Биохимический синтез сложных эфиров жирных кислот в системе без органического растворителя тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

/1 * \ - с* •

йл ч 'Л

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

на правах рукописи УДК: 665,135,091:664.788:577,152.311 (043.3)

Л У Т О В А ТАТЬиНА ЛЬВОВНА

БИОХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ МИРНЫХ КИСЛОТ В СИСТЕМЕ БЕЗ ОРГАНИЧЕСКОГО РАСТВОРИТЕЛЯ

Специальность: 02.00,10 - Биоорганическая химия, химия

природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Сртшютч Ю, А.

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................... 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая характеристика неионогенных поверхностно-активных веществ, в частности, СЗЖК и их применение в косметике. ................................................... 8

1.2 Способы получения СЗЖК..................................13

1.3 Краткая характеристика хроматографических методов анализа объектов исследования.............................. 22

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы и объекты исследования..................................31

2.2 Методы исследования

2.2.1 Определение влажности образца просяной мучки............ 34

2.2.2 Приготовление реакционной системы.........................................34

2.2.3 Метод выделения липидного комплекса...................... 36

2.2.4 Метод фракционного разделения липидного комплекса....... 36

2.2.5 Метод радиоактивной метки...............................38

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование закономерностей ферментативного синтеза СЭ1К на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя

3.1.1 Исследование возможности проведения ферментативного синтеза СЗЖК в системе без органического растворителя, зависимость образования фракции СЗЖК от времени инкубирования. ............................................................................39

3.1.2 Изучение ферментативного синтеза СЭ1К в системе без органического растворителя с использованием метода радиоактивного анализа....................................... 42

3.2 Разработка комплексных хроматографических методов (ТСХ и ВЭЖХ) для анализа липидов природных объектов

3.2.1 Подбор условий разделения сложных смесей липидов методом

3.2.2 Подбор условий разделения сложных смесей липидов методом ВЭЖХ........................................................................58

3.3 Подбор оптимальных условий синтеза СЭ1К на основе липид-ного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя

3.3.1 Исследование ферментативного синтеза СЭ1К на основе ли-пидного комплекса, просяной мучки в системе без органического растворителя в зависимости от времени инкубирования. ..................................................64

3.3.2 Кинетические исследования реакции этерификации. Установление порядка реакции.......................................................69

3.3.3 Исследование возможности проведения ферментативного синтеза С31К из добавленных жирных кислот в системе без органического растворителя..........................................81

3.3.4 Исследование возможности регулирования жирнокислотного состава СЭ1К при помощи реакции переацилирования с использованием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя.................................. 87

ВЫВОДЫ........................................................91

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................93

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Обострение проблемы сырьевого обеспечения, необходимость поиска и внедрения более эффективных видов сырья делает актуальным исследование "новых1* нетрадиционных источников получения сложных эфиров жирных кислот (СЗЖК),

Сложные эфиры жирных кислот представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые используются в различных областях промышленности в качестве пластификаторов, эмульгаторов, диспергаторов, стабилизаторов и др. Они улучшают реологические и косметические свойства кремов и мазей путем стабилизации эмульсий и эффективной гомогенизации многокомпонентных смесей. В пищевой промышленности их применяют при производстве маргарина, в хлебопечении, кондитерском, мыловаренном, сахарном, ликеро-водочном и мясомолочном производствах.

В последние годы неионогенные поверхностно-активные вещества приобретают все возрастающее значение. Самыми крупными потенциальными потребителями их являются нефтяная, химическая и легкая промышленность. Однако, производство неионогенных ПАВ характеризуется высоким расходом сырья и материалов, значительными потерями конечной продукции. Их получают из природного сырья (натуральные ПАВ), химическим, микробиологическим и, в последнее время, биохимическим способом.

Просяная мучка содержит в своем составе липиды, крахмал, белки, витамины и представляет большой интерес, поскольку хорошо известна в пищевой и микробиологической промышленности как источник растительного белка в составе кормовой смеси, как питательная среда, способствующая накоплению значительного количества биомассы.

Способ биохимического синтеза СЭ1К, при котором фермент и один из субстратов (жирные кислоты (ЖК)) локализованы в растительном объекте (просяная мучка) был показан в работах кафедры "Физическая

и коллоидная химия" МГУПП (1998 г).

Проведенные ранее исследования позволили определить, что биохимический синтез СЭ1К происходит под действием фермента - липазы, локализованного вместе с жирными кислотами внутри просяной мучки. Разработан метод получения ферментного препарата,обладающего липо-литической активностью, изучена его стабильность. Доказана возможность биохимического синтеза С31К низко- и высокомолекулярных спиртов на основе липидов просяной мучки. Показана возможность получения оксиэтилированных сложных эфиров ферментативным синтезом с участием липазы просяной мучки в среде органического растворителя.

