5,9 0,017 9,7 570 0,038 10 270 3.3 0,86 0,26

0,041 17 410 0,06 0.5 8,3 0,008 45 5600 0 016 41 2630 6 20 3,3

1/1

/ •с

ЧУ

¿Г

чу

£

ЧУ Ö-

if

i г

£

/ ©

■Л-

НО)-

у

О

•ö

Ни—))—ю

III

II

Рис. 2 Значения каталитических констант гидролиза субстратов I, V, III и II, катализируемого нативной пенициллинацилазой и ее мутантами по остатку ßPhe71.

субстратной специфичности каталитически активного мутанта (рис. 2). Чрезвычайно важной при этом является возможность увеличения каталитической активности фермента к отдельным субстратам.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что каталитическая активность пенициллинацилазы из E.coli в результате точечной мутации может быть улучшена более чем на порядок и этот факт имеет большое практическое значение.

Однако далеко не все выбранные мутации приводили к улучшению каталитических свойств фермента. Хотя введение мутаций в положение ßPhe71 по сравнению с другими мутациями было наиболее продуктивным и приводило к существенному улучшению каталитических свойств фермента примерно в 20% случаев, большинство мутантов уступало нативному ферменту. При замене фенилаланина ßPhe71 на триптофан наблюдали наиболее сильное снижение эффективности катализа, которое происходило главным образом за счет снижения каталитической активности мутантов (снижение каталитической константы kcat до 70 раз по отношению к субстрату IV), в то время как сродство фермента к исследованным субстратам (за исключением субстрата I) менялось не очень сильно. Мутант ßPhe71Tyr также был менее активным по сравнению с нативным ферментом, однако в этом случае наблюдали не столь сильную потерю

каталитической активности (максимум в 8,4 раза по отношению к субстрату III), а значение константы Михаэлиса Кга изменялось слабо

В связи с возможностью использования пенициллинацилазы как катализатора синтеза новых антибиотиков пенициллинового и цефалоспоринового ряда особый интерес вызывает специфичность мутантов к производным D-фенилглицина, являющимся ацильными донорами при синтезе важнейших Р-лактамных антибиотиков Присутствие аминогруппы в ацильной части приводит к сильному ухудшению сродства пенициллинацилазы к субстрату (сравните данные для нативного фермента по отношению к субстратам I и V в таблице 1) Замена фенилаланина в положении р71 позволяет увеличить специфичность пенициллинацилазы к производным D-фенилглицина, так мутантные ферменты pPhe71Leu и pPhe71Arg превращают субстрат V более эффективно по сравнению с нативным ферментом При этом в случае (3Phe71Leu наблюдается как увеличение каталитической константы, так и сродства фермента к субстрату (снижение Кт), в то время как в случае pPhe71Arg имеет место лишь увеличение к«,, Однако для улучшения эффективности действия пенициллинацилазы как катализатора синтеза новых р-лактамных антибиотиков недостаточно, как это считалось в литературе, улучшить специфичность фермента к остатку D-фенилглицина, необходимо также улучшить эффективность переноса остатка D-фенилглицина на ядра пенициллинов и цефалоспоринов

Изучение способности мутантных ферментов катализировать ацилъный перенос на ядра р-лактамных антибиотиков в водной среде

Наиболее простым количественным путем изучения того, какой эффект оказывает введение мутации по остатку pPhe71 на способность фермента катализировать синтез новых пенициллинов и цефалоспоринов в водной среде было бы определение констант связывания соответствующих нуклеофилов (6-АРА и 7-ADCA) с соответствующими ацилферментами

Однако экспериментальное определение величины константы связывания нуклеофила не представляется возможным Удобной количественной мерой, характеризующей синтетические свойства фермента в таких реакциях, является соотношение экспериментально измеренных начальных скоростей синтеза и гидролиза S/H„a4 анализируя зависимость соотношения S/H„a4 от концентрации нуклеофила можно определить значения комплексных кинетических параметров, которые принято считать количественной характеристикой реакционной способности нуклеофила по отношению к данному ацилферменту В рамках этой методологии были выполнены кинетические эксперименты с двумя различными донорами ацильной части для двух нуклеофилов, представляющих собой ядра пенициллинов и цефалоспоринов 6-АРА или 7-ADCA (таблица 2)

Результаты показывают, что 7-ADCA является более эффективным нуклеофилом в реакциях переноса ацильной группы, чем 6-АРА, причем даже при относительно низкой концентрации нуклеофила 25 мМ ацильный перенос на нуклеофил протекает значительно

Таблица 2 Соотношение начальных скоростей синтеза и гидролиза (8/Н)нач в реакциях с различными донорами ацильной части и нуклеофилами для мутантных ферментов по остат

атку^@Phe71

Фермент D-PGA/7-ADCA D-PGA /6-АРА D-HPGA/6-АРА

натнвный 9±2 1,9 ±0,1 1,2 ±0,04

/0Phe71Tyr 7.5 ± 0.4 0 74 ±0,01 0,61 ±0,03

0Phe71Leu 4,9 ± 0.4 0,94 ± 0,04 0,86 ±0,03

0Phe71Tip 2,9 ±0.2 0,77 ±0.05 0,62 ±0,03

(3Phe71Arg 1,8 ±0.03 0,76 ±0,01 0,45 ±0,01

0Pht71Lys 1,2 ±0,01 0,51 ±0,01 0,46 ± 0,02

0Phe71His 2,4 ± 0,06 0,28 ±0,006 0,23 ± 0,02

0Phe71Qu 3,6 ± 0,4 0,22 ± 0,009 0,20 ± 0.006

Условия проведения эксперимента рН 7 О, 25°С, 0 05 М фосфатный буфер Концентрация доноров ацильной части (D-PGA - амида D-фенилглицина и D-HPGA - амида D-п-оксифенилглицина}- 0,015 М, концентрация нуклеофилов (7-ADCA - 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты и 6-АРА - 6-аминопенициллановой кислоты)- 0,025 М

более эффективно, чем гидролиз ацилфермента Однако замена рР11е71 на другие аминокислотные остатки приводит к снижению способности фермента переносить ацильную группу на ядра пенициллинов и цефалоспоринов, причем более сильный эффект наблюдается в случае 6-АРА, в этом случае все исследованные мутанты становятся более эффективными гидролазами, а не синтетазами В реакциях ацильного переноса на 7-АОСА введение мутаций не приводит к столь резкой потере синтетических способностей, тем не менее, все исследованные мутанты уступали нативной пенициллинацилазе Таким образом, было установлено, что заменой аминокислотного остатка рРЬе71 можно улучшить сродство фермента к производным Б-фенилглицина, однако не удается увеличить эффективность переноса ацильной группы на ядра антибиотиков

Стереоселективность действия мутантных ферментов при гидролизе ТЯ-фенипацетилъных производных аминокислот

Для характеристики стереоспецифичности действия фермента необходимо иметь удобный метод определения индивидуальных энантиомеров субстрата или продукта в ходе ферментативной реакции Одним из наиболее удобных способов определения индивидуальных энантиомеров аминосоединений является метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с предколоночной модификацией аминогрупп реагентом, состоящим из о-фталевого альдегида и оптически активного тиолсодержащего соединения Подход основан на быстрой и эффективной модификации первичных аминогрупп хиральным реагентом и последующем разделении образующихся диастереомерных изоиндолов на ахиральной стационарной фазе, однако метод, описанный в литературе, работает далеко не для всех аминосоединений

Новый оптически активный тиоловый реагент №фенилацетил-(11)-фенилгл11цил-(8)-цистеин для определения индивидуальных энантиомеров амин осоед инений

Был синтезирован и предложен новый оптически активный тиоловый реагент N-фенилацетил-(11)-фенилглицил-(8)-цистеин, который можно использовать для определения энантиомеров более широкого ряда аминосоединений, чем классический N-ацетил-(8)-цистеин При использовании нового SH-реагента метод характеризуется хорошим разделением, чувствительностью, воспроизводимостью сигнала и может быть использован для количественного определения энантиомеров первичных аминосоединений как в индивидуальных препаратах, так и в реакционных смесях В дальнейшей работе новый реагент использовали для определения кинетических параметров реакции гидролиза стереоизомеров N-ацильных производных аминокислот, катализируемого нативной и мутантными пенициллинацилазами

Поскольку по имеющимся структурным данным остаток ßPhe71 располагается в области связывания уходящей группы, можно было ожидать, что введение точечной мутации по этому остатку повлияет на эффективность действия фермента по отношению к стереохимическим изомерам субстратов Энантиоселективность действия мутантов пенициллинацилазы исследовали в реакции гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот (таблица 3)

