Исследование супрамолекулярных комплексов с участием фотоактивных молекул и нитроксильных радикалов методами ЭПР спектроскопии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

КРУМКАЧЕВА ОЛЕСЯ АНАТОЛЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С УЧАСТИЕМ ФОТОАКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ И НИТРОКСИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ МЕТОДАМИ ЭПР СПЕКТРОСКОПИИ

01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

3 ОКТ 2013

Новосибирск - 2013

005534203

Работа выполнена на кафедре химической и биологической физики федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» (Новосибирский государственный университет, НГУ)

и

в лаборатории магнитного резонанса федерального государственного бюджетного учреждения науки Института «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор физико-математических наук, профессор Багрянская Елена Григорьевна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук доктор физико-математических наук, профессор Дзюба Сергей Андреевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук

доктор физико-математических наук Тарасов Валерий Федорович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский физико-технический институт им.Е.К. Завойского Казанского научного центра Российской Академии наук

Защита состоится " 23" октября 2013 г. в 16эо часов на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук.

Автореферат разослану^сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор химических наук A.A. Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание новых функциональных систем на базе супрамолекулярных комплексов является одной из перспективных задач в областях современной химии, биологии и нанотехнологий. Именно к таким системам относятся комплексы циклодекстрина (ЦД) с фотоактивными молекулами, предназначенные для проведения направленного синтеза и увеличения стабильности лекарств, и комплексы ЦД, ковалентно-связанные с нитроксильными радикалами (НР). Детальное изучение этих систем необходимо для понимания и усовершенствования их функциональных свойств.

Проведение фотолиза в ЦД может приводить к значительному изменению состава продуктов реакций и являться одним из способов проведения направленного синтеза. В тех случаях, когда имеет место зависимость возбужденных состояний молекулы включения от полярности локального окружения, проведение фотолиза в ЦД может привести к изменению реакционного состояния. Другим механизмом влияния ЦД является ограничение реакционной зоны объемом полости ЦД и увеличение времени жизни образующейся при фотолизе радикальной пары (РП). В отличие от гомогенного раствора, где время жизни радикальных пар составляет доли наносекунд, в полости ЦД радикалы удерживаются значительное время — десятки и сотни наносекунд. Это приводит к существенному увеличению выхода клеточных продуктов. Поскольку расстояние между радикалами в полости ЦД сравнимо с размером радикалов, следует ожидать, что при проведении фотолиза в ЦД обменное взаимодействие в РП будет оказывать существенное влияние на магнитные и спиновые эффекты, такие так Химическая Поляризация Ядер (ХПЯ), Химическая Поляризация Электронов (ХПЭ).

Другим направлением развития супрамолекулярной химии с участием циклодекстринов является синтез ЦД, ковалентно-связанных с НР. Такие комплексы являются перспективными для использования в качестве новых поляризующих агентов с целью увеличения сигналов ЯМР протеинов, а также в качестве эффективных и селективных тушителей флуоресценции. Возможность применения НР, ковалентно связанных с ЦД, для решения различных задач в значительной степени зависит от структуры комплекса, что определяет важность исследования равновесия в таких системах и определения параметров, которые в наибольшей степени оказывают влияние на равновесие.

Одна из основных проблем метода спиновых меток и зондов - быстрое восстановление аскорбиновой кислотой, альбумином и другими ферментативными системами до диамагнитного состояния в живых организмах. Недавно было показано, что замена близких к радикальному центру метальных

заместителей на спироциклические в пиперидиновых НР значительно улучшает их стабильность, а также увеличивает время их электронной спиновой релаксации в диапазоне температур 90-130 К1. Известно, что для НР пирролинового и пирролидинового типа константа скорости восстановления биогенными восстановителями почти на порядок ниже чем для НР пиперидинового типа. Поэтому актуальной задачей является синтез новых спирогексан-замещенных пирролиновых и пирролидиновых радикалов и исследование возможности их применения в качестве спиновых меток для изучения структуры и функций биополимеров.

Основными целями работы являются исследование влияния Р-ЦД на механизмы формирования спиновых эффектов и механизмы фотолиза ароматических кетонов; изучение структуры супрамолекулярных комплексов ЦД со стабильными нитроксильными радикалами; исследование возможности применения новых спиновых меток на основе 2,5-спироциклогексан-замещенных НР пирролинового типа для структурных исследований биополимеров.

Конкретными задачами работы являлись:

1. Экспериментальное исследование спиновых эффектов ХПЭ и ХПЯ в реакциях фотолиза трех различных кетонов: деоксибензоина (ДОБ), дибензилкетона (ДБК) и бензофенона (БФ) и определение роли ЦД в исследуемых фотохимических реакциях.

2. Исследование влияния Р-ЦД на структуру электронных уровней и релаксационные свойства нижних триплетных состояний ароматических кетонов (БФ, ДОБ) методами ВР ЭПР и импульсного ЭПР

3. Исследование типа структурного равновесия серии комплексов различных НР (в том числе рН чувствительного), ковалентно связанных с ТЫМЕВ (трижды метилированный Р-ЦД) методами стационарного и импульсного ЭПР. Исследование влияния образования ковалентной связи с ТЫМЕВ на функциональность и стабильность рН-чувствительного имидазолинового НР.

4. Измерение скоростей электронной спиновой релаксации 2,5-спироциклогексан-замещенных нитроксильных радикалов в широком диапазоне температур методом импульсного ЭПР. Измерение расстояния в модельном РНК дуплексе с использованием 2,5-спироциклогексан-замещенной нитроксильной спиновой метки и сравнение полученных результатов со стандартной 2,2,5,5-тетраметил-замещенной нитроксильной меткой.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование влияние (ЦД) на формирование эффектов спиновой поляризации ХПЭ и ХПЯ. Показано, что увеличение времени жизни радикальной пары (РП)

в ЦД и обменное взаимодействие в РП являются основными факторами, влияющими на формирование спиновой поляризации.

Впервые показано, что параметры расщепления в нулевом магнитном поле (Б и Е) триплетных состояний ароматических кетонов зависят от структуры комплекса с ЦД и полярности локального окружения СО-группы. Обнаружено, что скорость электронной релаксации в триплетных молекулах при Т=30 К уменьшается в комплексе с.ЦД по сравнению с гомогенным раствором из-за ограничения мобильности триплетной молекулы.

Для ряда новых комплексов НР, ковалентно связанных с ЦД (ТШМЕВ), методами ЭПР показано, что наблюдается равновесие между комплексами с радикальным фрагментом вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость ТШМЕВ, с преобладанием той или иной формы в зависимости от структуры НР и линкера. Ковалентное присоединение рН-чувствительного имидазолинового радикала к 'ПУМЕ В сохраняет рН-чувствительность радикала, но не увеличивает его стабильность.

Для новых 2,5-спироциклогексан-замещенных НР пирролинового типа, обладающих стабильностью по отношению к биогенным восстановителям, показана применимость для структурных исследований биополимеров методом ДЭЭР (двойной электрон-электронный резонанс) на примере измерений расстояний в модельном РНК дуплексе.

Научная и практическая значимость работы. Результаты работы вносят существенный вклад в развитие представлений о физико-химических процессах с участием циклодекстринов, короткоживущих радикалов и стабильных радикалов. Полученная в работе информация о механизмах эффектов ХПЯ и ХПЭ в радикальных парах в циклодекстринах и о влиянии циклодекстрина на параметры расщепления в нулевом магнитном поле (О и Е) триплетных состояний ароматических кетонов может быть использована при изучении фотохимических реакций в супрамолекулярных комплексах.

