Структурно-функциональный анализ новых антимикробных пептидов семян ежовника обыкновенного тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИБХ РАН)

На правах рукописи

РОГОЖИН Евгений Александрович

Структурно-функциональный анализ новых антимикробных пептидов семян ежовника обыкновенного (ЕсЫпосЫоа сгиъ-каШ)

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

31 ОКТ 20)3

005536817

Москва-2013

005536817

Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Официальные оппоненты:

Шахпаронов Михаил Иванович, доктор химических наук, заведующий группой мембранных биоэнергетических систем ИБХ РАН Липкин Алексей Валерьевич, кандидат химических наук, начальник лаборатории молекулярной биологии НИЦ «Курчатовский институт»

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится «20» ноября 2013 года в 10 ч 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.019.01 ИБХ РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Егоров Цезий Алексеевич

Автореферат разослан ^ О^С^ЗЗ. 20^

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последнее время значительное внимание уделяется поиску в растениях органических веществ, обладающих биологической активностью, при этом основной упор делается на соединения, проявляющие бактерицидную или фунгицидную активность. Среди таких соединений наиболее представлены различные полифенолы, фенольные гликозиды, сапонины, ненасыщенные лактоны, диены, пигменты, а также белки и пептиды. Кроме того, остается открытым вопрос о возможности их применения в защите культурных растений от болезней, поскольку все они являются низкомолекулярными вторичными метаболитами, и внедрение их в будущем может привести всего лишь к замещению используемых в настоящее время пестицидов на аналогичные.

На этом фоне наиболее актуальными становятся проблемы поиска и изучения защитных пептидов растений, к которым относят антимикробные пептиды (АМП) и ингибиторы гидролаз насекомых. Эти молекулы, являясь компонентами иммунитета растений, способны действовать против патогенов в достаточно низких концентрациях, что часто коррелирует с их небольшим содержанием в растениях. Подобные пептиды могут образовывать семейства гомологичных молекул.

Важным направлением исследований в данной области является изучение АМП, выделенных из культурных и дикорастущих (в том числе сорных) растений с использованием методов протеомики и геномики. В настоящее время считается, что относительная степень устойчивости дикорастущих растений к фитопатогенам обусловлена наличием АМП со специфическими структурами, которые могут действовать как индивидуально, так и в комплексе. Молекулярные и клеточные механизмы действия АМП растений также являются предметом активного изучения (Fant et al., 2000; van der Weerden et al., 2008; 2010; Lay et al., 2012).

АМП с широким спектром активности являются ключевыми факторами, обеспечивающими реализацию иммунной системы растений. Эти молекулы способны активно действовать в ответ на внедрение патогенного

микроорганизма в растение. Семена являются богатым источником различных пептидов, в том числе антимикробных. АМП растений представляют особый большой интерес для создания устойчивых к патогенам форм растений, поскольку их гены могут быть непосредственно встроены в геном с использованием методов генетической трансформации. Помимо этого, АМП рассматриваются в качестве альтернативы используемым пестицидам, что в перспективе может позволить сократить количество обработок агрохимикатами. Кроме того, применение таких соединений может способствовать активному подавлению патогенных организмов, обладающих резистентностью к используемым химическим средствам защиты растений.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в выделении и структурно-функциональном исследовании ряда новых антимикробных пептидов семян ежовника (ЕсЫпосМоа сгт^аШ).

В процессе данной работы были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Оптимизировать метод выделения АМП из семян ежовника.

2. Выделить и установить структуры новых антимикробных пептидов семян ежовника.

3. Проверить наличие антимикробной активности выделенных соединений.

4. Изучить взаимодействие АМП семян ежовника с фитопатогенным микроорганизмом на клеточном уровне.

Научная новизна. Предложен метод выделения антимикробных пептидов из семян ежовника, сочетающий их кислотную экстракцию с последующим фракционированием методами жидкостной хроматографии. Впервые из семян растения семейства Злаковые выделены дефензины, обладающие антифунгальной активностью на широкий спектр видов фитопатогенов, определены их полные первичные структуры. Показано, что

4

единственная замена Ala на His в С-концевом фрагменте молекулы дефензина достоверно приводит к снижению антифунгальной активности. Из семян ежовника выделен новый пептид с уникальным расположением остатков цистеина, обладающий антифунгальной активностью широкого спектра. Для полученного пептида установлена пространственная структура, представляющая собой новый тип укладки полипептидной цепи растительных антимикробных пептидов. Изучено взаимодействие пептида с фитопатогенным грибом на клеточном уровне и показано, что данная молекула обладает фунгистатическим действием и способна связываться с оболочкой спор гриба с последующей интернализацией в цитоплазму без нарушения целостности плазматической мембраны.

Практическая значимость. Выделенные в данной работе АМП семян ежовника могут быть использованы в для получения генетических конструкций с целью создания культурных растений с трансформированным геномом, обладающих повышенной устойчивостью к грибным фитопатогенам.

Апробация работы и публикации. Результаты данной работы представлены на VIII Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2008), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), V Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009), XIV школе-

5

конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва-Пущино, 2011). По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 машинописных страницах, состоит из введения, частей "Литературный обзор", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", выводов, библиографического списка, состоящего из 310 источников, из которых 302 - на иностранном языке. Работа включает 16 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выбор объекта исследования. Ежовник обыкновенный (ЕсЫпосЫоа сгт^аШ (Ь.) Веаот.) - сорное растение, широко распространенное в странах СНГ, устойчив к гербицидам, снижает урожай культурных растений за счет потребления до 80% азота почвы. Ограниченно используется в качестве сенокосного растения, так как аккумулирует большое количество нитратов, токсичных для скота. В некоторых странах применяется в качестве народного средства при лечении инфекционных заболеваний. Ранее работ по исследованию антимикробных пептидов ежовника не проводилось.

Оптимизация метода выделения АМП из зерновок ежовника.

Предложенный в рамках данного исследования метод выделения АМП из семян ежовника включает в себя кислотную экстракцию белков и пептидов с последующим концентрированием и высаживанием охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование осуществляли комбинированием различных типов жидкостной хроматографии. Принципиальная схема анализа представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Общая схема в млел с ни и АМН щ юрпонок ежовника

Выделение АМН из семян еживника. Выделение пептидов из тотального экстракта семян ежовника проводили последовательно тремя различными типами жидкостной хроматографии: аффинной (в ступенчатом градиенте №С1). эксклюзионной (в 5% СН3СМ+0,05% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и ОФ-ВЭЖХ (в линейном фадиенте СИ3СЫ+},1% ТФУ). В результате аффинной хроматофафии отобрали фи фракции,

элюировавшисся 50 (фракция А), 100 (фракция Б) и 500 иМ (фракция В) №С1 (рис. 2), обессолили методом ОФ-ВЭЖХ и разделяли методом гель-хроматографии.

