Экспериментальное определение и расчет параметров комплекса рутина с фосфатидилхолином

Усманова, Светлана Ильдаровна

Экспериментальное определение и расчет параметров комплекса рутина с фосфатидилхолином тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Усманова, Светлана Ильдаровна АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Уфа МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Экспериментальное определение и расчет параметров комплекса рутина с фосфатидилхолином»

Автореферат диссертации на тему "Экспериментальное определение и расчет параметров комплекса рутина с фосфатидилхолином"

На правах рукописи

Усманова Светлана Ильдаровна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ И РАСЧЕТ ПАРАМЕТРОВ КОМПЛЕКСА РУТИНА С ФОСФАТИДИЛХОЛИНОМ

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

2 8 НОЯ 2013

Уфа-2013

005540612

Работа выполнена на кафедре медицинской физики с курсом информатики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор физико-математических наук, профессор Насибуллин Руслан Сагитович

доктор физико-математических наук, профессор, директор Физико-технического института Федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Якшибаев Роберт Асгатович

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт физики молекул и кристаллов Уфимского научного центра Российской академии наук Хвостенко Ольга Григорьевна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Казанский физико-технический институт имени Е.К. Завойского» Казанского научного центра Российской академии наук

Защита состоится « 19 » декабря 2013 г. в 16°" на заседании диссертационного

совета Д 212.013.10 в Федеральном государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Башкирский государственный университет» по адресу:

450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, химический факультет, ауд. 311.

E-mail: dissovet2@rambler.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет».

Автореферат разослан « 18 » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук,

профессор . ¥ . . ___

Ю.А. Прочухан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Исследование связи между структурой молекулы и ее биологической активностью является проблемой, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение. Научно-технический прогресс и развитие производства повлекли за собой ухудшение экологической обстановки, одним из проявлений которой стало появление опасных для человека канцерогенов и аллергенов. Для уменьшения их вредного воздействия возникает необходимость создания новых лекарственных препаратов. Однако их выпуск сопряжен финансовыми и временными затратами. В качестве направления снижения вышеуказанных затрат является исследование уже известных веществ.

Природные флавоноиды, благодаря своим свойствам, применяются во многих отраслях промышленности. Для медицины в значительной степени они ценны в качестве источников для создания антиоксидантных, капилляроукрепляющих, противоаллергических, противовоспалительных, противоопухолевых препаратов, применяемых для профилактики и лечения многих заболеваний. Рутин, один из представителей молекул группы флавоноидов, регулирует проницаемость клеточных мембран. Несмотря на известные его свойства в литературе практически отсутствуют сведения о механизме взаимодействия рутина и фосфатидилхолина, который является основным компонентом клеточных мембран.

В работах, посвященных исследованию флавоноидов, существование биоактивных свойств объясняется внутри- и межмолекулярными водородными связями, обусловленными количеством и положением гидроксильных групп. Немаловажное значение имеет наличие в этих молекулах сопряженных двойных связей, которые участвуют в образовании я-комплексов, параметры которого также могут внести большой вклад в развитие теории связи структуры и биологической активности.

Работа поддержана грантом РФФИ №08-02-97011 «Исследование молекулярного механизма действия на клеточные мембраны биологически активных веществ группы флавоноидов».

Цель работы

Исследование молекулярного механизма взаимодействия рутина с фосфатидилхолином (ФХ) экспериментальными и расчетными методами.

Поставленная цель включает решение следующих задач:

1. Исследование спектров растворов рутина с ФХ методами одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии ядер 'Н, 13С и 31Р. Создание программного продукта для автоматического управления сбором и обработкой данных спектрометра ЯМР.

2. Определение структурных параметров комплекса рутина с ФХ с применением ядерного эффекта Оверхаузера.

3. Изучение взаимодействия системы я-электронов колец А и С рутина с холиновой группой ФХ методами AMI и DFT.

4. Определение изменения пространственного и электронного строения молекул, образующих комплекс.

Научная новизна

Показано комплексообразование при взаимодействии системы я-электронов колец А и С рутина и >Г(СНз)з-группы ФХ, подтвержденное спектрами ядер 'Н, |3С и 31Р растворов рутина с ФХ. Программа, разработанная для блока LCard, позволила автоматизировать процесс управления, сбора и обработки спектральных данных.

Определены изменения структуры и электронного строения взаимодействующих молекул методами квантово-химических расчетов.

Достоверность результатов обеспечена использованием современных спектральных, расчетных методов согласно поставленным задачам и проведением сравнительного анализа полученных результатов.

Личный вклад заключался в участии в постановке цели и задач исследования; получении результатов расчетов и эксперимента, их обработки и интерпретации; в разработке программы для приема и обработке сигналов ЯМР, подготовке материалов к публикациям.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данная работа имеет как фундаментальное значение:

— определение ¡информационных и энергетических характеристик комплексов рутина при взаимодействии его с ФХ;

— установление молекулярного механизма действия рутина на проницаемость клеточных мембран;

так и практическое:

— результаты исследования могут быть использованы в прогнозе и разработке новых лекарственных средств более эффективных и дешевых, чем существующие в мире и обладающих меньшим количеством побочных действий.

Апробация работы

Результаты работы докладывались:

— на научно-практической конференции БГУ (Уфа, 2004);

— на XII, XIII, XIV, XVI Всероссийских конференциях "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик, 2005, 2006, 2007, 2009 гг.);

— на научно-практической конференции БГМУ (Уфа, 2006 г.);

— на конференции по разработке, исследованию и маркетингу новой фармацевтической продукции (Пятигорск, 2007 г.);

— на IX Международной научно-практической конференции "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности" (Санкт-Петербург, 2011 г.);

— на II Международной научной конференции "Биотехнология. Взгляд в будущее" (Казань, 2013 г.)

Публикации

По теме диссертации опубликован двадцать один научный труд, из них: девять статей в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендуемых ВАК; двенадцать - в сборниках трудов международных, всероссийских научных и научно-практических конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 118 наименований и двух приложений. Работа изложена на 157 страницах, из них 48 страниц приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, указаны объекты исследования, сформулированы цель и задачи исследования, определены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе диссертации представлен обзор литературы по флавоноидам, структуре (рис. 1) и физических характеристиках рутина.