В реакции гидролиза L- и D-энантиомеров N-фенилацетильного производного фенилглицина нативная пенициллинацила из Е coli проявляет достаточно хорошую хиральную дискриминацию энантиомеров субстрата Однако замена остатка ßPhe71 на глутаминовую кислоту, и особенно на лизин, приводит к существенному увеличению энантиоселективности действия фермента Причем если мутант ßPhe71Lys обладал практически таким же значением k^/Kn, в реакции гидролиза L-энантиомера субстрата как и нативный фермент, то каталитическая эффективность превращения D-субстрата под действием мутанта была значительно ниже При замене ßPhe71 на лизин повышалось сродство к специфическому L-энантиомеру, в то время как при замене ßPhe71 на глутаминовую кислоту наблюдали повышение сродства к неспецифическому D-энантиомеру Для мутанта ßPhe71Glu наблюдалось также заметное снижение эффективности превращения обоих энантиомеров субстрата, однако реакционноспособность гидролиза D-энантиомера снижалась в большей степени, что и приводило к увеличению хиральной дискриминации Замены остатка фенилаланина на тирозин, гистидин и триптофан мало изменяли энантиоселективность пенициллинацилазы, но по-разному влияли на активность фермента по отношению к энантиомерам субстрата

В случае мутантных ферментов ßPhe71Leu и ßPhe71Arg стереоселективность снижалась почти на порядок, при этом для ßPhe71Leu ухудшение хиральной дискриминации фермента было обусловлено в основном улучшением кинетических параметров (как значения kcat, так и Кт ) гидролиза неспецифического D-энантиомера

Таблица 3 Изучение стереоселективности в реакции гидролиза Ы-фенилацетильного производного фенилглицина, катализируемой нативной пенициллинацилазой из Е сок и мутантными ферментами по остатку рРЬе71

фермент O-^-OH CuCO k«t. c"1 Km, «М мМГ'с"1 k

[WK„,k

нативвый L 111 0,017 6500 1960

D 0.И 0,033 3,3

/?Phe71Lys L 27,5 0,005 5500 12000

E> 0,14 0,3 0,46

£Phe71GIu L 24 0,025 960 5800

D 0,075 0,45 0,17

(8Phe71Leu L 30 0,004 7500 220

D 0,4 0,012 30

№hc71Tyr L 32 0,02 1600 2380

D 0,074 0,11 0,67

0Phe71 Arg L 20 0,0088 2270 300

Ь 0,23 0.03 7,4

/SPhe71Trp L 15 0,003 5000 1700

D 0,145 0,049 3

0Phe71HIs L 30 0,0065 4600 2100

D 0,064 0,028 2.8

Этот мутантный фермент показал наиболее сильное увеличение эффективности катализа при превращении субстратов с различными уходящими группами (наблюдали увеличение эффективности катализа в 140-150 раз), однако при этом терял способность к хиральной дискриминации

В реакции гидролиза L- и D-энантиомеров N-фенилацетильных производных аспарагина и аспарагиновой кислоты, т е в том случае, когда хиральная дискриминация субстратов представляет очень сложную задачу, некоторое увеличение энантиоселективности действия фермента наблюдали только для мутантного фермента pPhe71Leu Способность к хиральной дискриминации субстратов у всех остальных мутантных ферментов снижалась, причем для мутантов pPhe71Tyr и pPhe71His наблюдали увеличение кса1 для неспецифического D-энантиомера, что в конечном итоге и приводило к падению энантиоселективности на порядок Следует отметить, что хотя энантиоселективность гидролиза N-фенилацетильных производных аспарагиновой кислоты для мутанта pPhe71Glu ухудшается только в 2 раза, замена фенилаланина на

глутаминовую кислоту приводит к снижению к^, в 6 раз для Ь-энантиомера, и ухудшению связывания обоих энантиомеров субстратов (в случае Б-энантиомера Кт увеличивается сильнее) Для мутантных ферментов рРЬе71Ьуз, рР11е71А^ отмечается улучшение связывания обоих энантиомеров в активном центре фермента и заметное снижение кса, для специфического Ь-энантиомера Присутствие аминогрупп в боковых цепях в этом случае, возможно, приводит к появлению дополнительных электростатических взаимодействий с карбоксильными группами и непродуктивному связыванию субстрата

Таким образом, показано, что замена лишь одного остатка рРИе71 позволяет регулировать как каталитическую активность и энантиоселективность действия, так и эффективность ее использования в синтезе антибиотиков Интересным оказался тот факт, что для мутантного фермента рРЬе71Ьеи, демонстрирующего наибольший «прирост» каталитической активности, характерно сильное падение энантиоселективности При этом для других мутантных ферментов она может быть увеличена Полученный опыт говорит о том, что путем мутации остатка рРЬе71 не удается одновременно улучшить все исследуемые каталитические свойства, а только некоторые из них Возможность создания мутантных ферментов с более высокой энантиоселективностью представляет особый интерес так как дает перспективу разработки биокаталитических методов получения аминокислот очень высокой энантиомерной чистоты

Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку рРИе57

Центр связывания ацильной части представляет собой узкую щель, образованную боковыми цепями отдельных гидрофобных остатков, принадлежащих как а-, так и Р-цепи Фенилаланин рРЬе57 располагается на дне полости гидрофобного кармана

Хотя наименьшее расстояние между ним и ингибитором составляет 4 7 А, что слишком много для прямого

взаимодействия, этот остаток может быть важен для поддержания структуры участка связывания, поскольку находится на растоянии 3 5 А от рРго22 и на 3 9 А от рРЬе24, непосредственно участвующих в связывании субстрата

Эффективность катализа при замене остатка в положении Р57 (таблица 4) снижалась для всех мутантных ферментов

Особенно сильное падение каталитической активности (в 54 раза) и ксм/Кш в 2080 раз наблюдали для мутантного фермента рРЬе57Туг, который отличается от нативной пенициллинацилазы наличием в боковой цепи остатка р57 ОН-группы Замена фенилаланина на другие гидрофобные остатки (триптофан, лейцин и аланин) приводила к падению каталитической активности в 2,8, 1,8 и 2 раза, соответственно В результате

Таблица 4 Сравнение кинетических параметров для мутантного по остатку рРЬе57 и нативного фермента при гидролизе п-нитро-м-карбоксианилида фенилуксусной кислоты

фермент Кю, тМ к«!, с"1 к^Я^мМГ'с'1

нативный 0.037 17,7 480

/6РЬе57Тгр 0,1 6,4 64

(5РЬс57Туг 1,44 0,33 0,23

0РЬе57А1а 0,076 8,8 120

ДРЬе57Ьеи 0,074 10 135

проведенного нами исследования мутантных ферментов не удалось обнаружить какого-либо улучшения каталитических свойств при введении мутаций в положение ß57, и таким образом можно сделать вывод о том, что наличие фенилаланина в этом положении является оптимальным

Синтез ß-лактамных антибиотиков методом ацильного переноса в водной среде, катализируемого пенициллинацилазами

Эффективность реакции переноса ацильной группы на нуклеофил, катализируемой пенициллинацилазой, зависит от ограниченного набора параметров FNu=f(a, ß0, у, n0, s0), где а отражает специфичность пенициллинацилазы к целевому продукту и донору ацильной части, ßo - относительную реакционную способность нуклеофила и воды при превращении ацилфермента, у - соотношение скоростей гидролиза и синтеза при превращении комплекса ацилфермент-нуклеофил Особенностью синтеза ß-лактамных антибиотиков, катализируемого нативной пенициллинацилазой из Е coli, является то обстоятельство, что хотя а больше единицы (то есть целевой продукт в принципе гидролизуется лучше, чем исходный донор ацильной части) возможно получение ß-лакгамных антибиотиков с хорошим выходом Это становится возможным благодаря оптимизации ферментативного ацильного переноса на основе глубокого понимания кинетики этого процесса, а также выведения целевого антибиотика и побочного продукта D-PG в осадок

Анализ структурных данных показывает, что пенициллинацилаза из Е coli подвергается конформационным изменениям в районе остатков <xMetl42-aPhel46 при связывании объемных субстратов в активном центре, а остатки aArgl45 и aPhel46 играют особую роль, контролируя переход между открытой и закрытой конформациями активного центра (Alkema, W В L , Hensgens, С M H , Kroezmga, Е H , De Vries, E , Fions, R, Van der Laan, J -M , Dykstra, В W and Janssen, DB// Protein Eng, 2000, v 13, p 857863, McVey, С E , Walsh, M A , Dodson, G G , Wilson, К S , Brannigan J A // J Mol Biol, 2001, v 313, p 139-150) Процесс перестройки активного центра фермента может влиять и на область связывания ß-лактамных нуклеофилов, которая, судя по литературным данным и результатам молекулярного моделирования, также включает в себя остатки aArgl45 и aPhel46 Эти остатки являются привлекательными мишенями для сайт-направленного мутагенеза с целью получения ферментов с улучшенными каталитическими свойствами С целью выяснения роли остатков aArgl45 and aPhel46 в реакции переноса ацильной группы на ядра пенициллинов и цефалоспоринов был проведен насыщающий мутагенез (замена на все 19 аминокислотных остатков) и изучены каталитические свойства мутантов как катализаторов ацильного переноса

Исследование ферментов с точечной мутацией по остаткам aPliel46 и aArgl45

При насыщающем мутагенезе фермента по остатку aPhel46, все 19 мутантов обладали низкой каталитической активностью Предварительные исследования реакций ферментативного синтеза ампициллина в разбавленных растворах показали, что у большинства мутантных ферментов в принципе возрастает способность к переносу ацильной группы на ядро пенициллинов (увеличивается соотношение S/Hmax по