Рис. 2. Аффинная хроматография тотального жсграктя гернонок ежовника на колонке Heparin HiTrap Sepharose объемом 5 мл, скоростьполвижной фа»ы 1 мл/мин. Серым фоном отмечены юны злюции компонентов, которые были использованы лля лальнейшей очистки.

М асс -с п е ктром стр и ч сс к и и анализ обессоленной фракции А показал наличие молекулярных масс преимущественно в диапазоне 8-10 кДа, следовательно, для дальнейшего анализа ее не использовали.

В результате разделения фракции Б после аффинног: хроматографии гель-фильтрацией было собрано 6 основных фракций (рис. ЗА). По данным масс-спсктрометричсского анализа установлено, что ю фракции 5 содержались компоненты с молекулярными массами в пептидном диапазоне (4-7 кДа). Данная фракция была рехромотографнроваиа методом ОФ ВЭЖХ с получением двух очищенных пептидов, названных Ec-AMP-Dl и Ес-АМР-D2 (рис. ЗБ).

Рис. 3. Очистка фракции Б после аффинной хромаю! рафии: Л • эксклю тоннам хрома нн рафии на колонке Supcrdex Peptide 10/30. скорость по.шижной фа iM 15 мл/мим; Б - ОФ-Н )ЖХ фракции S (отмечена серым фоном), полученной в реiy.tt.iatc жсклюшовной хромаю! рафии, на колонке l.una С'ц 10x250 мм, скорость полвижной фан>1 1,5 мл/мни.

Моноизоюпныс молекулярные массы составили 5096,9 Да (для Ес-ЛМР-Dl) и 5162,8 Да (для Ес-АМР-Ю2); определение числа остатков цистсина/полуцистииа показано, что обе молекулы содержат по 8 остатков цистеипа. образующие по 4 внутримолекулярные дисульфидныс связи.

Установление первичных структур Ec-AMP-Dl и EC-AMP-D2.

Методом автоматической лефадацин по Эдману было определено 29 N-концсвых аминокислотных остатков (а.к.о.) Ec-AMP-Dl. Для получения его полной первичной структуры данный пептид гидролизовали эндопротсинаэой Glu-C lio карбоксильной группе остатка Glu27. Продукты реакции разделяли методой ОФ-ВЭЖХ. В результате были собраны две основные фракции, их масс-спектромегрический анализ позволил идентифицировать С-концсвой фрагмент, строение которого была определена автоматическим методом Эдмана. Полная первичная структура Ec-AMP-D2 была установлена аналогичным образом. Таким образом, оба пептида состоят из 47 а.к.о., и различаются единственной заменой Ala45H¡s.

Поиск гомологии пеэвичных структур по базам данных UniProt и IrEMBL с использованием алгоритма BLAST выявил принадлежность утих пептидов к семейству растигельных дефензинов с характерным цистеииовым

мотивом типа 10-С-5-С-3-С-8-С-6-С-1-С-3-С (Lay and Anderson, 2005). Множественное выравнивание первичных структур Ec-AMP-Dl и Ес-АМР-D2 с дефензинами других злаков представлено на рисунке 4.

Л мим о к ксл от КАП последовательность

Гомология,%

«C-AMP-D1 КС-АИР- D2

Tk-AMP-Dl Oryx al

Tk-AMP-Dl.1

Tadl

" »7 (100)

" 77 (81)

" 65 (65)

" «3 (70)

" »7 (70)

" 55 (56)

*• 52 (56)

" 40 (37)

;" эб гзо)

100 (100)

Рнс. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей дефешинов 1лаков. Кжовннк обыкновенный (£. crusgalli) (Ес-А.ЧР-DI и ЕсА.МР-1)2), пшенина Кнхары (Trilic um kiharat) (Tk-AMP-Dl и Tk-AMP-D!.l), овес (Oryza 5am-aBAD23741) (Oryzal), пшеница твердая (Т. turgidum) (Tadl и (iamma-l-P), кукуpy ta (Zea mays) (Gamma-l-z), ячмень (Hordeum vulgare) (Hordeunil) и сорго (Sorghum bicolor) (SI 1). Идентичные остаиси и консервативные ta мены относительно структур дефешинов ежовника выделены белым шрифтом на черном фоне. Процент гомологии представлен относительно структур дефеншнов ежовника (в скобках приводится процент гомологи относительно N-концевых фрагментов (1-27 а.к.о.) дефеншнов ежовника)

Наибольшую степечь структурной гомологии дефензины семян ежовника показали с охарактеризованными ранее дефензинами семян пшеницы Кихары (Odintsova el al., 2007) и овса (GenBank ID: BAD23741) (в диапазоне от 63 до 77%), а наименьшую - с пептидами из сорго (GenBank ID: ХР_002445212) и ячметя (GenBank ID: AAB0I671) (36 и 40% соответственно). При этом гомология выделенных дефензинов ежовника с N-концевым фрагментом молекул некоторых из сравниваемых пептидов злаков (пшеницы Кнхары, овса н пшеницы твердой) была выше, чем для целых молекул (70-81%).

В результате хромзтографнческоге разделения фракции В после аффинной хроматографии была собрана одна основная суммарная фракция, элюировавшаяся с колон<и в диапазоне 190-220 мин (рис. 5А). Масс-спектрометрический анализ показал, что в полученной фракции

присутствовали компоненты с молекулярными массами в диапазоне 3,3-7,5 кДа. Данную фракцию рехроматографировали методом ОФ-ВЭЖХ. в результате был получен основной компонент, названный ЕсАМР! (рис. 5Б).

Рис. S. Очистка фрикции В после аффинной \ромами рафии: Л - тель-фнлырация на колонке Sephacryl SKIOIIR. C'Kopocib полнижмои фа1ы 60 мл/час; Ь - ОФ-ВЭЖХ основной фракции (вылелены серым фоном) после гель-фильтрации на колонке Luna Сц 4,6 х 150 мм (Phenonicne*. США). Скорость потока но.твнжнон фаты 1,5 мл/мин. Светло- теленым цветом вылелена тона тлюирования EcAMI'l.

[lo данным масс-спектрометрии, моноизотопная молекулярная масса KcAMPI составила 4271,2 Да; определение числа остатков цистеина/полуцистнна показало, что выделенная молекула содержит 4 остатка цистсина, образующие 2 внутримолекулярные дисульфилные связи. Разница между измеренной и расчетной молекулярной массами составила 0,7 Да, следовательно, данный пептид не содержит никаких дополнительных посттранс л яцион н ых модификаций.

Определение первичной структуры EcAMPI. Методом автоматической деградации по Эдману была определена полная аминокислотная последовательность EcAMPI. состоящая из 37 а.к.о. Поиск гомологии первичных структур по базам данных UniProl и trliMBL с

использованием алгоритма BLAST показал, что данный пептид имеет структурное сходство с рядом представителей растительных пептидов, обладающих антимикробными свойствами и функцией ингибитора трипсина (рис. 6).

