Генерация кислородных радикалов и эффекты свободно-радикальных ингибиторов и хелаторов в системах in vivo и in vitro тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

российская академия наук

^ институт химической физики в черноголовке

На правах рукописи

острахолим елена алеровна

генерация кислородных радикалов и эффекты свободно-радикальных ингибиторов 11хелаторов в системах in vivo и in vitro

Специальность 02.00.15- химическая к,, пика i. ката.", и j

автореферат

. диссертации на соискание учений стеиеш! кандидата химических наук

Черноголовка - 19S4

Работа выполнена в научно-исследовательском витаминном институте. Научные руководители :

доктор химических наук, профессор Афанасьев И.Б., доки>р медицинских наук, профессор Коркина Л.Р.

Оф'И(нал|.ные оппоненты:

доктор мздацикеках наук .Конь И .Я.

кандидат магически;, наутс Бар.та1.юв Б.Т.

Вступая организацп',!:

на^шо-лсследоватсльскп?. институт тазико-хгелической меящипн МЗ Р5:_

Защита состоится " ^".е.М^рЛ. 1994 г. п "Л" мас на язссдлции специализированного совета Д. 2Ш.08.02 при Инсппуге химический физики (Черноголовка) по адресу: 142432, Московская обл., Черноголовка, Ннспг.'утскпй проспект, 14, Корпус общего назначения.

С д»ссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической фкрики (Черноголовка).

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретари специализированного совета кандидат физ.мат.наук

И.Р.Фогель

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Восстановлении кислорода в клетках сопровождается образованием его актины* промежуточных форм, в частности, супероксидного радикала. Супергкснд и продукты его дальнейших превращений обладают высокой реакционной способностью, в силу чего могут взаимодействовать с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами, вызывая их повреждение (Michelson, 1977). Возмогло, одним из наиболее важных проявлений токсического действия кислородных радикалов является пероксидация липидов, играющая существенную роль при многих патологиях. В настоящее время имеются прямые доказательства участия супероксида в пероксидации липидов. Однако в литературе продолжается дискуссия о роли супероксида в этом процессе.

В последние годы была показана важная роль свободно-радикальных реакций в различных процессах жинедеягельности. Процессы свободно-радикального окисления являются универсальным механизмом повреждения клеток. В связи с этим актуальной является проблема использования природных и синтетических соединений, относящихся к классам антшжеидантов, ловушек свободных радикалов И хелаторов ионов металлоз переменной валентности, для подавления повышенного образования свободных радикалов в различных патологиях. Современный арсенал антшжеидантов, используемых в клинической практике, ограничен, поэтому перспективным является поиск, разработка и создание новых высокоэффекзивных антииксидантных препаратов. Для нахождения эффективных свободно-радикальных ингибиторов необходимо изучить механизм их взаимодействия со свободными радикалами и, в первую очередь, свободным» кислородными радикалами, образующимися в биологических системах.,Особый интерес дтя исследования в этом направлен!:!: вредртгвяягз? природные нетоксичные соединения: витамин Р, липоевая кислота. Эти .соединения уже и/<еют широкое применение в качестве лекарственных препаратов и пбэтому их

использование в качестве ингибиторов свободно-радикальных процессов

* 1 " *

представляет особый практический интерес.

Таким образом, актуальность работы обусловлена разработкой теоретических проблем, связанных с изучением роли супероксида в процессе липидной пероксидации, а также исследованием механизма взаимодействия антиоксидантоо со свободными радикалами в модельных системах для ерздания оптимальной схемы разработки новых лекпрс!иенных антиоксидантных препаратов.

{Ic.ii, работы.

Основной целью данного исследования является выяснение механизма образования свободных кислородных радикалов на стадии инициирования перекисного окисления липидов, а также механизма взаимодействия антиокадампЪа: флаооноидл рутина, его комплексов с ионами металлов переменной валентности, липоепой и дигидролипоепой кислот, со свободными кислородным радикалам»; (02 ", НО') в модельных Системах in viiro и in vivo.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи: Остяные замами работы.

1. Иэу'и.'.ь механизм обра:; шания свободных радикалов в микросомальной системе на стадии инициирования перекисного окисления липидов.

