Супрамолекулярные комплексы "гость-хозяин" с участием спиновых ловушек и нитроксильных радикалов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

Половяненко Дмитрий Николаевич

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ «ГОСТЬ-ХОЗЯИН» С УЧАСТИЕМ СПИНОВЫХ ЛОВУШЕК И НИТРОКСИЛЬНЫХ

РАДИКАЛОВ

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

О

Новосибирск - 2008 003460 1ОЭ

003460109

Работа выполнена в Институте Международный томографический центр Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель доктор физико-математических наук,

профессор Елена Григорьевна Багрянская

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук,

Владимир Акимович Надолинный

кандидат химических наук, Евгений Михайлович Глебов

Ведущая организация Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Защита состоится " 28 " января 2009 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 в Институте Химической Кинетики и Горения Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Института Химической Кинетики и Горения СО РАН и Институте Международный томографический центр СО РАН.

Автореферат разослан " 24 " декабря 2008 г.

Зам. председателя диссертационного совета, доктор химических наук, профессор

Н.П. Грицан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Исследования последнего десятилетия указывают на то, что свободные короткоживущие радикалы принимают участие в различных физиологических и патологических процессах в живых организмах. Для живых организмов большое значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS*), которые могут образовываться при реакции короткоживущих радикалов, например супероксидного радикала, с глутатионом (GSH). Вследствие высокой реакционной способности, стационарные концентрации таких радикалов низки, что затрудняет их непосредственное детектирование методами лазерного импульсного фотолиза или методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). В качестве метода детектирования короткоживущих радикалов часто используется метод ЭПР спиновых ловушек, основанный на реакции спиновых ловушек (как правило, нитронов) с короткоживущими радикалами с образованием относительно стабильных спиновых аддуктов. Наиболее важными характеристиками спиновых ловушек являются скорость реакции с короткоживущими радикалами, времена жизни образующихся спиновых аддуктов. Кроме того, для корректной интерпретации полученных результатов необходимо знание механизмов реакций короткоживущих радикалов со спиновыми ловушками. Поэтому исследование механизмов реакций короткоживущих радикалов с нитронами, является востребованной и актуальной задачей.

Нитроксильные радикалы широко используются в качестве зондов для определения рН-, полярности и вязкости среды, в качестве медиаторов радикальной полимеризации, зондов на оксид азота, для измерения концентрации кислорода, в медицинской диагностике заболеваний с помощью ЭПР-томографии, в качестве контрастных агентов в ЯМР-томографии и др. Проблемой применения нитроксильных радикалов в качестве спиновых меток и зондов, и нитронов в качестве спиновых ловушек in vivo, является быстрое восстановление нитроксилов и спиновых аддуктов до диамагнитных соединений, которые невозможно регистрировать методом ЭПР. Одним из решений этой проблемы является синтез комплексов спиновых ловушек с различными супрамолекулами или применение инкапсулирования спиновых ловушек и нитроксильных радикалов в супрамолекулы, такие как полисомы, циклодекстрины, каликсарены и др.. Функциональные свойства инкапсулированных нитроксильных радикалов зависят от подвижности нитроксилов в капсулах и константы равновесия образования комплекса с нанокапсулой. В литературе имеются данные об исследовании комплексов некоторых нитроксильных радикалов с

каликсаренами и кукурбитурилами и нитроксильных радикалов, ковалентно связанных с циклодекстринами в растворах. Однако данные об исследований комплексов «гость-хозяин» нитроксильных радикалов с супрамолекулами в твердой фазе и информация о подвижности нитроксилов в комплексах отсутствуют. Исследование комплексов нитроксилов с циклодекстринами, каликсаренами и кукурбитурилами в твердой фазе позволяет получить информацию о подвижности нитроксильных радикалов и поэтому является практически важным и актуальным.

Данная диссертация посвящена изучению механизма реакций широко используемой спиновой ловушки фенил-М-третбутилнитрон (ФБН) с тиильным радикалом глутатиона, исследованию химических и спектроскопических свойств супрамолекулярных комплексов спиновых зондов и спиновых ловушек, организованных по типу «гость-хозяин» и изучению перспектив использования супрамолекулярных комплексов кавитандов с участием спиновых зондов и спиновых ловушек для исследования биологических объектов.

Основными целями работы являются:

1. Установление механизма реакции спиновой ловушки фенил-М-третбутилнитрон (ФБН) и ее фторированного аналога с тиильным радикалом глутатиона, в том числе механизма реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к фенил-К-третбутилнитрону, получение констант скорости захвата радикала глутатиона спиновой ловушкой ФБН и измерение времени жизни соответствующего спинового аддукта.

2. Установление влияния циклодекстринов на эффективность детектирования глутатиильного радикала спиновой ловушкой ФБН методом ЭПР.

3. Определение структуры комплексов нитроксильных радикалов, ковалентно-связанных с циклодекстринами, различного строения, и свойств комплексов нитроксильных радикалов с каликсаренами и кукурбитурилом.

Научная новизна работы. Впервые показана обратимость реакции широко используемой ловушки фенил-М-третбутилнитрон с тиильным радикалом глутатиона. Измерены константа скорости реакции ФБН с глутатиильным радикалом, и время жизни соответствующего спинового аддукта. Показано, что осуществляется реакция нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к ФБН.

Показано, что образование комплексов (3-циклодекстринов с ловушкой ФБН позволяет увеличить эффективность детектирования тиильных радикалов. ФБН, ковалентно связанный с различными циклодекстринами, был впервые применен для детектирования тиильных радикалов, измерена константа скорости реакции ловушки ФБН, ковалентно связанного с |3-

циклодекстринами, с тиильными радикалами. Показано, что ФБН, ковалентно связанный с циклодекстрином, является более эффективной ловушкой для детектирования тиильных радикалов методом ЭПР по сравнению с ФБН.

Применение комбинации различных магнитно-резонансных методов - ЭПР Х- и \У-диапазонов, 'Н ЯМР спектроскопии позволило исследовать структуру нитроксильного радикала 1,1-диметилэтил 2-метил-1-фенилпропил нитроксила (ИРЫО), ковалентно связного с метилированным р-циклодекстрином. Показано, что для данного нитроксила наблюдается равновесие между комплексом с радикальным фрагментом, расположенным вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина.

Изучены спектроскопические свойства комплексов нитроксильных радикалов 4-метокси-ТЕМПО и №(2-мет;мпропил)-?^-(1-дготил фосфоно-2,2-диметилпропил)-аминоксила (ОБРЫ) с пара-гексаноил-каликс[4]аренами и кукурбит[7]урилом в твердой фазе, исследована подвижность этих радикалов в нанокапсулах. Показано, что пара-гексапоил-каликс[4]арены эффективно предохраняют заключенные в них нитроксильные радикалы от восстановления аскорбиновой кислотой.

Практическая ценность.

Измеренные в работе константы скоростей реакции глутатиильного радикала с ФБН и с фторированным ФБН и времена гибели соответствующих радикальных аддуктов, а также показанное в работе наличие реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к ФБН могут быть применены при анализе результатов экспериментов по детектированию Э-центрированных радикалов с применением ловушки ФБН в различных биологических системах. В работе показано, что применение циклодекстринов увеличивает эффективность спиновых ловушек при детектировании глутатиильных радикалов. Этот подход может быть применен для увеличения чувствительности метода ЭПР спиновых ловушек. Полученные в работе результаты показывают, что инкапсулирование нитроксильных радикалов в каликсарены увеличивает стабильность нитроксильных радикалов относительно восстановления аскорбиновой кислотой, что может быть использовано для улучшения свойств функциональных нитроксильных радикалов.

Личный вклад соискателя.

Автор диссертации участвовал в постановке задач, решаемых в диссертационной работе, получил оригинальные результаты методами ЭПР, ЯМР и лазерного импульсного фотолиза, квалифицированно провел обсуждение результатов. Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором либо при его непосредственном участии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на международных конференциях: Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter (Санкт-Петербург, Россия, 11-15 июля 2005 г.), The 4th International Conference on Nitroxide Radicals -SPIN-2005 (Новосибирск, Россия, 20-24 сентября 2005г.), The 39th Annual International Meeting ESR Group of the Royal Society of Chemistry "Advanced Techniques and Applications of EPR" (Эдинбург, Великобритания, 2-5 апреля 2006 г.), AMPERE NMR SCHOOL (Познань, Вёрзба, Польша, 22 июня - 01 июля 2006 г.), 13th Biennial Congress Society for Free Radical Research (Давос, Швейцария, 15-19 августа 2006 г.), Sendai-Berlin-Novosibirsk Seminar on Advanced EPR 2006 (Новосибирск, Россия, 28-31 августа 2006 г.), The 5th Asia-Pacific EPR/ESR Symposium 2006 (Новосибирск, Россия, 24-27 августа 2006 г.), National Symposium on Biophysics: Trends in Biomedical Research (Нью-Дели, Индия, 13-15 февраля 2007 г.), The 40th Annual International Meeting ESR Group Royal Society of Chemistry (Оксфорд, Великобритания, 25-29 марта 2007 г.), 90th Canadian Chemistry Conference and Exhibition 2007 (Винипег, Канада, 26-30 мая 2007 г.), International conference Modern development of magnetic resonance (Казань, Россия, 24-29 сентября 2007 г.), GIRSE-ARPE first join meeting -GIRSE07 (Наполи, Италия, 30 сентября - 03 октября 2007 г.), SFRR-Europe Meeting 2008 "Free Radicals and Nutrition: Basic Mechanisms and Clinical Apllication" (Берлин, Германия , 5-9 июля 2008 г.), XXIIIrd International Conference on Magnetic Resonanse in Biological Systems (Сан-Диего, Калифорния, CILIA, 24-29 августа 2008 г.), 3rd Annual Research Day (Огайо, США, сентябрь 2008 г.), 6th Asia Pacific EPR Society - EPR Symposium 2008 - APES 2008 (Керне, Австралия, 13-18 июля 2008 г.), EUROMAR 2008 Magnetic Resonance for the Future (Санкт-Петербург, Россия, 4-11 июля 2008 г.), 5th International Conference on Nitroxide Radicals SPIN 2008 (Анкона, Италия, 7-11 сентября 2008 г.).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, а также в 23 тезисах докладов на международных симпозиумах и конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 213 наименований. Работа изложена на 139 страницах, содержит 6 таблиц, 76 рисунков и 9 схем.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении отражена актуальность проблемы, решению которой посвящена данная диссертация, сформулированы основные цели работы и дано описание структуры диссертации.

В первой главе представленной диссертации приведен литературный обзор, в котором рассмотрен метод спиновых ловушек и его применение для детектирования короткоживущих радикалов, рассмотрены комплексы «гость-хозяин» различных молекул с циклодекстринами, каликсаренами, кукурбитурилами, и подходы к описанию подвижности нитроксильных радикалов при их ограниченном движении. Первая часть главы посвящена обсуждению свойств короткоживущих свободных радикалов, методов их детектирования и их роли в физиологических процессах. В отдельном параграфе обсуждаются свойства стабильных нитроксильных радикалов (НР) и их применения. Во второй части описаны комплексы «гость-хозяин» различных молекул с супрамолекулами, такими как циклодекстрины, каликсарены и кукурбитурилы. Большое внимание уделяется комплексам с участием спиновых ловушек, нитроксильных радикалов с супрамолекулами, а также спиновым ловушкам, ковалентно связанным с циклодекстринами. Представлены результаты исследований влияния циклодекстринов на эффективность детектирования короткоживущих радикалов методом ЭПР спиновых ловушек. В третьей части литературного обзора описаны методы изучения подвижности нитроксильных радикалов и подходы к расчету формы их спектров ЭПР при ограниченном движении, в том числе при использовании а качестве спиновых меткок для исследования свойств и структуры белков.

Во второй главе представлены результаты исследования механизма реакции спиновой ловушки фенил-М-третбутилнитрон (ФБН) и ее фторированного аналога (фтор-ФБН) с тиильным радикалом глутатиона (08*).

О

и ¿- "V „(Л'^А'8»

О ± и

ин2

ФБН фтор-ФБН ДМ ПО глутатаон ^БН)

Рис. 2.1. Структуры ловушек ФБН, фторированного ФБН (фтор-ФБН), ДМПО и глутатиона (СЭН).

Методом лазерного импульсного фотолиза измерены константы скорости реакции ОБ' радикала с ФБН и 5,5-диметшширолин-М-оксидом (ДМПО). Глутатиильные радикалы генерировались в реакции фотолиза нитрозоглутатиона (вЗЖ)) на длине волны 355 нм. Получен промежуточный оптический спектр поглощения в диапазоне длин волн 280-600 нм. Изменение оптической плотности на 340 нм. (рис. 2.2а) связано с гибелью 08" радикала.

а

V 2

VI ///з 1 — 0.8 мкс

2 — 2.8 мкс

3 — 48 мкс

400 500 длина волны, нм

5 10

время, мкс

15

5 10

[БТ], мМ

Рис. 2.2. а. Кинетические кривые, измеренные на длине волны 340 нм при импульсном фотолизе 0.25 мМ СБЖ) в водном обескислороженном растворе, рН 7.0 (1) в отсутствии спиновых ловушек и (2) в присутствии 10 мМ ФБН. Сплошные линии соответствуют моноэкспоненциальным функциям (выражение 2.1) с константой скорости для кривой (1) А/ет=(3-5±0.4)х10! с"' и (2) £,с,?=(10.7±1.0)х105 с"1. На вставке: промежуточный оптический спектр поглощения, б. Зависимость наблюдаемой константы скорости к^ от концентрации (о) ФБН и (■) ДМПО.