н'?71 /

\/\ „,5 61./-Р1 I ^

Н'"1 „1591

„[55]

^ (V НИ

\ о'"' Ак

\ \ ¿г*

1601 СР5|-\|М1

г№

/ >н|в| ч с'й1 , н1®1' I

Н1Я1 н|67| " НТО

-Г

0™ С[12] * с',',3!" ^С1,"1^

„1501

Н1521 н147' Рис. 1 Структура молекулы рутина

о'"1'

с™ в с"1 н1 С51 ^С|7] 1 А 1

с121 с110] с|8]

н'45' н'

>81

Рассмотрены вопросы по изучению межмолекулярных взаимодействий биоактивных соединений с фосфолипидами клеточных мембран. Представлены данные об особенностях организации фосфолипидных молекул и физико-химические свойства ФХ. Исследование изменений структурных и электронных параметров комплексов, образующихся при межмолекулярных взаимодействиях необходимо для получения знаний о механизмах функционирования клеток живых организмов, для решения практических задач фармацевтики и биотехнологии.

Во второй главе представлены методики использования ЯМР-спектроскопии и квантово-химических расчетов; условия работы с веществами; сведения об оборудовании и программе, разработанной для модификации спектрометра.

Методами ЯМР спектроскопии исследовались препарат рутина и 10% спиртовый раствор ФХ, высушенный при температуре 30° С. Экспериментальные образцы готовили с концентрацией 0,005 М фосфатидилхолина и различными, но незначительно превышающими концентрациями рутина 0,01-0,02 М. При этом плато кривой титрования рутина с фосфатидилхолином не достигается.

13С ЯМР спектры записывались в стандартных условиях на импульсном спектрометре Bruker Avance-III. Температура образца 298К. Химические сдвиги (ХС) в спектрах 13С ЯМР приведены в м.д. относительно сигнала внутреннего стандарта тетраметилсилана. Растворителем был выбран диметилформамид, благодаря высокой растворяющей способности органических соединений.

Спектры 31Р ЯМР были зарегистрированы на модернизированном спектрометре BS 567 А фирмы "TESLA" с частотой на ядрах 31Р 40,4 МГц. Растворителями служили тетрахлорметан и четыреххлористый углерод с индексом х.ч. без дополнительной очистки. Схема прибора предусматривала усиление сигнала резонанса от ядер 31Р только в стационарном режиме, что заметно ограничивало возможности прибора особенно при исследовании биологических систем. Была разработана многопоточная программа для блока L-Card Е-154, позволяющая обрабатывать и накапливать массив данных с помощью двенадцатиразрядного АЦП с целью увеличения соотношение сигнал/шум до 20. Усреднение нескольких измерений, полученных ХС от 3,Р, показывают, что погрешность спектральной линии в данных препаратах не превышает 0,05 м.д. Погрешность измерения частоты сигнала Р31 не превышала 0,05 Гц. Число сканирований одного интервала составляло 400, без подавления диполь-дипольных взаимодействий фосфора с соседними протонами. Стабилизация магнитного поля осуществлялась с помощью внешнего стандарта на ядрах 'Н. Спектры регистрировались с одним и тем же капилляром,

заполненным ГМДС, ХС измерялись относительно 85% ортофосфорной кислоты.

Эксперимент ЯЭО проводили на спектрометре АМ-300 (Bruker ФРГ) с рабочей частотой на ядрах 'Н 300 МГц методом разностных спектров, когда суммирование нескольких прохождений происходит в условиях насыщения некоторого сигнала и того же числа прохождений без насыщений. На основании усреднения полученных по нескольким экспериментам данных можно сделать вывод о том, что точность измерения ХС не хуже 0,005 м. д.

Двумерные спектры зарегистрированы в стандартных режимах многоимпульсных последовательностей программного обеспечения прибора. Спектр gsCOSY зарегистрирован со следующими параметрами: размер матрицы 4К на 512 экспериментов спектральное окно 5,0 кГц, при обработке использовалась синусоидально-колоколообразная взвешивающая функция для Fi и F2 проекций (ssb=2). Спектры gsHSQC зарегистрированы с задержкой, оптимизированной под наблюдение Jcн = 145 Гц, размер матрицы 2К на 256 экспериментов. Для записи спектров NOESY использовалась матрица 2К на 256 экспериментов со спектральным окном 5,0 кГц, время смешения 0,5 с.

Результаты экспериментального метода ядерно-магнитного резонанса комплексов флавоноидов с клеточным ФХ представляют важнейшую информацию о механизме их комплексообразования. На основе современных методов молекулярного моделирования, а именно, молекулярной механики, молекулярной динамики и теории функционала плотности появилась возможность дополнить экспериментальные исследования. Расчеты структуры и электронного строения комплекса проводились с использованием программ HyperChem™ 7.01 и Природа 2.02. Проанализированы различные приближения, рассмотрены некоторые вопросы и обоснован выбор квантово-химического метода АМ1, описывается применение метода теории функционала плотности (DFT) для расчета структуры комплекса. Экспериментальные значения тензора квадрупольной связи ядер азота найденные Насибуллиным P.C. по микроволновым спектрам молекулы пиразола и пиридина показывали хорошую корреляцию с расчетными данными выбранного приближения.

В третьей главе представлены результаты спектроскопических исследований комплексов рутина с ФХ.

Эксперимент 13С ЯМР-спектроскопии подтвердил существование комплекса рутина с холиновой группой ФХ. Химический сдвиг (ХС) для углеродов холиновой группы, равный 54,00 м.д. для свободного ФХ (рис. 2), смещается в слабое поле при формировании комплекса с рутином на 0,12 м.д. (рис. 3).

\/ IV I

Рис. 2. Фрагмент 13С ЯМР спектра раствора ФХ

1 . ..11 _

—,-—-1------I ---- I---• -■—I ■ ■ I ' ) ' • I ' '

65 ВО 55 50 45 40 35

Рис.3. Фрагмент 13С ЯМР спектра раствора ФХ с рутином

а)

б)

концентрация, М/л

- четыреххлорнстын углерод

- тегграхлор метан

Рис.4. Спектры 31Р ЯМР от: Рис.5. Зависимость ХС ядер 31Р

а) раствора ФХ; ФХ от концентрации растворителя

б) раствора рутина с ФХ

Формирование комплексов ФХ с кольцами А и С флавоноида приводит к изменению ХС 13С, ароматических колец входящих в их структуру. С другой стороны эти ароматические структуры при взаимодействии изменяют ХС 31Р фосфатной группы ФХ на 0,6 м.д. в слабое поле (рис. 4).