Полученные в работе данные о зависимости структуры комплекса НР, ковалентно связанного с ЦД, от строения линкера и нитроксильного фрагмента могут быть в дальнейшем использованы для применения таких систем в качестве селективных поляризующих агентов по механизму ДПЯ и селективных тушителей флуоресценции.

Полученная информация о функциональных свойствах новых спироциклогексан-замещенных пирролиновых НР является важным для их применения в качестве спиновых меток для структурных исследований биополимеров.

Личный вклад соискателя. Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором либо при его непосредственном участии. Автор

диссертации участвовал в разработке плана исследований, проведении экспериментов, обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций по теме диссертационной работы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на международных и российских конференциях: EUROMAR 2013 (Херсониссос, Греция, 2013), VIII Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Новосибирск, Россия, 2012); 6th conference on Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides (Марсель, Франция, 2011); 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena (Нордвейк, Нидерланды, 2011); 3rd International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology" (Львов, Украина, 2010); Всероссийская молодежная школа с международным участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике» (Новосибирск, Россия, 2010); First Symposium "Supramolecular Chemistry for Material and Life Sciences (Новосибирск, Россия, 2010); Международная научная студенческая конференция (Новосибирск, Россия, 2010); Международная школа молодых ученых «Современные проблемы магнитного резонанса и его применения» (Казань, Россия, 2009 г); V Международный симпозиум "Дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур" (Казань, Россия, 2009), Central European Conference on Photochemistry (Бад-Гаштайн, Австрия, 2008).

Исследования были поддержаны Министерством образования и науки Российской Федерации (ФЦП) «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2012-2013 гг. проект № 8456»

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых научных международных журналах, рекомендованных ВАК, и 16 тезисах докладов международных и российских конференций, 5 из которых были представлены в виде устных докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, четырех глав, в которых изложены полученные автором результаты, выводов, благодарностей и списка литературы, включающего 182 наименований. Работа изложена на 118 страницах, содержит 8 таблиц, 26 рисунков и 23 схемы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы и дано описание структуры диссертации.

-с-Дз^о

Схема!. Структура |3-ЦД

В первой главе диссертации приводится краткий литературный обзор исследований супрамолекулярных комплексов ЦД (схема 1) и рассмотрены основные методы их исследования. Проведено обсуждение основных механизмов влияния ЦД на электронно-возбужденные состояния и фотохимические реакции, особое внимание уделено рассмотрению реакций, протекающих по радикальному механизму, в том числе, обсуждению механизмов формирования

эффектов ХПЭ и ХПЯ в гомогенных растворах и организованных средах. Описано применение метода ЭПР с временным разрешением (ВР ЭПР) для исследования триплетных состояний ароматических кетонов. Рассмотрены особенности комплексов НР, ковалентно связанных с ЦД, и перспективы их применения для увеличения стабильности НР, селективного тушения флуоресценции и т.д. Приведен обзор методик изучения равновесия в комплексах НР, ковалентно связанных с ЦД, с более подробным рассмотрением метода модуляции электронного спинового эха (Е8ЕЕМ). Обсуждается применение метода двойного электрон-электронного резонанса (ДЭЭР) для изучения структуры и функций биополимеров, и рассмотрены проблемы, возникающие при проведении исследований в "живых" системах и связанные с быстрым восстановлением НР. Обсуждаются возможные варианты решения данной проблемы, в том числе перспективность создания спиновых меток на основе спироциклогексан-замещенных НР. На основе анализа литературных данных сформулированы основные задачи для решения в рамках настоящей работы.

Вторая глава

диссертации посвящена

изучению влияния (3-ЦД на механизмы формирования спиновых эффектов методами ЯМР и спиновой химии -ХПЯ и ХПЭ на примере фотохимической реакции трех кетонов (деоксибензоина (ДОБ), дибензилкетона (ДБК) и бензофенона (БФ)) — диссоциации и переноса

атома водорода (Схема 2). Для повышения концентрации образуемых

ДОБ

Д6К

У I Д06Н, = РЬ- Я, = Р1ХНГ о-А,, I Д6К8, »(¡.^РН-СН,-Кз1 БФ Ч. . В РИ-

перенос атомэ

водорода

• К (растворитель или ЦД) ]

РП2

Схема 2. Химическая структура и общая схема фотолиза для исследуемых кетонов.

комплексов в работе использовался метилированный случайным образом ß-ЦД

(Кр-ЦД). Образование комплекса проверялось методом *Н ЯМР и УФ спектроскопии.

При фотолизе ДОБ в присутствии ЦД (Рис. 1) в спектре ХПЯ наблюдаются сигналы на продуктах рекомбинации бензильного и бензоильного радикалов (РП1), формирующихся в результате диссоциации молекулы ДОБ. Дополнительно наблюдается сигнал ХПЯ на протонах КВ-ЦД (3.2 м.д.), что указывает на протекание фотохимической реакции переноса атома Н с внутренней поверхности ЦД Яр-ЦД на молекулу ДОБ (РП2). Таким образом, при фотолизе ДОБ в ЯВ-ЦД одновременно реализуются два механизма: диссоциация и перенос атома Н. Аналогичные эксперименты ХПЯ (Рис. 1) показали, что при фотолизе ДБК в 1ф-ЦД имеет место диссоциации кетона, в случае фотолиза БФ - перенос атома водорода с КВ-ЦД. Полученные для комплекса ДБК/Кр-ЦД результаты согласуются с работой Петровой с соавторами2, где методом ХПЯ изучали фотолиз ДБК в Р-ЦД.

1)Д6ШР-ЦД

2) ДОБ/ЯР-ЦД

I ;

Ш(А)

а) W»b)

а«Р

3) БФЛф-ЦД

а)

IV(A) b)

. JU ^J1

KB!

V V

l(A)

J) b)

5 4 ppm

5 4

ppm

5 4 ppm

Рис 1. а) Стационарные спектры ЯМР комплексов Rß-ЦД с 1) ДБК, 2) ДОБ, 3) БФ в D20, (* = Н20) и Ь) соответствующие спектры ХПЯ, полученные после фотолиза комплексов. Длительность регистрирующего РЧ импульса - 8.7 мкс, задержка между лазерным и РЧ импульсами -1 мкс. Обозначения (1) ДОБ(1) = PhA-CO-CH2B-Phc; RB-ЦД (II); Дифенилэтан (IV) = (PhCH2A)2; Промежуточный продукт перегруппировки (III) = Ph-CO-C6H5-CH2A. (2) ДБК (I) = Phc-CH2B-CO-CH2B-Phc, Rß-ЦД (II), Промежуточный продукт реакции перегруппировки (III) = Ph-СНг-СО-СбН^-СНД Дифенилэтан (IV) = (PhCH2A)2 (3) БФ (I) (Ph)2A-CO, (II) Rß-ЦД, (III) продукт рекомбинации радикала Rß-ЦД с кетильным радикалом БФ.

Сравнение результатов экспериментов ХПЯ при фотолизе ДОБ в гомогенном растворе и в присутствии Rp-ЦД показало, что в случае диссоциации радикалов влияние образования комплекса сводится к увеличению времени жизни РП1 и, соответственно, увеличению выхода клеточного продукта. При фотолизе ДОБ в ЦД обнаружено увеличение выхода

продукта реакции перегруппировки, что свидетельствует о высокой подвижности радикалов внутри полости ЦД. Согласно правилу Каптейна для ХПЯ в сильных магнитных полях по Я-То механизму, наблюдаемая на протоне Г-ф-ЦД поляризация должна быть положительной. Однако в эксперименте наблюдается отрицательный знак поляризации, что, как мы предполагаем, определяется формированием ХПЯ по Я-Т механизму. Формирование ХПЯ по 8-Т_ механизму в молекулярно организованных средах обусловлено увеличением повторных контактов в РП и малым расстоянием между партнерами РП.

