Динамика фотосистемы 1 и фотосистемы 2 в фемто- и пикосекундной шкале времен тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

9946 6321

На правах рукописи

Шелаев Иван Викторович

ДИНАМИКА ФОТОСИСТЕМЫ 1 И ФОТОСИСТЕМЫ 2 В ФЕМТО- И ПИКОСЕКУНДНОЙ ШКАЛЕ ВРЕМЕН

01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

- 9 ЛЕК 2010

Москва-2010

004616321

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической физики им. H.H. Семенова РАН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Саркисов Олег Михайлович

доктор биологических наук профессор

Семенов Алексей Юрьевич

доктор химических наук, профессор

Кузьмин Владимир Александрович

доктор физико-математических наук, профессор

Тихонов Александр Николаевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр фотохимии РАН

Защита состоится «_» _20_г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 002.012.02 при Учреждении Российской академии наук Институте химической физики им. H.H. Семенова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте химической физики им. H.H. Семенова РАН

Автореферат разослан «_» ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

М.Г. Голубков

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Развитие современной химии и биологии тесно связано с изучением сверхбыстрых процессов, происходящих в фемтосекундной шкале времен. Инструментом, с помощью которого возможно исследование сверхбыстрой динамики в биологических и химических системах, является фемтосекундная лазерная спектроскопия. В последние годы развитие фемтосекундной лазерной техники позволило повысить временное разрешение в разы, что дало возможность изучать процессы, протекающие за десятки фемтосекунд. Существенной особенностью протекания реакций под действием световых фемтосекувдных импульсов является то, что реакции могут протекать в когерентном режиме. В этом режиме, манипулируя амплитудно-фазовыми характеристиками, можно осуществлять когерентное управление динамикой процессов, влиять на выход интермедиатов.

Самый известный и важный процесс, происходящий в природе под действием света, является фотосинтез. В этом процессе используются неисчерпаемый источник энергии - солнечный свет и неисчерпаемый донор электронов - вода. Первичные процессы этого удивительного явления протекают в фотосинтетических системах: фотосистеме 1 (ФС1) и фотосистеме 2 (ФС2). Принцип работы фотосистем может быть использован в самых различных разработках: в преобразовании солнечной энергии в электрическую энергию, в производстве топлива, такого как водород, в производстве биологически активных соединений, таких как НАДФН, НАДН и т.д..

Возможность использования фотосистем при решении тех или иных задач подразумевает хорошее понимание процессов, происходящих внутри самих этих белковых комплексов. К сожалению, на сегодняшний день отсутствует однозначное представление о динамике и механизмах процессов, идущих внутри реакционных центрах фотосистем, о природе первичного донора электрона, о механизме работы светособирающей антенны, передающей возбуждение на реакционный центр (РЦ), о степени асимметрии переноса электрона по симметричным ветвям редокс-кофакторов в ФС1.

Причина разногласий в большинстве случаев лежит в сложности интерпретации экспериментальных данных. Так в ФС1 РЦ и антенный комплекс неотделимы друг от друга, и, кроме того, поглощают в одной спектральной области, что затрудняет расшифровку фемто секундных данных. В ФС2 возможно выделить отдельно РЦ, но она является нестабильной при комнатной температуре.

Решить эти проблемы возможно, повышая временное разрешение фемтосекундных исследований, модернизируя методики измерений, а так же изучая динамику при перестройке несущей длины волны возбуждающего импульса. Именно такой подход к исследованию процессов в ФС1 и ФС2 реализуется в представленной диссертационной работе.

Цели и задачи работы.

1. Получить экспериментальные данные по динамике фотоиндуцированного поглощения для ФС1 и ФС2 в фемто- и пикосекундном масштабе времен.

2. Разработать методику отделения динамики реакционного центра ФС1 от динамики переноса энергии возбуждения в светособирающей антенне.

3. На основе экспериментальных данных предложить механизм первичных фотохимических процессов, протекающих в реакционных центрах ФС1 и ФС2.

4. Исследовать степень асимметрии переноса электрона по симметричным ветвям редокс-кофакторов в реакционном центре ФС1 Synechocystis sp. РСС 6803, путем изучения динамики в мутантных штаммах с заменами лигандов к первичному акцептору А0 в каждой из ветвей редокс-кофакторов.

5. Исследовать влияние фазовых и амплитудных характеристик возбуждающего фемтосекундного импульса на динамику ФС1.

Научная новизна.

Разработана методика, позволяющая регистрировать динамику фотоиндуцированного поглощения в широком спектральном диапазоне от 400 до 750 нм, а также перестраивать несущую длину волны возбуждающего импульса в видимом диапазоне.

Экспериментально зарегистрирована динамика спектров фотоиндуцированного поглощения ФС1 из цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6S03 и ФС2 из шпината во временном диапазоне от 0 до 100 пс с временным разрешением 20 фс и использованием импульса суперконтинуума в диапазоне 400-750 нм.

Разработана методика отделения динамики первичных процессов, протекающих в РЦ ФС1.

Показано, что разделение заряда в РЦ ФС1 при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 20 фс происходит чрезвычайно быстро (<100 фс); предполагается, что такое быстрое разделение заряда обусловлено когерентным механизмом.

Установлены механизмы первичных процессов в РЦ ФС1 и ФС2 и определены временные характеристики этих процессов.

Установлено, что фазовые характеристики возбуждающего импульса влияют как па динамику антенного комплекса, так и на процессы в РЦ ФС1.

Установлено, что симметричные ветви редокс-кофакторов электрон-транспортной цепи в РЦ ФС1 цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 не эквивалентны.

Практическая значимость работы.

Полученная информация о механизмах фотоиндуцированных процессов, протекающих в ФС1 и ФС2, о возможности влияния амплитудно-фазовых характеристик возбуждающего импульса, о степени эквивалентности ветвей электрон-транспортной цепи может найти применения при получении электрической энергии из солнечной, получении водородного топлива, при производстве лекарственных препаратов. Кроме того, разработанные методы исследования ФС1 и ФС2 представляют интерес для специалистов, работающих в области фотобиологии и изучающих сверхбыстрые процессы.

Апробация работы.

Основные результаты, вошедшие в диссертацию, были представлены в докладах на следующих научных конференциях:

1. Шелаев И.В., Саркисов О.М., Надточенко В.А., Гостев Ф.Е. «Когерентное управление в фотосистеме 1», Школа-Симпозиум «Динамика и структура в химии и биологии», Москва, апрель 2006.

2

2. Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Саркисов О.М., Семенов А.Ю., Надточенко В.А., Мешедов М.Д., Шувалов В.А. «Эксперименты по фемтосекундной динамке первичных реакций в комплексах фотосистемы 1», Школа-Симпозиум «Динамика и структура в химии и биологии», Москва, апрель 2008.

3. Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Саркисов О.М., Надточенко В.А., Семенов А.Ю., Шувалов В.А. «Фемтосекундная динамка первичных процессов, протекающих в фотосистеме 1 цианобактерии», 51-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Москва -Долгопрудный, ноябрь 2008.

4. Shelaev I.V., Gostev F.E., Mamedov М., Sarkisov О.М., Nadtochenko V.A, Shuvalov V.A., Semenov A.Yu. «Femtosecond primary charge separation in photosystem I», International conference «Organic nanophotonics», St. Petersburg, Russia, June 2009.

5. Шелаев КВ., Гостев Ф.Е., Надточенко В.А., Шкуропатов А.Я., Забелин A.A., Мамедов М.Д., Семенов А.Ю., Саркисов О.М., Шувалов В.А. «Процесс разделения заряда в реакционном центре фотосистемы 2 на фемтосекундной шкале времен», 52-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Москва - Долгопрудный, ноябрь 2009.

6. Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Саркисов ОМ., Надточенко В.А., Семенов А.Ю., Шувалов В.А. «Фемтосекундная динамка первичных процессов в фотосистеме 1 и влияние на них амплитудной и фазовой модуляции возбуждающего импульса», Научная конференция Института химической физики им. H.H. Семенова РАН, Москва, февраль 2010.

Публикации.

В основе диссертации лежат результаты, опубликованные в 3 статьях и 3 тезисах докладов на научных конференциях.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы.

Содержание диссертации.

Во введении приводится обоснование актуальности выбранной темы, перечисляются основные цели и задачи работы, говорится о ее научной новизне и практической значимости, коротко излагается содержание диссертации.

Первая глава диссертации является обзором научной литературы по тематике исследования. В первой части этой главы кратко изложены общие вопросы процесса фотосинтеза на молекулярном уровне, рассмотрена Z-схема фотосинтеза и обозначена роль ФС2 и ФС1 в этом процессе.

Во второй части описываются результаты работ, посвященных изучению ФС1 и процессов, протекающих в ней. Приведены результаты рентгеноструктурных исследований и сверхбыстрых кинетических экспериментов.

ФС1 цианобактерии состоит из 96 молекул хлорофилла [1], большинство из которых выполняют функцию светособирающей антенны. Реакционный центр, находящийся в центре белкового комплекса, включает в себя 6 молекул хлорофилла: димер Р700 и 4 хлорофилла, образующих два рыхлых димера (Ао) (Рис. 1). Согласно

3

литературным данным, при возбуждении РЦ от донора Р700 электрон переходит к первичному акцептору А0, затем ко вторичном)' акцептору - филлохинону (А!), а потом к железно-серным центрам Рх, РА и Рв. На протяжении нескольких десятилетий временные характеристики этих стадий и их механизмы являются предметом большого числа исследований.

О'

»Г

еС-вЛ еС-А -Г

О^-А (А,; )} " О еС-А,

еС-В,| |еС.А, Р'ОС!

Рис. 1. Структура ФС1 цианобактерии. А - вид параллельно плоскости мембраны, Б -расположение редокс-кофакторов ФС1.

Стрема

: С

Чг

ро. > = Р680

Люмен

Рис. 2. Электрон-транспортная цепь ФС2.

В работе [2] при возбуждении ФС1 импульсом с максимумом при 660 нм процесс передачи возбуждения от антенны на РЦ занимал 23 пс, образование первой ион-радикальной пары Р700+А0" происходило за 1,3 пс, а перенос электрона на вторичный акцептор А! - за 13 пс. В то же время, по данным работы [3], процесс разделения заряда в РЦ протекает за 20-30 пс, а передача возбуждения от антенны на РЦ - за 1,5-2,5 пс. Общим недостатком работ [1,2] является низкое временное разрешение и отсутствие критериев разделения динамики антенного комплекса и РЦ, которые поглощают в одном спектральном диапазоне, и поэтому дифференциальные спектры являются суммой сигнала от антенны и РЦ. Вопрос об активности ветвей электрон-транспортной цепи в РЦ ФС1 также изучается последние десятилетия. В работе [4], путем введения точечных мутаций в окружение первичных акцепторов электрона, авторы пришли к выводу, что в ФС1 из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii активны обе ветви.

В третьей части описываются результаты рентгеноструктурных и времяразрешенных спектроскопических исследований РЦ ФС2.

РЦ ФС2 включает в себя два хлорофилла Рш и PD2, образующих димер Р680, два хлорофилла СЫШ и ChlK, и два феофитина PheoDi и PheoD2 (Рис. 2). Следует отметить, что в работе [5] было показано, что электрон в РЦ ФС2 переносится только по ветви А, связанной с субъединицей D1. Процесс разделения заряда в РЦ ФС2, а именно образование РбвО^РЬеош", по данным работы [6], происходил за ~3 пс, при этом авторы полагали, что донором электрона является димер Р680, поглощающий вблизи 680 нм. Авторы работы [7] рассматривали альтернативную модель электрон-транспортной цепи в ФС2, в которой донором электрона является мономерный СЫШ, а димер Р680 служит восстановителем СЫш+, поэтому, временная компонента 3,2 пс приписывалась образованию радикальной пары ChlDi+PhcoDi", а компонента 11 пс -образованию пары Р680+ РЬеощ •

В четвертой части этой главы изложены основные представления о когерентном управлении в фотобиологических системах и приведены результаты исследований по данному вопросу.

Во второй главе описывается экспериментальная установка, методика измерений и обработки экспериментальных данных.

Установка создана в лаборатории био- и нанофотоники Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН. Схема экспериментальной установки представлена на Рис. 3. В зависимости от поставленной задачи имеется возможность достаточно легко перестроить установку под различные схемы проведения эксперимента.