В присутствии ФБН наибольший вклад в кинетику гибели ОБ" вносит реакция с ФБН и исходным ОБЫО. В этом случае кинетика гибели ОБ" описывается выражением 2.1.

= -{к^Т], + *и[аЯШ]0)-[ОТ>*® -[СУ] (2.1)

ш

где [8Т]о и [ОБИС^о- начальные концентрации ловушки (ЭТ) и нитрозоглутатиона.

Из угла наклона зависимостей наблюдаемой константы скорости к™ от концентраций ловушек ФБН и ДМПО (рис. 2.26) были получены константы скорости реакции с бв* радикалом коБН = (6.7±1.5)х107 М'с"1 для ФБН и кДМпо = (1.1±0.5)х108 м'с"1 для ДМПО. Константа скорости реакции ОБ" с ОЗЫО была определена и оказалась равной Ау0=(1.5±0.3)х 109 М"'с"', что хорошо согласуется с представленным значением в литературе (1.7-109 М"'с"'). Был исследован механизм гибели адцукта ФБНЛЗЗ'и показано, что адцукт распадается на нитрон и тиильный радикал. Методом ЭПР получены кинетические кривые гибели ФБНЛЗЗ" (рис. 2.36).

В соответствии с кинетической схемой реакций, включающей распад адцукта на нитрон и тиильный радикал, кинетика гибели адцукта описывается выражением (2.2). ОТ + 8Т < ^ >5Т ЮБ' вБ' + GSNO > + N0'

3.5- 2.72

г

2 3.0 [ ■ 9 о 1.0

"о 2.5 ? 0.37

2.0 Л ^ 11 I 0,14

(Л лТ ш 0.05

СЭ X 1.5 \ДЧ —■ 0,02

ш 1.0

в

0.5

342 343 344 345 346 347 Магнитное поле, мТ

О 1 23456789 10 время, с

Рис. 2.3. а. Спектры ЭПР, полученные при непрерывном облучении раствора 10 мМ вБКО и 40 мМ ФБН в 0.1 М фосфатном буфере, 0.5 мМ ДЭТПА, рН. 7.0. Наблюдаемые константы СТВ для ФБНЛЗЗ*: аы = 1.540±0.007 мТ, аа = 0.315±0.004 мТ б. Кинетики гибели адцукта ФБН/ОЗ" при различном времени облучения: (0) 2 с; (0) 1.5 с; (0) 1 с. Сплошными линиями представлены расчетные моноэкспонециальные кривые (выражение 2.2) с параметром к/ =(1.2±0.1) с"1. На вставке', кинетики гибели аддукта и расчетные кривые в логарифмической шкале.

В случае если при образовании аддукта концентрации ловушки и СЭЫО изменяются пренебрежимо мало, наблюдаемая константа скорости гибели ФЕН/ОЭ" оказывается зависимой от начальных концентраций ловушки [5Т]0 и [ОЗЫО]о (выражение 2.2).

а

кят+к^СБКОЪ

[БТЮЗ^^-к^^ТЮБ'] (2.2)

где кяг и кщ - константы скоростей реакции СБ' с ловушкой (8Т) и ввМО, kf - константа скорости распада аддукта на ловушку и короткоживущий радикал.

Были зарегистрированы кинетические кривые гибели ФБ11/05' при различных начальных концентрациях [ФБН]о и [ОЗЫО]о. Зависимость наблюдаемой константы скорости гибели к""6" от комбинации [ФБН]0 и [ОЗКО]0 в соответствии с выражением 2.2. была аппроксимирована линейной функцией. В результате была получена константа скорости распада аддукта, к^ЕН = (1.7±0.2) с"'.

Конкурентным методом ЭПР с ДМПО в качестве ловушки-конкурента была получена константа скорости реакции фторированного ФБН (рис 2.1.) с СБ" (кфтор.ФБН= (4.3±0.8)-107 М"'с"'). Методом ЭПР измерена константа скорости распада аддукта для фтор-ФБН (к1фт"р~ФШ=(р.9±0.2) с'). Обратимость реакции ОБ* с ФБН и фтор-ФБН была подтверждена по результатам анализа продуктов гибели адцуктов методом 'Н и "Б ЯМР (для фтор-ФБН). Показано, что основным продуктом является дисульфид ОББв, образующийся в реакции ОБ* с ОБЮ.

Анализ данных, полученными методами *Н и 19Р ЯМР (для фтор-ФБН) позволил сделать вывод о наличии реакции необратимого нерадикального присоединения восстановленного глутатиона (вЭН) к ФБН и фтор-ФБН с образованием диастереоизомеров гидроксиламина ФБНЛЗЗН (схема 2.1).

53% 47%

ФБН ФБНЛЗЗН (1) ФБНЛЗвН (2)

Схема 2.1. Присоединение глутатиона (вБН) к ловушке ФБН с образованием диастереоизомеров гидроксиламина ФБН/СБН.

В присутствии окислителя гидроксиламины могут быть окислены до спиновых адцуктов, что может привести к ложному заключению о присутствии тиильного радикала. Поэтому при анализе данных метода ЭПР спиновых ловушек следует учитывать этот механизм нерадикального образования спинового аддукта.

В третьей главе изучено влияние метилированных Р-циклодекстринов (рис. 3.1) на реакцию ФБН и тиильного радикала, а именно на константу скорости реакции и стабильность образующихся спиновых аддуктов. Зарегистрированные ЭПР спектры свидетельствуют об изменении констант СТВ и времени корреляции для ФБШЗЗ* при образовании комплекса с метилированными р-

циклодекстринами. Более того в присутствии циклодекстринов существенно повышается

стабильность аддукта ФБНУОЗ* (таблица 3.1).

Нитрон ФБН, ковалентно-связанный с Р-циклодекстринами различного строения (рис. 3.1), был впервые применен для детектирования глутатиильного радикала.

к20

б^ОИз О.

сж, о;

ФБННШМЕВ (^Рз^СНз, И2=Н) ФБН-ТгаМЕВ (РгРг=Р3=СН3)

РгО)/

«Ж,);

Р - циклодексгрины Р-СЭ (Н,=К2=К3=Н) ЯАМЕВ ([^[^^Н, СН3) 01МЕВ (Я^Г^СНз, Я2=Н) ТШМЕВ №=Р!2=Р!з=СНз)

Рис. 3.1. Структуры метилированных Р-циклодекстринов и ФБН, ковалентно связанного с 01МЕВ и ТЫМЕВ.

346 347 348 349 Магнитное поле, мТ

4 6 8 10 12

время, с

Рис. 3.2. ЭПР спектры (а) и кинетические кривые гибели (б) аддуктов вЗ* с (а, ш) ФБН; (б.Т-Г) ФБН-01МЕВ; (в,О) ФБН-ТШМЕВ ФБН, полученные при облучении раствора 10 мМ ОБМО, 40 мМ ловушки, фосфатный буфер, рН 7.0. Справа сплошными линиями показаны расчетные моноэкспоненциальные функции. На вставке: кинетики гибели аддуктов в логарифмической шкале.

Для ФБН, ковалентно связанного с ТИМЕВ, конкурентным методом с ловушкой ДМПО была получена константа скорости реакции с ОБ' {кфБн-тммЕв= (5.1±1.4)х 107М"'с"'), которая оказалось близкой к соответствующей константе скорости для ФБН.

Таблица 3.1. Константы СТВ а:., и ац время корреляции вращения (тс) и наблюдаемая константа скорости гибели первого порядка (к/) для аадукта ФЕН/СБ* в присутствии различных |3-цикподекстринов.

Цнклодекстрин а мТ N. а мТ н, т„ не мябл -1 к с I

- 1.545 0.31 <0.1 1.42

ЛАМЕВ 1.487 0.31 0.7 0.26

01МЕВ 1.487 0.31 0.7 0.21

ТЫМЕВ 1.540 0.31 0.2 1.26

ФБН-01МЕВ 1.473 0.28 1.0 0.29

ФБН-ТШМЕВ 1.487 0.30 0.55 0.60

В зависимости от структуры циклодекстрина время жизни спинового аддукта изменяется в несколько раз (рис. 3.26, табл.3.1). Анализ кинетических зависимостей гибели аддуктов ФБН, связанного с циклодекстринами, показывает, что адцукты гибнут в реакции первого порядка - распада аддукта на исходную ловушку и тиильный радикал. Более того, стабильность аддуктов ФБН, связанного с циклодекстринами, существенно выше, чем обычного ФБН. Таким образом, ФБН, связанный с циклодекстрином, является более эффективной спиновой ловушкой чем ФБН.

Четвертая глава посвящена изучению структуры аддукта ловушки ФБН, связанной с циклодекстрином. Для этого был синтезирован радикальный аналог спинового аддукта -радикал 1,1-диметилэтил 2-метил-1-фенилпропил нитроксил (Т1РМО), ковалентно-

е^Ця

(МеО)7' ............х<ОМе)7

Рис. 4.1. Структура радикала Т1РЖ), ковалентно связанного с ТШМЕВ

связанный с триметилированным р-циклодекстрином (ПРМО-ТЫМЕВ, рис. 4.1). Изучение нитроксилов, связанных с циклодекстринами является само по себе интересным, т.к. эти соединения могут использоваться для контроля путей протекания реакций и в методе динамической поляризации ядер.

Для Т1РЖ)-ТЫМЕВ получены спектры Х- и диапазонов. Форма спектра ЭПР XV-диапазона указывает на наличие двух форм молекулы, что проявляется в виде широкого и узкого пиков (рис. 4.2б).

а А\ Т=325К б

347 348 349

Магнитное поле, мТ

3376 3378 3380 3382 3384 3386 3388 Магнитное поле, мТ

Рис. 4.2. Спектры ЭПР (а) Х-диапазон, комнатная температура и (б) \У-диапазон, Т=325 К для Т1РМО-ТЫМЕВ в смеси вода/глицерин. Символом '*' отмечены линии марганца 55Мп, используемого в качестве эталона для калибровки магнитного поля.

Для установления структуры форм ПРИО-ТИМЕВ были проведены эксперименты с молекулами конкурентами - метиловым оранжевым, 1-адамантанолом и 1-адамантиламином. константа комплексообразования которых с Р-циклодекстринами лежит в пределах 103-105 М"1. При добавлен™ ТЫМЕВ, так и Т1Р>ТО, связанного с ТШМЕВ, ЯМР спектры молекул-конкурентов претерпевают изменения. Это свидетельствует о включении молекул-конкурентов в полость циклодекстрина и в полость молекулы Т1РЖ> циклодекстрин. В тоже время спектры ЭПР для Т1РКО-ТММЕВ не изменяются при добавлении молекул-конкурентов. Это указывает на равновесие для молекулы между формой с расположением нитроксильного фрагмента вне полости

2.0 м.д.

1.5

1.0

Рис. 4.3. (а) 'Н ЯМР Спектр 1-адамантанола 7.5 мМ, рН 7.1 и 5 мМ в присутствии (б) 0.5 мМ ТШМЕВ; (в) 0.5 мМ ТШМО-ТШМЕВ.

циклодекстрина (форма В) и фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина (форма А).

В

А

Таким образом, можно предположить, что структура аддуктов ФБН-циклодекстрин близка к структуре форм комплекса Т1РКО-ТК1МЕВ.

В пятой главе представлены результаты исследования комплексов шггроксильных радикалов с пара-гексаноил-каликс[4]аренами и кукурбит[7]урилом в твердой фазе.

Г. Ананченко (ЫЯС 5£еас1'е Институт молекулярных наук, г. Оттава, Канада) были получены и охарактеризованы комплексы 4-метокси-2,2,6,6-тереаметилпипередин-Ы-оксила (Метокси-ТЕМПО, МТ) и №(2-метилпропил)-М-(1-диэтил фосфоно-2,2-диметилпропил)-аминоксила (БЕРЫ) с каликсареном. По данным рентгеноструктурного анализа монокристаллов комплекса была установлена тетрагональная структура с Р4/ппс ф^4) пространственной группой симметрии. Радикал МТ заключен в капсулу, состоящую из двух молекул каликсарена (рис. 5.1).

ТЕМПО-ОМе (МТ) DEPN (5G1)

Рис. 5.1. Структуры пара-гексаноил-каликс[4]арена (С4), и нитроксилных радикалов ТЕМПО-ОМе (МТ) и DEPN (SG1). И рентгеноструктурные данные для комплекса МТ с каликсаренами. а. Диаграмма упаковки для комплекса МТ с каликс[4]ареном (для упрощения не показаны молекулы МТ и атомы водорода), б. Капсула комплекса ТЕМПО-ОМе с двумя молекулами С4.

