Кислородные метаболиты в иммунном ответе насекомых тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ
|
Комаров, Денис Александрович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Новосибирск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2008
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
01.04.17
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ И ГОРЕНИЯ
; На правах рукописи
V) I < < I ' т
Комаров Денис Александрович
КИСЛОРОДНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ НАСЕКОМЫХ
01.04 17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
003167002
Новосибирск 2008
Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук
Научные руководители
кандидат химических наук Слепнева Ирина Алексеевна
доктор химических наук Храмцов Валерий Владимирович
Официальные оппоненты
кандидат химических наук Тарабан Марк Борисович
доктор биологических наук Колосова Наталья Гориславовна
Ведущая организация
Институт химической физики им Н Н Семенова РАН, Москва
Защита состоится 9 апреля 2008 г в 16 30 часов на заседании диссертационного совета Д 003 014 01 в Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу, ул Институтская 3, Новосибирск, 630090
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН
Автореферат разослан 2 Z февраля 2008 г
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор химических наук
А А Онищук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Промежуточные продукты восстановления молекулярного кислорода до воды, такие как супероксидный радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал, принимают участие в иммунных реакциях многих живых организмов в качестве цитотоксических частиц против патогенных организмов В литературе обсуждается также возможность участия кислородных метаболитов в иммунных реакциях насекомых Однако существующие на сегодняшний день исследования в этой области ограничиваются лишь единичными работами, которые не позволяют сделать однозначный вывод об образовании и участии этих частиц в защитны* реакциях насекомых
Одним из основных механизмов защиты насекомых является процесс инкапсуляции, во время которого вокруг патогенного организма происходит формирование меланиновой капсулы Ключевой фермент меланизации, фенолоксидаза (ФО), окисляет тирозин до 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и далее до соответствующего ДОФА-хинона. Цепь последующих превращений приводит к образованию нерастворимого полимера меланина Предполагается, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием потенциально токсичных семихиноновых радикалов, в частности ДОФА-Семихиноновйго радикала Однако до сих пор не существовало экспериментальных доказательств образования этих частиц в процессе меланизации у насекомых Некоторые исследователи полагают, что гипотетические семихиноновые интермедиа™ меланизации могут взаимодействовать с- молекулярным кислородом, восстанавливая его до супероксидного радикала Существует ряд работ, в которых сообщается об Образовании супёрбксидного радикала в процессе меланизации у насекомых В этих работах супероксидному радикалу приписывается роль цитотоксйчной частицы, ответственной за разрушение чужеродного организма в процессе его инкапсуляции Однако авторы этих работ для регистрации супероксидного радикала применили недостоверный метод, поэтому полученные ими результаты вызывают сомнения С другой стороны существуют работы, в которых авторам не удалось зарегистрировать
г >,
п I I
1 V 5
и,
образование супероксиднрго радикала $ .„.Егрецесш.1 меланизации у насекомых _ , ,г
Таким образом, на сегодняшний день не существует достоверных доказательств образования и участия супероксидного радикала,в иммунных реакциях насекомых, и механизмы, приводящие к разрушению чужеродного материала в процессе иммунного ответа, остаются недостаточно изученными , -
Основной целью настоящей работы являлось определение природы -частиц, образующихся в процессе меланизации, которме к могли бы выступать ь качестве цитотоксических против патогенных организмов в процессе иммунного ответа насекомых ..Дляч успешного выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи
1 Выяснить, сопровождается ли процесс меланизации у насекомых образованием супероксидного радикала
2 Зарегистрировать^« образование семихиноновых радикалов в процессе >'!-меланизации у насекомых
3 Изучить роль супероксидного и семихиноновых радикалов в иммунных реакциях насекомых - г
Научная новизна. В настоящей работе впервые было показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием такой цитотоксической частицы, как ДОФА-семихиноновый радикал. ' Была изучена рорь ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в иммунном ответе насекомых.
Впервые было показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит образование перекиси водорода^ Зарегистрировать образование супероксидного радикала при ошспении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами не удалось^ Однако, учитываяг обнаруженное влияние супероксид дисмутазы на выход перекиси в этом процессе, был сделан вывод, что процесс окисления ДОФА фенолоксидазой сопровождается образованием супероксидного радикала
Было обнаружено взаимодействие между ДОФА и супероксидным радикалом, в результате которого, происходит образование ДОФА- •
семихинонового радикала и перекиси водорода Определена константа скорости этого взаимодействия, к = (3.4 ± 0 6)*105 M'V1.
Показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, при этом скорость генерации перекиси увеличивается в ответ на инъекцию иммунного стимулятора Было также показано, что генерация перекиси водорода в процессе меланизации у насекомых приводит к образованию высоко токсичного гидроксильного радикала
На основании результатов, полученных в настоящей работе, а также анализа литературных данных, был предложен механизм уникального, направленного на патогенный организм, цитотоксического действия, согласно которому частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала при иммунном ответе насекомых, могут являться такие интермедиа™ процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал
Практическая ценность. В работе проведено детальное исследование процессов, протекающих на ранних стадиях меланизации у насекомых, показано какие частицы, образующиеся в этом процессе, могут принимать участие в реализации цитотоксического действия по отношению к чужеродным организмам Полученные результаты могут быть использованы при разработке способов защиты сельскохозяйственных популяций насекомых от различных инфекций, а также при поиске препаратов для регуляции численности насекомых-вредителей
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях VI международная конференция имени Воеводского «Физика и «химия элементарных химических процессов» , (Новосибирск, Россия, 2002), VIII международная школа молодых 7„ ученых «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применения» (Казань, Россия, 2004), международная конференция «Современное достижения магнитного резонанса» (Казань, Россия, 2004), сибирской зоологической конференции (Новосибирск, Россия, 2004), объединенная международная конференция «ЭПР спиновых ловушек» и «ЭПР спектроскопия и томография в
биологических системах» (Коламбус, США, 2005), 4-ая международная конференция по нитроксильным радикалам «Синтез, свойства и применение нитроксидов» (Новосибирск, Россия, 2005)
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 4 статьях, а также, в 6 тезисах докладов на российских и международных симпозиумах и конференциях
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, благодарностей, списка цитируемой литературы, включающего 140 наименований, и двух приложений.^ Работа изложена на 88 страницах, содержит 2 таблицы и 30 рисунков
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ v „ > г
Во введении аргументирована актуальность проблемы, решению которой- посвящена диссертация, сформулированы цели и задачи исследования ^ ■
В первой главе представлен обзор литературы, посвященный кислородным метаболитам в биологических системах В лервой части главы рассмотрены молекулярные механизмы токсичности кислорода Коротко описаны физико-химические свойства интермедиатов восстановления молекулярного кислорода до воды, обсуждается их цитотоксическое действие
Во второй части главы описаны молекулярные механизмы токсичности соединений хинонового типа Рассмотрен механизм токсичности, основанный на ковалентном связывании « хиноноб с, важными биологическими макромолекулами, а также механизм, основанный на образовании высоко реакционных семихиноновых радикалов и их участии в активации молекулярного кислорода
