Окислительно-восстановительные реакции нитроксильных и нитронилнитроксильных радикалов с аскорбиновой кислотой и оксидом азота тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ И ГОРЕНИЯ МЕЖДУНАРОДНЫЙ ТОМОГРАФИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

БОБКО АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ НИТРОКСИЛЬНЫХ И НИТРОНИЛНИТРОКСИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ С АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТОЙ И ОКСИДОМ АЗОТА

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2005

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения и в Международном томографическом центре Сибирского отделения Российской академии наук

Научные руководители доктор физико-математических наук,

профессор Багрянская Елена Григорьевна

доктор химических наук, Храмцов Валерий Владимирович

Официальные оппоненты доктор химических наук,

профессор Плюснин Виктор Фёдорович

доктор биологических наук, профессор Ванин Анатолий Фёдорович

Ведущая организация Московский государственный университет им. М.

В. Ломоносова РАН

Защита состоится "_21_" _декабря_ 2005 г. в _15_ часов на заседании диссертационного совета К 003.014.01

в Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Института химической кинетики и горения СО РАН и Международного томографического центра СО РАН

Автореферат разослан " _ноября_ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук А. А. Онищук

¿6655"

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нитроксилъные радикалы (НР) широко применяются во многих областях физико-химических и биологических исследований, а также в качестве контрастирующих добавок в процессах полимеризации и структурных единиц при конструировании органических ферромагнетиков. НР, будучи парамагнитными соединениями, широко используются в качестве спиновых зондов и меток для определения параметров микроокружения среды (полярность, вязкость, кислотность (рН), концентрация кислорода) с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). НР позволяют получать уникальную информацию при исследовании структурных характеристик биологических макромолекул и биомембран, в первую очередь на основе метода спиновых зондов Биомедицинское применение НР включает в себя их использование в качестве контрастирующих соединений в томографии и физиологически активных соединений.

Несмотря на то, что исследование биологических систем с помощью НР проводится уже в течение 50 лет, до сих пор остаётся много нерешённых вопросов, что обусловлено как сложным характером биологических образцов, так и далеко не полным пониманием механизмов реакций НР с различными биологическими молекулами. Наиболее важными являются реакции окисления и восстановления, поскольку они не только отображают важную характеристику среды, так называемый окислительно-восстановительный статус, но и оказывают непосредственное влияние на интенсивность и даже на саму возможность детектирования сигнала ЭПР. Среди физиологически активных низкомолекулярных восстановителей аскорбиновая кислота (АК) и глутатион (ГЛ, ОЯП) в первую очередь отвественны за восстановление НР в различных тканях. Тем не менее, механизмы реакции НР с данными соединениями были изучены недостаточно.

Другой важной физиологически активной молекулой, вступающей в многочисленные окислительно-восстановительные реакции в биологических системах, является оксид азота (N0). В отсутствии других восстановителей специфическая реакция восстановления нитронилнятроксильного радикала (ННР) оксидом азота в иминонитроксильный радикал (МНР) используется для детектирования N0. Более того, в биологических средах ННР успешно используются как антагонисты N0, несмотря на их быстрое восстановление до гидроксиламинов. Вопрос о механизме такого действия остаётся открытым.

з

Осповиыми целями работы являлись:

• исследование механизмов реакций восстановления нитроксильных радикалов различных i«поп биологически важными восстановителями - аскорбиновой кислотой, глутатионом и оксидом азота;

• исследование механизма реакции ПНР и N0 в восстановительной среде и разработка нового метода определения оксида азот a ex vivo с использованием фторзамещённых ННР и "f ЯМР спектроскопии на основе изученного механизма реакции

Научная новизна работы. Изучен механизм восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой. Впервые было показано, чго этот процесс характеризуется равновесием между нитроксильным радикалом и аскорбиновой кислоюй с одной стороны, и гидроксилгмином и радикалом аскорбата с друюй стороны. Были обнаружены новые реакции, дающие существенный вклад в наблюдаемые кинетические кривые восстановления НР. а именно: окисление гидроксиламина радикалом аскорбата и дегидроаскорбиновой кислотой Также было показано, что нтроксильные радикалы восстанавливаются продуктами разложения дегидроаскорбиновой кислоты, предположительно 2,3-дикетогулоновой кислотой. Впервые предложена и подтверждена математическим моделированием полная реакционная схсма восстановления нигроксильных радикалов аскорбиновой кислотой.

Впервые показана роль глутагиона в восстановлении НР асхорбиновой кислотой. Хотя GSII не восстанавливает IIP, но оказывает сильное влияние на их восстановление аскорбатом через восстановление иродукюв окисления АК (радикал аскорбата и дегидроаскорбиновая кислота"! обратно в аскорбиновую кисло!у. Впервые измерена константа скорости реакции GSH с радикалом аскорбата (АР).

Проведено сравнительное исследование с1абилыюсти нитроксильных радикалов различных типов по отношению к восстановлению аскорбиновой кястотой. Показало, что стабильность НР уменьшается в ряду радикалов: пирролидин > имидазолндин > 3-имидазолина > 2-имидазолин-З-оксида (ННР). Было обнаружено, что замена м стильных групп вблизи радикально! о центра нитроксида на тгильные i-руппы ведёт к увеличению стабильности соединений к восстановлению в присутствии ках аскорбиновой кислоты, так и крови крыс.

Проведено исследование механизма реакции оксида азота и нитрошишитроксильных радикалов в восстановительной среде Было показано, что ННР быстро восстанавливаются как в присутствии аскорбиновой кислоты, так и в биологической среде (гомгленат мозжечка крыс). Восстановленные формы (гидроксиламины) фторзамещённых ННР превращаются в

соответствующие восстановленные формы (гидроксиламияы) ПНР в присутствии оксида азота. Было показано, что гидроксиламины ННР не реагируют с оксидом азота с образованием i идроксиламинов ИНР. Для осуществления такого процесса необходимо реокисление г идроксиламинов ННР обратно в радикал с последующей реакцией между ННР и оксидом азота. Образующийся ИНР, в свою очередь, восстанавливается до соответсгвуюшего гидроксил амина. На основе экспериментальных данных впервые была предложена реакционная схема взаимодействия нитроншшитроксильных радикалов и оксида азота в восстановительной среде.

Был предложен новый метод регистрации оксида азота ex vivo основанный на методе 19F ЯМР спиновых ловушек с использованием фторзамещённых ННР.

Практическая ценность. В данной работе проведено детальное исследование механизма восстановления нигроксильных радикалов аскорбиновой кислотой, показана роль глутатиона в этом процессе. Полученные данные представляют несомпенный интерес для исследователей, использующих НР как в качестве спиновых зондов, так и в качестве терапевтических соединений в биологических системах.