При фотолизе комплекса ДВК/Лр-ЦД сигнал ХПЭ не наблюдается, что, как мы предполагаем, является следствием быстрой рекомбинации радикалов в РП1 в полости ЯР-ЦД. При фотолизе ДОБ и БФ в присутствии Г<р-ЦД регистрируется широкий неразрешенный эмиссионный сигнал ХПЭ (Рис. 2). Это отличается от ситуации в гомогенном растворе, где при фотолизе ДОБ наблюдается мультиплетная ХПЭ (Рис. 2). На основании сравнения экспериментального спектра ХПЭ с расчетными для радикалов в РП1 и РП2, а так же учитывая отсутствие сигнала ХПЭ при фотолизе комплекса ДБКЖр-ЦД, в работе сделан вывод о том, что наблюдаемый при фотолизе комплекса ДОБ/Яр-ЦД спектр ХПЭ соответствует спектру РП2, образующейся в результате переноса атома Н. Для РП2, в которой только один из партнеров является подвижным, обратная рекомбинации затруднена, и время жизни РП2 значительно больше, чем для РП1. Это позволяет в течение длительного времени (порядка 16 мкс) детектировать методом ХПЭ сигнал от РП2.

(А)ЦД (8) изопропанол

Рис 2. ВР ЭПР спектры, зарегистрированные (А) после лазерного возбуждения водного комплекса ДОБ/ЯР-ЦД. На рисунке указаны задержка после лазерного импульса и время интегрирования. (В) через 300 не после лазерного возбуждения ДОБ в гомогенном растворе (изопропанол). Черная линия соответствует экспериментальному спектру, серая линия - расчетному спектру изопропильного радикала и кетильного радикала ДОБ.

Л

330 333 336 339 342 345 330 Магнитное поле / шТ

333 336 334 342

Магнитное поле / тТ

Наблюдаемая при фотолизе ДОБ/Яр-ЦД и БФ/Яр-ЦД эмиссионная интегральная поляризация может быть сформирована по триплетному и по 8-Т_ механизму. Для формирования поляризации по триплетному механизму время" жизни триплетного состояния должно быть меньше, чем время электронной спиновой релаксации в триплетной молекуле. На основе литературных и экспериментальных данных в работе сделаны оценки, согласно которым предполагаемое время жизни триплетной молекулы ДОБ в Ир-ЦД (=100-200 не) существенно больше, чем время электронной релаксации в триплете (=14 не), поэтому наблюдаемая эмиссионная ХПЭ формируется по Б-Т. механизму.

Увеличение времени жизни РП в ЯР-ЦД по сравнению с гомогенными растворами приводит к изменению механизма формирования химической ядерной и электронной поляризации. Вследствие того, что большую часть времени жизни радикалы проводят внутри ЦД, то есть на малом расстоянии друг от друга, обменное взаимодействие оказывает большое влияние на эффекты ХПЯ и ХПЭ, которые формируются за счет 5-Т_ переходов.

В третьей главе приведены результаты исследования влияния циклодекстринов на электронную структуру нижнего возбужденного триплетного ароматических кетонов (БФ, ДОБ) методами ВР и импульсного ЭПР. Для ароматических кетонов параметр расщепления в нулевом магнитном поле О определяется вкладами от спин-спинового дипольного взаимодействия (О;,) и спин-орбитального взаимодействия между Зпл* и Зпп* состояниями3 (050). В данной работе мы использовали высокую чувствительность параметров расщепления в нулевом магнитном поле ароматических кетонов к полярности локального окружения для определения локализации карбонильной группы (внутри/снаружи полости ЦД) и электронной структуры нижнего триплетного состояния кетонов в комплексе с ЦД.

Для этого было были измерены спектры ВР ЭПР триплетов ДОБ и БФ при Т=30 К в полярном растворителе трифторэтаноле (ТФЭ), неполярном метилциклогексане (МЦГ) и в комплексе с Яр-ЦД в водном растворе (Рис. 3). Параметры триплетных молекул ДОБ и БФ в различных растворителях, полученные из моделирования экспериментальных спектров, представлены в таблице 1.

Зарегистрированный спектр ВР ЭПР триплетного состояния БФ в комплексе с Яр-ЦД близок к спектру в неполярном растворителе метилциклогексане, где, согласно литературным данным, реакционным состоянием является п-л*4. Для ДОБ в неполярном растворителе, метилциклогексане, сигнал от триплетной молекулы не наблюдается. Мы предполагаем, что в данном случае триплетное состояние является комбинацией Зп-л* и Зя-л* состояний, каждое из которых дает примерно одинаковый вклад. Для такой ситуации ожидаемое значение

Бензофенон

Дсокснбснзоип

100 200 300 400 500

Магнитное по.те ! м Г

600 100 200 300 400 500 £00 Магнитное по.те / м'Г

Рис 3. Экспериментальные (линии с шумом) и расчетные ВР ЭПР спектры, полученные при фотолизе БФ (а) и ДОБ (Ь) при Т=30 К в ТФЭ, в смеси Н20/глицерин (7:3) в присутствии 3 тМ Я(3-ЦД и в МЦГ. Интервал интегрирования по времени - 0.6-0.8 мкс.

параметра О больше чем величина кванта микроволнового поля (9 гГц), поэтому сигнал ЭПР триплетной молекулы в X диапазоне (9 гГц) не может быть зарегистрирован5. Наблюдение ЭПР спектра триплетного состояния ДОБ в комплексе с Яр-ЦД указывает на полярное окружение СО группы, а увеличение значения О для триплета ДОБ при образовании комплекса с ЯР-ЦД в сравнении со значением в трифторэтаноле указывает на увеличение вклада от Зп-л* состояния. Неоднородное уширение линий ВР ЭПР в неполярных растворителях при образовании комплекса с Яр-ЦД в водных растворах и в неполярных растворителях обусловлено наличием различных геометрических конформаций возбужденной молекулы.

Таблица 1. Параметры расщепления в нулевом магнитном поле (Э и Е) (±0.1 ГГц), ширина распределения О и Е (±0.1 ГГц), начальная заселенность уровней энергии триплетного состоянии Ру. Рх. Р2 (±0.1), полученные из моделирования экспериментальных спектров._

Молекула Ру Рх Рг ДГГц) /£/(ГГц) АО (ГГц) ЛЕ (ГГц)

БФ/р-ЦЦ 0 0 1

БФ/МЦГ 0 0 1

БФ/ТФЭ 0.3 0 0.7

ДОБ/ТФЭ 0.4 0 0.6

РОВ/р-ЦД 0.5 0 0.5

-4.6

-3.4 -4.2 -4.3

-4.8

0.6 0.6 0.3 0.3 0.3

1.0 0.9 0.4 0.4

0.8

0.6 0.6 0.4

0.8

1.0

Мы предполагаем, что разница между экспериментальными ЭПР спектрами триплетных молекул ДОБ и БФ главным образом определяется их различным расположением внутри полости Яр-ЦД. СО-группа БФ располагается внутри полости ЛР-ЦЦ и в большой степени экранирована от молекул воды (полярного растворителя) в сравнении с комплексом ДОБ/Кр-ЦД.