Данная работа является логическим продолжением изучения биохимического синтеза СЭ1К под действием липазы просяной мучки на основе липидного комплекса просяной мучки и жирных спиртов, но уже в системе без органического растворителя, так как присутствие в реакционной среде растворителя накладывает на данный способ ограничения, тогда как преимущество реакционной среды, состоящей исключительно из субстратов и фермента очевидно. При этом исключено использование токсичных и дорогих растворителей, которые делают продукты синтеза непригодными, если следы растворителя остаются в них.

Кроме того, было проведено исследование - способна ли липаза этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные внутри просяной мучки, но и добавленные в систему, поскольку это позволит синтезировать заменители восков заданного жирнокислотного состава за счет включения желаемых жирных кислот в сложные эфиры.

Помимо этого, необходимо было проследить динамику изменений во времени не только свободных жирных кислот, но и отдельных фракций образованных сложных эфиров. Это возможно только с применением современных физико-химических методов анализа, среди которых предполагалось использовать различные варианты хроматографии и метод радиоактивной метки.

о

В случае неоднородности состава липидного комплекса, метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) является наиболее показательным, т.е. быстро позволяет проследить динамику изменения во времени отдельных фракций синтеза СЭЖК. Однако, в ряде случаев эффективность результатов анализа сложных смесей, содержащих эти вещества ( например, йОПОЛЬЬиЬопИс 1 шалЛИп иш1уфил \,Чс¡Хин/ или мерп и'ермалия) не отвечает задачам исследования. Повышения эффективности хрома-тографических методов может быть достигнуто на основе более широких исследований методического характера. Главная задача при этом состоит в повышении эффективности метода ТСХ и расширением его аналитических возможностей ( отечественные пластины, использование пластин с привитыми фазами ). Повышение эффективности разделения сложных смесей липидов, очевидно, можно добиться как путем более полного использования индивидуальных хроматографических методов, так и путем их комбинирования.

В связи с этим очевидна актуальность задачи исследования биохимического синтеза СЭЖК с участием липазы и жирных спиртов в системе без органического растворителя и разработке надежных хромато-графических методов анализа.

Цель работы. Целью настоящей работы является исследование возможности проведения биохимического синтеза СЭЖК под действием липазы просяной мучки в системе без растворителя и изучение способности липазы просяной мучки этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные в ней самой, но и добавленные искусственно, как свободные, так и в составе триацилглицеридов, что позволит получать заменители восков заданного жирнокислотного состава.

При этом необходимо было решить следующие конкретные задачи:

- исследовать условия проведения ферментативного синтеза СЭЖК в системе без органического растворителя;

- изучить кинетические характеристики ферментативного синтеза

СЭ1К в системе без органического растворителя;

- исследовать возможность получения восков заданного жирнокислот-ного состава за счет включения желаемых жирных кислот в зфиры;

- подобрать элюирующие системы для метода ТСХ на новых отечественных пластинах, обеспечивающих эффективное разделение анализируемых веществ:

- разработать комплексный метод определения изучаемых соединений на основе гибридизации методов ТСХ и ВЭЖХ.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые показана возможность осуществления биохимического синтеза СЭЖК, при котором используется фермент, локализованный вместе с одним из субстратов (жирными кислотами) непосредственно в растительном объекте (просяной мучке) в среде, не содержащей органического растворителя. Подобраны оптимальные условия проведения синтеза СЭЖК в системе без растворителя, где переменными параметрами были: температура, время инкубирования, концентрация субстратов. Впервые установлено, что липаза просяной мучки способна этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные в ней самой, но и добавленные искусственно. Область применения - использование в биотехнологии для синтеза восков с желаемыми включениями жирных кислот и жирного спирта. Впервые исследованы закономерности удерживания 1К и СЭ1К на отечественных пластинах "Сорбтон", что позволило проследить динамику изменения этих фракций в сложной биологической массе. Подобраны оптимальные условия для определения методом ВЭЖХ динамики накопления СЭЖК в исследуемых объектах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1,1 Краткая характеристика неионогепных поверхпостно-актв-ных веществ, в частности, СЭШ и их приметит в косметике.

Характерной особенностью современного производства косметических продуктов является его лечебно-профилактическое направление при создании препаратов, содержащих вещества, активно действующих на кожу. Сегодня лекарственные растения как биологически-активные вещества, находят широкое применение в косметических препаратах. [3.14,68,73]

Среди сырьевых веществ, используемых в косметике, липиды занимают одно из главных мест. Долгое время применяли наиболее легко доступные животные жиры и растительные масла, такие как свиное сало и жир, пальмовое, оливковое и миндальное масла. Они состоят из триацилглицеридов высших насыщенных (лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая) и ненасыщенных (олеиновая, линолевая, линоленовая) жирных кислот. Этот химический состав в значительной степени опоеделяет легкость проникновения их в волосяной фолликул и верхние слои эпидермиса. В связи с этим они являются самыми подходящими основами питательных и в меньшей степени защитных кремов. [8,68]