Название Лишомсяотми последовательность Гомология.»

V. hvdarifoli* -----«ГГ Ога^Ьм^А^М^и^ХмЁп D------------------24

L. *<Kfypt4CM PBCSPRTF .F^ л^УА£ИСУ-1|10м|ОО^ЯОС1и.ВЖМОЯ1«\ГО 19

F. escuJen tum -SEX^EI^ajNV^-KRMSTtMVUI&XxbmKRQQR----------17

N. int»arifolia KRDPOOREVEE^UU^OOEPRO- -OHOgOLRyEOO---------------"

Рис. 6. Сравнение аминокислотных последовательностей растительных нешндов с цне i ей новым мощном типа XnCIX3C2XnC3X3C4Xn (X - любой а.к.о., п-лмбое число а.к.о.). ЕсАМР! ит Echinochloa crusgaUix антимикробные пептиды ит Macadamia inlegrifolia и МВР-1 и i Zea mays, ингибиторы трипсина B\Vl-2c ит Fagopyrum esculentum и YhTI ит Veronica hederifolia; ингибитор трансляции luffin PI ит Luffa aiegypiiaca. Белым шрифтом на черном фоне о!мечены остатки иистеина. светло-серым фоном выделены идентичные остатки и консервативные тамены относительно структуры F.cAMPl.

Наибольшая степень гомологии EcAMPl была найдена с МВР-1 кукурузы (64%), что может объясняться близким филогенетическим родством данных видов растений друг к другу. С остальными из сравниваемых пептидов гомология была низкой (17-24%), она ограничивалась единичными остатками в участках между Cysl-Cys2 и Cys2-Cys3 остатками цистеина, а также в С-кониевом фрагменте молекул. Кроме того, характерная особенность представителей данной группы растительных пептидов заключалась в различной длине N- (последовательность до остатка Cysl) и С-концсвых участков структур (последовательность после остатка Cys4).

Определение пространственной структуры EcAMPl. Определение пространственной структуры 4-цистеинового пептида EcAMPl методом 'Н-ЯМР проведено в водном растворе при pH 6.6 проводили на базе лаборатории биомолскулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН. В результате расчетов спектров 'Н-ЯМР установлено, что пространственная структура пептида EcAMPl представлена двумя антипараллельными и-спиральными

участками, сформированными между 7-14 и 22-30 а.к.о. (рис. 7) Данные о-спирали стабилизированы двумя 5-5 связями, образованными попарно 4 остатками полуцистина С7-С29 и С11-С25. Альфа-спиральные участки соединены между собой (¿-поворотом (остатки 15-18), а также спиралью Зщ (остатки 19-21). Л'- и С-концевые участки данной молекулы (остатки 1-6 и 3137, соответственно) не структурированы.

Рис. 7. Пространственная структура ЕсАМPI. А - ленточная модель 20 структур, рассчшанных по алгоритму CYANA и наложенных на Патовые атомы 7-ЛО а.к.о. Отмечены боковые цепи а.к.о: формирующие гидрофобное ядро (Cys7, алнфашческая час1ь Агц8, Cysl 1, Mel12, Pro19, Val22. Cvs25, V al26 и Су*29) выделены светло-зеленым, боковая цепь остатка His!5 отмечена фиолеювым. Боковая i руина ociaiKa Тгр2() оботначена енннм. Дисульфилные мосты покатаны же.пыми линиями: /V- и Г-кониевые учасiкм покатаны. Б -структура в сравнении с "А" с поворотом на 160" вокруг своей вертикальной осн. Покатаны боковые группы остатков (Jultt и Argil, обра туюшие солевой мост (выделены красным).

Показано, что спираль Зщ в структуре EcAMPI стабилизируется солевым мостиком, расположенным между остатками Glul8 и Arg21. Между двумя а-спнразышми участками сформировано небольшое гидрофобное ядро, представленное боковыми группами остатков Met 12, ?rol9, Val22 и Val26, а также остатками Cys и а. шфа in ческой частью боковой гуанидогруппы остатка Arg8. Имидазольное кольцо остатка His 15 заглублено

13

внутрь гидрофобного ядра. Боковая группа остатка Тгр20 экспонирована в водный раствор.

Определение антимикробной активности выделенных пептидов.

Антимикробную активность выделенных пептидов определяли следующим образом: антифунгальную - методом учета прорастания спор/роста мицелия грибов (Broekaert et al., 1990; Duvick et al., 1992), антибактериальную -методом радиальной диффузии (Kiska, 1998; Othman et al., 2010). Пептиды тестировали в диапазоне действующих концентраций 0,2-20 мкМ (для Ес-AMP-D1/D2) на 9 видах фитопатогенных грибов и 0,5-32 мкМ (для EcAMPl) - на 15 видах грибов.

Ec-AMP-Dl ингибировал прорастание спор 6 из 9 тестируемых видов фитопатогенов при ингибирующей концентрации, вызывающей половинный эффект ингибирования (ИК50) 1,7-20,0 мкМ, в то время как Ec-AMP-D2 показал более низкую активность (из 5 тестируемых видов эффект ингибирования на уровне ИК50 был показан только на двух при концентрации 10,0 мкМ) (табл. 1). При максимальной тестируемой концентрации при действии как Ec-AMP-Dl, так и Ec-AMP-D2, наблюдалось наличие морфологических изменений P. infestans и P. debaryanum в виде частичного лизиса гиф и спорангиев. Показано, что единственная замена Ala на His в структуре дефензинов ежовника влияет на их антифунгальную активность in vitro.

Дефензины семян ежовника гомологичны охарактеризованным ранее дефензинами семян пшеницы Кихары Tk-AMP-Dl.l(77%) и Tk-AMP-Dl (65%) (Odintsova et al., 2007); и гомология их Л'-концевых участков выше и составляет 81 и 85% соответственно (рис. 3). При этом пептиды из пшеницы Кихары слабо действуют на узкий спектр видов фитопатогенов (Tk-AMP-Dl был неактивен против В. cinerea, В. sorokiniana, F. culmorum, С. graminicola и D. maydis при концентрации более 20 мкМ и слабо ингибировал F. graminearum и F. verticillioides при концентрации 6 мкМ).

Табл. 1. Антифунгальная активность АМП семян ежовника (ИК50, мкМ )

Микроорганизм Ec-AMP-Dl Ec-AMP-D2 EcAMPl

Alternaria alternata H.T. H.T. 16,0 (+)

A. solani H.T. H.T. 14,0 (н.о.)

Aspergillus niger H.T. H.T. >32,0 (-)

В. sorokiniana >20,0 (-) >20,0 (-) 18,2 (+)

С. graminicola >6,0 (н.о.) H.T. >10 (н.о.)