Образование капсул определяется слабьми Ван-Дер-Ваальсовыми взаимодействиями. Расстояние между ближайшими восемью радикалами в соседних капсулах составляет 10-16 ангстрем. Оценка величины диполь-дипольного взаимодействия для данных расстояний

составляет 0.4-1.8 мТ/см3. Вследствие этого в спектрах ЭПР неразбавленных образцов наблюдаются широкие линии, что не позволяет получить данные о подвижности нитроксилов в капсулах. Для устранения вклада диполь-дипольного взаимодействия в ширину линии с целью изучения подвижности радикалов в капсулах Г. Ананченко (Ш.С ЗЮаае Институт молекулярных наук, г. Оттава, Канада.) были синтезированы разбавленные образцы, в которых часть нанокапсул заполнены диамагнитными молекулами дибензшпсетона (ДБК). Для разбавленного образца (степень разбавления МТ / ДБК = 1/31) были зарегистрированы спектры ЭПР в Х-(9.26 ГГц), \¥-(94.45 ГГц) и У-(360 ГГц) диапазонах (рис. 5.2). При высокой температуре (Т=370 К) форма спектра ЭПР Х-диапазона для МТ в каликсаренах близка к спектру ЭПР в растворе, что свидетельствует о быстром движении МТ в капсулах. Магнитно-резонансные параметры МТ в каликсаренах были получены из сравнения экспериментальных спектров ЭПР в трех частотных диапазонах при низких температурах (Т=150 К) с расчетными спектрами в предположении отсутствия движения радикалов, и оказались равными АХХ(14М) = Ауу(14Ы) = 0.71 мТ, А22(141\1) = 3.35 мТ для компонент А-тензора и §ХХ1=2.01015(5), £«2=2.00960(5), §^=2.00620(2), gzz=2.00212(4) для компонент g-тeнзopa.

Интересным фактом оказалось наличие дублета в области, соответствующей компоненте в спектре ЭПР У-диапазона при Т=150 К. Показано, что пик gxxl соответствует одной молекуле МТ в капсулах, - молекуле МТ,

располагающейся в капсуле вместе с молекулой этанола. Этанол использовался в качестве растворителя при синтезе комплексов. После прогрева в течение 30 минут, молекулы этанола выходят из капсул пик в спектре исчезает (рис. 5.26). Выход молекул этанола из капсул подтверждают данные термогравитационного анализа -при температуре около 100 °С наблюдается изменение веса образца на 4%, что в точности соответствует расчетному значению при выходе этанола из капсул.

324 328 332 336 12.78 12.80 12.82 12.84 12.86

Магнитное поле, мТ Магнитное поле, Т

Рис. 5.2. ЭПР спектры Х- и У-диапазонов (360 ГГц) для поликристаллического образца комплекса (МТ+ДБК)/2С4 при МТ / ДБК = 1/31. Спектры У-диапазона при Т=150 К для (а) свежеприготовленных комплексов при и (б) после прогрева при 373 К в течение 30 мин. Пунктирными линиями изображены расчетные твердофазные спектры.

Спектр Y-диапазона для комплексов (МТ+ДБК)/С4 при высокой температуре состоит из одной широкой линии и оказывается не чувствительным к модели движения радикала в капсуле, поэтому проводилось моделирование лишь спектров Х- и W- диапазонов. Расчет спектров ЭПР в модели изотропного движения МТ в капсулах не позволяет получить хорошего согласия с экспериментальными спектрами. Из согласия положений линий в рассчитанных и экспериментальных спектрах ЭПР были оценены времена корреляции и энергия активации вращательного движения радикала в капсуле (Еакт=2.0 ккал/М).

Для описания характера движения радикалов в капсуле нами были проведены расчеты спектров ЭПР с использованием двух моделей. В первой модели предполагалось, что в собственной системе координат радикал быстро вращается вокруг некоторой оси, что приводит к усреднению g-тензора и тензора СТВ. При отклонении оси вращения в пределах 45 градусов вблизи экваториальной оси капсулы, наблюдается хорошее согласие между расчетными и экспериментальны спектрами. Во втором случае использована модель MOMD, (микроскопического порядка макроскопического беспорядка), предложенная Дж. Фридом с соавторам. В этой модели предполагается, что капсулы беспорядочно распределены в пространстве, при этом в капсулах присутствует ограниченное неизотрогшое движение радикала. Для движения радикала с учетом ограничивающего потенциала в виде гармоники с коэффициентом Х2,о=-1.5 удалось получить хорошее согласие для расчетного и экспериментального спектров при температурах 300-370 К. Ограничением этих двух моделей является требование малого времени корреляции движения радикала по сравнению с обратной частотой ЭПР спектрометра, то есть предел быстрого движения нитроксильного радикала. Поэтому хорошего согласия удается достичь лишь для спектров Х-диапазона и температур 300-370 К.

Для исследования устойчивости к восстановлению комплексов МТ/2-С4 были синтезированы твердые липидные наночастицы (TJIH, в англоязычной литературе "Solid Lipid Nanoparticles") на основе каликсаренов с размещенными внутри радикалами МТ. Предположительно, ТЛН представляют из себя

(2)

(3)

340 345 350

Магнитное поле, мТ Рис. 5.3. ЭПР спектры Х-диапазона твердых липидных наночастиц с помещенными в них МТ (1) при добавлении буферного раствора (рН 7.4, 1 мМ) аскорбиновой кислоты по прошествии (2) 15 мин.; (3) 24 ч. Символом '*' отмечены линии радикала аскорбата.

конгломераты частично упорядоченных нанокапсул МТ/2-С4, с размером наночастиц менее 270 нм. Форма спектра ЭПР для ТЛН в растворе (рис.5.3, (1)), свидетельствует о присутствии свободных МТ (~20%) и МТ в нанокапсулах. Для свободных радикалов спектр ЭПР представляет собой три узкие линии, для инкапсулированного МТ наблюдаются три широких пика. При добавлении буферного раствора аскорбиновой кислоты (рН 7.4, 1 мМ) к коллоидному раствору ТЛН с МТ в течение 5-ти минут сигнал свободных нитроксилов исчезает, и в спектре наблюдается сигнал радикала аскорбата (рис.5.3). Через несколько минут наблюдается лишь сигнал от МТ в капсулах, который не изменяется по прошествии 24 ч. Полученные данные свидетельствуют о том, что нанокапсулы 2 С4 предохраняют помещенные в них радикалы МТ от восстановления аскорбиновой кислотой.

Помимо комплексов МТ с каликсаренами были исследованы комплексы DEPN с каликсаренами С4 (рис.5.1). По данным рентгеноструктурного анализа монокристаллов комплекса DEPN/2-C4 установлена тетрагональная структура с P4/nnc (D4h4) пространственной группой симметрии. Для DEPN были получены смешанные комплексы DEPN и ДБК с каликсаренами.

Для смешанных комплексов DEPN / ДБК = 1/9 с каликсаренами получены спектры ЭПР Х-диапазона (рис.5.4) и высокопольные спектры ЭПР W- и Y-диапазонов. По результатам моделирования спектров ЭПР при температуре 150 К в трех частотных диапазонах в пределе отсутствия движения радикалов получены магнитно-резонансные параметры для DEPN в нанокапсулах: gxx=2.00965, gyy=2.00600, gzz=2.00210, АХХ(31Р)=АУУ(31Р)=4.25 мТ, AZZ(31P)=5.5 мТ l4xn=n

и Axx(14N)=Ayy(l4N)=0.45 мТ, Aa(14N)=3.3 мТ.

,11 Т=ЗООК Mr-

н! р 1 Т = 370 К

320 325 330 335 340 Магнитное попе, мТ Рис. 5.4. ЭПР спектры X-диапазона комплекса

(ОЕР№ДБК)/2 С4 в твердой фазе, ОЕРЫ/ДБК=1/9.

Сравнение формы спектров ЭПР Х-диапазона для (МТ+ДБК)/С4 и (DEPN+fflSK)/C4 при одной температуре указывает на то, что подвижность радикала DEPN в капсулах существенно меньше чем радикала МТ. При температуре 250 К для DEPN в капсулах наблюдается спектр подобный спектру замороженного раствора, в то же время при 250 К для МТ наблюдается ЭПР спектр, характеризующийся усредненными g-фактором и СТВ. Наличие двух магнитных ядер азота 14N и фосфора 31Р существенно усложняет моделирование спектров ЭПР для

комплексов DEPN с каликсаренами при высокой температуре. В рамках данной работы моделирование спектров при температурах выше 150 К не проводилось.

Нами были также исследованы комплексы радикала З-аминометил-2,2,5,5-тетраметил-пурролин-1-оксил (AMP) с кукурбит[7]урилом (СВ7) (рис. 5.5).

6

о.

AM Р анилин

Рис. 5.5 а. Структуры б. Спектры ЭПР для (АМР+анилин)/СВ7 со Прерывистыми лини Времена корреляции в| 1.7-10"8 с при 370 К.

Для AMP в во

константа СТВ оказались равными gis0=2.0060(2), £rN=(1.603±0.06) мТ и время корреляции при комнатной температуре тс=М0'" с. Образование комплекса с СВ7 приводит к изменению g-фактора и константы СТВ: g;so=2.0063(2), on=(1-487±0.05) мТ и времени корреляции до тс=5Т0"п с.

По данным рентгеноструктурного анализа комплексы AMP с СВ7 в твердой фазе являются аморфными. Разбавление комплексов было сделано с помощью анилина, также содержащего аминогруппу. Моделирование ЭПР спектра комплексов АМР/анилин=1/15 с СВ7 при 150 К в предположении, что движение радикалов отсутствует, позволило получить магнитно-резонансные параметры для (АМР+анилин)/СВ7: §,„=2.0095(2), gyy=2.0073(2), gzz=2.0022(l) и Axx(14N)=A17(14N)=0.53 мТ, АИ(14Н)=3.41 мТ.

По результатам моделирования спектров при различных температурах в модели медленного изотропного движения радикалов были получены времена корреляции вращения (рис.5.5б). При температуре 370 К время корреляции составляет 1.7-10"8 с, что свидетельствует о чрезвычайно низкой подвижности радикалов AMP в кукурбитурилах. Например, для МТ в капсуле на основе каликсареноп время корреляции вращения при Т=370 К составляет 1-10"10 с. Причиной чрезвычайно медленного движения AMP в кукурбитурилах может быть меньший размер полости СВ7 по сравнению с капсулой на основе каликсаренов. Кроме того, величина кулоновского взаимодействия протонированной NH2 группы AMP с порталами СВ7 превышает взаимодействие Ван-дер-Ваальса между МТ и каликсаренами.

,о ,г о и о о, о

!v N « / N- | N- l

w

кукрбит[7}урил

радикала AMP, анилина и кукурбит[7]урила. аморфных образов смешанных комплексов степенью разбавления AMP / анинил=1/15. ими представлены расчетные спектры, защения (тс) составляли 5-10'7 с при 150 К и

дном растворе изотропный g-фактор и

325

Т = 150 к

Т = 300 К

Т = 370 К

330

335

Магнитное поле, мТ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Изучен механизм реакции спиновых ловушек ФБН и фтор-замещенного ФБН с тиильным радикалом глутатиона и показана обратимость этих реакции. Измерены константы скорости реакции ловушек ФБН ((6.7±1.5)х107 М"'с'') и его фторированного аналога ((4.3+0.8)х107 М"'с"') с тиильным радикалом глутатиона. Показано наличие реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона (GSH) к ловушкам ФБН и фтор-замещенному ФБН с образованием стабильных гидроксиламинов.

2. Показано, что применение циклодекстринов позволяет повысить эффективность детектирования глутатиильных радикалов спиновой ловушкой ФБН. Для ФБН в присутствии ß-циклодекстринов и для ФБН, ковалентно связанного с ß-циклодекстринами, константа скорости реакции с тиильным радикалом изменяется несущественно, а время жизни соответствующих спиновых аддуктов возрастает.

3. На основание анализа спектров ЭПР Х- и W-диапазонов и 'Н ЯМР сделан вывод о том, что для нитроксильного радикала TIPNO ковалентно-связанного с ß-циклодекстрином наблюдается равновесие между комплексом с радикальным фрагментом, расположенным вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина.

4. Изучена подвижность нитроксильных радикалов 4-метокси-ТЕМРО и DEPN в пара-гексаноил-каликс[4]аренах и стабильного нитроксильного радикала AMP с кукурбиг[4]урилами в твердой фазе. Из сравнения расчетных и экспериментальных спектров ЭПР получены магнитно-резонансные параметры комплексов в твердой фазе и информация о структуре и характере движения нитроксилов внутри полости нанокапсул. Продемонстрировано, что каликсарены предохраняют инкапсулированные нитроксильные радикалы от восстановления аскорбиновой кислотой.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Polovyanenko D.N., Marque S.R.A., Lambert S., Jicsinszky L., Plyusnin V.F., Bagryanskaya E.G. EPR spin trapping of gluthathiyl radicals by PBN in the presence of ß-cyclodextrins and by PBN attached to ß-cyclodextrin //J. Phys. Chem. В., 2008, 112 (41), p. 13157-13162.

2. Polovyanenko D.N., Bagryanskaya E.G., Schnegg A., Möbius К., Coleman A.W., Ananchenko G.S., Udachin K.A., Ripmeester J.A. Inclusion of 4-methoxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl in a calixarene nanocapsule in the solid state // Phys. Chem. Chem. Phys., 2008,10, p.1-9.

3. Bagryanskaya E.G., Bardelang D., Chenesseau S., Finet J.-P., Jicsinszky L., Karoui H., Marque S. R. A., Möbius K., Polovyanenko D.N., Savitsky A., Tordo P. EPR, NMR, and Thermodynamic Evidences for Forced Nuclear Spin - Electron Spin Interactions in the Case of l-Phenyl-2-methylpropyl-l,l-dimethyl-2-nitroxide (TIPNO) Appended Permethylated ß-Cyclodextrin. II Applied Magnetic Resonance, 2009, 36 (1).