Импульсы длительностью 85 фс и энергией 10 нДж на длине волны 805 нм генерировались в твердотельном фемтосекундном лазере Tsunami (Spectra-Physics), использующем в качестве активной среды кристалл титаната сапфира. Частота повторения импульсов составляла 80 МГц. Для накачки фемтосекундного лазера использовался непрерывный твердотельный лазер с диодной накачкой Millennia (Spectra-Physics). Длина волны накачки 530 нм, мощность 5 Вт.

Излучение фемтосекундного лазера направлялось в регенеративный усилитель Spitfire (Spectra-Physics), накачиваемый твердотельным импульсным лазером с диодной накачкой Evolution X (Spectra Physics), при этом мощность накачки составляла 9 Вт, частота повторения импульсов 1КГц, а длина волны - 527 нм. После усиления, импульсы имели энергию около 1 мДж, длительность 85 фс при частоте следования 50 Гц и несущую длину волны 805 нм.

По выходе из усилителя была реализована схема возбуждение-зондирование, то есть пучок делился надвое.

Пучок, средней мощностью 400 мВт, направлялся на приготовление возбуждающего импульса. С помощью параметрического усилителя света (NOPА) пучок на длине волны 805 нм перестраивался в излучение на длине волны в диапазоне 470-1600 нм. Для экспериментов с ФС1 импульс перестраивался либо на 720 нм, либо на 670 и 700 нм, а для ФС2 - на 710 нм.

Затем, по выходе из параметрического усилителя, пучок проходил через линию задержки, состоящую из точного полого ретрорефлектора, установленного на подвижной платформе и управляемой шаговым мотором. Шаговый мотор управлялся от компьютера и обеспечивал минимальное перемещение (шаг) 0,5 мкм, отвечающее суммарной задержке 3,4 фс. Линия задержки определяла временную задержку между импульсом возбуждения и импульсом зондирования в ходе эксперимента.

Для изменения амплитудно-фазовых характеристик возбуждающего импульса, излучение пропускалось через амплитудно-фазовый модулятор на основе ЖК матрицы с 128 ячейками. В диссертации приведено описание принципа работы модулятора.

После прохождения модулятора для компенсации набегающего чирпа, за счет оптических элементов и диспергирующих сред, пучок направлялся в призменный кварцевый компрессор, по выходе из которого проходит через аттенюатор.

Приготовленный таким образом возбуждающий импульс с заданной длиной волны, энергией, амплитудно-фазовыми характеристиками фокусировался в кювету с образцом, где пересекается с пучком зондирования №1 под небольшим углом (-5-7°). Диаметр перетяжки в фокусе накачки составлял 200 мкм, а энергия возбуждения, которая направлялась на образец, как правило - 20-100 нДж. При этом, возбуждающий пучок мог перекрываться управляемым механическим затвором, установленным перед кюветой.

Прошедший кювету импульс возбуждения (накачки) попадал в моноимпульсный автокоррелятор производства фирмы Avesta, с помощью которого измерялась длительность возбуждающего импульса.

Второй (зондирующий) пучок с мощностью 10 мВт фокусировался на кювету с водой и, в результате генерации суперконтинуума, импульсы становились спектрально очень широкими. Их спектр простирался от 400 нм до 900 нм. Затем, пучок с помощью полупрозрачного зеркала делился на два пучка (№1 и№2) с примерно одинаковыми энергиями. Оба пучка фокусировались на кювету с образцом (диаметр перетяжки 120 мкм) с разносом в кювете друг относительно друга 3-4 мм. Пучок №2 служил для того, чтобы при регистрации сигнала избавиться от аппаратной функции, а другой, пучок №1, являлся зондирующим и пересекался с возбуждающим в образце. По прохождении кюветы оба пучка (№1 и №2) попадали в полихроматор. Их спектры регистрировались CCD-камерой SPEC-10 (Roper Scientific), данные с которой посылались на компьютер для первичной обработки.

Для получения спектров дифференциального поглощения при каждом времени задержки регистрировались спектры зондирующих лучей в присутствие и отсутствие возбуждающего излучения. Анализируемые спектры дифференциального поглощения (ДА) вычислялись по формуле:

ДА= \og(A)IA¿)* - log(/4/Aí2)°

где Ai и А2 — спектры зондирующих импульсов №1 и №2, измеряемые при открытом (*) и закрытом (°) затворе возбуждающего пучка. При каждом значении времени задержки между возбуждающим и зондирующим импульсами проводилось накопление 50 дифференциальных спектров. Такая методика регистрации спектров обеспечивала среднюю по спектру чувствительность равную 5-Ю"4 отн. ед. оптической плотности.

Представлена методика коррекции спектров с учетом временной задержки спектральных компонент суперконтинуума. За нуль времени задержки принимался момент максимального перекрытия импульсов накачки и зондирования на данной длине волны. Экспериментально нуль времени определялся как середина нерезонансного электронного отклика от кюветы с буфером в момент перекрывания импульсов накачки и зондирования. Это позволило строить кривую нулевой задержки во всем исследуемом диапазоне 400-900 нм. Точность определения нуля времени задержки составляла не хуже 3-6 фс.

Лшшоррелйтор

Рис. 3. Схема системы регистрации динамики спектров фотоиндуцированного поглощения.

В заключительной части второй главы приводятся условия приготовления образцов ФС1 и ФС2.

ФС1 находилась в 50 мМ Трис (рН 8,0) буфере. Для восстановления ФС1 (0,4 мг*Хл/мл) добавлялись аскорбат № (5 мМ) и 2,6-дихлорофинолиндофинол (4 мкМ). Окисление ФС1 проводилось путем засветки ФС1 непрерывным лазерным излучением на 532 нм. Все эксперименты с ФС1 проводились при комнатной температуре. Условия приготовления мутантных штаммов ФС1 были те же.

ФС2 из шпината находилась в 20 мМ Бис-Трис (рН 6,5) буфере с добавлением 0,03% М-додецил-р-О-мальтозида и 200 мМ сахарозы. В экспериментах с ФС2 образец охлаждался до +6°С.

Третья глава диссертации посвящена исследованию динамики процессов, протекающих в ФС1 цианобактерии 5улес/)ос>«Г« ур. РСС 6803 после поглощения ею фемтосекундного импульса света.

В первой части главы приводятся данные экспериментов с возбуждением ФС1 импульсами с несущими длинами волн 700 и 670 нм и энергией 20 нДж.

На рис. 4 представлена динамика дифференциальных спектров в области Оу полосы поглощения ФС1. При возбуждении фемтосекундным импульсом на 700 нм (рис. 4А), на ранних временах задержки, до 2 пс, в спектре выцветания с максимумом на длине волны 688 нм не имеется каких-либо особенностей. Примерно к 10 пс в

спектре формируются две полосы выцветания с максимумами при 688 и 705 нм. Л при задержке 70 пс дифференциальный спектр совпадает со спектром Р700+, описанным в литературе [8].

Длина волны (нм) ДлИна волны („и)

Рис. 4. Динамика спектров фотоиндуцированного поглощения ФС1 в области Q¡. полосы при возбуждении импульсами с несущими длинами волн 700 (А) и 670 нм (Б).

Если рассмотреть динамику спектров фотоиндуцированного поглощения в случае возбуждения импульсом 670 нм (рис. 4Б) на ранних временах задержки, то можно видеть, что максимум полосы выцветания с увеличением времени задержки смещается в красную область. Так при времени задержки 100 фс максимум лежит на длине волны 684 нм, затем, к 200 фс он смещается на 686 нм, а к 3 пс достигается максимальная длина волны этого красного сдвига - 687 нм. Еле заметное смещение максимума выцветания Qy полосы в течение 1 пс наблюдается и при возбуждении 700 нм (рис. 4А). Это красное смещение максимума полосы выцветания в сторону снижения энергии свидетельствует о процессе передачи энергии внутри антенного комплекса и на РЦ.

Следует отметить, что при возбуждении импульсами с несущими длинами волн 700 и 670 нм, возбуждается как РЦ, так и антенный комплекс, который в течение 10 пс маскирует динамику первичных процессов в РЦ. Для выделения динамики РЦ ФС1, путем снижения сигнала от антенного комплекса, несущая длина волны возбуждающего импульса была смещена на 720 нм.

Во второй части главы изложены данные исследования динамики ФС1 при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 720 нм.

Спектр поглощения ФС1 и спектр возбуждающего фемтосекундного импульса представлены на рис. 5. Энергия возбуждения 20 нДж была выбрана таким образом, чтобы минимизировать возможность двойного возбуждения отдельных РЦ.

На рис. 6А приведены спектры фотоиндуцированного поглощения восстановленной ФС1 (с открытым РЦ) в диапазоне от 400 до 730 нм при разных временных задержках между возбуждающим и зондирующим импульсами.

Спектр на задержке 80 фс имеет несколько характерных особенностей вблизи полос Соре и Qj: выцветание на длинах волн 440, 690 и 705 нм, плечо на 420 нм, пик поглощения между 460 и 500 нм и пик вблизи 660 нм. Такая структура спектра, представляет собой наложение друг на друга спектров хлорофилла в возбужденном состоянии, и в литературе приписывается сумме дифференциальных спектров Р700* (или Р700+) и А0* (или Ао"). Причем, полосы выцветания 420, 440, 690 нм и полосы

поглощения 460-500 и 660-670 нм относятся к А0* (или А0"). А выцветание на 435. 680 и 705 нм и поглощение на 450, 465-500 нм относятся к Р700* (либо к Р700+).

В следующие 2-4 пс после возбуждения вышеупомянутые особенности в дифференциальном спектре не претерпевают серьезных изменений. Значительные изменения в полосах выцветания 690 и 705 нм происходят от 4 до 50 пс. Такое изменение формы спектра частично связано со сдвигом полосы на 690 нм в синюю область вследствие эффекта Штарка. При задержках более 50 пс в дифференциальных спектрах (рис. 6) наблюдаются особенности, относящиеся к Р700+. Во-первых, в области Qy полосы имеется выцветание на 686 и 705 нм и поглощение на 694 нм. Во-вторых, выцветание на 439 нм в области полосы Соре, небольшой пик на 453 и широкая полоса поглощения от 465 и до 580 нм. В-третьих, небольшие отрицательные значения ДА в области 580-670 нм.

Длина волны (ни)

Рис. 5. Спектр поглощения ФС1 цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (черная линия) и спектр возбуждающего фемтосекундного импульса (пунктир).

На рис. 6Б представлена динамика спектров препаратов окисленной ФС1 (с закрытыми РЦ). Следует отметить, что некоторые характерные особенности спектров для ФС1 с открытыми РЦ не наблюдаются в случае с ФС1 с закрытыми РЦ. Так в спектрах ФС1 с открытым РЦ на ранних временах в области полосы Qy имеет место выцветание на 690 нм, которое затем сдвигается на 685 нм к -100 пс, в то время как аналогичное выцветание в спектрах ФС1 с закрытыми РЦ остается примерно на той же длине волны. Кроме того, плечо, наблюдаемое между 695 и 710 нм после задержки 2 пс в спектрах ФС1 с закрытыми РЦ сильно отличается от хорошо различимого минимума на 705 нм (относящегося к Р700+) в спектрах ФС1 с открытыми РЦ на задержках после 90 фс. Помимо этого, при больших задержках у ФС1 с открытыми РЦ пик в полосе выцветания на 694 нм переходит в поглощение (рис. 6). В области 460-640 нм спектры окисленной ФС1 также имеют отличия относительно восстановленной: отсутствует наклон от 465 нм в красную область и широкая полоса выцветания 650-670 нм на больших временных задержках.

3

<

Ol .1

90 nc 50 nc—f; i ¿

Hf

20 nc—J; -¡¡у 8 nc-—L A a 4 nc—

80 фс

I ■ ■ ' ■ I ■ ' ' ' 1

450 500 550 600 650 700 Длина волны (нм)

500 550 600 650 Длина волны (нм)

Рис. 6. Дифференциальные спектры поглощения восстановленной ФС1 (А) и окисленной ФС1 (Б) при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 22 фс.

Динамика спектров ФС1 с открытыми РЦ при задержках между импульсами возбуждения и зондирования от 50 до 100 фс представлена на рис. 7. Следует отметить, что при анализе данных спектры до 50-60 фс практически не рассматривались, так как проявляющиеся на этих временах полосы могут являться артефактными и быть смесью рамановских переходов и взаимодействия возбуждающего и широкого зондирующего импульсов, приходящих одновременно.

