Биологически активные мембранотропные полимеры на основе малеинового ангидрида тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

РГ8 Ом

им. А.В.ТОПЧИЕВА

_ О I< Л П 1 - ■

На правах рукописи

МУНШИ КАЛЬЯН

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МЕМБРАНОТРОПНЫЕ ПОЛИМЕРЫ НА ОСНОВЕ МАЛЕИНОВОГО АНГИДРИДА

02.00.06. - Химия высокомолекулярных соединений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1997

Работа выполнена в ИНХС им. А.В.Топчисвя РАН

Научные руководители:

доктор химических наук

ЛЛ.Стоцкая

кандидат химических- наук

А.В.Сербии

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Б.А.Кренцель

Официальные оппоненты: д.х.н., проф. Е.Ш.Финкельштейн (ИНХС им.А.В.Топчиева РАН)

д.х.н., проф. М.И.Штильман (РХТУ им.Д.И.Менделеева)

Ведущая организация: Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита диссертации состоится " 13 " ноября 1997 г. в 15 час. на заседании диссертационного совета ( Д 002.78.01 ) в Ордена Трудового Красного Знамени Институте нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН по адресу: 117912 Москва В-71, Ленинский проспект 29.

Автореферат разослан " 09 " октября 1997 г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНХС им. А.В.Топчиева РАН

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.х.н.

И. С. Калашникова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы

На сегодняшний день важной задачей науки о полимерах медицинского назначения является использование особенностей макромолекулярного состояния вещества для создания нового поколения лекарственных препаратов высокой эффективности, сочетающих в себе ряд ценных фармакологических свойств. Решение этой задачи является перспективным направлением в частности в химиотерапии вирусных заболеваний, где до сих пор используемые известные тпкомолекулярные препараты обладают высокой токсичностью и малой эффективностью, что часто исключает их применение в клинике.

Успехи химиотерапии вирусных инфекций, на наш взгляд, целиком зависят как от фундаментальных исследований в области молекулярной биологии вирусов, так и молекулярного конструирования химических соединений с заданным комплексом свойств, т.е. при поиске противовирусных препаратов нового поколения необходимо использовать известные свойства химических соединений для целенаправленного воздействия на тот или иной пап репродукции вируса. Изучение должно идти от предполагаемого механизма действия к препарату.

Анализ последних достижений в области вирусологии позволил выделить наиболее уязвимые стадии репродукции вирусов. Оказалось, что все они тем или иным способом связаны с клеточными мембранами.

В международной практике при лечении вирусных инфекций, вызываемых вирусами гриппа (РНК - содержащими вирусами), применяется группа препаратов на основе полициклических углеводородов адамантанового и норборнанового ряда.

Изучение механизма действия данных препаратов показало, что все эти соединения являются мембранотропными, т.е. блокирующими мембранозависимые процессы вирусной репродукции. Под термином мембранотропности здесь и далее подразумевается сродство препарата к клеточным мембранам, которое проявляется на уровне механизма противовирусного действия.

Однако, противовирусные препараты на основе производных адамантана и норборнана высокотоксичны, и к ним быстро развивается резистентность вируса.

Одним из перспективных и возможно наиболее удачных путей создания нового поколения противовирусных лекарственных препаратов с повышенной эффективностью и низкой токсичностью является получение конъюгатов известных низкомолекулярных соединенений противовирусного действия с полимерными носителями. Такие препараты соединяют в себе специфические особенности поведения макромолекул и их действия в организме (распределение по органам и тканям, время пребывания в организме, механизм транспорта в клетку и др.) с активным биологическим началом низкомолекулярного соединения.

Особое внимание исследователей при создании нового поколения малотоксичных лекарственных препаратов противовирусного действия для использования в качестве полимеров-носителей привлекают поликарбоксилаты в связи с их собственными ценными фармакологическими свойствами, такими как противовирусная и противоопухолевая активность, интерферониндуцирующее и иммуностимулирующее действие.

Таким образом, для создания новых противовирусных лекарственных препаратов с оптимальной активностью, с нашей точки зрения, требуется решение ряда сложных задач, таких как разработка методов синтеза малотоксичных поликарбоксилатов и химической модификации синтезированных полимеров различными низкомолекулярными лекарственными веществами, изучение природы связи в образующихся конъюгатах и ее корреляция с биологической активностью. При этом необходимо отметить важную роль гидрофильно-липофильного баланса, оказывающего существенное влияние на снижение токсичности и пролонгацию действия препарата, а также его растворимость.

Принимая во внимание сказанное, синтез новых макромолекулярных противовирусных соединений путем разработки селективных методов химического присоединенеия мембранотропных фрагментов к многофункциональным полимерным биологически активным соединениям анионогенного типа, несомненно, является чрезвычайно интересной и актуальной проблемой.

