Свойства мутантов пенициллинацилазы из Escherichia coli по положению 145 и 149 альфа субъединицы, 71, 384, 385 бета субъединицы в реакциях ацилирования аминосоединений и стереоселективного гидролиза амидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

на правах рукописи

Ямскова Ольга Васильевна

Свойства мутантов пеницнллинацилазы из Escherichia coli по положению 145 и 149 альфа субъединицы, 71,384,385 бета субъединицы в реакциях ацилирования аминосоединений и стереоселективного гидролиза амидов

02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2011

1 4 АПР 2011

4843733

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М.В. Ломоносова и в отделе биокинетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Научные руководители: профессор, д.х.н. Швядас В.К.

к.х.н., ст.н.с. Гуранда Д.Ф.

Официальные оппоненты: профессор, д.х.н. Кочетков К.А.

профессор, д.б.н. Ефременко Е.Н.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « А (1 » марта 20 И г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «¿Ъ » февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Использование биокатализаторов в тонком органическом синтезе находит все более широкое применение. Привлекательность биокаталитических превращений заключается в уникальной субстратной и стереоспецифичности действия ферментов, возможности проведения реакций в "мягких", экологически благоприятных условиях. Успешным примером является применение пенициллинацилазы из Escherichia coli для модификации бета-лактамных антибиотиков как на стадии гидролиза природного пенициллина с целью получения ядра пенициллинов 6-аминопенициллановой кислоты, так и на стадии ферментативного ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты с целью получения новых «полусинтетических» антибиотиков этого класса. На основании исследований последних лет, показавших высокую стереоселективность пенициллинацилазы, следует предположить, что этот фермент найдет широкое применение при получении энантиомерно чистых соединений. Детальные исследования выявили, что пенициллинацилаза обладает широкой субстратной специфичностью и высокой стереоселективностью в реакциях ферментативного гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот. В то же время было установлено, что каталитическая эффективность и стереоселективность фермента дикого типа в реакциях ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, а также в реакциях гидролиза соответствующих N-фенилацетильных производных недостаточна для сколько-нибудь эффективного расщепления рацематов этих соединений. На основании анализа научной литературы наиболее эффективным способом улучшения свойств пенициллинацилазы дикого типа представляется введение мутаций в структуру фермента. В случае пенициллинацилазы из Escherichia coli ранее было показано, что введением мутаций удается добиться улучшения способности фермента катализировать синтез бета-

лактамных антибиотиков. Следует отметить, что поиск мутантных форм пенициллинацилазы с улучшенной способностью катализировать ферментативный ацильный перенос на первичные амины не может быть сведен к использованию мутаций, которые улучшали способность к синтезу антибиотиков из-за принципиальных отличий в структуре субстратов и в условиях проведения соответствующих реакций. Более того, наряду с целью улучшения каталитической эффективности, задачей диссертационной работы было также увеличение стереоселективности действия фермента, принципы регуляции которой в настоящее время практически не изучены.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось поиск мутантных препаратов пенициллинацилазы из Е.соЧ с увеличенной стереоселективностью и каталитической эффективностью в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, и в реакциях стереоселективного гидролиза соответствующих Ы-ацильных производных. В соответствии с этим, задачами явились исследование каталитических свойств препаратов мутантных форм пенициллинацилазы по положению 145, 149 альфа цепи, а также 71, 384, 385 бета цепи, в частности, получение очищенных препаратов мутантных форм пенициллинацилазы, первичная характеристика их стабильности и каталитической активности, детальные исследования каталитических свойств перспективных препаратов в реакциях стереоселективного ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, и гидролиза соответствующих Ы-ацильных проиводных.

Научная новизна. Впервые показана возможность улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из Е.соН в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза их Ы-ацильных производных путём замены единичных аминокислотных остатков в структуре фермента. В частности, замена аминокислотного остатка в положении 145 альфа цепи и 71 бета цепи

пенициллинацилазы приводит к существенному увеличению стереоселективности и каталитической эффективности фермента в названных ферментативных превращениях.

Практическая значимость работы. Выявлены точечные мутанты пенициллинацилазы из E.coli, характеризующиеся увеличенной стереоселективостыо, эффективностью ацильного переноса на добавленный нуклеофил и каталитической активностью в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза соответствующих N-ацильных производных. Применение исследованных мутантов представляет интерес для целей разделения рацематов первичных аминов и аминоспиртов, а также для синтеза соответствующих энантиомерно чистых N-ацильных производных. Апробация работы. Результаты работы были представлены на российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва-Пущино, 2006 г., на 4 Международном конгрессе «Биотехнология-2007», Москва, 2007 г., на Международной конференции «Ломоносов-2007», Москва, 2007 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссией, 3 тезисов докладов на международных конференциях и 1 заявка на патент. Объем и структура работы. Дисертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 141 ссылку. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 25 рисунков.

Содержание работы

В качестве объектов исследования был выбран ряд мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli по положению 145 и 149

альфа субъединицы, 71, 384, 385 бета субъединицы, в качестве предмета исследования - стереоселективность и каталитическая эффективность действия мутантных ферментов в реакциях ацилирования первичных аминосоединений, в особенности аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза соответствующих амидов. Выбранные замены аминокислот (рис.1) представляют собой наиболее перспективные точки введения мутаций исходя из ранее накопленного опыта исследований пенициллинацилазы, а также из экспертного анализа структуры фермента и ориентации субстратов в его активном центре.

Рис. 1. Модельная структура фермент-субстратного комплекса нативной пенициллинацилазы и её природного субстрата - бензилпенициляина. Остатки аА^145, рРЬе71, (501у385 и ртЬг384 непосредственно участвуют в формировании участка связывания уходящей группы субстрата; а8ег149 расположен на короткой петле, соединяющей Са-связывающий участок и активный центр фермента.

Предполагалось, что выбранные мутантные формы пенициллинацилазы могут обладать более высокой каталитической активностью и стереоселективностью в исследуемых реакциях по сравнению с ферментом дикого типа.

Получение ферментных препаратов

Препараты мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli aSerl49Ala, ßPhe7ILeu, aSerl49Glu, aSerl49Arg, aSerl49Lys и aArgl45Leu были любезно предоставлены проф. Д. Янссеном (факультет биохимии Гронингенского Института биомолекулярных наук и биотехнологии, Гронингенский Университет, Нидерланды). Культуры клеток продуцентов мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli ßGly385Ser ßPhe71Leu, ßGly385Ser ßPhe71Leu ßArg325Cys, ßGly385Leu ßPhe71Leu, ßThr384Asn aSerl49Arg были получены в лаборатории профессора В. И. Тишкова (кафедра химической энзимологии Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова). Для получения мутантных форм пеницилинацилазы использовали штамм компетентных клеток Е. coli HB 101. Культивирование клеток проводили до оптической плотности культуральной жидкости около 0,8 ед. ОП Q. 600 нм) в объёме 250 мл (питательная среда 2YT, объём колбы 1 л) в присутствии 0,2 мМ хлорамфеникола и 0,1 мМ индуктора изопропил-ß-D-тиогалактопиранозида, 2 мМ ионов кальция, 5 г/л глицерина и глюкозы, при 15°С. Клетки отделяли центрифугированием. Фермент выделяли из клеток методом осмотического шока. Выход составлял 230 мг активного фермента с 1 литра среды.

Дальнейшую очистку препаратов пенициллинацилазы проводили методом гидрофобной хроматографии. К полученному раствору препарата фермента добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 1,5 М. Образец наносили на колонку Butyl-Toyopearl 650М, уравновешенную 50 мМ фосфатным буфером, pH 7,5, содержащий 1,5 М сульфата аммония. Элюирование проводили в линейном градиенте 1,5-0 М (NH4)2S04 при использовании 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,5). Типичная хроматограмма очистки представлена на рис. 2.