D. maydis 2,5 (н.о.) H.T. >10 (н.о.)

F. graminearum 3,0 (н.о.) H.T. 4,5 (н.о.)

F. oxysporum 20,0 (-) >20,0 8,8 (+)

Fusarium solani H.T. H.T. 4,0 (+)

F. verticilUoides 1,7 (н.о.) H.T. 8,1 (н.о.)

Phoma betae H.T. H.T. 6,0 (-)

B. cinerea >20,0 (-) >20,0 (-) н.т.

P. debarianum 10,0 (+) 10,0 (+) 12,0 (-)

P. infestons 5,0 (+) 10,0 (+) 16,3 (-)

P. ultimum H.T. H.T. 14,4 (-)

Trichoderma album H.T. H.T. >32,0 (-)

н.т. - не тестировалось; н.о. - не определялось. В скобках приведено наличие (+) или отсутствие (-) морфологических изменений структур микроорганизмов

В то же время приблизительно равная степень гомологии как целых первичных структур, так и одних А'-концевых фрагментов дефензинов ежовника с АМП кукурузы (gamma- 1-z) и твердой пшеницы (gamma-1-р) (5255 и 56% соответственно) может свидетельствовать в пользу того, что аминокислотные остатки, ответственные за антифунгальную активность, в структурах дефензинов злаков располагаются преимущественно в С-концевой части молекулы.

Дефензины ежовника были протестированы на наличие антибактериальной активности против Escherichia coli и Bacillus subtilis, однако не оказали эффекта при концентрации менее 20 мкМ. Следовательно,

выделенные и охарактеризованные дефензины относятся к подтипу морфогенетических, действующих только на грибы.

EcAMPl показал наличие антифунгальной активности против широкого спектра видов фитопатогенных грибов и оомицетов в микромолярных концентрациях (4-20 мкМ), при этом максимальный эффект был отмечен на видах рода Fusarium - F. solani и F. graminearum. Кроме того, пептид вызывал наличие морфологических изменений у ряда тестируемых фитопатогенов (A. altérnala, В. sorokiniana, F. oxysporum и F. solani) при действующей концентрации более 20 мкМ (табл. 2). Виды A. niger, С. graminicola, D. mayáis и Т. album были нечувствительны к действию EcAMPl в указанном диапазоне концентраций. Характерной особенностью биологического действия EcAMPl являлась задержка роста гиф из проросших грибных спор относительно контроля у некоторых из тестируемых фитопатогенов (Fusarium spp., Alternaria spp. и В. sorokiniana). Так, длина мицелия F. solani после инкубирования в течение 48 ч в контроле составляла 0,8-1,3 мм, тогда как в присутствии пептида - 0,3-0,6 мм.

Полученные результаты могут свидетельствовать о специфичности действия EcAMPl, которая может заключаться в реализации особого механизма действия, который выражается в проявлении фунгистатического эффекта. Характерно, что пептид EcAMPl обладал значимой гомологией с МВР-1 кукурузы (64%) (Duvick et al., 1992) (рис. 6), что может являться, как было сказано выше, результатом филогенетического родства родов Echinochloa и Zea, принадлежащих к одному семейству Злаковые (Роасеае). Ближайший гомолог - пептид МВР-1 - ингибировал прорастание спор широкого спектра фитопатогенных грибов, а также обладал бактерицидным эффектом (при концентрации около 2 мкМ подавление роста колоний Е. coli составляло 99,9%). Однако EcAMPl не подавлял роста колоний Е. coli и В. subtilis при концентрации менее 32 мкМ. Показано, что EcAMPl не проявлял трипсин-ингибирующей активности; он подвергался протеолизу трипсином по остаткам Arg, что подтверждено анализом продуктов реакции ОФ-ВЭЖХ и их секвенированием по Эдману.

Изучение взаимодействия ЕсАМР1 с фитопатогеииым грибом Л воЫт на клеточном уровне.

Получение флуоресцентного производного пептида ЕсАМР1 с 5(6)-карбокситетраметилродамином. С целью дальнейшего изучения взаимодействия ЕсАМР1 с грибом зо1ат методами флуоресцентной микроскопии было получено производное данного пептида с органическим флуорофором - 5(6)-карбокситетраметилродамином. Продукты данной реакции были разделены методом ОФ-ВЭЖХ (рис. 8).

I-1

Рис. 8. ОФ-ВЭЖХ продуктов реакции получения флуоресцентного производного EcAMPl с 5(6)-карбокситетраметилродамином. Колонка Luna С18 4,6x150 мм, градиент 8-42% CH3CN с добавлением 0,1% ТФУ за 40 мин. Скорость потока 0,75 мл/мин. Фракции, соответствующие флуоресцентным производным EcAMPl, отмечены как TMR-EcAMPl.

Идентификацию производных осуществляли масс-спектрометрически. В результате разделения были получены две фракции, которые объединили для дальнейших исследований. Концентрацию модифицированного пептида определяли спектрофотометрически с учетом коэффициента молярной экстинкции флуорофора при длине волны 555 нм (£555=65000 М"'см"').

Антифунгальная активность модифицированного пептида соответствовала природной молекуле.

Исследование взаимодействия EcAMPl со спорами гриба F. solani методами сканирующей флуоресцентной микроскопии. Для изучения динамики взаимодействия EcAMPl и грибом F. solani был использован метод сканирующей лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии. При добавлении пептида в концентрации 4 мкМ к спорам гриба была определена кинетика его связывания с клетками, а также установлена зависимость между степенью взаимодействия пептида с поверхностью спор гриба и временем инкубирования. Показано, что через 1 ч инкубирования EcAMPl интенсивно связывался с поверхностью спор, включая и перегородки между клетками внутри одной споры. По истечении 3 ч наблюдался эффект интернализации пептида с поверхности клеток внутрь цитоплазматического пространства (рис. 9), который заметно усиливался через 6 ч инкубирования.

С целью установления возможного мембранотропного эффекта EcAMPl к спорам был добавлен селективный краситель - 5(6)-карбоксифлуоресцеин - способный проникать через поврежденную цитоплазматическую мембрану внутрь клеток. В результате установлено, что EcAMPl не изменяет структурную целостность цитоплазматической мембраны клеток спор гриба, а его проникновение внутрь клетки может быть обусловлено, по всей видимости, определенными клеточными механизмами.

4 цМ. 1 ч / 4 III ЦП1

ч VI ^ |"ч • *

4 ц\1. 6«. . V ч Шт \ 1 1

Рис. 9. Распределение КсАШ'1 на спорах гриба р.\о!ат. Представлены июбражения, полученные путем конфокальной флуоресцентной микроскопии (левая панель) н микроскопии проходящею сипа (нравам панель). Отмечены время инкубировании (I, 4 н 6 ч) и концентрация пептида (2 мкМ ТМК-ЕсАМР! н 4 мкМ равной смеси ЕсАМР! и ТМК-КсАМР!).