1.2. Цель работы и основные залами исследования

Цельюнастоящей "" работы "" является" создание ""нового" поколения--------------------

малот оксичных высокоэффективных противовирусных лекарственных препаратов мебранотропного действия. Для осуществелепия этой задачи были проведены:

- синтез водорастворимых сополимеров: а) малеинового ангидрида и ДИВИНИЛОВ010 эфира, б) малеинового ангидрида и фурана, в) малеинового ангидрида и 2,3-дигидрофурана с различными макромолекулярными характеристиками;

- химическая модификация синтезированных сополимеров, а также сополимера малеинового ангидрида с метилвиниловым эфиром различными производными адамантана;

- изучение структуры и состава синтезированных макромолекулярных продуктов;

- изучение их биологической активности.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы

Научная новизна данной работы заключается в использования полимерного состояния вещества для создания мембранотропных препаратов, а именно в синтезе поликарбоксилатных полимеров, содержащих различные мембранотропные фрагменты в боковой цепи. В качестве мембранотропного вектора использованы аминопроизводные адамантана, химически связанные с полимерным носителем спейсерными группами различной длины, строения и конфигурационной подвижности, а в качестве полимерной матрицы -разработанные ранее нетоксичные сополимеры малеинового ангидрида, обладающие собственной биологической активностью: интерфероногенным и исспецифическим иммуноопосредованным противовирусным действием и отношении широкого спектра вирусных инфекций.

Определена молекулярная масса, при которой сополимер после химической модификации обладает наибольшей терапевтической эффективностью при малой токсичности и способен выводиться из организма через почки.

Впервые разработаны эффективные методы химической модификации сополимеров различными мембранотропными векторными группами адамантанового ряда. Изучены структура и состав мембранотропных сополимеров.

Изучена • эффективность впервые синтезированных адамантан-содержащих полимерных соединений при блокировании репродукции вируса и их влияние на мембранный транспорт ионов. Показано, что они по антивирусной активности не только превосходят действие противогриппозных низкомолекулярных производных адамантана, но и обладают значительно меньшей токсичностью (в 4-5 раз) и явно выраженной активностью против вируса гриппа В, резистентного к ремантадину.

Выявлено значительное ингибирующее действие новых мембранотропных полимерных препаратов на ВИЧ-инфекцию.

Реализован новый механизм биологического действия впервые синтезированных мембранотропных полимерных соединений, отличающийся от ранее известных адамантансодержащих низкомолекулярных препаратов: их ингибирующий эффект (в отличие от ремантадина) проявляется в большей степени на этапах выхода вирусного потомства из клеток, а не в процессе вирусспецифических синтезов.

Показана плодотворность и перспективность принципа макромолекулярного конструирования противовирусных препаратов на основе сополимеров малеинового ангидрида и мембранотропных векторов.

1.4. Основные положения, вынесенные на защиту

- разработка методов синтеза различных сополимеров малеинового ангидрида с определенными макромолекулярными характеристиками;

- разработка методов химической модификации синтезированных сополимеров различными производными адамантана;

- структура и состав создаваемых мембранотропных полимеров, их биоэлектрические и токсикологические характеристики;

- терапевтическая эффективность полимерных лекарственных препаратов, нового поколения против вируса гриппа и других опасных вирусных заболеваний, в частности ВИЧ-инфекции.

1.5. Апробация и публикации

Основные положения и выводы настоящей диссертационной работы

были представлены на 5-ти Международных и Всероссийских симпозиумах !!----

конференциях. Основное содержание диссертационной работы изложено в ¿0 публикациях (см. список).

1.6. Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на У30 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисунками, содержит 2*!/ таблиц и состоит из введения, 6 глав, включая литературный обзор, выводов и списка цитируемой литературы более 150 наименований.

2. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ОСНОВНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Синтез сополимеров малеинового ангидрида (М А) с различными макромолекулярнымн характеристиками (ММ\)

Учитывая ионогенный характер внешней поверхности клеточных мембран, биологически активные мембраногропные полимеры должны нести на себе заряды. В связи с этим для получения подходящей полимерной матрицы был осуществлен целенаправленный синтез чередующихся сополимеров МА, потенциально способных обладать биологической активностью противовирусного и противоопухолевого действия и склонных к образованию в водной среде отрицательно заряженных карбоксильных групп, фиксированных вдоль цепи в определенной последовательности. Изменяя химическое строение сомономерного звена, можно управлять жесткостью цепи и ее конформацией, гидрофильно-гидрофобным балансом, а используя регулятор роста полимерной цепи, можно управлять молекулярной массой и добиться проявления биологической активности при небольших молекулярных массах, не оказывающих токсического действия на организм.

Роль пятичленных кислородсодержащих циклов в проявлении биологической активности полимерных соединений известна. Это дало основание выбрать в качестве сомономера дивиниловый эфир (ДИВЭ), способный к реакции циклосополимеризации с образованием пятичленных циклов в полимерной цепи.

Чтобы получить сополимер с заданными молекулярными массами (Мп), в качестве регулятора роста полимерной цепи был использован тетрагидрофуран (ТГФ), способный к реакциям передачи цепи.