4. Polovyanenko D.N., Plyusnin V.F., Reznikov V.A., Khramtsov V.V., Bagryanskaya E.G. Mechanistic studies of the reactions of nitrone spin trap PBN with glutathiyl radical. // J. Phys. Chem. B, 2008,112 (15), p.4841-4847.

5. Ananchenko G.S., Udachin K.A., Coleman A.W., Polovyanenko D.N., Bagryanskaya E.G., Ripmeester J. A. Crystalline inclusion complex of a calixarene with a nitroxide. // Chem. Comm., 2008, p.223-225.

6. Polovyanenko D.N., Bagryanskaya E.G., Plyusnin V.F., Reznikov V.A., Khramtsov V.V. The reaction of nitrone spin trap PBN with glutathiyl radical: probable antioxidant mechanism. II Free Radical Research, 2008, 42, S65-S65.

7. Polovyanenko D.N., Bagryanskaya E.G., Reznikov V.A., Clanton T.L., Khramtsov V.V. New insight into the antioxidant mechanisms of PBN spin trap. // Free Radical Research, 2006, 40, S93-S93.

8. D. Polovyanenko, V.F. Plyusnin, L. Jicsinszky, S. Lambert, S. Marque, E. Bagryanskaya Influence ofß-cyclodextrins on EPR spin trapping of glutathiyl radicals by PBN. II Abstract of the 5th International Conference on Nitroxide Radicals SPIN 2008, September 7-11, 2008, Ancona, Italy, S4.

9. Semenov, S., Polovyanenko, D., Kirilyuk, I., Grigor'ev, I., Geras'ko, O., Fedin, V, and Bagryanskaya, E. Study of nitroxides encapsulated in cucurbit[7]uril // Book of abstracts of the XXIIIrd International Conference on Magnetic Resonanse in Biological Systems, August 24-29, 2008, San Diego, California, USA, p. 268.

10. D. Polovyanenko, S. Marque, J.-P. Finet, E. Bagryanskaya EPR spin trapping of thiyl radicals by PBN in the presence of methylated cyclodextrins and by PBN covalently bounded to methylated ß-cyclodextrins. II Abstract of the 6th Asia Pacific EPR Society - EPR Symposium 2008 (APES 2008), July 13 - 18, 2008, Cairns, Queensland, Australia, P-2.

11. D. Polovyanenko, M. Fedin, G. Ananchenko, J. Ripmeester, A. Savitsky, A. Schnegg, K. Möbius, L. Kulik, E. Bagryanskaya High field EPR study of nitroxides in p-hexanoyl calixarene. II Abstract of the EUROMAR 2008 Magnetic Resonance for the Future, July 411, 2008, St. Petersburg, Russia, p.205.

12. Bagryanskaya E. G., Bardelang D., Finet J.-P., Karoui H., Lambert S., Marque S. R. A., Möbius K., Polovyanenko D ., Rockenbauer A., Savitsky A., Tordo P. Nitroxide appended beta-cyclodextrine: is there a self-included complex? II Abstract of the GIRSE-ARPE first join meeting (GIRSE07), September 30 - October 03, 2007, Salerno, Napoli, Italy.

13. E.G. Bagryanskaya, D.N. Polovyanenko , M. V.Fedin, G.S. Ananchenko, A. Schnegg, A. Savitsky, K. Möbius Mobility of Nitroxides Encapsulated in Calixarenes Studied by

Multifrequency EPR. II Abstract of the International conference Modern development of magnetic resonance, September 24-29,2007, Kazan, Russian Federation.

14. Ananchenko G.S. , Bagryanskaya E.G., Polovyanenko D ., Udachin K.A., Ripmeester J., Coleman A.W., Schnegg A., Möbius K. Encapsulation of Nitroxides by Calixarenes: Structure of Complexes and Mobility of Guests as Revealed by Ultra High Field EPR. II Abstract of the 90 th Canadian Chemistry Conference and Exhibition (CSC2007) , May 2630, 2007, Winnipeg, Manitoba, Canada, report 0050.

15. E. Bagryanskaya, D. Polovyanenko, G. Ananchenko, K. Udachin, J. Ripmeester, A. Coleman, A. Schnegg, K. Möbius High-field EPR reveals the mobility of nitroxides encapsulated in calixarenes. II Abstract of The 40 th Annual International Meeting ESR Group Royal Society of Chemistry, March 25-29, 2007, New College, Oxford, UK, p.46.

16. D. Polovyanenko, V. Reznikov, V. Khramtzov, J.-P. Finet, S. Marque, H. Karoui, D. Bardelang, S. Lambert, A. Savitsky, K. Möbius and E. Bagryanskaya EPR Spin Trapping of Thiyl Radicals by PBN and PBN attached to cyclodextrin. II Abstract of the 40 th Annual International Meeting ESR Group Royal Society of Chemistry, March 25-29, 2007, New College, Oxford, UK, p. 117.

17. D.N. Polovyanenko, D.I. Potapenko, V.A. Reznikov, V.V. Khramtzov, E.G. Bagryanskaya Detection of thiyl short-lived radicals using EPR, 'H and19F NMR spin trapping. II Abstract of the 5th Asia-Pacific EPR/ESR Symposium 2006, August 24-27, 2006, Novosibirsk, Russia, p. 143.

18. D.N. Polovyanenko, D.I. Potapenko, V.A. Reznikov, V.V. Khramtsov, E.G. Bagryanskaya, Detection of thiyl short-lived radicals using EPR, 'H and19 F NMR spin trapping. II Abstract of the Sendai-Berlin-Novosibirsk Seminar on Advanced EPR 2006, August 28-31, 2006, Novosibirsk, Russia, p.61.

19. D.N. Polovyanenko, D.I. Potapenko, V.A. Reznikov, V.V. Khramtzov and E. G. Bagryanskaya Detection of thiyl and other free short-lived radicals using EPR 'H and19F NMR spin trapping. II Abstract of the AMPERE NMR SCHOOL, June 22 - July 01, 2006, Poznan/Wierzba, Poland, p58.

20. E. Bagryanskaya, D. Polovyanenko , V. Reznikov, V. Khramtzov, Detection ofS-centered radicals using EPR and 19F NMR Spin Trapping. // Abstract of the 39th Annual International Meeting Electron Spin Resonance Group of the Royal Society of Chemistry "Advanced Techniques and Applications of EPR", April 2-5, 2006, Edinburgh, UK, poster 2.

21. D.N. Polovyanenko, A.A. Bobko, D.I. Potapenko, V.A. Reznikov, I.A. Kirilyuk, V.V. Khramtzov, E.G. Bagryanskaya NMR spin trapping and time-resolved CIDNP study of the reactions of Nitronyl nitroxides and spin traps with alkyl and thiyl radical. II Abstract of 4th International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides (SPIN-2005), September 20-24 2005, Novosibirsk, Russia, p.89.

Подписано к печати 22 декабря 2008г.

Тираж 100 экз. Заказ № 1770. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

§1.1. Метод спиновых ловушек.

§1.1.1. Свободные радикалы.

§ 1.1.2. Метод ЭПР спиновых ловушек.

§ 1.1.3. Метод ЯМР спиновых ловушек.

§1.2. Комплексы «гость-хозяин» с различными супрамолекулами.

§ 1.2.1. Циклодекстрины и их комплексы.

§1.2.2. Каликсарены и их комплексы.

§ 1.2.3. Кукурбитурилы и их комплексы.

§1.3. Подвижность нитроксильных радикалов при ограниченном движении.

Постановка задачи.

Глава 2. Исследование механизма реакции глутатиильного радикала и спиновой ловушки ФБН.

Введение.

§2.1. Экспериментальна часть.

§2.2. Результаты и обсуждение.

§2.1.1. Измерение скорости захвата тиильного радикала.

§2.2.2. Механизм гибели радикального аддукта.

§2.2.3. Измерение константы скорости реакции с тиильным радикалом конкурентным методом.

§2.2.4. Исследование механизма гибели ФБН/GS* и фтор-ФБН /GS* методом ЯМРспектроскопии.

§2.5.5. Нерадикалыюе присоединение восстановленного глутатиона к ФБН.

§3.1. Экспериментальная часть.69

§3.2. Результаты и их обсуждение.70

§3.2.1. Измерение константы скорости захвата тиильного радикала в присутствии рциклодекстринов.70

§3.2.2. ЭПР спектры адцукта и кинетический анализ.73

§3.2.3. Спектры ЭПР и кинетики гибели адцуктов ФБН, ковалентно связанного с Рциклодекстринами.76

§3.2.4. Измерение константы скорости реакции глутатиильных радикалов с ФБН, коваленто связанным с Р-цикл о декстринами.79

§3.3. Заключение.81

Глава 4. Структура нитроксильного радикала TIPNO, ковалентно связанного с р~ циклодекстрином.82

Введение.82

§4.1. Экспериментальная часть.82

§4.2. Результаты.83

§4.2.1. Исследование методом ЭПР W-диапазона.84

§4.2.2. Конкурентные эксперименты с применением ЯМР.86

§4.2.3. Конкурентные эксперименты с применением ЭПР.91

§4.3. Обсуждение результатов.92

§4.4. Заключение.93

Глава 5. Изучение комплексов нитроксильных радикалов с каликсаренами н кукурбитурпламн.94

Введение.94

§5.1. Экспериментальная часть.94

§5.2. Результаты и их обсуждение.95

§5.2.1. Структура комплекса 4-метокси-ТЕМПО с каликсаренами.95

§5.2.2. Исследование комплекса методом ЭПР в различных частотных диапазонах. 99

§5.2.3. Подвижность и динамика радикалов, помещенных в каликсарены.104

§5.2.4. Устойчивость инкапсулированных нитроксильных радикалов к восстановлению аскорбиновой кислотой.111

§5.2.5. Комплексы нитроксильного радикала DEPN с каликсаренами.114

§5.2.6. Комплексы нитроксильных радикалов с кукурбит[7]урилом.119

§5.3. Заключение.122

Результаты и выводы.123

Благодарности.124

Список литературы.125

Введение

Исследования последнего десятилетия указывают на то, что свободные короткоживущие радикалы принимают участие в различных физиологических и патологических процессах в живых организмах. Показано, что микробицидная функция фагоцитов, осуществляющих защиту организма от бактериальных инфекций, во многом зависит от способности клеток вырабатывать супероксидный радикал. Однако высокий уровень генерации реактивных форм кислорода клетками может вызвать повреждение клеток и тканей организма. Генерация кислородных радикалов приводит к окислительному повреждению биомолекул, к нарушению функций биомембран, повреждению ДНК, и в итоге к развитию патологий и старению. Неспаренный электрон может быть локализован не только на атомах кислорода, но и на атомах углерода, серы, азота. Для живых организмов большое значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS") и радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах серы и азота. Основным источником супероксидного радикала (Ог*") в биологических системах являются ферментативные системы, такие как митохондриальная цепь переноса электронов и фотосинтезирующая система хлоропластов растительных клеток, и ксантиноксидаза. Тиильные радикалы могут образовываться из глутатиона (GSH), при реакции глутатиона с различными реакционными частицами. С реакциями, инициируемыми в живых организмах этими радикалами, связывают такие важные биологические процессы как окислительный стресс, ишемию и т.д. Типичные времена жизни таких радикалов лежат в диапазоне времен 10"9-Ю-6 секунд. Вследствие высокой реакционной активности, стационарные концентрации таких радикалов низки, что затрудняет, а часто делает невозможным их непосредственное детектирование методами лазерного импульсного фотолиза или методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

В качестве метода детектирования короткоживущих радикалов часто используется метод ЭПР спиновых ловушек, основанный на реакции спиновых ловушек (как правило, нитронов) с короткоживущими радикалами с образованием относительно стабильных о спиновых адцуктов, времена жизни которых лежат в диапазоне 1-10 секунд. Наиболее важными характеристиками спиновых ловушек являются — скорость реакции нитрона с короткоживущими радикалами, времена жизни образующихся спиновых адцуктов и различие спектров ЭПР в зависимости от захваченного короткоживущего радикала. Кроме 4 того, для корректной интерпретации полученных результатов необходимо знание механизмов реакций короткоживущих радикалов со спиновыми ловушками. В некоторых случаях наличие нерадикального присоединения по двойной связи нитронов по механизму Форрестера-Хэпбурна и последующее окисление продукта может приводить к неверным выводам о наличии короткоживущих радикалов в системе. Поэтому исследование механизмов реакций короткоживущих радикалов с нитронами, а также измерение констант скоростей реакций присоединения короткоживущих радикалов к нитронам и констант гибели соответствующих спиновых адцуктов является востребованной и актуальной задачей.

Нитроксильные радикалы широко используются в качестве рН-чувствительных зондов, зондов и спиновых меток для определения полярности и вязкости среды, в качестве медиаторов радикальной полимеризации, зондов на оксид азота, для измерения концентрации кислорода, в медицинской диагностике заболеваний с помощью ЭПР-томографии, в качестве контрастных агентов в ЯМР-томографии.