На рис. 5 показаны концентрационные зависимости ХС от ядер 3,Р ФХ в тетрахлорметане и четыреххлористом углероде. В образцах, концентрацией 0,0125 М/л ФХ в четыреххлористом углероде, добавление рутина изменяет ХС от ядер 31Р на 0,32 м.д. в сторону слабого поля. Растворы с концентрацией ФХ в тетрахлорметане и четыреххлористом углероде 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625 М/л, готовились разбавлением в кратное число раз.

Молекулы ФХ за счет водородных и электростатических диполь-дипольных взаимодействий образуют как линейные цепи, так и более сложные пространственные системы. При разбавлении ФХ в четыреххлористом углероде с 0,1 до 0,00625 М/л происходит изменение ХС на « 0,15 м.д. в сторону сильного поля. Воздействие рутина на образец ФХ в четыреххлористом

углероде концентрацией 0,0125 М/л, изменяет ХС от ядер 31Р на 0,11 м.д. в сторону слабого поля.

При разбавлении ФХ в четыреххлористом углероде, число водородных связей между кислородами фосфатной группы и какими-либо водородами другой молекулы ФХ, уменьшается. Поэтому среднее значение константы экранирование ядра 3,Р также будет изменяться. При образовании водородной связи протон, притягиваясь к электроотрицательному атому кислорода, будет уменьшать электронную плотность на нем, уменьшая тем самым электронную плотность на ядре фосфора. Сигнал от ядер 3,Р ФХ будет наблюдаться в более слабом поле. При разбавлении происходит уменьшение числа водородных связей, возрастает экранирование ядра 31Р, поэтому сигнал от фосфора смещается в более сильное поле.

При разбавлении ФХ в тетрахлорметане наблюдается сдвиг 31Р ЯМР линии в сильное поле и при концентрациях меньших 0,025 М/л достигается плато. Очевидно, при этих концентрациях устанавливается динамическое равновесие между числом рекомбинирующих и ассоциирующих молекул. При добавлении рутина происходит взаимодействие его гидроксильных и рамнозо-глюкозных протонов с кислородами фосфатной группы по типу водородной связи. Одновременно происходит взаимодействие за счет я-систем циклов рутина с холиновой и фосфатной группами ФХ. В результате таких взаимодействий образуется большое количество комплексов, которые имеют различные времена жизни. При малых временах жизни, по сравнению с временной шкалой ЯМР, они будут давать спектральные линии, соответствующие усредненным сдвигам для каждого из крайних состояний отдельно.

Данный факт можно объяснить взаимодействием я-системы рутина с фосфатной группой ФХ. Это взаимодействие не позволяет «оттягивать» электронную плотность с атомов кислорода, а тем самым и с атомов фосфора, блокируя доступ протонов рутина и тетрахлорметана к фосфорным кислородам. В данное явление значительный вклад вносят дисперсионные взаимодействия. Взаимодействующие молекулярные системы состоят из большого количества атомов, а дисперсионные силы аддитивны их числу. Дисперсионные взаимодействия, возникающие из-за квантовых колебаний

электронной плотности, не зависят от других молекулярных характеристик. Колебания электронной плотности происходят синхронно по ароматическому циклу кольца, усиливая взаимодействие.

Метод ЯЭО показал, что при облучении Н[451 (рис.6) интегральная интенсивность линий от Н[46] возрастает в 2,1%. При тех же условиях интенсивность Н[48] возрастает на (1,6±0,2)%. Такое изменение интенсивности сигнала показывает сближение Н[48] и Н[45] за счет вращения вокруг связи С1"1 и Си. При введении в раствор ФХ в тех же условиях влияние облучения не наблюдается.

Н№

—-*-V4

pjt«]

Hi«)

Рис. 6. Фрагмент спектра ЯМР 'Н: 0,005 М ФХ и 0,01 М рутина

Облучение ядра Н'461 качественно подтверждают справедливость проведенных расчетов. При образовании комплекса потенциальный барьер, разделяющий два конформационных состояния, повышается и вращение кольца С вокруг связи С'"1 и Си затормаживается.

В четвертой главе представлены результаты расчетных методов исследований комплексов рутина с ФХ.

Биологическая активность, проявляемая флавоноидами, зависит не только от структурных особенностей, но также и от местоположения в мембране,

которое определяется точками связывания с ФХ и изменением пространственной строения взаимодействующих молекул.

Сравнение энергий комплексообразования исследованных двух типов комплексов (рис. 7), отличных друг от друга расположением ФХ относительно плоскости колец А и С, приведенных в таблице, показало, что энергетически выгодным является взаимодействие холиновой группы ФХ с кольцом С во втором типе комплекса.

н1' 1 '

"с \ А, н™ * '

\ г. 351 «

\°Л.

Г „1721 С ч* ,4.

ДО1«»" н™ >¡1 о""

ГЧ--1» - •• О'Г и,, О*.

н'"17 С'^'нВД \ II I .....

0|2«| р

ми

II 1

сч

I г161 н14

1 А .[101.'

с I •' I I

гМЛгПЧ /Н™ 11«

оР'Г "с1,1*.. V

Н[!2] НИ7| \ НП37]

Н[Р'|»ЧС|?1-Н[Ч51

" о "1_р1"!

о™' н2с'"1

0[21] ..........С[ |Нг

о'!\'|23[ 01,|1 „[!![

\rjzr-0 /

М12*1

(Н2С)7

с™н с™н

н"Ч ,

°Гс"'

\п1"1

Н|62] Н1"1 /

Н15'1 X \ Г,|2'1 н1"1 1/

с>ш'н,

(СН2)„

НС™' НС п

с'1"

(СН2),

Г[22)

.с[32] н1- I

\,ПЧ (СН2)7

/ гИ'

\|121 [И1-пх ^о1

1110]

н>

/ н™

V1'1 Ч

0Г43!С139' |и?'гн[71] н1«1

10321 ,„' „(1

н>".г/ / й

/н[1371 И!14П]П

|1«А

н1

сотуо™ ii1"1' Хо'?г1 ор-^'о1;^/

/ > \ Н1"1 \ ,АЮ М- и!"! ....... ' ^.[71

"о™

Н[5»1

П[2°1 СГ121 ./ С Н1511 -у.ЗГ ^.1111'

II с I с1'4' с1161

Н|!2] [471

с|И"н3

Рис. 7. Два типа комплексов рутина с ФХ, расположенным на кольце А или С

Межмолекулярное поле влияет на электрооптические параметры молекул. Конформационные различия изолированных молекул и в комплексе проявляются в изменениях дипольного момента, значения которого для изолированных рутина и ФХ соответственно 7,27 Д и 16,88 Д. Тенденция роста дипольного момента с увеличением энергии межмолекулярного взаимодействия не всегда является строгой. Близкие значения величины

дипольного момента в комплексе с тс-системой кольца С в комплексах I и II типа свидетельствуют об одинаковом проявлении свойств и действии рутина.