Радикальную сопополимеризацию МА с ДИВЭ проводили в ампулах в вакууме с добавлением в разных концентрациях ТГФ, а также в его отсутствии. В качестве инициатора использовали азо-бис-изобутиронитрил (АИБН).

Нами исследовано изменение значения М „ сополимера ДИВЭМА в зависимости от условий синтеза. Показано, что с увеличением концентрации ТГФ, как и следовало ожидать, М„ ДИВЭМА уменьшается. Одновременно уменьшалась характеристическая вязкость [т]] раствора сополимера (рис. 1).

[ТГФ ]0, моль/л

Рис.Х. Зависимость значении М» ДИВЭМА (•) п |rjJ раствора ДИВЭМА (А в В) от концентрации ТГФ. Продолжительность сополимерюации t = 3 ч.; нач. концентрация: [МА]о = 0,6 моль/л; [ЦИВЭ]о = 0,3 моль/л; [АИБН]о = 0,005 моль/л; температура сополимерюации t = 60 °С; растворитель - хлороформ; И измерена при 32 °С в растворе ацетона ( А ) и N-метил пвррояидона (В ).

К началу настоящей работы было известно, что существуют 2 структурные модификации ДИВЭМА: "пирановая", т.е. содержащая 6-ти членный кислородный никл (I), и "фурановая" с 5-ти членным циклом (II),

причем___считали,____что____в______полярном---растворителе--(ацетоне)

образуется"гшраконый" цикл, а в неполярном (хлороформе) - "фурановый" цикл.

Однако, в лаборатории исследования физико-химических свойств полимеров ИНХС им. А.В.Топчиева РАН при изучении структуры ДИВЭМА спектральными методами было показано, что при синтезе ДИВЭМА в растворителях, существенно различающихся но полярное! и, образуется сополимер, содержащий преимущественно симметричный 5-ти членный кислородный цикл в биниклической структуре (II).

Нами установлено, что выбор растворителя сополимеризации оказывает существенное влияние на выход ДИВЭМА. При одинаковых условиях в растворителе с низкой полярностью - хлороформе выход ДИВЭМА выше, чем в растворителе с высокой полярностью - ацетоне. При этом в растворе хлороформа наблюдалась тенденция к уменьшению выхода сополимера с увеличением концентрации ТГФ. В то же время в растворе ацетона выход оставался практически неизменным (рис.2).

С целью изучения влияния жесткости цепи на биологическую активность, кроме ДИВЭМА, в качестве полимерной матрицы также использовали другие сополимеры, содержащие в цепи 5-тичленные кислородные циклы.

ВО

\

л..

50

О

2

3

4

[7ГФ]С, моль/л

Рис.2. Зависимость выхода ДИВЭМА от концентрации ТГФ. • - в хлороформе; А - в ацетоне; t = 65 °С; т = 3 ч; [МА]о = 0,6 моль/л; [ЦИВЭ]о = 0,3 моль/л; [АИБН]о = 0,005 моль/л.

По аналогичной схеме были синтезированы сополимер МА с фураном (Ф) и сополимер МА с 2,3-дигидрофураном (ДГФ). Соответствующие сополимеры ФМА (III) и ДГФМА(1У) содержат 5-ти членные кислородные циклы в полимерной цепи.

В табл. 1 приведены макромолекулярные характеристики ФМА, полученного в различных условиях.

Из таблицы видно, что а) процесс сополимеризации МА с Ф протекает с меньшей скоростью по сравнению с сополимеризацией МА с ДИВЭ; б) в случае использования хлороформа в качестве растворителя выход ФМА увеличивается; в) при увеличении мольного соотношения [МА]о : [Ф]о значения Ма сополимера и соответственно значения характеристической вязкости [т]] уменьшаются, что свидетельствует об участии МА в реакциях передачи цепи; г) при мольном соотношении [МА]о:[Ф]о =1:1 наблюдается максимальный выход сополимера.

.О

III

IV

Таблица 1.

Зависимость выхода и макромолекулярных характеристик ФМА от условий синтеза

N° п/п т, ч. Растворитель [МА]о. моль/л [Ф)о. моль/л Выход" ФМА. 0 о масс. N. дл/г

[АИБН]о. моль/л М „

! 2,7 МЭК 0,4 1,6 0,03 17 0,18*) 6500

2 2,7 МЭК 0.8 1,2 0,03 24 0,12*» 5200

3 2,7 МЭК ¡,0 1,0 0,03 28 0,10') 4200

4 2,7 МЭК 1,2 0,8 0,03 25 0.09*' 4000

5 2,7 МЭК 1,6 0,4 0,03 15 0,06*> 3700

6 10 ацетон 1,0 2,0 0,03 51 - 6000

7 10 ацетон 1,0 1,0 0,02 39 - 5500

8 10 ацетон 1,0 0,5 0,01 18 - 2400

9 10 хлф 0,9 2,1 0,03 61 0,22") 5900

10 10 хлф 1,5 1,5 0.03 81 0,13*'» 4000

11 10 хлф 1,8 1,2 0,03 64 0,08"' 3000

Темпера1лра сополммертагош t = 70 СС; МЭК - мегилэтилкегон; хлф - хлороформ; *) [г|] измерена в ацетоне при 32i!C; »») (riJ итасрена в N-Meriomippo талоне при 32 СС.