сравнению с нативным ферментов), однако каталитическая активность падает по крайней мере на порядок, что не позволяет детально исследовать их свойства как катализаторов ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков

В то же время обнаружено, что при насыщающем мутагенезе фермента по остатку aAIgl45 практически все мутанты демонстрируют способность катализировать ацильный перенос на ядра пенициллинов и цефалоспоринов более эффективно по сравнению с нативной пенициллинацилазой Более того, замена аргинина на другие остатки (за исключением остатков, несущих отрицательный заряд в боковой цепи) не сопровождалась столь существенной потерей каталитической активности как при получении мутантов по остатку аРЬе146 Для детального исследования кинетики ферментативного ацильного переноса на ядра пенициллинов и цефалоспоринов были выбраны три наиболее перспективных мутантаых фермента осАг§1458ег, осАг§145Ьеи и аА^14501у и в серии экспериментов определены основные кинетические параметры ферментативного синтеза а, р0 и у, полностью характеризующие эффективность переноса ацильной группы на внешний нуклеофил

Из представленных данных (таблица 5) видно, что для мутантных ферментов происходит значительное улучшение параметров, характеризующих реакционную способность нуклеофила (ро и у,), которое сопровождается некоторым ухудшением параметра а, характеризующего относительную специфичность фермента по отношению к продукту реакции и ацильному донору Для того, чтобы посмотреть каким образом изменение каталитических свойств фермента при мутации отразится на препаративном синтезе, мы провели серию экспериментов по синтезу ампициллина при высоких концентрациях субстратов, т е условиях, приближенных к промышленным (Таблица 5)

В случае всех трех мутантных пенициллинацилаз наблюдали существенное увеличение выхода ампициллина и снижение концентрации Б-РО (нецелевого продукта, образующегося при гидролизе Б-РвА) (рис 3) Использование мутантных ферментов позволило до 16 % увеличить долю 6-АРА, превращаемой в ампициллин, и снизить нецелевые потери БРвА на 29-56%

Таблица 5 Сравнение параметров а, р0 и у для нативного фермента и мутантных ферментов аА^1458ег, аА^145Ьеи и аА^145С1у

фермент [Апроши, мМ^ Активность фермента относительно нагивной пенициллинацилазы, % аБ /

нашвный V 1,4 100 7,7 0,08 0,14

оА^1450у 3,6 7,2 28 29 0,42 0,04

аАг£1458ег 3,3 6Л 16 14 0,35 0,05

аАг^1451хи 2,8 4,8 42 15 0,28 0,06

АУсловия проведения синтеза ампициллина О-РСА 0,015 М, 6-АРА 0,025 М, 0,05 М фосфатный буфер, рН 7, 25° С

^Условия эксперимента 6-АРА от 0,00125 до 0,035 М, О-РСА 0,015 М, 0,05 М фосфатный буфер, рН 7, 25° С

1, мин г, мин

I, мин Ъ мин

Рис. 3 Синтез ампициллина, катализируемый нативным ферментом и мутантами пенициллинацилазами aArgl45Ser, aArgl45Leu и аА^14501у. Обозначения: ( -•- ) ампициллин, (—) Б-фенилглицин. Условия проведения синтеза ампициллина: 0.3 М Э-РвА, 0.1 М 6-АРА, рН 6.3, 25° С

Снижение доли гидролиза Б-РвА делает интерессным использование этих мутантных пенициллинацилаз в ступенчатых синтезах ампициллина с дополнительным внесением ! донора ацильной части в ходе реакции. Для дальнейшего исследования был выбран мутантный фермент аАг§145Ьеи.

Характеристика мутантного фермента аА^145Ьеи как катализатора синтеза антибиотиков в водной среде

Определение кинетических параметров ферментативного ацильного переноса а, р0 и у проводили в условиях, которые представляют интерес для моделирования и оптимизации реальных промышленных процессов. В таблице 6 приведены значения кинетических параметров ферментативного гидролиза донора ацильной группы, а также ампициллина и цефалексина, являющихся продуктами исследуемого ферментативного ацильного переноса.

Представленный данные позволяют определить один из важных комплексных кинетических параметров ферментативного ацильного переноса - параметр а, характеризующий специфичность биокатализатора. Сравнение кинетических параметров

для мугантного фермента аАг§1451хи и нативного фермента показывает, что мутантный фермент проявляет более высокое сродство как к ацильному донору, так и продуктам ферментативного синтеза В то же время каталитическая активность мутанта аА^145Ьеи по отношению к ацильному донору уменьшается сильнее (в 5,8 раз), чем по отношению к Р-лактамным антибиотикам (в 2,3-2,7 раза) В конечном итоге такое изменение каталитических свойств пенициллинацилазы при мутации остатка аА^145 приводит к увеличению параметра а для мутантных ферментов (таблица 7), что осложняет проведение ферментативного синтеза в водной среде

Таблица 6 Параметры реаций гидролиза донора ацильной части (Б-РвА) и целевых антибиотиков

А Гидролиз Б-РОА

фермент ксаь с"1 Кш,мМ к,Дт, с'МГ1

нативный 21 54 390

аА^1451.еи 3,6 22 160

Б Гидролиз ампициллина

фермент с"' Кш,мМ к^/Кт, с'Ы1

нативный 21 3,3 6400

осА^1451,еи 9 2 4500

В Гидролиз цефалексина

фермент кс.ь с'1 Кгп, мМ к«,/Кт, С'М"1

нативный 23 0,5 46000

<хАг5145Х.еи 8,5 0,2 42500

В конечном итоге такое изменение каталитических свойств пенициллинацилазы при мутации остатка аА^145 приводит к увеличению параметра а для мутантных ферментов (таблица 7), что осложняет проведение ферментативного синтеза в водной среде Таблица 7 Параметры а, р0, у, определяющие эффективность переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил, катализируемого пенициллинацилазой

фермент ампициллин цефапексин

РоЖ1 У аО-РОА Ро.ЗиГ1 У

нативный 16 60 0,06 120 380 0,012

аАг§145Ьеи 27 280 0,02 260 1000 0,001

Математическое моделирование реакций ацильного переноса в водной среде с использованием определенных нами значений кинетических параметров для нативной пенициллинацилазы, а также для мутантных ферментов (таблицы 5 и 7) позволило сравнить эффективность использования различных форм фермента как катализаторов препаративного синтеза двух важнейших антибиотиков пенициллинового и цефалоспоринового ряда - ампициллина и цефалексина Математическое моделирование показало, что использование наиболее активных мутантов фермента по остатку aArgl45 должно привести к более эффективному синтезу ампициллина и цефалексина в широком диапазоне экспериментальных условий Результаты экспериментальной проверки этого предсказания представлены в таблице 8

Таблица 8 Сравнение эффективности катализа нативной Данные о

пенициллинацилазы из Е coli и мутантного фермента aArgl45Leu в синтезе выходе по ампициллина и цефалексина донору и

нуклеофилу, также

соотношени концентраци целевого антибиотика и побочного продукта D-PG

представлень в точке максимума накопления антибиотика для каждого синтеза

Условия проведения синтеза фермент Рнш% PDo»o„% S/H„„ [D-PGL«.M

0,05 MDPGA+ 0,05 М б-АРА, рН=б,3, 25° С нативный 22,7 22,7 0,69 0,017

aArgl45Leu 28,8 28,8 1,03 0,014

0,1 М DPGA+ 0,1 М б-АРД рН=6,3, 25° С натавный 36,1 36,1 1,13 0,032

aArgl45Leu 37,4 37,4 1,42 0,026

0,5 MDPGA+ 0,3 М б-АРА рН=6,3, 25° С нативный 78 46,8 1,44 0,16

aArgl45Leu 92 55,2 3,35 0,083

0,25 MDPGA+ 0,2 M7-ADCA рН=б,3, 25° С нативный 59,3 47,4 2,04 0,058

0tArgl45Leu 71,3 57,1 1,77 0,08

Важным фактором, который удается использовать для увеличения эффективности ацильного переноса на ядра Р-лактамных антибиотиков, катализируемого мутантными формами пенициллинацилазы по остатку аА^145, является низкая растворимость целевого продукта, что, при избытке донора ацильной части позволяет снизить негативный эффект увеличения параметра а и получить более высокие выходы по сравнению с нативным ферментом

Изучение стереоселективности мутантного фермента аА^145Ьеи

Рентгеноструктурные данные указывали на то, что остаток аА^145 участвует во взаимодействии с уходящей группой субстрата, а, следовательно, может влиять на ориентацию субстрата и участвовать в механизме хиральной дискриминации субстратов Полученные нами данные по изучению способности мутантов катализировать реакции ацильного переноса показали, что мутанты по остатку аА^145 проявляют высокую каталитическую активность как по отношению к ацильным донорам, так и к р-лактамным