Проблемой применения нитроксильных радикалов в качестве спиновых меток и зондов, и нитронов в качестве спиновых ловушек in vivo, является быстрое восстановление нитроксилов и спиновых адцуктов до диамагнитных соединений, которые невозможно регистрировать методом ЭПР. Основной реакцией, приводящей к короткому времени жизни спиновых адцуктов и нитроксильных радикалов в живых системах, является их восстановление до гидроксиламинов. Для уменьшения роли этой реакции и получения новых, более эффективных, спиновых ловушек и нитроксильных радикалов применяются два подхода. Это разработка новых стерически-затрудненных нитронов или нитроксильных радикалов, с низкой скоростью восстановления. Другой подход заключается в синтезе спиновых ловушек на основе комплексов нитронов с различными макромолекулами или применение инкапсулирования спиновых ловушек и нитроксильных радикалов в супрамолекулы, такие как полисомы, циклодекстрины, каликсарены и др. Заключение нитроксильных радикалов в различные нанокапсулы или макромолекулы приводит к повышению стабильности радикалов по отношению к восстановлению различными биологическими восстановителями. Функциональные свойства инкапсулированных нитроксильных радикалов зависят от подвижности нитроксилов в капсулах и константы равновесия образования комплекса с нанокапсулами. В литературе имеются данные об исследовании комплексов некоторых нитроксильных радикалов с каликсаренами и кукурбитурилами и нитроксильных радикалов, ковалентно связанных с циклодекстринами в растворах. Однако данные об исследовании комплексов гость-хозяин» нитроксильных радикалов с супрамолекулами в твердой фазе и информация о подвижности нитроксилов в комплексах отсутствуют. Исследование комплексов нитроксилов с циклодекстринами, каликсаренами и кукурбитурилами в твердой фазе позволяет получить информацию о подвижности нитроксильных радикалов и поэтому является практически важным и актуальным.

В настоящей работе методами ЭПР, ЯМР и лазерного импульсного фотолиза исследован механизм реакции глутатиильного радикала с широко применяемой спиновой ловушкой ФБН, изучено влияние циклодекстринов различного строения на время жизни спинового аддукта глутатиильного радикала с ФБН. Кроме того, исследовано влияние инкапсулирования некоторых нитроксильных радикалов и спиновой ловушки ФБН на их функциональные свойства.

Целями настоящей работы были:

1. Установление механизма реакции спиновой ловушки фенил-И-третбутилнитрон (ФБН) и ее фторированного аналога с тиильным радикалом глутатиона, в том числе механизма реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к фенил-И-третбутилнитрону, получение констант скорости захвата радикала глутатиона спиновой ловушкой ФБН и измерение времени жизни соответствующего спинового аддукта.

2. Установление влияния циклодекстринов на эффективность детектирования глутатиильного радикала спиновой ловушкой ФБН методом ЭПР.

3. Определение структуры комплексов нитроксильных радикалов, ковалентно-связанных с циклодекстринами, и свойств комплексов нитроксильных радикалов с каликсаренами и кукурбитурилами.

Научная новизна работы.

Впервые показана обратимость реакции широко используемой ловушки фенил-N-третбутилнитрон с тиильным радикалом глутатиона. Измерены константа скорости реакции ФБН с глутатиильным радикалом, и время жизни соответствующего спинового аддукта. Показано, что осуществляется реакция нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к ФБН.

Показано, что образование комплексов Р-циклодекстринов с ловушкой ФБН позволяет увеличить эффективность детектирования тиильных радикалов. ФБН, ковалентно связанный с различными циклодекстринами, был впервые применен для детектирования тиильных радикалов, измерена константа скорости реакции ловушки ФБН, ковалентно связанного с p-циклодекстринами, с тиильными радикалами. Показано, что ФБН, ковалентно связанный с циклодекстрином, является более эффективной ловушкой для детектирования тиильных радикалов методом ЭПР по сравнению с ФБН.

Применение комбинации различных магнитно-резонансных методов - ЭПР Х- и W-диапазонов, 'Н ЯМР спектроскопии позволило исследовать структуру нитроксильного радикала 1,1-Диметилэтил 2-метил-1-фенилпропил нитроксила (TIPNO), ковалентно связного с метилированным p-циклодекстрином. Показано, что для данного нитроксила наблюдается равновесие между комплексом с радикальным фрагментом, расположенным вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина.

Изучены спектроскопические свойства комплексов нитроксильных радикалов 4-метокси-ТЕМПО и №(2-метилпропил)-К-(1-диэтил фосфоно-2,2-диметилпропил)-аминоксила (DEPN) с пара-гексаноил-каликс[4]аренами и кукурбит[7]урилом в твердой фазе, исследована подвижность этих радикалов в нанокапсулах. Показано, что пара-гексаноил-каликс[4]арены эффективно предохраняют заключенные в них нитроксильные радикалы от восстановления аскорбиновой кислотой.

Практическая ценность работы.

Измеренные в работе константы скоростей реакции глутатиильного радикала с ФБН н с фторированным ФБН и времена гибели соответствующих радикальных адцуктов, а также показанное в работе наличие реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к ФБН могут быть применены при анализе результатов экспериментов по детектированию S-центрированных радикалов с применением ловушки ФБН в различных биологических системах. В работе показано, что применение циклодекстринов увеличивает эффективность спиновых ловушек при детектировании глутатиильных радикалов. Этот подход может быть применен для увеличения чувствительности метода ЭПР спиновых ловушек. Полученные в работе результаты показывают, что инкапсулирование нитроксильных радикалов в каликсарены увеличивает стабильность нитроксильных радикалов относительно восстановления аскорбиновой кислотой, что может быть использовано для улучшения свойств функциональных нитроксильных радикалов.

Объем и структура работы.

В первой главе представленной диссертации приведен литературный обзор, касающийся метода спиновых ловушек и его применения, комплексов «гость-хозяин» различных молекул с циклодекстринами, каликсаренами, кукурбитурилами, и подходов к описанию подвижности нитроксильных радикалов при их ограниченном движении.

Вторая глава посвящена исследованию механизма реакции спиновой ловушки фенил-Ы-третбутилнитрона (ФБН) и его фторированного аналога с тиильным радикалом глутатиона. Измерены константы скорости реакции тиильного радикала с ФБН и фторированным ФБН, показана обратимость этой реакции. Получены константы скорости гибели адцуктов ФБН/тиильный радикал и фторированный ФБН/тиильный радикал. Кроме того, показано наличие реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона (GSH) к ловушкам ФБН и фторированному ФБН с образованием стабильных ги дрокси ламинов.

В третьей главе представлены результаты исследования влияния метилированных Р-циклодекстринов на реакцию ФБН и тиильного радикала, а именно на константу скорости реакции и стабильность образующихся спиновых аддуктов. Нитрон ФБН, ковалентно-связанный с p-циклодекстринами различного строения, был впервые применен для детектирования глутатиильного радикала. Показано, что для ФБН в присутствии Р-циклодекстринов и ФБН, ковалентно-связанного с р-циклодекстрином, несущественно изменяется константа скорости реакции ФБН с короткоживущим радикалом. При этом время жизни спинового аддукта увеличивается в несколько раз.

Четвертая глава диссертации посвящена изучению структуры нитроксильного радикала 1,1-диметилэтил 2-метил-1-фенилпропил нитроксил (TIPNO), ковалентно-связанного с триметилированным p-циклодекстрином. Показано, что для данного нитрокснла характерно равновесие между двумя формами, т.е. комплексом с радикальным фрагментом, расположенным вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина.

В пятой главе представлены результаты исследования комплексов нитроксильных радикалов с пара-гексаноил-каликс[4]аренами и кукурбит[7]урилом в твердой фазе. Методом ЭПР различных частотных диапазонов изучена подвижность нитроксильных радикалов в нанокапсулах на основе каликсаренов и кукур[7]битурилов.

В конце диссертации приведены основные результаты и выводы, и список литературы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых научных международных журналах, рекомендованных ВАК и 23 тезиса докладов конференций. Список статей:

1. Polovyanenko, D.N., Marque, S.R.A., Lambert, S., Jicsinszky, L., Plyusnin, V.F., Bagryanskaya, E.G. "EPR spin trapping of gluthathiyl radicals by PBN in the presence of p-cyclodextrins and by PBN attached to p-cyclodextrin", J. Phys. Chem. В., 2008, 112 (41), 13157-13162.

2. Polovyanenko, D.N., Bagryanskaya, E.G., Schnegg, A., Mobius, K., Coleman, A.W., Ananchenko, G.S., Udachin, K.A., Ripmeester, J.A. "Inclusion of 4-methoxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl in a calixarene nanocapsule in the solid state", Phys. Chem. Chem. Phys., 2008, 10, 1-9.

3. Bagryanskaya, E.G., Bardelang, D., Chenesseau S., Finet, J.-P., Jicsinszky, L., Karoui, H., Marque, S. R. A., Mobius, K., Polovyanenko, D.N., Savitsky, A., Tordo, P. " EPR, NMR, and Thermodynamic Evidences for Forced Nuclear Spin - Electron Spin Interactions in the Case of l-Phenyl-2-methylpropyl-l,l-dimethyl-2-nitroxide (TIPNO) Appended Permethylated P-Cyclodextrin", Applied Magnetic Resonance, 2009, 36 (1).

4. Polovyanenko, D.N., Plyusnin, V.F., Reznikov, V.A., Khramtsov, V.V., Bagryanskaya, E.G. "Mechanistic studies of the reactions of nitrone spin trap PBN with glutathiyl radical", 2008, J. Phys. Chem. B, 112 (15), 4841-4847.

5. Ananchenko, G.S., Udachin, K.A., Coleman, A.W., Polovyanenko, D.N., Bagryanskaya, E.G., Ripmeester, J. A. "Crystalline inclusion complex of a calixarene with a nitroxide", Chem. Comm., 2008, 223-225.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих конференциях:

1. 5th International Conference on Nitroxide Radicals SPIN 2008, 7-11 сентября 2008 г., Анкона, Италия.

2. 3rd Annual Research Day, сентябрь 2008 г., Госуниверситет штата Огайо, США.

3. XXIIIrd International Conference on Magnetic Resonanse in Biological Systems, 24-29 августа 2008 г., Сан-Диего, Калифорния, США.

4. 6th Asia Pacific EPR Society - EPR Symposium 2008 (APES 2008), 13 - 18 июля 2008 г., Каине, Австралия.

5. EUROMAR 2008 Magnetic Resonance for the Future, 4-11 июля 20 08 г., Санкт-Петербург, Россия.

6. SFRR-Europe Meeting 2008 "Free Radicals and Nutrition: Basic Mechanisms and Clinical Apllication", 5-9 июля 2008 г., Берлин, Германия.

7. GIRSE-ARPE first join meeting (GIRSE07), 30 сентября - 03 октября 2007 г., Наполи, Италия.

8. International conference Modern development of magnetic resonance, 24-29 сентября 2007 г., Казань, Россия.

9. 90th Canadian Chemistry Conference and Exhibition (CSC2007), 26-30 мая 2007 г., Винипег, Канада.

10. The 40th Annual International Meeting ESR Group Royal Society of Chemistry, 25-29 марта 2007 г., Оксфорд, Великобритания.

11. National Symposium on Biophysics: Trends in Biomedical Research, 13-15 февраля, 2007, Нью-Дели, Индия.

12. 13th Biennial Congress Society for Free Radical Research - International, 15-19 августа, 2006 г., Давос, Швейцария.

13. The 5th Asia-Pacific EPR/ESR Symposium 2006, 24-27 августа 2006 г., Новосибирск, Россия.

14. Sendai-Berlin-Novosibirsk Seminar on Advanced EPR 2006, 28-31 августа 2006 г., Новосибирск, Россия.

15. AMPERE NMR SCHOOL, 22 июня - 01 июля 2006 г., Познань/Верзба, Польша.

16. The 39th Annual International Meeting Electron Spin Resonance Group of the Royal Society of Chemistry "Advanced Techniques and Applications of EPR", 2-5 апреля 2006 г., Эдинбург, Великобритания.

17. The 4th International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides (SPIN-2005), 20-24 сентября 2005 г., Академгородок, Новосибирск, Россия.

18. International Symposium and Summer School in Saint Petersburg "Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter", 11-15 июля 2005 г., Санкт-Петербург, Россия.

§5.3. Заключение

Методом ЭПР Х- (9.8 ГГц), W- (94.5 ГГц) и Y- (360 ГГц.) диапазонов была изучена подвижность радикалов 4-метокси-ТЕМРО и DEPN в каликс[4]аренах. Для изучения подвижности нитроксилов в нанокапсулах были исследованы "разбавленные" образцы с включением в каликсарены помимо радикала диамагнитной молекулы дибензилкетона. Моделирование спектров позволило получить магнитно-резонансные параметры комплексов и информацию о подвижности нитроксилов внутри полости нанокапсул на основе каликс[4]арена. ЭПР спектр Х-диапазона при 373 К идентичен спектру в растворе, таким образом, капсула каликсарена может рассматриваться как "клетка" растворителя. Более того, показано, что каликсарены предохраняют включенные в них нитроксилы от восстановления аскорбиновой кислотой.

Были также исследованы комплексы AMP с кукурбит[4]урилами. Получены магнитно-резонансные параметры для комплексов и показано, что радикалы обладают чрезвычайно низкой подвижностью в кукурбитурилах.