Третья часть главы посвящена обзору современных методов регистрации кислородных метаболитов в биологических системах Описаны методы регистрации супероксидного радикала, спектрофотометрические методы с использованием цитохрома с и нитросинего тетразолия, флюоресцентный метод с использованием дигидроэтидиума Подробно рассмотрены методы регистрации супероксидного радикала с помощью ЭПР метод спиновых
ловушек, метод с использованием пространственно затрудненных гидроксиламинов, а также метод с использованием триарилметильного С-центрированного радикала Обсуждаются достоинства и недостатки различных методов Рассмотрены способы регистрации перекиси водорода и-тидроксильного радикала Описан метод спиновой стабилизации орто-семихмноновых радикалов, применяемый для их регистрации методом ЭПР
В четвертой часто главы описаны основные защитные механизмы насекомых фагоцитоз и инкапсуляция Обсуждается роль и возможные механизмы образования кислородных метаболитов в этих процессах
Во второй глав % диссертации приведено описание материалов и методов, использованных в работе
Глава третья посвящена изучению процессов, протекающих при меланизации у насекомых, и выявлению частиц способных выступать в качестве цитотоксических против патогенных организмов В первой части главы приводятся результаты экспериментов по регистрации супероксидного радикала в системе, моделирующей процесс меланизации -при окислении ДОФА очищенной фенолоксидазой
Для регистрации возможного образования супероксидного радикала в
^ )
процессе окисления ДОФА фенолоксидазой использовали спиновую ловушку 5-
диэтоксифосфорил-5-метил-1-пирролин-Ы-оксид (ЭЕРМРО) В присутствии РЕРМРО в
фенолоксидазной системе при разных концентрациях ДОФА и активностях фенолоксидазы
образования спиновых аддуктов не
наблюдали (Рис 1 а) Было
1
обнаружено, что присутствие даже низкой концентрации ДОФА в стандартной системе генерации супероксидного радикала
а
3350 3400 3450 3500
магнитное поле, Гс
Рис. 1 Спектры ЭПР, полученные в присутствии 10 мМ РЕРМРО а при окислении ДОФА (1 мМ) фенолоксидазой (20 ед/мл), 6. при окислении }йсантина (0 05 мМ) ксантиноксидазо^ (0 05 ед/мя), в. то же, что 6, но в присутствии 10 мкМ ДОФА Буфер 50 мМ К, №а-фосфатный, рН 7 4, 50 мкМ ДТПА
(ксантиноксидазная система) приводит к значительному уменьшению интенсивности наблюдаемого спектра ЭПР аддукта йЕРМРО-ООН (Рис 1 б и 1 в) Полученный результат позволил предположить, что ДОФА взаимодействует с 02~, конкурируя со спиновой ловушкой,
С целью преодоления конкуренции между ловушкой и ДОФА, для регистрации 02' в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой применили
пространственно затрудненный гидроксиламин, 1-гидрокси-З-карбоксипирролидин (СР-Н),
который неспецифично окисляется супероксидным радикалом с образованием - стабильного нитроксильного радикала СР* Как видно из рисунка 2, СР-Н окислялся в фенолоксидазной системе, однако, присутствие супероксид дисмутазы (СОД) не ингибировало окисление СР-Н В тоже время специфичный ингибитор фенолоксидазы, фенилтиомочевина (ФТМ), полностью ингибировал окисление СР-Н в этой системе Эти результаты указывают на то, что 02- не принимает участия в окислении СР-Н в фенолоксидазной системе Возможными окислителями СР-Н в данном случае могут являться хиноновые/семихиноновые интермедиа™ процесса меланизации
Таким образом, в данных экспериментах образование супероксидного радикала в системе, моделирующей процесс меланизации - при окислении ДОФА фенолоксидазой, зарегистрировано не было Тем не менее, полученные результаты не позволили исключить возможность его образования в этом процессе. Вполне вероятно, что образование супероксидного радикала не было зарегистрировано вследствие его эффективного взаимодействия с ДОФА
30
О , 10 20 , 30 40
время, с
рис. 2, Кинетики/гбрфзордни.Я^адикала СР* при окислении 1 мй СР-Н в фенолоксидазной системе (•) 1 мМ ДОФА и 5 ед/мл ФО, (о) тоже, что (•), но в присутствии 200 ед/мл СОД, (х> то>ке, ¥го (•), но в присутствии ФТМ Буфер 50 мМ К, ^-фосфатный, рН 7 4, 50 мкМ ДТГТА - ~
Следующая часть работы г1освящена регистрации ДОФА-семихинонового радикала в процессе меланизации у насекомых Для регистрации семихиноновых интермедиатов процесса меланизации применили метод спиновой стабилизации орто-семихинонов ионами
двухвалентных металлов При окислении ДОФА в гемолимфе личинок Gallería mellonella в присутствии ионов Мд2+ наблюдали спектр ЭПР,
3475 3480 3485 магнитное поле, Гс
Рис. 3. Спектры ЭПР, полученные в присутствии 0 5 М Мд2+ а. при окислении ДОФА (10 мМ) в гемолимфе б теНопеИа, 6. при окислении ДОФА (10 мМ) фенолоксидазой (10 ед/мл), в. то же, что а, но в присутствии фенилтиомочевины Буфер 50 мМ Трис-НС1, рН 7 4, 50 мкМ ДТПА
приведенный на рисунке 3 а Идентичный спектр ЭПР был получен при окислении ДОФА очищенной фенолоксидазой в присутствии ионов Мд2+ (Рис 3 б) Наблюдаемый спектр ЭПР был идентифицирован как спектр комплекса ДОФА-семихинонового радикала с Мд2+ При добавлении в гемолимфу ФТМ спектр не наблюдали (Рис 3 в) Полученные данные показывают, что в процессе меланизации в гемолимфе Б теНопеИа
происходит генерация ДОФА-семихинонового радикала
Образование ДОФА-семихинона является следствием активности фенолоксидазы
Было показано, что
стационарная концентрация ДОФА-семихинонового радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой зависит от активности фермента
5 10 15 активность ФО, ед/мл Рис 4 Зависимость интенсивности ЭПР
спектра дофа-семихинонового радикала от (рис 4) В результате анализа активности фенолоксидазы при окислении *
дофа (ю мМ) фенолоксидазой в полученной зависимости было присутствии 0 5 М Мд2+ Буфер 50 мМ Трис-
на, рН 7 4, 50 мкм дтпа показано, что скорость генерации
ДОФА-семихинонового радикала в фенолоксидазной системе линейно зависит от активности фермента Этот результат позволил предположить, что ДОФА-семихинон образуется непосредственно на ферменте, в результате одноэлектронного окисления ДОФА фенолоксидазой
С целью выяснить, принимает ли ДОФА-семихиноновый радикал участие в цитотоксических реакциях при инкапсуляции патогенных организмов в гемолимфе насекомых, был проведен эксперимент, в котором сравнивали образование ДОФА-семихинона в гемолимфе личинок в теНоПеНа нативных и инфицированных грибком МеЬагЬшит атворЬа. Стационарная концентрация ДОФА-семихинона в гемолимфе инфицированных насекомых была в ~ 2 раза ниже, чем в гемолимфе нативных насекомых Было также показано, что скорость образования ДОФА-хинона в гемолимфе инфицированных насекомых в ~ 4 раза ниже, чем в гемолимфе нативных насекомых На основании полученных результатов сделан вывод об'участии ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в реализации микробицидного действия при инкапсуляции патогенных организмов в гемолимфе насекомых
Третья часть главы посвящена изучению взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом Выше было сделано предположение, что ДОФА взаимодействует с супероксидным радикалом Для проверки этого предположения изучили влияние ДОФА на окисление СР-Н супероксидным радикалом Присутствие 'ДОФА ингибировало окисление СР-Н супероксидным радикалом,
подтверждая предположение о существовании реакции между ДОФА и Ог" Зависимое^'' концентрации радикала СР*, образующегося при окислении СР-Н супероксидным
концентрация ДОФА, мкМ
Рис. 5 Влияние ДОФА на генерацию радикала СР' лри добавлении 5 мкл раствора К02 в ДМСО к 1 мМ раствору СР-Н Буфер 50 мМ К, Ыа-фосфатный, рН 7 4, 50 мкМ ДТПА
радикалом, от концентрации ДОФА (Рис 5) позволила оценить константу скорости взаимодействия ДОФА с Ог", кдо<рд ~ 5*105 М^с"1
Было сделано предположение, что в результате взаимодействия ДОФА с супероксиднь)мЧ!радикалом происходит образование ДОФА-семихинонового радикала и перекиси водорода* ОН2 + 0| .....>0; + Н202
Для проверки 'этого предположения изучили
образование ДОФА-семихинона в процессе окисления ДОФА супероксидным радикалом,
генерируемым ксантиноксидазной системой С помощью метода спиновой стабилизации орто-семихинонов было показано, что ДОФА-семихиноновый радикал образуется в данной системе (Рис б, вставка) При этом стационарная концентрация ДОФА-семиихинона зависит от активности ксантиноксидазы, те от скорости генерации супероксидного радикала (Рис б)
Для того, чтобы показать, что при взаимодействии ДОФА с супероксидным радикалом происходит образование перекиси водорода, изучили образование Нг02 при фотолизе раствора ДОФА Известно, что УФ-фотолиз растворов гидрохинонов приводит к образованию соответствующего семихинона и супероксидного радикала. Таким образом, при УФ-фотолизе раствора ДОФА должна происходить генерация супероксидного радикала, который будет взаимодействовать с ДОФА, и, если предположение относительно реакции ДОФА с Ог" верно, такой процесс должен сопровождаться образованием перекиси водорода
* Здесь и далее в уравнениях реакций будут использоваться обозначения С3Н2 - ДОФА, О5 - ДОФА-семихинон, 0 - ДОФА-хинон