Содержание сульфата аммония: 16% 100%

Рис. 2. Хроматограмма очистки прерарата пенициллинацилазы а5ег149Ьуз методом гидрофобной хроматографии. Привитая фаза: Ви1у1-Тоуореаг1 650М (пик пенициллинацилазы указан стрелкой).

Фракции, обладающие пенициллинацилазной активностью, объединяли, обессоливали и концентрировали примерно до содержания активных центров пенициллинацилазы равного около 10 мкмоль/л. Концентрацию активных центров мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием препарата фермента необратимым ингибитором (рис. 3).

Сфнсф.М

Рис. 3. Титрование активных центров препарата мутантной формы пенициллинацилазы аЗсг149С1и необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом.

Методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле подтверждали высокую чистоту препаратов фермента (рис. 4). Фактор очистки для стадии хроматографии составлял около 6,9, выход фермента около 65%. Фактор очистки на последующей стадии

8

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4. Фотография гель-электрофореза в денатурирующих условиях препаратов пенициллинацилазы. Дорожка 1 - клеточный лизат, дорожка 2 -контрольный образец пенициллинацилазы дикого типа, дорожка 3 - маркёры молекулярного веса белков 97 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 30 кДа, 20,1 кДа; дорожки 4, 5, 6 - очищенные препараты мутантных форм аЗсг149А1а, а5сг!49Ьуз, аЗсг14901и соответственно, дорожка 7 - препарат мутантной формы пенициллинацилазы а8ег149А1а, полученный после экстракции осмотическим шоком.

обессоливания составлял около 2,1, а общий выход пенициллинацилазы в результате проведения всех стадий выделения и очистки составлял около 50%.

Каталитическая активность мутантных форм

Для первичной характеристики каталитической активности каждого из полученных препаратов мутантных форм пенициллинацилазы были определены кинетические параметры ферментативного гидролиза цветного субстрата п-нитро-м-карбоксианилида фенилуксусной кислоты (табл. 1). Было найдено, что все полученные мутантные формы фермента являются высоко активными. Более того, большинство препаратов мутантных форм превосходят по каталитической эффективности нативный фермент в 2-3 раза. Наиболее активными в исследуемом ряду являются ферменты с точечными мутациями [5РЬс71Ьеи и а5ег149А^. Все полученные препараты мутантов пенициллинацилазы обладали достаточно высокой каталитической активностью и представляли интерес для дальнейших исследований.

Таблица 1. Кинетические параметры ферментативного гидролиза п-нитро-м-карбоксианилида фенилуксусной кислоты

Препарат пенициллинацилазы ^каЬ с"1 (кка,/Кга)10-3, М-'-с1 Относительная специфичность

Нативный 26 870 1

а8ег149А1а 27 1200 1.4

аЗегМЭЬув 49 2000 2.3

сйег14901и 16 500 0.6

с£ег149Аг0 43 2700 3.1

рРЬе71Ьеи 53 5200 6.0

рОуЗЯбвег [ЗРЬе71[.еи 40 2700 3.1

рС1у3858егрРЬе71Ьеи РА^325Суз* 35 2300 2.7

Р01у385Ьеи рРЬе71Ьеи 38 840 1.0

РТЬГ384А5П а5ег149Лг§ 33 1700 1.9

аА^1451хи 1,5 35 0,04

* мутация по положению 325 р-субъединицы произошла случайно в процессе проведения сайт-направленного мутагенеза.

Стабильность мутантных форм

Для практического применения мутантных препаратов пенициллинацилазы в реакциях стереоселективного гидролиза амидов и ацилирования аминосоединений, наряду с каталитической активностью препаратов важное значение имеет их стабильность в области нейтральных значений рН - в оптимуме каталитической активности, а также в щелочной среде (рН около 10), где достигаются условия депротонирования аминогрупп высокоосновных аминосоединений.

В ходе выделения и очистки препаратов мутантных форм пенициллинацилазы было выявлено, что ферменты с двойными и тройными заменами (PGly385Ser pPhe71Leu, pGly385Ser pPhe71Leu PArg325Cys, pGly385Leu pPhe71Leu) являются весьма нестабильными, поэтому дальнейшее исследование их каталитических свойств не проводилось.

Все исследуемые мутантные формы пенициллинацилазы с одиночной заменой были чрезвычайно стабильны в оптимуме каталитической активности (рН 7-8) при пониженных температурах, поэтому для сравнения их стабильности инактивацию проводили при температуре 50°С (табл. 2), соответствующей температурному оптимуму каталитической активности фермента. Во всех рассмотренных случаях инактивация фермента протекала согласно кинетике реакции первого порядка. Величины константы скорости инактивации отличались в 2-3 раза разнонаправлено относительно величины для нативного фермента. Если при комнатной температуре ферменты в течение суток сохраняли 100% активности, то при 50°С нативный препарат пенициллинацилазы терял половину активности примерно за 25 минут, а наиболее стабильный мутантный фермент aSerl49GIu - за 55 минут.

В области высоких значений рН (рН 10,3, 25°С) инактивация исследуемых ферментов также подчинялась кинетике реакции первого порядка. В этих условиях исследуемые препараты пенициллинацилазы были значительно менее стабильны - период полуинактивации нативного фермента составлял приблизительно 7 минут, а для наиболее стабильного препарата aSerl49Glu - приблизительно 11 минут (табл. 2).

Можно заметить, что замена аминокислотного остака в положении aSerl49 на положительно заряженные статки Lys и Arg приводит к наиболее сильному эффекту дестабилизации структуры фермента в

условиях повышенной температуры (константа инактивации увеличивается в 2-3,5 раза) и, напротив, введение отрицательно заряженного остатка в данном положении приводит к наибольшей стабилизации пенициллинацилазы с понижением констант рН- и термоинактивации приблизительно в 2 раза.

Таблица 2. Стабильность мутантных форм пенициллинацилазы в условиях оптимума каталитической активности и в щелочной среде.

Препарат пенициллинацилазы Кин, с (рН 8, 50°С) С (рН 10,3, 25°С)

Нативный 0,026 0,083

а8ег149А1а 0,027 0,082

аЗсг149Ьуэ 0,047 0,097

а8ег14901и 0,011 0,056

а8ег149А^ 0,097 0,092

аА^145Ьеи 0,050 0,151

Введение же алифатического аланина не влияет на стабильность фермента. Полученные данные свидетельствуют о том, что электростатическое взаимодействие с положительно заряженной группой фермента в окружении остатка 149 альфа-цепи способствует дополнительному поддержанию каталитически стабильной конформации пенициллинацилазы.

Каталитические свойства мутантных форм пенициллинацилазы в реакции гидролиза амидов

В литературе субстратная специфичность и стереоселективость пенициллинацилазы из Е.соИ по отношению к М-фенилацетильным

производным аминокислот объясняется в рамках трёхцентровой модели связывания субстрата в активном центра фермента, согласно которой выделяют участок связывания ацильной группы субстрата (р1), участок связывания бокового радикала (р2) и участок связывания карбоксильной группы при взаимодействии с К-фенилацетильными производными 5-аминокислот (рЗ). На участке р1 реализуются чрезвычайно эффективные гидрофобные взаимодействия, на участке р2 - относительно слабые гидрофобные взаимодействия, а на участке рЗ -электростатические взаимодействия карбоксильной группы с положительно заряженным аминокислотным остатком фермента. При связывании Я-энантиомеров Ы-фенилацетильных производных аминокислот происходит «неправильное» связывание фрагментов амидной части субстрата на участках р2 и рЗ. Этим объясняется, с одной стороны, высокая каталитическая эффективность и стереоселективностъ фермента в ряду Ы-ацильных производных аминокислот и, с другой стороны, низкая каталитическая активность и стереоселективностъ ферментативного гидролиза И-ацильных производных аминов и аминоспиртов.