Результаты и выводы

1. Изучен механизм реакции спиновых ловушек ФБН и фтор-замещенного ФБН с тиильным радикалом глутатиона и показана обратимость этих реакции. Измерены константы скорости реакции ловушек ФБН ((6.7±1.5)х107 iVf'c"1) и его фторированного аналога ((4.3+0.8)х ю7 mV1) с тиильным радикалом глутатиона. Показано наличие реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона (GSH) к ловушкам ФБН и фтор-замещенному ФБН с образованием стабильных гидроксиламинов.

2. Показано, что применение циклодекстринов позволяет повысить эффективность детектирования глутатиильных радикалов спиновой ловушкой ФБН. Для ФБН в присутствии Р-циклодекстринов и для ФБН, ковалентно связанного с |3-циклодекстринами, константа скорости реакции с тиильным радикалом изменяется несущественно, а время жизни соответствующих спиновых аддуктов возрастает.

3. На основание анализа спектров ЭПР Х- и W-диапазонов и !Н ЯМР сделан вывод о том, что для нитроксильного радикала TIPNO ковалентно-связанного с (3-циклодекстрином наблюдается равновесие между комплексом с радикальным фрагментом, расположенным вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина.

4. Изучена подвижность нитроксильных радикалов 4-метокси-ТЕМРО и DEPN в пара-гексаноил-каликс[4]аренах и стабильного нитроксильного радикала AMP с кукурбит[4]урилами в твердой фазе. Из сравнения расчетных и экспериментальных спектров ЭПР получены магнитно-резонансные параметры комплексов в твердой фазе и информация о структуре и характере движения нитроксилов внутри полости нанокапсул. Продемонстрировано, что каликсарены предохраняют инкапсулированные нитроксильные радикалы от восстановления аскорбиновой кислотой.

Благодарности

Автор чрезвычайно признателен своему замечательному научному руководителю д.ф.-м.н., профессору Елене Григорьевне Багрянской за руководство, постоянную заботу, терпение и непосредственное участие.

Огромная благодарность теплому коллективу лаборатории Магнитных Спиновых Явлений - к.ф.-м.н. Виталию Романовичу Горелику, к.ф.-м.н. Матвею Владимировичу Федину, к.ф.-м.н. Станиславу Рудольфовичу Шакирову, к.х.н. Дмитрию Павловичу Зубенко, Сергею Леонидовичу Веберу, Марии Владимировне Еделевой, Олесе Анатольевне Крумкачевой, Сергею Владимировичу Семенову.

Большое спасибо хочется сказать всем сотрудникам Международного Томографического Центра СО РАН, а именно директору академику РАН Ренату Зиннуровичу Сагдееву, заместителю директора член-корреспонденту РАН Виктору Ивановичу Овчаренко, д.х.н. Юрию Павловичу Центаловичу, к.х.н. Ольге Александровне Снытниковой, Петру Сергеевичу Шерину и всем остальным.

Автор благодарен д.х.н. профессору Госуниверситета штата Огайо, США Валерию Владимировичу Храмцову, профессору Института молекулярных наук, Канада Геннадию Станиславовичу Ананченко, профессору Прованского университета, Франция Сильвану Марку и сотрудникам Сибирского отделения Российской академии наук д.х.н., профессору Владимиру Петровичу Федину, д.х.н., профессору Владимиру Анатольевичу Резникову, д.х.н., профессору Виктору Федоровичу Плюснину, к.х.н. Игорю Анатольевичу Кирилюку, к.х.н. Ольге Анатольевне Герасько и другим, неупомянутых выше за недостатком места.

Особую благодарность хочется выразить секретарю кафедры химической и биологической физики Римме Ивановне Ратушковой за постоянную заботу и неоценимую помощь.

И конечно безграничная благодарность своим родителям Николаю Дмитриевичу, Светлане Иннокентьевне и жене Юлии Васильевне за постоянную поддержку, заботу и создание комфортных условий для работы и жизни в целом.

Дмитрий Половяненко

1. Curzio М., Esterbauer Н., Di Mauro С. "Chemotactic activity of the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal and homologous hydroxyalkenals" // Biol. Chem. Hoppe Seyler 1986, 367, 321-329.

2. Piloty, O., Schwerin, B. UBer. Dtsch. Chem. Ges. 1901, 34(11), p. 2354-2367.

3. Wieland H., Offenbacher M. // Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1914, 47(11), p. 2111-2115.

4. Huckel W., Liegel W. I I Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1938, 71(7), p. 1442-1446.

5. Завойский В., "Минувшее", изд. Татполиграф, 1996, 265 с.

6. Becker E.D. "A brief history of Nuclear Magnetic Resonance" II Analytical Chemistry, 1993, 65, p. 295A-302A.n

7. Лебедев О. Л., Казарновский С.Н., Труды по химии и химической технологии 1959, с. 649.

8. Володарский Л. Б., Григорьев И. А., Диканов С. А., Резников В. А., Щукин Г. И., Имидазолгшовые нитроксильные радикалы, 1988, Новосибирск: "Наука" Сибирское отделение.

9. Rhodes С. J. "Electron spin resonance (some applications for the biological and environmental sciences)"IIAnnu. Rep. Prog. Chem., Section C, 2004,100, p. 149-193.

10. Sweiger A., Jeschke G. "Principles of pulse electron magnetic resonance" // Oxford university press, 2001, pp. 578.

11. Milov A. D., Salikhov К. M., Shirov M. D. IIFizi. tv. tela. 1981,23, p. 975.

12. Milov A. D., Salikhov К. M., Shirov M. D. //Sov. Phys. Solid State 1981, 23, p. 565.

13. Milov A. D., Ponomarev А. В., Tsvetkov Yu. D. // Chem. Phys.Lett. 1984, 110, p. 67.

14. Khramtsov Y. V., Marsh D., Weiner L., Reznikov Y. A. "The application of pH-sensitive spin labels to studies of surface potential and polarity of phospholipid membranes mid proteins", // Biochim Biophys Acta 1992, 1104(2), p. 317-324.

15. Khramtsov Y. V., Yelinova V. I., Glazachev Yu. I., Reznikov V. A., Zimmer G. "Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label" II J. Biochem. Biophys. Methods 1997, 35(2), p. 115-128.

16. Kirilyuk I. A., Bobko A. A., Grigor'ev I. A., Khramtsov V. V. "Synthesis of the tetraethyl substituted pH-sensitive nitroxides of imidazole series with enhanced stability towards reduction" // Org.Biol.Chem. 2004, 2, p. 1025-1030.

17. Parkhomyuk-Ben Arye P., Strashnikova N., Likhtenshtein G. I. "Stilbene photochrome-fluorescence-spin molecules: covalent immobilization on silica plate and applications as redox and viscosity probes''// J.Biochem.Biophys Methods 2002, 51(1), p. 1-15.

18. Contreras-Lopez E., Champion D., Hervet H., Blond G., Le Meste M. "Rotational and translational mobility of small molecules in sucrose plus polysaccharide solutions" // J. Agric Food Chem. 2000,48(4), p. 1009-1015.

19. Bahri M. A., Heyne B. J., Hans P., Seret A. E., Mouithys-Mickalad A. A., Hoebeke M. D. "Quantification of lipid bilayer effective microviscosity and fluidity effect induced by propofol" // Biophys. Chem. 2005, 114(1), p. 53-61.

20. Marsh D. "Polarity contributions to hyperfine splittings of hydrogen-bonded nitroxides-themicroenvironment of spin labels" II J.Magn.Reson 2002, 157(1), p. 114-118. 01

21. Bartucci R., Guzzi R., Marsh D., Sportelli L. "Intramembrane polarity by electron spin echo spectroscopy of labeled lipids" // Biophys. J 2003, 84, p. 1025-1030.

22. Bobko A. A., Bagryanskaya E. G., Reznikov V. A., KolosovaN. G., Clanton T. L., Khramtsov V. V. "Redox-sensitive mechanism of NO scavenging by nitronyl nitroxides" // Free.Radio.Biol.Med. 2004, 36, p 248-258.

23. Ellis S. J., Velayutham M., Velan S. S., Petersen E. F., Zweier J. L., Kuppusamy P., Spencer R. G. "EPR oxygen mapping (EPROM) of engineered cartilage grown in a hollow-fiber bioreactor" // Magn.Reson.Med 2001, 46(4), p. 819-826.

24. Yokoyama H., Sato Т., Fukui K., Itoh O., Ohya H., Akatsuka T. " Noninvasive in vivo determination of intracerebral oxygen concentration in rats by a longitudinally detected ESR (LODESR) technique" If Magn.Reson.Med 2004, 51(3), p. 595-601.

25. Liu S., Timmins G. S., Shi H., Gasparovic С. M., Liu K. J. "Application of in vivo EPR in brain research: monitoring tissue oxygenation, blood flow, and oxidative stress" // NMR Biomed 2004. 17(5), p. 327-334.

26. Wan X., Fu Т. C., Funk A., London R. E. "Differential clearance of nitroxide MRI contrast agents from rat cerebral ventricles" // Brain.Res.Bull 1995, 36(1), p. 91-96.

27. Lee J. N. "Feasibility of overhauser-enhanced MR imaging with nitroxide free radicals" // J.Magn.Reson Imaging 1996, 6(1), p. 21-23.

28. Winalski С. S., Shortkroff S., Mulkern R. V., Schneider E., Rosen G. M. "Magnetic resonance relaxivity of dendrimer-linked nitroxides" // Magn.Reson.Med 2002, 48(6), p. 965-972.

29. Тарусов Б.Н. "Физико-химические механизмы биологического действия ионизирующих излучений" // Успехи соврем, биологии. 1957, 44(2), с. 171-185.1. ЗТ

30. Эмануэль Н.М., Липчина Л.П. "Лейкоз у мышей и особенности его развития при воздействии ингибиторов цепных окислительных процессов" // Докл. АН СССР 1958, 121(1), с. 141-144.

31. Harman D. "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry" // J. Gerontol. 1956, 11, p. 298-300

32. Harman D. "Free radical theory of aging" // Mutat. Res. 1992, 275, p. 257-266.

33. Furchgott R.F., Khan M.T., Jothianandan D. «Comparison of Endothelium-dependent relaxation and nitric oxide -induced relaxation in rabbit aorta" // Federal Proceedeings, 1987, 46, p.385-385.

34. Ugnarro L.J., Buga G.M., Wood K.S., Byrns R.E., Chaudhuri G. // Proceeding of National Academy of Science of USA, 98,1987, 84, p.9265-9269.

35. Chinthalapally V. Rao "Nitric oxide signaling in colon cancer chemoprevention" // Mutation Research 2004, 555, p. 107-119.

36. Diwan A. D., Wang M. X., Jang D., Zhu W., Murrell G. A. "Nitric oxide modulates fracture healing" II J. Bone. Miner. Res. 2000, 15(2), p. 342-351.

37. Defron D. Т., Most D., Barbul A. "Role of nitric oxide in wound healing" // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2000, 3(3), 197-204.

38. Скулачёв В.П. "В своем межмембранном пространстве митохондрия таит "белок самоубийства", который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз" // Биохимия. 1997, 61 (11), 2060-2063.

39. Weiner L., Kreimer D., Roth E. and Siliman I. "Oxidative stress transforms acetylcholinesterase to a motlen-globule-like state"// Biochem. Biophys. Res. Comms. 1994, 198 (3), p. 915-922.

40. Владимиров 10. А., Арчаков А. И. "Перикисное окисление липидов в биологических мембранах" // Наука, Москва 1972, 151 с.

41. Berlin V., Haselkine W. A. "Reduction of adriamycin to semiquinone-free radical by NADPH cytochrome P-450 reductase produces DNA cleavage in a reaction mediated by molecular oxygen" II J. Biol. Chem. 1981, 256, p. 4747-4756.

42. Imlay J. A., Linn S. "DNA damage and oxygen radical toxicity" // Science 1998, 240, p. 1302-1309.

43. Fridovich I. "Superoxide dismutases. An adaptation to a paramagnetic gas" // J. Biological Chemistry 1989, 264 (14), p. 7761-7764.

44. Brunori M., Rotilio G. "Biochemistry of oxygen radical species" 11 Methods in enzymology. Academic Press, Inc. London 1984,105, p. 22-35.

45. Зенков H.K., Панкин B.3., Меньшикова Е.Б. "Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты" // МАИК «Наука/Интерпериодика» 2001, 343 с.

46. Панин JI.E., Останина Л.С., Колпаков А.Р. "К механизму контринсулярного эффекта апопротеина В" // Вопросы мед. химии. 1995,41, вып. 6, с. 12-16.

47. Faure P. and Lafond J.-L. "Measurements of plasma sulfhydryl and carbonyl groups as possible indicator of protein oxidation" // In Analysis of free radicals in biological systems. A.E. Favier et al (ads), Birkhauser Verlag Basel/Switzerland, 1995.

48. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L. "An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumours" // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, 72, p. 3666-3670.

49. Закирова A.H. "Клинико-диагностическое значение показателей перекисного окисления липидов при ишемической болезни сердца" // Автореф. дисс. канд. мед. наук. М. ВКНЦ АМН СССР, 1981.

50. Hazell L. J., Arnold L., Flowers D. "Presence of hypochlorite-modified proteins in human atherosclerotic lesions" // J. Clin. Invest. 1996, 97, p. 1535-1544.

51. A. Meister. "Glutathione metabolism and its selective modification" II J. Biol. Chem. 1988, 263, p. 17205-17208.

52. Mullins M. E., Stamler J. S„ Osborne J. A., Loscalzo J. , Singel D. J. "EPR Spectroscopic Characterization of Biological Thiyl Radicals as PBN Spin-Trap Adducts" // Appl. Magn. Resort. 1992,3, p. 1021-1032.