800
ООО 0 05 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 активность ксантиноксидазы, ед/мл
Рис. 6 Зависимость интенсивности ЭПР спектра ДОФА-семихинонового радикала от активности ксантиноксидазы Вставка ЭПР спектр ДОФА-семихинона, полученный при окислении ксантина (0 05 мМ) ксантиноксидазой (0 1 ед/мл) в присутствии 10 мМ ДОФА и 05 И Zn2+ Буфер 50 ММ Трис-HCI, рН 7 4, 50 мкМ ДТПА
Было показано, что при фотолизе раствора ДОФА происходит образование Н202 -С целью выяснить, образуется ли Н202 в результате взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом, изучили влияние СОД на выход перекиси водорода в данной системе В присутствии насыщающей концентрации СОД выход перекиси водорода при фотолизе раствора ДОФА с хорошей точностью уменьшался в два раза, что согласуется со стехиометрией реакции ДОФА с 02Л и реакции дисмутаций 022 0| —» 02 + Н202
Зависимость выхода перекиси водорода при фотолизе раствора ДОФА от концентрации СОД (Рис 7) позволила определить константу скорости
взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом, Ццофа = (3 4 ± 0 б)*105 М_1с 1 Полученное значение константы скорости реакции ДОФА с Ог1 хорошо согласуется с~ оценкой, проведенной ранее в эксперименте с использованием СР-Н в качестве конкурирующего вещества, и достаточно близко к константам скоростей реакций других катехолов с супероксидным радикалом, известным из литературы
В четвертой части главы представлены результаты экспериментов по регистрации перекиси водорода в процессе меланизации Выше было показано, что в процессе меланизации в результате одноэлектронного окисления ДОФА происходит образование ДОФА-семихинонового радикала Следует ожидать, что такой процесс сопровождается образованием супероксидного радикала, согласно реакции ОН2 + 02 —>0' + 0| + 2 Н+ Ранее, методом ЭПР зарегистрировать образование О/ в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой не удалось, что, по всей видимости, связано с высокой эффективностью взаимодействия супероксидного радикала с ДОФА Как было показано выше, взаимодействие ДОФА с
о
см
X в: з
З'
го
а,
х
а)
х о
20
15
У/
-«Г—
(3 = 0 9997 Чи -' * "Г.....1 1 1' Т' —-
О 10 20 -30 40 50 60 70 концентрация СОД, нМ
1800
Рис. 7. Зависимость выхода Н202 при УФ-фотолизе раствора ДОФА (01 тМ) от концентрации СОД Буфер 50 мМ К, фосфатный, рН 7 4, 50 мкМ ДТПА
супероксидным радикалом приводит к образованию перекиси водорода Тогда/ процесс окисления ДОФА фенолоксидазой должен сопровождаться образованием перекиси водорода
Действительно, в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит образование перекиси водорода, при этом выход Н2О2 уменьшается в присутствии СОД (Рис 8). Полученный результат указывает на то, что образование перекиси водорода в
фенолоксидазной системе
происходит в результате взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом Таким образом, при окислении ДОФА фенолоксидазой действительно происходит образование супероксидного радикала Однако, принимая во внимание обнаруженную способность ДОФА эффективно взаимодействовать с 02", маловероятно, что супероксидный радикал принимает участие в цитотоксических реакциях при инкапсуляции патогенных организмов в гемолимфе насекомых
Ингибирование выхода Н2О2 супероксид дисмутазой в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой составляло около 25 % и не достигало 50 %, как это было при фотолизе раствора ДОФА Этот результат означает, что лишь часть перекиси водорода, образующейся при окислении ДОФА фенолоксидазой, образуется в результате взаимодействия супероксидного радикала с ДОФА Другая часть перекиси водорода образуется независимо от супероксидного радикала, по всей видимости, в результате двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода на ферменте ОН2 + 02-^-40 + Н202
Цитотоксический потенциал перекиси водорода позволил предположить, что ее образование в процессе меланизации играет важную роль в защитных реакциях насекомых Чтобы проверить это предположение, было
X
о А-1-!-,-.-1—
0 1 2 3 4 5
концентрация ДОФА, мМ
Рис. 8. Образование Н202 при окислении ДОФА фенолоксидазой (•) окисление ДОФА 5 ед/мл ФО, (о) тоже, что (•), но в присутствии 200 ед/мл СОД Буфер 50 мМ К, №-фосфаггный, рН 7 4, 50 мкМ ДТПА
О 1 4 24
время после инъецирования, часы
Рис. 9. Скорость генерации Н202 при окислении ДОФА (1 мМ) в гемолимфе личинок б. теНопеНд в присутствии 1 мМ №N3 (п = 7 - 20; * Р < 0.05). Буфер: 50 мМ К, Ыа-фосфатный, рН 7.4, 50 мкМ ДТПА.
изученб образование Нг02 в гемолимфе иммуномодулированных насекомых. Личинкам G, mellonella инъецироёали суспензию убитых формалином бактериальных клеток Bacillus ttiuiihgieris'is. Контрольную группу насекомых инъецировали стерильным раствором NaCI. Через 1, 4 и 24 часа после инъекции гемолимфу выделяли. Для ингибирования эндогенной
каталазы к выделенной гемолимфе
добавляли №N3, после чего определяли скорость генерации перекиси водорода. Как видно на рисунке 9, в течение четырех часов после инъекции в гемолимфе иммуномодулированных насекомых наблюдалось достоверное увеличение скорости генерации Н202 по сравнению с контрольными насекомыми. На основании полученных результатов сделан вывод',: что генерация перекиси водорода в процессе меланизации играет существенную роль в защитных реакциях насекомых против патогенных организмов. ' г;;;-''
Токсические свойства перекиси
а
водорода обусловлены ее способностью восстанавливаться с образованием высоко
реакционноспособного гидроксильного радикала.
Следующая часть работы посвящена регистрации
гидроксильного радикала в процессе меланизации у насекомых. Для регистрации возможного образования НО' в
б в
3440
3460 3480 3500 3520 магнитное поле, Гс
Рис. 10. Спектры ЭПР, полученные в гемолимфе в. те11опе11а в присутствии 1 мМ йаЫз и спиновых ловушек; а. 50 мМ ОМРО; 6. 50 мМ РОВЫ и 2 % ДМСО; в. 50 мМ РСШ и 2 % этилового спирта. Буфер: 50 мМ К, [Ма-фосфатный, рН 7.4, 50 мкМ ЭДТА.
гемолим'фе- насекомых использовали метод спиновых ловушек Для ингибирования эндогенной кЬтёлазы в гемолимфу добавляли №N3 В присутствии в гемолимфе спиновой ловушки 5,5-диметил-1-пирролин-Ы-оксида (ОМРО) образования спиновых аддуктов не наблюдали (Рис 10 а) Полученный результат объяснили низкой специфичностью взаимодействия ОМРО с гидроксильным радикалом, а также невысокой стабильностью аддукта ЭМРО-ОН, В связи с этим была предпринята попытка зарегистрировать образование вторичных радикалов при добавлении в гемолимфу 2 % ДМСО или этилового спирта В качестве спиновой ловушки в этих экспериментах использовали о-(4-пиридил-1-оксид)-1\1-третбутилнитрон (РОВ1М) ЭПР спектры, приведенные на рисунках 10 б и 10 в, были получены в гемолимфе в 'присутствии РОВЫ и ДМСО или этиловЬго спирта, соответственно
При добавлении в гемолимфу 5 мкМ Ре2+ интенсивность наблюдаемых ЭПР спектров существенно возрастала (Рис 11а и 11 б) Константы СТВ наблюдаемых спиновых аддуктов хорошо соответствуют известным из литературы константам СТВ спиновых аддуктов РОВМ с метильным и а-гидроксиэтильным радикалами Образование
вторичных радикалов "СН3 и "СН(ОН)СНз в присутствии ДМСО и этилового спирта, соответственно, подтверждает предположение о генерации гидроксильного
радикала в гемолимфе насекомых Более того, в присутствии в гемолимфе 5 мкМ Яе2* и спиновой ловушки
.А
ЭМРО был получен низкоин^енсивный спектр аддукта ОМРО-ОН (Рис 11 в), что также указывает на генерацию НО* в гемолимфе. При добавлении, в
3440
3460 3480 3500 3520 магнитное поле, Гс
Рис. 11. Спектры ЭПР, полученные в гемолимфе в теНопеНа в присутствии 1 мМ-ЫаЫ3, 5 мкМ Ре2+ и спиновых ловушек а. 50 мМ РОВЫ и 2 % ДМСО, б. 50 мМ POBN и 2 % этилового спирта, в 50 мМ РМРО г. То же, что 6, но в присутствии 200 ед/мл каталазы вместо №N3 Буфер 50 мМ К, N3-фосфатный, рН 7 4, 50 мкМ ЭДТА
гемолимфу каталазы вместо №N3 образования спиновых аддуктов не наблюдали (Рис, 11 г) Этот результат указывает на то, что образование НО* в гемолимфе является следствием генерации перекиси водорода в процессе меланизации
Таким образом, в процессе меланизации в гемолимфе насекомых происходит генерация перекиси водорода и ее восстановление до высоко токсичного гидроксильного радикала Образование гидроксильного радикала в процессе меланизации может играть важную роль в разрушении чужеродного материала прй инкапсуляции патогенных организмЬв в гемолимфе насекомых - ' ''
. , ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе было показано, что на начальной стадии процесса меланизации в гемолимфе насекомых протекают следующие реакции
сгн21 о2—^-><а + н2о2
ОН2 + 02 —0= + 0\ + 2 Н+
0Н2+0|->0' +Н202
Н202 —5^->Н0'+Н0"
Было показано, что процесс меланизации сопровождается образованием таких частиц, как ДОФА-семихиноновый радикал, ДОФА-хинон, супероксидный радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал
