Изучение восстановления хинонов и образования кислородных радикалов в биологических системах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

1Г Б ОА

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ И ГОРЕНИЯ

На правах рукописи

УДК 541.138.2: 547.782: 547.475.2.

Дикалов Сергей Иванович

Изучение восстановления хинонов и образования кислородных радикалов в биологических системах

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1994

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель

Доктор химических наук Храмцов Валерий Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук Юданов Валерий Федорович Институт катализа СО РАН, г. Новосибирск

Доктор биологических наук Азизова Офелия Ахатовна Институт физико-химической медицины Минздрав России, г. Москва.

Ведущая организация:

Институт химической физики РАН, г. Москва

Защита состоится •Н; ЛН^ЫЛ ■гг

.го

часов на

заседании специализированного совета К 00220.01 в Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская, 3, Институт химической кинетики и горения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН и в зале отечественной литературы отделения ГПНТБ СО РАН в Академгородке.

Автореферат разослан " г.

Ученный секретарь специализированного совета Доктор химических наук Н.П.Грицан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Исследованием кислородных радикалов в химии и биологии интенсивно занимаются с 50-х годов. Широкое применение хинонсодержахцих противоопухолевых антибиотиков, важная рель окислительного повреждения в биологии и медицине делает актуальным изучение восстановления хинонов и образования кислородных радикалов в биологических системах.

Одним из прямых способов регистрации кислородных радикалов является метод ЭПР спектроскопии с использованием спиновых ловушек. Спиновые ловушки - соединения, реагирующие с короткоживущими свободными радикалами с образованием долгоживущих парамагнитных продуктов. Однако идентификация захваченного радикала часто затруднительна. Первая часть работы посвящена исследованию новых спиновых ловушек на основе 2Н-имвдазол-Ы-оксида, которые позволяют преодолеть некоторые недостатки метода спиновых ловушек и расширить его область применения.

Известно, что как противоопухолевое так и побочное действие хинонсодержащих антибиотиков обусловлены восстановлением хинонов и генерацией ими кислородных радикалов. Во второй части работы изучены механизмы восстановления природных и синтетических хинонов и генерации ими кислородных радикалов в ферментативных системах, а также в присутствии тиолов или аскорбата.

Генерация кислородных радикалов приводит к окислительному повреждению биомолекул, то есть к нарушению функций биомембран, повреждению ДНК и в итоге к развитию патологий и старению. Таким образом, изучение окислительного повреждения в животных, бактериальных и растительных клетках, а также способов защиты от кислородных радикалов, является весьма актуальной темой, изложенной в третьей части работы.

Цель работы состояла в исследовании новых спиновых ловушек, в изучении восстановления хинонов и образования кислородных радикалов в биологических системах.

Научная новизна и практическое значение.

Изучены новые спиновые ловушки на основе 2Н-имидазол-Ы-оксида. Показано, что они образуют спиновые авдукты с различными О-, С- и центрированными радикалами; по сравнению с широко приметаемой спиновой ловушкой 5,5-димстилпирролин-14-оксидом не имеют фонового сигнала ЭПР; существенно отличаются по коэффициенту липофильности, и по ЭПР спектру алдуктов можно легко определить тип захваченного радикала. Благодаря этим положительным качествам можно надеяться, что новые оптовые ловушки найдут широкое применение в химии и биологии.

Впервые показана генерация ОН-рздикалов олигонуклеотидными производными хинонов, что важно для разработки средств направленного повреждения онкогена.

Исследована роль ионов железа в восстановлении хинонов и генерации ими кислородных радикалов. Впервые обнаружено, что хиноны, х ел актирующие ионы железа, по сравнению с хинонами-нехелаторами обладают большей способностью окислять аскорбат и тлутатион и генерировать кислородные радикалы. Установлено, что это связано с обратимой реакцией переноса электрона в комплексе семихинона с Fe3+. Обнаружено, что, в отличие от адриамшцша, новые хиноны-хелаторы подавляют пфекиснос окисление лшщца, что позволяет выработать новые подходы для снижения побочного действия противоопухолевых хинонсодержащих антибиотиков.

Описаны основные побочные реакции и возможные ошибки при использовании оптических методов определения констант скорости реакции тиолов с супфоксвдным радикалом. Разработаны и апробированы новые ЭПР способы определения констант скоростей реакции антиоксид актов с супероксидным радикалом.

Обнаружено, что развитие врожденной патологии в крысах линии Wistar/S, тепловой шок в бактериях Eboli, выращивание растительных клеток в каллусных и суспензионных хультурах сопровождаются увеличением образования кислородных радикалов. Предложены способы защиты растительных клеток от кислородных радикалов при выращивании in vitro. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на 3-сй Международной конференции по нигроксильным радихалам (Новосибирск, 1989), на 8, 9, 10-м международных семинарах "Роль кислородных радикалов в химии, бислопш и медицине" (Москва, 1990; Санкт-Петербург, 1991; Минск, 1992), на Международной конференции Цитохром Р-450 (Москва, 1991); на Международной конференции по роли кислородных радикалов в химии, биологии и медицине (Вена, 1993), на Международной конференции по спиновым ловушкам и нигроксильным радикалам (Оклахома, 1993). Публикапии.

По материалам диссертации опубликовано S работ в международных журналах, 12 тезисов в сборниках международных конференций. Структура и объем работы.