Предложен механизм нитронилнитроксильных радикалов с оксидом азота в восстановительных средах. На основе изученного механизма реакции предложен и апробирован метод регистрации оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых нитроншшитроксильных радикалов и спектроскопии "F-ЯМР.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: всероссийская конференция с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, Россия, 2001), 3-я и 4-я международная конференция по нитроксильным радикалам «Синтез, свойства и применение питроксильных радикалов» (Кайзерслаутерн, Германия, 2001; Новосибирск, Россия, 2005), 7-й международный симпозиум по спиновым ловушкам (Чапл Хилл, США, 2002), VI международная конференция имени Воеводского «Физика и химия элементарных химических процессов» (Новосибирск, Россия, 2002), 8-й международный симпозиум по спиновым и магнипплм эффектам в химии (Чанл Хилл, США, 2003), XI Амперовская школа по ЯМР (Закопаны, Польша, 2003), 5-я встреча европейской федерации групп ЭПР (Лиссабон, Португалия, 2003), 48-я ежегодная встреча биофизического общества (Балтимор, США, 2004), Международная рабочая встреча по in vivo ЭПР (Ганновер, США, 2004), 11-я ежегодная встреча общества по свободным радикалам в биологии и медицине (о. св. Томаса, США), международная конференция по спектроскопии и визуализации ЭПР в биологических системах (Коламбус, США, 2005)

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, а также в 13 тезисах докладов на международных и российских симпозиумах и конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка ци i ируемой литературы, включающего 123 наименования. Работа изложена на 95 страницах, содержит 6 таблиц, 36 рисунков и 14 схем.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении аргуменгирована актуальность проблемы, решению которой посвящена диссертация, сформулирована основная цель работы и дано описание структуры и содержания диссертации.

В первой главе работы проведен обзор литературы, посвящённый окислительно-восстановительным свойствам питроксильпых радикалов и обсуждению механизмов реакции НР с различными биологически активными молекулами. В первой части кратко описывается разнообраше типов нитроксияьных радикалов, приводятся химические структуры НР, использованных в данной работе Вторая часть посвящеяа методам регистрации оксида азота. Описывается важность N0 в организмах млекопитающих, даётся представление о возможных способах регистрации оксида азога, обсуждаются их недостатки и достоинства Подробно рассмотрен метод регистрации NO с помощью нитронилпитроксильных радикалов, условия el о применимое™ в биологических системах.

В третьей части главы рассматриваются литературные данные по окислительио-влесiаноьительным сиойс i вам ннтроксильных радикалов как одноэлекгронных окисли гелей и восстановителей В первом разделе обсуждаются механизмы электрохимического окисления/восстановления НР. Второй раздел посвящён описанию известных реакций протекающих во время восстановления НР аскорбиновой кисчотой В третьем разделе большое вшгмание уделено механизмам окисления НР супероксидным радикалом. Обсуждается реакционная способность тиолсодержащих соединениями (на примере гпутат иона! по отношению к НР Рассмотрены механизмы окисления/восстановления нитроксильных радикалов и их ттидроксиламинов (ГАН) в биологических системах. Приводятся примеры использования этих соединений для измерения окислихельно-восст анови геиьного статуса in vivo методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

В четвертой часта главы рассматривается метод ЯМР спиновых ловушек и его применение для регистрации короткоживущих радикалов Описываются преимущества и недостатки данного метода в сравнении с традиционным методом ЭПР спиновых ловушек

Во второй главе представлены экспериментальные материалы по исследованию механизма реакции аскорбиновой кислоты с нитроксильными радикалами В ходе

исследований было выяснено, что

1 0-,

0 15 30 45 60 75 90 Время, мин

Рисунок 1. Кинетическая кривая восстановления нитроксильного радикала 19 (о, 1 мМ) в присутствие аскорбиновой кислоты (50 мМ) в 0,1 М Ыа-фосфатном буфере, рН 7,6, ДТП Л 0,1 мМ Гидрокснламин (10 мМ) 19Г был добавлен в реакционную смесь через 15,5 минут после начала реакции Время добавления указано стрелкой Линией прел ставлена аппроксимация кинетических данных согласно предложенной в работе кинетической схеме (см схему 2.1)

восстановление НР аскорбиновой кислотой -обратимый процесс. На рисунке 1 приведена кинетическая кривая восстановления НР пирролидинового типа 19 (хим. структуру см. в таблице 1) аскорбиновой кислотой. Добавление соответствующего

гидроксиламина 19Г ведёт к увеличению концентрации НР, что указывает на обратимость процесса восстановления ПР. В последующих экспериментах было показано, что обратимость процесса восстановления нитроксильных радикалов обусловлена окислением гидроксиламина НР продуктами

кислоты,

На

окисления аскорбиновой радикалом аскорбата

дегидроаскорбиновой кислотой рисунке 2 приведены кинетические кривые окисления гидроксиламина 19Г в присутствии аскорбиновой кислоты и различных концентраций аскорбат оксидазы (в системе аскорбат/аскорбат оксидаза в присутствии кислорода протекает ферментативно

катализируемая генерация радикала аскорбата). Было показано, что скорость окисления гидроксиламина НР зависит как от концентрации аскорбат оксидазы (скорости генерации радикала аскорбата), так и от концентрации гидроксиламина. Соответствующая бимолекулярная константа скорости реакции гидроксиламина 19Г и радикала аскорбата была вычислена из полученных данных. Её значение равно (1,1±0,05)-103 М"'с"'.

Рисунок 2

2 4 6 8 10 время, мин

Кинетические кривые окисления гидроксиламина 19Г (1 мМ) в присутствии аскорбиновой кислоты (1 мМ) и различных концентраций аскорбат оксидазы (0, 0,01, 0,02 и 0,03 ед/мл, снизу вверх) Линиями представлены аппроксимации кинегических данных

Время, мин

Рисунок 3. Кинетические кривые окисления гидроксиламина НР 19Г мМ) в присутствии дегидроаскорбиновий кислоты (0 мМ (■), 2 мМ (¡-I) 5 мМ (о)) в 0,1 М Ыа-фосфапюч буфере, рН 7,6, Д111Л 0.1 мМ Данные получены регистрацией интенсивности нилюпоиевой компоненты спектра ЭПР нитроксильнгао радикала 19 - продукта окисления гидроксиломшм 19Г Линиями представлены длпроксимаиии кинепгческих данных согласно предложенной в работа кинетической схеме (см схему 2 Г/

про [\.к-1ы разложения ДГА обладают восст анони гельными свойствами по отношению к нитроксилькым радикалам. На рисунке 4 преде гавлены кинетические кривые восстановления радикала 19 в присутствии дегядроаскорбиновой кислоты. Вид кинетических кривых доказывает, что добавленное к НР соединение (ДГА) сначала переходит в какое-то другое соединение, которое, в свою очередь, носстанаичивчет НР Принимая во внимание данное соображение, аппроксимирование кинетических кривых показывает, что восстнавливающим соединением для НР служит продукт гидролиза Д] 'А - 2,3-дикетогулоновая кислота

Кроме того, было показано, что дегидроаскорбиновая кислота (ДГА) также способна восстанавливаться

гидроксиламинами НР до радикала аскорбата. Гидроксиламины, в свою очередь, превращаются в нитроксильные радикалы. На рисунке 3 приведены кинетические кривые окисления гидроксиламина 19Г в присутствии дегидроаскорбиновой кислоты. Следует отметить, что процесс окисления Г АН дех идроаскорбиновой кислотой не стехиометрический, так как ДГА не устойчивое соединение в водных растворах и гидролизу стся в 2.3-дикеюгулоновую кислогу (ДКГ).

В литературе отмечалось, чго

Время, мин

Рисунок Л Кинетические чривыс восстановления иитроксилыим о радикала 19 (I мМ) в присутствие дегидроаскорбиновой кис поты чМ о, 10 мМ • ■) в 0,1 V! Мд-фосфатном буфере, рН 7,6, ДЧТ1А. 0,1 мМ Линии представляют аппроксимацию кинсгических данных согласно предложенной в работе кинетической схеме (см схему 2.П

На основе математического моделирования полученных кинетических кривых, была предложена схема реакций (см схему 1) восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой Вычислены константы скорооей реакций для представителей HP пирролидшювого, имидазолипового и имидазолидинового типов (см. таблицу 2.1).