До сих пор считалось, что частицей, ответственной за разрушение чужеродного материала в гемолимфе насекомых, является супероксидный радикал В настоящей работе было обнаружено, что супероксидный радикал эффективно взаимодействует с ДОФА (к = 3 4*105 М^с"1) Учитывая этот факт, а также известную из литературы способность меланина взаимодействовать с Ог^ (к ~ 106 М"1^1), можно сделать вывод,, что супероксидный радикал сам по себе не принимает участия в цитотоксических реакциях против патогенных организмов Полученные в настоящей работе результаты показывают, что частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала в гемолимфе насекомых, могут являться ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал
Отличительной особенностью строения насекомых является открытая кровеносная система. В отличие от млекопитающих, гемолимфа насекомых циркулирует не по замкнутым сосудам, а непосредственно в полости тела Такая особенность в строении требует наличия механизмов локализации образования цитотоксических частиц, так как их свободное распространение в условиях открытой кровеносной системы могло бы привести к повреждению не только клеток чужеродного организма, но и собственных органов насекомого Свободное распространение хиноновкх/семихинбновых интермедиатов процесса меланизации, в том числе ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона, в гемолимфе насекомых затруднено, -так как они будут взаимодействовать с образующейся меланиновой капсулой В то же время в литературе есть данные, что у насекомых различных видов регистрируется высокая активность каталазы По всей видимости, каталаза служит для эффективного разложения перекиси водорода, образующейся в гемолимфе в процессе меланизации/ таким образом защищая от повреждения собственный 'органы насекомого При этом цитотоксическая активность перекиси водорода может быть локализована внутри меланиново'й капсулы, так что ее восстановление до высоко токсичного гидроксильного радикала протекает -ё' непосредственной близости к поверхности патогенного организма * Таким образом, генерация таких интермедиатов процесса мела~низац-йи;' кай ДОФА-сейихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекиси' водорода и гидроксильного радикала в процессе иммунного ответа в гемолимфе насекомых, может представлять собой уникальный механизм локального и направленного на патогенный организм цитотоксического действия
ВЫВОДЫ
1 Показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованием цитотоксичного ДОФА-семихинонового радикала Была изучена генерация ДОФА-семихинона, а также ДОФА-хинона в гемолимфе нативных и инфицированных насекомых Сделан
вывод об участии этих частиц в реализации цитотоксического действия при инкапсуляции патогенных организмов в гемолимфе насекомых
2 Показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит оёрс&ование перекиси водорода Выход перекиси водорода уменьшается в присутствии супероксид дисмутазы, что свидетельствует об участии супероксидного радикала в этом процессе Однако прямыми методами зарегистрировать образование супероксидного радйкала в этой системе не удается
3 Обнаружено взаимодействие между ДОФАг и супероксидным радикалом, в результате которогб происходит образование ДОФА-семихинонового радикала и перекиси водорода Определена константа скорости этого взаимодействия, к = (3 4 ± 0 6)*10$
4 Показано, что образование перёкиси водорода в фенолокСйдазной системе происходит по двум механизмам в результате взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом, а также в результате двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода на ферменте
5 Показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, при этом скорость генерации перекиси увеличивается е 'ответ на инъекцию иммунного стимулятора Генерация перекиси водорода в гемолимфе насекомых приводит к образованию высоко токсичного гидроксильного радикала
6 На основании полученных рёзультатов, а также анализа литературных данных, предложен механизм направленного на патогенный организм цитотоксического действия, в основе которбго" лея&гг ' генерация таких интермедиатов процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекиси водорода и гидроксильного радикала
Список работ, опубликованных'frd теме диссертации:
1 Slepneva I А , Komarov D А , Glupov V'VSerebrov V.V , Khramtsov V V Influence of fungal infection on the DOPA-semiquinone and DOPA-quinone production m haemolymph of Galleria mellonella larvae // Biochem Biophys Res Commun - 2003 - V 300 - P 188-191
2 ■r Komarov D A., Slepneva I A , Glupov V V , Khramtsov V V Detection of
- free radical formation in haemolymph of insects by EPR spectroscopy //
- Appl Magrv'Reson - 2005 -V 28 - P 411-419
3 Komarov, D A ; Slepneva, I A , Glupov, V V , Khramtsov, V V Superoxide and hydrogen peroxide formation during enzymatic oxidation of DOPA by phenoloxidase // Free Radic Res 39, 853-858 (2005)
4 Комаров Д.A , Слепнева И A , Дубовский И М , Гризанова Е В , Храмцов В В., Глупов В В Генерация супероксидного радикала и перекиси водорода в гемолимфе насекомых в процессе иммунного ответа // Доклады Академии Наук- Т 411, №3 - С 420-423
5 Slepneva, I A, Komarov, D А , Glupov, V V , Serebrov, V V , Khramtsov, V V An electron spin resonance study of the role of DOPA o-semiquinones in the immune response of insects // Book of Abstracts of VI Voevodsky Conference Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes -Novosibirsk, Russia - July 21-25, 2002 - P 95
6 Komarov D A , Slepneva I A , Glupov V V , Khramtsov V V Detection of free radicals formation in haemolymph of insects by EPR spectroscopy // Book of Abstracts of VIII International Youth Scientific School Actual Problems of Magnetic Resonance and Its Application - Kazan, Russia -August 15-19, 2004 - P 53
7 Komarov D A , Slepneva I A , Glupov V V , Khramtsov V V Detection of free radicals formation in haemolymph of insects by EPR spectroscopy // Book of Abstracts of The International Conference Modern Development of Magnetic Resonance - Kazan, Russia - August 15-20, 2004 - P 198
8 Глупов В В , Слепнева И А , Комаров Д А , Серебров В В , Хвощевская М Ф , Лозинская Я Л Ключевые механизмы иммунитета насекомых // Тезисы Докладов Сибирской Зоологической Конференции -Новосибирск - 15-22 сентября, 2004 - С Збб
9 Slepneva I A , Komarov D A , Glupov V V , Khramtsov V V Detection of free radicals formation in haemolymph of insects by EPR spectroscopy // Book of Abstracts of 8th International EPR Spin Trapping Meeting & 11th In Vivo EPR Spectroscopy and Imaging - Columbus, OH, USA.- September 4-8, 2005 - P 89
10 Slepneva I A., Komarov D A , Glupov V V , Khramtsov V V Spin trapping studies of free radicals generation in haemolymph of insects // Book of Abstracts of 4th International Conference on IMitroxide Radicals Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides - Novosibirsk, Russia - September 20-24, 2005 - P 101
Подписано к печати 19 февраля 2008г
Тираж 100 экз Заказ № 714 Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел 335-66-00
Введение.
1. Литературный обзор. Кислородные метаболиты в биологических системах.б
1.1. Молекулярные механизмы токсичности кислорода.б
1.2. Молекулярные механизмы токсичности хиноновых соединений.
1.3. Методические подходы к изучению кислородных метаболитов в биологических системах.
1.3.1. Регистрация супероксидного радикала.
1.3.2. Регистрация перекиси водорода.
1.3.3. Регистрация гидроксильного радикала.
1.3.4. Регистрация семихиноновых радикалов. Метод спиновой стабилизации орто-семихинонов.
1.4. Цитотоксические частицы в иммунном ответе насекомых.
2. Материалы и методы.
3. Экспериментальная часть. Цитотоксические интермедиаты процесса меланизации.
3.1. Регистрация супероксидного радикала в процессе меланизации.
3.2. Регистрация ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в гемолимфе насекомых.
3.3. Изучение взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом.
3.4. Регистрация перекиси водорода в процессе меланизации.
3.5. Регистрация гидроксильного радикала в гемолимфе насекомых.
На сегодняшний день достоверно известно, что интермедиаты восстановления молекулярного кислорода до воды, такие как супероксидный радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал, принимают участие в иммунных реакциях многих живых организмов в качестве цитотоксических частиц против патогенных организмов. В литературе обсуждается также возможность участия кислородных метаболитов в иммунных реакциях насекомых. Однако существующие на сегодняшний день исследования в этой области ограничиваются лишь единичными работами, которые не позволяют сделать однозначный вывод об образовании и участии этих частиц в защитных реакциях насекомых.