Диссертация написана на 98 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 12 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, результатов и обсуждения работы, списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы и формулируются задачи исследования.

В" обзоре литературы излагаются современные представления о механизме восстановления хинонов и образования кислородных радикалов в биологических системах, а также об антиоксвдантной системе. Ниже приведены основные химические реакции, описывающие общую схему генерации кислородных радикалов и развития окислительного повреждения в биологических системах [6, 7].

1. о2 -> Or (митохондрии, редуктазы)

2. 2 Oy --> H202 + 02 (супероксид дисмутаза)

3. 2Н202 --> 2Н20 + 02 (каталаза)

4. Or + Fe3+--> 02 + Fe2+

5. Fe2+ + Н2О2--> Fe3+ + OH" + ■ОН

6. Н202 + Fe2+ -> FeOi+ + H20

Инициация цепной реакции

7. Fe02+ (0Н)(Н02) + LH-> L-

Развитие цепи

8. L- + 02 -> LOO-

9. LOO- + LH -* LOOH

Разветвление цепи

10. LOOH +

+ L-

+ ОН- + Fe3+

Fe2+ ->. LO-

Захват кислородных радикалов ангиоксидангами (обрыв цепи)

11. RSH + Oy (LOO-, LO-) --» RS- + H202 (LOOH, LOH)

Разложение органических перекисей пероксидазами

12. LOOH -► LOH + Н20

В работе использовалась общая схема восстановления хинонов и образования кислородных радикалов в биологических системах:

13. Q + FpH -> Q- + Fp + H+

14. Q + DH -> Q* + D + H+

15. 0- + 02 —> Q + Or

16. Or + Н20 —> H02 + OH-

17. Н02 + Or — H202 + o2

18. Q* + Fe3* -> Q + Fe2+

вде Q и Q- - хинон и семихинон, FpH и Fp - восстановленный и окисленный фермент, DH - восстановитель, LH - липид, ДНК, белки.

з

В гааве 'материалы и методы" приводится описание используемых методов и условий проведения экспериментов. Восстановление хинонов изучалось с помощью спектрофотометрии, тонкослойной хроматографии, электрохимического определения концентрации кислорода, ЭПР спектроскопии по образованию семихинона. Образование супероксицного {Ог) и гцдроксильного ("ОН) радикалов исследовалось методом ЭПР спектроскопии, используя спиновые ловушки: 5,5-диметилпирролин-М-океид (ДМПО) и производные 2Н-имидазол^-оксида.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I- Иссдеддини?_производных 2Н-имид аз ол-Ы-оксида_как_ШШЙ

РПИН9ВШ ЛОВУШЕК-

Метод спиновых ловушек успешно используется для исследования различных процессов, проходящих с участием свободных радикалов. Он позволяет одновременно идентифицировать короткоживущий радикал и получать информацию об их количестве и кинетике образования. Однако использование этого метода ограничено в связи с малой химической стабильностью спиновых ловушек и их аддуктов, проблемой определения строения захваченного радикала по спектру спинового аддукта. С целью преодоления этих ограничений были исследованы новые спиновые ловушки.

В данной работе была изучена способность производных 2Н-имидазол-Ы-оксида образовывать спиновые аддукты с различными О-, С- и Б- центрированными радикалами. Обнаружено, что спиновые аддукты с различными радикалами имеют легко отличимые спектры ЭПР, определены константы СТВ (Табл. 1, 2) [1].

Таблица 1. Параметры спектров ЭПР спиновых аддуктов, оптических спектров и коэффициенты липофильносги производных 2Н-имидазол-Ы-оксида.

Спиновые Спиновые Оптические Липо-

аддукты с ОН аддукты с СН3 спектры фильность

1 4 аы.Э ан, Э ан.Э ан.Э ^шв! НМ 1вЕ Сос/Сн*)

14.3 16.3 15.6 22.4 275 3.88 0.08

К 1=04, к2=сн3 13.9 15.4 15.3 21.4 305 3.39

Я1=С00СНз, Я2=СНз 14 Л 14.9 15.5 21.1 298 3.80

Я1=соок, и^енэ 14.3 15.6 15.6 21.7 288 3.89

Я1=СЛЧ1Шз, Я2=СНз 14.2 15.2 15.6 21.1 267 4.02 0.03

К1=РЬ,К2=СН3 15.5 20.9 273 4.14 8.5

Я^РЬ, К2=(СН2>гС02Н 15.3 20.9 276 4.14 1.0

КИСН2),СН3 14.4 19.3 274 4.04 > ю4

К1=СС13, ЯгСНз 14.8 20.7 283 3.84 12.5

Причем время жизни и эффективность захвата радикалов сравнимы, а иногда и превосходят аналогичные параметры для широко применяемых ФБН и ДМПО. Более того, оказалось, что новые спиновые ловушки стабильны и не имеют фонового сигнала ЭПР. Важно отметить, что псшучейные данные об оптических спектрах и коэффициентах липофильности производных 2Н-имвдазся-К-оксвда (Табл. 1) позволяют сделать вывод о новых возможностях при использовании этих спиновых ловушек в фотохимических и биомембранных системах. Так, было показано, что ОН-радикал не проникает в липвдную мембрану вследствие вероятной гибели ОН-радикалов в поверхностном слое липида.

Таблица 2. Константы сверхтонкого взаимодействия спиновых аддуктов от 2,2,4-триметил-2Н-имидазсш -оксида.