Проведенные исследования показали, что исследуемые мутантные формы пенициллинацилазы не имеют ощутимых преимуществ по сравнению с нативным ферментом в реакциях ферментативного гидролиза Ы-фенилацетильных производных аминокислот, в частности, производного аспарагиновой кислоты, для которого наблюдаются наименьшие значения стереоселективности и константы специфичности в ряду И-фенилацетильных производных а-аминокислот. Однако при ферментативном гидролизе Ы-ацильных производных первичных аминов и аминоспиртов стереоселективность мутантных форм аА^145Ьеи и рРЬе71Ьеи в ряде случаев существенно превышала стереоселективность нативной пенициллинацилазы.

Таблица 3. Стереоселективность ферментативного гидролиза Н-фенилацетильных производных аминоспиртов под действием нативной пеницшшинацилазы и ее мутантной формы рРЬс71Ьеи (рН 7,5, 25°С, 0,01 М КН2Р04, 0,1 М КС1).

Ы-фенилацетильное производное аминоспирта Нативный препарат рРЬе71Ьеи

2-Аминопропанол 25 (Б)* 5(8)*

2-Аминобутанол 4(8) 15(8)

2-Амино-4-метилпентанол 36(8) 60 (8)

Фенилглицинол 95 (8) 27 (Б)

Фенил ал анинол 2 (Я) 7 (Б)

*В скобках указан активный энантиомер субстрата.

Таблица 4. Стереоселективность нативной пенициллинацилазы и ее мутантных форм РЬер71 Ьеи и Агдсх145Ьеи в реакциях гидролиза N-(11)-манделил-производных аминосоединений (рН 7,5,25°С)

Субстрат Стереоселективность препарата фермента

Нативный препарат РЬеР71Ьеи Аг£а145Ьеи

1\Г-(Ы)-Манделил-(±)-2-аминобутанол 25 100 37

Ы-(Я)-Манделил-(±)-фенилаланинол 4,2 39 7,4

Исследование субстратной специфичности и стереоселективности мутантных форм аАг§145Ьеи и рРЬе71Ьеи показало, что данные замены существенно увеличивают каталитическую активность и стереоселективность фермента по потношению к И-ацильиым производным аминоспиртов (табл. 3 и 4). Увеличение стереоселективности достигало 2-6 раз, а в отдельных случаях наблюдали смену активного энантиомера.

Каталитические свойства мутантных форм

пенициллииацилазы в реакции ацильного переноса

Ранее при детальном исследовании кинетики реакций ферментативного ацильного переноса, катализируемого пенициллинацилазой из Е.соИ, была определена «минимальная» кинетическая схема (рис. 5) и количественные критерии, которые следует использовать при скрининге каталитических свойств и характеристике препаратов мутантных ферментов с улучшенными свойствами.

К* к2 к,

Е + Б - ЕЗ --»- ЕА ---" Е + Р2

t, к4

К,

ЕР - Е + Р

Рис. 5. "Минимальная" кинетическая схема активированного ацильного переноса, катализируемого пенициллинацилазой из E.coti. Е - фермент, S - донор ацильной части, N - нуклеофил; ES, ЕР - комплекс фермента с субстратом и продуктом синтеза; ЕА - ацилфермент, EAN - комплекс ацилфермент-нуклеофила; Pi -продукт, выделяющийся при образовании ацилфермента; Р2 - продукт гидролиза ацилфермента.

Согласно данной схеме, при ферментативном ацильном переносе на нуклеофил, молекула воды выступает в качестве конкурентного нуклеофила. В результате переноса на молекулу воды образуется побочный продукт и, следовательно, эффективность синтеза целевого продукта снижается. Эффективность мутантных форм в качестве катализаторов ацильного переноса можно оценить путём определения соотношения начальных скоростей накопления продуктов синтеза (перенос на добавленный нуклеофил) и гидролиза (перенос на молекулу воды).

Особый интерес представляет реакция синтеза ампициллина в результате ферментативного ацильного переноса амида Я-фениглицина на ядро пенициллинов 6-аминопенициллановую кислоту. Скрининг «синтетической» активности мутантных форм пенициллинацилазы путём определения соотношения начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза в реакции синтеза ампициллина (табл. 5) показал, что замена аминокислотного остатка Бег149 альфа цепи приводит к улучшению эффективности ферментативного ацильного переноса на 6-аминопенициллановую кислоту.

Таблица 5. Эффективность ацильного переноса амида Я-фенилглицина на 6-амияопенициллановую кислоту, катализируемого мутантными формами пенициллинацилазы (рН 6.3; 25°С безбуферная среда, концентрация нуклеофила 93 мМ, ацильного донора 100 мМ).

Препарат пенициллинацилазы Соотношение начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза

Нативный 4,8

а8ег149А1а 5,2

аЗегМЭЬув 7,0

а8ег14901и 3,9

а8ег149А^ 10

Для наиболее эффективных мутантных форм пенициллинацилазы в реакции синтеза ампициллина были определены кинетические параметры синтеза в соответствии с «минимальной» кинетической схемой: а, отражающий специфичность пенициллинацилазы к ампициллину в сравнению с ацильным донором, Ро, отражающий относительную реакционную способность нуклеофила в отсутствие гидролиза ацилфермент-нуклеофильного комплекса, и параметр у,

отражающий соотношение скоростей синтеза/гидролиза при превращении ацилфермент-нуклеофилыюго комплекса (см. табл. 6).

К,/К/ к ¡К, к,

Таблица 6. Значения ключевых кинетических параметров ферментативного синтеза ампицилииа, катализируемого пенициллинацилазой (рН 6.3; 25°С, концентрация ацилыюго донора 100 мМ).___

Препарат пенициллинацилазы У 1/у Ро а

ПА 0,060 17 56 5,2

аБегМЭА^ 0,030 33 63 5,3

а5ег149А^ рТЬг384Азп 0,032 30 77 5,5

Таблица 7. Синтез ампициллина в гомогенной системе, катализируемый пенициллинацилазой (рН 6,3; 25°С, амид Я-фенилглицина 50 мМ, 6-аминопеницкллановая кислота 50 мМ).

Препарат пенициллинацилазы Выход ампициллина, % Выход ампициллина на основании моделирования, %

Нативный фермент 20 18

а8ег149Агй рТЬг384А5п 30 31

По сравнению с диким типом мутантные формы а5ег149А^ и а8ег149А1^ рТЬг384А8п обладают более высокими значениями р0 и более низкими значениями у. Параметр у для обеих мутантных форм почти в 2 раза ниже, чем в случае нативного фермента, что свидетельствует о меньшей подверженности гидролизу тройного ацил-фермент-нуклеофнльного комплекса. Двухточечная мутантная форма а5ег149А^ рТЬг384Азп превосходит другие формы по способности катализировать синтез ампициллина. Увеличение выхода ампициллина было подтверждено экспериментально, а также при математическом

моделировании протекания реакции на основании определенных значений ключевых кинетических параметров реакции (табл. 7).

Эффективность и стереоселективность мутантных форм пенициллинацилазы в реакции ацильиого переноса на высокоосновные первичные аминосоединения

Важной задачей настоящего исследования был поиск мутантных форм пенициллинацилазы с увеличенной стереоселективностью и каталитической эффективностью в реакциях ацилирования высокоосновных первичных аминосоединений, в частности, первичных аминов и аминоспиртов. Скрининг ацилтрансферазной способности исследуемых мутантов в реакциях ацилирования таких соединений выявил две наиболее перспективные формы пенициллинацилазы -аАт§145Ьеи и рРЬе71Ьеи.

Таблица 8. Кинетические параметры ацильного переноса на высокоосновные аминосоединения, катализируемого пенициллинацилазой (0,1 М фенилацетамида; 0,1 М Н3В03, рН 9,5, 25°С).