Предложений механизм реакции состоит из пяти элементарных реакций Реакция I описывает равновесие, осуществ'шсмое между окислительно-восстановительными парами НР.ТЛ1! и Л К/АР. Существование этого равновесия подтверждается экспериментами,

приведенными на рисунках i и 2 Реакция II описывает равновесие, устанавливающееся между парами НР/АР и ГАШДГА. Прямая реакция была известна из литературных источников, существование обратной бьшо показано нами в эксперименте, результаты которого приведены ка рисунке 3 Реакции Ш и IV хорошо известны и изучены в питературе На протекание реакции V указывают данные, приведённые ла рисунке 4

НР ¥ лк +ф=± ГАН к АР (I)

НР + АР ГАН ^ ДГА (П)

1АР <ф=+ ЛК + ДГА (1Щ

ДГА --*'-> ДКГ (IV)

НР 1 ДКГ - -■-> ГАН I продукты (V)

Схема I Механизм восстановления НР аскорбиновой кислотой НР - нитроксильный радикал АК -аскорбиновая кислота ГАН - гидроксиламин НР, АР радикал аскорбата, ДГА дегидроаскорбиновая кис юта. ДКГ 2,3 дикетогулоновая кислота

Таблица 2 I Константы скоростей реакций, вычисленных согласно схем? 1 длч НР ичидазолиновогс (15, 16), имидазолидинового (17,18) и нирролщщисвого (19) типов

1 1.03 га 0.9 я 0.8

I0'7

I о.в

ж 05 § 04 3. 03

1 °2

5 01

2 оо

Рисунок

10 20 30 40 время, мин 5 Кииетипеские кривые

На рисунке 5 приведены кинетические кривые восстановления радикала 18 в присутствии глутатиона и аскорбиновой кислоты. Как видно из рисунка, глутатиоя не восстанавливает НР. Более юго, гчутатион не влияет на скорость реакции НР с аскорбиновой кислотой, но увеличивает эффективное гь восстановления [[Р. Этот эффект связал со способностью глутатиона восстанавливать продукты окисления аскорбиновой кислоты (радикал аскорбата и дегидроаскорбиновая кислота) обратно в АК На рисунке 6 приведены спекгры ЭПР радикала аскорбата,

0 5 Гс

нпепановяеимя имрок«.ильного радикал« 18 ^ I мМ) и 0,1 М \а-фск,фй1 гюм буфере рН 7.и, Д1ПЛ 0,1 мМ а присутствии 50 мМ ОвН (а), 100 мМ АК (5), ЮОмМ АК и 5 мМ СБН (в), 100 мМ АК и 10 мМ ОЯ! (!,!)

генерируемого в системе ас к'орба I -'ас горбат оксидаза, в присутствии различных концентраций глуташона Увеличение концентрации ОЙН вызьтаег уменьшение стационарной концентрации радикала аскорбата. Из полученных данных была вычислена эффективная конешнга скоросш реакции глутатиона и радикала аскорбата. Г-е значение сос!авило (10±5) М 'с"1. Отметим, что данная константа скоросш реакции является эффективной в силу сложности механизма взаимодействия радикала аскорбата и глу ¡атиопа. Во второй и третьей частях данной главы приводятся сравнительные исследования стабильности радикалов 2-имидазолинового, 3-имидазешшового, имидаютидинового и пирролидинового ¡ипов, а также их тетраэшльных аналогов по отношению к

восстановлению АК. На рисунке 7 А приведены кинетические кривые восстановления имидазолиновых радикалов 11, 13 и 14 с различным количеством пильных заместителей, полученные из измерения интенсивности яижополевой компоненты спектра Э1ТР НР от

Ряс) нок 6 Квазистационарные

конценграции радикала аскорбата, генерируемого с помощью аскорбал оксидам ^0 03 ед'мл) ч присутствии 1 мМ аскорбиновой кисяогы и различных концентраций глутатиона (0. 20, 40 и 60 мМ от наиболее до наименее интенсивного спектра, соответстве'пго) в 0.' М Ма-фосфатном Суфере рН 7,6, ДТП А 0,1 мМ

-1-1

£С

Л. ,

се -2

V

Л.

14

13

11 \

20

40 60 50 Время, с

100 120

0 1 2 3 4 10 20 30 40 [аскорбиновая кислота], мМ

Рисунок 7 Л Зависимость ло1 арифма отношения текущей [ЯI и начальной [Н0|, концентрации радикачов 11, 13 и 14, измеренной методом ЭПР в 0,1 М Ка-фосфатном буфере рН 7,5 в присутствии 1 мМ аскорбиновой кислоты от времени Начальная концентрация нитроксилылга радикалов 0,1 мМ Линейность кинетики показывает, что зависимость изменения сигнала ЭПР подчиняется экспоненциальному закону согласно уравнению |Я| - [Кс] ехр(-к„ь,1).

Ь Зависимость констаты реакции псевдопервого порядка восстановления радикалов II, 13 и 14 от концентрации аскорбиновой мклоты Линии линейные «страполяции дня вычисления бимолекулярной константы скорости восстановления

времени. Устойчивость питроксильпых радикалов к восстановлению возрастает при

увеличении количества этильиых групп во вгором и пяюч положениях гетероцикла. На

рисунке 7.Б показана зависимость наблюдаемой кокс(анты скорости реакции (к„ь,) от

Таблица 2. Бимолекулярные константы скорости восстановления нигроксильных радикалов 10-19

аскорбиновой кислотой в 0,1 М №-фосфагном буфере, рН 7,', ДТПА 0,! мМ и значения начальных скоростей

восстановления ИР в 'срисутствии кроьи крыс (У,,) нитроксильцых радикалов 11,13-15,17 и 18

радикал

Г

10

/

11

12

Н2Ы

13

структура Х>ЧХМХ!

! I

I I

___

N

I.

О

А-

5 6±0 3

13 4-0 9 ~~ 7,8

и

СГ"

'Ч^к!.

ЕГ

0 74 И) 07

1,0

18

19

ч/

N

I.

О

0 02ЫГООЗ~

соон!

А-

0 11=0 01

концентрации аскорбиновой

кислоты. В ходе экспериментов было покачано, что стабильность НР к восстановлению уменьшается в ряду радикалов: пирролидин > имидазолидин > 3-имидазочина > 2- имидазолин-3-оксида (ННР). Было обнаружено, что замещение метальных замес пи елей вблизи радикального цсчпра нитроксида на этильные группы ведёт к увеличению стабильности

соединений по отношению к восстановлению аскорбиновой кислотой Такая же тенденция для -»тилзамещённыч НР наблюдается и при использовании крови крыс в качестве восстанови геля Бимолекулярные константа скоростей реакции ПР с аскорбиновой кислотой и начальные скорое 1 и восстановления НР в крови крыс приведены в таблице 2.

В третьей г.шве представлены результаты исследования механизма реакции между нитропильшроксильными радикалами и оксидом азота в восстановительной среде.