Для более детальной характеристики связывания ЕсАМР! с оболочкой спор, а также его распределения внутри клеток была проведена их визуализация методом с<анирующей лазерной двухфотоиной (41*1) флуоресцентной микроскопии. После 6 ч инкубирования значительное количество пептида было локализовано в цитоплазме споры, причем данное распределение было неравномерным (рис. ЮА). Аккумуляция пептида внутри клетки может происходить в вакуолярных структурах (предположительно, липидных каплях).

Рис. 10. Локализация F.cAMP 1 в конидиях F. solani. Представлены изображения, полученные путем лвухфотоннон микроскопии. А - динамика связывания пептида в клетке споры после 6 ч инкубирования; Б - степень распределения пептида по профилю оболочки споры после 6 ч инкубирования; И - степень свитывання пентила с поверхностью оболочки споры после 6 ч инкубиро1ання. Светло-синнм цветом покатана минимальная степень святывания, светло-зеленым - средняя, желтым - максимальная.

Сканирование оболочки споры в поперечном сечении также выявило неоднородность связывания пептида с ее оболочкой. Вероятно, это можно объяснить различной степенью сорбции EcAMPl иолисахаридными компонентами клеточной стенки (хитином, хитозаиом, глюканами, маннанами и др.) (рис. 10Б), которые распределены в ней неоднородно. Кроме того, характер связывания пептида с внешней поверхностью клеток спор носил равномерный характер, без образования агрегаций на поверхности спор (рис. 10В).

Исследование в /а им оде in nut ия EcAMPl со спорами гриба F. solani методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). С использованием метода АСМ была изучена способность пептида EcAMPl изменять физические свойства поверхности грибных спор. Пептиды тестировали в диапазоне действующих концентраций 4,0-32 мкМ. В рамках данной работы была установлена прямая зависимость между возрастанием его действующей концентрации и степенью нарушения (разрушения, разрыхления) поверхности грибных спор путем экспериментального определения среднеквадратичной шероховатости поверхности (Salerno and Bykov, 2006) (рис. II).

__ _)

Рис. II. Исследование поверхности конидий гриба /•". \olani при взаимодействии с ЕсАМР]. Л - общий вил поверхности конилнн И. \olani без обработки (контроль, масштаб 13,6x13,6 мкм); Б • общин вид поверхности конидии К и>1ат после инкубирования с 16 мкМ ЕсАМР! в течение 1 ч (масштаб 12,8x13,4 мкм); В - общий вил поверхности конилнн ьо1а/и после инкубирования с 32 мкМ ЕсАМР! в течение I ч (масштаб 8,0 х 8,$ мкм).

Так, при концентрации 4 и 8 мкМ данное значение составляло 2,69 и 2,96 относительных единиц (оти. ед.), что выше контроля, соответственно, на 16 и 27%. При увеличении действующих концентраций ЕсАМР1 до 16 и 32 мкМ, данный параметр возрастал до 3,9 и 6,31 отн. ед., что превышало ко1ггролыюс значение в 1,7 и 2,7 раза соответственно.

Таким образом, существует корреляция между нарушением структуры |рибных конидий под воздействием изучаемого пептида и наличием морфологических изменений, которые детектируются визуально при концентрации более 20 мкМ.

Заключение

Таким образом, из семян ежовника обыкновенного (£. сгих-^аНГ) выделено три молекулы, обладающие широким спектром антнфунгальной активности и принадлежащие к двум различным структурным типам растительных пептидов. Выделенные и охарактеризованные в рамках данной работы дефензины являются первыми представителями молекул данного семейства, обладающие выраженной антнфунгальной активностью, которые были обнаружены в растениях семейства Злаковые. Пептид ЕсАМР 1, является представителем новою семейства 4-цистеиновых пептидов растений и обладает новым типом структурной укладки полипептидной

цепи, обеспечивающей его эффективное взаимодействие с мишенью. Установлен двухстадийный характер взаимодействия данного пептида на клетки-мишени, заключающийся в его связывании с оболочкой и последующей интернализацией внутрь для дальнейшего взаимодействия с внутриклеточными органеллами. Показано, что вероятный механизм антигрибного действия этого пептида отличается от всех известных растительных антимикробных пептидов, что представляет интерес для дальнейшего исследования с целью получения новых знаний об иммунитете растений к стрессовым факторам окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована методика выделения антимикробных пептидов из семян ежовника, включающая кислотную экстракцию с высаживанием ацетоном и последующим фракционированием комбинацией методов жидкостной хроматографии.

2. Из семян ежовника выделены два новых дефензина, Ec-AMP-Dl и Ec-AMP-D2, для которых установлены первичные структуры. Показано, что они состоят из 47 аминокислотных остатков и отличаются единственной заменой Ala на His в 46 положении полипептидной цепи. Также был выделен новый пептид EcAMPl с уникальным 4-цистеиновым мотивом, для которого установлены полная аминокислотная последовательность и пространственная структура. Показано, что данный пептид состоит из 37 аминокислотных остатков, его пространственная структура представлена двумя антипараллельными альфа-спиральными участками, соединенными бета-шпилькой, стабилизированными двумя дисульфидными мостами, и неструктурированными N- и С-концевыми участками.

3. Установлено, что выделенные пептиды обладают антифунгальной активностью против широкого спектра фитопатогенов при ИК50 4-20 мкМ. Сравнительное тестирование дефензинов ежовника показало, что Ec-AMP-Dl более активен, чем Ec-AMP-D2, таким образом, замена Ala на His в 46

положении полипептидной цепи приводит к снижению антифунгальной активности.

4. Изучено взаимодействие пептида Ее AMPI со спорами фитопатогенного гриба Fusarium solani на клеточном уровне. Установлено, что данный пептид равномерно связывается с оболочкой, вызывает изменение физических свойств ее поверхности, и в дальнейшем интернализуется внутрь клеток, не повреждая цитоплазматическую мембрану.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Odintsova T.I., Rogozhin Е.А., Baranov Yu.V., Musolyamov A.Kh., Yalpani N., Egorov Ts.A., Grishin E.V. Seed defensins of barnyard grass Echinochloa crusgalli (L.) Beauv. // Biochemie, 2008, V. 90, P. 1667-1673.

2. Nolde S.B., Vassilevski A.A., Rogozhin E.A., Barinov N.A., Balashova T.A., Samsonova O.V., Baranov Y.V., Feofanov A.V., Egorov T.A., Arseniev A.S., Grishin E.V. Disulfide-stabilized helical hairpin structure of a novel antifungal peptide EcAMPl from seeds of barnyard grass {Echinochloa crus-galli) // J. Biol. Chem., 2011, V. 286 (28), P. 25145-25153.

Материалы конференций

1. Рогожин E.A., Мусолямов А.Х. Новые дефензины, выделенные из зерновок ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli) II Тезисы докладов VIII Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», 2 апреля 2008 г. М.: 2008. С. 32-33.