Субстрат Препарат пенициллинацилазы Ро Г

З-Фенилглицин Нативный фермент 480 0,023

аА^145Ьеи 1167 0,008

Б-Фенилглицинол Нативный фермент 1 0

аАг§145Ьеи 17 0

Э-Мстиловый эфир фенилглицина* Нативный фермент 35 0

аА^145Ьеи 526 0

8-Фенилэтиламин Нативный фермент 2 0

аА^145Ьеи 22 0

♦Реакцию проводили при рН 8,0.

Определенные значения кинетических параметров ферментативного ацилирования аминосоединений (табл. 8) показывают,

что при использовании мутантной формы аА^145Ьеи в качестве катализатора для всех аминосоединений наблюдается увеличение нуклеофильности в 2-17 раз. Наименьшее увеличение наблюдается в случае аминокислоты, а наибольшее - в случае аминоспирта и метилового эфира аминокислоты. Следует отметить, что в случае всех исследуемых препаратов пенициллинацилазы для аминосоединений, за ислючением аминокислот, в исследуемом интервале концентраций параметр у равен 0. Этот факт имеет принципиальное значение, поскольку в этом случае эффективность ацильного переноса можно увеличивать пропорционально увеличению концентрации аминокомпонента в реакционной среде и таким образом добиваться наиболее высоких выходов целевого продукта.

Тем не менее, несмотря на высокую способность мутантной формы аА^145Ьеи катализировать ацильный перенос на различные высокоосновные аминосоединения (таблица 9), улучшения стереоселективности ацилирования эфиров аминокислот по сравнению

Таблица 9. Энантиоселективность ацилирования эфиров аминокислот Я- и Б-амидом миндальной кислоты (10 мМ КН2РО4, рН 8,0,25°С)

Субстрат Препарат пенициллинацилазы Ея Е5

(±)-Метиловый эфир аланина Нативный фермент 4,3 (в)* 91,2(8)

аА^1451-еи 2,0 (II) 35,1 (в)

(±)-Этиловый эфир валина Нативный фермент 4,8(8) 7,3 (8)

аА^145Ьеи 1,8 (8) 8,5 (8)

(±)-Метиловый эфир лейцина Нативный фермент 6,8 (в) 53,3 (в)

аА^14511еи 1,3 (в) 24,5 (в)

(±)-Метиловый эфир фенилаланина Нативный фермент 4,7(8) 17,1 (в)

осА^ШЬеи 1,4 (в) 11,4(8)

*В скобках указаны активные энантиомеры.

с нативным препаратом не достигается. Хотя начальные скорости синтеза целевого продукта в данных реакциях в случае мутантной формы аА^145Ьеи, как правило, выше, чем для нативного фермента (в отдельных случаях в сотни раз), стереоселективность реакции ацилирования ниже в 1,5-5 раз, чем в случае нативного фермента.

Таблица 10. Кинетические параметры ферментативного стереоселективного ацилирования рацемата 2-аминобутанола амидом Я-миндальной кислоты (рН 9,5, 25°С).

Препарат пенициллинацилазы Относительная начальная скорость накопления продукта синтеза Соотношение начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза Стерео-селективность

Нативный фермент 1 1 26

рРЬе71Ьеи 22 8,5 95

аА^145Ьеи 6,3 3,8 35

Наиболее существенного улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из Е.соИ путем введения одиночных мутаций в структуру удалось добиться в случае ферментативного ацилирования аминоспиртов (табл. 10). Мутантные формы пенициллинацилазы РРЬе71Ьеи и аА^145Ьеи значительно превосходили нативный фермент по трем основным параметрам синтетический реакции: стереоселективности, эффективности ферментативного переноса ацилыюй группы на аминоспирт и скорости синтеза целевого продукта, причем улучшение вышеперечисленных параметров достигало десятки раз.

Основные результаты и выводы

1. Показана возможность значительного улучшения каталитических свойст пенициллинацилазы из Е. coli путём замены единичных аминокислотных остатков в структуре фермента.

2. Путем замены pPhe71Leu и aArgl45Leu можно увеличить каталитическую активность и стереоселективность в реакциях ферментативного гидролиза N-ацильных производных аминоспиртов, а также эффективность ацильного переноса и стереоселективность в реакциях ацилирования аминоспиртов.

3. Путем замены aArgl45Leu можно увеличить нуклеофильную реакционную способность аминов, аминоспиртов и эфиров аминокислот в реакциях ферментативного ацильного переноса.

4. Путем замены aSerl49Arg можно увеличить нуклеофильную реакционную способность 6-аминопенициллановой кислоты в реакции ферментативного синтеза ампициллина.

5. Путем введения глутамата в положении 149 альфа-цепи можно увеличивать стабильность пенициллинацилазы.

Список публикаций

1. А.С. Ясная, О.В. Ямскова, Д.Ф. Гуранда, Т.А. Щербакова, В.И. Тишков, Швядас В.К. «Клонирование пенициллинацилазы из Escherichia coli. Каталитические свойства рекомбинантных ферментов», Вестник московского университета, Химия, 2008, № 2, с. 127-133.

2. И.В. Шаповалова, В.Б.Л. Алкема, О.В. Ямскова, Э. де Врис, Д.Ф. Гуранда, Д.Б. Янссен, В.К. Швядас. Мутация остатка PF71 в структуре

пенициллинацилазы из Escherichia coli приводит к улучшению энантиоселективности и каталитических свойств, Acta Naturae 2009, №3, 65-70.

3. О. В. Ямскова, С. В. Хороненкова С.В. Оптимизация условий культивирования, выделения и очистки мутантов пенициллинацилазы из Е. coli и исследование их каталитических свойств. Российская школа-конференция «Гинетика микроорганизмов и биотехнология», Москва-Пущино, 26 ноября - 2 декабря 2006.

4. O.V. Yamskova, S.V. Khoronenkova, D.F. Guranda, A.S. Yasnaya, Study of kinetic properties of different mutants of penicillin acylase from Escherichia coli. Proceedings of the 4-th Intern. Congress "Biotechnology -State of the Art & Prospects of Development", Moscow, Russia, March 1216, 2007, p.314-315.

5. Ясная A.C., Ямскова O.B., Хороненкова C.B. Изучение свойств мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli. «Ломоносов - 2007». Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам, Москва, 11-14 апреля 2007, с. 502.

6. Гуранда Д. Ф., Ямскова О. В., Панин Н.В., Швядас В. К. Заявка на патент RU2009142994 «Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы», Бюллетень № 35 ФГУФИПС от 20 декабря 2010 г.

Подписано в печать 28.02.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 1085 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1. 1. Общие сведения о пенициллинацилазе из Е. coli

1. 2. Методы определения ферментативной активности пенициллинацилазы

1.3. Очистка пенициллинацилазы

1. 3. 1. Источники пенициллинацилазы и способы её первичного выделения

1. 3. 2. Очистка пенициллинацилазы 22 1. 4. Применение ПА из Е.coli для получения энантиомерно чистых соединений

1. 5. Применение ПА из Е. coli в реакциях ферментативного ацильного переноса 43 1.6. Изменение каталитических свойств ПА при помощи мутагенеза 2. Экспериментальная часть

2. 1. Материалы 49 2. 2. Методы

2. 2. 1. Культивирование клеток, содержащих пенициллинацилазу и её 50 мутантные формы

2. 2. 2. Выделение пенициллинацилазы и её мутантных форм методом 51 осмотического шока

2. 2. 3. Очистка пенициллинацилазы и её мутантных форм при помощи 51 гидрофобной хроматографии

2. 2. 4. Определение активности пенициллинацилазы и её мутантных форм

2. 2. 5. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы и её 52 мутантных форм