Извесгно, что нитромитниитроксильные радикалы специфически реагируют с оксидом азена и гготюму успешно используются в качестве ст>иновы> зондов на N0 в химических системах. В тоже время, в предыдущей главе было ус!ановлсно, что среди разных классов НР именно ННР наименее устойчивы к посстановлепию. В связи с этим для регистрации N0 с помощью НИР методом ')ПР в биосистемах требуется их дополнительная запила от восстановителей Встраивание в липидную фазу - один из способов защиты ННР 0( восстановления Применение гидрофобных ННР должно обеспечить их надёжное встраивание в липидную фазу фосфолипядпых мультислоёв, липосомныч и клеточных мембран, и тем самым обеспечить защиту этих радикал о з от биологических восстановителей, что существенно повысит эффективность ННР как акцепторов N0.

ННР 238 (см. схему 2) был встроен в мультислои из яичного фосфагидилхолина. Добавление цитозоля мозжечка крысы (5 М1 белка/мл) к такому образцу ННР не сопровождалось изменением спектра ЭПР в течение нескольких часов (рис. 8.а), в ю время как спектр ЭПР для тою же ННР в растворе в присутствии цитозоля не удавалось записать вследствие быстрого восстановления радикала. Таким образом мембранный барьер

24 25 26 27

Схема 2 Химические структуры фторзамещенных соединений использованных для иучепия реакции между ННР и N0 в восстановительной среде (24-27), и химическая структура гидрофобногоННР 23в.

fr

значительно ограничивает доступность гидрофобных HHP для биологических восстановителей и существенно снижает скорость их восстановления.

Обработка раствором SIN-1 (донор NO) HHP встроенного в липидпую фазу в присутствии цитозоли мозжечка приводила к быстрой трансформации спектра ЭПР HHP в спектр ИНР (рис 8.6}.

Полученные данные укачивают на перепек га вность использования 1идрофобных HHP, способных встраиваться в мулыислои, для увеличения эффективности

детектирования N0 и продления срока действия HHP в качестве антагонистов оксида азота in vitro и т vivo

Важным применением HHP а в особенности 2-фенил-4,4,5,5-

тетраустилимидазолин-1 -оксил-3-оксидов, является их использование как антагонисгон оксида азота в биологических системах. Физиологические эффекты действия HHP нельзя просто объяснить их радикап-радакальной реакцией с оксидом азота, так как HHP быстро восстанавливаются в соответствующие гидроксиламииы (ННР-Г)-Тем не менее, было показано, что образуется более, чем 18% восстановленной формы ИНР, гидроксиламина ИНР-Г. при внутривенном введении HHP крысам. В этом свете особенно

/Vy!

Рисунок 8 Спектры ЭПР ННР 233, встроенного в дииидные мультислои т фосфатидилхолина (24 м|/м.ч> в присугс;вии цшоюля го москечка крыс (а), и спектр соответствующею ИН<\ зарегистрированного после добавления к обризцу (э) донора оксида азога Ч|><-| (5 мМ) (б). Условия записи спектров ЭПР' микроволновая мощность 12 мВт, амплитуда модуляции I Гс

важным становится изучение механизма реакции оксида азота с его восстановленной формой (ННР-Г')

На рисунке 9 показано, что при добавление газообразного оксида азота к гомотенату мозжечка крысы, содержащему восстановленную форму ННР-Г. происходит частичная трансформация соединения ННР-Г 26 в соединение ИНР-Г 27. То есть и< этого эксперимента следует, что ННР в восстанови 1ельной среде реагируют с оксидом азота с образованием ИНР-Г. Остается открытым вопрос о том, по какому механизму протекает реакция. Можно выдвинуть две гипотезы (О оксид азота реагирует с ННР-Г с образованием ИНР-Г или (Ш

ННР-Г окисляется в радикал ПНР, коюрый под действием NO превращается в ИНР. ИНР, в свою очередь, восстанавливается в гидроксинамин ИНР-Г.

В расгворе, содержащем

восстановленный аскорбиновой кислотой ПНР, проводилась генерация NO фотолизом нитропруссида натрия После

фотолитического разложения нитропруссида натрия наблюдалось изменение спектра ,9Ь-ЯМР Сигнал WF- ЯМР спектра ННР-Г 26 частично или полностью переходил в сш нал 'V-ЯМР спектра ИНР-Г 27. На рисунке 10 приведены зависимое ги получающихся концентраций соединения ИНР-Г 27 от времени фотолиза при различных концентрациях аскорбиновой кислоты. Концентрация образованию) ося соединения ИНР-Г 27 была прямо пропорциональна количеству генерируемого оксида aso га и обратно нроиорциодальна концентрации аскорбиновой кислоть.

Эти данные под1верждают предположение о том. чго при генерации N0 в присутствии АК происходит окисление гидроксил амина ПНР в радикал ННР, коюрык в свою очередь реширует с оксидом азота с образованием ИНР В присутствии аскорбиновой кислоты как радикал ННР, так и радихал ИНР должны восстанавливаться до соответствующих гидроксиламинов.

Для проверки этого предположения, были записаны спектры ОПР раствора, содержагцего соединение ПНР 24 и аскорбиновую кислоту, при фотолизе нитропруссида натрия Действительно, при проведении фотолиза, в начале наблюдался спектр Э1ТР соединения ННР 24 (рис 11 б) Затем этот спектр грансформировался с течением времени в спектр соединения ИНР 25 (рис

химический сдвиг, ррт

Рисунок 9 "f-ЯМР спектры ННР 24 (1 мМ) в гомогенаге мозжечка крысы (пунктирная линия) и после (сплошная линия* добавления О,! М Na-фосфатного буфера насыщенпо1 о оксидом азога, конечная концентрация 1мМ Спектральные парам_ 1 ры Ib 3 Гп, количество накоплений в каждом спектре 128 Пи а то\;. нк в друюм случае ЭПР сш нал не наблюдался

Время фотолиза, мин Рисунок 10 Образование ИНР-Г 27 т ННР-Г" 26 (3,33 мМ) под действием оксчда азота в 0,1 М Ыа-фосфатлом буфере, рН 7,5 ДТПА 0,1 мМ, 8,5% ДМСО в присутствии различных концентраций аскорбиновой кислоты (АК) Генерация оксида азота из нитропруссида мафия (33,3 мМ) производилась со скоростью 2,7±0,2 ммоль/л/мин

11.в, г) с последующим его исчезновением (рис 11.д) вследствие восстановления в диамагнитное соединение ИНР-Г' 27

Была предложена следующая схема реакций, хорошо объясняющая полученные данные.

HHP + Red HHP-Г + Ox' (1)

HHP + 'NO -> ПНР + •no2 (2)

HHP- г + *Л'02 -> НИР + тог (3)

ННР- г + МНР HHP + ИНР-Г (4)

ННР г + 'NO + Red ИНР-Г + UNO, + Ox' (5)

Суммарная реакция (5) описывает экспериментально наблюдаемую аккумутяцию гидроксиламина ИНР-Г при взаимодействии гидроксиламина HHP-Г с N0 в присугсгвии

восстановителя (в нашем случае оксилительно-восстановнтельчой парой Red/Ox* является аскорбиновая

кислота/радикал аскорбата). Равновесие в реакции (1) в восстановительной среде сильно сдвинуто в правую сторону, при этом спектр ЭНР HHP не наблюдается в присутствии избытка восстановителя или в гомогенатах тканей. Реакции (Ч) и (4) показывают механизм накопления радикала HHP до стационарной концентрации, которую можно детектировать методом ЭНР при высоких скоростях генерации оксида азота. С другой стороны HHP подвергается восстановлению в реакции (1) или реагируе/ с N0 (21. ! зки.м образом, накопленное количество продукт реакции, ИНР-Г, прямо чрог.орционалыго i енернруемому количеству N0 и обратно пропорционально концентрации аскорбиновой кислоты.