Таблица.

Энергия комплекса и структурные параметры по результатам метода AMI

Расположение ФХ относительно колец рутина А С

расстояние, А F ^комп (кДж/ моль) Р,Д расстояние, А р "КОМП (кДж/ моль) Р. Д

I тип комплекса 4,12 -26,44 11,34 4,30 -34,48 14,77

II тип комплекса 5,78 -29,92 18,12 4,47 -50,53 14,64

Многократно проведенные расчеты из различных исходных точек локализации показали, что указанная молекула образует с клеточным ФХ многочисленные комплексы. Согласно данным метода AMI наиболее устойчивый комплекс образуется, когда кольцо С рутина взаимодействует с холиновой группой ФХ. Одновременно кольцо А связывается с фосфатной группой.

Анализ структурных данных расчета показал, что при образовании комплекса происходит значительное изменение конформации в кольцах А и С рутина, в холиновой, фосфатной и карбонильной группах ФХ. Кольцо В теряет свою первоначальную плоскую структуру, кольцо С вращается по связи С'14'-С[,8] на 30°. Отношение расстояний между атомами Н[45] и Н[48], Н[45] и Н[46) составляет 1,8, что косвенно подтверждается проведенными экспериментами.

При образовании комплекса происходит перераспределение заряда во взаимодействующих молекулах. В комплексе I типа с кольцом А суммарная электронная плотность уменьшается на кольцах А на 0,083 а.е., С на 0,050 а.е. и увеличивается на кольце В на 0,095 а.е. Значительный вклад в эти изменения вносят атомы С[9], Н[45], С[8), Н[501, которые близко расположены к фосфатной группе ФХ, а также атомы Си, С[5), С[101, О1171, С[14]; на рамнозе и глюкозе перераспределение заряда незначительно. В целом частичный заряд холиновой группы ФХ остается неизменным, но наблюдается небольшое увеличение в

группах СР1Н3 на 0,011 а.е., С13]Н3 на 0,005 а.е. и уменьшение на 0,017 а. е. в группе С'4)Нз, что связано с близким расположением к 0[17] атома Н[ш'. На фосфатной и глицероловой группах заряд увеличивается одинаково на 0,005 а.е. На жирнокислотных остатках с насыщенной связью остается без изменений, однако заряд увеличивается на 0,004 а.е. на атоме С[23', с ненасыщенной увеличивается на 0,001 а.е.

В комплексе ФХ с кольцом С происходят следующие изменения заряда: уменьшение суммарной электронной плотности на 0,025 а.е. наблюдается практически на всех атомах кольца А, на кольце С уменьшение на 0,01 а.е. и увеличение на кольце В на 0,043 а.е. Значительный вклад в эти изменения вносят атомы С[3], О1221, С[П1, С[12], а также С[14], Н[47], Н[52), которые близко расположены к фосфатной группе ФХ; изменения, связанные с близким расположением О129' к холиновой группе ФХ на глюкозе и уменьшения заряда на рамнозе 0,006 а.е. и 0,003 а.е. соответственно. В целом частичный заряд холиновой группы ФХ уменьшается на 0,001 а.е., но наблюдается небольшое увеличение в группах С[2,Н3 на 0,013 а.е. и С[3)Н3 на 0,005 а.е. и уменьшение на 0,024 а. е. в группе С[4|Н3. На фосфатной и глицероловой группах заряд увеличивается на 0,006 а.е и 0,002 а.е., наибольший вклад вносят атомы О1'41, 0[15!, С[|6], Н[|9]. На жирнокислотных остатках с насыщенной связью увеличивается на 0,002 а.е., с ненасыщенной уменьшается на 0,002 а.е.

В комплексах II типа при взаимодействии ФХ с кольцом А заряд перераспределяется следующим образом: суммарная электронная плотность уменьшается на кольцах В на 0,007 а.е. и С на 0,002 а.е., увеличивается на кольце А на 0,013 а.е. Вклад в эти изменения вносят атомы С[3), О'171, С[5], Н[46], С18', С19', О'191; на рамнозе и глюкозе суммарное изменение заряда незначительно, но значительное перераспределение наблюдается на атомах С'371, С[39], Ot43], Н[69], Н1?0], Н[73], которые близко расположены к фосфатной группе ФХ. Частичный заряд холиновой группы ФХ уменьшается на 0,005 а.е. Наблюдается небольшое увеличение в группах С[2]Н3 на 0,004 а.е., С[4]Н3 на 0,005 а.е. и уменьшение на 0,008 а.е. в группе С[31Н3. На фосфатной группе заряд увеличивается на 0,009 а. е. и уменьшается на глицероловой на 0,004 а.е.

На жирнокислотных остатках с насыщенной связью увеличение составило 0,003 а.е., с ненасыщенной уменьшение на 0,007 а.е.

В комплексе ФХ с кольцом С рутина: суммарная электронная плотность уменьшается на кольце А на 0,036 а.е. и рамнозе на 0,010 а.е.: значительный вклад в это изменение вносят атомы С[8!, С[9), С"01, Н[451, а также С[38], С[39], Н[661, Н[7°1, Н'73', которые близко расположены к фосфатной группе ФХ. Частичный заряд увеличивается на кольцах В, С и глюкозе на 0,003 а.е., 0,035 а.е. и 0,006

а.е„ за счет атомов Си, 0[22], С[12], С'13", С[141, С[37), О1421, 0[43J, Н™, что связано с

близким расположением к холиновой группе ФХ. Частичный заряд холиновой группы ФХ уменьшается на 0,011 а.е., но наблюдается небольшое увеличение в группах С[2)Нз на 0,010 а.е. и уменьшение на С[3]Н3 на 0,002 а.е., на 0,011 а. е. в группе С[4]Н3. На фосфатной и глицероловой группах заряд увеличивается на 0,022 а.е и 0,008 а.е., наибольший вклад вносят атомы О"31, Н[18'. На жирнокислотных остатках с насыщенной связью уменьшается на 0,007 а.е., с ненасыщенной уменьшается на 0,011 а.е.