Методом импульсного ЭПР было изучено влияние ЦД на времена продольной и поперечной электронной релаксации Т] и Т2 триплетного состояния молекулы БФ в смеси Н20/глицерин и в неполярном растворителе толуоле при Т=30 К (Рис. 4). Как видно из рис.4 Т2 и Т] зависят от растворителя и от ориентации триплетной молекулы относительно направления внешнего магнитного поля. Наиболее

короткое время релаксации (для Т1 и Т2) наблюдается на краях спектра ЭПР (250 и 500 мТл). Эти положения соответствуют ориентации оси ъ (ось ъ || С=0 связи) триплетной молекулы вдоль внешнего магнитного поля. Измеренные времена релаксации (Т! и Т2) в присутствии Яр-ЦД значительно длиннее, чем в гомогенном растворителе

толуоле (максимальные значения Т1цдЛУолуол=1.5 и Т2цд/Т2толуол=4). В рамках предположения, что для поперечной и продольной релаксации основным является динамический процесс

релаксации, определяющийся модуляцией диполь-дипольного взаимодействия, уменьшение скорости электронной

релаксации триплетного

состояния БФ в присутствии яр-ЦЦ в сравнении с гомогенным растворителем определяется ограничением движения из-за эффекта локализации в полости

яр-цд.

а)

1- 2.0

I 1.6

<0

% лл

с,

О- 0.8 к

I 0.4

ш

0.0

0

1 30

25 | 20 S 15

(О

£ ю

£ 5 5

S. 0

m

b)

с)

i - i

i I

150 200 250 300 350 400 450 500 550

Магнитное поле / мТ

Рис 4. (а) Эхо-детектируемый спектр ЭПР триплетного состояния БФ в смеси Н20/глицерин (7:3) в присутствии 3 шМ RP-ЦД (импульс л/2 - 50 не; задержка между импульсами л — 180 не). Зависимость Т2 (Ь) и T¡ (с) от значения внешнего магнитного поля: • — в смеси Н20/глицерин (7:3) в присутствии 3 шМ RP-ЦД, о-в толуоле.

Четвертая глава диссертации посвящена исследованию комплексов НР пиперидинового (N001, N002), пирролинового (N004), пирролидинового (N003), и имидазолинового (N005) типа, ковалентно связанных с трижды метилированным Р-ЦД (ТШМЕВ). Для НР, ковалентно связанного с ЦД, характерны различные типы равновесия между формами: это равновесие типа (В - А) (схема 4 модель 1) и равновесие (В - О) (схема 4 модель 2). Положение НР относительно полости ЦД, (НР находится внутри ЦД, снаружи полости ЦД, либо прикрывает полость ЦД) определяется структурой ЦД, длиной и структурой связывающего линкера.

нитроксильные радикалы. ти1мев ковалентно связанные с циклодскстрином

1 -эдамантанметанол

NCD1 _/

HN—\ N-O'

R= HN

свободные нитроксильные радикалы

—( HN—( N-O-

HN-Ч М-

HN- < N О'

РЧ Мг

п

tN О

>0

—/ 0—( N - О"

HN4 Мг

о 4

TEMPOS

О-/ N-O'

рЧ Н"

п

V-N О

О» О

АМР1

Н н

АМР2

Ca,

N-O-

Схема 3. Химическая структура исследованных комплексов.

Для изучения процесса комплексообразования мы использовали методы ЕБЕЕМ (метод Модуляции Электронного Спинового Эха)6 (Т=80 К) и стационарного ЭПР (Т=300 К). Эффект ЕБЕЕМ для НР возникает вследствие сверхтонкого анизотропного взаимодействия электрона с ядром дейтерия 020. В случае удаленных ядер частота модуляции соответствует Зеемановской частоте дейтерия, а амплитуда модуляции, нормированная на амплитуду спинового эха (Рис. 5), К(2Н) прямо пропорциональна количеству молекул дейтерия в ближайшем окружении НР. Для количественного

«П

А

А*

модель 2

в

ч»

Схема 4. Возможные структурные формы НР, ковалентно связанного с циклодекстрином.

описания степени доступности НР к молекулам дейтерия использовался параметр Кк=К(2Н)(комплекс)/К(свободный радикал)х100%. Уменьшение свидетельствует о погружении НР в полость ТШМЕВ. Из моделирования экспериментальных спектров ЭПР были получены значения времени корреляции движения НР ¡сот которое характеризует динамику радикалов. Образование комплекса между ТЯ1МЕВ и НР ограничивает подвижность радикала, тем самым уменьшая значение /согг.

Для определения типа равновесия (модель 1 или модель 2 на схеме 4)7 в ЫСОб мы одновременно анализировали измеренные значения /согг, ам и К(2Н) (Рис. 5, табл. 2) и сравнивали их со значениями для свободных НР и со значениями для N005 в присутствии молекулы-конкурента 1-адамантанметанол (АМ).

Рис 5. Временные зависимости ESEEM (слева) и стационарные ЭПР спектры (справа) свободных нитроксильных радикалов и ковалентно-связанных с TRIMEB (NCDs) в DjO/DMSO-ök (4/1 v/v): черная линия - свободные нитроксильные радикалы; красная линия - 0.5 мМ NCDs (HP ковалентно-связанные с TR1MEB); синяя линия - 0.5 мМ NCDs в присутствии молекулы -конкурента 5 мМ AM.

Таблица 2. Амплитуда модуляции ESEEM К(2Н), параметр RK и время корреляции tcorr, для свободных HP и ковалентно-связанных с TRIMEB (NCDs), полученные из обработки ЭПР спектров в D20/DMS0-d6 (4/1 v/v)

Во всех изученных системах мы обнаружили равновесие между комплексами с радикальным фрагментом вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость TRIMEB (модель 1, схема 4), в некоторых случаях с преобладанием той или иной формы. Хотя в исследуемых системах линкер, соединяющий радикальный фрагмент и TRIMEB, имеет различную подвижность, его длины недостаточно для

формирования комплекса с глубоко погруженным в полость TRIMEB

нитроксильным радикалом. Доступность НР к молекулам растворителя зависит от структуры мостика между радикалом и TRIMEB.

В комплексах N001 и N003 НР и TRIMEB соединены через -МН-СО-ЫП-"жесткий" мостик, поэтому этот комплекс показал высокую доступность молекул

растворителя к радикалу. N002 имеет такую же структуру нитроксильного фрагмента, как и N001, но отличающийся линкер: соединение через более подвижную -МН-СО-О- структуру в N002 приводит к частичному включению нитроксильного фрагмента в полость TRIMEB и к уменьшению доступности растворителя к радикалу.

Методом стационарного ЭПР (Рис. 6) было показано, что ковалентное присоединение рН-чувствительного радикала к ТЯ1МЕВ в системе N005 сохраняет рН-чувствительность радикала в районе рКа=2.89. Измеренная константа восстановления аскорбиновой кислотой для N005 составляет 26 с" 'М-1 и близка к значению константы восстановления для АТ1 22.5 с"'М"'. Этот

НР К(2П) RK tcorr, нс

(±0.005) (±0.05)

TEMPO 1 0.71 100% 0.08

NCD1 0.694 98% 0.45

NCD1/AM 0.661 93% 0.67

ТЕМРОЗ 0.711 100% 0.07

NCD2 0.642 90% 0.54

NCD2/AM 0.658 93% 0.47

AMPI 0.757 100% 0.07

NCD3 0.731 97% 0.54

NCD3/AM 0.621 82% 1

PC AI 0.754 100% 0.06

NCD4 0.614 81% 0.59

NCD4/AM 0.628 83% 0.91

ATI pH=9 0.77 100% 0.03

NCD5 0.746 97% 0.13

pH=7.7

NCD5/AM 0.756 98% 0.13

рН=7.7

АТ1рН=1.5 0.758 100% 0.03

NCD5 0.735 97% 0.12

рН=1.3

NCD5/AM 0.74 98% 0.11

рН=1.3

результат согласуется с данными ЕБЕЕМ, согласно которым нитроксильный фрагмент обладает высокой доступностью к молекулам растворителя (и, соответственно, к аскорбиновой кислоте) как в протонированной, так и в депротонированной формах. Для улучшения стабильности рН-чувствительного радикала, ковалентно связанного с ТЯ1МЕВ, необходимо использовать более гибкую структуру мостика, которая позволит радикалу глубже проникать в полость ЦД.