Выше приведенная схема реакций даёт правдоподобное объяснение антагонистического действия ПНР против N0 в биологических сисгсмах.

В следующей части третьей главы представлены результаты, посвященные разработке метода регистрации оксида азота в биоло! ических сисгсмах. Он основан на использовании

Магнитное поле, Гс Рисунок И Изменение со временем спектра ЭПР раствора, содержащего ПНР 24 (3,33 мМ), аскорбиновую кислоту (3 33 мМ) и нитропруссид натрия (33,3 чМ) в 0,1 М 'Ыа-фосфатноч буфере, рН 7,5, ДТП А О 1 мМ, 8,5% ДМСО до (а), после 3 мик (б), 6 мин (в), 9 мин (1) и 20 мин (д) фотолиза Сьектр (е) был -записан после 40 мину г фотолиза такого же раствора, но в отс;>гстчии кшроиру'хида нлрия. Условия записи спекттюв микроволновая мощность 10 чВс, амшииуда модуляции 0,8 Гс, время записи спектра 5 с, количество накоп 1еняй в снсмре 10

фгорзамещенных ПНР, как ловушек на оксид азота, и метода l9í ЯМР спиновых ловушек, как метода регистрации Суть меч ода основана на специфической реакции оксида азота с НИР с образованием ИНР, по гах как 31и соединения быстро восс i анавли вакп ся в биологической системе в диамагнитные соединения, то регистрация продукта реакции и исходною соединения осуществлялась с помощью |9Р-ЯМР спектроскопии

Для и ¡учения скорости генерации окисда азота ex vivo были выбраны три различные линии крыс: Две из них - ISIAH и OXYS - линии крыс с шпергонией различного происхождения Бы то предположено, что повышенное давление крови е этих крыс обусловлено меньшей оационарпой концентрацией оксида awia Крысы линии Wistar (нормотензивная пиния ¡-рыс) были выбраны как контроль

Для определения количества i енерируемого оксида азота, крысам внутрибрюшипно вводился фтор замещенный IIIIP 24 (0,2 мг/г живого веса) Через один час производили забор крови и снимали ,9F-ЯМР спекгры (см рис. 12j. Как видно из рисунка 13. соотношение концентраций [27J/[26], представляющее фракцию спиновой ловушки прореагировавшей с оксидом азота, сущее гвеяни выше в крови крыс линии Wistar по сравнению с крысами линий OXYS и 1SIAH. В то же самое время разница а соотношении концен!раций [27|/[26] не наблюдалась для крыс линии OXYS и ISIAH. Таким образом, полученные данные указывают на связь между врождённой гипертонией у крыс линии OXYS и JSIA.H и недостатком оксида азота в организмах животных.

105 106107 108 109 110 111 112 113 тП5

химический сдвиг, ррт Рисунок 12 "ЬЯМР спектр образца крови, полученного из крысы линии ОХ У Я через ! час после вн}трибрюшинногс введения ННР 24. Сигналы в спектре "!--ЯМР соответствуют восстановленной форм*- ПНР 24 (I идрокскламии НИР-Г', 26) и восстановленной форме ИНР 25 (гидроксиламии ИНР-Г, 27) Параметры спек фа. 1Ь - - 5 Гц количество накоплений в (нектпе 1024

15-

10

05-

00-

*

п=12 '•¡¿г***

Í2M.JÍÍ

OXfS

ISIAH

Рисунок 3.7 Отношение концентраций |2T¡/|26| в крови различны* линий крыс (*р<0,005 по сравшпшю с крысами линии Wisiar)

Полученные в работе результаты показывают возможность применения данного метода при определении оксида азсиа в организмах млекопитающих in viva

Использованные в работе приборы, методики и аббревиатура описаны в четвертой

главе.

ВЫВОДЫ

1 Показано, что устойчивость нитроксильных радикалов убывает в ряду пирролидиновые, имидазолидиновые, имидазолиновые и 2-имидазол-З-оксидные

2. Нитроксильныс радикалы с обьёмными алифагаческими заместителями во втором и в пятом положении пягичлеяного гетероцикла обладают повышенной стабильностью по сраввснию с тетраметильными аналогами в восстановительных средах. Увеличение числа этильных групп около радикального центра нитроксида ведёг к увеличению стабильности нитроксильпого радикала в этих условиях.

3. При исследовании механизма восстановиения нитроксильных радикалов аскорбиновой киегютой показано, что в течении данной реакции происходит реокисление соответствующего гидрокеяламича нитроксильного радикала как радикалом аскорбата, гак и дегидроаскорбиновой кислотой обратно в нигроксид. Предложен полный механизм реакции Вычислены копегашы скоростей всех элементарных стадий реакции восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой для ряда IIP различных типов. Показано, что глуташон ríe восстанавливает НР, но увеличивает глубину восстановительного процесса в присутствии аскорбиновой кислоты.

4. Показано, что заключение гидрофобных НИР в липидную фазу увеличивает устойчивость НИР к восстановлению и позволяет использовать ПНР для регис фации N0 в восстановительных средах методом ЭПР.

5 Показано, что гпдроксиламины ПНР не реагируют с оксидом a30ia Окисление гидроксиламинов НИР в радикал является необходимой стадией ,оля протекания реакции с оксидом азота с образованием ИНР Предложен механизм реакции НПР с оксидом азота в восстановительной среде.

6. Разработала методика определения оксида азота в биологических средах с использованием фтор замещённьк питронилнитроксильных радикалов и (.лмироскипии 'Т-ЯМР для исследования роли оксида азота в патологиях крыс гипертензивного происхождения ex vivo.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Bobko Л.A., Sergeeva S.V., Bagryanskaya E.G., Markel A.L., Khramtsov V V., Reznikov V.A., Kolosova N G 19F NMR measurements of NO production in hypertensive JSIAH and OXYS rats // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, v. 330, № 2, p. 367-70.

2. Kirilyuk I.A., Bobko A.A., Khramtsov V.V., Grigor'ev I.A. Nitroxides with two pK values-useful spin probes for pH monitoring within a broad range. // Organic and biomolecular chemistry, 2005, v. 3, № 7, p. 1269-74.

3. Kirilyuk I.A, Bobko A A., Grigor'ev I.A., Khramtsov V.V. Synthesis of the tetraethyl substituted pH-sensitive nitroxides of imidazole series with enhanced stability towards reduction. // Organic and biomolecular chemistry, 2004, v. 2, № 7, p. 1025-30.

4. Bobko A.A., Bagryanskaya E.G, Reznikov V.A., Kolosova N.G , Clanton T.L., Khramtsov V.V. Redox-sensitive mechanism of NO scavenging by nitronyl nitroxides. // Free radical biology and medicine, 2004, v 36, № 2, p. 248-58

5. В. И. Блинова, А. А. Бобко, Д. Г. Мажукин, A.JI. Маркель, В В. Храмцов. Новые доноры и акцепторы оксида азота как потенциальные терапевтические агенты. // Биоорганическая химия, 2003, г. 29, № 4, с. 434-441.

6. Андрей А. Бобко, Игорь А. Киришок, Игорь А Григорьев, Джей Л. Цвайер, Валерий В. Храмцов. Обратимый механизм восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой.// Сборник тезисов 4-й Международной конференции по нитроксильным радикалам, Сентябрь 20-24, 2005, Новосибирск, Россия, стр. 5.