2. 2. 6. Исследование термостабильности пенициллинацилазы и её мутантных 53 форм

2. 2. 7. Исследование рН-стабильности пенициллинацилазы и её мутантных

2. 2. 8. Количественное определение компонентов реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 2. 2. 9. Определение энантиомеров первичных аминосоединений методом предколоночной дериватизации ортофталевым альдегидом 2. 2. 10. Определение энантиоселективности реакции ферментативного гидролиза

И-фенилацетильных производных аминокислот, аминов и аминоспиртов 2. 2. 11. Определение энантиоселективности реакции ферментативного гидролиза ч[-(К)-манделил-производных аминосоединений 2. 2. 12. Химический синтез И-фенилацетильных производных аминосоединений 57 2. 2. 13. Определение кинетических параметров ферментативного ацильного переноса на 6-аминопенициллановую кислоту 2. 2. 14. Определение соотношения скоростей синтеза/гидролиза и 58 максимального выхода цлевого продукта в реакции ферментативного синтеза ампициллина

2. 2. 15. Исследование кинетики ферментативного ацилирования аминосоединений Л- и Э-амидом миндальной кислоты 2. 2. 16. Исследование кинетики ферментативного ацилирования первичного 60 аминосоединения амидом Я-миндальной кислоты

2. 2. 17. Исследование кинетических параметров ацильного переноса, катализируемого мутантными формами пенициллинацилазы, на Э-энантиомеры аминосоединений с использованием фенилацетамида в качестве ацильного донора и определение максимального выхода целевого продукта

3. Обсуждение результатов 62 3. 1. Очистка рекомбинантных пенициллинацилаз 64 3.2. Каталитическая активность мутантных форм пенициллинацилазы 69 3. 3. Стабильность мутантных форм 71 3. 4. Мутантные формы пенициллинацилазы в реакции гидролиза Т\т-ацильных производных аминосоединений 3. 4. 1. Ферментативный гидролиз К-фенилацетильного производного аспарагиновой кислоты 3. 4. 2. Ферментативный гидролиз ТЧ-ацильных производных первичных аминов 76 и аминоспиртов

3. 5. Мутантные формы пенициллинацилазы как катализаторы реакции ацильного 78 переноса

3. 5. 1. Влияние введения мутаций на эффективность ферментативного синтеза 78 ампициллина

3. 5. 2. Использование мутантной формы аА^145Ьеи и рРЬе71Ьеи в качестве катализатора ацилирования аминосоединений в водной среде

4. Выводы

Актуальность проблемы. Использование биокатализаторов в тонком органическом синтезе находит все более широкое применение. Привлекательность биокаталитических превращений заключается в уникальной субстратной и стереоспецифичности действия ферментов, возможности проведения реакций в "мягких", экологически благоприятных условиях. Успешным примером является применение пенициллинацилазы из Escherichia coli для модификации бета-лактамных антибиотиков как на стадии гидролиза природного пенициллина с целью получения ядра пенициллинов б-аминопенициллановой кислоты, так и на стадии ферментативного ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты с целью получения новых «полусинтетических» антибиотиков этого класса. На основании исследований последних лет, показавших высокую стереоселективность пенициллинацилазы, следует " предположить, что этот фермент найдет широкое применение и при получении энантиомерно чистых соединений. Детальные исследования выявили, что пенициллинацилаза обладает широкой субстратной специфичностью и высокой стереоселективностью в реакциях ферментативного гидролиза N-фенилацетильных производнь!^'"аминокислот. В "то же время было установлено, что каталитическая эффективность и стереоселективность фермента дикого типа в реакциях ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, а также в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных первичных аминов и аминоспиртов недостаточна для эффективного расщепления рацематов этих' соединений. На основании анализа научной литературы наиболее эффективным способом улучшения свойств пенициллинацилазы дикого типа представляется введение мутаций в структуру фермента. В случае пенициллинацилазы из Escherichia coli ранее было показано, что введением мутаций удается добиться улучшения4 способности фермента катализировать синтез бета-лактамных антибиотиков. Следует отметить, что поиск мутантных форм пенициллинацилазы с улучшенной способностью катализировать ферментативный ацильный перенос на первичные амины не может быть сведен к использованию мутаций, которые улучшали способность к синтезу антибиотиков из-за принципиальных отличий в структуре субстратов и в условиях проведения соответствующих реакций. Более того, наряду с целью улучшения каталитической эффективности, задачей диссертационной работы было также увеличение стереоселективности действия фермента, принципы регуляции которой в настоящее время практически не изучены.

Цель и задачи исследования. Основной задачей настоящей работы явилось изучение мутантных препаратов пенициллинацилазы из Е.соН по положению 145, 149 альфа цепи, а также 71, 384, 385 бета цепи с целью поиска форм фермента с увеличенной стереоселективностью и каталитической эффективностью в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях стереоселективного гидролиза соответствующих М-ацильных производных. В соответствии с этим, было необходимо изучить каталитические свойства мутантных препаратов пенициллинацилазы, в частности, получить гомогенные препараты мутантных форм пенициллинацилазы, провести первичную характеристику их стабильности и каталитической активности, детальные исследования каталитических свойств перспективных препаратов в реакциях стереоселективного ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, а также гидролиза соответствующих Ы-ацильных проиводных.

Обзор литературы 1.1. Общие сведения о пенициллинацилазе из Е. coli

Пенициллинацилаза (ПА) относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз (К.Ф.3.5.1.11). Впервые ПА выделили в 50-х годах из грибов Pénicillium chrysogenum и Aspergillus oryzae [1, 2], а в дальнейшем обнаружили у разных микроорганизмов [3, 4, 5, 6, 7, 8]. Хотя ПА из разных продуцентов характеризуются достаточно высокой степенью гомологичности [9], они могут достаточно сильно отличаться между собой по каталитическим свойствам [10, 11, 12, 13]. Уникальным свойством ферментов данного семейства является их способность избирательно катализировать расщепление амидной связи пенициллина, не затрагивая более лабильную ß-лактамную связь ядра антибиотика.

ПА из E.coli АТСС 11105 состоит из а- и ß- цепей (23.9 кДа и 61.5 кДа, соответственно) [14], которые получаются в результате протеолитической активации общего мембран но-связанного предшественника (стереоизображение трехмерной структуры пенициллинацилазы представлено на рис. 1).

Рис. 1. Стереоизображение трехмерной структуры пенициллинацилазы: а-субъединица показана красным цветом, (3-субъединица — зеленым.

Предшественник синтезируется как полипептид 92 кДа, состоящий из сигнального пептида, содержащего 26 аминокислот (а.к.), а также а- и р-субъединиц (209 а.к. и 557 а.к., соответственно), разделенных эндопептидом (54 а.к.) [15]. Обе цепи, из которых состоит пенициллинацилаза, тесно переплетены и формируют пирамидальную структуру с глубокой чашеобразной выемкой в центре, на дне которой находится активный центр фермента.

В структуре ПА выделяют 3 участка связывания субстрата: участок связывания ацильной части субстрата, участок связывания карбоксильной группы (или ее аналога) и участок связывания бокового радикала. Из анализа структуры комплекса фермента с фенилуксусной кислотой, являющейся сильным конкурентным ингибитором, следует, что связывание субстрата происходит внутри глубокой выемки в поверхности белковой глобулы, на дне которой находится гидрофобный "карман", образованный многочисленными ароматическими боковыми радикалами аминокислот. Фенильная часть ингибитора направлена внутрь этого "кармана", а карбоксильная группа взаимодействует с серином р1. Предполагается, что нуклеофильность гидроксильной группы И-концевого серина Р1 увеличивается за счет взаимодействия с собственной а-аминогруппой при участии молекулы воды.