Актуальность проблемы. Одним из основных механизмов защиты насекомых является процесс инкапсуляции, во время которого вокруг патогенного организма происходит формирование меланиновой капсулы. Ключевой фермент меланизации, фенолоксидаза, окисляет тирозин до 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и далее до соответствующего ДОФА-хинона. Цепь последующих превращений приводит к образованию нерастворимого полимера меланина. Предполагается, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием потенциально токсичных семихиноновых радикалов, в частности ДОФА-семихинонового радикала. Однако до сих пор не существует экспериментальных доказательств образования этих частиц в процессе меланизации у насекомых. Некоторые исследователи полагают, что гипотетические семихиноновые интермедиаты меланизации могут взаимодействовать с молекулярным кислородом, восстанавливая его до супероксидного радикала. Существует ряд работ, в которых сообщается об образовании супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых. В этих работах супероксидному радикалу приписывается роль цитотоксичной частицы, ответственной за разрушение чужеродного организма в процессе его инкапсуляции. Однако, так как авторы этих работ для регистрации супероксидного радикала применили недостоверный метод, полученные ими результаты вызывают сомнения. С другой стороны существуют работы, в которых авторам не удалось зарегистрировать образование супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых.
Таким образом, на сегодняшний день не существует достоверных доказательств образования и участия супероксидного радикала в иммунных реакциях насекомых, и механизмы, приводящие к разрушению чужеродного материала в процессе иммунного ответа, остаются изученными недостаточно.
Основной целью настоящей работы являлось определение природы частиц, образующихся в процессе меланизации, которые могли бы выступать в качестве цитотоксических против патогенных организмов в процессе иммунного ответа насекомых. Для успешного выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Выяснить, сопровождается ли процесс меланизации у насекомых образованием супероксидного радикала.
2. Зарегистрировать образование семихиноновых радикалов в процессе меланизации у насекомых.
3. Изучить роль супероксидного и семихиноновых радикалов в иммунных реакциях насекомых.
Научная новизна. В настоящей работе впервые было показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием такой цитотоксической частицы, как ДОФА-семихиноновый радикал. Была изучена роль ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в иммунном ответе насекомых.
Впервые было показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит образование перекиси водорода. Зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами не удалось. Однако, учитывая влияние супероксид дисмутазы на выход перекиси в этом процессе, был сделан вывод, что процесс окисления ДОФА фенолоксидазой сопровождается образованием супероксидного радикала.
Было обнаружено взаимодействие между ДОФА и супероксидным радикалом, в результате которого происходит образование ДОФА-семихинонового радикала и перекиси водорода. Определена константа скорости этого взаимодействия, к = (3.4 ± 0.б)*105 М^с"1.
Показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, при этом скорость генерации перекиси увеличивается в ответ на инъекцию иммунного стимулятора. Было также показано, что генерация перекиси водорода в процессе меланизации у насекомых приводит к образованию высоко токсичного гидроксильного радикала.
На основании результатов, полученных в настоящей работе, а также анализа литературных данных, был предложен механизм уникального, направленного на патогенный организм, цитотоксического действия, согласно которому частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала при иммунном ответе насекомых, могут являться такие интермедиа™ процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал.
Выводы.
1. Показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованием цитотоксичного ДОФА-семихинонового радикала. Была изучена генерация ДОФА-семихинона, а также ДОФА-хинона в гемолимфе нативных и инфицированных насекомых. Сделан вывод об участии этих частиц в реализации цитотоксического действия при инкапсуляции патогенных организмов в гемолимфе насекомых.
2. Обнаружено взаимодействие между ДОФА и супероксидным радикалом, в результате которого происходит образование ДОФА-семихинонового радикала и перекиси водорода. Определена константа скорости этого взаимодействия, которая составила к = (3.4 ± 0.б)*105 М^с"1.
3. Показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит образование перекиси водорода, при этом часть перекиси образуется в результате взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом, другая часть - в результате двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода на ферменте.
4. Показано, что зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами не удается. Однако, учитывая, что супероксид дисмутаза ингибирует выход перекиси водорода в этом процессе, сделан вывод, что окисление ДОФА фенолоксидазой сопровождается образованием супероксидного радикала.
5. Показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, при этом скорость генерации перекиси увеличивается в ответ на инъекцию иммунного стимулятора. Генерация перекиси водорода в гемолимфе насекомых приводит к образованию высоко токсичного гидроксильного радикала. б. На основании полученных результатов, а также анализа литературных данных, предложен механизм направленного на патогенный организм цитотоксического действия, в основе которого лежит генерация таких интермедиатов процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекиси водорода и гидроксильного радикала.
Благодарности.
Автор глубоко признателен своим научным руководителям -Слепневой Ирине Алексеевне и Храмцову Валерию Владимировичу. Признателен Бобко Андрею Александровичу, Глазачеву Юрию Ивановичу, Шолоховой Лине Федоровне за всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории патологии насекомых Института Систематики и Экологии Животных СО РАН: Дубовскому Ивану Михайловичу, Лозинской Яне Леонидовне, Хвощевской Марине Федоровне, Глупову Виктору Вячеславовичу - за предоставленных насекомых, обсуждение и помощь в проведении ряда экспериментальных работ.
Заключение.
В настоящей работе было показано, что на начальной стадии процесса меланизации в гемолимфе насекомых протекают следующие реакции: QH2 + Oz ФО ) Q + Н202 QH2 + 02 ф0 > Q- +0\+2 Н+
QH2+0|->Q'+H202
Н202 Red >НО'+НО
Впервые было показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованиемтаких- цитотоксических частиц, как ДОФА-семихиноновый радикал и> гидроксильный радикал. Зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами нам не удалось. Однако, учитывая, что супероксид дисмутаза ингибировала выход перекиси водорода в этом процессе, можно сделать вывод, что окисление ДОФА фенолоксидазой сопровождается образованием супероксидного радикала.
Существуют работы, в которых сообщается об образовании перекиси водорода в гемолимфе насекомых в процессе иммунного ответа [136, 137]. Однако механизм образования Н202 до сих пор оставался неизученным. Полученные нами результаты показывают, что перекись водорода в гемолимфе насекомых может образовываться в результате двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода фенолоксидазой, а также при взаимодействии ДОФА с супероксидным радикалом.
До сих пор считалось, что частицей, ответственной за разрушение чужеродного материала в гемолимфе насекомых, является супероксидный' радикал. Нами было обнаружено, что супероксидный радикал эффективно взаимодействует с ДОФА (к = 3.4*105 М^с"1). Учитывая этот факт, а также известную из литературы способность меланина взаимодействовать с Or (k ~ 106 М^с"1 [138]), можно сделать вывод, что супероксидный радикал сам по себе не принимает участия в цитотоксических реакциях против патогенных организмов. Полученные в настоящей работе результаты показывают, что частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала в гемолимфе насекомых, могут являться ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал.
Отличительной особенностью строения насекомых является открытая кровеносная система. В отличие от млекопитающих, гемолимфа насекомых циркулирует не по замкнутым сосудам, а непосредственно в полости тела. Такая особенность в строении требует наличия механизмов локализации образования цитотоксических частиц, так как их свободное распространение в условиях открытой кровеносной системы могло бы привести к повреждению не только клеток чужеродного организма, но и собственных органов насекомого. Свободное распространение хиноновых/семихиноновых интермедиатов процесса меланизации, в том числе ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона, в гемолимфе насекомых затруднено, так как они будут взаимодействовать с образующейся меланиновой капсулой. В то же время в литературе есть данные что, у насекомых различных видов регистрируется высокая активность каталазы [139, 140]. По всей видимости, каталаза служит для эффективного разложения перекиси водорода, образующейся в гемолимфе в процессе меланизации, таким образом защищая от повреждения собственные органы насекомого. При этом цитотоксическая активность перекиси водорода может быть локализована внутри меланиновой капсулы, так что ее восстановление до высоко токсичного гидроксильного радикала протекает в непосредственной близости к поверхности патогенного организма. Таким образом, генерация таких интермедиатов процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекиси водорода и гидроксильного радикала в процессе иммунного ответа в гемолимфе насекомых, может представлять собой уникальный механизм локального и направленного на патогенный организм цитотоксического действия.
1. Sono М. Heme-containing oxygenases /M.Sono, М.P.Roach, E.D.Coulter, J.H.Dawson //Chem. Rev.- 1996.- V.96.- P.2841-2887.
2. Misra H.P. The univalent reduction of oxygen by reduced flavins and quinones /Н.P.Misra, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1972.- V.247.-P.188-192.
3. Misra H.P. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase /Н.P.Misra, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1972.- V.247.- P.3170-3175.
4. Patel K.B. Semiquinone free radicals and oxygen. Pulse radiolysis study of one electron transfer equilibria /К.В.Patel, R.L.Willson //J. Chem. Soc.- Faraday Trans.- 1973.- V.69.- P.814-825.