На задержке 50 фе в полосе Qy наблюдается выцветание с максимумами на 690 и 705 нм. После 50 фс в области 660 нм появляется полоса поглощения, которая растет вплоть до 100 фс. По данным работы [9] выцветание на 705 нм характеризует образование Р700* (или Р700+), а полоса выцветания на 690 нм - А0* (или Ао"). Появление поглощения на 660 нм после 50 фс указывает на образование анион радикала хлорофилла, согласно [10], то есть на А0".

Длина волны (нм)

Рис. 7. Дифференциальные спектры поглощения восстановленной ФС1 в области Qy полосы при задержках от 50 до 100 фс.

Таким образом, при возбуждении фемтосекундным импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 22 фс после 60 фс происходит разделение зарядов в РЦ ФС1. Быстрое разделение зарядов в РЦ может указывать на когерентный механизм процесса разделения заряда в РЦ ФС1, который будет рассмотрен ниже.

При возбуждении восстановленной ФС1 фемтосекундным импульсом на 720 нм длительностью 22 фс частично возбуждается и антенный комплекс ФС1, поглощающий вблизи 700 нм (рис. 5). Для того, чтобы избавиться от вклада антенного комплекса в сигнал восстановленной ФС1 и получить спектры, связанные непосредственно с переходами в РЦ, были вычтены дифференциальные спектры окисленной ФС1 (закрытый РЦ) из восстановленной (открытый РЦ) при одних и тех же задержках.

На рис. 8 представлен результат такого вычитания на ранних задержках (60 фс -1 пс, рис. 8А) и на пикосекундных временах (3, 12 и 80 пс, рис. 8Б). В области Qy полосы, как и в случае восстановленной ФС1, на самых ранних задержках (60 фс) наблюдаются две полосы выцветания на 689 нм и 705 нм. Как было отмечено выше, полоса с максимумом при 705 нм относится либо к возбужденному состоянию Р700*, либо к Р700+, в то время как полоса 690 нм может быть отнесена либо А0*, либо к А0\ Вероятность того, что А0* наблюдается в спектрах АДА на 60 фс мала, так как А0* присутствует как в спектрах закрытых РЦ, так и в спектрах открытых РЦ и поэтому после операции вычитания в спектрах АДА полосы, характерные для А0* должны отсутствовать. Следовательно, спектры АДА на ранних задержках относятся к спектрам первой ион-радикальной пары Р700+А0". При больших задержках, когда электрон уже переходит от Ао" к Аь спектры соответствуют второй ион-радикальной

г.

660

680

700

паре Р700+А0А1~. Так как филлохинон А] и его анион поглощают в ближнем УФ диапазоне, то спектры Р700+ и Р700+А0АГ не отличаются в рассматриваемом диапазоне 420-730 нм.

0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0

450 500 550 600 650 700 Длина волны (нм)

450 500 550 600 650 700 Длина волны (нм)

Рис. 8. Дифференциальные спектры РЦ ФС1, полученные вычитанием спектров окисленной ФС1 из восстановленной при одних и тех же задержках. А - спектры при задержках от 60 фс до 1 пс. Б - спектры при 3, 12 и 80 пс.

На рис. 9А представлена кинетическая кривая изменения ДДА на длине волны 705 нм, отображающая динамику образования Р700+. Кинетическая кривая имеет две компоненты: первую - быструю, менее 100 фс, и вторую - медленную с характерным временем ~5 пс. Быстрая компонента характеризует образование Р700+ вследствие непосредственного возбуждения РЦ ФС1 фемтосекундным импульсом. Доля таких Р700+ составляет -50% (рис. 9А). В свою очередь медленная компонента, скорее всего, отвечает за формирование Р700+ в результате передачи энергии возбуждения от

антенного комплекса на РЦ. Соответственно, доля Р700+, образовавшихся таким путем, также составляет примерно 50%. При экспоненциальной аппроксимации кинетической кривой ЛАА на длине волны 705 нм получено характерное время для медленной стадии образования Р700+: т=5,4±0,4 пс.

Таким образом, процесс передачи энергии на РЦ ФС1 происходит значительно медленнее, чем первичное разделение заряда.

5 10 15 Время задержки (пс)

0.4

0.2

о

X

0.0

-0.2

-0.4

■ - \ 1, 1 ■

| 'i saift ь

1 V -U-^j. ц'

1 , ■ i ' 'г ' » i

20 40 60 80 Время задержки (пс)

Рис. 9. А - кинетическая кривая ДДА для ФС1 на длине волны 705 нм. Черным цветом обозначена экспоненциальная аппроксимация экспериментальных данных с т=5,4±0,4 пс. Б - кинетическая кривая ДА на длине волны 660 нм при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 720 нм.

На рис. 9Б представлена кинетическая кривая ДА для ФС1 на длине волны 660 нм, которая как было отмечено ранее, отображает процесс передачи электрона от Л<," к Ар Характерные времена обеих кинетических кривых составляют -26 пс.

На основе представленных выше экспериментальных данных основные события в РЦ ФС1 могут быть записаны в виде схемы:

Антенна* —^ ((Р700А0)*А, <тфс > Р700+Ао'А,) —^ Р700+АоАЛ (1) Начальные условия после возбуждения фемтосекундным импульсом длительностью 22 фс и несущей длиной волны 720 нм выглядят следующим образом: доля Антенна* |,ь0 =а и Р700*АоА]|,=о =1-а, где 0<а<1. Из экспериментальных данных (рис. 9) а приблизительно составляет (0,5)±0,1.

Из-за сверхбыстрого процесса (Р700А0)*А| <тфс > Р700+А0"АЬ схема (1) может быть записана в упрощенном виде:

Антенна* —^ Р700+Ао*А, -"-> Р700+АоАГ, (2)

где Р700+Ао~А, |,_0 =1-а.

Кинетические уравнения, описывающие изменения концентраций А^Антенна*], ЩР700+Ао"А1] и А'[Р700+ЛоЛ]"] в соответствии со схемой (2), имеют решение:

£[Антенна*]= а ехр (~к]1)

АТР700ТА„-А,1= {1 + а • ^^ } ехр(-Ш) - а ■ ехр (-И I) АГ[Р700+АоАГ]= ехр(-А7 > ехр(-Ш).

При помощи операции сингулярного разложения (БУИ), матрица экспериментальных данных может быть представлена в виде:

АЛ(1,А)=13,чА'1(1)5(Л), , (3)

где - спектры 1 -го состояния (Антенна*, Р700+Ао~А1, Р700+А0АГ), а А'(Ц -заселенность этого состояния в разные моменты времени.

Рис. 10. Спектры и кинетические кривые интермедиатов, полученные с помощью глобального экспоненциального анализа с использованием БУИ матрицы экспериментальных данных. Левая колонка - спектры: А1) Антенна*; Б1) Р700+А0"А1; В1) Р700+АоАГ. Правая колонка - кинетика: А2) исчезновения Антенны*; Б2) образования и исчезновения Р700+Ао~А1; В2) образования Р700+АоАГ.

Для нахождения значений А'1 и к2, спектров и кинетических кривых переходов между тремя состояниями, Антенна*, Р700+Ао"А] и Р700+АоАГ, экспериментальные данные по восстановленной ФС1 были подвергнуты глобальному экспоненциальному анализу с учетом схемы (2). Алгоритм глобального экспоненциального анализа с использованием метода сингулярного разложения для фемтосекундных экспериментов описан в работе [11].

В результате глобальноого экспоненциальноого анализа были найдены константы скоростей А1=0,19±0.04 пс"1 и £2=0,038±0,007 пс'1, которым отвечают характерные времена т1= 5,3 пс и т2= 26 пс соответственно. Спектры состояний Антенна*, Р700+Ао"А1 и Р700+АоА1"", найденные также при анализе с использованием 8УО, представлены в левой колонке рис. 10 (А1, Б1 и В1). Кинетика заселенностей трех состояний представлена в правой колонке рис. 10 (А2, Б2 и В2). Следует отметить, что матрица экспериментальных данных ДА(1, X) хорошо аппроксимируется суммой произведений спектров в левой колонке и кинетик заселенности в правой. Кроме того, найденные спектры Р700+А(ГА! и Р700+АоАГ (рис. 10 Б1 и В1), хорошо

согласуются с экспериментальными спектрами (рис. 8), полученными при вычитании спектров окисленной ФС 1 из спектров восстановленной ФС1.

В третьей части представлены результаты исследования вопроса об активности ветвей цепи переноса электрона в РЦ с помощью мутантных штаммов ФС1 M688LPsaA (AML) и M668LPsaB (BML). В этих мутантных штаммах ФС1 была сделана замена метионина, аксиального лиганда к первичному акцептору А0, на лейцин в ветви А и В, соответственно.

При возбуждении фемтосекундным импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 26 фс в случае AML ФС1 характерный спектр первой ион-радикальной пары Р700+А0" появляется к 550-600 фс. А в случае BML ФС1 -несколько раньше, чем у AML - к 300-310 фс.

Замедление первичного разделения зарядов по сравнению с нативной ФС1 в аналогичном эксперименте можно объяснить тем, что в мутантных штаммов ФС1 не образуется когерентный электронно-колебательный волновой пакет. Возможно, что мутация повлияла на расположение энергетических уровней хлорофиллов в РЦ и взаимодействие их между собой.

Следует отметить, что с изменением скорости образования первой ион-радикальной пары Р700+Ао" в мутантных формах ФС1 изменились и времена образования второй пары P700+AoAi". Так кинетические кривые AML и BML ФС1 на длине волны 660 нм, на которой наблюдается динамика передачи электрона с первичного акцептора А0 на вторичный Ai, при моноэкспоненциальной аппроксимации дают характерные времена Taml=35±3 пс и tbml=29±3 пс. В случае нативной ФС1 время образования вторичной ион-радикальной пары составляет порядка 25 пс. Таким образом, в мутантных формах ФС1 имеет место небольшое замедление переноса электрона на вторичный акцептор Ai по сравнению с нативной ФС1.

Сопоставляя времена образования ион-радикальных пар в РЦ ФС1 AML и BML, можно сделать вывод, что ветви А и В электрон-транспортной цепи имеют разный вклад в процесс переноса электрона.. Причем преимущественно перенос электрона в РЦ ФС1 происходит по ветви А.

В четвертой части главы представлены данные эксперимента с возбуждением ФС1 амплитудно-модулированным импульсом с несущей длиной волны 720 нм, а также предлагается модель, описывающая быстрое разделение заряда в РЦ ФС1.

Как уже отмечалось во второй части главы, быстрое разделение зарядов в РЦ ФС1 может объясняться когерентным механизмом. Дело в том, что спектральная ширина возбуждающего фемтосекундного импульса, длительностью 22 фс и несущей длиной волны 720 нм, составляет -1500 см"1, в то время как расстояние между максимумами выцветания на 690 и 705 нм (рис. 8), отвечающие Ао (или A<f) и Р700* (или Р700+) соответственно, равно 240 см"1. Поэтому, импульс, скорее всего, возбуждает одновременно Ао и Р700, с образованием когерентного электронно-колебательного волнового пакета на состояниях А0* и Р700*. Как только волновой пакет разваливается из-за электронной фазовой релаксации, электрон стабилизируется на А0, что приводит к разделению заряда в РЦ.

Для качественной проверки гипотезы о когерентном механизме процесса разделения заряда был проведен эксперимент с амплитудной модуляции возбуждающего импульса. Синий край спектра возбуждающего импульса был отрезан до 700 нм амплитудно-фазовым модулятором таким образом, чтобы не возбуждать А0. При этом ожидалось, что произойдет замедление разделения заряда в РЦ ФС1, вследствие отсутствия когерентного режима этого процесса.

На рис. 11 представлена динамика дифференциальных спектров ФС1 при возбуждении модулированным импульсом. Форма спектров сильно отличается от аналогичных спектров при возбуждении спектрально-ограниченным импульсом (рис. 6, 7). При задержке 100 фс наблюдается только одна полоса выцветания на 705 нм, а полоса выцветания на 690 нм, отвечающая Л0*/А0", начинает образовываться только после 1,5 пс.

Длина волны (нм)

Рис. 11. Дифференциальные спектры поглощения восстановленной ФС1 в области Qv полосы при возбуждении ачплитудно-модулированным импульсом на 720 нм при задержках от 100 фс до 3,3 пс.