В тканях взаимодействие рутина и ФХ

-¿ПИ

0[»]/V1«

Н2С'|61

с1,71н

-н приводит к усложнению процесса из-за

°"н конкуренции с молекулами воды за точки [Н связывания. При оптимизации системы вода-ФХ (рис. 8) и рутин-ФХ в рамках метода AMI, получается энергетически выгодно удаление воды. Рассчитанное значение энергии

происходит в водном растворе, что, естественно

kj- J

О1241*С/[23] О13".

о131'

VC32J

0[зз) взаимодействия ФХ с водой Е=-20,49 кДж/моль, показывает, что комплекс рутина и ФХ должен ,н быть более стабильным. Следовательно, можно предположить, что комплекс рутин-ФХ остается устойчивым в водной среде. Одновременно этот факт может частично объяснить механизм действия рутина как противоотечного препарата.

(н2съ с™н

Шн

<Н2С),5

II,

(СН2Ъ

С11281Нз

Рис. 8. Схема взаимодействия ФХ с молекулами воды

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ:

1. Методами одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии на ядрах 'Н, "С, 31Р установлен комплекс рутина с ФХ. Химические сдвиги ядер 13С и 31Р подтверждают участие в образовании комплекса холиновой и фосфатной группы ФХ.

2. Расчетными методами квантовой химии в различных приближениях, в частности методами AMI и теории функционала плотности исследовано взаимодействие системы я-электронов рутина с холиновой и фосфатной группами ФХ. Получены значения энергии я-связи для двух типов комплексов в зависимости от расположения ФХ относительно сахарной группы рутина. Взаимное влияние комплексообразующих молекул приводит к делокализации я-электронов и возрастания степени ароматичности кольца С рутина. Комплекс рутина с блокированием активных центров ФХ является достаточно прочным.

3. Определены изменения структурных параметров при комплексообразовании методом Оверхаузера, которые подтверждают справедливость расчетов и объясняют изменение проницаемости клеточных мембран.

4. Результаты исследования водного окружения на комплекс рутин-ФХ показывает, что удаление воды энергетически выгодно. Этот факт частично объясняет механизм действия рутина как противоотечного препарата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Сетченков, М.С. Комплекс рутина с фосфатидилхолином / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, Ю.Г. Афанасьева, Л.В. Спирихин, P.C. Насибуллин // Бутлеровские сообщения. - 2006. - Т. 9. - №4- С. 21-25.

2. Сетченков, М.С. Исследование молекулярного механизма взаимодействия 5,7,3',4',-тетраоксифлавон-3-рутинозида и 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавонола с фосфатидилхолином / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, Ю.Г. Афанасьева, Л.В. Спирихин, P.C. Насибуллин // Бутлеровские сообщения.

- 2007. - Т. 12. - №6,- С. 26-30.

3. Насибуллин, P.C. О молекулярном механизме биоактивности рутина / P.C. Насибуллин, С.И. Усманова, М.С. Сетченков, Ю.Г. Афанасьева, Е.Р. Фахретдинова // Химическая физика и мезоскопия. - 2008. - Т. 10. - №2. - С. 228-231.

4. Сетченков, М.С. Комплексообразование некоторых биологических активных молекул с фосфатидилхолином / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, Ю.Г. Афанасьева, P.C. Насибуллин // Известия вузов. Физика. - 2009. - №4. -С. 77-80.

5. Сетченков, М.С. Исследование конформационного состояния молекул фосфатидилхолина и рутина при комплексообразовании / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, А.Р. Тимербулатова, P.C. Насибуллин // Башкирский химический журнал. -2009. - Т. 16. -№2-С. 70-72.

6. Setchenkov, M.S. Complexing of some biologically active molecules with phosphatidylcholine / M.S. Setchenkov, S.I. Usmanova, J.G. Afanaseva, R.S. Nasibullin // Russian physics journal. - 2009. - V. 52. -№ 4. - P. 417-420.

7. Нусратуллин, B.M. Исследование изменений комплекса 3,2,4,5,7-пентагидроксифлавон — фосфатидилхолин в водной среде / В.М. Нусратуллин, М.С. Сетченков, С.И. Усманова, P.C. Насибуллин // Бутлеровские сообщения.

- 2009. - Т. 18. - №7. - С. 60-62.

8. Усманова, С.И. Некоторые структурные параметры и электронное строение комплекса 5,7,3',4',-тетраоксифлавонола-3-рутинозида с

фосфатидилхолином / С.И. Усманова, Е.Р. Фахретдинова, P.C. Насибуллин // Химическая физика и мезоскопия. -2011. - Т. 13. - №2. - С. 281-284.

9. Сетченков, М.С. ЯМР 3|Р спектроскопические исследования комплексобразования рутина с фосфатидилхолином / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, В.М. Нусратуллин, Ю.Д. Насибуллин, P.C. Насибуллин // Бутлеровские сообщения. -2011. - Т. 25. -№ 6. - С. 63-65.

Публикации в сборниках статей научных конференций:

10. Усманова, С.И. Комплекс 5,7,3 ',4'-тетраоксифлавон-3-рутинозида с фосфатидилхолином / С.И. Усманова, М.С. Сетченков, P.C. Насибуллин // Сборник статей XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». - Йошкар-Ола, 2005. - Ч. 2. - С. 87-89.

11. Сетченков, М.С. О молекулярном механизме биоактивности некоторых молекул группы флавоноидов / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, Ю.Г. Афанасьева, Е.Р. Фахретдинова, JI.B. Спирихин, P.C. Насибуллин // Физика в Башкортостане: сборник статей. - Уфа: Гилем, 2005. - С. 234-242.

12. Загидуллин, С.Н. Молекулярный механизм действия некоторых биоактивных соединений / С.Н. Загидуллин, М.С. Сетченков, Р.И. Галеева, З.Д. Юсупова, С.И. Усманова, P.C. Насибуллин // Сборник тезисов научно-практической конференции. Естественные науки. - Уфа, 2004. - Т. 1. - С. 9-11.