Захваченный радикал ац, Э ан1. Э ан2, Э

ОН 14.3 16.3

СНэ 15.6 22.4

• СН2ОН 15.2 22.4 1.0

СН(СНз)ОН 15.1 21.3

СН2С(СН3)гОН 15.6 22.1 0.6

Глутатионил 142 16.2

Дигвдролипоил 14.1 15.7

Важно отметить, что производные 2Н-имвдазод-Ы-оксвда не образуют спиновых аддуктов с супероксидным радикалом [1]. Это свойство исключает побочную реакцию разложения спиновых аддуктов с супероксидньгм радикалом (ROOH) с образованием аддукта с ОН-радюсалом (ROH), что актуально при использовании спиновой ловушки ДМПО. Это нашло применение при изучении образования радикалов при реакции супероксвдного радикала с антиоксид антами, Так было зарегистрировано образование тиильиых радикалов (RS*) при реакции тиолов (RSH) с супероксидным радикалом (О/).

Таким образом, изучены новые спиновые ловушки на основе 2Н-имид аз ал-N-оксида. Показано, что они по сравнению с широко применяемыми спиновыми ловушками ДМПО и ФБН не имеют фонового сигнала ЭПР, обладают широким набором по коэффициенту липофильности, и ЭПР спектры аддуктов новых спиновых ловушек с разными радикалами хорошо различаются. Эти положительные качества позволяют надеяться на их широкое применение в разных областях химии и биологии.

II. Изучение восстановления хинонов и образования кислородных радикалов.

Башур Н.Р. с соавторами в 1977 году показали, что при ферментативном восстановлении НАДФН цигохроы Р-450 редуктазой противоопухолевого хинонсодержащего антибиотика рубомицина происходит восстановление кислорода и образование кислородных радикалов, что обуславливает и лечебное и побочное действие хинонов. Позднее Нохл X. и Вайнер Л.М. с соавторами установили общий механизм генерации кислородных радикалов при ферментативном восстановлении хинонов (реакции 13, 1518, 5). Это позволило выдвинуть гипотезу о том, что хинон, присоединенный к олигонуклеотвду комплементарному уникальной последовательности онкогена, образуя комплекс с онкогеном, будет способен генерировать кислородные радикалы и, таким образом, направленно повреждать ДНК. Это позволило бы существенно снизить побочное кардиотоксичное действие и повысить терапевтическую активность хинонсодержащих препаратов. Для проверки данной гипотезы была изучена генерация ОН-радикалов следующими соединениями: рубомицин (Рб); тимидин-5 -фосфат производное рубомицина (Рб-рТ); гептанукпеотндное производное рубомицина (P6-pN7, где pN^=pCCAAACA); 2-Ы-бутил-3-хлоро-1,4-нафто-хинон (НХ);декатимидилатом2-К-бутил-3-хлоро-1,4-нафтохинона (НХ-рТу). В качестве комплементарных одигонуклеотидов были выбраны додекануклеотид pAACCTGTTTGGC (pNjj) и гексадекааденилат рА10-Образование ОН-радикалов определялось по спиновому аддукту мет ильного радикала со спиновой ловушкой ДМПО в присутствии 5% диметилсульф-оксида (реакции 19 и 20).

19. -ОН + (CH3)2SO -> -СН3 + HOSOCH3

20. СН3 + ДМПО -> ДМПО-СН3

Было показано, что вышеперечисленные хинонсодержащие соединения стимулировали образование ОН-радикалов в системе с НАДФН цитохром Р-450 редуктазой [2]. Однако эффективность генерации ОН-радикалов снижалась в ряду от хинона к олигонукл еогидному производному, свободному и в комплексе: Рб, Рб-рТ, Рб-pNy, Рб-pNy + pN а, а также НХ, НХ-рТ7, НХ-рТ7 +рА10 [2].

Таким образом, олигонуклеотидные производные природных и синтетических хинонов способны генерировать ОН-радикалы, что подтверждает возможность применения этих хинонсодержащих соединений для направленного повреждения ДНК.

Было сделано предположение о том, что использование хинонов, хелатируюших ионы железа, с одной стороны, способно повысить

эффективность генерации ОН-радикалов, с другой стороны, позволило бы генерировать ОН-радикалы в непосредственной близости к хинону, присоединенному к ДНК.

Для проверки этого предположения было изучено образование ОН-радикалов в системе с НАДФН цигохром Р-450 редуктазой в присутствии следующих хинонов: 2-фепил-4-(бутиламино)нафто [2,3-Ь]хинолин-7,12-дион (Ос), 2-фенил-5-нигронафто[2,3^]индол-6,11-дион ((2П) [3].

Было обнаружено, что (}с способен связывать Ре(3+) в комплекс с константой устойчивости 7-1018 М"3. В противоположность (}с близкий по строению хинон С?п не способен связывать ионы железа [3].

Образование ОН-радикалов определялось по спиновому аддукту метильного радикала со спиновой ловушкой ДМПО в присутствии 5% диметилсульфоксида (реакции 19 и 20; стр. 8).

На рисунке 1 показаны кинетики образования спинового аддукта ДМПО-СН3 в присутствии <3С, (}п и противоопухолевого антибиотика адриамицина.

Рис. 1 Кинетики образования спинового аддукта ДМПО-.СН3 в НАДФН цитохром Р-450 редуктазной системе в присутствии 5-10"5М Ос (а), адриамицина (б) и Оп (в).