2. Рогожин Е.А., Одинцова Т.И., Мусолямов А.Х., Баранов Ю.В., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Дефензины ежовника Echinochloa crusgalli II Тезисы докладов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, С. 281.

3. Рогожин Е.А., Мусолямов А.Х., Ялпани Н.. Смирнов А.Н., Егоров Ц.А.. Гришин Е.В. Антимикробные пептиды сорного злака - ежовника

23

обыкновенного (Echinochloa crusgalli) II Материалы V Съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова, 2-4 декабря 2008 г., М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2009. С. 177-179.

4. Рогожин Е.А., Смирнов А.Н.. Мусолямов А.Х., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Выделение новых антимикробных пептидов из зерновок ежовника обыкновенного {Echinochloa crusgalli) II Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009», 25-29 мая 2009 г. Пермь, 2009, С. 242-243.

5. Рогожин Е.А., Мусолямов А.Х., Смирнов А.Н., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Антимикробные пептиды ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli) II Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», 23-27 июня 2009 г., Казань, 2009, С. 133.

6. Нольде С.Б., Рогожин Е.А., Василевский A.A., Баринов H.A.. Балашова Т.А., Егоров Ц.А., Гришин Е.В., Арсеньев A.C. Пространственная структура нового антимикробного пептида из семян ежовника обыкновенного (.Echinochloa crusgalli) II Материалы Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова // Москва-Пущино, 28 сентября - 1 октября 2009 г, С. 304-305.

7. Рогожин Е.А., Смирнов А.Н., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Антимикробные белки и пептиды зерновок сорного злака - ежовника обыкновенного {Echinochloa crusgalli L.) // Материалы III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 1-4 октября 2009 г, Ростов-на-Дону, 2009, Издательство СКНЦ ВШ ЮФУ, С. 112-113.

8. Рогожин Е.А., Феофанов A.B., Егоров Ц.А., Арсеньев A.C.. Гришин Е.В. Изучение новых антимикробных пептидов сорного злака — ежовника обыкновенного {Echinochloa crusgalli L.) с уникальным 4-цистеиновым мотивом // Тезисы докладов XIV школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», 19-23 апреля 2010 г., Пущино, С. 57.

9. Беркут A.A., Опарин П.Б., Василевский A.A., Рогожин Е.А., Самсонова О.В., Феофанов A.B., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Исследование механизма действия защитного пептида из ежовника EcAMPl // Тезисы Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", Москва-Пущино, 14-17 ноября 2011 года, С. 10.

Заказ № 63-аЛ 0/2013 Подписано в печать 14.10.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201363624 На правах рукописи

РОГОЖИН ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НОВЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ СЕМЯН ЕЖОВНИКА ОБЫКНОВЕННОГО (ЕСН1 КОС НЮ А СЯШ-САЬЫ)

02.00Л0 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

д.х.н., профессор [Егоров Цезий Алексеевич

МОСКВА - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

1 .ВВЕДЕНИЕ 6

1.1. Актуальность темы 6

1.2. Научная новизна исследований 7

1.3. Практическая значимость 8

1.4. Цели и задачи исследования 8 Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9

1. Характеристика антимикробных пептидов растений 9

2. Классификация антимикробных пептидов растений 9

2.1.Тионины 12

2.2. Дефензины 14

2.2.1. Классификация дефензинов 15

2.2.2. Структурные особенности дефензинов 15

2.2.3. Биологическая активность растительных дефензинов 17

2.3. Неспецифические липид-переносящие белки 20

2.4. Гевеин-подобные пептиды 23

2.5. Ноттин-подобные пептиды 25

2.6. Циклотиды 26

2.7. Снекины 27

2.8. Четырех-цистеиновые антимикробные пептиды 28 2.8.1 Антимикробные пептиды из нута {Macadamia integrifolia) и 28 кукурузы {Zea mays)

2.8.2. Антимикробные пептиды из недотроги {Impatiens balsamina) 29

3. Общие принципы действия антимикробных пептидов 30

3.1. Механизмы антибактериального действия АМП растений 31

3.2. Механизмы антифунгального действия АМП растений 32

3.3. Механизмы действия дефензинов растений 33

3.4. Механизмы действия тионинов 35

3.5. Механизмы действия липид-переносящих белков 36

3.6. Механизмы действия гевеино-подобных пептидов 37

4. Применение антимикробных пептидов растений 37

4.1. Возможность клинического применения АМП растений 37

4.2. Возможность применения АМП растений в пищевой 39 промышленности

4.3. Использование АМП растений в сельском хозяйстве 40

4.3.1. Создание трансгенных культур, экспрессирующих гены АМП 41 растений

4.3.2. Перспективы применения АМП растений в качестве 44 биопестицидов

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 46

1. Оборудование 46

2. Реактивы 46

3. Биологический материал 47

3.1. Ежовник обыкновенный 47

3.2. Микроорганизмы 47

3.2.1. Грибы 47

3.2.2. Оомицеты 48

3.2.3. Бактерии 48

4. Выделение АМП из семян ежовника 48

4.1. Экстракция 48

4.2. Обессоливание тотального ацетонового осадка 48

4.3. Хроматографическое разделение обессоленного ацетонового 49 осадка

5. Методы структурного анализа АМП семян ежовника 50

5.1. Восстановление и алкилирование 50

5.2. Матричная ассоциированная лазерная десорбция/ионизация 51 (МАЛДИ) времяпролетная масс-спектрометрия

5.3. Гидролиз эндопротеиназой С1и-С 51

5.4. Установление аминокислотной последовательности 51

6. Аналитические методы исследования АМП семян ежовника 52

6.1. Гидролиз трипсином 5 2

6.2. Определение концентрации АМП спектрофотометрическим 52 методом

6.3. Получение флуоресцентной производной АМП из семян 52 ежовника

7. Методы исследования функциональной активности АМП 53 семян ежовника

7.1. Определение антифунгальной активности 53

7.2. Определение антибактериальной активности 53

7.3. Сканирующая лазерная конфокальная флуоресцентная 54 микроскопия

7.4. Сканирующая лазерная двухфотонная флуоресцентная (4-pi) 54 микроскопия

7.5. Сканирующая зондовая (атомно-силовая) микроскопия (АСМ) 55 Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 57

1. Выбор объекта исследований 57

2. Оптимизация метода выделения АМП из семян ежовника 58

3. Выделение АМП из семян ежовника 60

3.1. Выделение Ec-AMP-D 1 и Ее-AMP-D2 61

3.2. Выделение ЕсАМР 1 62

4. Структурная характеристика АМП семян ежовника 64

4.1. Установление первичных структур Ec-AMP-D 1 и Ec-AMP-D2 64 4.1.1. Сравнение первичных структур Ec-AMP-Dl и Ec-AMP-D2 с 66 гомологами