Рис. 6. (а) ЭПР спектры Х-диапазона ЫСЭ5 при рН=5.3 (черная линия) и рН=1.2 (синяя линия). (Ь) Изменение константы СТВ для Г\ГС05 при изменении рН в водном растворе. Константа СТВ измерялась между центральной и низкопольной компонентами в ЭПР спектре НР. (с) Зависимость сигнала ЭПР от времени для 0.1 мМ N005 в присутствии 1 мМ аскорбата при рН=6.8.

В итоге, комплекс 1ч!С04 показал оптимальное сочетание свойств ТШМЕВ и НР. Среди всех 5 исследованных систем, ЖЮ4 является наиболее перспективным с точки зрения его использования в качестве селективного тушителя флуоресценции: (1) внутренняя полость ТШМЕВ остается свободной, что позволяет эффективно образовывать комплекс включения с другими молекулами (2); структура соединительного мостика обеспечивает расположение НР рядом с молекулой включения.

Пятая глава диссертации посвящена исследованию нового типа 2,5-спироциклогексан-замещенных НР пирролинового типа. Эти радикалы были синтезированы в лаборатории азотистых соединений к.х.-н. И. А. Кирилюком (НИОХ СО РАН). Измерения, проведенные совместно с Р.К. Стрижаковым (НИОХ СО РАН) показали, что новые спироциклогексан-замещенные НР пирролинового типа обладают более высокой стабильностью к восстановлению, чем их пиперидиновые и тетраметил-замещенные аналоги.

Для НР 1,2,3, МОББЬ были измерены температурные зависимости времён электронной релаксации Тт и Г/ в водно-глицериновом растворе 1:1. В отличие от тетраметил-замещенного аналога МТ55Ь, временной спад спинового эха для НР с двумя спироциклогексановыми фрагментами не является моноэкспоненциальным.

соон соыи, сг 1 О" 2

Схема 5. Структуры и заместители 2,5-спироциклогексан-замещённых пирролиновых НР. М0581.-08Н - глутатион, спин-меченный тиол-специфичным спироциклогексан-замещёиным НР.

Введение громоздких

спироциклических фрагментов вместо метальных групп приводит к подавлению механизма электронной фазовой релаксации, связанного с движением СН3 групп и определяющего резкий рост скоростей электронной фазовой релаксации при температурах Т>80 К для тетраметил-замещенных НР. Измеренные времена релаксации Тт для 2,5-спироциклогексан-замещенных НР

пирролинового типа не зависят от температуры в диапазоне 50 - 120 К. Спин-

решеточная релаксация для исследованных НР в диапазоне температур 50 -120 К определяется Рамановским процессом и в пределе высоких температур ее скорость пропорциональна Т2. Это позволяет увеличивать частоту повторения импульсной последовательности с увеличением температуры, и как результат компенсировать снижение интенсивности спинового эха, пропорциональной Больцмановскому фактору ~ 1/Т. Таким образом, релаксационные свойства новых 2,5-спироциклогексан-замещённых пирролиновых НР позволяют использовать эти радикалы для измерения межспиновых расстояний методом ДЭЭР, в том числе при азотных температурах 80-120 К.

Рис. 7 Характерные спады спинового эха для МТБ8Ь и 1 в водно-глицериновых растворах (1:1) при 100 К.

7.0-,

6.5

6.0

о>

3 5.5

5.0

о □ □ °<-& ■ £

о й

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Т(К)

Рис. 8. Температурные зависимости времён релаксации электронов Тт (а) и Г/ (Ь) в водно-глицериновом растворе (1:1) для МТЗБЦа), 3(и), 2(о), 1(Д), МОБвЦО) и МОЗЗЬ-ОБЩУ). Погрешность измерений ~ 5%.

Для исследования возможности использования новых радикалов в качестве спиновых меток в биологических системах И.А.Кирилюком (НИОХ СО РАН) был синтезирован глутатион, спин-меченный МОЗЭЬ. Успешность протекания реакции между меткой МВББЬ и цистеиновой группой глутатиона доказывалась по изменению формы стационарного ЭПР спектра в Х- и (2-диапазонах для МОЗЗЮЗН по сравнению со спектром свободной спиновой метки ГуГО88Ь. Измерение электронной спиновой релаксации М0581.-08Н показало, что присоединение спиновой метки к глутатиону с образованием радикала М088Ь-08Н не изменяет параметры релаксации Г, и Тт.

Для тестирования возможности применения новых НР для измерения расстояний в биополимерах в лаборатории Г.Г.Карповой (ИХБиФМ СОР АН) был проведен синтез модельных дуплексов РНК, спин-меченных 2,5-спироциклогексан-замещенным НР пирролинового типа (дуплекс 1) и их тетраметил-замещенным аналогам (дуплекс 2). Синтез проводился с использованием оригинальных методов, предложенных Карповой Г.Г. с соавторами (ИХБФМ СО РАН).

н

N—-^^Чн дуплекс 1

Н I! 1 ----------

го^вссоасоа

н' гГ-х

N •6

ОН ОН

ОН ОН

■¿у

-"Л-

Ч'

%ш дуплекс 2 о-^Нг

ЧЛ ^¿Оссссас!

У он он

он он

Схема 6. Структура модельного дуплекса РНК и используемых спиновых меток.

Для дуплексов 1 и 2 методом ДЭЭР8 в (^-диапазоне были получены близкие функции распределения по расстояниям между радикалами: (гдээр)=3.81 нм, <т=0.41 нм и (г(ээ/>)=3.80 нм, сх=0.35 нм (для дуплекса 1 и 2, соответственно). Хорошее согласие между расстояниями, полученными с применением двух разных меток, демонстрирует применимость новых спироциклогексан-замещенных меток для структурных исследований методом ДЭЭР.

^ какэчка

Рис. 9 Измерение расстояний в дуплексах 1 и 2 в С>-диапазоне методом ДЭЭР. (А) характерный эхо-детектируемый спектр ЭПР и позиции импульсов накачки и наблюдения. (В) Временные зависимости ДЭЭР после вычитания базовой линии (нормированная интенсивность). (С) Полученные распределения по расстояниям (нормированные на единицу).

В экспериментах ДЭЭР регистрируется только одна осцилляция даже при больших значениях времен эволюции. Мы считаем, что быстрое затухание колебаний связано со свойствами исследуемой системы, а именно с наличием достаточно длинного и подвижного линкера в структуре спин-меченных дуплексов РНК, что в итоге приводит к широкому распределению по расстояниям. Спироциклогексан-замещенная спиновая метка обладает улучшенными релаксационными свойствами (наличие затяжного плато вначале), что потенциально должно улучшить точность определения расстояния за счет регистрации большего числа осцилляций. Но, по всей видимости, наличие различных конформаций для используемого линкера не позволило продемонстрировать данное преимущество новой метки.