антибиотикам и в связи с этим представляют интерес изучение энантиоселективности их действия в реакциях гидролиза Ы-ацильных производных аминокислот Оказалось, однако, что введение мутаций в положение аА^145 приводит к изменению профиля субстратной специфичности пенициллинацилазы и каталитическая активность в реакциях гидролиза Ы-фенилацетильных производных падает в большей степени, чем каталитическая активность по отношению к р-лактамным антибиотикам Примечательно, что активность мутанта аАг§145Ьеи по отношению как к Ь-, так и О-энантиомеру Ы-фенилацетил-фенилглицина падала примерно на порядок и в результате энантиоселективность мутанта практически не изменялась по сравнению с нативным ферментом В случае гидролиза К-фенилацетил-аспарагиновой кислоты наблюдали еще более сильное падение каталитической активности фермента при введении мутации, однако в этом случае падение активности к энантиомерам субстрата происходила неравномерно, и в итоге наблюдали снижение энантиоселективности фермента в 4 раза Очевидно, элиминирование положительного заряда в активном центре пенициллинацилазы снижает способность фермента к хиральной дискриминации В связи с низкой каталитической активностью в реакциях этого типа, а также пониженной энантиоселективнсотью действия по сравнению с нативным ферментом мутантные пенициллинацилазы по остатку аА^145 вряд ли будут представлять интерес как катализаторы для препаративного использования

ВЫВОДЫ

1) Введение мутаций в положения рРЬе57, рРЬе71, аА^145 и аРЬе146 позволяет получить каталитически активные мутанты пенициллинацилазы, причем некоторые из них превосходят по своим свойствам нативный фермент

2) Введением мутаций по остатку рР11е71 можно изменить субстратную специфичность пецициллинацилазы и увеличить каталитическую активность замены рРЬе71Ьеи и рРЬе71Ьуз приводят к увеличению каталитической эффективности действия мутантных ферментов более чем на два порядка, причем эффект улучшения каталитических свойств сильно зависит от структуры превращаемого субстрата

3) Замена фенилаланина на другие аминокислотные остатки в положении рРЬе71 изменяет энантиоселективность фермента, причем в зависимости от природы вводимого остатка и структуры субстрата энантиоселективность может быть как увеличена, так и уменьшена

4) Замена остатка рРЬе57 приводит к потере эффективности действия фермента, не обнаружено улучшения ни одного из исследованных свойств фермента при мутагенезе этого остатка

5) При замене остатка аРЬе14б можно получить мутантные ферменты, способные более эффективно катализировать перенос ацильной группы на ядра р-лактамных антибиотиков, однако практически все мутантные ферменты в этом ряду обладают низкой каталитической активностью

6) Эффективным путем улучшения синтетических свойств фермента является замена остатка аАг§145 наиболее эффективными мутантами являются аАг§1458ег, аАг§145Ьеи и аА^14501у, при их использовании в качестве катализаторов синтеза

ампициллина удается получить более высокие выходы целевого антибиотика (увеличение выхода до 16 %) и снизить нецелевые потери донора ацильной части на 29-56%

7) Предложен новый оптически активный тиоловый реагент №фенилацетил-(Я)-фенилглицил-(8)-цистеин, применение которого позволяет улучшить эффективность хирального анализа аминосоединений и изучать ряд ранее недоступных для количественного исследования реакций энантиоселективного превращения

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 SAW Jager, I.V. Shapovalova, P A Jekel, W В L Alkema, V К Svedas and D В Janssen Saturation mutagenesis reveal the importance of residues aR145 and aF146 of penicillin acylase m the synthesis ofp-lactam antibiotics//J Biotechnol, 2007, V 133 P 18-26

2 Гуранда Д T, Шаповалова И.В., Швядас В К Новое N-ацильное производное (S)-цистеина для количественного определения энантиомеров аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией орто-фталевым альдегодом // Биоорганическая химия 2004 т 30 №5 С 1-7

3 И.В. Шаповалова Каталитические свойства мутантов пенициллинацилазы // Материалы 1-ого Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» Москва 2002 С 442-443

4 Shapovalova I.V., Alkema W В L , de Vnes E , Guranda D T , Janssen D В , Svedas V К Mutation of residues 0F71 of Escherichia coll penicillin acylase results in altered specificity and improved catalytic properties // Abstracts of Int Conf "Biocatalysis-2002 Fundamentals and applications" Moscow, Russia 2002 P 152

5 Guranda D T, Kudiyavtsev P A , Khimiuk A J, Pchehntsev N A , Shapovalova I.V., Svedas V К New chiral thiols for HPLC determination of enantiomers of primary amines after pre-column modification with o-phthaldehyde// Abstracts of Int Conf "Biocatalysis-2002 Fundamentals and applications" Moscow, Russia 2002 P 88

6 Чилов Г Г, Юшко М И, Буханов А Л, Шаповалова И.В., Швядас В К Нетрадиционные пути ферментативной модификации и синтеза бета-лактамных антибиотиков // Материалы 2-ого Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» Москва 2003 часть 2, С 183-184

7 Буханов А Л, Шаповалова И.В., Юшко М И Влияние ионной силы и природы неорганических анионов на кинетику реакций ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой // Материалы XI Международной конференции "Ломоносов-2004" Москва, Россия 2004, С 9

Подписано в печать 10 10 2007 Формат 60x88 1/16 Объем 1 п л. Тираж 150 экз Заказ № 671 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Список сокращений

Введение

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8 1.1. Антибиотики, как эффективные антиинфекционные препараты

1.1.1.0 механизме действия ß-лактамных антибиотиков 11 1.1.2 Полусинтетические антибиотики

1.2 Пенициллинацилаза из E.coli

1.2.1 Структура пенициллинацилаз из Е. coli

1.2.2 Каталитический механизм

1.2.3 Субстратная специфичность пенициллинацилаз

1.2.4 Строение участка связывания ацильной части субстрата (pl)

1.2.4.1 Ингибирование пенициллинацилаз производными фенилуксусной кислоты

1.2.5 Участок связывания нуклеофила

1.2.5.1 Изучение участка связывания боковой группы субстрата (р2)

1.2.5.2 Изучение участка связывания карбоксильной группы субстрата (рЗ)

1.2.6 О pH-зависимости каталитической активности

1.2.7 Кинетическая схема реакций ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой из Е. coli

1.3 Изучение структурно-функциональных взаимосвязей в пенициллинацилазе 34 1.3.1 Об опыте использования сайт-направленного мутагенеза с целью улучшения пенициллинацилазы для синтеза ß-лактамных антибиотиков

1.3.2Использование новейших технологий для изучения ПА из E.coli

1.4 Исследование субстратной специфичности и изучение кинетики мутантных ферментов

1.4.1 Мутагенез, основанный на анализе аминокислотной последовательности

1.4.2 Случайный мутагенез

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Сайт-направленный мутагенез пенициллинацилазы из E.coli

2.2.2 Экспрессия и очистка мутантных ферментов

2.2.3 Определение концентрации активных центров нативной пенициллинацилазы

2.2.4 Определение концентрации активных центров мутантных пенициллинацилаз

2.2.5 Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза цветных субстратов

2.2.6 Синтез М-фенилацетил-(11)-фенилглицил-(8)-цистеина

2.2.7 Предколоночная модификация аминогрупп о-фталевым альдегидом

2.2.8 ВЭЖХ-анализ 61 2.2.90пределение константы Км в реакции гидролиза

М-фенилацетильных производных аминокислот

2.2.10 Определение ккат гидролиза М-фенилацетильных производных аминокислот под действием пенициллинацилаз

2.2.11 Определение концентрации свободных аминогрупп

2.2.12 Изучение стабильности пенициллинацилазы

2.2.13 Хроматографический анализ реакционной смеси при синтезе антибиотиков

2.2.14 Ферментативный синтез ампициллина, катализируемый нативной и мутантными пенициллинацилазами в гомогенной водной системе

2.2.15 Ферментативный синтез цефалексина, катализируемый мутантной пенициллинацилазой аА^145Ьеи

2.2.16 Определение кинетических параметров реакции ферментативного синтеза ампициллина и цефалексина

2.2.17 Определение реакционной способности 6-АРА как нуклеофила в реакции синтеза ампициллина

2.2.18 Определение реакционной способности 7-АБСА как нуклеофила в реакции синтеза цефалексина

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение

3.1 Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку рРЪе

3.1.1 Профиль субстратной специфичности и каталитической эффективности действия мутантных ферментов

3.1.2 Изучение способности мутантных ферментов катализировать ацильный перенос на ядра р-лактамных антибиотиков в водной среде

3.1.3 Изучение стабильности мутантных ферментов в щелочной и кислой среде

3.1.4 Стереоселективность действия мутантных ферментов при гидролизе >1-фенилацетильных производных аминокислот

3.1.4.1 Новый реагент М-фенилацетил-(К)-фенилглицил-(5)-цистеин для предколоночной модификации с о-фталевым альдегидом при определении отдельных энантиомеров

3.1.4.2 Стереоселективность действия фермента

3.2 Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку рРЬе

3.3 Синтез Р-лактамных антибиотиков методом ацильного переноса в водной среде, катализируемого пенициллинацилазами

3.4 Исследование каталитических свойств ферментов с точечной мутацией по остаткам аРЬе 146 и аА

§

3.4.1 Изучение стабильности мутантных ферментов

3.4.2 Способность мутантных ферментов катализировать ацильный перенос

3.4.3 Характеристика мутантного фермента аА^145Ьеи как катализатора синтеза антибиотиков в водной среде