53. Harman L. S., Carver D. K., Schreiber J., Mason R. "One- and Two-electron Oxidation of Reduced Glutathione by Peroxidases" // J. Biol. Chem. 1986, 261, p. 1642-1648.

54. Singh R. J. "Photosensitized decomposition of S-notrosothiols and 2-methyl-2-nitrosopropane. Possible use for site-directed nitric oxide production", FEBS Letters, 1995, p. 47-51.

55. Wood P. D. Mutus В., Redmond R. D. "The mechanism of photochemical release of nitric oxide from S-nitrosoglutathione" // Photochemistry andPhotobiology 1996, 64, p. 518-524.

56. Quintiliani M., Badiello R ., Tamba M., Esfandi A., Gorin G. "Radiolysis of glutathione in oxygen-containing solutions of pH 7" II Int. J. Radiat. Biol. 1977,32, p. 195-202.

57. Hoffman M. Z., Haymon E. //J.Phys.Chem. 1973, 77, p. 990.

58. Tamba M., Simone G., Quintiliani M. "Interactions of thiyl radicals with oxygen: a pulse radiolysis study" // Int. J. Radical Biol. 1986, 50, p. 595-600.

59. Prutz W. A., Butler J., Land E. J. "The glutathione free radical equilibrium, GS- + GS" ^ GSSG*", mediating electron transfer to Fe (III)-cyto chrome c" // Biophy Chem.1994, 49, p. 101111.

60. Monig J., Asmus K.-D., Forni L. G., Willson R., "ON the reaction of molecular oxygen with thiyl radicals: a re-examination" II Int. J. Radiat. Biol. 1987, 52, p. 589-602.

61. Зубарев В. E. "Метод спиновых ловушек"// Изд.Московского Университета 1984,186 с. 68. Janzen Е. G., Hare D. L. "Two decades of spin trapping" // Advances in Radical Chemistry, 1990, l,p. 235-295.

62. Buettner G. R., "Spin Trapping: ESR parameters of spin adducts" // Free. Rad. Biol. Med. 1987, 3, p. 259-303.

63. Eberson L. "Inverted spin-trapping. Part III. Further studies on the chemical and photochemical oxidation of spin-traps in the presence of nucleophiles" // J. Chem .Soc, Perkin Transactions 1994, 2, p. 171-176.

64. Bonnet R., Brown R. F. C., Clark V. M., Sutherland I. O., Todd A. "Experiments towards the synthesis of corrins. Part II. The preparation and reactions of delta 1-Pyrroline 1-oxides" // J. Chem Soc. 1959, p. 2094-2102.

65. Makino K., Hagiwara Т., Hagi A., Nishi M., Murakami A. "Cautionary note for DMPO spin trapping in the presence of iron ion" // Biochemical and Biophysical research communications. 1990, 172 (3),p. 1073-1080.

66. Hanna P. M., Chamulitrat W., Mason R. P. "When are metal ion-dependent hydroxyl and alkoxyl radical adducts of 5,5-dimethyl-l-pyrroline N-oxide artefacts?" // Archives of Biochemistry and Biophysics, 1992, 296, p. 640-644.

67. Carloni P., Eberson L., Greci L., Sgarabotti P. and Stipa P. "New insights on N-ferf-butyl-a-phenylnitrone (PBN) as a spin-trap. Part 1. Reaction between PBN and N-chlorobenzotriazole" // J. Chem. Soc., Perkin Transactions 2. 1996, p. 1297-1305.

68. Janzen E. G., Lin C. R. and Hinton R. D. "Spontaneous free radical formation in reactions of w-chlorobenzoic acid with C-phenyl-N-tert-butylnitrone (PBN) and 3- or 4-substituted PBN's" // J. Org. Chem. 1992,57, p. 1633-1635.

69. Eberson L., McCullough J. J. "Generation of triacyanomethyl spin adducts of alpha-phenyl-N-/err-butylnitrone (PBN) via non-conventional mechanisms" // J. Chem. Soc., Perkin Trans 2 1998, p. 49-58.

70. Sang H., Janzen E. G. and Lewis В. H. "Mass spectrometry and electron paramagnetic resonance study of free radicals spontaneously formed in nitrone-peracid reactions" // J. Org. Chem., 1996, 61, p. 2358-2363.

71. Eberson L. "Spin trapping and electron transfer" // Advances in Physical Organic Chemistry 1998, 31, p. 91-141.

72. Potapenko D. I., Bagryanskaya E. G., Reznikov V. V., Clanton T. L., Khramtsov V. V. "NMR and EPR studies of the reaction of nucleophilic addition of (bi)sulfite to the nitrone spin trap DMPO" II Magn. Reson. Chem. 2003; 41, p. 603-608.1. QT

73. Potapenko D. I., Clanton T. L., Bagryanskaya E. G., Gritsan N. P., Reznikov V. A., Khramtsov V. V. "Nonradical mechanism of (bi)sulfote reaction DEPMPO: Cautionary note for S03" radical spin trapping" II Free. Rad. Biol. Med. 2003, 34, p. 196-206.от

74. Potapenko D. I., Bagryanskaya E. G., Tsentalovich Yu. P., Reznikov V. A., Clanton T. L., Khramtsov V. V. "Reversible Reactions of Thiols and Thiyl Radicals with Nitrone Spin Traps" // J. Phys. Chem. В 2004, 108, p. 9315-9324.1. Rd.

75. Khramtsov V. V., Berliner L. J., Clanton T. L. "NMR spin trapping: Detection of free radical reactions using a phosphorus-containing nitrone spin trap" // Magn.Reson.Med. 1999, 42, p. 228234.

76. Tuccio В., Lauricella R., Frejaville C., Bouteiller J.C. and Tordo P. "Decay of the hydroperoxyl spin adduct of 5-diethoyphosphoryl-5-methyl-l-pyrroline N-oxide: an EPR kinetic study" II J. Chem. Soc., Perkin Trans 2 1995, p. 295-298.

77. Roubaud V., Sankarapandi S., Kuppusamy P., Tordo P. and Zweier J.L. "Quantitative measurement of superoxide generationusing the spin trap 5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-l-pyeeoline-N-oxide" // Analyt Biochem 1997, 247, p. 404-411.

78. Eberson L. "Spin trapping: problems and artefacts"; In Toxicology of the Human Environment. The critical role of free radicals.; Rhodes C.J., ed. Taylor and Francis: London and New York, 2000; p 25-47.

79. Davies M. J., Gilbert В. C., Stell J. K., Whitwood A. C. "Nucleophilic substitution reactions of spin adducts. Implications for the correct identification of reaction intermediates by EPR/spin-trapping" // J. Chem .Soc. Perkin Trans. 2 1992,333-335.

80. Davies M. J., Forni L. G. and Shuter S. L. "Electron spin resonance and pulse radiolysis studies on the spin trapping of sulfur-centered radicals" // Chem.-Biol. Interact. 1987, 61, 177188.

81. Edamatsu R., Mori A., Packer L. "The spin-trap N-Tert-alpha-phenyl-butylnitrone prolongs the life span of the senescence accelerated mouse" // Biochem Biophys Res Commun. 1995, 211, p. 347-349.

82. Thomas С. E., Carney J. M., Bemotaa R-C., Hay D. A., Carr A. A. "In vitro and in vivo activity of a novel series of radical trapping agents in model systems of CNS oxidative damage" II Ann. NYAcadSci. 1994, 738, p. 243-249.

83. Lancelot E., Revaud ML, Boulu R.G., Plotkine M., and Callebert J. "Alpha-phenyl N-rert-butylnitrone attenuates excitotoxicity in rat striatum by preventing hydroxyi radical accumulation" // Free Rad. Biol.Med. 1997, 23, p. 1031-1034.

84. Thomas С. E., Huber E. W., Ontweiler D. P. "Hydroxyi and peroxyl radical trapping by the monoamine oxidase-B inhibitors deprenyl and MDL 72,974A: implications for protection of biological substrates" // Free Rad. Biol. Med. 1997,22, p. 733-737.

85. Piccinini F., Bradamante S., Monti E., Zhang Y.K. and Janzen E.G. "Pharmacological action of a new spin-trapping compound, 2-phenyl DMPO, in the adriamycin-induced cardiotoxicity" // Free Rad, Res. 1995, 23, p. 81-87.

86. Andersen K. A., Diaz P. Т., Wright V. P., Clanton T. L. "N-tert-butyl-alpha-phenylnitrone: a free radical trap with unanticipatedeffects on diapharm function" // J. Appl, Physiol. 1996, 80, p. 862-868.

87. Janzen E. G., Poyer J. L., Schaefer C. F., Downs P. E., DuBose С. M. "Biological spin-trapping II. Toxicity of nitrone spin traps: dose-ranging in the rat" // J. Biochem. Biophys Methods. 1995, 30, p. 239-247.

88. Selinsky B. S., Levy L. A., Motten A. G., London R. "Development of Fluorinated, NMR-Active Spin-traps for studies of free radical chemistry" // J. Magn. Res. 1989, 81, p. 57-67.

89. Khramtsov V. V., Reznikov V. A., Berliner L. J., Litkin A. K., Grigor'ev I. A., Clanton T. L. "NMR spin trapping: detection of free radical reactions using a new fluorinated DMPO analog" // Free Rad. Biol. Med. 2001, 30 (10), p. 1099-1107.

90. Berliner L. J., Khramtsov V. V., Fujii H., Clanton T. L. "Unique In Vivo Applications of Spin Traps" II Free RadBiol. Med. 2001, 30(5), p. 489-499.

91. Vargas-Berenguel A.; Ortega-Caballero F.; Casas-Solvas J. M. II Mini-Rev. Org. Chem. 2007, 4, p. 1-14.

92. Martino M., Neri P. I I Mini-Rev. Org. Chem. 2004,1, p.219-231.

93. Kim K., Selvapalam N., Oh. D. H. J. II Incl. Phenom. Macrocyclic Chem. 2004, 50, p. 31-36.

94. Sauvage J.-P.; Dietrich-Buchecker C. Molecular Catenanes, Rotaxanes and Knots: A Journey Through the World of Molecular Topology, 1999.

95. Kelly T. R. // Top. Curr. Chem. 2005, 262. 1,1 Villiers A. II Compt. Rend. 1891,112, 536.

96. Szejtli J. "Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry" I I Chem. Rev. 1998, 98, p. 1743-1753.

97. French D. П Adv. Carbohydr. Chem. 1957, 12, 189.

98. Thoma J. A.; Stewart L. Starch, Chemistry and Technology I.; Whistler, R. L., Paschall, E. F., Eds.; Academic Press: New York,1965; p 209.

99. Caesar G. V. "Starch and its Derivatives", Radley, J. A., Ed.;Chapman and Hall: London, 1986; Chapter X,p 290.

100. Duchene D., Ed. "Cyclodextrins and Their Industrial Uses" // Editions de Sante.: Paris, 1987; p 448.

101. Szejtli J., Osa Т., Eds. Comprehensive Supramolecular Chemistry; Pergamon: Oxford 1996, 3 (Cyclodextrins), p 693.

102. Fromming, К. H., Szejtli J. Cyclodextrins in Pharmacy // Kuwer: Dordrecht, 1994; p 224.

103. Harata К. "Structural Aspects of Stereo differentiation in the Solid State" I I Chem. Rev. 1998, 98, p. 1803-1827.

104. Hapiot F., Tilloy S., Monflier E. "Cyclodextrins as Supramolecular Hosts for Organometallic

105. Complexes" // Chem. Rev. 2006,106, p. 767-781.121

106. Rekharsky M. V., Inoue Y. "Complexation Thermodynamics of Cyclodextrins" // Chem. Rev. 1998, 98, p. 1875-1917

107. Schneider H.-J., Hacket F„ Rtidiger V. "NMR Studies of Cyclodextrins and Cyclodextrin Complexes" // Chem. Rev. 1998, 98, 1755-1785.

108. Bardelang D., Clement J.-L., Finet J.-P., Karoui H., Tordo P., "NMR Investigations of the a-Cyclodextrin Inclusion of (a-Phenyl-iV-fert-butylnitrone) Analogues" // J. Phys. Chem. В 2004, 108, p. 8054-8061.

109. Karoui H.; Rockenbauer A.; Pietri S.; Tordo P. // Chem. Commun. 2002, 24, p. 3030-3031.

110. Karoui H., Tordo P. "ESR-spin trapping in the presence of cyclodextrins. Detection of PBN-superoxide spin adduct" I I Tetrahedron Letters 2004,45, p. 1043-1045.

111. Clement J.-L., Tordo P. "Advances in Spin Trapping" // Electron Paramag. Reson., 2007, 20, p. 29-49.

112. Stolze K., Udilova N., Nohl H. "Spin Trapping of Lipid Radicals with DEPMPO-derived Spin Traps: Detection of Superoxide, Alkyl and Alkoxyl Radicals in Aqueous and Lipid Phase" // Free Rad. Biol.Med. 2000,29, p. 1005-1014.

113. Bardelang D., Charles L., Finet J.-P., Jicsinszky L., Karoui H., Marque S. R. A., Monnier V., Rockenbauer A., Rosas R., Tordo P. // Chem. Eur. J. 2007, 13, p. 9344-9354.