4.2. Определение первичной структуры ЕсАМР 1 68 4.2.1. Сравнение первичной структуры EcAMPl с гомологами 69

4.3. Определение пространственной структуры EcAMPl 70 4.3.1. Сравнение третичной структуры ЕсАМР 1 с другими 71 пептидами

5. Функциональная характеристика АМП семян ежовника 74

5.1. Биологическая активность Ec-AMP-Dl и Ec-AMP-D2 74

5.2. Биологическая активность Ее AMP 1 8 О

5.3. Изучение взаимодействия EcAMPl с фитопатогенным грибом на 82 клеточном уровне

5.3.1. Получение флуоресцентного производного пептида ЕсАМР 1 82

5.3.2. Исследование взаимодействия EcAMPl со спорами гриба 83 Fusarium solani методами сканирующей флуоресцентной микроскопии

5.3.3. Исследование взаимодействия EcAMPl со спорами гриба 89 Fusarium solani методом атомно-силовой микроскопии (АСМ)

6. Заключение 94

ВЫВОДЫ 96

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 97

1. Введение

1.1. Актуальность темы

В последнее время значительное внимание уделяется поиску в растениях органических веществ, обладающих биологической активностью, при этом основной упор делается на соединения, проявляющие бактерицидную или фунгицидную активность. Среди таких соединений наиболее представлены различные полифенолы, фенольные гликозиды, сапонины, ненасыщенные лактоны, диены и пигменты. Остается открытым вопрос о возможности их применения в защите культурных растений от болезней, поскольку все они являются низкомолекулярными вторичными метаболитами и внедрение их в будущем может привести всего лишь к замещению используемых в настоящее время пестицидов на аналогичные.

На этом фоне наиболее актуальными становятся проблемы поиска и изучения защитных пептидов растений, к которым относят антимикробные пептиды (АМП) и ингибиторы гидролаз насекомых. Эти молекулы, являясь компонентами иммунитета растений, способны действовать против патогенов в достаточно низких концентрациях, что часто коррелирует с их небольшим содержанием в растениях. Подобные пептиды могут образовывать семейства гомологичных молекул.

Важным направлением исследований в данной области является изучение АМП, выделенных из культурных и дикорастущих (в том числе сорных) растений сочетанием методов протеомики и геномики. В настоящее время считается, что относительная степень устойчивости дикорастущих растений к фитопатогенам обусловлена наличием АМП со специфическими структурами, которые могут действовать как индивидуально, так и в комплексе. Молекулярные и клеточные механизмы действия АМП растений также являются предметом активного изучения (Fant et al., 2000; van der Weerden et al., 2008; 2010; Lay et al., 2012).

АМП с широким спектром активности являются ключевыми факторами, обеспечивающими реализацию иммунной системы растений. Эти

молекулы способны активно действовать в ответ на внедрение патогенного микроорганизма в растение. Семена являются богатым источником различных пептидов, в том числе антимикробных. АМП растений представляют особый большой интерес для создания устойчивых к патогенам форм растений, поскольку их гены могут быть непосредственно встроены в геном с использованием методов генетической трансформации. Помимо этого, АМП рассматриваются в качестве альтернативы используемым пестицидам, что в перспективе может позволить сократить количество обработок агрохимикатами. Кроме того, применение таких соединений может способствовать активному подавлению патогенных организмов, обладающих резистентностью к используемым химическим средствам защиты растений.

1.2. Цели и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в выделении и структурно-функциональном исследовании ряда новых антимикробных пептидов семян ежовника (ЕсЫпосЫоа сгш^аШ).

В процессе данной работы были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Оптимизировать метод выделения АМП из семян ежовника.

2. Выделить и установить структуры новых антимикробных пептидов семян ежовника.

3. Проверить наличие антимикробной активности выделенных соединений.

4. Изучить взаимодействие АМП семян ежовника с фитопатогенным микроорганизмом на клеточном уровне.

1.3. Научная новизна исследований

Предложен метод выделения антимикробных пептидов из семян ежовника, сочетающий их кислотную экстракцию с последующим

фракционированием методами жидкостной хроматографии. Впервые из семян растения семейства Злаковые выделены дефензины, обладающие антифунгальной активностью на широкий спектр видов фитопатогенов, определены их полные первичные структуры. Показано, что замена Ala на His в С-концевом фрагменте молекулы дефензина достоверно приводит к снижению его антифунгальной активности. Из семян ежовника выделен новый пептид с уникальным расположением остатков цистеина, обладающий антифунгальной активностью широкого спектра. Для этого пептида установлена пространственная структура, представляющая собой новый тип укладки полипептидной цепи растительных антимикробных пептидов. Изучено взаимодействие пептида с фитопатогенным грибом на клеточном уровне и показано, что данная молекула обладает фунгистатическим действием и способна связываться с оболочкой спор гриба с последующей интернализацией в цитоплазму без нарушения целостности плазматической мембраны.

1.4. Практическая значимость

Выделенные в данной работе АМП семян ежовника могут быть использованы в для получения генетических конструкций с целью создания культурных растений с трансформированным геномом, обладающих повышенной устойчивостью к грибным фитопатогенам.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Характеристика антимикробных пептидов растений

Антимикробные пептиды являются важными компонентами врождённой системы защиты от патогенов всех живых организмов. Большинство АМП обладают широким спектром действия и могут рассматриваться как новый класс перспективных антимикробных агентов. По сравнению с традиционными антибиотиками антимикробные пептиды проявляют высокую селективность по отношению к патогенным микроорганизмам и в большинстве случаев не токсичны для животных и человека. В отличие от животных, растения не имеют характерной иммунной системы, поэтому антимикробные пептиды составляют основу их защиты от широкого спектра патогенов. Таким образом, всестороннее изучение данных соединений является перспективным направлением в области создания растений с трансформированных геномом с повышенной устойчивостью в стрессовым факторам биотической природы.

В последнее время подобные исследования стали особенно актуальны благодаря высокому развитию методов генной инженерии. Известны случаи применения антимикробных пептидов для создания трансгенных животных. Однако до сих пор точно не выяснена взаимосвязь между структурой и антимикробными свойствами защитных пептидов. Много неясного остаётся в клеточных и молекулярных механизмах их действия.

2. Классификация антимикробных пептидов растений

Ген - кодируемые антимикробные пептиды - это древние компоненты конститутивных защитных систем многоклеточных организмов для борьбы с патогенами (Thomma et al., 2002; Ganz, 2003). В настоящее время известно более 1000 АМП, обладающих различной структурой, аминокислотным составом и механизмом действия. Многие из них обладают широким спектром антимикробной активности. Общей чертой большинства таких

пептидов является неспецифическое взаимодействие с цитоплазматической мембраной, приводящее к разрушению липидного слоя и лизису атакуемой клетки. Полагают, что некоторые АМП проявляют высокую рецептор-независимую специфичность к патогенам, другие - взаимодействуют с определенными рецепторами на поверхности мембраны клетки патогена или с внутриклеточными мишенями (Garcia-Olmedo et al., 1998). В настоящее время АМП представляют собой полипептидные соединения длиной не более чем 100 аминокислотных остатков (Thomma et al., 2002; Ganz, 2003).