3.4.4 Изучение субстратной специфичности и каталитической активности мутантных ферментов

3.4.5 Изучение стереоселективности мутантного фермента аА^145Ьеи

Актуальность проблемы фармацевтической Пенициллинацилаза из Е. соИ широко используется в Появление структурных данных, а также промышленности. разностороннее исследование каталитических свойств пенициллинацилаз из различных источников позволило задуматься о получении пенициллинацилаз с измененными свойствами. Совместный анализ ранее накопленных данных о взаимосвязи строения субстратов и эффективности их каталитического превращения, а также структуры пативной пенициллинацилазы, аналогов фермент-субстратного комплекса и комплексов с ингибиторами нозволяет очертить круг тех аминокислотных остатков, которые могут определять специфичность и хиральную дискриминацию субстратов в активном центре, а также участвовать предоставляет в механизме действия фермента. Сайт-направленный мутагенез действия и форм тонкой возможность выявления роли этих остатков в механизме понимания природы субстратной ненициллинацилазы, энантиоселективности ненициллинацилазы химической катализаторы, специфичности мутантных и ее действия. В то же время получение представляет большой поскольку нативный интерес таким фермент. для путем Таким медицинской могут быть промышленности, превосходяш;ие получены и образом, получение характеристика мутантных форм пенициллинацилазы имеет как фундаментальное, так и практическое значение. Целью настоящей работы Целью настоящего исследования явилось: сайтструктурных направленный мутагенез остатков, которые на основании имеющихся данных могут играть важную роль в механизме действия фермента и онределять его специфичность специфичности (pPhe71, pPhe57, aArgl45 и aPhel46); изучение субстратной полученных мутантных пенициллинацилаз, характеристика стереоселективности их действия в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производпых аминокислот, выявление методом быстрого скрининга перспективных мутантов для использования в синтезе антибиотиков, детальное кинетическое исследование реакций переноса ацилыюй группы на добавленный нуклеофил, катализируемых наиболее активными мутантами, их использование в препаративном синтезе ампициллина и цефалексина. Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований мутантных субстратная были впервые охарактеризованы каталитические свойства более 30 форм пенициллинацилазы из Е. соИ: их специфичность и эпантиоселективность каталитическая действия, активность, способность катализировать ацильный перенос на ядра пенициллинов и цефалоспоринов. Показано, что ряд мутантных ферментов по остатку pPhe71 обладают измененным субстратным профилем и более высокой специфичностью по отпошению к остатку D-фенилглицина, причем каталитическую активность фермента к субстрату удается повысить более чем в 10 раз. Введением мутаций в положение pPhe71 (в зависимости от природы вводимого остатка) можно повысить или понизить стереоселективность гидролиза N-фенилацетильных производных фермента в реакциях Охарактеризована аминокислот. возможность иснользования мутантных ферментов в качестве катализаторов синтеза важных Р-лактамных антибиотиков ампициллина и цефалексина; показано, что замена остатка pPhe57, являющегося важным составным фрагментом узкого гидрофобного кармана для связывания ацильной части субстрата, приводит к снижению эффективности связывания субстрата на несколько порядков. В то же время замена остатков aArgl45 и aPhel46 может улучшить эффективность ацильного переноса на ядра ненициллииов и цефалоспоринов. Методом мутантные ферменты быстрого скрининга выбраны aArgl45 и aPhel46 наиболее и нерснективные детальное по остаткам проведено исследование их каталитических свойств с целью выявления оптимальпых условий синтеза антибиотиков. Определены количественные параметры, определяющие эффективность переноса ацильной группы на добавленый нуклеофил нри иснользовании данных мутантов ненициллинацилазы в качестве катализатора. Три мутантные формы фермента по остатку aArgl45, показавшие наиболее эффективные свойства при синтезе ампициллина и цефалексина по сравнению с нативной пенициллинацилазой, использованы в качестве катализаторов нренаративного процесса. Показано, что нри использовании этих мутантных форм можно нолучить более высокий выход целевого продукта с меньшими нецелевыми нотерями донора ацильной части при синтезе ампициллина. Детально охарактеризована также субстратная и стереоспецифичность действия одного из «улучшенных» мутантных ферментов этой грунпы aArgl45Leu в реакциях гидролиза. Предложен новый оптически активный тиоловый реагент Nфенилацетил-(Я)-фенилглицил-(8)-цистеин для хирального анализа аминокислот и определения энантиоселективности действия пенициллинацилазы и ее мутантов.

выводы

1) Введение мутаций в положения рРЬе57, рРЬе71, аАг§145 и аРЬе146 позволяет получить каталитически активные мутанты пенициллинацилазы, причем некоторые из них превосходят по своим свойствам нативный фермент.

2) Введением мутаций по остатку рРЬе71 можно изменить субстратную специфичность пецициллинацилазы и увеличить каталитическую активность: замены рРЬе71Ьеи и рРЬе71Ьуз приводят к увеличению каталитической эффективности действия мутантных ферментов более чем на два порядка, причем эффект улучшения каталитических свойств сильно зависит от структуры превращаемого субстрата.

3) Замена фенилаланина на другие аминокислотные остатки в положении рРЬе71 изменяет энантиоселективность фермента, причем в зависимости от природы вводимого остатка и структуры субстрата энантиоселективность может быть как увеличена, так и уменьшена.

4) Замена остатка рРЬе57 приводит к потере эффективности действия фермента; не обнаружено улучшения ни одного из исследованных свойств фермента при мутагенезе этого остатка.

5) При замене остатка аРЬе146 можно получить мутантные ферменты, способные более эффективно катализировать перенос ацильной группы на ядра Р-лактамных антибиотиков, однако практически все мутантные ферменты в этом ряду обладают низкой каталитической активностью.

6) Эффективным путем улучшения синтетических свойств фермента является замена остатка <хАг£145: наиболее эффективными мутантами являются аА^1458ег, аА^145Ьеи и аА^14501у, при их использовании в качестве катализаторов синтеза ампициллина удается получить более высокие выходы целевого антибиотика (увеличение выхода до 16 %) и снизить нецелевые потери донора ацильной части на 29-56%.

7) Предложен новый оптически активный тиоловый реагент Ы-фенилацетил-(К)-фенилглицил-(8)-цистеин, применение которого позволяет улучшить эффективность хирального анализа аминосоединений и изучать ряд ранее недоступных для количественного исследования реакций энантиоселективного превращения.

Выражаю благодарность: Проф. Д.Б. Янссену и его сотрудникам Э. де Врису, В.Б.Л. Алкеме и С.А.В. Джагеру за совместную работу по получению мутантных пенициллинацилаз (факультет биохимии Гронингенского Института биомолекулярных наук и биотехнологии, Гронингенский Университет, Нидерланды),

Д.Т. Гуранде за консультации при работе по разработке нового оптически активного тиолового реагента К-фенилацетил-(Я)-фенилглицил-(8)-цистеина,

М.И. Юшко за консультации по моделированию и оптимизации ферментативного синтеза ампициллина и цефалексина,

Своим подным и близким за моральную поддержку.

3.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы было исследовано влияние замены остатков, которые на основании имевшихся структурных данных могли играть важную роль в механизме действия фермента и определять его специфичность (pPhe71, pPhe57, aArgl45 и aPhel46). При исследовании субстратной специфичности мутантных ферментов по остаткам pPhe71 и pPhe57 было обнаружено, что замена pPhe71 на другие остатки, содержащие различные функциональные группы в своей боковой цепи, существенно меняет субстратный профиль фермента. Для мутантных ферментов pphe71Leu и pPhe71Lys наблюдали существенное (до 150 раз) улучшение субстратной специфичности к отдельным субстратам.

Установлено, что остаток pPhe57, находящийся на дне гидрофобного кармана, является оптимальным для фермента, и введение остатков, содержащих в своей боковой цепи как более объемные, так и небольшие гидрофобные радикалы, приводит к снижению каталитической активности и специфичности фермента.

При исследовании влияния замены остатка pPhe71 на стереоспецифичность действия фермента в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот было установлено, что, в зависимости от природы аминокислотного остатка в этом положении, стереоселективность может как увеличиться, так и уменьшиться. Наиболее сильный эффект обнаружен в реакции гидролиза N-фенилацетильного производного фенилглицина, когда энантиоселективность в зависимости от введенной мутации менялась в диапазоне от 300 до 12000, в то время как нативная пенициллииацилаза по отношению к этому субстрату имела энантиоселективность равную 1960; для мутантных ферментов pPhe71Lys и pPhe71Glu стереоселективность увеличивалась в 6 и 3 раза, соответственно, по сравнению с нативным ферментом.

При исследовании синтетических свойств мутантных ферментов по остатку pPhe71 установили, что при замене этого остатка эффективность фермента катализировать ацильный перенос на внешние нуклеофилы снижается.