Цитируемая литература

1.Rajca, A.; Kathirvelu, V.; Roy, S. К., et al. A Spirocyclohexyl Nitroxide Amino Acid Spin Label for Pulsed EPR Spectroscopy Distance Measurements. Chem-Eur J 2010, 76(19), 5778-5782.

2.Petrova, S. S.; Kruppa, A. I.; Leshina, Т. V. Time-resolved photo-CIDNP of dibenzyl ketone-beta-cyclodextrin inclusion complex. Chem Phys Lett 2004, 385 (12), 40-44.

3.Hayashi, H.; Nagakura, S. Semi-empirical calculations of the zero-field-splitting parameters of the lowest triplet states of aromatic ketones. Mol Phys 1972, 24 (4), 801-807.

4.Sharnoff, M. ESR of the Triplet State of Benzophenone. J Chem Phys 1969, 51 (1), 451-452.

5.Ikoma, Т.; Akiyama, K.; Tero-Kubota, S. Twist conformational effects on the excited triplet states of aromatic ketones studied by multifrequency TREPR and pulsed EPR spectroscopy. Mol Phys 1999, 96 (5), 813-820.

6.Milov, A. D.; Samoilova, R. I.; Shubin, A. A., et al. ESEEM Measurements of Local Water Concentration in D(2)0-Containing Spin-Labeled Systems. Appl Magn Reson 2008,35(1), 73-94.

7.Bagryanskaya, E. G.; Bardelang, D.; Chenesseau, S., et al. EPR, NMR, and Thermodynamic Evidences for Forced Nuclear Spin-Electron Spin Interactions in the Case of 1 -Phenyl-2-Methylpropyl-l, 1 -Dimethyl-2-Nitroxide (TIPNO) Attached to Permethylated beta-Cyclodextrin. Appl Magn Reson 2009, 36 (2-4), 181-194.

8.Milov, A. D.; Maryasov, A. G.; Tsvetkov, Y. D. Pulsed electron double resonance (PELDOR) and its applications in free-radicals research. Appl Magn Reson 1998, /5(1), 107-143.

Результаты и выводы

1. Изучено влияние циклодекстрина на механизмы фотолиза ароматических кетонов и на формирование эффектов спиновой поляризации. Показано, что увеличение времени жизни РП в ЦД и обменное взаимодействие в РП являются основными факторами, влияющими на формирование спиновой поляризации. При фотолизе ДОБ в ЦД происходит как диссоциация молекулы ДОБ, так и перенос атома водорода с ЦД на ДОБ. Наблюдение ХПЯ на продукте перегруппировки свидетельствует о высокой подвижности радикалов внутри полости ЦД. Для БФ основным каналом фотолиза является реакция с ЦД.

2. Методом ВР ЭПР исследована природа триплетного состояния ароматических кетонов и показано, что параметры расщепления в нулевом магнитном поле (О и Е) триплетных состояний зависят от структуры комплекса с ЦД и полярности локального окружения СО-группы. Обнаружено, что скорость электронной релаксации в триплетных молекулах при Т=30 К уменьшается в комплексе Р-ЦД по сравнению с гомогенным раствором из-за ограничения мобильности триплетной молекулы.

3. Методами ЕБЕЕМ и стационарного ЭПР показано, что для ряда новых комплексов нитроксильных радикалов, ковалентно-связанных с ЦД (ТММЕВ) наблюдается равновесие между комплексами с радикальным фрагментом вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость ТШМЕВ, с преобладанием той или иной формы в зависимости от структуры нитроксильного радикала и линкера. Ковалентное присоединение рН-чувствительного имидазолинового радикала к ТШМЕВ сохраняет рН-чувствительность радикала, но не увеличивает его стабильность.

4. Показано, что времена электронной релаксации новых 2,5-спироциклогексан-замещенных нитроксильных радикалов пирролинового типа, обладающих стабильностью по отношению к биогенным восстановителям, позволяют применять метод ДЭЭР в диапазоне температур 50-120 К. Показана применимость новых меток для структурных исследований биополимеров методом ДЭЭР на примере измерений расстояний в модельном РНК дуплексе.

Основные результаты изложены в следующих работах:

1. Krumkacheva. О. A.: Fedin, М. V.; Polovyanenko, D. N.; Jicsinszky, L.; Marque, S. R. A.; Bagryanskaya, E. G., Structural Equilibrium in New Nitroxide-Capped Cyclodextrins: CW and Pulse EPR Study // J Phys Chem В 2013, 117 (27), 82238231.

2. Kirilyuk I. A., Polienko Y. F., Krumkacheva O. A.. Strizhakov R. K., Gatilov Y. V., Grigor'ev I. A., Bagryanskaya E. G., Synthesis of 2,5-Bis(spirocyclohexane)-Substituted Nitroxides of Pyrroline and Pyrrolidine Series, Including Thiol-Specific Spin Label: An Analogue of MTSSL with Long Relaxation Time //I Org Chem 2012, 77 (18), 8016-8027

3. Krumkacheva. P.: Tanabe, M.; Yamauchi, S.; Fedin, M.; Marque, S. R. A.; Bagryanskaya, E., Time-Resolved and Pulse EPR Study of Triplet States of Alkylketones in beta-Cyclodextrin // Appl Magn Reson 2012, 42 (1), 29-40

4. Krumkacheva. O. A.: Gorelik, V. R.; Bagryanskaya, E. G.; Lebedeva, N. V.; Forbes, M. D. E., Supramolecular Photochemistry in beta-Cyclodextrin Hosts: A TREPR, NMR, and CIDNP Investigation//Langmuir 2010, 26 (11), 8971-8980

5. Krumkacheva. O. A.: Kirilyuk, I. A.; Polienko, Y. F.; Grigor'ev, I. A.; Strizhakov, R. K.; Babailova, E. S.; Ivanov, A. V.; Vorobjeva, M. A.;.Venyaminova A. G; Malygin, A. A.; Karpova, G. G.; Fedin, M. V. and Bagiyanskaya, E. G., New 2,5-bis(spirocyclohexane)-substituted nitroxides of pyrroline and pyrrolidine series as spin labels: advanced properties and applications to distance measurements in RNA // Book of abstracts of Magnetic Resonance Conference "EUROMAR2013", Hersonissos (Greece), 2013, 327 MO

6. Krumkacheva. O. A.: Gorelik, V. R.; Forbes, M., D., E.; Bagryanskaya, E., G., Supramolecular Photochemistry in p-Cyclodextrin Hosts: A TREPR, NMR, and CIDNP Investigation // труды XII Международной школы молодых ученых «Современные проблемы магнитного резонанса и его применения», Казань (Россия), 2009, стр. 169-173

7. Krumkacheva О. A.. Fedin М. V., Polovyanenko D. N., Marque S. R. A., Plyusnin V. F. and Bagryanskaya E. G., Nitroxides attached to cyclodextrin as selective probes for lumenescence quenching // Book of abstracts of 6th conference on Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides, Marseilles (France), 2011, p. 97

8. Krumkacheva P.. Tanabe M., Forbes M. D. E., Yamauchi S. and; Bagryanskaya E., TREPR, NMR, and CIDNP Investigation of Supramolecular Photochemistry in beta-Cyclodextrin Hosts // Book of abstracts of 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, Noordwijk (The Netherlands), 2011, p.64

Подписано в печать 12.09.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 140 экз. Заказ № 173.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» (Новосибирский государственный университет, НГУ)

и федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт «Международный томографический центр» Сибирского отделения

