Электрохимические биосенсоры для анализа эстераз в смеси тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи 00346 144Ь . жР^^ г.

ДУБАЧЕВА ГАЛИНА ВИТАЛЬЕВНА

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ЭСТЕРАЗ В СМЕСИ

02.00.15-катализ 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2008

003461446

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических паук Курочкин Илья Николаевич

Официальные оппоненты:

профессор, доктор химических наук Изумрудов Владимир Алексеевич профессор, доктор химических наук Ярополоз Александр Иванович

Ведущая организация:

Институт Физиологически Активных Веществ РАН

Защита диссертации состоится ^декабря 2008 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ^ноября 2008 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук

Сакодынская ИХ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эстеразы являются одними из ключевых ферментов крови человека, изменение активности этих ферментов в крови приводит к развитию целого ряда функциональных нарушений организма, в том числе вызванных контактом с фосфорорганическими соединениями и карбаматами, широко использующимися в сельском хозяйстве. Для клинических исследований и ранней диагностики таких нарушений необходимо знать соотношение уровней активности этих ферментов в крови. Таким образом, актуальной задачей является создание чувствительных и стабильных биоаналитических устройств, позволяющих быстро и надежно определять активности эстераз в крови человека.

Так как каждая из эстераз локализована преимущественно в одном компоненте крови, то обычно при проведении анализа исходный препарат цельной крови подвергают фракционированию, что делает общую схему анализа сложной и требует значительного времени при анализе большого количества образцов. Упрощение схемы определения активностей эстераз, а также существенное увеличение скорости проведения анализа может быть достигнуто, во-первых, за счет анализа активностей эстераз в препаратах цельной крови, что исключает необходимость фракционирования, а во-вторых, за счет использования методик, позволяющих одновременно определять активности этих ферментов в образце.

На сегодняшний день в литературе имеется единственный пример разработанного метода одновременного определения активностей эстераз в образце цельной крови, который основан на многоступенчатой схеме флуориметрического измерения скорости гидролиза различных субстратов под действием холинэстераз. Данный метод характеризуется высокой чувствительностью и высокой скоростью проведения анализа, однако тип субстратов, используемых в данном методе, ограничивается только тиохолинсодержащими соединениями, что накладывает ограничения на количество определяемых таким методом ферментов.

В то же время к настоящему моменту был создан целый ряд мультисенсорных устройств с оптической и электрохимической регистрацией аналитического отклика, позволяющих быстро и надежно решать задачи, связанные со скринингом ферментов, их потенциальных ингибиторов, а также в ряде случаев количественно определять содержание субстратов и ингибиторов в пробе. Таким образом, объединение нескольких сенсорных элементов в одном мультисенсоре открывает возможности создания нового подхода к одновременному определению активностей ферментов в смеси.

В настоящей работе разрабатывается подход к определению активностей эстераз в смеси, основанный на использовании электрохимического мультисенсора, состоящего из нескольких амперометрических сенсоров, детектирующих различные продукты ферментативных реакций (фенол, холин, этанол). Данный метод подразумевает одновременный анализ нескольких эстераз с использованием смеси фенол-, холин- и этанол-содержащих субстратов, что исключает многоступенчатость, а следовательно, позволяет

дополнительно упростить схему анализа, снизить его стоимость, сократить время его проведения, а также увеличить его информативность вследствие возможности регистрации динамики развития электрохимического отклика.

Поскольку потенциальное использование электрохимического мультисенсора связано с анализом образцов цельной крови, что подразумевает сильное разбавление исследуемых проб, то очень важным аспектом этой работы являются аналитические характеристики биоселсоров. Поэтому в данной работе исследуется возможность дополнительного улучшения чувствительности тирозиназного, холиноксидазного и алкогольоксидазного биосенсоров за счет использования нового класса полимеров - полиэлектролитов нелинейной архитектуры (ПЭНА). Данные полимерные объекты с узким молекулярно-массовьм распределением были синтезированы сравнительно недавно и отличаются от линейных аналогов в первую очередь большей объемной плотностью заряда и более жесткой топологической структурой. Именно благодаря этим свойствам ПЭНА обладают значительным потенциалом при создании биосепсоров по методу послойного нанесения полиэлектролитов (ПНП). Следует также отметить, что использующийся в данной работе для создания электрохимических сенсоров метод ПНП, представляющий собой простую и эффективную технику создания многослойных ультратонких органических пленок на твердой поверхности, допускает миниатюризацию аналитических систем, что в свою очередь делает возможным создание в будущем микроэлектромеханических мультисенсоров с малыми, менее 1 мкм, размерами чувствительных элементов.