При изучении замены остатков aPhel46 и aArgl45 обнаружена возможность увеличения синтетического потенциала пенициллинацилазы. С помощью метода быстрого скрининга бьш определен ряд наиболее перспективных мутантов для последующего детального исследования. Установлено, что хотя в результате мутации остатка aPhel46 и удается увеличить эффективность переноса на внешний нуклеофил, однако такие мутанты представляют скорее только научный интерес, поскольку обладают значительно более низкой каталитической активностью, чем нативный фермент. В то же время замена остатка аАг§145 является значительно более перспективной для увеличения синтетического потенциала пенициллинацилазы. После первоначального скрининга мутантных ферментов по остатку аА^145 были отобраны 3 кандидата (аА^ 145 Бег, аА^145Ьеи и аАг§14501у) для детального исследования их эффективности в реакции синтеза ампициллина. Было показано, что при использовании всех трех мутантных ферментов удается получить более высокие выходы целевого антибиотика (увеличение выхода до 16 %), и можно снизить нецелевые потери донора ацильной части на 29-56%. Для мутантного фермента аА^145Ьеи определены значения ключевых кинетических параметров, с использованием которых проводено моделирование и оптимизация ферментативного синтеза ампициллина и цефалексина. Полученные при моделировании рекомендации подтверждены экспериментально и проведены, с более высокими, чем у нативного фермента, выходами, синтезы ампициллина и цефалексина. Таким образом показано, что с помощью сайт-направленного мутагенеза можно получить мутантные формы пенициллинацилазы, обладающие улучшенными каталитическими свойствами по сравнению с нативным ферментом и пригодные для решения конкретных практических задач. Более эффективные мутантные ферменты аАгд145Бег, аАг£145Ьеи и аА^145С1у, могут быть использованы в качестве катализаторов препаративного синтеза Р-лактамных антибиотиков.

1. С.М.Навашин, И.П.Фомина, Полусинтетические пенициллины, М. Медицина, 1974 г., с.10.

2. Н.С.Егоров, Основы учения об антибиотиках, М. Высшая школа, 1969.

3. Betina V. The Chemistry and Biology of Antibiotics, Elsevier Scientific, Amsterdam, 1983.

4. Nicholas R.A., Hamilton H., Cohen M.S. in Principles of Pharmacology (Munton P.L. ed), Chapmann&Hall, New York, 1995, pp. 1351-1371.

5. Швядас B.K. Ферментативный синтез и модификация Р-лактамных антибиотиков и пептидов. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, ВИНИТИ, 1988,7,148с.6. веб-сайт Нобелевского комитета http://nobelprize.org/

6. Segel Н., Microbiologe, Canbride University Press, Cambridge, 1986.

7. Bruggink A., Synthesis of b-lactam antibiotics. Chemistry, Biocatalysis & Process Integration, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2001.

8. Bruggink A., Roos E.R., Vroom de E., Penicillin acylase in the industrial production of b-lactam antibiotics, Org.Proc.Res.&Develop., 1998,2,128-133.

9. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzymatic modification of P-Iactam antibiotics: problems and perspectives. Enzyme Engineering. Future Directions, Plenum Press, 1980,257-293,5.

10. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzymatic synthesis of P-lactam antibiotics: a thermodynamic background. Enzyme.Microb.Technol. 1980,2,138-144.

11. Svedas V.K., Margolin A.L., Borisov I.L., Berezin I.V. Kinetics of the enzymatic synthesis ofbenzylpenicillin. Enzyme.Microb.Technol. 1980,2,313-317.

12. Guranda D.T., Khimiuk A.I., Van Langen L.M., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. An "Easy-on, easy-off' protecting group for the enzymatic resolution of (±)-l-phenylethylamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymmetry. 2004,15,2901-2906

13. Юшко М.И., Буханов A.JI., Швядас B.K. "Изучение связывания нуклеофила в активном центре пенициллинацилазы. Кинетический анализ", Биохимия, 2003,68 №3.403-408.

14. Youshko M.I., Chilov G.G., Shcherbakova T.A., Svedas V.K. "Quantitative characterization of the nucleophile reactivity in penicillin acylase-catalyzed acyl transfer reactions" Biochim. Biophys. Acta: Proteins & Proteomics, 2002, 1599 (1-2), 134-140.

15. Youshko M.I., Van Langen L.M., De Vroom E., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. "Penicillin Acylase-Catalyzed Ampicillin Synthesis Employing a pH Gradient: a New Approach to Optimization", Biotechnol. Bioeng., 2002, 78(5), 589-593.

16. Huber F.M., Chauvette R.R., Jackobson B.G., In Chemistry and Biology of b-lactam Antibiotics (Flynn E.H. ed.), Academic Press, New York, 1972.

17. Barbero J.I., Buesa J.M., Gonzalez de Buitrago G., Mendez E., Pez-Aranda A., Garcia J.L., Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila. 1986, Gene, 49,69-80.

18. Ohashi H., Katsuta Y., Hashizume T., Abe S.N., Kajiura H., Hattori H., Kamei T., Yano M., Molecular cloning of penicillin G acylase gene from Arthrobacter viscosus. Appl.Environ. Microbiol., 1988,54,2603-2607.

19. Gang D.M., Shaikh K., Regulation of penicillin acylase in Esherichia coli by cyclic AMP. Biochim.Biophys.Acta, 1976,425,110-114.

20. Valle F., Gosset G., Tenorio B., Oliver G., Bolivar F., Characterization of the regulatory region of the Esherichia coli penicillin acylase structural gene. Gene, 1986,50,119-122.

21. Merino E., Balbas P., Recillas F., Becerril B., Valle F., Bolivar F., Carbon regulation and the role in nature of the Esherichia coli penicillin acylase (pac) gene. Mol. Microbiol., 1992,6,2175-2182.

22. Roa A., Garcia J.L., New insights into the regulation of the pac gene from Esherichia coli W ATCC 11105, FEMS Microbiol. Lett., 1999,177,7-14.

23. Prieto M.A., Perez-Aranda A., Garcia J.L., Characterization of an Esherichia coli aromatic hydrolase with a broad substrate range, J. Bacterid., 1993,175,2162-2167.

24. Prieto M.A., Diaz E., Garcia J.L., Molecular characterization of 4-hydroxyphenylacetate catabolic path-way of Esherichia coli W: engineering a mobile aromatic degradative cluster. J. Bacterid., 1996, 178,111-120.

25. Cole M, Deacylation of acylamino compounds other than penicillins by the cell- bound penicillin acylase of Esherichia coli, Biochem. J., 1969,115,741-745.

26. Cole M, Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acylase of Esherichia coli, Biochem. J., 1969,115,733-739.

27. Schumacher G., Sizmann D., Haug H., Buckel P., Bock A., Penicillin acylase from Esherichia coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acids Res., 1986,14,5713-5727.

28. Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., Dobson E.J., Dobson G., Moody P.C., Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic center. Nature, 1995,373,262-268.

29. Sizmann D., Keilmann C., Bock A., Primary structure requirements for the maturation in vivo of penicillin acylase from Esherichia coli ATCC 11105. Eur. J. Biochem, 1990,192, 143-151.

30. Choi K.S., Kim J.A., Kang H.S., Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Esherichia coli ATCC 11105. J. Bacterid., 1992, 174,6270-6276.

31. Kasche V., Lummer K., Nurk A., Piotraschke E., Rieks A., Stoeva S., Voelter W., Intramolecular auto-proteolysis initiates the maturation of penicillin amidase from Esherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1999,1433,76-86.

32. Zoya Ignatova, Frank Wischnewski, Holger Notbohm, Volker Kasche, Pro-sequence and Ca2+-binding: Implications for Folding and Maturation of Ntn-hydrolase Penicillin Amidase from E. coli, Mol Biol., 2005,348(4), 999-1014.

33. Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., Dodson, E.J., Dodson, G., and Moody, P.C.E., Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre, Nature, 1995,373,264-268.

34. McVey, C.E., Walsh, M.A., Dodson, G.G., Wilson, K.S., Brannigan J.A., Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism, J. Mol. Biol., 2001,313,139-150.

35. Shamolina, Т., Svedas, V.K., Reactivation of heterodimer and individual subunits of penicillin acylase from E. coli after inactivation in urea, Biochemistry (Mosc), 2000, 65, 672-676.

36. Brannigan J.A., Dobson G., Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R., Murzin A.G., A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature, 1995,378,416-419.

37. Oininen C., Rouvinen J., Structural comparison of Ntn-hydrolases. Protein Sci., 2000, 9, 2329-2337.

38. Done S.H., Brannigan J.A., Moody P.C.E., Hubbard R.E., Ligand-induced conformational change in penicillin acylase, J. Mol. Biol., 1998,284,463-475.

39. Morillas, M., Goble, M. L., Virden, R., The kinetics of acylation and deacylation of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105: evidence for lowered pKa values of groups near the catalytic centre, Biochem. J., 1999,338,235-239.

40. Чилов Г.Г., Сидорова A.B., Швядас B.K. Исследование механизма каталитического действия N-концевых гидролаз методами квантово-химического моделирования. Биохимия, 2007, т. 72 (5), с. 615-321.

41. Polgar L. Mechanism of Protease Action, CRC, Cambridge, 1989.

42. Dobson G., Wlodawer A., Catalytic triads and their relatives. Trends Biochem. Sci., 1998,23,347-352.

43. Kim M.G., Lee S.B., Penicillin acylase-catalysed synthesis of b-lactam antibiotics in water-methanol mixtures: effect of cosolvent content and chemical nature of the substrate on reaction rates and yields. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 1996,1,201-211.