Российской академии наук

Исследование супрамолекулярных комплексов с участием фотоактивных молекул и нитроксильных радикалов методами

ЭПР спектроскопии

На правах рукописи

04201363322

КРУМКАЧЕВА ОЛЕСЯ АНАТОЛЬЕВНА

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Специальность 01.04.17 - " химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества "

Научный руководитель:

профессор, д.ф.-м.н. Е.Г. Багрянская

Новосибирск - 2013

Оглавление

Оглавление.....................................................................................................................................2

Список используемых обозначений............................................................................................4

Введение.........................................................................................................................................5

Глава 1. Литературный обзор.................................................................................................12

1.1 Супрамолекулярные комплексы "гость-хозяин" с циклодекстринами........................12

1.2 Фотохимические реакции в супрамолекулярных комплексах с циклодекстринами ..15

1.3 Химическая поляризация электронов. Метод ЭПР с временным разрешением.........17

1.4 Химическая поляризация ядер..........................................................................................22

1.5 ВР ЭПР спектры возбужденных триплетных состояний ароматических кетонов......25

1.6 Нитроксильные радикалы, ковалентно связанные с циклодекстрином. Метод модуляции электронного спинового эха (Е8ЕЕМ)..................................................................30

1.7 Метод Двойного Электрон-Электронного Резонанса. Спироциклогексан-замещенные нитроксильные радикалы...........................................................................................................34

1.8 Постановка задачи.............................................................................................................37

Глава 2. Изучение фотохимических реакций ароматических кетонов в комплексе с ЦД39

2.1 Введение..............................................................................................................................39

2.2 Экспериментальная часть..................................................................................................42

2.3 Исследование образования комплекса кетонов с ЦД методами ЯМР и УФ спектроскопии..............................................................................................................................43

2.4 ХПЯ ДОБ в гомогенном растворе....................................................................................45

2.5 ХПЯ кетонов в водном растворе ЦД................................................................................47

2.6 ХПЭ ДОБ в гомогенном растворе....................................................................................54

2.7 ХПЭ при фотолизе ДОБ в ЦД...........................................................................................56

2.8 ХПЭ в реакции фотолиза кетонов в присутствие нитроксильных радикалов.............62

2.9 Заключение.........................................................................................................................64

Глава 3. Влияние циклодекстрина на электронное строение нижнего возбужденного триплетного состояния ароматических кетонов......................................................................66

3.1 Введение..............................................................................................................................66

3.2 Экспериментальная часть..................................................................................................67

3.3 Исследование спектров ЭПР триплетных молекул ДОБ и БФ методом ЭПР с временным разрешением............................................................................................................68

3.4 Исследование времен спиновой релаксации триплетных молекул ДОБ и БФ методом импульсного ЭПР........................................................................................................................73

3.5 Заключение.........................................................................................................................76

Глава 4. Изучение структуры комплексов нитроксильных радикалов, ковалентно связанных с циклодекстринами.................................................................................................78

4.1 Ведение...............................................................................................................................78

4.2 Экспериментальная часть..................................................................................................80

4.3 Исследование комплексов методом ESEEM...................................................................81

4.4 Исследование комплексов методом стационарного ЭПР..............................................85

4.5 Изучение свойств рН-чувствителыгого радикала, ковалентно связанного с ЦД........89

4.6 Обсуждение результатов...................................................................................................91

4.7 Заключение.........................................................................................................................95

Глава 5. 2,5-спироциклогексан-замещённые пирролиновые нитроксильные радикалы как спиновые метки для структурных исследований супрамолекулярных биополимеров методом импульсного ЭПР.........................................................................................................97

5.1 Введение..............................................................................................................................97

5.2 Экспериментальная часть..................................................................................................99

5.3 Измерения спиновой релаксации спиновой метки MDSSL в модельных условиях .100

5.4 Исследования свойств спиновых меток в спин-меченном глутатионе......................103

5.5 Измерение расстояний в модельном дуплексе РНК с использованием спин-меченного спироциклогексан-замещенного нитроксилыюго радикала..............................104

5.6 Заключение.......................................................................................................................106

Результаты и выводы................................................................................................................108

Благодарности............................................................................................................................109

Список литературы....................................................................................................................110

Список используемых обозначений

HP нитроксильный радикал

РП радикальная пара

ЦД циклодекстрин

TRIMEB трижды метилированный (3-ЦД

RP-ЦД метилированный случайным образом (3-циклодскстрин

NCD комплексы нитроксильных радикалов, ковалентно связанных с трижды метилированным P-CDs

ЭПР электронный парамагнитный резонанс

ЯМР ядерный магнитный резонанс

ХПЯ химическая поляризация ядер

ХПЭ химическая поляризация электронов

BP ЭПР ЭПР с временным разрешением

ESEEM electron Spin Echo Envelope Modulation, метод модуляции электронного спинового эха

ДЭЭР, pulsed electron double resonance, импульсный метод двойного

PELDOR, электрон-электронного резонанса, DEER

DEER

SDSL site-directed spin labeling, метод направленного введения спиновых меток

ДОБ деоксибензоин

ДБК дибензилкетон

БФ бензофенон

СТВ сверхтонкое взаимодействие

AM 1-адамантанметанол

АК аскорбиновая кислота

GSH глутатион

MDSSL (1-оксил-2,5-диспироциклогекси-3-метил)метилтиосульфонат

MTSSL (1-оксил-2,2,5,5-тетраметилпирролин-3-метил)метилтиосульфонат

Введение

Создание новых функциональных систем на базе супрамолекулярных комплексов является одной из перспективных задач в областях современной химии, биологии и нанотехнологий1"3. Именно к таким системам относятся комплексы цикл о декстрина (ЦД) с фотоактивными молекулами, предназначенные для проведения направленного синтеза и увеличения стабильности лекарств, и комплексы ЦД, ковалентно-связанные с нитроксильными радикалами (НР). В последних свойства ЦД образовывать комплексы с другими молекулами дополняются свойствами присоединённых радикалов, что в определенных случаях приводит к увеличению стабильности радикальных фрагментов. Детальное изучение этих систем необходимо для понимания и усовершенствования их функциональных свойств.

В ряде работ4"8 показано, что в некоторых случаях проведение фотолиза в ЦД приводит к значительному изменению состава продуктов реакций и может являться одним из способов проведения направленного синтеза. Необходимым условием развития данной области является детальное понимание механизмов влияния ЦЦ на процессы фотолиза. Ниже приведена общая схема фотолиза органических молекул (Диаграмма Яблонского).

Химическая ^ - ТЬёакция

У Интеркомбинационная конверсия

Химическая ** реакция

Ьц

|

Клеточные

продукты

Внеклеточные продукты

Диамагнитная молекула М

Радикальная пара (РП)

Диамагнитная молекула М после поглощения кванта света переходит в возбужденное синглетное состояние ]М*, из которого возможен переход в основное состояние с испусканием кванта света (люминисценция), либо безизлучательно и переход в возбужденное триплетное состояние 3М* в результате интеркомбинационной конверсии,

обусловленной спин-орбитальным взаимодействием. Формирование реакционно способного электронно-возбужденного состояния ('М* либо 3М*) относится к первичным фотохимическим процессам, для которых следующим этапом является химическая реакция этого состояния (диссоциация на два радикала, отрыв атома водорода, изомеризация и т.д).