Этот факт можно объяснить следующим образом: при селективном возбуждении Р700, когерентного электронно-колебательного волнового пакета на состояниях Р700 и А о не создается, и поэтому разделение заряда происходит значительно медленнее, в рамках традиционных представлений о механизме разделения заряда в РЦ ФС1, описанным в работе [2].

Для описания процесса когерентного разделения зарядов в РЦ была рассмотрена следующая модель. Пусть \fi(Ei) и чЫЕг) - волновые функции возбужденных состояний, отвечающие А0* и Р700* соответственно. Тогда, при наличии диполь-дипольного взаимодействия Vu между этими состояниями появляются две новые волновые функции fs и с энергиями Es и ЕА соответственно, которые выражаются через vyi и i|/2: Ч^ = {cos(J> i|/i + sin<t> v|>2} exp{-(i/h) Est},

Ч'д = {соэф у? - sinij) } exp{-(i/h) EAt}, (1)

где

Es,a = (E, + E2)/2 ± 0,5 V{(E, - E2)J +4V122}, tg 2ф = 2V]2/(Ei - E2),

Волновые функции I's и Ч'А являются стационарными, но при условии фемтосекундного фотовозбуждения ФС1 нестационарная функция может быть рассмотрена как суперпозиция Ч^ и 4V 4' = Cs4's + Ca4'a =

= (cs costj) exp{-(i/h) Est} - cA sinij) exp{-(i/h) EAt}) vf/j + + ( cs sini|> exp{-(i/h) Est} + cA cos<J) exp{-(i/h) EAt}) vj/2 = = c, v|/| + c2 щ ■ (2)

16

Следует отметить, что [c¡|2 и |с2|2 выражают временную зависимость образования и гибели полос выцветания на 690 и 705 нм соответственно. Накладываемые условия на |ci|2 и |с2|\ с учетом фемтосекундного возбуждения ФС1, выглядят следующим образом: при t = 0 |ci|2 = 1 и |с2|2 = 0, а при t > 0, |ci¡2 + |с2|2 = 1. Если в выражении (2) принять, что cs = cos(j> и сА = -s 1пф, то получим:

|с,|2 = cos4(<¡>) + sin4«») + 0,5 sin2 (2ф) cos (AEt/ h), [c2|2 = 0,5 sm2(2<ji) (1 - cos (AEt/ h)), (3)

где ДЕ = Es - Ea. Если же взять ф = 45° и AEt/ h = л, то |с,|2 = 0 и jc2|2 = 1.

На рис. 12 представлена временная зависимость ДА705/ДА690 для ФС1 с открытым РЦ при возбуждении импульсом на 720 нм и длительностью 22 фс. Сплошной черной линией на рис. 12 показано отношение |сг(2/|с1соответствующее в эксперименте AA7ü5/AAs9o. При экспериментально полученном значении ДЕ, равным 240 см'1 (разница между 690 и 705 нм), модельная кривая совпадает с экспериментальной зависимостью при ф=21°. В этом случае отношение 2V12/(E1 - Е2) составляет ~0,9.

1.2 1.0

§ 0.8

СО

4 0.6

а

N.

Зз 0.4 0.2 0.0

12 3 4

ДЕ-№ (рад)

Рис. 12. Временная зависимость ДА705/ДА690 для ФС1 с открытым РЦ при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 22 фс. Сплошной линией обозначена модельная кривая.

Примечательно, что в интервале от 80 фс и далее теоретическая кривая и экспериментальная зависимость расходятся: теоретическая идет к нулю при ДЕ1/Ь =2я, а экспериментальное отношение ДА7о5/ДА69о остается практически неизменным вплоть до нескольких пикосекунд. Причиной такой разницы в поведении зависимостей, скорее всего, является образование ион-радикальной пары Р700 Ао", на что указывает появление поглощения на 660 нм после 60 фс.

В пятой части главы изложены результаты исследования динамики ФС1 при фазовой модуляции возбуждающего импульса.

Простейшее изменение фазовых характеристик фемтосекундного импульса осуществляется варьированием линейного чирпа. Смысл этого параметра заключается в следующем. Напряженность электрического поля можно представить как £ = £0(/)-со5[й),/+а(0], где а(1) - функция, описывающая модуляцию несущей частоты за время импульса. Во многих экспериментах используют такие импульсы,

17

Время задержки (фс) 20 40 60 80 100

для которых a(t) = y-t1H. Параметр у, характеризующий скорость фазовой модуляции, называется линейным временным чирпом. Этот параметр показывает, какие компоненты частот спектра облучают образец в начале, а какие позже, то есть относительные фазы спектральных компонент различаются. В случае линейного чирпа импульса, фаза спектральной компоненты зависит от ее частоты следующим образом:

1 1 4п~

<р(о>) = -Р-(а)-(оа)-, Р = -

2 0 16(1п2)! + угт4'

где т - длительность импульса. Параметр Р называют спектральным чирпом. Варьируя этот параметр с помощью фазового модулятора, мы изменяем относительную задержку спектральных компонент импульса. Следует отметить, что при изменении только лишь знака чирпа энергия и длительность импульса не изменяются.

0.5Р

0.0

—•— -1200 фс' О - +1200 фс2

ft №

-1.0 - ЪчШЗкЯ*. a¡ Jb.-

<

-1.5

-2.0 b

0.S 1.0 1.5 2.0 Время задержки (пс)

-2

-6 ■

3 -в

... Офс

--50000 фс3

-10

гг V

у.

U 93***

Г', ,

iVv

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Время задержки (пс)

Рис. 13. А - кинетические кривые на длине волны 705 нм после вычитания окисленной из восстановленной ФС1 при разных линейных чирпах (Р=±1200 фс2) возбуждающего импульса на 720 нм. Б - кинетическая кривая окисленной ФС1 на длине волны 435 нм при разных чирпах возбуждающего импульса на 700 нм.

В ходе исследования влияния фазовых характеристик возбуждающего импульса на динамику ФС1 были выполнены два эксперимента: с положительным и отрицательным линейными чирпами возбуждающего импульса на 720 нм. Импульсы имели один и тот же спектральный состав, одну и ту же длительность (35 фс) и энергию (80 нДж). На рис. 13А представлена кинетическая кривая на длине волны 705 нм при двух разных значениях ß.

После релаксации электронной фазы в возбужденных электронных состояниях Ао и Р700* может оставаться колебательная когерентность, в рамках которой может проявляться когерентное управление динамикой процессов переноса электронов в реакционном центре. Различие в динамике может быть связано с влиянием фазовых характеристик как на процессы, протекающие в антенне, так и в РЦ. Образование когерентного колебательного пакета в антенном комплексе было обнаружено при возбуждении ФС1 импульсом на 700 нм с нелинейным чирпом (рис. 13Б).

Это позволяет предположить, что чирпировние может влиять на скорость передачи энергии от антенны на РЦ. Однако проведенный анализ кинетических кривых в антенном комплексе (когда РЦ ФС1 закрыт) показал, что в условиях проведенных экспериментов с возбуждением на 720 нм при линейном чирпировании

никаких существенных динамических изменений в антенне не происходит. Это означает, что наблюдаемое когерентное управление (рис. 13А) связано с образованием когерентных пакетов в РЦ.

Для когерентного управления необходимо наличие хотя бы двух каналов переноса электрона. В литературе экспериментально показано, что перенос электрона в РЦ ФС1 может происходить по двум ветвям. Проведенные нами эксперименты с мутантными штаммами AML и BML ФС1 показали, что эти ветви переноса электрона не эквивалентны, т.е. скорости образования первой ион-радикальной пары в разных ветвях различны. Эти аргументы могут указывать на то, что при изменении фазовых характеристик когерентного колебательного волнового пакета меняется вклад ветвей в общий перенос электрона, что проявляется в изменении экспериментально наблюдаемой динамике процессов переноса электрона. Кроме того, нельзя не сказать о том, что когерентное управление может быть обусловлено и изменением эффективности переноса энергии возбуждения в антенне.

Четвертая глава диссертации посвящена исследованию фемтосекундной динамики первичных процессов разделения заряда в РЦ ФС2 (Dl/D2/Cyt Ь559).

Возбуждение изолированного РЦ ФС2 проводилось фемтосекундным импульсом с несущей длиной волны 700 нм, длительностью 20 фс и энергией 100 нДж. Главная цель такого возбуждающего фемтосекундного импульса на длине волны 700 им заключалась в минимизации возбуждения пигментов, поглощающих на длине волны 670 нм.

Наиболее значительные изменения поглощения РЦ ФС2 наблюдаются в спектральном диапазоне 410-470 нм, что указывает на образование ион-радикальных состояний Chi и/или Pheo в фемто- и пикосекундном диапазоне времен, которые, как известно, поглощают вблизи 450 нм [10]. Для того чтобы выявить динамику этого процесса спектр возбужденного состояния РЦ, измеренного на самых ранних временах 0,10-0,15 пс, был вычтен из спектров при больших задержках. Эта операция с вычитанием проводилась в предположении, что выцветание в полосе Соре для (Chl/Pheo)* и (Chl/Pheo)" одинаково. Тогда, результат вычитания главным образом должен быть связан именно с ион-радикальным состоянием либо Chi", либо Pheo".

Длина волны (нм)

Рис. 14. Дифференциальные спектры ДДА РЦ ФС2 в диапазоне 405-585 нм после вычитания спектра возбужденного состояния (0,10-0,15 пс) из спектров при всех остальных временах задержки.

На рис. 14 показаны спектры (ЛДА) РЦ ФС2 после операции вычитания, описанной выше, в спектральном диапазоне 405-585 нм. Полоса вблизи 445 нм, которая относится к ион-радикальной полосе [10], наблюдается уже при задержках менее 1 пс. Кинетическая кривая на этой длине волны (рис. 15А) была аппроксимирована суммой двух экспонент с характерными временами 1,4±0,2 (с вкладом 26%) и 14,7±5,0 пс (-74%).

Очевидно, что на динамику ион-радикальной полосы на 445 нм будет накладываться динамика тушения возбужденного состояния РЦ. Полоса в области 470-580 нм с отрицательным значением АДА и центром вблизи 510 нм (рис. 14), которая возникла одновременно с возбужденным состоянием РЦ и, затем, развивалась в фемто- и пикосекундном масштабе времен, может служить индикатором формирования и тушения возбужденного состояния РЦ.

Время задержки (пс) Время задержки (пс)

Рис. 15. Кинетические кривые МА РЦ ФС2 на 445 нм (А) и 510 нм (Б). При двухэкспоненциальной аппроксимации характерные времена для 445 нм: Т1=1,4±0,2 пс и Тг=14,7±5,0 пс, а для 510 нм: Т|=0,6±0,6 пс и т2=10,7±2,0 пс.

Длина волны (нм)

Рис. 16. Дифференциальные спектры ДДА РЦ ФС2 в диапазоне 645-740 нм после вычитания спектра возбужденного состояния (0,10-0,15 пс) из спектров при всех остальных временах задержки.

Показанная на рис. 15Б кинетическая кривая тушения на длине волны 510 нм может быть аппроксимирована суммой двух экспонент с характерными временами

0,6±0,6 (-12%) и 10,7±2,0 пс (-88%) соответственно, которые почти совпадают в пределах ошибок с характерными временами для кинетической кривой на 445 нм.

Природа двух кинетических компонент, наблюдаемых на 445 и 510 нм, может стать более ясной из рассмотрения динамики в области <3У полосы поглощения. Для этой цели на рис. 16 показаны дифференциальные спектры (ДДА) для разных временных задержек, которые были получены также как и спектры на рис. 14, но только в диапазоне 645-740 нм.

Амплитуда изменений поглощения на длинах волн 670 и 685 нм, измеренная как результат вычитания ДДА67о=ДА67о-(ДАМ5+ДА685)/2 и ДДА685=ДАб85-(ДА67о+ДА7оо)/2, может быть использована как амплитуда в кинетиках на длинах волн 670 нм (рис. 17А) и 685 нм (рис. 17Б) соответственно. Обе кинетические кривые были аппроксимированы двумя экспонентами и характерные времена для обеих составили ~1 и -15 пс.

Следует отметить, что СЫШЮ, а так же СМ7Л 71 поглощают вблизи 670 нм, поэтому при возбуждении фемтосекундным импульсом на 700 нм с полушириной -40 нм возбуждаться будут хромофоры, имеющие поглощение на 680 нм. А такими в РЦ ФС2 являются РЬео и Р680.