13. Сетченков, М.С. ЯМР-спектроскопические исследования флавоноидов / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, P.C. Насибуллин // Медицинский вестник Башкортостана. - 2006. - С. 267-268.

14. Сетченков, М.С. Комплексообразование за счет взаимодействия к-системы гетероциклов биологически активных веществ с некоторыми молекулами клеточных фосфатидилхолинов / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, Ю.Г. Афанасьева, Г.Н. Загитов, С.Н. Загидуллин, P.C. Насибуллин // Медицинский вестник Башкортостана. - 2006. - С. 265-266.

15. Сетченков, М.С. Исследование комплексообразования рутина с клеточным фосфатидилхолином методом 31Р ЯМР спектроскопии / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, P.C. Насибуллин // Сборник статей XIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». -Уфа, 2006. - Ч. 2. - С. 208-211.

16. Сетченков, М.С. Взаимодействие некоторых молекул группы флавоноидов с фосфатидилхолином / М.С. Сетченков, С.И. Усманова, Ю.Г. Афанасьева, Ю.Г. Фахретдинова, JI.B. Спирихин, P.C. Насибуллин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов / Пятигорская ГФА, Санкт-Петербургская ГХФА.-Пятигорск, 2007-Вып. 62.-С. 360-365.

17. Усманова, С.И. Изменение конформационных состояний 5,7,3',4'-тетраоксифлавон-3-рутинозида при образовании комплекса с двумя молекулами фосфатидилхолина / С.И. Усманова, М.С. Сетченков, P.C. Насибуллин // Сборник статей XIV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». - Казань, 2007. - С. 663-665.

18. Сетченков, М.С. 31Р-ЯМР исследования комплексов рутина с мембранным фосфатидилхолином / М.С. Сетченков, В.М. Нусратуллин, С.И. Усманова, Г.Н. Загитов // Материалы Международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук». - Уфа, 2009. - Вып. 4, - С. 192-195.

19. Нусратуллин, В.М. Взаимодействие морина с гидратной оболочкой фосфатидилхолина / В.М. Нусратуллин, С.И. Усманова, М.С. Сетченков, P.C. Насибуллин // Тезисы докладов XVI Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем". - Йошкар-Ола, 2009. - С. 164.

20. Усманова, С.И. Исследование конформационных состояний 5,7,3',4'-тетраоксифлавонол-3-рутинозида методом NOE-dif / С.И. Усманова, М.С. Сетченков, В.М. Нусратуллин, P.C. Насибуллин // Сборник трудов Девятой международной научно-практической конференции "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности". - Санкт-Петербург, 2011.-Т. 4. - С. 424-426.

21. Усманова, С.И. Исследование комплексообразования рутина с фосфатидилхолином методом 13С ЯМР спектроскопии / С.И. Усманова, М.С. Сетченков, З.Д. Юсупова, P.C. Насибуллин // Сборник трудов II Международной научной Интернет-конференции "Биотехнология. Взгляд в будущее". - Казань, 2013. - С. 358-360.

Усманова Светлана Ильдаровна

Экспериментальное определение и расчет параметров комплекса рутина с

фосфатидилхолином

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано к печати 15.11.2013 г. Отпечатано на цифровом оборудовании с готового оригинал-макета, представленного авторами. Формат 60x84 ]/]6. Усл.-печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 92

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, Тел.: (347) 272-86-31 ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата физико-математических наук, Усманова, Светлана Ильдаровна, Уфа

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

04201455174 УСМАНОВА СВЕТЛАНА ИЛЬДАРОВНА

Экспериментальное определение и расчет параметров комплекса рутина с фосфатидилхолином

02.00.04 - физическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

I i

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Насибуллин P.C.

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений...............................................................................3

Введение...........................................................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы.............................................................................................7

1.1. Флавоноиды. Строение и свойства.........................................................................7

1.2. Структура и физико-химические свойства рутина...............................................8

1.3. Структура и функции биологических мембран...................................................10

1.4. Взаимодействие флавоноидов с фосфолипидами биологических мембран ....15 Глава 2. Методика исследования.................................................................................19

2.1. Ядерный магнитный резонанс. Эффект Оверхаузера.........................................19

2.2. Условия проведения и методика экспериментов ЯМР-спектроскопии............29

2.3. Квантово-химические методы расчетов...............................................................34

2.4. Методика вычислительного эксперимента..........................................................46

Глава 3. Результаты спектроскопических исследований взаимодействия рутина с фосфатидилхолином......................................................................................................49

3.1. Результаты эксперимента С ЯМР-спектроскопии............................................49

Л 1

3.2. Результаты эксперимента Р ЯМР-спектроскопии............................................51

3.3. Результаты эксперимента 'Н ЯМР-спектроскопии.............................................55

Глава 4. Результаты квантово-химических исследований взаимодействия рутина с фосфатидилхолином......................................................................................................56

4.1. Структура и электронное строение I типа комплекса.......................................58

4.2. Структура и электронное строение II типа комплекса.......................................63

Обсуждение результатов...............................................................................................75

Выводы............................................................................................................................78

Список литературы........................................................................................................79

Приложение 1.................................................................................................................92

Приложение 2...............................................................................................................102

Список используемых сокращений

АО - атомная орбиталь БАС - биологически активные соединения ВЗМО - верхняя занятая молекулярная орбиталь ЛКАО - линейная комбинация атомных орбиталей м.д. - единица измерения ХС в миллионных долях МО - молекулярная орбиталь

МПДП - метод пренебрежения двухатомным перекрыванием МЧПДП - модифицированный метод частичного пренебрежения дифференциальным перекрыванием НСМО - нижняя свободная молекулярная орбиталь

ПДДП - пренебрежение двухатомным дифференциальным перекрыванием

Ш1Д11 - полное пренебрежение дифференциальным перекрыванием

ССП - самосогласованное поле

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ФС - фосфтаидилсерин

ХС - химический сдвиг

ЧПДП - частичное пренебрежение дифференциальным перекрыванием ЯМР - ядерный магнитный резонанс ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера

AMI - Austin Model 1 - параметризация, включающая члены ван-дер-ваальсова оттталкивания

DFT - Density Functional Theory - Теория функционала плотности

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Природные флавоноиды, благодаря своим свойствам, применяются во многих отраслях промышленности. Для медицины в значительной степени они ценны в качестве источников для создания антиоксидантных, капилляроукрепляющих, противоаллергических, противовоспалительных, противоопухолевых препаратов, применяемых для профилактики и лечения многих заболеваний. Рутин, один из представителей молекул группы флавоноидов, регулирует проницаемость клеточных мембран. Несмотря на известные его свойства в литературе практически отсутствуют сведения о механизме взаимодействия рутина и фосфатидилхолина (ФХ), который является основным компонентом клеточных мембран.