5. Klebanoff S.J. Oxygen-based free radical generation by ferrous ions and deferoxamine /S.J. Klebanoff, A.M.Waltersdorph, B.R.Michel, H.Rosen//J. Biol. Chem.- 1989.-V.264.- P.19765-19771.
6. Qian S.Y. Iron and dioxygen chemistry is an important route to initiation of biological free radical oxidations: an electron paramagnetic resonance spin trapping study /S.Y.Qian, G.R.Buettner //Free Radic. Biol. Med.- 1999.- V.26.- P.1447-1456.
7. Fridovich I. Quantitative aspects of the production of superoxide anion radical by* milk xanthine oxidase /I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1970.-V.245.- P.4053-4057.
8. Babior B.M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (first of two parts)/В.М.Babior//New Engl. J. Med.- 1978.-V.298.- P.659-668.
9. Babior B.M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (second of two parts) /В.М.Babior//New Engl. J. Med.- 1978.- V.298.- P.721-725.
10. Bielski B.H.J. Reactivity of HO2/O2" radicals in aqueous solution /B.H.J.Bielski, D.E.Cabelli, R.L.Arudi, A.B.Ross //J. Phys. Chem. Ref. Data- 1985.- V.14.- P.1041-1100.
11. Bielski B.H.J. Mechanism of disproportionation of superoxide radicals /B.H.J.Bielski, A.O.Allen //J. Phys. Chem.- 1977.- V.81.- P.1048-1050.
12. McCord J.M. The reduction of cytochrome с by milk xanthine oxidase /J.M.McCord, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1968.- V.243.- P.5753-5760.
13. McCord J.M. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) /J.M.McCord, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1969.- V.244.- P.6049-6055.
14. Winterbourn C.C. Reactions involving superoxide and normal and unstable haemoglobins /С.С.Winterbourn, B.M.McGrath, R.W.Carrell //Biochem. J.- 1976.- V.155.- P.493-502.
15. Sutton H.C. The rate of reaction of superoxide radical ion with oxyhaemoglobin and methaemoglobin- /H.C.Sutton, P.B.Roberts,
16. C.C.Winterbourn //Biochem. J.- 1976.- V.155.- P.503-510.
17. Nanni E.J. Does superoxide ion oxidize catechol, a-tocopherol, and ascorbic acid by direct electron transfer? /E.J.Nanni, M.D.Stallings,
18. D.T.Sawyer//J. Am. Chem. Soc.- 1980.- V.102.- P.4481-4485.
19. Winterbourn C.C. Reactivity of biologically important thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide /C.C.Winterbourn, D.Metodiewa //Free Radic. Biol. Med.- 1999.- V.27.- P.322-328.
20. Klug-Roth D. Pulse radiolytic investigations of superoxide catalyzed disproportionation. Mechanism for bovine superoxide dismutase /D.Klug-Roth, I.Fridovich, J.Rabani //J. Am. Chem. Soc.- 1973.- V.95.-P.2786-2790.
21. Panayiotidis M. Glucose oxidase-produced H202 induces Ca2+-dependent DNA damage in human peripheral blood lymphocytes /М.Panayiotidis, O.Tsolas, D.Galaris //Free Radic. Biol. Med.- 1999.-V.26.- P.548-556.
22. Cohen G. The Fenton reaction /G.Cohen //Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Edited by R.A.Greenwald.- Boca Raton, Florida, The United States: CRC Press, Inc.-1986.- P.55-64.
23. Kehrer J.P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity /J.P.Kehrer //Toxicology- 2000'.- V.149.- P.43-50.
24. Czapski G. Reaction of 'OH /G.Czapski //Method. Enzymol.- 1984.-V.105.- P.209-215.
25. Oxidative damage to DNA /J.Cadet, M.Berger, B.Morin et al. //Analysis of Free Radicals in Biological Systems. Edited by A.E.Favier, J.Cadet, B.Kalyanaraman, M.Fontecave and J.-L.Pierre.- Basel, Switzerland: Birkhauser Verlag.- 1995.- P.51-64.
26. Dizdaroglu M. Free radical-induced' damage to DNA: mechanisms and measurement /М.Dizdaroglu, P.Jaruga, M.Birincioglu, H.Rodriguez //Free Radic. Biol. Med.- 2002.- V.32.- P.1102-1115.
27. Halliwell B. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance /В.Halliwell, S.Chirico //Am. J. Clin. Nutr.- 1993.- V.57.-P.715S-725S.
28. VanGinkel G. Lipid peroxidation-induced membrane structural alterations /G.VanGinkel, A.Sevanian //Method. Enzymolt- 1994.-V.233.- P.273-288.
29. Cohen G. Glutathione peroxidase: the primary agent for the elimination of hydrogen peroxide in erythrocytes /G.Cohen, P.Hochstein //Biochemistry- 1963.- V.2.- P.1420-1428.
30. Babior B.M. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent /В.М.Babior, R.S.Kipnes, J.T.Curnutte //J. Clin. Invest.- 1973.- V.52.- P.741-744.
31. Antimicrobial properties of milk: dependence on presence of xanthine oxidase and nitrite /J.T.Hancock, V.Salisbury, M.C.Ovejero-Boglione et al. //Antimicrob. Agents Chemother.- 2002.- V.46.- P.3308-3310.
32. Klebanoff S.J. Role of the superoxide anion in the myeloperoxidase-mediated-antimicrobial system /S.J. Klebanoff //J. Biol. Chem.- 1974.-V.249.- P.3724-3728.
33. DiGuiseppi J. Oxygen toxicity in Streptococcus sanguis. The relative importance of superoxide and hydroxyl radicals /J.DiGuiseppi, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1982.-V.257.- P.4046-4051.
34. Permeability of bilayer lipid membranes for superoxide (02") radicals: /R.A.Gus'kova, I.I.Ivanov, V.K.Kol'tover et al. //Biochim. Biophys. Acta- 1984.- V.778.- P.579-585.
35. Bienert G.P. Membrane transport of hydrogen peroxide /G.P.Bienert, J.K.Schjoerring, T.P.Jahn //Biochim. Biophys. Acta- 2006.- V.1758.-P.994-1003.
36. O'Brien P.J. Molecular mechanisms of quinone cytotoxicity /P.J.O'Brien //Chem.-Biol. Interact.- 1991.- V.80.- P.l-41.
37. Stokes, A.H. Cytotoxic and genotoxic potential, of dopamine-/A.H.Stokes, T.G.Hastings, K.E.Vrana //J. Neurosci. Res.- 1999.-V.55.- P.659-665.
38. Tse D.C. Potential1 oxidative pathways of, brain catecholamines /D.C.Tse, R.L.McCreery, R.N.Adams //J. Med. Chem.- 1976.- V.19.-P.37-40.
39. A pulse radiolysis ' investigation of the oxidation of the melanin precursors 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) and' the cysteinyldopas /A.Thompson, EJ.Land, M.R.Chedekel et al. //Biochim. Biophys. Acta-1985.- V.843.- P:49-57.
40. Tyrosinase enhances the covalent modification» of DNA^by dopamine /A.H.Stokes, B.G.Brown, C.K.Lee et al. //Mol. Brain Res.- 1996.- V.42.-P. 167-170.
41. Rao P.S. Ionization constants and spectral characteristics of some semiquinone radicals in aqueous solution /P.S.Rao, E.Hayon //J. Phys. Chem.- 1973.- V.77.- P.2274-2276.
42. Nohl H. The involvement of biological quinones in the formation of hydroxyl radicals via the Haber-Weiss reaction /H.Nohl, W.Jordan //Bioorg. Chem.- 1987.- V.15.- P.374-382.
43. Sushkov D.G. Generation of OH radical during enzymatic reduction ofi 9,10-anthraquinone-2-sulphonate. Can semiquinone decompose hydrogen peroxide? /D.G.Sushkov, N.P.Gritsan, L.M.Weiner //FEBS Lett.- 1987.- V.225.- P.139-144.
44. Reaction between ortho-semiquinones and oxygen: pulse radiolysis, electron spin resonance, and oxygen uptake studies /B.Kalyanaraman,
45. W.Korytowski, В-Pilas et al. //Arch. Biochem. Biophys.- 1988ir V1266.-P.277-284.
46. Bielski; B.H.J: Generation of superoxide radicals by photolysis of oxygenated; ethanob solutions? /B.H.JiBielski, J.MlGebicki //J. Am. Chem. Soc. 1982;-V.104:-P.796-798;
47. Fujii H. Direct measurement of superoxide anion produced in: biological systems; by ESR spectrometry: a pH-jump method /Н.Fujii, KIKakinuma //j;.Biochem;- 1990:- V. 108.- P;983-987.,
48. Auclair C. Nitroblue tetrazolium reduction /C.Auclair, E.Voisin // Handbook of Methods for Oxygen Radical" Research. Edited by R.A.Greenwald:- Boca, Raton; Florida, The United States: CRC Press, Inc.-1986.-P. 123-132.