114. Okazaki M., Kuwata K. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4181.

115. Eastman M. P., Freiha В., Hsu С. C., Lum К. C., Allen Chang C. // J. Phys. Chem. 1987, 91, p. 1953.

116. Eastman M. P., Freiha В., Hsu С. C., Allen Chang С. II J. Phys. Chem., 1988, 92, p. 1682. 133 Martinie J., Michon J., Rassat A. // J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, p. 1818.

117. Janzen E. G.; Kotake Y. II J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 3699, // Chem. Phys. Lett., 1988, 150, 199, II J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 7319, II J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 2872.137

118. Mezzma E., Fani M., Ferroni F., Franchi P., Menna M., Lucarini M., "Synthesis and Characterization of a Persistent Paramagnetic Rotaxane Based on a-Cyclodextrin" // J. Org. Chem. 2006, 71, p. 3773-3777.

119. Ionita G., Chechik V. // Org. Biomol. Chem. 2005, 3, p. 3096-3098.

120. Ionita G., Meltzer V., Pincu E., Chechik V. // Org. Biomol Chem. 2007, 5, p. 1910-1914.

121. Bardelang D., Rockenbauer A., Jicsinszky L., Finet J.-P., Karoui H., Lambert S., Marque S. R. A., Tordo P. "Nitroxide Bound P-Cyclodextrin: Is There an Inclusion Complex?" // J. Org. Chem. 2006., 71, p. 7657-7667.

122. Franchi P., Fani M., Mezzina E., Lucarini M. "Increasing the Persistency of Stable Free-Radicals: Synthesis and Characterization of a Nitroxide Based l.Rotaxane" // Org. Lett. 2008, 10, p. 1901-1904.

123. Asfari Z., Bohmer V., Harrowfield J., Vicens J., Saadioui M., Eds.; Kluwer: Dordrecht, The Netherlands 2001; p. 296-311.

124. Tatsuya O., Katsutoshi I., Shintaro F., Masahir, G. U J. Membr. Sci. 2003, 217, p. 87-97.

125. Droogmans G., Maertens C., Prenen J., Nilius В. II Br. J. Pharmacol. 1999,128, p. 35-40.

126. Thallapally P. K., Lloyd G. O., Wirsig Т. В., Bredenkamp M. W., Atwood J. L., Barbour L. J. // Chem. Commun. 2005, p. 5272-5274.

127. Atwood J. L., Barbour L. J., Jerga A. // Science 2002,296, p. 2367-2369.

128. Atwood J. L., Barbour L. J., Jerga A. II Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 43, p. 2948-2950.

129. Kim J. S„ Quang D.T., "Calixarene-Derived Fluorescent Probes" // Chem. Rev. 2007, 107, p. 3780-3799

130. Shahgaldian P., Da Silva E., Coleman A. W., Rather В., Zaworotko M. J. // Int. J. Pharm. 2003,253, p.23-28.

131. Shahgaldian P., Cesario M., Goreloff P., Coleman A. W. HChem. Commun. 2002, p. 326-327.

132. Dubes A., Udachin K. A., Shahgaldian P., Coleman A. W., Ripmeester J. A. II New J. Chem. 2005, 29, p. 1141-1146.

133. Ananchenko G. S., Udachin K. A., Dubes A., Ripmeester J. A., Perrier Т., Coleman A. W. // Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, p. 1585-1588.

134. Ananchenko G. S., Udachin K. A., Ripmeester J. A., Perrier Т., Coleman A. W. // Chem.Eur. J. 2006,12, p. 2441-2447.

135. Ananchenko G. S., Pojarova M., Udachin K. A., Leek D>M., Coleman A. W., Ripmeester J. A. // Chem. Commun. 2006, p. 386-388. —.

136. Ananchenko G.S., Udachin K.A., Pojarova M., Dubes A., Ripmeester J. A., Jebors S., Coleman A.W. "Van der Waals Nanocapsular Complexes of AmphiphilicCalixarenes" // Crystal Growth & Design, 2006, 6, p. 2141-2148

137. Franchi P., Lucarini M., Pedulli G. F. "Use of Nitroxide Radicals to Investigate Supramolecular Entities" // Curr. Org. Chem. 2004, 8, p. 1831-1849.

138. Krock L., Shivanyuk A., Goodinb D. В., Rebek J. // Chem. Commun. 2004, p. 272-273.

139. Rajca A., Mukherjee S., Pink M., Rajca S. II J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, p. 13497-13507.

140. Behrend R., Meyer E., Rusche F. II Justus Liebigs Ann. Chem. 1905, 339, p. 1-37.

141. Freeman W. A., Mock W. L., ShihN.-Y. И J.Am. Chem. Soc. 1981, 103, p. 7367-7368.

142. W. L. Mock // Top. Curr. Chem. 1995, 175, p. 1- 24.

143. Hoffmann R., Knoche W., Fenn C., Buschmann H.-J., "Host-Guest Complexes of Cucurbituril with the 4-Methylbenzylammonium Ion, Alkali-metal Cations and NH/" // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1994, 90, p. 1507-1511.

144. Lee J. W., Samal S., Selvapalam N„ Kim H.-J., Kim K. // Acc. Cherri. Res. 2003, 36, p. 621630.

145. Kim K. II Chem. Soc. Rev. 2002, 31, p. 96-107.

146. Kim J., Jung I.-S., Kim S.-Y., Lee E., Kang J.-K., Sakamoto S., Yamaguchi K., Kim K. // J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, p. 540-541.

147. Day A. I., Arnold A. P., Blanch R. J., Snushall B. //J. Org. Chem. 2001, 66, p. 8094-8100.

148. Day A. I., Blanch R. J., Arnold A. P., Lorenzo S., Lewis G. R., Dance I. // Angew. Chem. 2002, 114, p. 285-287, II Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, p. 275-277.

149. Lagona J., Mukhopadhyay P., Chakrabarti S., Isaacs L.,"The Cucurbitn.uril Family" / / Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, p. 4844-4870.

150. Mock W. L., ShihN.-Y. II J. Org. Chem. 1983,48, p. 3618-3619.

151. Mock W. L., ShihN.-Y. И J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, p. 4706-4710.

152. Mock W. L., ShihN.-Y. II J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, p. 2697-2699.

153. Mezzina E., Cruciani F., Pedulli G. F., Lucarini M. "Nitroxide Radicals as Probes for Exploring the Binding Properties of the Cucurbit7.uril Host" II Chem. Eur. J. 2007, 13, p. 7223-7233.

154. Berliner L., Reuben J. "Spin Labeling", Biol. Magn. Res., New York: Plenum press 1989, 8, 670 p.

155. Berliner L., Reuben J. "Spin Labeling: The next millenium" // Biol. Magn. Res., New York: Plenum press, 1989,14, 444 p.

156. Borbat P. P., Costa-Filho A. J., Earle K. A., Moscicki J. K., Freed J. H. "Electron Spin Resonance in Studies of Membranes and Proteins"// Science, 291(5502), p. 266-269.176

157. Дзюба C.A. "Метод спиновых меток и зондов с использованием импульсной ЭПР-спектроскопии" // Успехи химии 2007, 76, с. 752-767.

158. Лихтенштейн Г. И. "Применение спиновых меток" II М.:Наука, 1972.

159. Бучаченко А. Л., Васерман А. М. "Стабильные нитроксильные радикалы: электронное строение, реакционная способность и применение" // М.: Химия, 1973.

160. Кузнецов А.Н. "Метод сипнового зонда"ИМ. Наука, 1976.

161. Schnieder D. J., Freed J. H., in Biol.Magn.Reson"Spin Labeling"// ed. Berliner L., Reuben J. , New York: Plenum press 1989, 8, p. 1-76.1 ОЛ

162. Meirovitch E., Nayeem A., Freed J. H. "Analysis of protein-lipid interactions based on model simulations of electron spin resonance spectra" И J. Chem. Phys. 1984, 88, p. 3454-3465.

163. Дудич И.В., Тимофеев В.П., Волькенштейн M.B., Мишарин А.Ю. // Молекулярная биология, 1977, 11, с. 685-693.

164. Timofeev V. P., Duidich I. V., Volkenstein М. V., Misharin A.Yu. // Biophys.Struct. Mech. 1980, 7, p. 41-49.

165. Тимофеев В. П., "Сегментная подвижность поли"и" и метод спин-метки", // Молекулярная биология 1986, 20, с. 697-711.

166. Timofeev V. P., Nikolsky D. О. "The Role of the Fast Motion of the Spin Label in the Interpretation of EPR Spectra for Spin-Labeled Macromolecules" // J. Biomol. Struct. Dyn. 2003, 21, p. 367-378.

167. Timofeev V. P., Tkachev Ya. V., Novikov V. V., Alyoshkin V. A., Lapuk V. A. "Is the Fab-Fragment from Monoclonal Rheumatoid IgM Flexible? A Spin Label Dynamics Study" // J. Biomol. Struct. Dyn. 2005, 23, p. 175-181.

168. Polovyanenko D.N. Bagryanskaya E.G., Reznikov V.A. Clanton T.L. Khramtsov У. V. "New insight into the antioxidant mechanisms of PBN spin trap" // Free Radical Research 2006. 40. S93-S93.1 QQ

169. Polovyanenko D.N. Plyusnin V.F. Reznikov V.A. Khramtsov V.V. Bagryanskaya E.G. "Mechanistic studies of the reactions of nitrone spin trap PBN with glutathiyl radical" II J. Phys. Chem. В 2008, 112 (15V p. 4841-4847

170. Ross D.,NorbeckK., Moldeus P. // J.Biol.Chem. 1985, 260, p. 15028-15032.

171. Hart T.W. "Some observations concerning S-nitroso and phenylsulphonyl derivatives of L-cysteine and glutathione" // Tetrahedron Lett, 1985, 26, p. 2013-2016.

172. Grivin V. P., Plyusnin V. F., Khmelinski I. V., Bazhin N. M., Mitewa M., Bontchev P. R. II J. Photochem. Photobiol. A.: Chem. 1990, 51, p. 371-377.

173. Glasoe, P. K.; Long, F. A. // J.Phys.Chem. 1960, 64, p. 188-190.

174. Chamulitrat W., Jordan S. J., Mason R. P., Saito K., Culter R. G. "Nitric Oxide Formation during Light-induced Decomposition of Phenyl N-tert-Butylnitrone" // J.Biol. Chem. 1993, 268, p. 11520-11527.

175. Stoll S., Schweiger A. II J. Magn. Reson. 2006, 178 (1), p. 42-55.

176. Stoll S., Schweiger A. // Biol. Magn. Reson. 2007, 27, p. 299-321.

177. Marque S., Fischer H., Baier E., Studer A. "Factors Influencing the C-O Bond Homolysis of Alkoxyamines: Effects of H-Bonding and Polar Substituents" // J. Org. Chem. 2001, 66 (4), p. 1146-1156

178. Mobius K., Savitsky A., Schnegg A., Plato M., Fuchs M. H Phys. Chem. Chem. Phys. 2005, 7, p. 19-42.

179. Ananchenko G. S. Udachin K. A., Coleman A. W. Polovyanenko D. N. Bagryanskaya E. G. Ripmeester J. A. "Crystalline inclusion complex of a calixarene with a nitroxide" // Chem. Comm. 2008. p. 223-225.

180. Polovyanenko D. N. Bagryanskaya E. G. Schnegg A. Mobius K. Coleman A. W., Ananchenko G. S., Udachine K. A. Ripmeester J. A. "Inclusion of 4-methoxy-2,2.6.6tetramethylpiperidine-N-oxyl in a calixarene nanocapsule in the solid state" // Phys. Chem.

181. Chem. Phys. 2008, 10, p. 1-9.203M. R. Fuchs, T. F. Prisner and K. Mobius IIRev. Sci. Instrum., 1999, 70,3681-3683

182. Schnegg A., Kirilina E., Fuchs M., Savitsky A., Grishin Y., Dubinskii A., Plato M., Lubitz W., Mobius K. // Appl. Magn. Reson., 2007, 31, p. 59-98.

183. M. Nishio, M. Hirota and Y. Umezawa "The CH/rc interaction" // Wiley-VCH, New York, 1998.

184. Carrington A., McLauchlan A. D. "Introduction to Magnetic Resonance with Applications to Chemistry and Chemical Physics" // Harper & Row, New York, 1967.

185. Smirnova Т. I., Smirnov A. I., Paschenko S. V., Poluektov O. G. // J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, p. 3476-3477.

186. Kurad D., Jeschke G., Marsh D. // Biophys. J. 2003, 85, p. 1025-1033.

187. W.-J. Lin, J. H. Freed II J. Phys. Chem. B. 1979, 83, 379-401.

188. Pegi A., Julijana K., Slavko P., Janez S., Marjeta S. H J. Pharm. Sci. 2003, 92, p. 58-66.

189. Pojarova M., Ananchenko G. S., Udachin K. A., Daroszewska M., Perret F., Coleman A. W., Ripmeester J. A. // Chem. Mater. 2006, 18, p. 5817-5819.

190. Shahgaldian P., Gualbert J., Aissa K., Coleman A. W. II Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003, 55, p. 181-184

191. Grimaldi S., Finet J.-P., Le Moigne F., Zeghdaoui A., Tordo P., Benoit D„ Fontanille M., Gnanou Y. // Macromolecules 2000, 33, p. 1141.