Предложенный механизм катализа можно описать следующим образом. Атака атома О7 Ы-концевого серина по карбонильному атому углерода субстрата сопровождается передачей протона от гидроксильной группы на собственную □аминогруппу при участии мостиковой молекулы воды. При этом образуется оксианион, который затем предположительно стабилизируется путем взаимодействия с амидной группой РАбп241 и атомом азота полипептидного остова, принадлежащим рА1а69. Аминокислотные остатки рАзп241 и РА1а69 образуют оксианионный центр. Далее протон, акцептированный аминогруппой серина, передается по той же самой цепочке на уходящую группу, тетраэдрический атом углерода промежуточного комплекса вновь возвращает себе статус карбонильного и происходит завершение стадии ацилирования. Деацилирование протекает в общем случае в последовательности, зеркально симметричной той, что была описана выше. Предполагаемый механизм катализа схематично представлен ниже (рис. 2):

Asn241 n ончн

Seri о—н nh2 н'

Nv ßAla69 V

NH r2 h2n—r2 nu J

Seri r>H nh2 Ф to-h о X r" "nu „OH

Seri

Seri

-NH,

Рис. 2. Механизм катализа ПА из Е. coli.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫ ВОДЫ

1. Показана возможность значительного улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из Е. coli путём замены единичных аминокислотных остатков в структуре фермента.

2. Путем замены ßPhe71Leu и aArgl45Leu можно увеличить каталитическую активность и стереоселективность в реакциях ферментативного гидролиза N-ацильных производных аминоспиртов, а также эффективность ацильного переноса и стереоселективность в реакциях ацилирования аминоспиртов.

3. Путем замены aArgl45Leu можно увеличить нуклеофильную реакционную способность аминов, аминоспиртов и эфиров аминокислот в реакциях ферментативного ацильного переноса.

4. Путем замены aSerl49Arg можно увеличить нуклеофильную реакционную способность 6-аминопенициллановой кислоты в реакции ферментативного синтеза ампициллина.

5. Путем введения глутамата в положении 149 альфа-цепи можно увеличивать стабильность пенициллинацилазы.

1. Sakaguchi К. and Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1950, 23, 411-414.

2. Murao S. Penicillin-amidase. 3. Mechanism of penicillin-amidase on sodium penicillin. J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1955, 29, 404-407.

3. Hamilton-Miller J.M.T. Penicillinacylase. Bacteriol. Rev. 1966, 30, 761-771.

4. Vandamme E.J. and Voets J.P. Microbial penicillin acylases. Adv. Appl. Microbiol. 1974, 17,311-369.

5. Huang H.T., Seto T.A. and Shull G.M. Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Appl. Microbiol. 1963, 11, 1-6.

6. Mahajan P.B. Review. Penicillin acylases an update. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9, 537-554.

7. Кочеткова Е.Ф., Бартошевич Ю.Э. и Романова Н.Б. Биосинтез пенициллинацилаз. Антибиотики мед. биотехнол. 1986, 31(10), 729-740.

8. Virden R. "Structure, processing and catalytic action of penicillin acylase". Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 1990, 8, 189-218.

9. Verhaert R.M.D:,' Riemens A.M., van der Laan J.-M., van Duin J. and Quax W.J. Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from A.faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63(9), 3412-3418.

10. Svedas, V., Guranda, D., van Langen, L., van Rantwijk, F. and Sheldon, R. (1997) Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett. 417, 414-418.

11. Verhaert, R.M.D., Riemens, A.M., van der Laan, J.-M., van Duin, J. and Quax, W.J. (1997) Molecular cloning and analysis of the gene encoding thethermostable penicillin G acylase from A.faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 63,3412-3418. 1

12. Galunsky B., Lummer K. and Kasche V. Comparative study of substrate-and stereospecificity of penicillin G amidases from different sources and hybrid isoenzymes. Monatsh. Chem. 2000, 131(6), 623-632

13. Guranda, D.T., van Langen, L.M., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A. and Svedas, V.K. (2001) Highly efficient and enantioselective enzymatic acylation of amines in aqueous medium. Tetrahedron: Asymm. 12, 1645-1650.

14. Oh S.-J., Kim Y.-Ch., Park Y.-W., Min S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in E.coli. Gene. 1987, 56, 87-97

15. Schumacher G., Sizmann D., Haug H., Buckel P. and Bock A. Penicillin acylase from E.coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acid. Res. 1986, 14, 57135727.

16. Rolinson G. N., Batchelor F. R., Butterworth D., Cameron-Wood J., Cole M., Eustace G. C., Hart M. V., Richards M., Chain E. B. Formation of 6-Aminopenicillanic Acid from Penicillin by Enzymatic Hydrolysis. Nature. 1960, 187:236-237

17. Claridge C. A., Gourevitch A., Lein J. Bacterial Penicillin Amidase. Nature. 1960, 187:237-238. ' '

18. Huang H.T., Seto T.A., Shull G.M. Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Appl. microbiol. 1963, 11:1-6.

19. Cole M. Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115:747-756.

20. Bomstein J., Evans W. G. Automated colorimetric determination of 6aminopenicillanic acid in fermentation media. Anal. Chem. 1965, 37:576-578.96

21. Ныс П.С., Савицкая Е.М., Колыгина Т.С. Метод определения активности пенициллинамидазы. Антибиотики. 1973, 18(3):270-273.99

22. Balasingham К., Warburton D., Dunnill P., Lilly M.D. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 1972, 276(l):250-256.

23. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Метод количественного определения активности пенициллинацилазы по образованию фенилуксусной кислоты. Антибиотики. 1976, 21(8):694-697.

24. Shaikh K.j TalatbP.G.v Gang'D.M.-Spectrophotometric method for the estimation of 6-aminopenicillanic acid. Antimicrob Agents Chemother. 1973, 3(2): 194-197.

25. Baker W. L. A note on the detection of penicillin acylase activity in Escherichia coli by the reaction ampicillin with biuret reagent. J. Appl. Bacteriol. 1980,49:225-229.

26. Baker W. L., Blake B. D. Estimation of penicillin concentrations and penicillin metabolizing enzyme activities by the Lowry reaction. The Journal of Antibiotics. 1980, Nov:1386-1387.

27. Baker W. L. Application of the fluorescamine reaction with 6-aminopenicillanic acid to estimation and detection of penicillin acylase activity. Antimicrobal Agents and Chemotherapy. 1983, Jan., 26-30.

28. Baker W. L., Lonergan G. T. Chemistry of some fluorescamine-amine derivatives with relevance to the biosynthesis of benzylpenicillin by fermentation. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2002, 77:1283-1288.

29. Baker W. L. Modified fluorimetric assay for estimation ampicilloate concentration and its use for detecting p-lactamase and penicillin acylase activity in bacteria. Analyst. 1997, 122:447-453.

30. Ninkovic M., Riester D., Wirsching F., Dietrich R., Schwienhorst A. Fluorogenic assay for penicillin G acylase activity. Analytical Biochemistry. 2001, 292:228-233.

31. Cole M, Sutherland R. The role of penicillin acylase in the resistance of gram-negative bacteria to penicillins. J. Gen. Microbiol. 1966, 42(3):345-356

32. Oostendorp J.G. A quantitative microbiological determination of 6-aminopenicillanic acid. Antonie Van Leeuwenhoek. 1972, 38(2):201-206

33. Cole M. Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia'coli. Biochem. J. 1969, 115:747-756.

34. Cole M. Formation of 6-aminopenicillanic acid, penicillins and penicillin acylase by various fungi. Appl. Microbiol. 1966,14(1):98-103.

35. Manni P.E., Lipper R.A., Blaha J.M., Hem S.L. Analysis of potassium penicillin G and ' its : degradation products" by thin-layer chromatography. J. Chromatogr. 1973, 76(2):512-515.

36. Vandamme E.J., Voets J.P. Separation and detection of degradation products of penicillins and cephalosporins by means of thin-layer chromatography. J. Chromatogr. 1972,71 (1):141-148.-.-.

37. Никольский Jl.M. Экпресс-метод определения фенилуксусной кислоты в культуральной жидкости при биосинтезе бензилпенициллина. Антибиотики. 1979, 24(12):893-895.