49. Liochev S.T. Superoxide from glucose oxidase or from nitroblue tetrazolium? /S.I.Liochev, I.Fridovich //Arch. Biochem; Biophys.-1995.- V.318;- P.408-410.
50. Auclair C. Superoxide anion involvement in NBT reduction catalyzed by NADPH-cytochrome P-450 reductase: a pitfall /C.Auclair, M.Torres, J.Hakim //FEBS Lett.- 1978.- V.89.- P.26-28.
51. Bielski B.H.J. Reduction of nitro blue tetrazolium by C02" and 02~ radicals /В.НJ.Bielski, G.G.Shiue, S.Bajuk //J. Phys. Chem.- 1980.-V.84.- P.830-833.
52. Nappi A.J. Superoxide anion generation in Drosophila during melanotic encapsulation of parasites /A.J.Nappi, E.Vass, F.Frey, Y.Carton //Eur. J. Cell Biol.- 1995,- V.68;- P.450-456.
53. Whitten M.M.A. In vitro superoxide activity in the haemolymph of the West Indian leaf cockroach, Blaberus discoidalis /M.'M.A.Whitten, N.A.Ratcliffe //J. Insect Physiol.- 1999.- V.45.- P.667-675.
54. Role of superoxide and reactive nitrogen intermediates in Rhodnius prolixus (Reduviidae)/Trypanosoma rangeli interactions /М.М.А. Whitten, C.B.Mello, S.A.O.Gomes. et al: //Exp. Parasitol.-2001.- V.98.- P.44-57.
55. Choi H.S. A quantitative nitroblue tetrazolium assay for determining intracellular superoxide anion production in phagocytic cells /H.S.Choi, J.W.Kim, Y.-N.Cha, C.Kim //J. Immunoassay Immunochem.- 2006.-V.27.- P.31-44.
56. Tordo P. Spin-trapping: recent developments and applications /P.Tordo //Electron Paramag. Res.- 1998.- V.16.- P.116-144.
57. Timmins G.S. Spin trapping in vivo: facts and artifacts /G.S.Timmins, K.J.Liu, //In Vivo EPR (ESR): Theory and Applications. Edited by L.J.Berliner.- New York, New York, The United States: Kluwer Academic/Plenum Publishers.- 2003.- P.285-308.
58. Cox R.H. Detection and identification of short-lived free radicals by an electron spin resonance trapping technique /R.H.Cox, E.G.Janzen, J.L.Gerlock //J. Am. Chem. Soc.- 1968.- V.90.- P:5909-5910.
59. Janzen E.G. Spin trapping /E.G.Janzen //Accounts Chem. Res.- 1971.-V.4.- P.31-40.
60. Buettner G.R. Spin trapping: ESR parameters of spin adducts /G.R.Buettner //Free Radic. Biol. Med.- 1987.- V.3.- P.259-303.
61. Finkelstein E. Spin trapping kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones /Е. Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman //J. Am. Chem. Soc.- 1980.- V.102.- P.4994-4999.
62. Buettner G.R. Considerations in the spin trapping of superoxide and hydroxyl radical in aqueous systems using 5,5-dimethyl-l-pyrroline-l-oxide /G.R.Buettner, L.W.Oberley //Biochem. Biophys. Res. Commun.-1978.- V.83.- P.69-74.
63. Finkelstein E. Spin trapping of superoxide /Е.Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman, J.Paxton //Mol. Pharmacol.- 1979.- V.16.- P.676-685.
64. Finkelstein E. Production of hydroxyl radical by decomposition of superoxide spin-trapped adducts /Е.Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman //Mol. Pharmacol.- 1982.- V.21.- P.262-265.
65. Buettner G.R. The spin trapping of superoxide' and hydroxyl free radicals with DMPO (5,5-dimethylpyrroline-N-oxide): more about iron /G.R.Buettner//Free Radic. Res. Commun.- 1993.- V.19.- P.S79-S87.
66. A comparative study of EPR spin trapping and cytochrome с reduction techniques for the measurement of superoxide anions /S.P.Sanders, S.J.Harrison, P.Kuppusamy et al. //Free Radic. Biol. Med.- 1994.-V.16.- P.753-761.
67. Karoui H. Spin trapping of superoxide in the presence of |3-cyclodextrins /Н.Karoui, A.Rockenbauer, S.Pietri, P.Tordo //Chem. Commun.- 2002.- P.3030-3031.
68. Forrester A.R. Spin traps. A cautionary note /A.R.Forrester, S.P.Hepburn //J. Chem. Soc.- 1971.- V.4.- P.701-703.
69. Finkelstein E. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects /Е.Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman //Arch. Biochem. Biophys.- 1980.- V.200.- P.l-16.
70. Cautionary note for DMPO spin trapping in the presence of iron ion /K.Makino, T.Hagiwara, A.Hagi et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1990.- V.172.- P.1073-1080.
71. Hanna» P.M. When are metal ion-dependent hydroxyl and alkoxyl radical adducts of 5,5-dimethyl-l-pyrroline N-oxide artifacts? /P.M.Hanna, W.Chamulitrat, R.P.Mason //Arch. Biochem. Biophys.-1992.- V.296.- P.640-644.
72. Nonradical mechanism of (bi)sulfite reaction with DEPMPO: cautionary note for S03" radical spin trapping /D.I.Potapenko, T.L.CIanton, E.G.Bagryanskaya et al. //Free Radic. Biol. Med.- 2003.- V.34.- P.196-206.
73. Rosen G.M. A method for the detection of superoxide in biological systems /G.M.Rosen, E.Finkelstein, E.J.Rauckman //Arch. Biochem. Biophys.- 1982.- V.215.- P.367-378.
74. Dikalov, S. Quantification of superoxide radicals and peroxynitrite in vascular cells using oxidation of sterically hindered hydroxylamines and electron spin resonance /S.Dikalov, M.Skatchkov, B.Fink, E.Bassenge //Nitric Oxide- 1997.- V.I.- P.423-431.
75. Dikalov S. Quantification of peroxynitrite, superoxide, and peroxyl radicals by a new spin trap hydroxylamine l-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-oxo-piperidine /S.Dikalov, M.Skatchkov, E.Bassenge //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997.- V.230.- P.54-57.
76. Application of a trityl-based radical probe for measuring superoxide /C.Rizzi, A.Samouilov, V.K.Kutala et al. //Free Radic. Biol. Med.-2003.- V.35.- P. 1608-1618.
77. Kuppusamy P. High resolution electron paramagnetic resonance imaging of biological samples with a single line paramagnetic label /Р.Kuppusamy, P.Wang, M.Chzhan, J.L.Zweier //Magn. Reson. Med.-1997.- V.37.- P.479-483.
78. Rothe G. Flow cytometric analysis of respiratory burst activity in phagocytes with hydroethidine and 2',7'-dichlorofluorescin /G.Rothe,
79. G.Valet //J. Leukocyte Biol.- 1990.- V.47.- P.440-448.
80. Benov L. Critical evaluation of the use of hydroethidine as a measure of superoxide anion radical /L.Benov, L.Sztejnberg, I.Fridovich //Free Radic. Biol. Med.- 1998.- V.25.- P.826-831.
81. Superoxide reacts with hydroethidine but forms a fluorescent product that is distinctly different from ethidium: potential implications in intracellular fluorescence detection of superoxide /H.Zhao, S.Kalivendi,
82. H.Zhang etal. //Free Radic. Biol. Med.- 2003.- V.34.- P.1359-1368.
83. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence
84. H.Zhao, J.Joseph, H.M.Fales et al. //Proc. Natl. Acad, Sci. U. S. A.-2005.- V.102.- P.5727-5732.
85. Zielonka J. Mechanistic similarities between oxidation of hydroethidine by Fremy's salt and superoxide: stopped-flow optical and EPR studies /J.Zielonka, H.Zhao, Y.Xu, B.Kalyanaraman //Free Radic. Biol. Med.-2005.- V.39.- P.853-863.
86. Detection of intracellular superoxide formation in endothelial cells and intact tissues using dihydroethidium and an HPLC-based assay /B.Fink, K.Laude, L.McCann et al. //Am. J. Physiol.-Cell Physiol.- 2004.- V.287.-P.C895-C902.
87. An ultrasensitive fluorescent assay for the in vivo quantification of superoxide radical in organisms* /C.D.Georgiou, I.Papapostolou, N.Patsoukis et al. //Anal. Biochem.- 2005.- V.347.- P.144-151.