В табл.2 приведены макромолекулярные характеристики ДГФМА в зависимости от условий синтеза. В этом случае также наблюдалось уменьшение Мп с увеличением мольного соотношения [МА]о[ДГФ]о . В то же время обнаружена высокая реакционная способность сомономерной пары ДГФ + МА. Скорость сополимеризации на несколько порядков выше скорости сополимеризации МА с ДИВЭ и тем более с Ф.

В изученном ряду электронодонорньтх сомономерол их реакционная способность в реакции радикальной сополимеризации с МА изменяется в следующем порядке: ДГФ » ДИВЭ » Ф, т.е. скорость сополимеризации снижается по мере повышения стабильности > С = С < связи.

Таблица 2.

Зависимость выхода и М п сополимера ДГФМА от условий синтеза

№ опыта [МА]0, моль/л [ДГФ]о, моль/л [АИБН]о, моль/л [МА]0: ЩГФ]о Выход ДГФМА, % масс. м„

1 1,5 1,5 0,10 1,0 80 7000

2 1,7 1,3 0,12 1,3 77 5800

3 1,8 1,2 0,15 1,5 76 5000

4 2,0 1,0 0,20 2,0 77 3900

I = 70 °С; т = 0,1 ч.; растворитель - хлороформ.

Следует отметить, что с увеличением мольного соотношения суммарной концентрации сомономеров к концентрации инициатора, т.е., ([МА]о + [ДГФ]о ) : [АИБН]о значение М„ ДГФМА увеличивается, а зависимость, как и следовало ожидать, является прямолинейной (рис.3).

6С0Э г

8X0

4X0

3X0

ч,

10 50

([Ш]0+[ДГФ]0):[МБН]0

30

Рис.3. Зависимость М ■ ДГФМА от мольного соотношения ОМА]» + (ДГФ]о): [АИБ11]».

Условия синтеза приведены в табл.2.

■ *- В качестве полимерной матрицы мы также использовали сополимер МА с метилвиниловым эфиром (МВЭ). В отличие от ДИВЭМА, ФМА и ДГФМА,

сополимер МВЭМА (V) содержит кислородный фрагмент нециклического типа (простая эфирная группа). Аналогично ДИВЭМА

СН3.

О

в структуре МВЭМА присутствуют углево-

дородные шарнирные группы, увеличива-

ло

О

п

тощие гибкость полимерной цепи . Наличие в сомономерном звене таких углеводородных

V

шарниров СН2 ; С H обеспечивает меньшую жесткость

полимерной цепи, а за счет метокси группы сохраняется необходимая гидрофобность полимерной матрицы.

В дальнейшем задача состояла в получении мембранотропных полимерных соединений на основе синтезированных полимерных матриц и низкомолекулярных веществ адамантанового ряда, обладающих, как известно, повышенным сродством к рецепторам клеточных мембран.

С целью придания полимерной матрице повышенных мембранотропных и дополнительных защитных функций, избирательно направленных на блокаду ключевых стадий репродукции разных вирусов, локализованных на клеточных мембранах, осуществлена химическая модификация синтезированных сополимеров посредством низкомолекулярных веществ с активным биологическим началом.

Учитывая выраженное антивирусное действие лигюфильных углеводородов каркасного строения, в частности адамантанового ряда, в качестве мембранотропных фрагментов был использован ряд аминопроизводных адамантана (табл.3).

Теоретические предпосылки позволили нам предположить, что биологически активное действие мембранотропных полимеров па уровне специфических мишеней должно зависеть от наличия между полимерной матрицей и адамантановым ядром промежуточных "спейсерных" групп (Z) различного типа.

2.2. Химическая модификация синтезированных сополимеров аминопроизводнымн адамантана

Таблица 3.

Аминопроизводныс адамантана, использованные для химической модификации

№ п/п Название Структура производных адамантана Тип "спейсерной" группы -Ъ-

] Аминоадамантан —

2 Аминометил адамантан N"2 — СН2—

3 Аминоэтил адамантан ¿50---ИН2 —сн2—сн2—

4 Аминопропил адамантан — —сн2—сн2—сн2—

5 Ремантадин —сн— 1 СНз

С нашей точки зрения, наличие "спейсерных" групп различной длины и конфигурационной подвижности было необходимо для обеспечения оптимального расстояния между гидрофобным ядром адамантана и гидрофильной полимерной матрицей. Это позволило бы обеспечить необходимое проникновение липофильной части мембранотропного полимера (адамантанового ядра) к различным биорецепторам и одновременно наилучшее адаптирование гидрофильной части (полимерной матрицы) к поверхности клеточных мембран с максимальной реализацией многоточечного кооперативного взаимодействия полимерного препарата со специфическими мишенями. Как будет показано ниже, именно определенная длина й конфигурационная подвижность "спейсерных" групп сыграли важную роль в создании такого "оптимального расстояния" и соответствующей биологической активности.