АМП обладают рядом общих для них свойств: небольшим размером, сумарным положительным зарядом молекулы, а также амфифильностью структуры, что позволяет им непосредственно или с участием рецепторов взаимодействовать с мембранами микроорганизмов, приводя к нарушению ее проницаемости.

Из разных видов растений, преимущественно из семян, выделены более тысячи АМП. В настоящее время в растениях обнаружено 7 основных семейств антимикробных пептидов, размеры которых варьируют в среднем от 20 до 90 аминокислот. К ним относятся тионины, дефензины, гевеин- и ноттин-подобные пептиды, циклотиды (макроциклические пептиды), неспецифические липид-переносящие белки и снекины (Hancock and Chappie, 1999; Garcia-Olmedo et al., 1998; Garcia-Olmedo et al., 2001) (табл. 1).

Кроме того, из ряда растений выделены АМП, не относящиеся ни к одному из известных семейств: АМП МВР-1 зерна кукурузы (Zea mays) (Duvick et al., 1992), пять АМП (MiAMPl, MiAMP2a, b, с, d) из нута (Macadamia integrifolia) (Marcus et al., 1997, 1999) и четыре гомологичных АМП (Ib-AMPl-4) семян недотроги мелкоцветковой (Impatiens balsamina) (Tailor et al., 1997).

Табл. 1. Классификация АМП растений

Семейство АМП

Биологическое действие

Структурные особенности

Литературны й источник

Тионины

Дефензины

Липид-

переносящие

белки

Гевеин-подобные

Ноттин-подобные

Циклотиды

Снекины

Антимикробное, ингибирование роста растительных и животных клеток

Фунгицидное,

бактерицидное

действие на

грамположительные

бактерии

Перенос

фосфолипидов,

фунгицидная и

бактерицидная

активность

Фунгицидное действие, в меньшей степени

антибактериальное на

грамположительные бактерии

Фунгицидное действие

Гемолитическая, бактерицидная и фунгицидная активность

Фунгицидное и бактерицидное действие

45-47 а.к.о., две а-спирали, образующие длинную ветвь, и короткая В-складка, образующая короткую ветвь, стабилизированную 3-4 8-8 мостами 35-54 а.к.о., одна а-спираль и 3 участка В-структуры, стабилизированные 4 8-8 мостами

90-93 а.к.о., 4 8-8 моста, 4 а-спиральных участка, соединенных петлями

29-41 а.к.о, 3-5 8-8 моста

Трехмерная структура представлена антипараллельным В-листом и В-поворотами

28-38 а.к.о., 3 8-8 моста

29-31 а.к.о., 3 В-складки, 3 S-S моста

63 а.к.о., 6 S-S мостов

Florack and Stiekema, 1994; Stec, 2006

Térras et al., 1995b;

Broekaert et al., 1995

Nielsen et al., 1996

Broekaert et al, 1992b; Martins et al., 1996; Odintsova et al., 2009

Broekaert et al., 1992a;

Broekaert et al., 1996

Craik et al., 1999, 2010; Ireland et al., 2006

Segura et al., 1999; Berrocal-Lobo et al., 2002

Все эти молекулы являются положительно заряженными при физиологических значениях рН, цистеин-богатыми, имеющими компактную

структуру, стабилизированную дисульфидными связями, число которых составляет от двух до десяти (рис. 1).

Рис. 1. Пространственные структуры различных семейств АМП растений: А -дефензии семян редиса (Brassica napus) (PDB ID: 1AYJ, Fant et al., 1998); Б - ß-пуротионин зерновок пшеницы (Triticum aestivum) (PDB ID: 1BHP, Stec et al.,

1995); В - неспецифический липид-переносящий белок зерновок пшеницы (Triticum aestivum) (PDB ID: 1GH1, Gincel et al., 1994); Г - гевеиноподобный пептид семян амаранта (Amaranthus caudatus) (PDB ID: 1MMC, Martins et al.,

1996); Д - циклический пептид из Chassalia parvifolia (PDB ID: 1BH4, Daly et al., 1999); E - ноттиноподобный пептид из Phytolacca americana (PDB ID: 1DKC, Gao et al., 2001). a-спирали выделены красно-желтым цветом, ß-тяжи - светло-синим.

Большинство таких пептидов несут гидрофобный и заряженный домены. Данная структура называется амфифильной и обеспечивает взаимодействие пептида с мембраной микроорганизма (Garcia-Olmedo et al., 2001). Все растительные АМП, для которых известна их пространственная организация, содержат ß-складки, ассоциированные с а-спиралью/спиралями (Hancock and Chappie, 1999).

Тионины представляют собой первые АМП, выделенные из растений. Представители этого семейства обнаружены в различных органах (семенах,

Д ^ Е

2.1. Тионины

стеблях, корнях, листьях) разных растений. Установлено, что тионины локализованы в вакуолях (Romero et al., 1997). В настоящее время известно более 100 последовательностей тионинов из 15 видов растений (Stec, 2006). Все они являются высокоосновными или нейтральными пептидами длиной в среднем 45-47 аминокислотных остатков (а.к.о.), соединенных 3-4 дисульфидными связями.

Тионины синтезируются в виде предшественников с молекулярной массой около 18 кДа, содержащих сигнальный и зрелый пептиды, а также С-концевой пропептид (Epple et al., 1995); в пределах одного вида растения С-концевые пропептиды могут быть высоко консервативны (Schräder-Fischer, Apel, 1993, 1994). Удаление С-концевого пропептида происходит в результате посттрансляционной модификации молекулы предшественника тионинов. Предполагается, что функция С-концевого пропептида состоит в нейтрализации токсического действия зрелого пептида до момента поступления предшественника в межклеточное пространство или в вакуоли (Florack and Stiekema, 1994; Bohlmann, 1994).

Пространственная структура тионинов (рис. 1Б) образована двумя параллельными a-спиралями и короткой ß-складкой. С-концевой участок тионинов образует петлю (Majewski J, Stec В., 2009).

Антимикробная активность данных пептидов показана по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям, грибам, дрожжам, а также для культур эукариотических клеток. Они ингибируют рост бактерий, а также фитопатогенных грибов и оомицетов при ингибирующей концентрации, вызывающей 50% эффект (ИК50) в диапазоне 1-15 мкг/мл (Stec, 2006; Loeza-Ángeles et al., 2008). Антифунгальная активность тионинов сильно снижается при наличии в среде ионов Ca в концентрациях более 5 мМ и одновалентными катионами при концентрации менее 50 мМ.

Как было отмечено выш