2. Оценить эффективность действия липосвой и дигидролипоепой кислот в модельной системе перекис >ioro окисления.

3. Изучит|> влияние рутина и его комплексов с ионами меди и железа на свободно-радикальные процессы в различных модельных системах.

4. Исследовать действие р^шна и липоепой кислоты на модели экспериментального reMOciijVnoiL у крыс. '

Предложен новый .механизм микросомальной ферментативной NADPH-зависимоГ'.'липидной пероксидацин. в котором первичным инициатором является супсроксн% на последующих стадиях образующий реакционноспособный комплекс Рс2+-АДФ-Ъ2, способный взаимодействовать с липидами и приводки» к развитию процесса липидной пероксидацин. Выявлена группа новых ингибиторов свободнорадикальных реакций - комплексов рутина с ионами металлов переменной валентностК и проведена оценка ингнбиторной активности в in vitro системах генерации киа^ро.иных радикалов. На основании полученных экспериментальных данных определены константы скорости реакций рутина и его комплексов с супероксндом. Установлено, что комплексы рутина с нонами меди обладают высокой СОД-подобной активностью. Впервые было показами, что ингибирующнй эффект рутина на псрскиснос окисление липидов обусловлен образованием KovrwieKta х;лтгор-двухвалентное железо с последующим внугрикомплсксным охмелением Fe2+ до Fe3+ внутри комплекса железо-рутин.

На основании исследования эффектов антаоксидантов и хелаторов (рутина, комплексов ,)утина с ионами железа и меди, а также липосвой и дигидролипоевой кислоты) на образование сво'юдных радикалов в микросомальчой ПОЛ, впервые

предложен механизм ингабирующего действия этих соединений в лнпидной пероксидации, обусловленной их способностью взаимодействовать с супероксидом, реагировать с псроксидными радикалами и хелнтировать ионы двухвалентного железа.

На модели экспериментального гемосидероза показано, что в соотве степи с результатами in vitro экспериментов, рутин и липоееая кислота проявляли ярко выраженное имгибирукпцее действие на ммкросомальнун- ПОЛ в лечении крыс, находящихся в условиях оксидативного стресса.

Научно-практическое значен ие.

Полученные в процессе выполнения работы результаты свидетельствуют о том, что супсроксид, образуемый в микросомах, играет важн}'о роль в инициировании псроксидации липидов.

В результате выполненных исследований выявлена группа новых, высокоэффективных антиоксидантов, перспективных для последующих работ по разработке новых фармакологических препаратов.

В работе экспериментально обоснована целесообразность применения рутина и липоевой кислоты для терапии заболеваний, связанных с перегрузкой железа.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на 10 Российском семинаре "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (1992 г., Минск), Международной конференции общества свободно-радикальных исследований, "Development of antioxidant and chelating drugs for the treatment of environment-associated diseases", 1994, Москва. Апробация диссертации состоялась 27 мая 1994 г. на ученом совете ВНИВИ и 22 июня 1994 г. на заседании семинара Отдела кинетики и катализа Института химической физики п .Черноголовка РАН.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ. ,

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания матери" лов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 125 страниц мицшнопмсного текста, включая 4 схемы, 4 таблицы, 27 рисунков. Библиография включает 203 наименования работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе были использованы следующие реактивы: 2-тиобарГмтуровая кислота (Fluka,Швейцария, Sigma Chemical Co., США); о-фенантролин. FcS04 , кагал аза 65000 ед./мг, ксангин (Serva, ФРГ); СОД 3000 едУмг, цитохром с/люминол, люцигсиин (Sigma Chemical Co., США); трис-HCI буфер, ИАДФН, АДФ, альбумин лиоф.сывороточный (Rcanal, Венгрия); нитрит натрия, FcC1.1, и-,~>утаиол, фосфорная кислота, в-нафтол, аскорбиновая кислота, трихлоруксусная кислота, хлорная кислота, гидразин, хлорамин, хлороформ, метанол, ..i-днметнламннбензальдегид, рутин, реактивы отечественного производства квалификации ЧДА, ХЧ. ОСЧ.