Время задержки (пс) Рис. 17. Кинетические кривые ДДА РЦ <1 времена для обеих длин волн составляют -1

ii°. ... i .... i .... i .... || 0 5 10 15 20 Время задержки (пс)

2 на 670 нм (А) и 685 нм (Б). Характерные -15 пс.

С учетом литературных данных рассмотрим два возможных подхода к объяснению результатов, представленных на рис. 14 и 16. Первая модель разделения зарядов в РЦ ФС2, предполагает что из возбужденного состояния СЫШ электрон переходит к PheoD] с образованием первичной радикальной пары ChlDi+PheoDf, а вторая модель - что электрон переходит от Р680* к PheoD1 через СЬЬь В обоих случаях электрон от PheoDr переходит к Qa за 200 пс [12]. Первая модель предполагает, что динамика ион-радикалыюй полосы Pheo~ на 445 нм должна иметь самое маленькое характерное время, так же как и в полосе выцветания СЫШ, из-за образования ChlD1+. Только после завершения этой быстрой реакции электрон переходит от Р680 к ChlDi+ с более медленным характерным временем. Согласно второй модели быстрой реакцией должно быть образование Р680 СЫш", в то время как медленная реакция должна соответствовать переходу электрона от ChlDi~ к PheoDi-В соответствии с первой моделью, ион-радикальная полоса PheoDf на 445 нм не может иметь медленную компоненту, если конечно не предположить особый вклад ChlD1+ в полосу PheoDr, который уменьшается, когда электрон переходит от Р680 к

ChID]+. В случае же второй модели, полоса PheoDi" на 445 нм наоборот должна иметь динамик)' с медленной кинетикой, как это и видно на рис. 15А.

Спектры, показанные на рис. 16, могут быть также рассмотрены с точки зрения этих двух моделей. Выцветание на длине волны 670 нм (рис. 17А) может быть свидетельством участия СЫШ в процессе разделения зарядов согласно второй модели. Кинетика выцветания на 670 нм, так же как и кинетика на 685 нм, включает две временные компоненты, которые совпадают с ранее упомянутыми: быструю (0,9 пс) и медленную (14 пс). Само выцветание на 670 нм может быть рассмотрено как восстановление СЫщ вследствие первичного разделения заряда между Р680* и ChID1. Так как этот процесс является превращением РЦ* в состояние с разделенными зарядами, то должно наблюдаться уменьшение стимулированного излучения на 685 нм, которое представлено на рис. 16 как положительное АДА на 685 нм с соответствующей кинетической кривой (рис. 17Б). Кроме того, медленная компонента (14 пс) выцветания на 685 нм может относиться к медленному переходу электрона от ChlD1" к Pheom- Следует отметить, что при этом динамика восстановления ChIDi согласуется с аналогичным поведением в полосе 445 нм на ранних временах.

Хотя представленные здесь результаты фемтосекундного исследования не могут совершенно исключать первую модель, они показывают гораздо лучшее совпадение со второй моделью. В соответствии с этой моделью схема первичных стадий переноса электрона в РЦ ФС2 может быть представлена следующим образом: , 0,9 пс 14 пс . ,

Р680 -> Р680 ChlD1--> Р680 PheoDf ■

Основные результаты и выводы:

1. Обнаружено быстрое разделение заряда в РЦ ФС1 за время <100 фс при возбуждении фемтосекундным импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 22 фс. Предположено, что оно может происходить вследствие когерентного электронно-колебательного волнового пакета, создаваемого возбуждающим импульсом на энергетических уровнях Р700* и А0*.

2. Предложен механизм первичных процессов в РЦ ФС1; определены характерные времена передачи энергии от антенны на РЦ (~5 пс) и образования вторичной ион-радикальной пары Р700+А]' (26 пс).

3. Установлено, что точечная мутация аксиального лиганда к хлорофиллу А0 в ветви А цепи переноса электрона ФС1 приводит к большему замедлению процессов в РЦ, чем аналогичная мутация в ветви В, что указывает на их неэквивалентность.

4. Установлено влияние фазовых характеристик возбуждающего импульса как на динамику антенного комплекса, так и на динамику процессов в РЦ ФС 1.

5. Установлено, что разделение заряда в изолированном РЦ ФС2 (01/02/Су1 Ь559) при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 700 нм и длительностью 20 фс происходит за 0,9 пс с образованием первичной радикальной пары Р680+СЫш~> образование вторичной ион-радикальной пары Р680+РЬеопГ происходит за -14 пс.

Материалы диссертации отражены в следующих публикациях:

1. Sarkisov О.М., Gostev F.E., Shelaev I.V., Novoderezhkin V.I., Gopta O.A., Mamedov M.D., Semenov A.Yu. and Nadtochenko V.A.. Long-lived coherent oscillations of the femtosecond transients in cyanobacterial photosystem I И Phys. Chem. Chem. Phys., 2006, 8, pp. 1-8.

2. Shelaev I.V., Gostev F.E., Nadtochenko V.A., Shkuropatov A.Ya., Zabelin A.A., Mamedov M.D., Semenov A.Yu., Sarkisov O.M., Shuvalov V.A.. Primary light-energy conversion in tetrameric chlorophyll structure of photosystem II and bacterial reaction centers: II. Femto- and picosecond charge separation in PSII Dl/D2/Cyt b559 complex!'I Photosynth. Res., 2008, 98, pp. 95-103.

3. Shelaev I.V., Gostev F.E., Mamedov M.D., Sarkisov O.M., Nadtochenko V.N., Shuvalov V.A and Semenov A.Yu.. Femtosecond primary charge separation in Synechocystis sp. PCC 6803 photosystem IИ Biochim. Biophys. Acta, 2010, 1797, pp. 1410-1420.

4. Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Саркисов O.M., Надточенко В.А., Семенов А.Ю., Шувалов В.А.. Фемтосекундная динамка первичных процессов, протекающих в фотосистеме I цианобактерииП Труды 51-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Ч. IV, молекулярная и биологическая физика, Москва, МФТИ, 2008, с.107-109.

5. Shelaev I.V., Gostev F.E., Mamedov М., Sarkisov О.М., Nadtochenko V.A., Shuvalov V.A., Semenov A.Yu.. Femtosecond primary charge separation in photosystem I II International conference «Organic nanophotonics», St. Petersburg, Russia, June 21-28, 2009, p. 38.

6. Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Надточенко B.A., Шкуропатов А.Я., Забелин А.А., Мамедов М.Д., Семенов А.Ю., Саркисов О.М., Шувалов В.А.. Процесс разделения заряда в реакционном центре фотосистемы 2 на фемтосекундной шкапе времен И Труды 52-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Ч. IV, молекулярная и биологическая физика, Т. 2, Москва, МФТИ, 2009, с. 121-122.

Цитируемая литература:

1. Jordan P., Fromme P., Witt Н.Т., Klukas О., Saenger W., Krauss N.. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution!I Nature, 2001, 411, pp. 909-917.

2. Savikhin S., Xu W., Chitnis P.R., Struve W.S.. Ultrafast primary processes in PS I from Synechocystis sp. PCC 6803: roles ofP700 and A0H Biophys. J., 2000, 79, pp. 15731586.

3. Melkozernov A.N., Lin S., Blankenship R.E.. Excitation dynamics and heterogeneity of energy equilibration in the core antenna of Photosystem I from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 680311 Biochemistry, 2000, 39, pp. 1489-1498.

4. Ramesh V.M., Gibasiewicz K., Lin S., Bingham S.E., Webber A.N.. Replacement of the methionine axial ligand to the primary electron acceptor Aa slows the Ao~ reoxidation dynamics in Photosystem III Biochim. Biophys. Acta, 2007, 1767, pp. 151-160.

5. Shkuropatov A.Ya., Khatypov R.A., Shkuropatova V.A., Zvereva M.G., Ovens T.G., Shuvalov V.A.. Reaction centers of photosystem II with a chemically-modified pigment composition: exchange of pheophytins with 131-deoxo-131-hydroxy-pheophytin all FEBS Lett., 1999,450, pp. 163-167.

6. Wiederrecht G.P., Seibert M., Govindjee, Wasielewski M.R.. Femtosecond photodichroism studies of isolated photosystem II reaction centers// Proc. Nati Acad Sci. USA, 1994, 91, pp. 8999-9003.

7. Holzwarth A.R., Muller M.G., Reus M., Nowaczyk M., Sander J., Rogner M.. Kinetics and mechanism of electron transfer in intact photosystem II and in the isolated reaction center: Pheophytin is the primary electron acceptorII Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2006, 103, 18, pp. 6895-6900.

8. Hastings G., Kleinherenbrink F.A.M., Lin S., McHugh T.J., Blankenship R.E.. Observation of the reduction and reoxidation of the primary electron acceptor in photosystem 11/ Biochemistry, 1994, 33, pp. 3193-3200.

9. Shuvalov V.A., Nuijs A.M., van Gorkom H.J., Smit H.W.J., Duysens L.N.M.. Picosecond absorbance changes upon selective excitation of the primary electron donor P700 in photosystem III Biochim. Biophys. Acta, 1986, 850, pp. 319-323.

10.Fujita I., Davis M.S., Fajer J.. Anion Radicals of Pheophytin and Chlorophyll a: Their Role in the Primary Charge Separations of Plant Photosynthesis!/ JACS, 1978, 100, 19, pp. 6280-6282.

11.Ernsting N.P., Kovalenko S.A., Senyushkina T., Saam J., Farztdinov V.. Wave-packet-assisted decomposition of femtosecond transient ultraviolet-visible absorption spectra: application to excited-state intramolecular proton transfer in solution// J. Phys. Chem. A, 2001,105, pp. 3443-3453.

12.Nuijs A.M., van Gorkom H.J., Plijter J.J., Duysens L.N.M.. Primary charge separation and excitation of chlorophyll a in photosystem // particles from spinach as studied by picosecond absorbance difference spectroscopy!I Biochim. Biophys. Acta, 1986, 848, pp. 167-175.

Подписано в печать: 18.11.2010

Заказ № 4605 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1 Электрон-транспортная цепь в процессе фотосинтеза.

1.2.1 Строение ФС1.

1.2.2 Спектроскопические исследования ФС1.

1.3.1 Строение ФС2.

1.3.2 Спектроскопические исследования ФС2.

1.4 Когерентное управление в фотосинтетических системах.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1 Система регистрации спектров фотоиндуцированного поглощения.

2.2 Методика коррекции спектров фотоиндуцированного поглощения.

2.3 Система управления амплитудно-фазовыми характеристиками возбуждающего импульса.

2.4 Образцы ФС1 и ФС2 в фемтосекундных исследованиях.

Глава 3. Результаты исследования ФС1.

3.1 Фемтосекундная динамика ФС1 при возбуждении 670 и 700 нм.

3.2 Фемтосекундная динамика ФС1 при возбуждении 720 нм.

3.3 Фемтосекундная динамика мутантных штаммов ФС1.

3.4 Когерентный механизм разделения зарядов в РЦ ФС1.

3.5 Когерентное управление процессами в ФС1.

Глава 4. Результаты исследования ФС 2.

Фемтосекундная динамика изолированного РЦ ФС2.

Развитие современной химии и биологии тесно связано с изучением сверхбыстрых процессов, происходящих в фемтосекундной шкале времен. Инструментом, с помощью которого возможно исследование сверхбыстрой динамики в биологических и химических системах, является фемтосекундная лазерная спектроскопия. В последние годы развитие фемтосекундной лазерной техники позволило повысить временное разрешение в разы, что дало возможность изучать процессы, протекающие за десятки фемтосекунд. Существенной особенностью протекания реакций под действием световых фемтосекундных импульсов является то, что реакции могут протекать в когерентном режиме. В этом режиме, манипулируя амплитудно-фазовыми характеристиками, можно осуществлять когерентное управление динамикой процессов, влиять на выход интермедиатов.

Самый известный и важный процесс, происходящий в природе под действием света, является фотосинтез. В этом процессе используются неисчерпаемый источник энергии — солнечный свет и неисчерпаемый донор электронов - вода. Первичные процессы этого удивительного явления протекают в фотосинтетических системах: фотосистеме 1 (ФС1) и фотосистеме 2 (ФС2). Принцип работы фотосистем может быть использован в самых различных разработках: в преобразовании солнечной энергии в электрическую энергию, в производстве топлива, такого как водород, в производстве биологически активных соединений, таких как НАДФН, НАДН и т.д.