В работах, посвященных исследованию флавоноидов, существование биоактивных свойств объясняется внутри- и межмолекулярными водородными связями, обусловленными количеством и положением гидроксильных групп [55, 67]. Немаловажное значение имеет наличие в этих молекулах сопряженных циклов, которые участвуют в образовании ^-комплексов, параметры которого также могут внести большой вклад в развитие теории связи структуры и биологической активности.

Цель работы

Исследование молекулярного механизма взаимодействия рутина с ФХ экспериментальными и расчетными методами.

Поставленная цель включает решение следующих задач:

1. Исследование спектров растворов рутина с ФХ методами одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии ядер и Р. Создание программного продукта для автоматического управления сбором и обработкой данных спектрометра ЯМР.

2. Определение структурных параметров комплекса рутина с ФХ с применением ядерного эффекта Оверхаузера.

3. Изучение взаимодействия системы л-электронов колец А и С рутина с холиновой группой ФХ методами AMI и DFT.

4. Определение изменения" пространственного и электронного строения молекул, образующих комплекс.

Научная новизна

Показано комплексообразование при взаимодействии системы 71-электронов колец А и С рутина и >Г(СНз)з-группы ФХ, подтвержденное спектрами ядер JH,

13 31

Си Р растворов рутина с ФХ. Программа, разработанная для блока LCard, позволила автоматизировать процесс управления, сбора и обработки спектральных данных.

Достоверность результатов обеспечена использованием современных спектральных, расчетных методов-согласно поставленным задачам и проведением сравнительного анализа полученных результатов.

Личный вклад заключался в участии в постановке цели и задач исследования; получении результатов расчетов и эксперимента, их обработки и

интерпретации; в разработке программы для приема и обработки сигналов ЯМР, подготовке материалов к публикациям.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данная работа имеет как фундаментальное значение:

- определение конформационных и энергетических характеристик комплексов, образованных при взаимодействии рутина с ФХ;

- установление молекулярного механизма действия рутина на проницаемость клеточных мембран;

так и практическое:

результаты исследования могут быть использованы в прогнозе и разработке новых лекарственных средств более эффективных и дешевых, чем существующие в мире и обладающих меньшим количеством побочных действий.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Флавоноиды. Строение и свойства

В настоящее время известно более 8000 флавоноидных молекул, обладающих различными видами биологической активности и низкой токсичностью. Класс флавоноидов широко представлен в природе. Флавоноиды участвуют в регуляции многих биохимических процессах в животных и растительных организмах [5, 7]. Данные соединения обладают такими фармакологическими свойствами, как антиоксидантной,

мембраностабилизирующей, антигистаминной, противовоспалительной, противоопухолевой и другими видами активности [67, 89, 78, 90, 117, 58, 66, 104, 114]. Благодаря своим свойствам эти вещества активно применяются в составе противомикробных, противовирусных, антимутагенных, гепатопротекторных, противовоспалительных, сердечно-сосудистых, диуретических и других лекарственных средств.

На рис. 1.1 представлена структурная основа большинства флавоноидов, которым является флавоновое ядро.

Рисунок 1.1. Флавоновое ядро

Соединения данного класса отличается друг от друга расположением и количеством гидроксильных групп. Наличие гидроксильных групп и кето-групп приводит к уменьшению гидрофобности молекулы. В системе октанол/вода при рН 7,4 определялась гидрофобность [69]. При этом условии коэффициент

распределения большинства флавоноидов превышал 1, кроме рутина, коэффициент рН которого составил 0,4.

1.2. Структура и физико-химические свойства рутина

Молекула рутин, представитель класса флавоноидов (рис. 1.2) обладает всеми вышеперечисленными свойствами биологической активности. Для достижения лечебного эффекта требуется принимать рутин в меньших дозах, чем другие вещества данного класса [32, 17].

|571

„[62] /

[61] V

^0[зц с

„168|

Н' „[63,

[40] /

Л34]

|55)

(26]' „[58]

|64|

436]

0[35] \ \ 0142,^Н

0[33] [72]

■"I ^ I

\/\ „

■[27] I К

О /

Н'56'-сх н

>|30]

[53)

С|23]

[49]

[22]

[17]

Н166]^ / ^[37]

[65|

,,,, ^[39] /-[«]

0Г I „« I н"11

— ■— " н[70]

[18]

[46|

Н|73| н[671

[20]

.[12|

431'

44]

5,/ ^

-[Ю]

-18]

[51]'

ИГ

49]'

,[14]

,[16]

[45]

Н[44|

о1191

и [50]

.[15]

О?11

Н[521 н1471 Рисунок 1.2. Структура молекулы рутина

[48]

Енольная и кетонная разновидности структуры рутина различаются между собой областью кольца В (рис. 1.3). Более устойчивым таутомером является енольная форма [85]. Теорией функционала плотности определена разность в стабильности, которая составляет приблизительно 83,4 кДж/моль.

Рисунок 1.3. Формы молекулы рутина: енольная (а) и кетонная (б)

Энергия комплексообразования фосфатидилхолина с кверцетином 13,6 ккал/моль [57, 10] с молекулой рутина 17,1 ккал/моль. Расстояние от центра кольца С кверцетина до атома азота фосфатидилхолина составляет 4,6 А, от центра кольца рутина - 4,9 А [45, 47]. Площадь поперечного сечения фосфатидилхолина уровне атомов С[23] и С[32] в 1,2 раза больше, чем в комплексе с рутином. Значительные изменения наблюдаются и в геометрии биоактивных молекул (табл. 1.1).

Таблица 1.1.