Комплексы рутина с ионами металлов были синтезированы и любезно предоставлены нам сотрудником лаборатории кинетики и катализа научно-исследовательского вит тминного института кандидатом химических наук ДорожкоА.И.

Кроме того, в работе применялись комплексы, получение смешением растворов ругин-' и солен железа и м.-дн, непосредственно перед экспериментом,

!?чс1!ернмситал1>ная работа проведена на беспородных крысах-самцах с массой гола 200-250 г.

Выделение микр)>сом проводили с помощью дифференциального центрифугирования. Определение белка проводили по методу Лоури с использованием дезоксихолата натрия. В качестве стандарта использовали бычий сыворото'уный альбумин. (Скорость окисления NADPH в микросомах измеряли при 340 нм спбктрофотометрически. Процессы перекисного окисления липидов в микросомах и гомогенатах изучали по образованию ТБК активных продуктов. Определение активности ксантмиоксидзм проводили спектрофотомегрически по накоплений) мочевой кислоты ¡Bimloli А., 1985). Определение скорости генерирований Oíпроводили спектрофотометрически по восстаноаленню цитохрома с [McCord J.M., 1977| и хемилюминесцснтным метолом в присутствии "хемилк^минесцеитиого зонда" люцнгенина.

Содержание Feионов определяли спектрофотометрически по образовпчию окрашенного продукта с фенан гролнном, а т акже ЭПР-методом по образованию нтгрозильных парамагнитных комплексов с £=2,03.

In vivo эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар массой тела 180-220г. Перегрузка железа в организме крыс создавалась кормлением крыс карбонилт.н-лм железом в течение 42 дней |Flclcher L.M., 1989J, после чего животным интраперитонеалчно были введены рутин и липоевая кислота (ЛК).

Анализ ТБК-активных продуктов (МДА), уровня негемового железа мнкро -ом, хемилюмкнесценции проводился соответственно на 10 и 14 день после начала кормления препаратами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРООКСИДАНТОВ НА ИНИЦИИРОВАНИЕ ПЕРЕКИСНОГО OKI ЮЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

В настоящей работе была изучена пероксидацня мнкросома.нанлх лнгздов двумя методами: методом люцнгениновой хеми люминесценции (специфический тест на продукцию 02") и по образованию ТБК-активных продуктов (интегральный метод определения общего содержания конечных, продуктов окисления липидов), что позволило нам исследовать липидную перокендацию как на этапе инициирования, так и на стадиях гпубоких деструктивных процессов, сопровождающихся накоплением продукта перекисногс'окисления-малонового диальдегида (МДА).

Как видно из рис.1, инкубация микросом печени крыс с NADPH стимулировала сильную люцнгенкковую хемнлюминес^енцию (ХЛ). Участие суперокскда в этом процессе доказывалось тем, что супероксндднсмугаза (СОД) ингибировала люцигешш-эаписимую ХЛ на 69-90%. Таблица 1. Эффект ионов металлов переменной валентности на

перекисиос окисление липидов микросом и люцнгениноаую хемнлюмннесценцию микросом в условиях пероксидацни

Люцигениковая НАДФН-зависнмая мнкросомадьиая кемилшмннесценция ИОЛ, МДА (нм/мг белка) микросом (% ннг) •

а) - ЕеАДФ* +FeAfl4>*

кошроль 0 10,2± 2,03 i5,6±i,a

R-3+ (1'OOmNf) 70± 5 14,8± 0,3 19,2± 1,2

Fe3+(10mM) 46,8± 3,5 15,4± 0,68 16,1± 0,35

Cu2+ (lOOmM) 100 5,7± 0,35 2Д±о;'5

Cu2+ (10 шМ) 70± 7,5 7,7± 0,4 9,С6± 0,61

РеЗ+АДФ (FeC13 20± 5 15,6± 1,8

50 mM; АДФ 800

шМ)

время инкубации: * • • 30 минуг при 37°С, а) - 5 минуг прч 37° С.

гои'оо 18J00 16Q07

Л

11000 е 1200Р г? 10000

M

8000 I 6000

4000 , 2000

о QlOlU'.UtU J'UrU?UIOlÇ:Uia>a>B>B-II-!a-eï-I

0 100 200 300 400

t,c

Рис.1. Эффект хининов и ^.люцигеннновую хемнлюмимесценцию МИКроСОМ печени крыс.