Возможность использования фотосистем при решении тех или иных задач подразумевает хорошее понимание процессов, происходящих внутри самих этих белковых комплексов. К сожалению, на сегодняшний день отсутствует однозначное представление о динамике и механизмах процессов, идущих внутри реакционных центрах фотосистем, о природе первичного донора электрона, о механизме работы светособирающей антенны, передающей возбуждение на реакционный центр (РЦ), о степени асимметрии переноса электрона по симметричным ветвям редокс-кофакторов в ФС1.

Причина разногласий в большинстве случаев лежит в сложности интерпретации экспериментальных данных. Так в ФС1 РЦ и антенный комплекс неотделимы друг от друга, и, кроме того, поглощают в одной спектральной области, что затрудняет расшифровку фемтосекундных данных. В ФС2 возможно выделить отдельно РЦ, но она является нестабильной при комнатной температуре.

Решить эти проблемы возможно, повышая временное разрешение фемтосекундных исследований, модернизируя методики измерений, а так же изучая динамику при перестройке несущей длины волны возбуждающего импульса. Именно такой подход к исследованию процессов в ФС1 и ФС2 реализуется в представленной диссертационной работе.

Цели и задачи:

1. Получить экспериментальные данные по динамике фотоиндуцированного поглощения для ФС1 и ФС2 в фемто- и пикосекундном масштабе времен.

2. Разработать методику отделения динамики реакционного центра ФС1 от динамики переноса энергии возбуждения в светособирающей антенне.

3. На основе экспериментальных данных предложить механизм первичных фотохимических процессов, протекающих в реакционных центрах ФС1 и ФС2.

4. Исследовать степень асимметрии переноса электрона по симметричным ветвям редокс-кофакторов в реакционном центре ФС1 БупескосузИз яр. РСС 6803, путем изучения динамики в мутантных штаммах с заменами лигандов к первичному акцептору Ао в каждой из ветвей редокс-кофакторов.

5. Исследовать влияние фазовых и амплитудных характеристик возбуждающего фемтосекундного импульса на динамику ФС1.

В представленной работе получены экспериментальные данные с более высоким временным разрешением, чем в аналогичных фемтосекундных исследованиях, описываемых в литературе. Кроме того, сдвиг несущей длины волны возбуждающего импульса в красную область позволил выделить динамику первичных процессов в реакционном центре ФС1 и ФС2. Это позволило обнаружить быстрое разделение заряда в РЦ ФС1. На основе данных предложен механизм такого быстрого процесса. В работе так же получены данные об активности ветвей электрон-транспортной цепи в РЦ ФС1.

Диссертация состоит из четырех глав, введения, заключения и списка цитируемой литературы.

Первая глава диссертации является обзором научной литературы по тематике исследования. В первой части этой главы кратко изложены общие вопросы, касающиеся процесса фотосинтеза. Затем изложены современные представления о структуре ФС1 на молекулярном уровне и литературные данные по спектроскопическим и фемтосекундным исследованиям ФС1. Так же представлены данные о строении ФС2 и ее спектроскопии. В конце главы изложены общие понятия о когерентном управлении и литературные данные по управлению процессами, протекающими в биологических системах.

Во второй главе описывается экспериментальная установка, методика обработки экспериментальных данных, а также принцип работы амплитудно-фазового модулятора фемтосекундных импульсов и параметры исследуемых образцов ФС1 и ФС2.

Третья глава диссертации посвящена исследованию динамики первичных процессов ФС1, протекающих в РЦ и антенном комплексе при возбуждении фемтосекундными импульсами с несущими длинами волн 700 и 670 нм, а так же 720 нм. Кроме того, здесь представлены результаты исследования влияния амплитудно-фазовых характеристик возбуждающего импульса на процессы в ФС1. Приведены результаты изучения динамики мутантных штаммов ФС1 M688LPsaA (AML) и M668LPsaB (BML). Предложен механизм первичных процессов в РЦ ФС1.

Четвертая глава диссертации посвящена исследованию динамики первичных процессов в изолированном реакционном центре ФС2, выделенной из шпината.

В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы.

В конце диссертации приводится список цитируемой литературы.

Выводы:

1. Обнаружено быстрое разделение заряда в РЦ ФС1 за <100 фс при возбуждении фемтосекундным импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 22 фс.

2. Предложен механизм первичных процессов в РЦ ФС1 и определены характерные времена процессов передачи энергии от антенны на РЦ (~5 пс) и образования второй ион-радикальной пары Р700+А1 (26 пс).

3. Показано, что точечная мутация аксиального лиганда к хлорофиллу Ао в ветви А цепи переноса электрона ФС1 приводит к большему замедлению процессов в РЦ, чем аналогичная мутация в ветви В, что указывает на их неэквивалентность.

4. Показано, что быстрое разделение заряда может происходить вследствие когерентного электронно-колебательного волнового пакета, создаваемого возбуждающим импульсом на энергетических уровнях Р700* и Ао*.

5. Установлено влияние фазовых характеристик возбуждающего импульса как на динамику антенного комплекса, так и на динамику процессов в РЦ ФС1. А так же предложена гипотеза о когерентном управлении вкладом двух ветвей в процесс переноса электрона в РЦ путем фазовой модуляции импульса.

Глава 4 Результаты исследования ФС2

Фемтосекундная динамика изолированного РЦ ФС2.

Исследование ФС2, являющейся одной из основных звеньев в процессе фотосинтеза наравне с ФС1, состояло в изучении фемтосекундной динамики первичных процессов, происходящих в РЦ ФС2 (ТЛ/1Ш/Су1 Ь559). Хотя БШШ/Су! Ь559 РЦ содержит минимальное число кофакторов (шесть хлорофиллов и два феофитина), динамика передачи энергии между хромофорами, а также кинетика и механизм первичного разделения заряда в РЦ до сих пор плохо изучены, как было отмечено ранее в главе 1. Затруднение, главным образом, вызвано тем, что в полосе крайне трудно отделить возбужденное состояние от состояния с разделенными зарядами. Также, установление быстрого равновесия между возбужденными состояниями, между возбужденным состоянием и состоянием с разделенными зарядами и между состояниями с разделенными зарядами создает трудности в определении внутренних констант скоростей для процесса разделения зарядов.

Особая проблема интерпретации данных заключается в вопросе о природе первичного донора электрона в РЦ ФС2, который обсуждался в главе 1. Следует еще раз отметить, что внутренняя скорость разделения зарядов в РЦ ФС2 по литературным данным сильно варьируется в зависимости от длины волны возбуждения и температуры [81].

Возбуждение изолированного РЦ ФС2 проводилось фемтосекундным импульсом с несущей длиной волны 700 нм, длительностью 20 фс и энергией 100 нДж. Главная цель такого возбуждающего фемтосекундного импульса на длине волны 700 нм заключалась в минимизации возбуждения пигментов, поглощающих на длине волны 670 нм.

Т-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

400 450 500 550 600 650 700 Длина волны (нм)

Рис. 37. Динамика спектров фотоиндуцированного поглощения изолированных РЦ ФС2 при температуре 278 К при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 700 нм и длительностью 20 фс.

На рис. 37 представлена динамика спектров фотоиндуцированного поглощения изолированных РЦ ФС2 при температуре 278 К и при задержках от 0,1 пс до 28,5 пс. Как видно на рис. 37, основные изменения происходят вблизи 430 и 682 нм, полосы Соре и Qy соответственно. Помимо выцветания молекул Chl/Pheo в полосе Qy присутствует и стимулированное излучение.

Выцветание Pheo в полосе Qx на длине волны 545 нм присутствует уже на самых ранних временах (0,1-0,2 пс) и сохраняется до 28,5 пс (самой большой задержке в данном исследовании). Амплитуда выцветания на длине волны 545 нм остается постоянной на протяжении всего эксперимента. Это позволяет предположить, что возбужденное состояние РЦ включает частично I и Pheo*oi,d2, что, затем, переходит в состояние с разделенными зарядами P680'PheoDf, с похожим выцветанием на 545 нм. Следует отметить, что выцветание узкой полосы РИео на 510 нм увеличивается, а вблизи 420 нм — уменьшается в пикосекундном масштабе времен, что указывает на переход из состояния (РЬеощ/РЬеот)* в состояние (РЬео01)-.

Время задержки (пс)

Рис. 38. Кинетическая кривая РЦ ФС2 на 665 нм при температуре 278 К и при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 700 нм.

На рис. 38 показана кинетическая кривая на длине волны 665 нм, демонстрирующая быстрое выцветание в течение первых 2,5 пс с последующей релаксацией с характерным временем 13,3 пс. Такое изменение поглощения связано, скорее всего, с окислением первичного акцептора электрона (СЫ670) вследствие перехода электрона к PheoD|.

Хорошо известно, что поглощение в Qy полосе всеми восьмью пигментами в РЦ ФС2 проявляется в виде одной полосы с центром на 675676 нм при комнатной температуре, и только при криогенной температуре частично разрешается. При этом выделяются две перекрывающиеся полосы на 670 и 680 нм с плечом на 684 нм. Электронный переход Pheo Qx хорошо разрешается, в отличие от переходов для хлорофиллов, он проявляется в виде пика на 542-543 нм, как при комнатной, так и при низкой температуре.

Наиболее значительные изменения поглощения РЦ ФС2 наблюдаются в спектральном диапазоне 410-470 нм (рис. 37), что указывает на образование ион-радикальных состояний Chi и/или Pheo в фемто- и пикосекундном диапазоне времен, которые, как известно, поглощают вблизи 450 нм [50]. Для того чтобы выявить динамику этого процесса спектр возбужденного состояния РЦ, измеренного на самых ранних временах 0,10-0,15 пс, был вычтен из спектров при больших задержках. Эта операция с вычитанием проводилась в предположении, что выцветание в полосе Соре для (Chl/Pheo)* и (Chl/Pheo)" одинаково. Тогда, результат вычитания главным образом должен быть связан именно с ион-радикальным состоянием либо Chi", либо Pheo".

I—I—|—I—I—I—|—I—I—I—|—I—I—I—|—I—I—I—|—I—I—I—|—I—I—I—|—I—I—I—|—I—I—I—|

420 440 460 480 500 520 540 560 580 Длина волны (нм)

Рис. 39. Дифференциальные спектры ААА РЦ ФС2 в диапазоне 405-585 нм после вычитания спектра возбужденного состояния (0,10-0,15 пс) из спектров при всех остальных временах задержки.

На рис. 39 показаны спектры (AAA) РЦ ФС2 после операции вычитания, описанной выше, в спектральном диапазоне 405-585 нм. Полоса вблизи 445 нм, которая, скорее всего, относится к ион-радикальной полосе [50], наблюдается уже при задержках менее 1 пс, а изменения AAA происходят даже и после 30 пс. Кинетическая кривая на этой длине волны (рис. 40А) была аппроксимирована суммой двух экспонент с характерными временами 1,4±0,2 (с вкладом 26%) и 14,7±5,0 пс (-74%).

Очевидно, что на динамику ион-радикальной полосы на 445 нм будет накладываться динамика тушения возбужденного состояния РЦ. Полоса в области 470-580 нм с отрицательным значением AAA и центром вблизи 510 нм (рис. 39), которая возникла одновременно с возбужденным состоянием РЦ и, затем, развивалась в фемто- и пикосекундном масштабе времен, может служить индикатором формирования и тушения возбужденного состояния

РЦ.

Показанная на рис. 40Б кинетическая кривая тушения на длине волны 510 нм может быть аппроксимирована суммой двух экспонент с характерными временами 0,6±0,6 (-12%) и 10,7±2,0 пс (-88%) соответственно, которые почти совпадают в пределах ошибок с характерными временами для кинетической кривой на 445 нм.

Время задержки (пс)

Время задержки (пс)

Рис. 40. Кинетические кривые АДА РЦ ФС2 на 445 нм (А) и 510 нм (Б). При двухэкспоненциальной аппроксимации характерные времена для 445 нм: т,=1,4±0,2 пс и т2=14,7±5,0 пс, а для 510 нм: т,=0,6±0,6 пс и т2=10,7±2,0 пс.