7. Andrey A. Bobko, Denis A. Komarov, Mark G. Angelos, Thomas L. Clanton, Periannan Kuppusamy, Jay L. Zweier, and Valery V. Khramtsov. Ischemia-induced myocardial acidosis: detection by Electron paramagnetic resonance and importance of buffering capacity. // Book of abstracts of The International Conference/Workshop on Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy and Imaging of Biological Systems, September 4-8, 2005, Hilton Columbus at Easton Town Center, Columbus, Ohio, USA., p. 49.

8. Andrey A. Bobko, Elena G. Bagryanskaya, Vladimir A. Reznikov, Svetlana V. Sergeeva, Nataljya G. Kolosova, Arkadii L. Markel, Thomas L. Clanton, and Valery V. Khramtsov. I9F NMR Approach for determination of nitric oxide in vivo using fluorinated nitronyl mtroxide. SFRBM's 11th Annual Meeting, November 17-21, 2004, St. Thomas, US Virgin Islands.// Free radical biology and medicine, 2004, November 20-24, 37, Supplement 1, p. S93.

9. Audrey A. Bobko, Igor Л. Kmlyuk, Igor A Grigor'ev, Jay Zweier, Valery V. Khramtsov Tetraelhyl substituted pH-sensitive probes, new insigth into the mechanism of the nitroxide reduction by ascorbate./,' Book of abstracts of Internationa! Workshop on In vivo DPR, September 19-23,2004, Hanover, New Hampshire, USA, p. P-5.

10. V.V. Khramtsov, E.G. Bagryanskaya, D.I. Potapenko, A.A Bobko, V.A. Reznikov, N.G. Kolosova, T L. Clanion. P-31 and F-19 NMR spin trapping of short-lived intermediates 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, USA, February 14-18, 2004. //Biophysical Journal 86 (1). 191A-191A Part 2 Suppl. S Jan. 2004

11. A.A. Bobko E.G Bagryanskaya; S A. Popov; V.A. Reznikov; N.G. Kolosova; T.L. Clanton; V.V. Khramtsov. Mechanism of antagonistic action of nitronyl nitroxides against nitric oxide in reducing environment in vitro and in vivo studies.'/ Book of abstracts of 5th Meeting of the European Federation of FPR Groups, September 7-11, 2003, Lisbon, Portugal., P8.

12 E Bagryanskaya, D I. Potapenko, A Bobko, D P Zubenko, N V. LcbeJeva, V. Reznikov, V. Khramtsov. NMR and fR CTDNP investigations of Short-Lived Intermediates in Chemical Reactions.// Book of abstracts of Ampere XI NMR School. Zakopane. Poland, June 1-6, 2003 p. 1.

13. E. Bagryanskaya, DJ Potapenko, A. Bobko, V. Fe/nikov. N G. Kolosova, V. Khramtsov, Г. Clanton ""P and l?F Spin-Trapping of Short-Lived Intermediates.// Book of abstracts of 8lh International Symposium of Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, September 21-26. 2003, Chape! Hill, North Carolina, p. 45.

14. Бобко А. А., Попов С. A , Речников В. А., Багряисхая E. Г., Клэнтон К. Л., Храмцов В. В. Детектирование NO с использованием метода ЯМР спиновых ловушек и фтерсодержащих шпронилшпроксильрых радикалов// Сборниь тежеш VI конференции им. Воеводского, Фшчка и химия элементарных химических процессов, Июль 21-25,2002, Новосибирск, Россия.

15 A A. Bobko, £ G Bagryanskaya, S. A. Popov, V. A Reznikov, Т L Clanton, and V. V Khramtsov. Revealing the redox sensitive mechanism of NO scavenging activity of mtrouyl nitroxides./' Book of Abstracts of 2nd International confcrcnce on biomedical spectroscopy, July. 5-8, 2003, London, United Kingdom, p 80.

16. Bobko A.A, Popov S.A., Reznikov V.A, Bagryanskaya EG, Clanton 1.L, khramtsov V.V New method for NO detection using NMR spin topping and fluorine-con taning nitronyl nitroxides // Book of abstracts of 7th International Symposium on Spm Trapping. July 7-12, 2002, Chapel Hill, NC, USA., p. T-14

I

19

17. VI Yelinova, D G, Mazhukin, A.A. Bobko, and VV Khramtsov. EPR Studies of NO liberation by new hydrophilic 3,4-dihydro-l,2-diazete-l,2-dioxide and its vasodilatory activity.// Book of abstracts of 3,d International Conference on Nitroxide Radicals- Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides (SPIN-2001), September 23-29, 2001, Kaiserslautcrn, Germany., p. Friday 11:20 18 А А. Бобко, В. И. Блинова, Д Г. Мажукин, А. Л. Маркель, В В. Храмцов. Корректирование артериального давления N0 активными соединениями.// Сборник тезисов конференции Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека, сентябрь 19-22, 2001, Смоленск, Россия, стр. 77.

\

t

«

Подписано к печати 15 ноября 2005г. Тираж 100 экз. Заказ № 1695. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Ц*24 181

РНБ Русский фонд

2006-4 26655

Введение

Глава 1. Литературный обзор. Окислительно-восстановительные свойства нитроксильных радикалов

§1.1. Типы нитроксильных радикалов

§1.2. Спиновые зонды на NO

§1.3. Окислительно-восстановительные реакции нитроксильных ф радикалов

§1.3.1. Электрохимическое окисление и восстановление нитроксильных радикалов

§1.3.2. Восстановление нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой

§1.3.3. Окислительно-восстановительные превращения нитроксильных радикалов в биологических системах in vitro и in vivo

§1.3.3.1. Окисление нитроксильных радикалов и их гидроксиламинов супероксидным радикалом in vitro

§1.3.3.2. Восстановление нитроксильных радикалов тиолсодержащими соединениями in vitro (на примере глутатиона)

§1.3.3.3. Применение нитроксильных радикалов in vivo как зондов на окислительно-восстановительный статус среды

§1.4. ЯМР спиновых ловушек как метод исследования диамагнитных продуктов метаболизма нитроксильных радикалов

Глава 2. Сравнительное исследование реакций восстановления нитроксильных радикалов пирролидинового, имидазолинового и имидазолидинового типов

§2.1. Исследование механизма реакции восстановления нитроксильных радикалов пирролидинового, имидазолинового и имидазолидинового типов аскорбиновой кислотой

§2.1.1. Обратимость реакции восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой

§2.1.2. Окисление гидроксиламинов HP радикалом аскорбата

§2.1.3. Окисление гидроксиламинов HP дегидроаскорбиновой кислотой

§2.1.4. Схема реакции и математическое моделирование

§2.1.5. Изучение влияния глутатиона на восстановление нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой

§2.2. Сравнительное исследование стабильности к восстановлению радикалов пмпдазолинового, имидазолидинового и пирролидинового типов

§2.3. Сравнительное исследование стабильности к восстановлению тетраметил- и тетраэтилзамещённых нитроксидов

Глава 3. Исследование механизма реакции между нитронилнитроксильными радикалами и оксидом азота в восстановительной среде

§3.1. Использование липосом с целью увеличения стабильности нитронилнитроксильных NO-зондов в восстановительной среде

§3.2. Изучение реакции фторсодержащих нитронилнитроксильных радикалов с NO в восстановительной среде методом 19F ЯМР и ЭПР спектроскопии

§3.2.1. Изучение магниторезонансных свойств фторсодержащих HHP

§3.2.2. Исследование реакции фторзамещённых HHP с оксидом азота

§3.2.3. Проверка возможности реакции гидроксиламина HHP с оксидом азота

§3.2.4. Изучение механизма реакции HHP с NO в восстановительной среде

§3.3. Использование l9F ЯМР спектроскопии и фторсодержащих нитронилнитроксильных радикалов для детектирования NO ex vivo

Глава 4. Материалы и методы

Выводы

Благодарности

Нитроксильные радикалы (HP) широко применяются во многих областях физико-химических и биологических исследований, в качестве контрастирующих добавок в процессах полимеризации и структурных единиц при конструировании органических ферромагнетиков. HP, будучи парамагнитными соединениями, используются в качестве спиновых зондов и меток для определения параметров микроокружения среды (полярность [1-3], вязкость [4-6], рН [7-9], концентрация кислорода [10-12]) с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). HP позволяют получать уникальную информацию при исследовании структурных характеристик биологических макромолекул и биомембран, в первую очередь на основе метода спиновых зондов [13]. Биомедицинское применение HP включает в себя их использование в качестве контрастирующих соединений в томографии [14-16] и физиологически активных соединений [17, 18].