1. ынкросомм'1 ыг белка/мл) инк>{»ироиал!1 с NA ПРИ (0.3 мМ) и люцигенином (40 рМ) в 100 мМ К-фосфа1,1< м буфере (pli 7,6),

2. » присутствии Fe-АДФ (50 jiM);

3. в irpncyitrniin Fc-ЛДФ-Лдр ¿50 /iM):

4. а нрмсу¡¿г ПН Fc-ЛДФ-ЛДР (КМ цМ):

5. в ирмсутстпии мснациона (50 pMj;

6. в присутствии чена.чиона (НЮ рМ).

Соединения, обычно относимые к группе прооксидантов, оказывали

различные эффекты на скорость ПОЛ. Гак типа железа увеличивали скорость

образования МДА , а ионы меди ннгибировали ее (табл.1). Однако и ионы меди и

ионы железа ик' ибировали люцигениновую ХЛ микросом в условиях липидной

пер.жейл'тии, причем наиболее мощными мншбиторами были ионы меди, что

может б'.пъ связано с ииактивируюишм действием меди на компоненты NADPH-

зависимой нспи переноса электронов: питохром Р-450 и питохром Р-450 i

редуктаз v.

Другой тип прооксидангов, а именно, частицы кварца и волокна хризогил-асбеста(ХА) и крокидол!<]г-ас(>ссга(КЛ) также стимулировали микросомальную

Другой тип прооксидангов, а именно, частицы кварца и волокна хпн'ютмл-асбеста(ХА) н крокидалит-зсбеста(КА) также стимулировали микрос.шальную ПОЛ, причем иж эффект имел более сложный характер. Так например, было обнаружено, что проокендгитный эффект пылевых частиц иа микросомальную ПОЛ не коррелировал с содержанием свободного железа, как это иож ю было предположить.

Люцигениновая хемилюминесценция микросом г условиях перокендащш иншбировалась всеми исследованными пылями, возможно вследствие я''? мутации супероксида на ионах железа, содержащихся на поверхности частиц цыли.

В литературе широко обсуждается тот факт, что на генерирование 02" в млкросомах могут влиять хмнонные соединения, увеличивая скорость (Дзразования суиерокснда. Мы изучили эффект хиионов: противоракового актрацик'чшового антибиотика адриамицина (Лдр) и менадиома (витамина кЗ) на генерацию супероксида в микросомах. Ранее сотрудниками нашей лаборатории было показа!;«, что адриамиции стимулировал образование продуктов ПОЛ. Однако как »¡¡дно из рис.1, адриамицин и его комплекс Ре3+-АДФ-Адр, образуемый адриамнцииом с железом в присутствии АДФ в мнкросомах, практически полностью подавляли ХЛ-ответ (ряс. 1, крив. 4, 3). Несколько иной эффек" наблюдался в случае мендиона, который икгибировал как образование МДА, так и генерацию супероксида (рис. 1, крив. 5,6).

На примере хинонов нами предложен следующий меканнзм инициирования мшсросомальиой ПОЛ (рис.2).

Мы предположили, что из всех изучаемых соединений только менадион может переносить электрон через мембранные липиды к кислороду в водной фазе, тем самым увеличивая скорость восстановления цнтохрома с супероксидам. Ингибирование восстановления цитохрома с адрнамицином и его комплексом объясняется тем, что основной вклад в э тот процесс вносит прямое восстановление цитохрома ферментами микросом. В соответствии с результатами хемилюминесценци», супероксид, продуцируемый ОРН-ц иго хром Р-450 редуктазай и цитпхромом Р-450, способен восстанавливать как Ре3+-АДФ-/:др так и менаднон (реакции 1,2)

02'- + Мд------> 02 + Мд-

02 - + Ре?+-АДФ-Адр —> 02 + Ре2+-АДФ-Адр Ре2+-АДФ-Адр------->Рс2+-АДФ + Адр

(1) (2) (3)

Однако, в отличие ог обратимой реакции (1) с менадлоном, взаимодействие 02'* с комплексом Рс3+-АДФ-Адр является необратимым процессом, так как продукт р^жщш (Рс2+-АДФ-Адр) нестабилен н разлагается до Рег+-АДФ и Адр.