В отличие от и адриамицина, хинон <3С, хелатирующий ионы железа, не имеет лаг-периода перед образованием спинового аддукта ДМПаСН3. Наличие лаг-периода для <3П и адриамицина обусловлено тем,

что вследствие конкуренции между реакциями 15 и 18 восстановление Ре3+ и последующее образование ОН-радикалов происходит после полного восстановления кислорода (реакция 15). Отсутствие лаг-периода для <3С связано с отсутствием конкуренции между реакциями 15 и 18. Более того, образование ОН-радикалов (реакция 5) без лаг-периода означает, что реакции восстановления кислорода и Ес3+ идут параллельно. Для объяснения образования ОН-радикалов без лаг-периода в случае ()с было выдвинуто предположение о том, что семихинон <2^, находясь в комплексе с Ре3+, с одной стороны, может окисляться кислородом (реакция 21), и, с другой стороны, внутримолекулярно восстанавливает Ре3+ (реакция 22) [3].

21. -"<2с-РеЗ+ + 02 -> Ос-РеЗ+ + 02"

22. '<2С-Ре3+ -у 0С-Ре2+

23. <2С-Ре2+ + Н202-> Ос-РеЗ+ + ОН" + -ОН

Важно отметить, что в образце, содержащем <3С (50цМ), НАДФН (5-Ю*3 М) и НАДФН цигохром Р-450 редуктазу, добавление РеС1з не приводило к росту скорости окисления НАДФН (реакция 13). Поэтому предполагается, что <3С и его комплекс с Ре3+ реагируют с НАДФН цитохром Р-450 редукгазой одинаково и образуют семихинон <Зо* свободный или в комплексе с Ре3+. Далее образование ОН-радикала происходит согласно реакций 15, 21, 17, 22,23 [3].

Таким образом, обнаружен новый тип хинонов, которые хелатируют ионы железа, и, в отличие от антибиотиков адриамицина, рубомицина и хинонов, не хеяатирующих ионы железа, генерируют ОН-радикалы без лаг-периода. Предложена схема реакций, объясняющая отсутствие лаг-периода в генерации ОН-радикалов для <3С [3].

Наряду с ^ферментативным восстановлением, например, НАДФН цигохром Р-450 редукгазой, в биологических системах хиноны могли бы восстанавливаться тиалами (КБН) или аскорбатом (АН*). Предполагается, что такое восстановление может играть важную роль в противоопухолевом действии хинонсодержащих антибиотиков. Поэтому представлялось важным изучить восстановление хинонов аскорбатом и наиболее распространенным в живых клетках тиалом - плутатионом. Для этого были выбраны хиноны, хелатирующие ионы железа <3С и адриамицин, а также не хелатирующие -(2П, 2 -д иметил амино -3 -хл ор -1,4-нафтохинон (ЦХНХ) и 2-(3-гвдроксипро-пил)-антрахинон (АХГП). Восстановление хинонов изучалось с помощью ЭПР спектроскопии по образованию семихинока и по поглощению кислорода, используя электрод Кларка.

Было обнаружено, что в присутствии аскорбата все данные хиноны стимулировали поглощение кислорода (Таблица 3), причем добавление

десферала, связывающего Ре3+ в инертный комплекс, существенно снижало скорость восстановления кислорода в случае хинонов, хелатирующих ионы железа - (}с и адриамицина [4].

Таблйца 3. Пошощение кислорода в образцах, содержащих 2.5-10*3 М аскорбата, 5цМ РеС13, десферал и хиноны. Пошощение кислорода в образце без десферала и хинона - 100%.

Хинон Ос <?п Адриамицин АХГП дхнх

Десферал 5цМ 200цМ 500цМ 500цМ 500цМ

- 1635±85% 209±17% 409±31% 262+28% 566±34%

150цМ б25±45% 19б±17% 270±22% - 47б±5б%

Поглощение кислорода в данных образцах может происходить согласно реакциям 14, 15 и 24. Причем восстановление хинона (реакция 14) является лимитирующей стадией в процессе поглощения кислорода [4]. Поэтому скорость поглощения кислорода равна скорости восстановления хинона. Таким образом, по-видимому, все изученные хиноны способны восстанавливаться аскорбатом по реакции 14. Однако комплексы хинонов (Зс и адриамицина с Ре3+ способны восстанавливать ион железа в Ре2+ (реакция 25), а затем восстанавливать кислород (реакция 26). Протеканием реакций 25 и 26 [4] можно объяснить большую эффективность восстановления кислорода хинонами, хелатирующими ионы железа (<2С и адриамицин), причем (}с был наиболее эффективен.

24. АН- + Ог*--> А"1 + Н202

25. АН" + <гс-РеЭ+--► А1 + (}С-Ре2+

26. (}С-Ре2+ + 02--> + 02"

Важно отметить, что в образце, содержащем аскорбат и комплекс (2С-Ре3+, было зарегистрировано образование семихинона, "Ч2С и аскорбат радикала, AJ. Причем в образце, содержащем аскорбат и комплекс адриамицина с Ре3+, образование семихинона адриамицина не было зарегистрировано. Эти данные свидетельствуют о том, что как для адриамицина так и для (Зс комплексы с ионами железа вступают в реакции 25 и 26. Однако в отличие от адриамицина для комплекса (}С-Ре2+, по-видимому, существует внутримолекулярная реакция переноса электрона с образованием семихинона "'<3С-Ре3+ (реакция 27) [4].