38. Точёная Н.Пг,---Чайковская С.М., Серова Л.И. Определение пенициллинацилазы и ацилазы методом хроматографии в тонком слое сорбента при их совместном образовании штаммами. Антибиотики. 1975, 20(3):239-243.

39. Pruess D.L., Johnson MJ. Enzymatic deacylation of S35-benzylpenicillin. J Bacteriol. 1965, 90:380-383.

40. Cole M. Properties of the penicillin deacylase enzyme of Esherichia coli. Nature, 1964, 203(4944):519-520.

41. Березин И.В., Клёсов A.A., Швядас В.-Ю.К., Ныс П.С., Савицкая Е.М. Кинетика гидролиза бензилпенициллина, катализируемого пенициллинамидазой. Антибиотики, 1974, 10:880-887.

42. Березин И.В., Клёсов А.А., Марголин A.JL, Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.К. Изучение пенициллинамидазы из Е. coli рН-зависимость константы равновесия ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(6):519-523.

43. Plaskie A., Roets E.,-Vanderhaeghe Н. Substrate specificity of penicillin acylase of E. coli. J. Antibiot. (Tokyo). 1978, 31(8):783-788.

44. Simons H., Gibson T.D. Rapid continuous colorimetric enzyme assay for penicillin G acylase. Biotechnology Techniques. 1999, 13:365-367.

45. Findlater J;D., Orsi B.A-. Assay for the enzymic hydrolysis of penicillin and acylhydroxamates. Anal. Biochem. 1974, 58:294-300.

46. Walton R. Search for microorganisms producing cephalosporin С amidase. Dev. Ind. Microbiol. 1964, 5:349-353.

47. Kutzbach C, Rauenbusch Ei Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11 105. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1974 Jan;355(l):45-53

48. Ныс П.С., Колыгина T.C., Гараев M.M. Пенициллинамидаза из Е. coli. Прямой спектрофотометрический метод определения активности фермента. Антибиотики. 1977, 22(3):211-216.

49. Zhang Q., Zhang L., Han H., Zhang Y. A method for screening penicillin G scylase-producing bacteria by means of 2-nitro-5-phenylacetaminobenzoic acid. Anal. Biochem. 1986,156:413-416.

50. Szewczuk A., Siewinski M., Slowinska R. Colorimetric assay of penicillin amidase activity using phenylacetyl-aminobenzoic acid as substrate. Anal. Biochem. 1980,5:349-353.

51. Szewczuk A., Siewinski M., Slowinska R. Colorimetric assay of penicillin amidase activity using phenylacetyl-aminobenzoic acid as substrate. Anal. Biochem. 1980,103:166-169.

52. Kerr D.E. A colorimetric assay for penicillin-V amidase. Analytical Biochemistry. 1993,-209:332-334: •

53. Юшко М.И., Шамолина T.A., Гуранда Д.Ф., Синев А.В., Швядас В.К. Высокоспецифические субстраты для спектрофотометрического определения активности пенициллинацилазы, Биохимия 1998, 63(9): 1295-1300.

54. Марголин AJIv (1978) Кинетико-термодинамическое изучение ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков, катализируемого пенициллинацилазой. Дисс. канд. хим. наук, МГУ, Москва.

55. Sakaguchi К. and Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1950, 23:411-414.

56. Murao S. Penicillin-amidase. 3. Mechanism of penicillin-amidase on sodium penicillin. J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1955, 29:404-407.

57. Hamilton-Miller J.M.T. Penicillin acylase. Bacteriol. Rev. 1966, 30:761-771.

58. Vandamme E.J. and Voets J.P. Microbial penicillin acylases. Adv. Appl. Microbiol. 1974, 17:311-369.

59. Huang H.T., Seto T.A. and Shull G.M. Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Appl. Microbiol. 1963, 11:1-6.

60. Mahajan P.B. Review. Penicillin acylases an update. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9:537-554.

61. Кочеткова Е.Ф., Бартошевич Ю.Э. и Романова Н.Б. Биосинтез пенициллинацилаз. Антибиотики мед. биотехнол. 1986, 31(10):729-740.

62. Virden R. Structure, processing and catalytic action of penicillin acylase. Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 1990, 8:189-218.

63. Cole M. Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115:747-756.

64. Schumacher G., Sizmann D., Haung H., Buckel P., Böck A. Penicillin acylase from E. coli: unique gene protein relation. Nucleic Acid Research. 1986, 14(14):5713-5727

65. Alkema W.B.L., Dijkhuis A.-J., de Vries E., Janssen D.B. The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. 2002, 269:2093-2100.

66. Alkema W.B., Prins A.K., de Vries E., Janssen D.B., Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. 2002, 365(l):303-309.

67. Choi K.S., Kim J.A., Kang H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J Bacterid. 1992, 174(19):6270-6276.

68. De Leon A., Garcia B., Barba de la Rosa A.P., Villasenor F., Estrada A., Löpez-Revilla R. Periplasmic penicillin G acylase activity in recombinant Escherichia coili cells permeabilized with organic solvent. Process Biochemistry. 2003, 39(3):301-305.

69. Hiersbach H., Kühne A., Tisher W., Weber M., Wedekind F., Plapp R. Improvement of the catalytic properties of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, 43:679-684.

70. Forney L.J., Wong D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55(10):2556-2560.

71. Chou C.P., Lin W.-J., Kuo B.-Y., Yu C.-C. Genetic strategies to enhance penicillin acylase production in Escherichia coli. Enzyme and Microbal Technology. 2007, 27:766-773.

72. Dvorak H.F., Heppel L.A. .Metallo-enzymes released from Escherichia coliby osmotic shock. II. Evidence that 5'-nucleotidase and cyclic phosphodiesterase arezinc metallo-enzymes. J. Biol. Chem. 1968, 243(10):2647-53.102

73. Kutzbach С., Rauenbusch E. Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105. Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1974, 355(l):45-53.7Я

74. Forney L., Wong D.C. L., Ferber D.M. Selection of amidases with novel substrate specificities from penicillin amidase mutants of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55:2550-2555.

75. Erarslan A., Terzi I., Güray A., Bermek E. Purification and kinetics of penicillin G acylase from a mutant strain of Escherichia coli ATCC 11105. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1991, 51:27-40.

76. Van den Tweel W.J.J., Harder A., Buitelaar R.M. Stability and stabilization of enzymes. Proceedings of an international symposium held in Maastricht, The Netherlands, 22-25 November 1993, 398-405.

77. Karyekar S. K., Hegde M. V. Affinity purification of penicillin acylase on phenylacetic acid linked to INDION 48-R: effect of spacer variation. Biotechnology Techniques. 1989, 3(3):145-148.

78. Гуранда Д.Т., Воловик T.C., Швядас B.K. pH-Зависимость стабильности пенициллинацилазы из Escherichia coli. Биохимия. 2004, 69(12): 1700-1705. • .-

79. Szewczuk A., Kuropatwa М., Prusak Е., Wieczorek J. Two immunologically different penicillin amidases synthesized by Escherichia coli PCM 271. Archivum immonologiae ettherapiae experimentalis. 1984, 32:121-126.

80. Ht M ♦ I \ I * « ♦ ♦ 4 -»4 »\ '«

81. Fargues C., Chanel S., Grevillot G. An efficient three step preparative purification of penicillin acylase from Escherichia coli cells. Bioseparation. 1997, 6:343-351.

82. Rodrigues M., Güereca L., Valle F., Quintero R., Löpez-Munguia A. Penicillin acylase extraction by osmotic shock. Process Biochemistry. 1992, 27:217223.

83. Tiselius A., Hjerten S., Levin Ö. Protein chromatography on calcium phosphate columns. Arch. Biochem. Biophys. 1969, 65:132-155.