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что исследование биологических систем с помощью HP проводится уже в течение 50 лет, до сих пор остаётся много нерешённых вопросов, что обусловленно как сложным характером биологических образцов, так и далеко не полным пониманием механизмов реакций HP с различными биологическими молекулами. Наиболее важными являются реакции окисления и восстановления, поскольку они не только отображают важную характеристику среды, так называемый окислительно-восстановительный статус, но и оказывают непосредственное влияние на интенсивность и даже на саму возможность детектирования сигнала ЭПР нитроксильных радикалов. Среди физиологически активных низкомолекулярных восстановителей аскорбиновая кислота (АК) и глутатион (ГЛ, GSH) в первую очередь отвественны за восстановление HP в различных тканях. Механизмы реакций HP с данными соединениями, как оказалось, были изучены недостаточно, несмотря на многочисленные публикации.

Другой важной физиологически активной молекулой, вступающей в многочисленные окислительно-восстановительные реакции в биологических системах, является оксид азота (N0). Специфическая реакция восстановления нитронилнитроксильного радикала (HHP) оксидом азота в иминонитроксильный радикал (ИНР) используется для детектирования N0 в отсутствии других восстановителей. Более того, в биологических средах HHP успешно используются как антагонисты NO несмотря на их быстрое восстановление до гидроксиламинов. Вопрос о механизме такого действия остаётся открытым.

Основными целями работы являлись:

• исследование механизмов реакций восстановления нитроксильных радикалов различных типов биологически важными восстановителями - аскорбиновой кислотой, глутатионом и оксидом азота;

• исследование механизма реакции HHP и N0 в восстановительной среде и разработка нового метода определения оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых HHP и 19F ЯМР спектроскопии на основе изученного механизма реакции.

Научная новизна работы. Изучен механизм восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой. Впервые было показано, что этот процесс характеризуется равновесием между нитроксильным радикалом и аскорбиновой кислотой с одной стороны, и гидроксиламином и радикалом аскорбата с другой стороны. Были обнаружены новые реакции, дающие существенный вклад в наблюдаемые кинетические кривые восстановления HP, а именно: окисление гидроксиламина радикалом аскорбата и дегидроаскорбиновой кислотой. Также было показано, что нитроксильные радикалы восстанавливаются продуктами разложения дегидроаскорбиновой кислоты, предположительно 2,3-дикетогулоновой кислотой. Впервые предложена и подтверждена математическим моделированием полная реакционная схема восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой.

Впервые показана роль глутатиона в восстановлении HP аскорбиновой кислотой. Хотя GSH не восстанавливает HP, но оказывает сильное влияние на их восстановление аскорбатом через восстановление продуктов окисления АК (радикал аскорбата и дегидроаскорбиновая кислота) обратно в аскорбиновую кислоту. Впервые измерена константа скорости реакции GSH с радикалом аскорбата (АР).

Проведено сравнительное исследование стабильности нитроксильных радикалов различных типов по отношению к восстановлению аскорбиновой кислотой. Показано, что стабильность HP уменьшается в ряду радикалов: пирролидин > имидазолидин > 3-имидазолина > 2-имидазолин-З-оксида (HHP). Было обнаружено, что замена метальных групп вблизи радикального центра нитроксида на этильные группы ведёт к увеличению стабильности соединений к восстановлению в присутствии как аскорбиновой кислоты, так и крови крыс.

Проведено исследование механизма реакции оксида азота и нитронилнитроксильных радикалов в восстановительной среде. Было показано, что HHP быстро восстанавливаются как в присутствии аскорбиновой кислоты, так и в биологической среде (гомогенат мозжечка крыс). Восстановленные формы (гидроксиламины) фторзамещённых HHP превращаются в соответствующие восстановленные формы (гидроксиламины) ИНР в присутствии оксида азота. Было показано, что гидроксиламины HHP не реагируют с оксидом азота с образованием гидроксиламинов ИНР. Для осуществления такого процесса необходимо реокисление гидроксиламинов HHP обратно в радикал с последующей реакцией между HHP и оксидом азота. Образующийся ИНР, в свою очередь, восстанавливается до соответствующего гидроксиламина. На основе экспериментальных данных впервые была предложена реакционная схема взаимодействия нитронилнитроксильных радикалов и оксида азота в восстановительной среде.

Был предложен новый метод регистрации оксида азота ex vivo основанный на методе 19F ЯМР спиновых ловушек с использованием фторзамещённых HHP.

Практическая ценность. В данной работе проведено детальное исследование механизма восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой, показана роль глутатиона в этом процессе. Полученные данные представляют несомненный интерес для исследователей, использующих HP как в качестве спиновых зондов, так и в качестве терапевтических соединений в биологических системах.

Предложен механизм нитронилнитроксильных радикалов с оксидом азота в восстановительных средах. На основе изученного механизма реакции предложен и апробирован метод регистрации оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых нитронилнитроксильных радикалов и спектроскопии 19Р-ЯМР.

В первой главе работы приведён обзор литературы, в котором рассмотрена реакционная способность нитроксильных радикалов как одноэлектронных окислителей и восстановителей по отношению к некоторым важнейшим биологически активным молекулам. В обзоре приведены примеры использования HP в качестве зондов на окислительно-восстановительный статус среды биологической системы. В последнем параграфе описан метод ЯМР спиновых ловушек, который был с успехом использован для детектирования ненаблюдаемых методом ЭПР диамагнитных продуктов окислительно-восстановительных реакций спиновых аддуктов.

Во второй главе приведены результаты исследования механизма восстановления HP аскорбиновой кислотой. Восстановление HP аскорбиновой кислотой сопровождается образованием гидроксиламина нитроксильного радикала (ГАН). Впервые было обнаружено, что ГАН реокисляется как радикалом аскорбата, так и дегидроаскорбиновой кислотой обратно в HP. Были определены соответствующие константы скоростей. В работе исследована роль глутатиона (важнейший восстановитель в биологических системах) в процессе восстановления HP аскорбиновой кислотой. Было показано, что глутатион сам не восстанавливает HP, но повышает эффективность восстановления HP аскорбиновой кислотой вследствие реакции радикала аскорбата с глутатионом. Интересные данные получены при исследовании сравнительной стабильности HP различных типов к восстановлению аскорбиновой кислотой. Показано, что стабильность радикалов уменьшается в ряду: пирролидин, имидазолидин, имидазолин и 2-имидазол-З-оксид. Изучено влияние введения этильных заместителей (вместо метальных) во второе и пятое положения гетероцикла HP на скорость восстановления аскорбиновой кислотой. Показано, что введение этильных заместителей вблизи радикального центра HP приводит к увеличению стабильности соединений.