27. <}с-Ре2+--> "<Зс-РеЗ+

Протекание реакции 27 было проверено прямым образом. К растворам исследованных хинонов были добавлены ионы восстановленного железа (РеБО^. При этом только (2С стимулировал окисление ионов железа и было зарегистрировано образование семихинона <3^.

Таким образом, в отличие от адриамицина, для хинона <3С в комплексе с существует обратимый внутримолекулярный перенос

электрона (реакции 22 и 27).

Для количественной оценки вклада комплексообразования хинона с ионами железа в реакцию окисления аскорбата по поглощению кислорода были определены константы реакции наиболее сильного по окислительным способностям хинона ДХНХ и хинона <2С, хелатирующего ионы железа. Были получены следующие значения: к 14(ДХМХ)=0.042±0.005 М-1с-! и к25(0с-Ре3+)=98±9 М"^"1. Из сравнения Болтин ввдно, что комплекс хдшона Qc с Ге3+ восстанавливался аскорбатом быстрее более чем в 2000 раз по сравнению с ДХНХ [4].

Аналогично аскорбату в присутствии путгтиона <2С восстанавливался наиботее эффективно всяедствии хеяатпрованш ионов железа [4].

Важно отмстить, что выше описашше отличия между хинонамк, хелат1!рующими ионы железа (QC п гдриамидик) и не хслатирующими (<3П, ДХНХ, АХГП), а также между (2С и здриамицином не связаны с различием в потенциалах восстановления <3С или адриамицина (Таблица 4).

Таблица 4. Одноэлектронные потенциалы восстановления хшюнов в безводном диметилсульфоксвде (V).

Хинон Адриамищш Р. СЗп ДХНХ

- РеС1, -0.55 -0.70 -0.53 -0.32

+ РеС1ч -0.45 -0.54 -0.53 -0.32

Известно, что примените противоопухолевых хинонсодержащих антибиотиков в значительной степени ограничено кардиотоксичностью, которая развивается из-за стимуляции этими хинонами перекисного окисления липида. Поэтому представлялось важным сравнить хинонсодсржащие антибиотики с новым хиноном <2С, хелатирующим ионы железа, по эффекту на перекисное окисление липида. Перекисное окисление липида оценивалось стандартным методом по образованию малонового диальдегвда. Обнаружено, что, в отличие от адриамицина, (Зс подавляет перекисное окисление липцда [4], что открывает новые подходы для снижения побочного действия противоопухолевых хинонсодержащих антибиотиков.

Таким образом, в настоящей части работы исследована роль ионов железа в восстановлении хинонов и генерации ими кислородных радикалов. Впервые обнаружено, что комлексообразовакие хинонов с ионами железа значительно повышает эффективность восстановления хинонов-хелаторов и генерации кислородных радикалов. Показано, что это связано с обратимой реакцией переноса электрона в комплексе семихинона с Ре^. Обнаружено, что в отличие от адриамицина, новые хиноны-хелаторы подавляют перекисное окисление липида, что открывает новые подходы для снижения побочного действия хинонсодержащих противоопухолевых лекарств.

III. Образование кислородных радикалов и антиоксипангы в биодршчсскта система*;-

Необходимо отметить, что при изучении образования кислородных радикалов в биологических системах одной из важнейших задач является исследование защитной ангиоксцдантной системы. С одной стороны, эта система состоит из ферментов, таких как супер оксид дисмутазы (реакция 2), каталазы (реакция 3), пероксидазы (реакция 12). Однако не обнаружены ферменты, уничтожающие алкоксилыше (LO*) и перокскяьные (LOO-) радикалы. Более того, супероксидный радикал, образующийся в цепи переноса электрона в значительно большем количестве, чем LO* и LOO, в лнпвдной мембране не разлагается супсроксид дисмутазой. Поэтому велика роль пгокомолекулярных антиоксидантов, например, а-токоферола и аскорбиновой кислоты, которые ловят такие радикалы как O?, LO- и LOO-. Хотя концентрация тиатов значительно превышает количество других низкомо-лехулярных антиоксидантов, рать тиолов как ловушек кислородных радикалов до недавнего времени оставалась неясной.

Определение констант скоростей реакции тиолов с супероксидным радикалом.

Супероксидный радикал образуется в биологических системах в наибольшем количестве и обладает наименьшей реакционной способностью при взаимодействии с низкомолекулярными акгиоксидантами по сравнению с радикалами LO- и LOO*. Таким образом, для оценки роли тиолов как ловушек кислородных радикалов необходимо определение констант скоростей реакции тиолов с супероксвдным радикалом.

Для определения констант скоростей реакции с супероксидным радикалом есть два широко используемых спектрофотометр ических подхода. В первом используется конкуренция между цитохромом С и антиокевдантом за О2* радикал (реакции 11 и 28). Во-втором - конкуренция между адреналином и антиоксидантом (реакции 11 и 29). Однако данные, полученные с помощью адреналина или цитохрома С, были очень различны (~106' и ~103 M_1c-J, соответственно). Поэтому были проанализированы причины этих расхождений и предложены новые подходы для определения этих констант с использованием ЭПР спектроскопии.