84. Mahajan P.B.-, BorkarP.B.'Novel'approaches to purification of penicillin acylase. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9:421-437.

85. Sudharan V.K., Shewale J.G. Hydrophobic interaction chromatography of penicillin amidase. Biotechnol. Let. 1987, 9(8):539-542.

86. Kasche V-Löffler F.-, Scholzen T., Krämer D.M., Boller T. Rapid protein purification using phenylbutylamine-Eupergit: a novel method for large-scale procedures. J. Chromatogr. 1990, 510:149-154.

87. Fonseca L.P., Cabral J.M.S. Evaluation of affinity and pseudo-affinity adsorption process-for-penicillin acylase-purification. Bioseparation. 1996, 6:293302.

88. Fonseca L. P., Cabral J. M. S. Optimization of pseudo-affinity process for penicillin acylase purification. Bioprocess Engineering. 1999, 20:513-524.li 1 . 11

89. Fonseca L.P., Cabral J.M.S. An integrated downstream processing strategy for the recovery and partial purification of penicillin acylase from crude media. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2002, 77:1176-1185.

90. Santarelli X., Fitton V., Verdony N., Cassagne C. Preparation, evaluation and application of new pseudo-affinity chromatographic supports for penicillin acylase purification. Journal of Chromatography B, 2000. 739:63-72.

91. Kefili R., Ridvan S., Yavuz H. Synthesis and characterization of pseudo-affinity ligand for penicillin acylase purification. International Journal of Biological Macromolecules. 2006, 39:250-255.

92. Fitton V., Santarelli X. Evaluation of immobilized affinity metal chromatography for purification of penicillin acylase. Journal of Chromatography B. 2001,754:135-140. * ' """< v *.

93. Sanches J., Verdoni N., Fitton V., Santarelli X. Efficient two-step chromatograph purification of penicillin acylase from clarified Escherichia coli ultrasonic homogenate. Journal of Chromatography B. 2001, 753:45-50.

94. Marcos J.C., Fonseca L., Ramalho M.T., Cabral J.M.S. 10th Portuguese Congress of Biochemistry, 1996, Braga, Portugal, book of abstracts.

95. Gavasane M. R., Gaikar V. G. Aqueous two-phase affinity partitioning of penicillin acylase from E. coli in presence of PEG-derivatives. Enzyme and Microbial Technology. 2003. 32:665-675.

96. Banzal-Mutalic R., Gaikar V. G. Purification and concentration of alkaline phosphatase by selective permeabilization of Escherichia coli using reverse micellar solutions.Enzyme and Microbial Technology. 2003, 32:14-26.i лл ш

97. Cheng S., Wei D., Song Q. Extraction penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis in recombinant Escherichia coli with cetyl-trimethylammoniumbromide. Biochemical Engineering Journal. 2006, 32:56-60.

98. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes feacalis. Канд. дисс. Хим. ф-т МГУ. М. 2000.

99. Liu S., Song Q., Wei D., Zhang Y., Wang X. Preparation of optically pure tret-leucine by penicillin G acylase-catalyzed resolution. Preparative Biochemistry & Biotechnology 2006, 36:235-241.

100. Li D., Cheng S., Wei D., Ren Y., Zhang D. Production of enantiomerically pure (S)- р-phenylalanine and (R)- р-phenylalanine by penicillin G acylase from Escherichia coli in aqueous mediumJ Biotechnolv Lett. 2007, 29:1825-1830.

101. Guy A., Dumant A. and Sziraky P. Kinetic resolution of p-hydroxyphenyl acetamides by hydrolysis with pen-G acylase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3(6):1041-1044.

102. Basso A., Braiuca P., Clementi S., Ebert C. Computational analysis of the aminic subsite of PGA explains the influence of amine structure on enantioselectivity. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2002, 19-20:423430.

103. Lummer K., Rieks A., Galunsky B., Kasche V. pH dependence of penicillin amidase enantioselectivity for charged substrates. Biochimica et Biophysica Acta 1999,1433: 327-334.

104. Svedas, V. K., Margolin, A. L., Borisov, I. L., and Berezin, I. V., Kinetics of enzymatic synthesis of benzylpenicillin, Enzyme Microb. Technol., 1980, 2:313317.

105. Wu Q., Chen С.-Х., Du L.-L., Lin X.-F. Enzymatic synthesis of amoxicillin via a one-pot emzymatic hydrolysis and condensation cascade process in the presence of organic co-solvents. Appl. Biochem. Biotechnol. 2010, 160(7):2026-2035.

106. Буханов A. JI. Катализируемый пенициллинацилазой синтез бета-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах. Канд. дис. Хим. ф-т. МГУ. М. 2005.

107. Lindsay J.P., Clark D.S., Dordik J.S. Combinatorial formulation of biocatalyst preparations for increased activity in organic solvents: salt activation of penicillin amidase. Biotechnology and bioengineering. 2004, 85(5):553-560.

108. Illanes A., Wilson L., Aguirre C. Synthesis of cephalexin in aqueous medium with carrier-bound and carrier-free penicillin acylase biocatalysts, Appl Biochem Bioteclmol, 2009, 157:98-110.

109. Bernardino S.M.S.A., Fernandes P., Fonseca L.P. A new biocatalyst: penicillin G acylase immobilized in sol-gel micro-particles with magnetic properties. Biotechnol. J. 2009, 4:695-702.

110. Illanes A., Wilson L., Aguirre C. Synthesis of cephalexin in aqueous medium with carrier-bound and carrier-free penicillin acylase biocatalysts. Appl biochem biotechnol, 2009, 157:98-110.

111. Bergeron L.M., Tokatlian T., Gomez L., Clark D.S. Redirecting the inactivation pathway of penicillin amidase and increasing amoxicillin production via a thermophilic molecular chaperone. Biotechnology and bioengineering, 2009, 102(2):417-424.

112. Bergeron L.M., Gomez L., Whitehead T.A., Clark D.S. Self-renaturing enzymes: design of an enzyme-chaperone chimera as a new approach to enzyme stabilization. Biotechnology and bioengineering, 2009, 102(5):1316-1322.

113. Oh B., Kim K., Park J., Yoon J., Han D., Kim Y. Modifying the substratespecificity of penicillin G acylase to cephalosporin acylase by mutating active-siteresidues. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 319(2):486-492. 1

114. Flores G., Soberon X. and Osuna J. Production of a fully functional, permuted single-chain penicillin G acylase. Protein Sci, 2004,13:1677-1683.

115. Forney L. J., Wong D. C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 1989, 55(10):2556-2560.

116. Roa A., Garcia J. L., Salto F., Cortes E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J. 1994, 303:869-875

117. Svedas V., Guranda D., van Langen L., van Rantwijk F., Sheldon R. Kineticstudy of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett. 1997, 417:414-418.109

118. Гуранда Д.Т., Воловик Т.С., Швядас В.К. pH-зависимость стабильности пенициллинацилазы из Escherichia coli., Биохимия, 2004, 69(12):1700-1705.

119. Alkema W.B., Prins A.K., de Vries E., Janssen D.B., Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. 2002, 365(l):303-309.

120. Van der Laan J. M., Riemens A. M., Quax W. J. W09605318 Mutated penicillin G acylase genes, 22.02.1996.

121. You L., Usher J. J., White B. J., Novotny J. W09820120 Mutant penicilling acylases, 14.05.1998.

122. You L., Usher J. J., White B. J., Novotny J. US6403356 Mutant penicillin g acylases, 11-06-2002 •1.IO

123. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I., Guranda D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions. Factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann N Y Acad Sei. 1996, 799:659-69.

124. Шаповалова И. В. Характеристика новых мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli. Канд. дис. хим. ф-т МГУ. М. 2007.

125. Химюк А. Я. Стереоселективное ацилирование аминосоединений в водной среде. Канд. дис. хим. ф-т МГУ. М. 2005.