Отрицательным свойством липидов является их способность к окислению и прогорканию, связанная с ненасыщенным характером триацилглицеридов жирных кислот. Продукты этих процессов - альдегиды, кетоны и жирные кислоты - оказывают раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки. Эти процессы задерживаются путем гидрогенизации ненасыщенных жирных кислот, однако, при этом распадаются витамины О, Р и Е. [8,68]

Важное значение имеют эфиры жирных кислот с одноатомными спиртами - изопропилмиристат, изопропилпальмитат, изопропиллаури-нат. легко проникающие в кожу и непрогоркающие. [8,68]

Наиболее часто в косметике используют углеводороды (вазелин, парафин, церезин и др.), воски, представляющие собой сложные эфи-ры высших жирных кислот с одноатомными, реже двухатомными спиртами. Также воски содержат свободные жирные кислоты, свободные спирты, стерины и др. Из натуральных восков для косметики важны пчелиный воск, спермацет, ланолин, [9,141

Спермацет - воск, получаемый из жира особых полостей черепа кошалота. Твердая, белая, жирная на ощупь масса с перламутровым блеском и температурой плавления 45-54 ° С. В отличие от жира, спермацет не оставляет на бумаге жирных пятен и мало подвергается прогорканию. Добавленный в крема спермацет, придает им более плотную консистенцию и эмульсионные свойства, вследствие чего применяется для смягчающих, охлаждающих кремов и губной помады. [68] За последние годы произошло резкое сокращение добычи кошало-тов, что ограничивает ресурсы получения спермацета. Спермацет рассматривается как один их дефицитнейших видов косметического сырья.

Ланолин - жироподобное вещество, получаемое путем промывания овечьей шерсти в мыльной воде или экстракцией органическими растворителями. Не разлагается, не раздражает кожу человека и хорошо всасывается. Очищенный ланолин представляет собой смесь жиров и восков, содержащих холестерин, Ланолин, обладающий большой гидро-фильностью, поглощает значительное количество воды (около 150%), не теряя при этом мазеобразной консистенции, поэтому широко применяется в косметике для приготовления кремов и охлаждающих мазей. [68,751

Пчелиный воск вырабатывается восковыми железами пчел и выделяется в виде тончайших пластинок. Пчелиный воск, отбеленный на солнце белый воск быстро прогоркает, поэтому белый воск консервируют тут же после отбеливания. [68,75]

Все рассмотренные воски природного происхождения - это прежде всего с,.ножные эфиры высших жирных кислот и высокомолекулярных спиртов. Как уже указывалось выше, в связи с дефицитом восков природного происхождения в косметической промышленности, получают искусственные воска на основе сложных эфиров жирных кислот (пальмитиновой и стеариновой) и высокомолекулярных алифатических спиртов, содержащих двенадцать и более атомов углерода, а также смеси полиэтиленгликолей с молекулярным весом 300, 500 и 600. Синтетические воска служат дешевым заменителем дорогостоящих природных восков, обладают эмульгирующей способностью и поэтому могут быть использованы в качестве основного или вспомогательного эмульгатора в составе кремов, лосьонов, препаратов для бритья, декоративных косметических изделий. Поскольку природные продукты представляют собой смеси, содержащие большое количество различных органических соединений, а современная промышленность стремится производить изделия постоянного качества,поэтому устойчивые синтетические вещества заметно потеснили собственно натуральные. [3,593 Использование синтетических поверхностно-активных веществ (ПАВ), к которым относятся сложные эфиры жирных кислот, позволит не только восполнить дефицит природного сырья, источники которого ограничены, но и достигнуть большего разнообразия свойств изготовляемой продукции. [22,50,60]

ПАВ широко используются не только в косметическом производстве, но и в других отраслях промышленности. Так например, неионо-генные ПАВ находят применение в качестве жирующих препаратов в кожевенном производстве. В нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности их используют в качестве эмульгаторов и деэ-мульгаторов. Применение неионогенных ПАВ в лакокрасочной промышленности и производстве химических волокон, позволяет значительно интенсифицировать технологические процессы. Широкое применение

находят ПАВ в пищевой промышленности, кондитерском производстве, мыловарении, сахарном, ликеро-водочном и мясомолочном производствах. [1,10, 17, 20, 50, 51, 58, 613

В настоящее время существует также необходимость в дополнительных источниках получения восков и это может быть осуществлено с помощью биотехнологии. С тех пор, как в 1971 году вышел запрет на импорт каша/ютового жира, изыскиваются новые источники получения восков. Наибольшее внимание исследователей было сконцентрировано на масле Жожоба, основными компонентами которого являются (в % от суммы): сложные эфиры - эйкозенилолеат (5.7%), эйкозенилэй-козеноат (28%), свободные жирные кислоты присутствуют в количестве 100 мг на 1 кг воска. Однако, попытки увеличить продуктивность этого растения посредством агрономии и селекции находятся пока в развитии: необходимо 10-12 лет, прежде чем новые растения дадут урожай. [102]

В тоже время р