28. о/ + CytC-* 02 + Cyt Cred

29. 02* + ЕрН2-> Н202 + ЕрН

k29 = 4' Ю4 МЛ'1.

30. Ог* + ЕрН -> Н202 + Ad ,

где Cyt С - цитохром С, ЕрН2 и ЕрН - пщрохинон и семихинон адреналина.

Было обнаружено, что тиолы способны восстанавливать цитохром С (реакция 31) со следующими константами скоростей: k31(GSH)=3±2 М 'с"1, к31(МПГ)=б±4 М 'с'1, k31(THJIK)=200± 100 М^с1, к3,(БНЛК)=500±300 М'с"1, к31(ДГЛК)=600±300 MV1 [5]. 31. RSH + Cyt С-> RS-+ Cyt Cred

Использование конкуренции между цитохромом С и тиолом корректно, если скорость реакции 31 много меньше скорости реакции 28 или küsPbVk,!» [RSH], Используя [02> 10"8М и kjr^ lO^M'V1, был сделан вывод о том, что данный подход не применим для производных липоевой кислоты (ЦГПК, БНЛК и ТШК), а в случае МРГ и GSH полученные значения к jj будут значительно занижены.

Было известно, что тиолы способны реагировать с адренохромом (реакции 32 и 33), продуктом реакции адреналина с 02\ по которому ведется регистрация реакции 29. Однако константы скоростей реакций 32 и 33 в литературе отсутствовали. Наблюдаемые константы скорости реакции адренохрома с тисшами (К32+К33) были определены спектрофотометрически (Таблица 5). Продукт реакции 32 восстанавливает кислород (реакция 34). Поэтому было возможно оценить константу реакции 32 по поглощению О2 (Таблица 5). Было обнаружено, что адренохром нестабилен, причем продукт разложения адренохрома также реагировал с тиоламн (Таблица 5).

32. Ad + RSH - —> Ad " + RS- + H+

33. Ad + RSH - —> Ad-SR

34. AdJ + 02 - —> Ad + О/

где Ай и Ас!" - хинон и семихинон адренахрома.

Таблица 5. Наблюдаемые константы скорости (М'1 сек"1) реакции адренохрома, продукта разложения адренохрома (адренохром разд.), 2-диметил-амино-3-хлор- 1,4-нафтохинон (ДХНХ) с дигидролипоевой кислотой (ЦГЛК), Епутатионом (С8Н), N -(2-меркаптопропил)-глицином (МПГ), полученные с помощью спектрофотометр ии (Оптика) и определения поглощения кислорода ([02]) [5].

Тиолы Адренохром Адренохром разл. ДХНХ

Оптика P2] Оптика [02] Оптика [021

ДГЛК 300±110 92±31 81±31 15л5.0 43±7 lk3

GSH 4.Ы.8 _ 5.6±2.5 4.1±0.9 O.StO.2

МПГ 2.5±0.9 - - - -

Побочные реакции адренохрома приводят к необходимости использования только начальной скорости образования адренохрома и к

заниженным оценкам скорости реакции 29. Таким образом, использование данного подхода будет приводить к завышенным оценкам констант скорости реакции тиолов с супероксидным радикалом [5].

Полученные данные показывают, что в спектрофотометр ических подходах определения ки основной проблемой являются побочные реакции конкурентного реагента за супероксидный радикал. Поэтому в качестве такого реагента нами был предложена спиновая ловушка ДМПО для которой известна константа реакции с супероксидным радикалом и, как мы полагали, побочные реакции не имеют большого значения.

Для определения к л с помощью спиновой ловушки ДМПО в качестве источника 02~ радикала была использована НАДФН цитохром Р-450 редук-таза (реакции 13 и 15), для которой скорость образования 02" равна удвоенной скорости окисления НАДФН, определяемой спектрофотометрически. Используя квазистационарнос приближение для концентрации спинового адцукта ДМПО-ООН (все Ог~ радикалы реагируют с ДМПО и скорости реакций 35 и 36 равны), из зависимости концентрации ДМПО-ООН от скорости окисления НАДФН был определен порядок (п= 1.9+0.2) и константа (2.8±0.5-103 М-кг1) реакции гибели ДМПО-ООН (реакция 36).

35. Ог" + ДМПО -> ДМПО-ООН

36. 2ДМПО-ООН -► диамагнитные продукты

Были исследованы побочные реакции тиолов с ДМПО-ООН, с ферментом и с хинонами, в результате чего были подобраны условия, в которых этими побочными процессами можно пренебречь.

Используя квазистационарное приближение для спинового аддукта ДМПО-ООН и второй порядок реакции 36, было получено следующее линеаризованное выражение для зависимости амплитуды спектра ЭПР ДМПО-ООН (А) от концентрации тиолов (рЯН]): у = к-рБН], ще у={А/А»)2-1, к=клзнАдмпо'ДМПО], А, - амплитуда спектра ЭПР без тиолов. кдмпо = 30 М-к"! ,рН=7.4, кцлн = 30 кДМПО!. кяБН - наблюдаемая константа скорости реакции 11.

Для определения Кц с помощью ДМПО, наряду с вышеописанным подходом, можно использовать зависимость скорости окисления тиолов (реакция 11) от концентрации восстановленных тисяов. Скорость окисления тиолов определялась по скорости падения концентрации восстановленных тиолов. Концентрация восстановленных тиолов определялась с помощью развитого ранее Храмцовым В.Б. с соавторами (ИХКиГ) метода с использованием нитроксильного бирадикала (ЧЖВвБВМО-) по амплитуде низкопалевой компоненты спектра ЭПР (А).