Природа двух кинетических компонент, наблюдаемых на 445 и 510 нм, может стать более ясной из рассмотрения динамики в области <3У полосы поглощения. Для этой цели на рис. 41 показаны дифференциальные спектры (ААА) для разных временных задержек, которые были получены также как и спектры на рис. 39, но только в диапазоне 645-740 нм. Здесь представлена динамика в фемто- и пикосекундном масштабе времен главных особенностей: выцветания на длине волны 670 нм и полосы с максимумом на 685 нм.

I—I—|—I—I—I—I—|—I—I—I—I—|—I—I—I—I—|—I—I—I—I—|—I

650 660 670 680 690

Длина волны (нм)

Рис. 41. Дифференциальные спектры ААА РЦ ФС2 в диапазоне 645-740 нм после вычитания спектра возбужденного состояния (0,10-0,15 пс) из спектров при всех остальных временах задержки.

Амплитуда изменений поглощения на длинах волн 670 и 685 нм, измеренная как результат вычитания ААА67о=АА67о-(АА645+ААб85)/2 и ААА685=ААб85-(ААб7о+АА7оо)/2, может быть использована как амплитуда в

-0.2

-0,55 пс

-0,7 пс

-0.4 кинетиках на длинах волн 670 нм (рис. 42А) и 685 нм (рис. 42Б). Обе кинетические кривые были аппроксимированы двумя экспонентами и характерные времена для обоих составили ~1 и ~15 пс. А

0.0 т I о х -0.2 о г

V©

С <1 <1

I . I . I . I

0 5 10 15 20

Время задержки (пс) < <

0.8

0.6 и ос

0.4

I 1 1 1 1 I

-1-1-1-г

-|-1-1-1-г

-1-1-1-г о

5 10 15 Время задержки (пс)

20

Рис. 42. Кинетические кривые ААА РЦ ФС2 на 670 нм (А) и 685 нм (Б). Характерные времена для обеих длин волн составляют ~1 и ~15 пс.

Следует отметить, что ChlDi>D2, а так же ChlZi>Z2 поглощают вблизи 670 им, поэтому при возбуждении фемтосекундным импульсом на 700 нм с полушириной ~40 нм возбуждаться будут хромофоры, имеющие поглощение на 680 нм. А такими в РЦ ФС2 являются Pheo и Р680.

Представленные экспериментальные данные можно интерпретировать следующим образом. Амплитуда полосы выцветания феофитинов на длине волны 545 нм, появившейся одновременно с возбуждением, при задержках более 30 пс скорее всего определяется образованием Pheo". Это означает, что вклад Pheooi* (и возможно Pheoo2*) в выцветание на длине волны 545 нм в возбужденном РЦ практически равен вкладу PheoDr в выцветание на той же длине волны, но уже связанным с образованием ион-радикальной пары. Если это так, то коэффициент экстинкции должен быть одинаковым для этих двух выцветаний, а это будет означать, что Pheo* преобразуется в PheoDr при возбуждении РЦ импульсом с несущей длиной волны 700 нм. Отношение амплитуд полос выцветания на длинах волн 420 нм и 545 нм для возбужденного состояния равно —13, а при уже образовавшемся PheoDT оно несколько меньше и составляет ~8 [52,82]. Кроме того, выцветание на длине волны 435 нм наблюдается в возбужденном состоянии РЦ и отсутствует при образовавшемся PheoDr. Это означает, что при возбуждении импульсом на 700 нм в выцветание РЦ* ФС2 дают вклад некоторые другие пигменты, возможно, пара Р680, имеющая поглощение на 435 нм [83, 84]. Это согласуется с выцветанием на длине волны 682 нм, которое так же включает и стимулированное излучение.

С учетом литературных данных рассмотрим два возможных подхода к объяснению результатов, представленных на рис. 39 и 41: первая - модель разделения зарядов в РЦ ФС2, предполагает, что из возбужденного состояния ChlDi* электрон переходит к PheoD] с образованием первичной радикальной пары ChlDi+PheoDr, а вторая модель - что электрон переходит от Р680* к Pheoob возможно через Chi di- В обоих случаях электрон от Pheoof переходит к (^д за 200 пс [85]. Первая модель предполагает, что динамика ион-радикальной полосы РЬео" на 445 нм должна иметь самое маленькое характерное время, так же как и в полосе выцветания СЫоь из-за образования СЫоЛ Только после завершения этой быстрой реакции электрон переходит от Р680 к СЫт+ с более медленным характерным временем. Согласно второй модели быстрой реакцией должно быть образование Р680+СЬЬГ, в то время как медленная реакция отвечает переходу электрона от СЫ0Г к РЬео01.

Действительно, согласно описанным результатам имеются две кинетические компоненты с характерными временами около 0,9 и 14 пс. Вычитание спектра фотоиндуцированного поглощения на ранних временах (0,1-0,15 пс) из спектров при больших задержках выявляет некоторые спектральные особенности (рис. 39 и 41). Эти особенности говорят о тушении возбужденного состояния РЦ, которое проявляется в исчезновении широкой полосы РЦ* вблизи 510 нм (рис. 40Б) и образовании ион-радикальной полосы на 445 нм (рис. 40А), имеющие кинетические компоненты со средними временами 0,9 и 14 пс. В соответствии с первой моделью, ион-радикальная полоса РЬеооГ на 445 нм не может иметь медленную компоненту, если конечно не предположить особый вклад СЫо1+ в полосу РЬеооГ, который уменьшается, когда электрон переходит от Р680 к СЫ01+. В случае же второй модели, полоса РЬео0]~ на 445 нм наоборот должна иметь динамику с медленной кинетикой, как это и видно на рис. 40А.

Спектры, показанные на рис. 41, могут быть также рассмотрены с точки зрения этих двух моделей. Выцветание на длине волны 670 нм (рис. 39) может быть свидетельством участия СЫ01 в процессе разделения зарядов согласно второй модели. Кинетика выцветания на 670 нм также как и кинетика на 685 нм включают две временные компоненты, которые совпадают с ранее упомянутыми: быстрая (0,9 пс) и медленная (14 пс). Само выцветание на 670 нм может быть рассмотрено как восстановление СЫо1 вследствие первичного разделения заряда между Р680* и СЬЬь Так как этот процесс является превращением РЦ* в состояние с разделенными зарядами, то должно наблюдаться уменьшение стимулированного излучения на 685 нм, которое представлено на рис. 41 как положительное АДА на 685 нм с соответствующей кинетической кривой (рис. 42Б). Кроме того, медленная компонента (14 пс) выцветания на 685 нм может относиться к медленному переходу электрона от ChlD]" к PheoDi. Следует отметить, что при этом динамика восстановления ChlDi согласуется с аналогичным поведением в полосе 445 нм на ранних временах.

Так как полоса выцветания на 670 нм наблюдалась всегда, когда образовывался PheoDr в РЦ [52, 82], можно было бы предположить, что это выцветание есть результат взаимодействия СЫШ и Pheooi- . Однако, быстрое образование выцветания (~0,9 пс) и медленная релаксация ДА (—14 пс) на 665 нм и ДДА на 670 нм (рис. 38 и 42А) не подтверждает данное предположение, что это выцветание - только индикатор восстановления Pheo, так как Pheo восстанавливается на протяжении 30 пс (рис. 39). Если же ChlDi все же поглощает на 670 нм, то согласно представленным экспериментальным данным, ChlDi не может быть первичным донором электрона в РЦ ФС2, что говорит не в пользу первой модели.

Хотя представленные здесь результаты фемтосекундного исследования не могут совершенно исключать первую модель, они показывают гораздо лучшее совпадение со второй моделью. В соответствии с этой моделью схема первичных стадий переноса электрона в РЦ ФС2 может быть представлена следующим образом:

0 9 пс 14 пс Р680*-'-> P680+ChlDf-> РбвО^еооГ .

Таким образом, из исследования РЦ ФС2 можно сделать следующие выводы:

1. Установлено, что динамика ион-радикальной полосы РЬео на 445 нм имеет две временные компоненты Т1=1,4±0,2 пс и т2=14,7±5,0 пс.

2. Кинетическая кривая на длине волны 685 нм также имеет две стадии, с характерными временами —1 пс и -15 пс.

3. Разделение заряда в изолированном РЦ ФС2 при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 700 нм и длительностью 20 фс происходит за 0,9 пс с образованием первичной радикальной пары Р680+СЫО1~, а образование вторичной ион-радикальной пары Р680+РЬеоО1~ происходит за -14 пс.

Заключение

В заключении приведем в краткой форме основные выводы диссертационной работы:

1. Обнаружено быстрое разделение заряда в РЦ ФС1 за время <100 фс при возбуждении фемтосекундным импульсом с несущей длиной волны 720 нм и длительностью 22 фс. Предположено, что оно может происходить вследствие когерентного электронно-колебательного волнового пакета, создаваемого возбуждающим импульсом на энергетических уровнях Р700* и А0*.

2. Предложен механизм первичных процессов в РЦ ФС1; определены характерные времена передачи энергии от антенны на РЦ (~5 пс) и образования вторичной ион-радикальной пары Р700+А1 (26 пс).

3. Установлено, что точечная мутация аксиального лиганда к хлорофиллу Ао в ветви А цепи переноса электрона ФС1 приводит к большему замедлению процессов в РЦ, чем аналогичная мутация в ветви В, что указывает на их неэквивалентность.

4. Установлено влияние фазовых характеристик возбуждающего импульса как динамику антенного комплекса, так и на динамику процессов в РЦ ФС1.

5. Установлено, что разделение заряда в изолированном РЦ ФС2 (Б1/Г>2/Су1 Ь559) при возбуждении импульсом с несущей длиной волны 700 нм и длительностью 20 фс происходит за 0,9 пс с образованием первичной радикальной пары Р680+СЫоГ; образование вторичной ион-радикальной пары Р680+РЬеооГ происходит за -14 пс.

1. Hill R., Bendall F. Function of the two cytochrome components in chloroplasts: a working hypothesis// Nature, 1960, 186, pp. 136-137.

2. Hauska G., Schiitz M., Biittner M. The cytochrome b6f complex composition, structure and function In: Advances in Photosynthesis, Oxygenic Photosynthesis!/ (Ort D.R. and Yokum C.F. eds.), Kluwer Acad. Publ., 1996, 4, pp. 377-398.

3. Malkin R., Niyogi K. Photosynthesis. In: Biochemistry and Molecular Biology of Plants// (Buchanan В., Gruissem W., Jones R. eds) Rockville MD: American Society of Plant Physiologists, 2000, pp. 568-628.

4. Hope A.B. The chloroplast cytochrome bf complex: A critical focus on function// Biochim Biophys Acta, 1993, 1143, pp. 1—22.

5. Shubin V.V., Bezsmertnaya I.N., Karapetyan N.V. Isolation from Spirulina membranes of two photosystem Itype complexes, one of which contains chlorophyll responsible for the 77 К fluorescence band at 760 nm/t FEBS Lett. 1992,309, pp. 340-342.

6. Jordan P., Fromme P., Witt H.T., Klukas O., Saenger W., Krauss N. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution// Nature, 2001, 411, pp. 909-917.

7. Brettel K., Leibl W. Electron transfer in photosystem I // Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1507, pp. 100-114.

8. Карапетян H.B. Организация и функция пигментбелковых комплексов фотосистемы 1 цианобактерии Spirulina// Биол. Мембраны, 1998, 15, с. 461— 471.

9. Shuvalov V.A., Nuijs A.M., van Gorkom H.J., Smit H.W.J., Duysens L.N.M. Picosecond absorbance changes upon selective excitation of the primary electron donor P700 in photosystem /// Biochim. Biophys. Acta, 1986, 850, pp. 319-323.

10. Klukas O., Schubert W.-D., Jordan P., Kraufl N., Fromme P., Witt H.-T., Saenger W. Photosytem I, an improved model of the stromal subunits PsaC, PsaD and PsaEH J. Biol. Chem., 1999, 274, pp. 7351-7360.

11. Deisenhofer J., Epp O., Miki K., Huber R., Michel H. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction center of Rhodopseudomonas viridis at 3Â resolution!! Nature, 1985, 318, pp. 618-624.

12. Guergova-Kuras M., Boudreaux B., Joliot A., Joliot P., Redding K. Evidence for two active branches for electron transfer in photosystem III Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, pp. 4437^1442.

13. Chitnis V.P., Ke A., Chitnis P.R. The PsaD Subunit of Photosystem I. Mutations in the Basic Domain Reduce the Level of PsaD in the Membranes!! Plant Physiol., 1997, 1, 15, pp 1699-1705.