Таким образом, создание высокочувствительных и стабильных биосенсоров на основе тирозиназы, холиноксидазы и алкогольоксидазы и их объединение в электрохимическую мультисенсорную систему с целью одновременного определения активностей ключевых эстераз крови человека относятся к важным фундаментальным и практическим задачам.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является исследование возможности применения электрохимических сенсорных систем для одновременного определения активностей эстераз в смеси, а также исследование возможности улучшения аналитических характеристик биосенсоров на основе тирозиназы, холиноксидазы и алкогольоксидазы за счет использования ПЭНА.

В настоящей работе последовательно решались следующие задачи:

1. Стабилизация высокочувствительных биосенсоров на основе тирозиназы и холиноксидазы, созданных по методу ПНП.

2. Разработка методики одновременного анализа эстераз в смеси на примере АХЭ и БХЭ с использованием двухэлектродного сенсора, состоящего из тирозиназного и холиноксидазного электродов, характеризующихся высокой чувствительностью и стабильностью.

3. Исследование возможности улучшения аналитических характеристик электрохимических биосенсоров за счет использования ПЭНА.

4. Создание алкогольоксидазного биосенсора по методу ПНП с целью расширения спектра электрохимических сенсоров для одновременного определения активностей нескольких эстераз в смеси.

Научная новизна работы. Впервые с использованием метода ПНП были получены высокочувствительные и стабильные биосенсоры на основе тирозиназы, холиноксидазы и алкогольоксидазы для количественного определения фенола, холина и этилового спирта, соответственно. Впервые показана возможность одновременного использования холинового и фенольного биосенсоров в качестве составных элементов электрохимического мультисенсора, позволяющего быстро и надежно производить одновременный анализ эстераз в смеси.

Впервые исследовано взаимодействие ПЭНА с ферментами в водных растворах (с тирозиназой и холиноксидазой) и на поверхности электродов (с тирозиназой, холиноксидазой и алкогольоксидазой). В результате проведенных исследований показана перспективность использования ПЭНА в качестве компонентов наноструктурированных покрытий электрохимических биосенсоров. Так, замена линейных полиэлектролитов на звездообразные катионные полиэлектролиты и молекулярные полиэлектролитные щетки позволила повысить чувствительность биосенсоров в несколько раз: в 1,7 раза в случае тирозиназных, в 4,7 раза в случае холиноксидазных и в 5,3 раза в случае алкогольоксидазных биосенсоров.

Практическая значимость работы. Разработаны электрохимические биосенсоры для определения фенола, холина и этилового спирта на основе метода ПНП, обладающие рекордными значениями чувствительности и стабильности по сравнению с их аналогами, созданными по данной методике. Предел обнаружения по фенолу, холину и этанолу составили соответственно 6-Ю-9 М, 1-Ю"7 M и 4-10"5 М, операционная стабильность характеризуется RSD для 10 измерений, равным соответственно 5 %, 1 % и 7 %.

На примере определения активностей АХЭ и БХЭ в данной работе продемонстрирована возможность успешного использования полученных электрохимических сенсорных систем для быстрого и надежного анализа эстераз крови в смеси. Пределы обнаружения АХЭ и БХЭ с помощью разработанного метода составляют соответственно 2,2-Ю'10 M и 2,1-Ю"10 М, что в десятки раз ниже содержания данных ферментов в цельной крови. При этом средняя ошибка определения холинэстераз, рассчитанная для 15 тестовых смесей, составляет 8 % в случае АХЭ и 4 % в случае БХЭ. Время измерения, как правило, не превышает 15 минут.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: П International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development" (Moscow, Russia, 2003), Eighth World Congress on Biosensors "Biosensors 2004" (Granada, Spain, 2004), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, Россия, 2004), IX

Всероссийский слет студентов, аспирантов и молодых ученых - лауреатов конкурса «Ползуновскис гранты» (Сочи, Россия, 2004), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, Россия, 2005), Fourth Moscow International Congress "BiotechnoJogy: state of the art and prospects of development" (Moscow, Russia, 2007), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, Россия, 2008), First Russian-Japanese Young Scientists Conferenc eon Nanomate rials and Nanotechnology (Moscow, Russia, 2008), NATO Advanced Research Workshop 983370 "Counteraction to Chemical and Biological Terrorism at a National and Local Level in the East Europe Countries" (Dnepropetrovsk, Ukraine, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей, 1 патент РФ и 11 тезисов докладов на конференциях, конгрессах и симпозиумах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 173 страницы печатного текста, 99 рисунков, 27 таблиц и 149 ссылок.