37. ЯБН + -ОКВББВЛО---> ОИВЗН + ЛвЗВИО-

И

Концентрация тиолов (рЗН]) определялась по формуле: Р^Н] = (А - А^ [^В55ВЫО ); /(А^ -АО,

ще А,-амплигуда ЭПР сигнала без тиолов, А^,-амплитуда ЭПР сигнала при [113Н]»[0>ГО85ВМ0];, [ОЫВ&5ВЖ>]{ - начальная концентрация 6 ир ад икала.

Определение константы скорости реакции супероксцдного радикала с тислами с помощью нитроксильного бирадикала проводилось используя следующее выражение: (У,/Уи-У11) = кп'{КЩ]/кдМПоНМПО],

Итак, из зависимостей амплитуды спектра ЭПР ДМПО-ООН и скорости окисления тиолов от концентрации тислов были определены константы скорости реакции супероксвдного радикала с тиалами (Таблица 6) [5].

Таблица 6. Наблюдаемые константы скорости (М'1 сек"1) реакции между супероксвдным радикалом и тиалами.

Тиолы ввн мпг ТНЛК БНЛК ДГЛК

Константы (1.8±0.5)-105 (2.2*0.5)-10* <1.2±0.3)105 (2.5*0.9)-105 (4.8±2)-105

Отметим,' что полученные данные позволяют сделать вывод о важности тиолов как ловушек кислородных радикалов.

Следует отметить, что по восстановительным свойствам (Таблицы 5 и 7) тиолы отличаются больше, чем по ловушечным свойствам (Таблица 6).

Таблица 7. Потенциалы восстановления дисульфидов в безводном ДМФА.

Дисульфиды ТНЛК БНЛК ДГЛК

Еь V -1.26*0.02 -1.17±0.03 -1.45±0.03 -1.66*0.02

Таким образом, в настоящей части работы исследованы основные побочные реакции в оптических методах определения констант скорости реакции тиолов с супероксвдным радикалом, что позволило проанализировать критерии их применимости. Разработаны и апробированы новые подходы с применением спектроскопии ЭПР для определения констант скоростей реакции антиоксидантов с супероксвдным радикалом.

Роть кистда.рдШ'В рздшшрр при внранмЕздии растительных та сток р каллусной и суспензионной культурах.

Известно, что при выращивании растительных клеток в суспензионной и каллусной культурах возникает множество мутаций. Однако природа мутагенного фактора не совсем ясна. Можно было предполагать, что мутации образуются под действием кислородных радикалов. Усиленное образование кислородных радикалов может вызываться комплексом железа Ре-ЭДТА, который обычно добавляется в питательную среду. Дело в том,

что железо является необходимым микроэлементом для развития растительных клеток. Однако ионы железа могут участвовать в образовании кислородных радикалов -ОН, Ре02+,Ь0-, О?, (реакции 5, б, 10, 39).

38. Ре3+-ЭДТА + ЭН -V Рс24"-ЭДТА + Э- + Н+

39. Ре2+-ЭДТА + 02 -► Ре3+-ЭДТА + Ог»

Для изучения роли кислородных радикалов при выращивании растительных клеток в каллусной и суспензионной культурах люцерны были исследованы образование ОН-радикалов, содержание тиолов и активность кат ал азы, а также влияние на эти процессы различных комплексов железа.

Было обнаружено, что стимулированное образование ОН-радикалов в митохондриях суспензионной и каллусной культур было больше, чем в проростках семян в 2 и 3 раза, соответственно. Причем активность кат ал азы (фермента, разлагающего Н2О2) в суспензионной и каллусной культурах была ниже, чем в проростках. Содержание тиолов было ниже при культур ал ьном выращивании. Отмстим, что использование в питательной среде вместо Ре-ЭДТА таких комплексов железа как Ре-АДФ, Ре-цитрат и Ре-десферал снижало образование ОН-радикалов до 3 раз, увеличивало содержание тиолов.

Дикаловой А.Э. с коллегами (Институт цитологии и генетики) было обнаружено, что использование в питательной среде вместо Ре-ЭДТА таких комплексов железа как Ре-АДФ, Ре-дотрат и Ре-десферал значительно уменьшало частоту мутаций и гибели растительных клеток, приводило к увеличению скорости роста клеточной массы в суспензионной и каллусной культурах.

Таким образом, показано, что увеличение образования кислородных радикалов, с одной стороны, и снижение активности защитной антиокси-дантной системы, с другой стороны, играют важную рель в возникновении мутаций в в суспензионной и каллусной культурах. Причем использование в питательной среде вместо Ре-ЭДТА таких комплексов железа как Ре-АДФ, Ре-щпраг и Ре-десферал значительно снижало образование кислородных радикалов в растительных клетках.

Роль кислородных радикалов в развитии врожденной патотогии у крыс динни У/Ым/5-

Салгаником Р.И. с коллегами (Институт цитологии и генетики) для изучения наследственных болезней, включающих нарушение обмена Сахаров, была выведена линия крыс \У1йаг/8, чувствительная к галактозной диете. У данной линии животных была обнаружена множественная патология, включая: образование катаракт и опухолей, атеросклероз, кардимиопатию и преждевременное старение. Было выдвинуто предположение, что врожденное

нарушение метаболизма Сахаров может приводить к увеличению образования кислородных радикалов, что ведет к развитию выше перечисленных заболеваний. Для проверки этой гипотезы была сделана оценка образования кислородных радикалов по стимулированному образованию ОН-радикалов в гомогенате и митохонцриальной системе из печени и сердца.