В тех случаях, когда имеет место зависимость возбужденных состояний молекулы включения от полярности локального окружения, проведение фотолиза в ЦД может привести к изменению реакционного состояния и, как следствие, к изменению пути реакции. Влияние ЦД на синглетное и триплетное возбужденные состояния, детально исследовалось во многих работах методом время разрешенной люминесцентной

О 1 Ч

спектроскопии " . Было показано, что формирование комплекса с ЦД, как правило, приводит к изменению квантового выхода и спектра люминесценции, из-за изменения полярности окружения, ограничения подвижности молекул в полости ЦД и подавления механизмов тушения люминесценции. Одним из эффективных инструментов исследования электронной структуры триплетных состояний также является метод ЭПР с временным разрешением (ВР ЭПР). 14-16 Несмотря на то, что метод ВР ЭПР активно применяется для изучения триплетных состояний в замороженных гомогенных растворах, на данный момент исследование влияния ЦД на триплетное возбужденное состояние

1 7

методом ВР ЭПР проводилось лишь в одной работе .

Проведение фотолиза в ограниченном объеме полости ЦД приводит к изменению динамики интермедиатов, и, в результате, к изменению выхода и состава продуктов по сравнению с гомогенным раствором6. Например, влияние ЦД на механизм реакции диссоциации возбужденного состояния с образованием радикалов обусловлено тем, что в отличие от гомогенного раствора, где время жизни радикальных пар составляет доли наносекунд, в полости ЦД радикалы удерживаются значительное время - десятки и сотни наносекунд. В первую очередь, это приводит к существенному увеличению выхода клеточных продуктов. Учитывая так же, что расстояние между радикалами в РП в полости ЦД, как правило, сравнимо с размером радикалов, следует ожидать, что при проведении фотолиза в ЦД обменное взаимодействие в РП будет оказывать существенное влияние па магнитные и спиновые эффекты, такие так Химическая Поляризация Ядер (ХПЯ), Химическая Поляризация Электронов (ХПЭ). Изучению этого вопроса посвящена вторая глава диссертации, в которой представлены результаты исследования механизмов формирования спиновых эффектов в присутствии ЦД на примере фотолиза кетонов методами магнитного резонанса (ЯМР и ЭПР) и спиновой химии - ХПЯ и ХПЭ, которые

б

позволяют получить прямую информацию о реакциях, протекающих по радикальному механизму. Продолжением этой работы являются результаты, представленные в третьей главе диссертации, посвященной исследованию влияния ЦД на электронную структуру нижнего возбужденного триплетного состояния кетонов методами ВР и импульсного ЭПР.

Другим направлением развития супрамолекулярной химии с участием циклодекстринов является синтез ЦД, ковалентно-связанных с нитроксильными радикалами (ЫСОб)18"23. Такие системы являются перспективными реагентами для исследования супрамолекулярных комплексов ЦД с биомолекулами22 для использования в качестве новых поляризующих агентов с целью увеличения сигналов ЯМР протеинов24, а также в качестве эффективных и селективных тушителей флуоресценции25"26. В ряде работ показано, что комплексы ЦД со спиновыми ловушками могут быть использованы для увеличения времени жизни спиновых аддуктов, образующихся в результате реакции с

.-27-30 «20

такими короткоживущими радикалами как супероксидныи , тиильныи и др. Возможность применения нитроксильных радикалов, ковалентно связанных с ЦД, для решения различных задач в значительной степени зависит от структуры комплекса. Структура ЦД, длина и структура связывающего линкера определяют положение нитроксильного радикала относительно полости ЦД (НР находится внутри ЦД, снаружи полости ЦД, либо прикрывает полость ЦД). Было показано, что время жизни спиновых аддуктов, образующих комплекс, в котором радикал глубоко погружен в полость ЦД, значительно больше, чем время жизни свободного аддукта20'28'30. Отметим, однако, что системы с глубоко погруженным в полость ЦД нитроксильным радикалом неприменимы в случаях, когда требуется формирование комплекса ЦД с другой молекулой. Поэтому важной задачей является исследование равновесия в таких комплексах и определение параметров, которые в наибольшей степени оказывают влияние на это равновесие. Этому вопросу посвящена четвертая глава диссертации, в которой представлены результаты исследования влияния свойств радикального фрагмента и линкера на равновесие в новых комплексах нитроксильных радикалов, ковалентно связанных с ЦД. Для исследования комплексов НР с ЦД использовался стационарный и импульсный ЭПР в сочетании с методом ЯМР при добавлении гостевых молекул, которые являются основными методами исследования комплексов и позволяют получить информацию о динамике нитроксильного радикала и о его расположение относительно полости ЦД21'31"32.

Образование комплекса между нитроксильным радикалом и ЦД не всегда позволяет решить одну из основных проблем метода спиновых меток и зондов - быстрое

7

восстановление аскорбиновой кислотой, альбумином и другими ферментативными системами до диамагнитного состояния в живых организмах33. Для решения этой проблемы используются различные подходы: инкапсулирование радикалов в наноконтейперы (липосомы, циклодекстрины, кукурбитурилы, каликсарены и т.д.) либо синтез нитроксильных радикалов, в которых рядом с радикальным центром вводятся

л)

стерически-затрудненпые заместители . Недавно было показано, что замена метильных заместителей на спироциклические в пиперидиновых нитроксильных радикалах значительно улучшает их стабильность35, а также увеличивает время их электронной спиновой релаксации в диапазоне температур 4 90-130 К36'37. Известно, что для нитроксильных радикалов пирролинового и пирролидинового типа константа скорости восстановления биогенными восстановителями почти на порядок ниже чем для НР пиперидинового типа38. Поэтому очень перспективной задачей был бы синтез новых спирогексан-замещенных пирролиновых и пирролидиновых радикалов и исследование возможности их применения в качестве спиновых меток для изучения структуры и функций протеинов. Результаты, полученные в рамках работы по данному направлению представлены в пятой главе диссертации.

Целями диссертации являются исследование влияния Р-ЦД на механизмы формирования спиновых эффектов и механизмы фотолиза ароматических кетонов; изучение структуры супрамолекулярных комплексов ЦД со стабильными нитроксильными радикалами; исследование возможности применения новых спиновых меток на основе 2,5-спироциклогексан-замещенных нитроксильных радикалов пирролинового типа для структурных исследований биополимеров.

Таким образом, в настоящей работе были решены следующие задачи:

1. Экспериментальное исследование спиновых эффектов ХПЭ и ХПЯ в реакциях фотолиза трех различных кетонов: деоксибензоина (ДОБ), дибензилкетона (ДБК) и бензофенона (БФ) и определение роли ЦД в исследуемых фотохимических реакциях.

2. Исследование влияния Р-ЦД на структуру электронных уровней и релаксационные свойства нижних триплетных состояний ароматических кетонов (БФ, ДОБ) методами ВР ЭПР и импульсного ЭПР

3. Исследование типа структурного равновесия серии комплексов различных нитроксильных радикалов (в том числе рН чувствительного), ковалентно

связанных с ЦД, методами стационарного и импульсного ЭПР. Исследование влияния образования ковалентной связи с ТШМЕВ (трижды метилированный Р-ЦД) на функциональность и стабильность рН-чувствительного имидазолинового нитроксильного радикала.

4. Измерение скоростей электронной спиновой релаксации 2,5- спироциклогексан-замещенных нитроксильных радикалов в широком диапазоне температур методом импульсного ЭПР. Измерение расстояния в модельном РНК дуплексе с использованием 2,5-спироциклогексан-замещенной нитроксильной спиновой метки и сравнение полученных результатов со стандартной 2,2,5,5-тетраметил-замещенной нитроксильной меткой.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, четырех глав, в которых изложены полученные автором результаты, выводов, благодарностей и списка литературы.

В первой главе диссертации привод