Принятые в тексте сокращения. RSD - относительное стандартное отклонение, АСМ - атомно-силовая микроскопия, АХЭ - ацетилхолинэстераза, БСА - бычий сывороточный альбумин, БХЭ - бутирилхолинэстераза, ВОПГ - высокоориентированный пиролитический графит, ГА - глутаровый альдегид, ПАЗ - полианионная звезда, ПАС -полианетолсульфонат натрия, ПАЩ - полианионная щетка, ПВС - поливиниловый спирт, ПДМДААС1 - полидиметилдиаллиаммонийхлорид, ПКЗ - поликатионная звезда, ПНП -послойное нанесение полиэлектролитов, ПЭАФ - полидиэтиламинофосфазен, ПЭНА -полиэлектролиты нелинейной архитектуры.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Стабилизация тирозиназного и холиноксидазного биосенсоров, созданных по методу ПНП.

Одной из ключевых проблем анализа эстераз крови с использованием электрохимических биосенсоров является стабильность используемых электродов, поэтому особое внимание в начале данной работы было уделено изучению операционной стабильности тирозиназного и холиноксидазного биосенсоров, ранее созданных в лаборатории Экобиокатализа по методу ПНП. Принцип работы этих биосенсоров представлен на рис. 1.

Было показано, что полученные электроды, покрытые пленкой (ПДМДААС1/Фермент), обладают хорошей чувствительностью: пределы обнаружения составили б'Ю"9 М по фенолу и 1-Ю"7 М по холину, однако заметно теряют свою активность при последовательных измерениях аналитов: после каждого измерения активность снижается на 3-4 %, при этом RSD за 10 измерений составляет 14-15 %. Поэтому первой задачей данной работы было улучшение значений этих параметров до приемлемых для

-4-

анализа эстераз величин (<1 % для уменьшения активности за каждое измерение и <10 % для ЙББ, рассчитанного по 10 измерениям).

Фенол

, 1/2 02 Чн2о

Пирокатехин

1/2 02

Графит g

-150 мВ-

vs. Ag/AgCl

^Д^Тирозиназа о-Хинон

Графит +480 мВ < vs. Ag/AgCI

Н20

а)

Mn(Vl) (Мп02)

Мп(НЛ1Г (Мп0/Мп203) б)

Холин

Бетаин

Рис. 1. Принцип работы а) тирозиназного и б) холиноксидазного биосенсоров.

На рис. 2а представлены первые 10 ответов тирозиназных электродов, покрытых пленкой (ПДМДААС1/Тирозиназа), на концентрацию фенола 1-Ю"5 М. Операционную стабильность биосенсоров характеризовали двумя параметрами: ИЗО и декрементом падения активности за каждое измерение (А), который вычисляли по тангенсу угла наклона зависимости активности электродов от числа измерений (Д = ^аЛщахИОО %).

40 35 30' .О 25

Я 20 м 15 10 5

0

0 2 4 б 8 10

Номер измерения б)

электродов, покрытых пленкой

2 4 6 8

Номер измерения а)

Рис. 2. Операционная стабильность электродов, покрытых пленкой а) (ПДМДААО/Тирозиназа) и б) (ПДМДААС1/Тирозиназа/ГА). Условия измерения: последовательные добавления l-lff5 М фенола, ячейка с перемешиванием, 0,05 М Na-фосфатпый буфер с 0,1 MNaCl, рН 7,0, комнатная температура.

Как видно из рис. 2а и данных, приведенных в табл. 1, полученные биосенсоры характеризуются значительным падением и разбросом активности при последовательных измерениях фенола. Были рассмотрены две причины неудовлетворительной операционной стабильности электродов - неустойчивость пленки (ПДМДААО/Тярозиназа) на поверхности графита и неустойчивость верхнего слоя тирозиназы.

В качестве способа стабилизации пленки (ПДМДААС1/Тирозиназа) было рассмотрено формирование подслоя с помощью полидиэтиламинофосфазена (ПЭАФ), который нерастворим при рН>4 и по данным атомно-силовой микроскопии (АСМ) формирует на поверхности графита плотную пленку, устойчивую при нейтральных значениях рН, степень

заполнения которой не изменяется при адсорбции на нее других полиэлектролитов. ПЭАФ положительно заряжен при рН<3, поэтому адсорбция фермента проводилась после нанесения дополнительных слоев полианиона и поликатиона. Как видно из данных табл. 1, желаемого эффекта по улучшению операционной стабильности достичь не удалось. На этом основании было сделано предположение, что неудовлетворительная операционная стабильность биосснсоров связана с неустойчивостью верхнего слоя фермента.