ЛИПИДНАЯ МЕМБРАНА

0ОДНАЯ ФАЗА

Рис.2. Хелагированис пдриампцнном нонов железа и его эффект на г;:рскисноо окисление липидов в микросома*

ИУак, к'ы предполагаем, что стимулирующий эффект прооксидантов на ПОЛ объясняется, образованием комплексов двухвалентного железа (Ре2+-АДФ-02 и Рег+-АДФ). При этом адриамиции катализирует образование активных форм (ре2+.ддф) внутри липидиой мембраны, а менянном катализирует образование 02" и Н207 в водной фас'; вне мембраны и не участвует в инициировании ПОЛ. Таким образом, 02" играет важную роль в инициировании микросомальной ПОЛ, а

продукции 02 " через хиноииый релокс-цнхл. Если хиноны не могут хслатировать Рс3+ (как менздкон), оии фактически иигибируют ПОЛ.

Мы считаем, что аналогичный механизм реализуется и в случае других исследованных прооксидантов.

ЭФФЕКТ АНТИОКСИДАНТОВ И ХЕЛАТОРОВ ЖЕЛЕЗА НА СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ '

Нами изучена антиохсидантная активность липоевой кислоты (ЛК) и ее восстановленной формы-дигидролипосвой кислоты (ДГЛК), которая, как предполагается, является не только типичной свободно-радикальной ловушкой, но и хелатором железа. ЛК н ДГЛК проявили сходные слабые кнгибирующиё эффекты на КАОРН-зависнмую ПОЛ микросом печени крыс (рнс.З крив.1 ¡2).

О 1 2-3 4 5

П)М ' '.

Рис. 3. Образование ТБК-ахтивных продуктов и люцяггаяиовая ХЛ 8 мкхросомги печени крыс.

1,2 Эффект ЛК и ДГЛК на образованно ТБК-актнвных продуктов.

Михросомы (0,5 мг белка/ил) были инкубированы с NACPH (103|лМ),ТсС13 (50цМ), АДФ (800 цМ), ЛК » ДГЛК в К-фосфапюм буфер« (рИ 7,6) при 37°С.

3,4 Эффект ЛК и ДГЛК на люцигснкнонуга хемилюмикесцепцию. Условия эксперкмеата аналогичны описанным сьенс,

5 Эффект ДГЛК на люцигекииовую кскилюмкнесиенцию, но в отсутствия в .

инкубационной смеси.

Итгтенсипкость ХЛ без ЛК и ДГЛК бралась за 1(Ю%.

интенсивность ХЛ без ЛК и ДГЛК бралась за 100%.

Более сильным было ннгибирующее действие ЛК на люцигенгаовую хемклюминесценцию, генерируемую в процессе ПОЛ (рис.3 криа.З). Эффект ДГЛК на ХЛ был значительно меньше, однако, если Ре34"-АОР не добавлялся в исследуемую систему, ингибирующее действие ДГЛК приближалась к действию ЛК (рис.3, крив.5). Мы предположили, что слабый ингнбирующий эффект ДГЛК на микросомальную ПОЛ и люцигениновую хемилюминесцекцкю является следствием побочного окисления ДГЛК, катализируемого конами Ре3+. Что касается ЛК, то, по-виднмому, она может подавлять ПОЛ только через взаимодействие с 02", но, как видно из рис.3, для полного подавления образования ОН" требуется большая концентрация ЛК(около 5 мМ).

Далее были исследованы ругин и его комплексы с нонами металлов, которые оказались эффективными ингибиторами ПОЛ и люцнгсниновэЯ демилюминесцснцин в микросомах печени крыс (табл.2). Для выяснения механизма ингибиторной активности данных соединений мы изучили их действие на генерацию гидроксильного радикала в системе фентона и супероксида в ксаитнн-кешшшокендазной системе.