44. McDonough M.A., Klei H.E., Kelly J.A. Crystal structure of penicillin G acylase from the Brol mutant strain of Providencia rettgeri. Protein Sci., 1999, 8,1971-1981.

45. McVey C.E., Walsh M.A., Dobson G.G.,K.,S.W., Brannigan J.A. Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: Structural insights into the catalytic mechanism. J. Mol. Biol., 2001,313,139-150.

46. M. Cole Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escherichia coli, Nature., 1964. 203,519-520.

47. M. Cole Deacylation of acylamino compounds other than penicillins by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J., 1969,115,741-745.

48. Н.С. Бондарева, М.М. Левитов, М.С. Рабинович Изучение субстратной специфичности пенициллинацилазы из E.coli, Биохимия, 1969, 34,478-783.

49. М. Van der Mey. Е. De Vroom Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994,4, 345-348.

50. M. Robak, A. Szewczuk Penicillin amidase from Proteus rettgeri, Acta Biochimica. Polonica. 1981,28 275-284.

51. D. Chiang, R.E. Bennet Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaterium. J. Bacteriol. 1967,93,302-308.

52. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I., Guranda D.F. Enantio-selective penicillin acylase-catalyzed reactions. Factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1996,799,659-669.

53. Alkema W.B.L., Floris R., Janssen D.B. The use of chromogenic reference substrates for the kinetic analysis of penicillin acylases. Anal. Biochem., 1999,275,47-53.

54. Margolin A.L., Svedas V.K., Berezin I.V. Substrate specificity of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1980,616,283-289.

55. Д. Т. Гуранда Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis, диссертация на соискание кандидата хим. наук, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000.

56. A.S. Soloshonok, A.G. Kirilenko, N.A. Fokina, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, V.P. Kukhar, V.K. Svedas, E.V. Kozlova Biokatalytic resolution of ß-fluoroalkyl-ß-amino acids, Tetrahedron: Asymmetry, 1994,5,1119-1126

57. A. Plaskie, E. Roets, H. Vanderhaeghe Substrate specificity of penicillin acylase of E.coli. J. Antibiotics. 1978,31,783-788.

58. И.А. Ямсков, M.B. Буданов, B.A. Даванков, П.С. Ныс, Е.М. Савицкая Энантиоселективный гидролиз №фенилацетил-0,Ь-С-фенилглицина пенициллинамидогидролазой из E.coli и ее иммобилизированными препаратами. Биоорг. химия. 1979,5,604-610.

59. W.B. Alkema, A.K. Prins, Е. de Vries, D.B. Janssen Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem J. 2002, 365,303.

60. Svedas V., Guranda D., Van Langen L., Van Rantwijk F. and Sheldon R. Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett., 1997,417,414-418.

61. D.T. Guranda, L. M. van Langen, F. van Rantwijk, R. A. Sheldon, V. K. Svedas Highly efficient and enantioselective enzymatic acylation of amines in aqueous medium, Tetrahedron: Asymmetry, 2001,12,1645-1650.

62. Чилов Г.Г., Нетрадиционные пути получения ядер р -лактамных антибиотиков ферментативной трансформацией пенициллинов и цефалоспоринов, Диссертация на соискание звания кандидата химических наук, Москва, 2003.

63. Юшко М.И. Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в комогенных, гетерогенных и твердофазных системах, диссертация на соискание кандидата хим. наук, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000.

64. Fernandez-Lafuente R., Rosell C.M., Guisan J.M. Dynamic reaction design of enzymic biotransformations in organic media: equilibrium-controlled synthesis of antibiotics by penicillin G acylase. Biotechnol. Appl. Biochem., 1996,24,139-143.

65. Lummer K., Rieks A., Galunsky В., Kasche V. pH dependence of penicillin amidase enentioselectivity for charged substrates. Biochim Biophys. Acta, 1999, 1433, 327-334.

66. Boccu E., Carenza M., Lora S., Palma G., Veronese F.M. Radiation-induced polymerization for the immobilization of penicillin acylase. Appl. Biochem. Biotechnol., 1987,15,1-10.

67. Alvaro G., Fernandez-Lafuente R., Blanco R.M., Guisan J.M. Immobilization-stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli. Appl. Biochem. Biotechnol., 1990,26,181-195.

68. Prabhune A., SivaRaman H. Immobilization of penicillin acylase in porous beads of polyacrylamide gel. Appl. Biochem. Biotechnol., 1991,30,265-272.

69. Bryjak J., Noworyta A. Immobilization of penicillin acylase on copolymer of butyl acrylate and ethylene glycol dimethacrylate. J. Chem. Technol. Biotechnol., 1993, 57, 7985.

70. Fonseca L.P., Cardoso J.P., Cabral. J.M. Immobilization studies of an industrial penicillin acylase preparation on a silica carrier. J. Chem. Technol. Biotechnol., 1993,58,27-37.

71. Kasche V. Mechanism and yields in enzyme catalysed equlibrium and kinetically controlled synthesis of b-lactam antibiotics, peptides and other condensation products. Enzyme Microb. Technol., 1986, 8,4-16.

72. Forney L.J., Wong D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55,2556-2560.

73. Forney L.J., Wong D.C., Ferber D.M. Selection of amidases with novel substrate specificities from penicillin amidase of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55,2550-2555.

74. Choi K.S., Kuo B.Y., Kang H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacterid., 1992, 174,6270-6276.

75. Alkema, W.B.L., Prins, A.K., Vries, E. Janssen, D.B. Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J., 2002, 365,303-309.

76. W.B.L. Alkema Kinetic and strucrural studies of penicillin acylase from Escherichia coli. Rijksuniniversiteit Groningen, 2002,142 p.

77. Alkema W. B. L., Dijkhuis A.-J., Vries E., Janssen D.B. The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase. Eur J Biochem. 2002,269(8), 2093-100.

78. Gabor E.M., Janssen D.B., Increasing the synthetic performance of penicillin acylase PAS2 by structure-inspired semi-random mutagenesis, Protein Eng Des Sei., 2004,17 (7), 571-579.

79. Menard R., Plouffe C., Laflamme P., Vernet T., Tessier D.C., Thomas D.Y., Storer A.C. Modification of the electrostatic enviroment is tolerated in the oxyanion hole of the cysteine protease papain. Biochemistry, 1995,34,464-471.

80. Warshel A. Electrostatic origin of the catalytic power of the enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem., 1998,273, 27035-27038.

81. Jackson S.E., Fersht A.R. Contribution of long-renge electrostatic interactions of the stabilization of the catalyric transition state of the serine protease subtilisin BPN\ Biochemistry, 1993,32,13909-13916.

82. Morillas M., Goble M.L., Virden R. The kinetics of acylation and dezcylation of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105: evidence for lowered pKa values of groups near the catalytic centre. Biochem. J., 1999,338,235-239.

83. Roa A., Garcia J.L., Salto F., Cortes E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J., 1994,303, 869-875.

84. Martin J., Prieto I., Barbero J.L., Perez-Gil J., Mancheno J.M., Arche R. Thermodynamic profiles of penicillin G hydrolysis catalysed by wild-type and Metl68Ala mutant penicillin acylases from Kluyvera citrophila, Biochem. J., 1990,280,659-662.

85. Prieto I., Rodrigues M.C., Marguez G.„ Perez-Aranda A., Barbero J.L. Changing glicine 21 for glutamic acid in the b-subunit of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila prevents protein maturation. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992,36,659-662.

86. Morillas, M., McVey, C.E., Brannigan, J.A., Launder A.G., Forney L.J., Virden, R. Mutations of penicillin acylase residue B71 extend substrate specificity by decreasing steric constraints for substrate binding, Biochem. J., 2003,371,143-150.

87. Brannigan, J. A., Dodson, G. G., Done, S. H., Hewitt, L., McVey, C. E., Wilson, K. S. Strucrural Studies of Penicillin Acylase, Appl. Biochem.Biotechnol., 2000, 88,313-319.

88. Abrahmsen L., Tom J., Burnier J., Butcher K.A., Kossakoff A., Wells J.A. Engineering subtilisin and its substrates for efficient ligation of peptide bonds in aqueous solution. Biochemistry, 1991,30,4151-4159

89. Elliott R.J., Bennet A.J., Braun C.A., MacLeod A.M., Borgford T.J. Active-site variants of Streptomyces griseus protease B with peptide-ligation activity. Chem. Biol., 2000,7,163-171.

90. You L., Usher J.J., White B.J., Novotny J. Internetional patent WO/98/20120,1998.

91. Hedstrom L., Szilagyi L., Rutter W.J. Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops, Science, 1992,255,1249-1253.

92. Bender M.L. The mechanism of a-chymotrypsin catalyzed hydrolysis. J. Am. Chem. Soc., 1962,84,3682-3690.

93. Gololobov M.Y., Borisov I.L., Svedas V.K. Acyl group transfer by proteases froming an acylenzyme intermediate: kinetic model analysis (including hydrolysis of acylenzyme nucleophile complex). J. Theor. Biol., 1989,140,193-204.