Нами разработаны условия проведения модификации сополимеров МА вышеуказанными аминопроизводными адамантана. При химической модификации были использованы ДИВЭМА с Мл в пределах 3000-12000; ФМА с М„ 3000^6500: ДГФМД сМ.в диапазоне 4000+7000 и МВЭМАс Мп= 41000 и 7000.

Модификацию проводили в две стадии:

1) связывание аминопроизводных адамантана с полимерной матрицей;

2) гидролиз остаточных ангидридных групп продукта первой стадии и получение водорастворимых солей.

Первую стадию осуществляли в растворе диметилсульфоксида (ДМСО) или М-метилпирролидона (М-МП) при комнатной температуре (25° - 30 °С). Отработка методики в различных растворителях показала, что для обеспечения гомогенности реакционной смеси наиболее подходящими являются высокополярные апрогонные растворители типа ДМСО или М-МП. Во всех случаях добавление раствора аминопроизводного адамантана к раствору полимера независимо от растворителя практически мгновенно приводило к- малиновому окраиппзаншо, что, видимо, связано с образованием донорно-акцепторных комплексов между амином и ангидридными группами сополимера.

Переход аминопроизводных адамантана из свободного состояния в полимер-конъюгированное контролировали по исчерпанию свободных ЫНг-групп методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием нингидрина для проявления пластин.

По данным ТСХ связывание аминосоединений практически полностью завершается в течение 1 часа. После дополнительного выдерживания реакционной смеси полимерный конъюгаг выделяли осаждением в избыток эфира или его смесей с гексаном, хлороформом и другими апротонными мало полярными органическими растворителями.

Образующийся плохо растворимый в поде промежуточный продукт 1-ой стадии промывали избытком эфира, сушили и без дополнительной очистки проводили 2-ю стадию - гидролиз в водных растворах бикарбоната натрия или других щелочных металлов до полного растворения в водной среде.

Полученный водорастворимый полимерный конъюгат очищали от низкомолекулярных примесей методом ультрафильтрации водных растворов. При этом использование мембран с определенной пропускающей способностью позволило удержать в фильтрационной ячейке полимерные молекулы и отмыть низкомолекулярные примеси (М„ < 1000). После четырехкратного цикла ультрафильтрации полимерные конъюгаты выделяли из концентрированных водных растворов с помощью лиофильной сушки.

Принимая во внимание то, что гидрофильно-липофильный баланс синтезированных мембранотропных полимеров оказывает существенное влияние на их биологическую активность, нами варьировалась степень модификации сополимеров аминопроизводными адамантана в пределах 5 + 85 % мол.

Предварительное отборочное тестирование показало, что мембранотропные полимеры на основе ФМА, ДГФМА и МВЭМА более, чем вдвое токсичнее аналогичных препаратов на основе ДИВЭМА при соизмеримых макромолекулярных характеристиках (М„ < 10000) (см. табл.4). Поэтому мембранотропные полимеры на основе ФМА, ДГФМА и МВЭМА в дальнейшем детально не исследовались.

2.3. Изучение структуры коньюгатов ДИВЭМА с различными аминопроизводными адамантана

С целью установления природы химической связи производных адамантана с полимерной матрицей нами была исследована структура синтезированных мембранотропных полимеров методами ИК-фурье, ЯМР 13С и ПМР - спектроскопии *. Данные ЯМР 13С и ПМР - спектроскопии указывают на то, что адамантановое ядро входит в состав образующихся полимерных соединений. Об этом свидетельствует наличие в спектре исследованных образцов 3-х узких пиков, характерных для адамантанового ядра (химический сдвиг 5 = 42,7; 37,6 и 31,5 м.д.).

» ИК-фурье исследование выполнено в лаборатории модификации полимеров ИНХС им. А.В.Топчиева РАН под руководством д.х.н. Т.Л.Лебедевой.

Учитывая присутствие активных ангидридных групп в сополимерах МА, при взаимодействии ДИВЭМА с амипопроизводными адамантана полимераналогичное превращение мы рассматривали как реакцию ангидридных" групп-с первичными аминами и" предполагали." что" образуется амидная связь (структура У1). Однако, вследствие гидролиза в сополимерах МА всегда присутствуют свободные карбоксильные группы (получить абсолютно не гндролизованный ДИВЭМА в растворителях хлороформе и ацетоне практически не удастся), поэтому не исключена возможность образования аммонийной соли ДИВЭМА (структура VI I).