В третьей главе приведены результаты исследования реакции нитронилнитроксильных радикалов с оксидом азота. Впервые предложен и экспериментально подтверждён механизм данной реакции в восстановительной среде. Показано, что, несмотря на быстрое восстановление, HHP реагирует с N0 с образованием гидроксиламина иминонитроксильного радикала. Продемонстрировано, что гидроксиламин ИНР образуется вследствие реакции между HHP и N0. При этом радикал HHP получается при реокисления соответствующего гидроксиламина. Применение фторзамещённых HHP позволило регистрировать превращение диамагнитного гидроксиламина HHP в гидроксиламин ИНР методом 19F ЯМР. В то же время, образование парамагнитного радикала HHP и его трансформацию под действием оксида азота в ИНР регистрировали методом ЭПР. На основе полученных результатов предложен метод определения количества оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых HHP и 19Р-ЯМР спектроскопии. Метод апробирован на животных на примере нескольких линий крыс, предположительно отличающихся уровнем генерации оксида азота. Наблюдалось хорошее согласие с результатами, полученными по измерению накопления нитритов и нитратов в крови животных.

Список использованных сокращений, реагентов и методик приведён в четвёртой главе данной работы.

Выводы

1. Показано, что устойчивость нитроксильных радикалов убывает в ряду: пирролидиновые, имидазолидиновые, имидазолиновые и 2-имидазол-З-оксидные.

2. Нитроксильные радикалы с объёмными алифатическими заместителями во втором и в пятом положении пятичленного гетероцикла обладают повышенной стабильностью по сравнению с тетраметильными аналогами в восстановительных средах. Увеличение числа этильных групп около радикального центра нитроксида ведёт к увеличению стабильности нитроксильного радикала в этих условиях.

3. При исследовании механизма восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой показано, что в течении данной реакции происходит реокисление соответствующего гидроксиламина нитроксильного радикала как радикалом аскорбата, так и дегидроаскорбиновой кислотой обратно в нитроксид. Предложен полный механизм реакции. Вычислены константы скоростей всех элементарных стадий реакции восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой для ряда HP различных типов. Показано, что глутатион не восстанавливает HP, но увеличивает глубину восстановительного процесса в присутствии аскорбиновой кислоты.

4. Показано, что заключение гидрофобных HHP в липидную фазу увеличивает устойчивость HHP к восстановлению и позволяет использовать HHP для регистрации N0 в восстановительных средах методом ЭПР.

5. Показано, что гидроксиламины HHP не реагируют с оксидом азота. Окисление гидроксиламинов HHP в радикал является необходимой стадией для протекания реакции с оксидом азота с образованием ИНР. Предложен механизм реакции ННРс оксидом азота в восстановительной среде.

6. Разработана методика определения оксида азота в биологических средах с использованием фторзамещённых нитронилнитроксильных радикалов и спектроскопии 19Р-ЯМР для исследования роли оксида азота в патологиях крыс гипертензивного происхождения ex vivo.

Благодарности

Автор чрезвычайно признателен своим научным руководителям - Багрянской Елене Григорьевне и Храмцову Валерию Владимировичу.

Автор благодарен Кирилюку Игорю Анатольевичу, Григорьеву Игорю Анатольевичу, Слепнёвой Ирине Алексеевне, Резникову Владимиру Анатольевичу, Мажукину Дмитрию Геннадьевичу, Колосовой Наталье Гориславовне, Сергеевой Светлане Владимировне, Маркелю Аркадию Львовичу, Шолоховой Лине Фёдоровне, Чаловой Ирине Владимировне, Глазачеву Юрию Ивановичу, Иртеговой Ирине Геннадьевне, знакомым, друзьям и родственникам.

Без помощи всех этих людей автор был бы бессилен что-нибудь сделать.

1. Bartucci, R., Guzzi, R., Marsh, D., Sportelli, L., Intramembrane polarity by electron spin echo spectroscopy of labeled lipids. Biophys J, 2003. 84(2 Pt 1): p. 1025-30.

2. Marsh, D., Polarity contributions to hyperfine splittings of hydrogen-bonded nitroxides—the microenvironment of spin labels. J Magn Reson, 2002. 157(1): p. 1148.

3. Bahri, M. A., Heyne, B. J., Hans, P., Seret, A. E., Mouithys-Mickalad, A. A., Hoebeke, M. D., Quantification of lipid bilayer effective microviscosity and fluidity effect induced by propofol. Biophys Chem, 2005. 114(1): p. 53-61.

4. Parkhomyuk-Ben Arye, P., Strashnikova, N., Likhtenshtein, G. I., Stilbene photochrome-fluorescence-spin molecules: covalent immobilization on silica plate and applications as redox and viscosity probes. J Biochem Biophys Methods, 2002. 51(1): p. 1-15.

5. Contreras-Lopez, E., Champion, D., Hervet, H., Blond, G., Le Meste, M., Rotational and translational mobility of small molecules in sucrose plus polysaccharide solutions. J Agric Food Chem, 2000. 48(4): p. 1009-15.

6. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G., Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods, 1997. 35(2): p. 115-28.

7. Khramtsov, V. V., Marsh, D., Weiner, L., Reznikov, V. A., The application of pH-sensitive spin labels to studies of surface potential and polarity ofphospholipid membranes and proteins. Biochim Biophys Acta, 1992. 1104(2): p. 317-24.

8. Khramtsov, V. V., Panteleev, M. V., Weiner, L. M., ESR study of proton transport across phospholipid vesicle membranes. J Biochem Biophys Methods, 1989. 18(3): p. 237-46.

9. Yokoyama, H., Sato, Т., Fukui, K., Itoh, O., Ohya, H., Akatsuka, Т., Noninvasive in vivo determination of intracerebral oxygen concentration in rats by a longitudinally detected ESR (LODESR) technique. Magn Reson Med, 2004. 51(3): p. 595-601.

10. Ellis, S. J., Velayutham, M., Velan, S. S., Petersen, E. F., Zweier, J. L., Kuppusamy, P., Spencer, R. G., EPR oxygen mapping (EPROM) of engineered cartilage grown in a hollow-fiber bioreactor. Magn Reson Med, 2001. 46(4): p. 819-26.

11. Liu, S., Timmins, G. S., Shi, H., Gasparovic, С. M., Liu, K. J., Application of in vivo EPR in brain research: monitoring tissue oxygenation, blood flow, and oxidative stress. NMR Biomed, 2004. 17(5): p. 327-34.

12. Берлинер, Лоуренс Д., Метод Спиновых меток. Теория и применение. 1979: Издательство "МИР".

13. Winalski, С. S., Shortkroff, S., Mulkern, R. V., Schneider, E., Rosen, G. M., Magnetic resonance relaxivity of dendrimer-linked nitroxides. Magn Reson Med, 2002. 48(6): p. 965-72.

14. Lee, J. N., Feasibility of overhauser-enhanced MR imaging with nitroxide free radicals. J Magn Reson Imaging, 1996. 6(1): p. 261-3.

15. Wan, X., Fu, Т. C., Funk, A., London, R. E., Differential clearance of nitroxide MRI contrast agents from rat cerebral ventricles. Brain Res Bull, 1995. 36(1): p. 91-6.17,18,19