94. Malthouse J.P., Primrose W.U., Mackenzie N.E., Scott A.I. 13C-NMR study of the ionizations within a trypsin-chloromethyl ketone inhibitor complex. Biochemistry, 1985, 24,3478-3487.

95. O'Connell T.P., Day R.M., Torchilin E.V., Bachovchin W.W., Malthouse J.G. A 13C-NMR study of the role of Asn-155 in stabilizing the oxyanion of a subtilisin tetrahedral adduct. Biochem. J., 1997,326,861-866.

96. O'Connell T.P., Malthouse J.G. Determination of the iionization state of the active-site histidine in a subtilisin-(chloromethane inhibitor) derivative by 13C-NMR. Biochem. J., 1996,317,35-40.

97. Robillard G., Shulman R.G. High resolution nuclear magnetic resonance studies of the active site of chymotrypsin. I. The hydrogen bonded protons of the "charge relay" system. J. Mol. Biol., 1974,86,519-540.

98. Bachovchin W.W. Confirmation of the assignment of the low-field proton resonance of serine proteases by using specifically nitrogen-15 labeled enzyme. Proc. Nat. Acad. Sci., 1985, 82,7948-7951.

99. Halkides C.J., Wu Y.Q., Murray C.J. A low-barrier hydrogen bond in subtilisin: 1H-and 15N-NMR studies with peptidyl trifluoromethyl ketones. Biochemistry, 1996,35, 15941-15948.

100. Cassidy C.S., Lin J., Frey P.A. A new concept for the mechanism of action of chymotrypsin: the role of the low-barrier hydrogen bond. Biochemistry, 1997,36,45764584.

101. Cassidy C.S., Lin J., Frey P.A. The deuterium isotope effect on the NMR signal of the low-barrier hydrogen bond in a transition-state analog complex of chymotrypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000,273, 789-792.

102. Stein R.L., Elrod J.P., Schowen R.L. Correlative variations in enzyme-derived and substrate-derived structures of catalytic transition states. Implications for the catalytic strategy of acyl transfer enzymes. J. Am. Chem. Soc., 1983,105,2446-2452.

103. Stein R.L., Strimpler A.M., Hori H., Powers J.C. Catalysis by human leukocyte elastase: proton inventory as a mechanistic probe. Biochemistry, 1987,26,1305-1314.

104. Polgar L., Szeltner Z., Boros I. Substrate-dependent mechanisms in the catalysis of human immunodeficiency virus protease. Biochemistry, 1994, 33,9351-9357.

105. Никитин В.А. «Катализ пенициллинацилазой в кислой и щелочной средах», дипломная работа, кафедра химической энзимологии,химический факультет, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2003.

106. Ayala Y.M., Di Cera Е. A simple method for determinatio of individual rate constants for substrate hydrolysis by serine proteases. Protein Sci, 2000,9,1589-1593.

107. Ninkovic M., Riester D., Wirsching F., Dietrich R., Schwienhorst A. Fluorogenic assay for penicillin G acylase activity. Anal. Biochem., 2001,292,228-233.

108. Knuttel Т., Hartmann Т., Meyer H., Scheper T. On-line monitoring of a quasi-enentiomeric reaction with two coumarin substrates via 2D-fluorescence spectroscopy. Enzyme and Microb. Technol., 2001,29,150-159.

109. Sakamoto H., Ichikawa Y., Yamano Т., Takagi T. Circular dichroic studies on the interaction between reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-adrenodoxin reductase and adrenodoxin. J. Biochem. (Tokyo), 1981,90,1445-1452.

110. Arvidson D.N., Bruce C., Gunsalus R.P. Interaction of the Escherichia coli trp aporeperssor with its ligandd, L-tryptophan. J. Biol. Chem., 1986,261,2238-243.

111. Kim Y., Yoon K., Knang Y., Turley S., Hoi W.G. The 2.0 A crystal structure of cephalosporin acyalse. Structure Fold. Des., 2000, 8,1059-1069.

112. Martin J., Slade A., Aitken A., Arche R., Virden R. Chemical modification of serine at the active site of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biochem. J., 1991,280, 659-662.

113. Yan B.X., Sun Y.Q. Glycine residues provide flexibility for enzyme active sites. J. Biol. Chem., 1997,272,3190-3194

114. MacArthur M.W., Thornton J.M. Influence of proline residues on protein conformation. J. Mol. Biol., 1991,218,397-412.

115. Kim Y., Yoon K., Khang Y., Turley S., Hoi W.G. The 2.0 A crystal structure of cephalosporin acylase. Structure Fold. Des., 2000, 8,1059-1068.

116. Suresh C.G., Pundle A.V., SivaRaman H., Rao K.N., Brannigan J.A., McVey C.E., Verma C.S., Dauter Z., Dobson E.J., Dobson G.G. Penicillin V acylase crystal structure reveals new Nth-hydrolase family members. Nat. Struc. Biol., 1999,6,414-416.

117. Carter P., Wells J. A. Dissecting the catalytic triad of a serine protease. Nature, 1988, 332,564-568.

118. Corey D.R., Craik C.H. An anvestigation into the minimum requirements for peptide hydrolysis by mutation of the catalytic triad of trypsin. J. Am. Chem. Soc., 1992,114, 1784-1790.

119. Oinonen C., Rouvinen J. Structural comprasin of Ntn-hydrolases. Protein Sci., 2000,9, 2329-2337.

120. Chanouni P., Steenhuis J.J., Fan-ens D.L., Kobilka B.K Agonist-induced conformational changes in the G-protein-coupling domain of the b-2 adrenergic receptor. Proc. Nat. Acad. Sci., 2001,98,5997-6002.

121. Boyd A.E., Marnett A.B., Wong L., Taylor P. Probing the active center gorge of acetylcholinesterase by fluorophores linked to substituted cysteines. J. Biol. Chem., 2000, 275,22401-22408.

122. Davis B.G., Shang X., DeSantis G., Bott R.R., Jones J.B. The controlled introduction of multiple negative charge at single amino acids sites in subtilisin Bacillus lentus. Bioorg. Med. Chem., 1999,7,2293-2301.

123. Stemmer W.P. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature, 1994, 370,389-391.

124. Crameri A., Raillard S.A., Bermudes E., Stemmer W.P. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution. Nature, 1998,391,288-291.

125. М.И. Юшко, Т.А. Шамолина, Д.Ф. Гуранда, А.В. Синев, В.К. Швядас «Высокоспецифичные субстраты для спектрофотометрического определения активности пенициллинацилазы», Биохимия, 1998, 63 (9), с. 1295-1300.

126. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002,589 с.

127. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.

128. Aswad D.W., Determination of D- and L-aspartate in amino acid mixtures by highperformance liquid chromatography after derivatization with a chiral adduct of o-phthaldialdehyde, Anal. Biochem. 1984. V. 137 P. 405-409

129. Buck R.H., Krummen K., Resolution of amino acid enantiomers by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatisation with a chiral reagent, J. Chromatogr. 1984. V. 315. P. 279-285.

130. Svedas V.K., Galaev I.J., Borisov I.L., Berezin I.V. The interaction of amino acids with o-phthaldialdehyde: A kinetic study and spectrophotometric assay of the reaction product, Anal. Biochem. 1980. V. 101. P. 188-195.

131. Florance J., Galdes A., Konteatis Z., Kosarych Z., Langer K., High-performance liquid chromatographic separation of peptide and amino acid stereoisomers, J. Chromatogr. 1987. V. 414. P. 313-322.

132. Duchateau A.L.L., Knuts H., Boesten J.M.M., Guns J. J., Enantioseparation of amino compounds by derivatization with o-phthalaldehyde and D-3-mercapto-2-methylpropionic acid, J. Chromatogr. 1992. V. 623. P. 237-245.

133. Jegorov A., Trnka Т., Stuchlik J., High-performance liquid chromatographic detection of enantiomeric amino alcohols after derivatization with o-phthaldialdehyde and various thiosugars, J. Chromatogr. 1991. V. 558. P. 311-317.

134. Desai D.M., Gal J., Enantiospecific drug analysis via the ortho-phthalaldehyde/homochiral thiol derivatization method, J. Chromatogr. 1993. V. 629. P. 215-228.

135. Bruckner Н., Wuttner R., Godel Н., Automated enantioseparation of amino acids by derivatization with o-phthaldialdehyde and N-acylated cysteines, J. Chromatogr. 1989. V. 476. P. 73-82.

136. Duchateau A.L.L., Boesten J.M.M., Coussens B.B. High-Performance liquid chromatographic separation and molecular modelling of diastereomeric isoindole derivatives of amino compounds, Chirality, 1995, V.7, P. 547-555.

137. Jacobs W.A., Leburg M.W., Madaj E.J. Stability of o-phthalaldehyde-derived isoindoles, Anal. Biochem. 1986. V. 156. P. 334-340.

138. Lindner W., Indirect Separation of Enantiomers by Liquid Chromatography, Eds. M. Zief, L.J. Crane. Chromatographic Chiral Separations. Chromatographic Science Series. V. 40, New York: Marcel Dekker. 1988. P. 116.