Таблица 2. Эффективность антноксидантного действия рутина и и его комплексов на ферментативное перекненое окисление лкпндов в микросомах печени люцигешшовую хемилюминесценцию

¡50 (цМ)*

рутина

CuPyrCl (in situ) CuPyiCl (синт)** FePyrC204 (синг) FePyrC13 (in situ) FePyrC13 (синт)

* - концентрация 50% ипгибирования ** - синтезированный комплекс

ПОЛ Люцигениновая

хемилюминесценция 20 25 5

80 10 id Ю

125=300

100 20

ловушками гидрокеильиого радикала были комплексы рутина с РеС204 я СиС12 (150= 1и 2 цМ соответственно). Высокая ингибнторная активность комплексов, по-видимому, обусловлена реакцией НО' с ионами металлов комплексов. На основании кинетических опытов, проведенных в системе ксантин-ксантиноксидаэа (рис.4), нами определены константы скорости реакции супероксида с рутином и его металлическими комплексами.

120

Рис.4. Кинетика ингибирования генерации супероксида в ксаитин-ксаитиноксидаэиой системе (по восстановлению цитохрома с) рутином и его комплексами с ионами металлов.

1.контроль;

2. в присутствии М рутина; ^

3. в присутствии 10-5 од синтезированного комплекса рутин-желсто;

4. в присутствии 10"5 М комплекса рутин-железо, емнтез/гроваквого in stilt.

5. в присутствии 10-5 м синтезированного комплекса FePyTC204; ft. в присутствии 10" ^ М синтезированного комплекса рутин-мсяь.

7. в присутствии 10'^ М комплекса рутами:1;:!., синтезированного in situ.

Орыты проводились при концентрациях рутина и комплексов, исключающих возможность шиибирозакня ими активности фермента. Расчет констант скорости проводился по формуле:

(VI) -VI) к1 (цит.с) У111пЬ]

где VI) = 1310-9 М миа"1 - скоросты енерациш супероксяда VI - скорость восстановления цигохрома с к1= 2.6105 М-1с->

Результаты расчетов приведены в Таблице 3. Рутин и его металлические комплексы обладают достаточно высокой реакционной способностью в реакции с суперохсидом. Как и следовало ожидать, наиболее активны комплексы меди, которые можно, по-видимому, рассматривать как модели фермента Си7л-супероксидднсмутазы. Полученные результаты важны для оцентки эффективности антиокендантной активности синтезированных комплексов в качестве потенциальных лекарственных препаратов.

Таблица 3.

Значения констант скорости реакции супероксида с рутилом и его металлическими комплексами

Ингибитор к2, ЛНс'1

Нами предложен новый механизм ингибирующего действия рутина на лнпидную пероксидацию.

Рс(рутин)С13 (in situ)

Ре(рутин)С13(синтез.)

Си(рутин)С12(ш situ)

Си(рутин)€12(снктез.)

ре(рупш)(оксалат)

Рутин

сисод

Л1пСОД

(5.23il.l4)105 (2414)105 (1.6±0.24)107 (29±4.б)107 (0.83±0.044)107 (3.7±0.7)105 (1.5-2.4)10' (23J (03-3.6)10» [23)

«,с

Рис. 5. Кинстиха автоокисления Ре2+ (Ре504 200цМ) в Трис-НС! буфере (рН 7,4) в присутствии хслатора (70 цМ). Смесь инкубировали при коматной температуре, затем добавляли фенантролин(1мМ). Содержание комплекса Ре2+-фенантролт1 определяли спехтрофотометрически.

1. контроль;

3. в присутствия АДФ;

2. в присутствии рутина.

Как видно из рис.5 рутин быстро окисляет Ре2+ ионы п водном растворе. Аналогичным образом рутин действует на двухвалентное железо, содержащееся о клеточных органеллах. Так например, добавление рутина к гомогенату мозга приводило к быстрому окислению двухвалентного ¡хелеза (с 3,35 нМ/г ткани до 1,1 нМ/г ткани). На основании этого мы предположили, что ускорение окисления Ре внутри комплекса Ре-Рутин - основная причина иигибирующего действия рутина з процессах биологического окисления, катализируемых нонами двухзалентаого железа.