х - cienein. модификации; п степень полимеризации; М, - Н, Na; Ad - i-• ■.

В результате анализа ИК-фурье спектров оказалось, чго при взаимодействии ДИВЭМА с различными аминонроизводными адамантана при t < 30 °С образуется преимущественно аммонийная соль. Это подтверждается наличием в спектре полос —СОО® групп (1575 и 1418 см1) и иона-ЫНР(~330() - 3400 см1). Спектральные данные также указывают на го, что в данной системе образуется слабая Н-связь между анионом и катионом (рис. 4).

Энергия водородного связывания между ионами в данной системе определяется величиной сдвига полосы (¿чнр от ее положения в отсутствии II-

связи (-3400 см"1). Из полученных данных согласно спектрам ИК-фурье видно, что энергия Н-связи между катионом аминопроизводного адамантана (Ад) и анионом ДИВЭМА уменьшается с увеличением длины "спейсерной" группы, находящейся между аминогруппой и адамантановым ядром.

В случае использования аминоадамантана и аминоэтиладамантана

+

показано, что Н-связь катиона ЫН3—-Ад с анионом ДИВЭМА

+

сильнее, чем катиона МН3—СНг—СНг—Ад (А= 103 и 4 см-!

соответственно). Обнаруженный факт, очевидно, связан с влиянием стерических факторов исходных соединений на образование Н-связи между ионами.

35Й0 ЗСОО 2000 ль'00 ' 1000

Волновое чайло , си"1

Рис.4, ИК-фурье спектры твердых образцов: а - продукта взаимодействия ДИВЭМА и аминоэтиладамантана; 6 - продукта взаимодействия ДИВЭМА и аминоадамантана.

Известно, что чем больше энергия Н-связи между ионами, тем труднее они диссоциируют в воде. Поскольку энергия Н-связи коррелирует со способностью ионных пар диссоциировать в воде, величина этой энергии должна коррелировать с реакционной способностью образовавшихся аммонийных катионов в водных средах и опосредованно с их биологической активностью.

И, действительно, оказалось, что макромолекулярные системы на основе ДИВЭМА и аминоэтиладамантана обладают большей антивирусной активностью по сравнению с системами, содержащими аминоадамантан. В то же время сам амнноэгиладамантан в виде солянокислой соли, i.w катион

-МНз® связан с анионом Ci9 сильной водородной связью (Au^= 375 см-1 ),

проявлял в ~ 3,5 раза меньшую ингибирующую активность по отношению к вирусу гриппа, чем солянокислая соль аминоадамантана с более слабой Н-связыо катиона с анионом (AuSH^= 300 см-').

2.4. Биологическая активность сиитезироваштых мембрянотрогшых

полимеров

Биологическая активность синтезированных мембранотропных полимеров была изучена на культуре клеток in vitro в Институте гриппа РАМН, Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН и Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М. Сеченова РАН.

Предварительные биологические испытания показали, что среди всех синтезированных мембранотропных полимеров с точки зрения антивирусной активности и малой токсичности наибольший интерес представляют впервые синтезированные полимерные соединенения на основе ДИВЭМА и аминоэтиладамантана. В дальнейшем их детально исследовали в качестве полимерных лекарственных препаратов нового поколения и сравнивали с адамантансодержащим низкомолекулярным препаратом - ремантадином, являющимся широко распространенным в клинической практике ингибитором вирусных инфекций.

Ранее было отмечено, что гидрофильно-липофильный баланс синтезированных мембранотропных полимеров должен оказывать существенное влияние на их биологическую активность. Нами также было предположено, что тип "спейсерной" группы будет играть заметную роль в биологической активности мебмранотропных полимеров. В результате испытаний было установлено, что антивирусная активность и питотоксичность мембранотропных препаратов зависили как от типа спейсерной группы, так и от химической природы полимерной матрицы, а также от содержания производных адамантана, т.е. от степени модификации сополимеров (табл.4).

Таблица 4.

Цитотоксичность (ЦТДю) и антивирусная активность полимерных конъюгатов на основе сополимеров МА и аминопроизводных адамантана

Сополимер м. сополимера Аминопроюводные адамантана х, % мол. ЦТД50, цг/мл Ингибиро-вание репродукции вируса гриппа, %"

ФМЛ 4000+6500 N112—Ад 18 400 —

ДГФМА 400СМ-7000 ЫНг—Ад 18 500 —

МВЭМА 7000 N42—Ад 18 540 —

ЫНг—Ад 18 1000 59

ЫНг—Ад 30 930 67

МНз-СНг-Ад 30 960 69

ДИВЭМА 4000+6000 ТЧШ-СЩСНз}—Ад 30 950 65

ИНг-СНг-СНг-СНг—Ад 30 900 13

30 980 80

1\7Н2-С1ЬСН:^-АЛ 20 1100 85

10 1200 95

х - степень модификации; ЦТДя - доза, при которой происходит 50 % - ная гибель клеток; ** по отношению к контролю (инфицированные клетки в отсутствии препарата).