Бьшо обнаружено, что стимулированное образование ОН-радикалов было на 60% выше в гомогенате 2-3 месячных крыс линии Wistar/S по сравнению с контролем. У более взрослых животных (10-12 месяцев) разница в образовании ОН-радикалов была еще более значительной [6].

Таким образом, было показано, что у крыс линии Wistar/S по сравнению с Wistar/R происходит повышенное образование ОН-радикалов, что, по-видимому в едет к окислительному повреждению организма и развитию множественной патологии.

Роль кислородных радикалов в индукции тепловым шоком мутаций в

Салгаником Р.И. с коллегами (Институт цитологии и генетики) было обнаружено, что воздействие повышенной температуры (тепловой шок) на бактерии Е. coli, вызывает увеличение частоты мутаций. Бьшо сделано предположение, что это связано с увеличением образования кислородных радикалов под действием теплового шока (помещение бактерий из 37°С на 10 минут в 50°С). Для проверки этого предположения было исследовано влияние теплового шока на образование ОН-радикалов и на каталазную активность в суспензии бактерий Е. coli.

Было обнаружено, что стимулированное образование ОН-радикалов линейно увеличивалось до 7 раз с возрастанием продолжительности теплового шока с 5 до 20 минут. В тоже время, скорость разложения перекиси водорода уменьшалась до 4 раз.

Таким образом, было показано, что тепловой шок в бактериях Е. coli ведет к снижению каталазной активности и увеличению образования ОН-радикалов, что вызывает увеличение частоты мутаций.

1б

Выводы

1. Показано, что производные 2Н-имидазод-1Ч-оксвда способны образовывать спиновые аддукты с различными О-, С- и S- центрированными радикалами. Высокая химическая стабильность производных 2Н-имидазол-N-оксида и возможность определения структуры захваченных радикалов по спектру ЭПР спиновых аддуктов позволяют надеяться на широкое применение новых спиновых ловушек.

2. Установлено, что олигонуклеотидные производные нафтохинона и рубомицина способны генерировать ОН-радикалы, что может быть использовано при разработке средств направленного повреждения онкогена.

3. Впервые обнаружено, что хиноны, хелатирующие ионы железа, по сравнению с хинонами-нехелаторами, обладают большей способностью окислять аскорбат и шутатиои и генерировать кислородные радикалы. Установлено, что хинон-хелатор Qc, в отличие от адриамицина, способен окислять аскорбат и шутатион с образованием еемихинона и генерировать ОН-радикалы без лаг-периода, что связано с реакцией переноса электрона в комплексе еемихинона Qc с Fe3+. Обнаружено, что Qc в отличие от адриамицина подавляет перекисное окисление липвдов.

4. Описаны побочные реакции, оказывающие влияние на результаты, полученные при использовании оптических методов определения констант скорости реакции тиолов с супсроксндным радикалом. Разработаны и апробированы новые способы определения констант скоростей реакции тиолов с супероксидным радикалом с использованием ЭПР спектроскопии.

5. Установлено увеличение стимулированного образования кислородных радикалов у крыс линии Wistar/S по сравнению с линией Wistar/R; в растительных клетках, культивируемых in vitro; при тепловом шоке в бактериях £. coli.

п

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Дикалов С.И., Кирилюк ИА., Григорьев ИА. и Володарский Л.Б. "2Н-имидазол-N-оксиды как спиновые ловушки" Известия Академии наук, серия химическая (1992) 5, 1064-1068.

2. Dikalov S.I., Rumyantseva G.V., Weinei L.M., Sergeev D.S., Frolova E.I., Godovikova T.S. and Zaritova V.F. "Hydroxyl radical generation by oligonucleotide derivatives of anthracycline antibiotic and synthetic quinone" (1991) Chem.Biol.Interaction 77, 325-339.

3. Dikalov S.I., Rumyantseva G.V., Piskunov A.V. and Weiner L.M. "Role of quinoBe-iron (III) interaction in NADPH-dependant enzymatic generation of hydroxy 1 radicals" (1992) Biochemistry 31, 8947-8953.

4. Dikalov S., Alov P. and Rangelova D. "Oxygen consumption study of quinone reduction by ascoibate and glutathione. Role of iron ions chelation" (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 195, 1, 113-119.

5. Dikalov S., Khramtsov V. and Zimmer G. "Determination of rate constants of reaction of thiols with superoxide radical by EPR. Critical remarks on spectrophotometrical approaches" (1994) Arch. Biochem. Biophys. In Press

6. Salganik R.I., Solovyova NA., Dikalov S.I., Grishaeva O.N., Semenova LA. and Popovsky A.V. "Inherited enhancement of hydroxyl radical generation and lipid peroxidation in the S strain rats results in DNA rearrangements degenerative diseases and premature aging" (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 199,726-733. _ , „

Подписано в печать 24.11.94. Фор/ат 60x84/16

Печ.листоЕ I,?, Заказ ¡," 156 Тирад 100

Отпечатано на ротапринте Института катализа СО РАН .Новосибирск

is