В качестве модели свободно-радикального деструктивного процесса, инициируемого эндогенным железом в системе, характеризующейся большим содержанием ненасыщенных фосфолипидоз, был предложен процесс перекисного окисления гомогената мозга. Образование ТБК-активных продуктов в процессе автоокисления гомогената показано на рис.6.

g OOS

й 007 в 0.06

§• 0.05

s 0 04

§ 0.03

§ 0.02 I

в . . о -1-1—-(-1-»--1

О 20 40 60 ВО 100 120

1,МИЦ

Рис.6. Кинетика образования ТБК-активных продуктов в процессе автоокисления гомогената мозга.

Рутин и его комплексы с медью, взятые в концентрации 100% иигибирования генерации ОН* и 02" радикалов (100цМ) в системе Фентона и ксантин-ксантиноксидазной системе, эффективно ингибировали ПОЛ гомогената ыозга, что коррелирует с результатами, полученными в условиях микросомальной - липидной пероксидации.

IN VIVO ЭФФЕКТЫ РУТИНА И ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НОРМАЛЬНЫХ КРЫС И КРЫС С ПЕРЕГРУЗКОЙ ЖЕЛЕЗА

In vitro эксперименты показали высокую эффективность рутина и его комплексов с ионами железа и меди в ингибировании микросомальной ПОЛ и меньшую эффективность в этом процессе другого нетоксического природного антиоксиданта - лнпоевой кислоты. Поскольку оба соединения являются витаминами и находят в настоящее время применение в лечении и профилактике различных заболеваний, мы исследовали их эффекты на ПОЛ микросом крыс в условиях гемосидероза. Результаты эксперимента приведены в табл.4.

Кормление крдо карбонильным (элементарным) железом приводило к резкому увеличению содержания негеминового железа в микросомах печени крыс и увеличению содержания ТБК-активных продуктов в 1,6 и 1,8 раз на 10 и 14 день после прекращения кормления животных. Таким образом in vivo пероксидация в гемосидерозных животных имеет отложенный характер и развивается значительно позднее завершения кормления крыс железом.

Кормление крыс с перегрузкой железом приводило к ингибированию микросомальной ПОЛ (табл.4), что подтверждает результаты, полученные в экспериментах in vitro.

Таблица 4. Эффект рутина и липоевой кислоты на содержание негемового

железа, ТБК-активные продукты и люцигениновую немилюминесцеицию при моделировании хронической перегрузки тканей железом

Группа ПОЛ, ХЛ-ответ

нМ/мг белка 1макс

Содержание Содержание Содержание

белка,мг/мл цитохрома негемового

Р-450, железа,

нМ/мл нМ/мг белка

Jгруппа (контр) 2группа (гемосид)

О день

3,16fi±0,35t 1904б±2100 25±2,8 2,387±0,956 4618±2277 26,2±2,4

J1,02±2,08 20,55i5,07 12,1±1,9 70,95±1б,9

Iгруппа ^группа Згруппа

3,0±0,861

4,935±0,091

4,3±2,66

10 день

19946±2988 22,3±2 10,9±2,1 ]8,35±5,1

6434±2351 22±4,2 12,3±2,8 6,55±10,4

21020*6630 24±1,0 15,6+1,2 19,6±3,9

(коитр+рутин)

4группа 1,233±0,251

(гсмосид+рутин)

1 группа 3,89±0,4 24

2 группа 7 ±0,707

5 группа 3,933±0,472

(контр+ЛК)

бгруппа 3,78±0,611

(гемосид+ЛК)

7754±4330 44±3,4

16,5±2,0 б7±15,2

14 день

19006±2900 22,8±1,8 11,4±2,1 18,9±3,4

6143±299 22,5±0,7 18,7±2,9 58,4±б,8

18336±3969 19,5±2Д 11,5^,1 18,4±1,б

5663±2705 25,3±4,2 15,5±2Д бОДШД

Значительный интерес представляет обнаруженный нами факт ингибирования рутином и ЛК пероксидации липидов в микросомах гемосидерозных животных и отсутствие каких-либо эффектов на ПОЛ микросом контрольных

крыс. Этот результат указывает на различие механизмов ПОЛ в печени здоровых животных н животных с перегрузкой железа в организме и подтверждает возможность применения рутина и лилоевой кислоты в качестве лекарственных препаратов для лечения и профилактики заболеваний, связанных с перегрузкой железа.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения эффектов лрооксидантных хиноноа (противоракового . антибиотика адриамицына н его комплекса с ионами железа, а также меиадиона(Р-

метилнафтохинона)), пылевых частиц и ионов металлов (железа и меди) выявлена важная роль супероксида в реакции пероксндации липидов.