Новые адамантансодержащие полимерные препараты на основе ДИВЭМА оказались, по крайней мере, в 4-5 раз менее токсичны для клеток, чем ремантадин (рис.5).

Для объяснения этого факта было изучено влияние ремантадина и его полимерных аналогов на ионные каналы и ионные насосы клеток эпителия кожи лягушки. В результате оказалось, что в отличие от ремантадина его полимерные аналоги не оказывают влияния на мембранный транспорт ионов и тем самым не проявляют внутриклеточного действия, приводящего к токсическому эффекту.

1200 4-

ДИВЭМА ЛИ-! 11П-2 ПП-3 Рм

1'пс.5. Цитотоксичность (1ГГДя, цт/мл) Д11ВЭМА, ремантадина и адамант анеодержаших полимерных препаратов (ПП).

ПГ1-1; ПП-2; ПП-3 содержат 10 %; 20 %; 30°,о мол. аминоэтиладамантана соответственно; Рм - ремантадин.

Ингибирующее действие мембранотропных полимерных препаратов на репродукцию вирусов гриппа А (чувствительного к ремантадину) и В (резистентного к ремантадину) показано на рис.б. Как видно из рисунка, полимерная матрица обладает слабой антивирусной активностью, тогда как полимерные адамантансодержащие соединения по своей эффективности сопоставимы, а в некоторых случаях превышают действие ремантадина в отношении ингибирования вируса гриппа А. В то же время эти соединения характеризуются принципиально новой особенностью, отличающей их от ремантадина и заключающейся в достаточно высокой антивирусной активности в отношении вируса гриппа В. резистентного к ремантадину.

ДИВЭМА ПП-1 ПП-2 ПП-3 Рм ДИВЭМА ПП-1 ПП-2 ПП-3 Рм

100 -

5

Ю 40 -£

^ ПГ\ _ _

V.®

^ 70 --

о.

се

Щ 50 -

20 --

30 --

80 --

90 -

10 --

о

ВИРУС А

ВИРУС В

Рис.6. Ингибирующее действие ДИВЭМА, ремантадина и адамаиталсодержащих полимерных препаратов (1111-1; ПП-2; ПП-3) на репродукцию вирусов гриппа А и В.

Ингибирующее действие представлено в % по отношению к контролю (инфицированные клетки в отсутствии препарата).

При биологических испытаниях в культуре клеток было также обнаружено, что синтезированные мембранотропныг полимеры проявляли ярко выраженное ингибирующее действие на ВИЧ-инфекцию. Антивирусная активность полимерных препаратов изучалась по ингибированию синтеза белков р55 и р24, специфичных для этой инфекции. Если в контроле в необработанных клетках явно обнаруживаются ВИЧ-специфические белки р55 и р2\ то при введении полимерных препаратов синтез этих белков полностью подавляется.

Необходимо обратить внимание на то, что наиболее выраженный антивирусный эффект наблюдался в том случае, когда клетки обрабатывали препаратом до инфицирования или в первые часы после адсорбции вируса. Эта тенденция указывает на то, что в данном случае уязвимой стадией репликации вируса являются ранние события, возможно, связанные с сорбцией вируса на клеточной мембране и проникновением вируса в клетку. И в том, и в другом случае в процесс репродукции вируса вовлечена плазматическая мембрана клетки хозяина. Поэтому целенаправленно выбранный принцип синтеза препаратов, удовлетворяющих понятию "мембранотропные" оказался эффективным для блокирования ВИЧ-инфекции.

Хотя вышеуказанные результаты получены in vitro, есть основание

предположить возможность антивирусного действия мембранотропных полимеров на ВИЧ-инфекцию и на уровне организма. Это свидетельствует о перспективности применения полимерных мембранотропных соедшдашй качестве не только противогриппозных препаратов, но и в другом чрезвычайно важном направлении - в борьбе против СПИДа.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез водорастворимых сополимеров малеинового ангидрида с дивиниловьт эфиром, фураном и 2,3-дигидрофураном с различными макромолекулярными характеристиками. При этом найден оптимальный диапазон молекулярной массы сополимеров (4000+6000), приводящей к наибольшей терапевтической эффективности полимерного препарата. Показано, что сополшиер малеинового ангидрида с дивиниловым эфиром обладает повышенной биологической активностью по сравнению с сополимерами фурана, 2,3-дигидрофуршш и метилвиыаоваго эфира.

2. Впервые осуществлена химическая модификация синтезированных сополимеров различными аминопроизводнычи адамантана. Показана взаимосвязь степени модификации полученных полимерных конъюгатов с их биологической активностью. Установлено, что для проявления повышенной биологической активности самой эффективной "спейсериой" группой, связывающей адамантгаьный заместитель с полимерной матрицей, являются углеводородные шарниры —СП2—СН2—-.