14. Golbeck, J.H. "Photosystem I and its Bacterial Counterparts" in CRC Handbook of Organic Photochemistry and Photobiologyl7 (Song P.S. and Horspool W. eds.) CRC Press, Bocca Raton, FL., 1995, pp. 1407-1419.

15. Golbeck, J.H. "Photosystem I in Cyanobacteria" in The Molecular Biology of CyanobacterialI (Biyant D.A. ed.) Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1994, pp. 179-220.

16. Chitnis V.P., Chitnis P.R. PsaL subunit is required for the formation of photosystem I trimer s in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803// FEB S Lett, 1993, 336, pp. 330-334.

17. Jekow P., Schubert W.-D., Fromme P., Kruip J., Chitnis P.R., Roegner M., Saenger W. Crystallisation of intact and subunit L-deficient monomers from Synechocystis PCC 6803 Photosystem I// Z. Naturforsch., 1996, 51B, pp. 195-199.

18. Karapetyan N.V., Schlodder E., van Grondelle R., Dekker P. In Photosystem I. The Light-Driven Plastocyanin:Ferredoxin Oxidoreductase// (Golbeck J. ed) Springer, Dordrecht, 2006, pp. 177-192.

19. Hastings G., Kleinherenbrink F.A.M., Lin S., McHugh T.J., Blankenship R.E. Observation of the reduction and reoxidation of the primary electron acceptor in photosystem I // Biochemistry, 1994, 33, pp. 3193-3200.

20. Nuijs A.M., Shuvalov V.A., van Gorkom H.J., Plijter J.J., Duysens L.N.M. Picosecond absorbance difference spectroscopy on the primary reactions and the antenna-excited states in photosystem I particles// Biochim. Biophys. Acta, 1986, 850, pp. 310-318.

21. Savikhin S., Xu W., Chitnis P.R., Struve W.S. Ultrafast primary processes in PS I from Synechocystis sp. PCC 6803: roles ofP700 and A0 // Biophys. J., 2000, 79, pp. 1573-1586.

22. Savikhin S., Xu W., Martinsson P., Chitnis P.R., Struve W.S. Kinetics of charge separation and A0 —>Aj electron transfer in photosystem I reaction centers// Biochemistry, 2001, 40, pp. 9282-9290.

23. White N.T.H., Beddard G.S., Thorne J.R.G., Feehan T.M., Keyes T.E., Heathcote P. Primary charge separation and energy transfer in the photosystem I reaction center of higher plants// J. Phys. Chem., 1996, 100, pp. 12086-12099.

24. Melkozernov A.N., Lin S., Blankenship R.E. Excitation dynamics and heterogeneity of energy equilibration in the core antenna of Photosystem I from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803H Biochemistry, 2000, 39, pp. 1489-1498.

25. Gibasiewich K., Ramesh V.M., Melkozernov A.N., Lin S., Woodbury N.W., Blankenship R.E., Webber A.N. Excitation dynamics in the core antenna of PS I from Chlamydomonas reinhardtii CC 2696 at room temperature// J. Chem., 2001, 105, pp. 11498-11506.

26. Gibasiewich K., Ramesh V.M., Lin S., Redding K., Woodbury N.W., Webber A.N. Excitonic interactions in wild-type and mutant PS I reaction centers!7 Biophys. J., 2003, 85, pp. 2547-2559.

27. Ramesh V.M., Gibasiewicz K., Lin S., Bingham S.E., Webber A.N. Replacement of the methionine axial ligand to the primary electron acceptor A0 slows the Ao~ reoxidation dynamics in Photosystem III Biochim. Biophys. Acta, 2007, 1767, pp. 151-160.

28. Guskov A., Kern J., Gabdulkhakov A., Broser M., Zouni A., Saenger W. Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A° resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride!/ Nature, 2009, 16, pp. 334-342.

29. Zouni A., Witt H.-T., Kern J., Fromme P., Krauû N., Saenger W., Orth P. Crystal structure of photosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 A resolution!/ Nature, 2001, 409, pp. 739-743.

30. Summer E. J., Schmid V.H., Bruns B.U., Schmidt G.W. Requirement for the Hphosphoprotein in photosystem II of Chlamydomonas reinhardtii!7 Plant. Physiol., 1997, 113, pp. 1359-1368.

31. Zheleva D., Sharma J., Panico M., Morris H.R., Barber J. Isolation and characterization of monomeric and dimeric CP47-reaction center photosystem IIcomplexes//J. Biol. Chem., 1998, 273, pp. 16122-16127.\

32. Rhee K.-H., Morris E.P., Barber J., KuEhlbrandt W. Three-dimensional structure of photosystem II reaction centre at 8 A resolution!! Nature, 1998, 396, pp. 283-286.

33. Bricker T.M., Ghanotakis D.F. Introduction to Oxygen Evolution and the Oxygen-Evolving Complex. In: Advances in Photosynthesis, The Light Reactions!! (Ort D.R. and Yokum C.F. eds.), Kluwer Acad.Publ., 1996, 4, pp. 113-129.

34. Joliot P., Barbieri G., Chabaud R. Un nouveeau modele des centres photochimiques du systeme IIII Photohem. Photobiol., 1969, 10, pp. 309-329.

35. Kok B., Forbush B., McGloin M. Cooperation of centers in photosynthetic oxygen evolution: I. A linear four step mechanism// Photochem. Photobiol., 1970, 11, pp. 457-475.

36. Durrant J., Hastings H., Joseph D., Barrer J., Porter G., Klug D. Subpicosecond equilibration of excitation energy in isolated photosystem II reaction centersll Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, pp. 11632-11636.

37. Shkuropatov A.Ya., Khatypov R.A., Volshchukova T.S., Shkuropatova V.A., Owens T.G., Shuvalov V.A. Spectral and photochemical properties of borohydride-treated D1-D2-cytochrome b-559 complex of photosystem II /! FEBS Letters, 1997, 420, pp. 171-174.

38. Raszewski G., Saenger W., Renger T. Theory of optical spectra od photosystem II reaction centers: Location of the triplet state and the identity of the primary electron donor!I Biophys. J., 2005, 88, pp. 986-998.

39. Prokhorenko V., Holzwarth A.R. Primary processes and structure of the photosystem II reaction center: a photon echo study!! J. Phys. Chem. B, 2000, 104, pp. 11563-11578.

40. Isgandarova S., Renger G., Messinger J. Functional Differences of Photosystem II from Synechococcus elongatus and Spinach Characterized by Flash Induced Oxygen Evolution Patterns!I Biochemistry, 2003, 42, pp. 89298938.

41. Fujita I., Davis M.S., Fajer J. Anion Radicals of Pheophytin and Chlorophyll a: Their Role in the Primary Charge Separations of Plant Photosynthesis II JACS, 1978, 100, 19, pp. 6280-6282.

42. Klimov V.V., Klevanik A.V., Shuvalov Y.A., Krasnovsky A.A. Reduction of pheophytin in the primary light reaction of photosystem //// FEBS Lett., 1977, 82, pp. 183-186.

43. Hastings G., Durrant J.R., Barber J., Porter G., Klug D.R. Observation of Pheophytin Reduction in Photosystem Two Reaction Centers Using Femtosecond Transient Absorption Spectroscopy// Biochemistry, 1992, 31, pp. 7638-7647.

44. Durrant J.R., Hastings G., Hong Q., Barber J., Porter G., Klug D.R. Determination of P680 singlet state lifetimes in photosystem two reaction centres!/ Chem. Phys. Lett., 1992, 188, pp. 54-60.

45. Wiederrecht G.P., Seibert M., Govindjee, Wasielewski M.R. Femtosecond photodichroism studies of isolated photosystem II reaction centers// Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1994, 91, pp. 8999-9003.

46. Donovan B., Walker L.A., Yocum C.F., Sension R.J. Transient Absorption Studies of the Primary Charge Separation in Photosystem II /1 J. Phys. Chem., 1996, 100, pp. 1945-1949.

47. Rech T., Durrant J.R., Joseph D.M., Barber J., Porter G., Mug D.R. Does Slow Energy Transfer Limit the Observed Time Constant for Radical Pair Formation in Photosystem II Reaction Centers?// Biochemistry, 1994, 33, pp. 14768-14774.

48. Dekker J.P., Van Grondelle R. Primary charge separation in Photosystem II II Photosynth. Res., 2000, 63, pp. 195-208.

49. Pawlowicz N.P., Groot M.-L., van Stokkum I. H. M., Breton J., van Grondelle R. Charge Separation and Energy Transfer in the Photosystem II Core Complex Studied by Femtosecond Midinfrared Spectroscopy!7 Biophysical J., 2007, 93, pp. 2732-2742.

50. Саркисов O.M., Уманский С.Я. ФемтохимияН Успехи химии, 2001, 70, 6, с. 515-538.

51. Kohler В., Krause J.L., Raksi F., Wilson K.R., Yakovlev V.V., Whitnel R.M., Yan Y. Controlling the Future of Matter!! Acc. Chem. Res., 1995, 28, pp. 133140.

52. Wohlleben W., Buckup Т., Herek J.L., Motzkus M. Coherent Control for Spectroscopy and Manipulation of Biological Dynamics/! Chem. Phys. Chem., 2005, 6, pp. 850 857.

53. Collini E., Wong C.Y., Wilk K.E., Curmi P.M.G., Brumer P., Scholes G.D. Coherently wired light-harvesting in photosynthetic marine algae at ambient temperature// Nature, 2010, 463, pp. 644-648.

54. Kovalenko S.A., Dobryakov A.L., Ruthmann J., Ernsting N.P. Femtosecond spectroscopy of condensed phases with chirped supercontinuum probing!I Physical Review A., 1999, 59, 3, pp. 2369-2384.

55. Shank C.V., Yen R., Fork R.L., Orenstein J., Baker G.L. Picosecond Dynamics of Photoexcited Gap States in Polyacetylen!I Phys. Rev. Lett., 1982, 49, 22, pp. 1660-1663.

56. Weiner A.M., Leaird D.E., Wiederrecht G.P., Nelson K.A. Femtosecond Pulse Sequences Used for Optical Manipulation of Molecular Motion/! Science, 1990, 247, 4948, pp. 1317 1319.

57. Mi D., Lin S., Blankenship R.E. Picosecond transient absorption spectroscopy in the blue spectral region of photosystem I // Biochemistry, 1999,38, pp. 15231-15237.

58. Shuvalov V.A., Yakovlev A.G., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya. Photosystem I. The Light-Driven Plastocyanin:Ferredoxin OxidoreductaseH (Golbeck J. ed.) Springer, Dordrecht, 2006, pp. 291-300.

59. Ke B. The rise time of photoreduction difference spectrum and oxidation-reduction potential ofP430// Arch. Biochem. Biophys., 1972, 152, pp. 70-77.

60. Savikhin S., Photosystem I. The Light-Driven PI as to cyan in : Ferredoxin Oxidoreductase// (Golbeck J. ed.) Springer, Dordrecht, 2006, pp. 155-175.

61. Croce R., Dorra D., Holzwarth A.R., Jennings R.C. Fluorescence decay and spectral evolution in intact Photosystem I of higher plants// Biochemistry, 2000,39, pp. 6341-6348.

62. Golbeck J.H. The binding of cofactors to PS I analyzed by spectroscopic and mutagenic methodsII Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2003, 32, pp. 237-256.

63. Macomber G.D. The dynamics of spectroscopic transition!I John Wiley and Sons, New York-London-Sydney-Toronto, 1976.

64. Shuvalov V.A. Main features of the primary charge separation in photosynthetic reaction centersII (Sybesma C. ed.) Nijhoff Martinus, Dr.W. Junk Publishers, Advances in Photosynthesis Research, The Hague/Boston/Lancaster, 1984, pp. 93-100.

65. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Shutilova N.I., Krasnovsky A.A. The study of photoreduction of pheophytin and photooxidation of P680 in photosystem II preparations!I Plant. Physiol., 1980, 27, pp. 315-326.

66. Doring G., Stiehl H.H., Witt H.T. A second chlorophyll reaction in the electron chain of photosynthesis—registration by the repetitive excitation technique!IZ. Naturforsch B, 1967, 22, pp. 639-644.

67. Doring G., Renger G., Vater J., Witt H.T. Properties of the photoactive chlorophyll-a II in photosynthesis!IZ. Naturforsch B, 1969, 24, pp. 1139-1143.