2. Предложен новый механизм микросомальиой ферментативной NADPH-завнси»1ой липидной пероксндации, в котором первичным инициатором является супероксид (02'"), образующийся в результате "утечки" электронов с дыхательной цепи микросом. На последующих стадиях реакции супероксид образует реакционноспособный комплекс

Ре2+-АДФ-02, способный взаимодействовать с лнпидами и приводить к развитию процесса липидной пероксндации.

3. На основании исследования эффектов антиоксидантов н хелаторов (рутина, комплексов рутина с ионами железа и меди, а также липоевой и дигидролипоевой кислоты) на образование свободных радикалов в микросомальной ПОЛ, впервые предложен механизм икгибкрующего действия этих соединений в липидной

псроксидацкй, обусловленный их способностью взаимодействовать с супероксидом,

!

реагировать с пероксидными радикалами и хелатнровать ионы двухвалентного железа.

.4. Исследовано ингибирующее действие хелаторов на перекисное окисление липидов и образование кислородных радикалов в гомогенатах мозга крыс. Показало, что различие в эффектах ингибиторов на ПОЛ гомогенатов мозга и микросом печени является следствием различного состава ненасыщенных жирных кислот.

5. Впервые показано, что ингибирующий эффект хелаторов на ПОЛ обусловлен образованием комплекса хе.г.атор-двухвалентное железо с последующим внутрикомллексным окислением активных ионов двухвалентного железа,

6. Проведена оценка ингибиторной активности рутина и его комплексов с металлами в in vitro системах генерации активных кислородных радикалов. Показана

высокая активность комплексов металл-рутин в подавлении образования

радикалов.

7. На основании кинетических опытов, проведенных в системе ксантии-ксантиноксидаза, впервые определены константы скоростей реакции супероксида с рутином, а также его комплексами с ионами железа и меди.

8. Исследованы эффекты двух нетоксических природных антиоксидантоп (витаминов) рутина и липосвой кислоты на пероксидацию липидов в условиях in vivo (администрация антиоксидантов крысам с перегрузкой железа). Показано, что в соответствии с результатами in vitro экспериментов, рутин и лнпоевая кислота проявляли ярко выраженное ингибирующее действие на мнкросомальную ПОЛ гемосидерозных животных.

Полученные результап.1 показывают высокую эффективность рутина й его комплексов как потенциальных антирадикальных лекарственных средств, а также возможное использование рутнна и липосвой кислоты для коррекции патологических состояний, связанных с перегрузкой железом.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соодаева С.К., Узлова(; )страхович) Е.А., Козлов А.В., Бизюкии А.В., Симчуч С.Г., Поисх противофиброзных препаратов среди бкофлавоноидов, Тезисы 2 Конгресса по болезням органов дыхания, 1991г., Челябинск

2. Afanas'cv I.B., Dorozhko АЛ., Polozova N.I., Kuprianova N.S., Brodskii A.V.; Ostrachovitch П.A., Kotkiiia L.O., Is superoxide an initiator of microsomal lipid peroxidation? Arch.Biochem.Biophys..l993,v.3()2,Nl,pp.200-205

3. K07.I0V A.V., Ostrachovitch E.A., Afanas'cv 1.В., Mechanism of inhibitory effects of chelating drujs on lipid peroxidation in rat brain homogenates. Biochem.Pharmacol., 1994, v.47, N5, pp.795-799

4. K07.I0V A.V., Ostrachovitch E.A., Afanas'ev 1.В., Inhibitory effects of chelating drugs on lipid peroxidation in rat brain homogenates. 10 th Russian Seminar on Oxygen Radicals, Free Rad.Biol.&Mcd., 1994, v.16, N1, pp.10-11 1

5. Ибрагимова Г.А., Острахович E.A., Соодаева C.K., Коркина Л.Г., Афанасьев И.Б., Противофибрознос действие препаратов иа основе природных флавоноидов.