3. Спектральными методами впервые изучена структура синтезированных макромолекулярных продуктов. Установлено, что при взаимодействии сополимера малеинового ангидрида и дивинилового эфира с аминопроизводиыми адамантана в иссчедованных условиях преимущественно образуется аммонийная соль со слабой водородной связью.

4. Изучен ряд химико-фармацевтических свойств мембранотропных полимеров. Показано их превосходство над низкомолекулярными аналогами, выражающееся в высокой антивирусной активности и малой токсичности. Впервые установлено их явно выраженное ингибирующее действие на ВИЧ-инфекцию и вирус гриппа, в том числе на вирус, резистентный к ремантаоину.

5. Впервые изучено влияние синтезированных полимеров на мембранный транспорт ионов. На основе полученных биоэлектрических характеристик объяснено токсическое действие ремантадина и причина малой токсичности его полимерных аналогов.

6. Показана перспективность применения синтезированных мембранотропных полимеров для разработки лекарственных препаратов нового поколения в борьбе с гриппом и ВИЧ-инфекцией.

Список докладов и публикаций:

Доклады:

1. 2nd International Conference on "AIDS, CANCER, HUMAN'S RETROVIRUSES", St.Petersburg, Russia, 1993.

2. Научная Конференция ИНХС им. А.В.Топчиева РАН, Москва, 1993, '94, '97.

3. 3rd International Symposium on Polymers for Advanced Technologies (PAT '95), Pisa, Italy, 1995.

4. X th Internationa) Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 1996 (ICV '96).

5. Международная Конференция "Фундаментальные проблемы науки о полимерах", Москва, Россия, 1997.

Публикации:

—l: L:L'.Stonkaya. 'A'.V.Scrbm, К. МтШ. O'.P. Bogdan, A'G:Bukh'nskaya.~

1.V-Athmna. Some New Aspects of H!V-l Inhibition by Membranotropic Poljmeric Substances. Conference ibstr. "AIDS, CANCER. IIUMAN'S RETROVIRUSES". St.Petersburg, Russia, 1993. p.3S-39.

2. Stotskaya L.L., Serbia AV, Mnnshi A'.. Ko;eletskaya K.N.. Natochin Yu. Г. Antiviral Efficiency of New Adamantanccontaining Polymeric Drugs. Symposium PA T '95. Pisa, Italy. 1995, p.277.

3. JIJI. Стоцкая. А.В. Сербии. К. Мунши. К.Н.Ктелецкан. А.А.Сомчшю. О.И.Киселев, К.В.Зайцева. Ю.В.Наточин. Эффективность новых адамантаисодержащих полимерных соединении против вируса гриппа и их влияние на мембранный транспорт ионов. Химико-фармацевтический журнал, № 3, 1995, с. 19-22.

4. Стоцкая JI.JI-, Сербин А.В., Myrnuti К., Козелецкая К.Н. Новые полимерные мембранотропные препараты против гриппа и СПИДа. III Российский

национальный конгресс "Человек и лекарства". Москва. 1996, с.50.

5. K.Munshi. L.L. Stotskaya, A.V.Serbin and K.N.Kozeletskaya. A Few Macromolecular Approaches to Overcome Viral Drug Resistance. Absir. 1СГ '96, Jerusalem, Israel, 1996, p. 154.

6. L.L.Stotskaya. A.V.Serbin, K.Munshi, l.Y.Alimova, A.G.Bukrinskaya. New Anti-H1V Agents Based on Polymeric Adamantane Derivatives. Absir. 1CV '96. Jerusalem, Israel, 1996, p. 123.

7. Стоцкая JI.JI.. Горшкова М.Ю.. Сербин 4.R., Мунши К. Взаимосвязь поведении и растворах макромолекул сополимера малеинового ангидрида и ei о NH? - содержащих ко!гыогатов с их биологической активностью. Тезисы: Международная Конференция "Фундаментальные проблемы науки о полимерах", Москва, Россия, 1997, сЗ-ЯЗ.

8. Стоцкая Л.Л.. Сербин Л. В.. Мунши К. Баринскнй II. Ф., Грибенча С. В. Иммунооносредованное защитное действие новых адамантансодержатих полимеров против опасных неГгровирусных инфекций. IV Российский национальный конгресс "Человек и лекарства", Москва, 1997, с. 286.

9. Serbin А. V., Stotskaya L.L., Munshi K., Kozeletskaya K.N. Anti-HIV and AntiInfluenza activity of Polymeric Adamantane derivative drugs. Russian Journal of HIV/ AIDS and Related Problems. St. Petersburg. Russia, 1997, p. 275-276.

10. MunshiK., Stotskaya L.L., Serbin A. V., Bukrinskaya A.G., Kozeletskaya K.N. Newly Synthesized Membranotropic l'oIymcrs:Inhibitors of Influenza and HIV-l Replication. 4 th International Symposium PA T '97, Leipzig, Germany, 1997, p VII. 16.

Соискатель