Конформационные изменения исследуемых молекул при комплексообразовании

двугранный угол кверцетин рутин

сШ.с12]_сии_с11б] 19° 24°

С[2]_0[1]_С[1О]_С[9] 14° 9°

С[3]-С[4]-С[5]-С[6] 18° 2°

С[2]_С[3]_С[4]_0[,7] 16° 1°

10° (С[2]-С[3]-0[,8]-Н[23]) 7° (С[2]-С[3]-0[22,-Н[23])

157° (С[5]-С[6]-0[19]-Н[24]) 171о(С[5].С[6].0[18]_н[49])

фосфатидилхолин

ЫШ_С15]_С17|_0ЦО] -5° -5°

В обоих комплексах происходит вращение кольца С относительно криволинейной плоскости колец А и В, огибающих фосфатную группу фосфатидилхолина. Длины связи в комплексе с рутином

Н[23]_0[14] Н[24]_

0[13] 2,16 Ä. В комплексе с рутином Н[50]-О[131 2,05 Ä, Н[58]-0[,4] 2,96 Ä [46].

При расчетах методом РМЗ в программе МОР АС заряд кислородов рутина находятся в пределах от -0,212 а.е. до 0,246 а.е. [31].

1.3. Структура и функции биологических мембран

Благодаря способности мембранных липидов спонтанно образовывать в водной среде протяженные пленки формируются биологические мембраны [4]. Таким образом, образуется жидкостный матрикс, окружающий белки и другие молекулы (рис. 1.4) [112, 113] ответственные за физиологические и барьерные функции [74, 63]. Также мембраны определяют форму органеллы или клетки, являются структурой, обеспечивающей распознавание химических сигналов, играют роль в межклеточном взаимодействии и способствуют передвижению клеток [103, 111, 118].

Рисунок 1.4. Модель жидкостной мозаики биомембраны, законченная структура которой стабилизируется слабыми взаимодействиями, такими как липид-липид, липид-белок, белок-белок и белок-вода.

Широкое использование различных физических методов дало возможность проводить изучение мембранной структуры на молекулярном уровне. Все это создало благоприятные условия для детального исследования структурной организации природных и модельных мембран. Все структурообразующие липиды имеют одно "структурно выделенное" направление с разделенными полярной и гидрофобной областями. Полярная и гидрофобная (углеводородная) части молекулы, как правило, обладают достаточной гибкостью и подвижностью, что позволяет им принимать наиболее выгодную форму, соответствующую минимуму энергии, а "жидкому" бислою - сохранять барьерные свойства при изменении в широких пределах липидного состава, температуры, ионной силы водной среды и т. д.

Основными молекулярными компонентами биологических мембран являются липиды и белки. Встроенные молекулы холестерола встречаются в составе плазматической биомембраны млекопитающих, но отсутствуют у бактерий. Молекулы белков и липидов в бислое могут свободно диффундировать в двух направлениях. Подобно молекулам в тонком слое жидкости, где время жизни липидов составляет t = 107-108 с направление липидов латеральное. Время жизни флип-флоп-перехода составляет t ~ 1 час [24]. Низкая частота такого перехода могла бы позволить двум слоям сохранять различный липидный и белковый состав. И в самом деле, состав липидного двойного слоя асимметричен во всех до сих пор исследованных биологических мембранах. Функция этой асимметрии до сегодняшнего времени пока неясна.

Основным составляющим классом липидов биомембраны являются фосфолипиды, в состав которых входят ФХ, ФЭ и ФС [21]. Все они взаимосвязаны между собой, поскольку этаноламин и холин могут образовываться в ходе метаболизма из серина путем декарбоксилирования и последующего метилирования. Количество ФХ в живой клетке варьирует в пределах 15-50 % (на сухую массу), а в нервных тканях достигает 60-80 % массы, что часто превосходит содержание каждого из отдельно взятого фосфолипида [16, 20].

На долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав гликолипидов или гликопротеинов. Соотношение между белками и липидами в мембранах значительно варьирует - от 20 % (по массе сухого вещества) белка в миелине до 80% в митохондриях. В табл. 1.2 обобщены данные по составу мембраны. Плотность мембран животных прямо пропорциональна содержанию в них белка [9].

Бинарная система ФХ и ФЭ широко используется во многих работах при исследовании фосфолипидов различными методами [70]. Фосфолипиды фактически являются взаимозаменяемыми, но, тем не менее, молекулы ФХ чаще применяются во многих исследованиях благодаря таким физическим свойствам в формировании пузырьков и определенной структуре в растворе.

Трёхмерная структура молекулы ФХ определяется торсионными углами [107], где глицериновый остов и полярная головка образуют цепочку (гидрофильную область), а гидрофобную область образуют остатки олеиновой кислоты и стеариновой кислоты (рис. 1.5). Более ранние исследования, проведенные на кафедре медицинской физики Башкирского государственного медицинского университета, были направлены на определение конформационных свойств электронного состояния ФХ свободного и связанного с биологически активными соединениями в зависимости величины углов [2, 19].

Фосфолипидные молекулы в водных растворах приобретают ламинарную структуру углеводородных цепочек и самособираются в бислойную мембрану. В мембране жирнокислотные остатки располагается внутри мембраны благодаря своим гидрофобным свойствам, а в контакте с водным окружением оказываются гидрофильные полярные группы этих молекул.

В химическом отношении фосфолипиды представляют собой сложные эфиры трехатомного спирта глицерина с двумя жирными кислотами; к третьей гидроксильной группе которых присоединен ортофосфат, а к нему - небольшая органическая молекула, характерная для каждого вида фосфолипидов. ФЭ, ФХ -соединения, в которых фосфатидовые кислоты этерифицированы по фосфатному

гидроксилу этаноламином, имеющим первичный амин - N£[3, холином, состоящим из третичного амина 1Ч(СН3)3.

Таблица 1.2

Фосфолипидный состав субклеточных мембран печени крысы, доля от

суммарного количества фофсолипидов, %

Элемент мембраны митохо ндрии микро сомы лизосо мы плазматич еская мембрана ядерная мембра на мембраны аппарата Гольджи

Кардиолипин 18 1 1 1 4 1

Фосфатидилэт аноламин 35 22 14 23 13 20

Фосфатидилхо лин 40 58 40 39 55 50

Фосфатидилин озитол 5 10 5 8 10 12

Фосфатидилсе рин 1 2 ■ 2 9 3 6

Фосфатидиная кислота - 1 1 1 2 1

Лизофосфогли цериды 1 11 7 2 3 3

Сфингомиелин 1 1 20 16 3 8

Фосфолипиды (мг/мг белка) 0,175 0,374 0,156 0,672 0,500 0,825

Холестерол (мг/мг белка) 0,003 0,014 0,038 0,128 0,038 0,078

Рисунок 1.5. Молекула ФХ, |3 и