88. Olmsted 3rd J. Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids /J.Olmsted 3rd, D.R.Kearns //Biochemistry- 1977.- V.16.- P.3647-3654.
89. Keston A.S. The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide /A.S.Keston, R.Brandt //Anal. Biochem.- 1965.-V.ll.- P.1-5.
90. Cathcart R. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay /R.Cathcart, E.Schwiers, B.N.Ames//Anal. Biochem.- 1983.-V.134.- P.111-116.
91. LeBel C.P. Evaluation of the probe 2',7'-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress /С.P.LeBel, H.Ischiropoulos, S.C.Bondy-//Chem. Res. Toxicol.- 1992.-V.5.- P.227-231.
92. Jiang Z.-Y. Hydrogen peroxide production during experimental protein glycation /Z.-Y.Jiang, A.C.S.Woollard, S.P.Wolff //FEBS Lett.- 1990.-V.268.- P.69-71.
93. Beauchamp C. A mechanism for the production of ethylene from methional. The generation of the hydroxyl radical by xanthine oxidase /C.Beauchamp, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1970.- V.245.- P.4641-4646.
94. Lawrence G.D. Ethylene formation1 from methionine and its analogs /G.D.Lawrence // Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Edited by R.A.Greenwald.- Boca Raton, Florida, The United States: CRC Press, Inc.-1986.- P.157-163.
95. Terephthalic acid г a dosimeter for the detection of hydroxyl radicals in vitro /J.C.Barreto, G.S.Smith, N.H.P.Strobel et al. //Life Sci.- 1995.-V.56.- P.PL89-PL96.
96. Saran M. Assaying for hydroxyl radicals: hydroxylated terephthalate is a superior fluorescence marker than hydroxylated benzoate /М.Saran, K.H.Summer //Free Radic. Res.- 1999.- V.31.- P.429-436.
97. Buettner G.R. Spin-trapping methods for detecting superoxide and hydroxyl free radicals in vitro and in vivo /G.R.Buettner, R.P.Mason //Method. Enzymol.- 1990.- V.186.- P.127-133.
98. Kasai H. Analysis of a form'of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, as a marker of cellular oxidative stress during carcinogenesis/Н.Kasai//Mutat. Res.- 1997.- V.387.- P.147-163.
99. Hydroxyl free radical adduct of deoxyguanosine: sensitive detection and mechanisms of formation /R.A.Floyd, J J.Watson, P.K.Wong et al. //Free Radic. Res. Commun.- 1986.- V.I.- P.163-172.
100. Yoshioka M. Semiquinone radicals generated from catecholamines by ultraviolet irradiation /M.Yoshioka, Y.Kirino, Z.Tamura, T.Kwan //Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)- 1977.- V.25.- P.75-78.
101. Felix C.C. Electron spin resonance characterization of radicals from 3,4-dihydroxyphenylalanine semiquinone anions and their metalchelates /C.C.Felix, R.C.Sealy //J. Am. Chem. Soc.- 1981.- V.103.-P.2831-2836.
102. Tomkiewicz M. Photooxidation and decarboxylation of tyrosine studied by EPR and CIDNP techniques /М .Tomkiewicz, R.D.McAlpine, M.Cocivera //Can. J. Chem.- 1972.- V.50.- P.3849-3856.
103. Sealy R.C. Identification by electron spin resonance spectroscopy of free radicals, produced during autoxidative melanogenesis /R.C.Sealy, W.Puzyna, B.Kalyanaraman, C.C.Felix //Biochim. Biophys. Acta- 1984.-V.800.- P.269-276.
104. Kalyanaraman B. Characterization of o-semiquinone radicals in biological systems /B.Kalyanaraman //Method. Enzymol.- 1990.-V.186.- P.333-343.
105. Eaton D.R. Complexing of metal ions with semiquinones. An electron spin resonance study /D.R.Eaton //Inorg. Chem.- 1964.- V.3.- P. 12681271.
106. Kalyanaraman B. Peroxidatic oxidation of catecholamines. A kinetic electron spin resonance investigation using the spin stabilization approach /B.Kalyanaraman, C.C.Felix, R.C.Sealy //J. Biol. Chem.-1984'.- V.259.- P.7584-7589.
107. Глупов В.В. Внутренние защитные системы насекомых /В.В.Глупов, С.А.Бахвалов, Ю.Я.Соколова //Патогены Насекомых: Структурные и Функциональные Аспекты. Под редакцией В.В.Глупова.- Москва: Круглый год.- 2001.- Р.481-501.
108. Lavine M.D. Insect hemocytes and their role in immunity /MtD.Lavine, M.R.Strand//Insect Biochem. Mol. Biol.- 2002.- V.32.- P.1295-1309.
109. Superoxide production in-Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils /D.Bergin, E.P.Reeves, J.Renwick et al. //Infect. Immun.-2005.- V.73.- P.4161-4170.
110. Anderson R.S. Comparative biochemistry of phagocytizing insect hemocytes /R.S.Anderson, B.Holmes, R.A.Good //Сотр. Biochem. Physiol.- 1973.- V.46.- P.595-602.
111. Mazet I. Comparative analysis of phagocytosis of fungal cells by insect hemocytes versus horse neutrophils /I.Mazet, J.Pendland, D.Boucias //Dev. Сотр. Immunol.- 1994'.- V.18.- P.455-466.
112. Akita N. Hemocytes release phenoloxidase upon contact reaction, an allogeneic interaction, in the ascidian Halocynthia roretzi /N.Akita, M.Hoshi //Cell Struct. Funct.- 1995.-V.20.- P.81-87.
113. Sugumaran M. Comparative biochemistry of* eumelanogenesis and the protective roles of phenoloxidase and melanin in insects /М.Sugumaran //Pigment Cell Res.- 2002.- V.15.- P.2-9.
114. Land E.J. Rate constants for the first two chemical steps of eumelanogenesis /E.J.Land, S.Ito, K.Wakamatsu, P.A.Riley //Pigment Cell Res.- 2003.- V.16.- P.487-493.
115. Chedekel M.R. Early steps in the free-radical polymerization of 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) into melanin /M.R.Chedekel, E.J.Land, A.Thompson, T.G.Truscott //J. Chem. Soc.-Chem. Commun.- 1984.-P.1170-1172.
116. Nappi A.J. Melanogenesis and the generation of cytotoxic molecules during insect cellular immune reactions /A.J.Nappi, E.Vass //Pigment Cell Res.- 1993.- V.6.- P.117-126.
117. Nappi A.J. Melanogenesis and associated cytotoxic reactions: applications to insect innate immunity /A.J.Nappi, B.M.Christensen //Insect Biochem. Mol. Biol.- 2005.- V.35.- P.443-459.
118. Arakawa T. Superoxide generation in vitro in lepidopteran larval haemolymph /T.Arakawa //J. Insect Physiol.- 1994.- V.40.- P.165-171.
119. Arakawa Т. Superoxide generative reaction in insect hemolymph and its mimic model system with surfactants in vitro /T.Arakawa //Insect Biochem. Mol. Biol.- 1995.- V.25.- P.247-253.
120. Pomerantz S.H*. Separation, purification, and properties of two tyrosinases from hamster melanoma /S.H.Pomerantz //J. Biol. Chem.-1963.- V.238.- P.2351-2357.
121. Mason H.S. The chemistry of melanin. Mechanism of the oxidation of dihydroxyphenylalanine by tyrosinase /H.S.Mason //J. Biol. Chem.-1948.- V.172.- P.83-99.
122. Nichol H. Iron metabolism in insects /H.Nichol, J.H.Law, J.J.Winzerling //Annu. Rev. Entomol.- 2002.- V.47.- P.535-559.
123. Nappi A.J. Hydrogen peroxide production in immune-reactive Drosophila melanogaster /A.J.Nappi, E.Vass //J. Parasitol.- 1998.-V.84.- P.1150-1157,
124. The role of reactive oxygen species on Plasmodium melanotic encapsulation in Anopheles gambiae /S.Kumar, G.K.Christophides, R.Cantera et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 2003.- V.100.-P.14139-14144.
125. Reaction of superoxide anions with melanins: electron spin resonance and spin trapping studies /W.Korytowski, B.Kalyanaraman, I.A.Menon et al. //Biochim. Biophys. Acta- 1986.- V.882.- P.145-153.
126. Antioxidant enzymes of larvae of the cabbage looper moth, Trichoplusia ni: subcellular distribution and activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase /S.Ahmad, C.A.Pritsos,
127. S.M.Bowen et al. //Free Radic. Res. Commun.- 1988.- V.4.- P.403-408.
128. Ahmad S. Mechanisms for regulating oxygen toxicity in phytophagous insects /S.Ahmad, R.S.Pardini //Free Radic. Biol. Med.- 1990.- V.8.-P.401-413.