Табл. 1. Сравнение активности и операционной стабильности тирозиназных электродов, стабилизированных за счет использования ПЭАФ и ГА.

Конструкция Активность, иА/с А, % RSD, %

(ПДМДААС1/Тирозиназа) 33 ±5 -3,1 ± 0,9 15

(ПЭАФ/ПАС/ПДМДААС1/Тирозиназа) 13±2 -3± 1 20

(ПДМДААС1/Тирозиназа/ГА) 36 ±2 -0,9 ± 0,4 5

С целью стабилизации верхнего слоя тирозиназы было изучено влияние обработки глутаровым альдегидом (ГА) на операционную стабильность биосенсоров. Целесообразность использования ГА в случае тирозиназных электродов была обусловлена тем, что методами АСМ было показано формирование плотной пленки при адсорбции тирозиназы на ПДМДААС1 - степень заполнения поверхности графита увеличилась с 29 ± 7 % до 98,3 ± 0,8 % при нанесении тирозиназы на пленку поликатиона. Типичные первые 10 ответов электродов, покрытых пленкой (ПДМДААС1/Тирозиназа/ГА) представлены на рис. 26. Из рис. 26 и данных табл. 1 видно, что операционная стабильность тирозиназных сенсоров по обоим параметрам улучшилась в 3 раза, при этом сохранилась прежняя чувствительность электродов.

Далее была исследована операционная стабильность холиноксидазных биосенсоров.

3501

300

250

< 200 S

i-T 150 100 500

450 400 350 300 i> 250 м 200 150 100 50 О

2 3 4 5

Номер измерения

а)

1 2 3 4 5

Номер измерения б)

Рис. 3. Операционная стабильность электродов, покрытых пленкой а) (ПДМДААСиХолиноксидаза) и б) (ПДМДАЛС1/Холиноксидаза/ГА). Условия измерения: последовательные добавления 1-104 М холина, ячейка с перемешиванием, 0,05 М HEP ES с 0,03 М KCl, pH 7,5, комнатная температура.

Первые несколько ответов холиноксидазных электродов, покрытых пленкой

(ПДМДААО/Холиноксидаза), на 1 • 10"4 М холина представлены на рис. 3 а. Как видно из рис.

За и данных табл. 2, использование полученных электродов характеризуется падением активности и заметным разбросом данных.

Как и в случае с тирозиназными электродами, были рассмотрены две причины неудовлетворительной операционной стабильности холиноксидазных сенсоров: неустойчивость всей пленки (ПДМДААС1/Холиноксидаза) и неустойчивость верхнего слоя фермента. Как видно из данных табл. 2, формирование устойчивого подслоя с помощью ПЭАФ и ПВС не привело к стабилизации биосенсоров. В то же время использование ГА оказалась эффективным и в случае холиноксидазных сенсоров (рис. 36).

Табл. 2. Сравнение активности и операционной стабичьности холиноксидазных электродов, стабилизированных за счет формирования подслоя с помощью ПЭАФ и ПВС, а также за счет ковалентной прошивки ГА.

J Конструкция Активность, нА Д, % ] RSD, %

(ПДМДААО/Холиноксидаза) 349 ± 45 -2,5 ± 0,4 5

(ПЭАФ/ПАС/ПДМДААС1/Холиноксидаза) 349 ± 95 -6 ±2 17

(ПВС/ПДМДААС1/Холиноксидаза) 33 ±6 -4 ± 2 14

(ПДМДААС1/Холинокспдаза/ГА) 360 ± 28 -0,1 ± 0,1 1

Таким образом, операционная стабильность тирозиназного и холиноксидазного биосенсоров была улучшена в несколько раз, при этом чувствительности сенсоров и пределы обнаружения по фенолу и холину остались прежними. Биосенсоры с такими характеристиками могут быть использованы для количественного анализа эстераз крови.

2. Разработка методики одновременного анализа эстераз в смеси на примере АХЭ и БХЭ с использованием двухэлектродного сенсора, состоящего из тирозиназного и холиноксидазного электродов.

Поскольку определение эстеразной активности сводится к измерению скорости накопления холина и фенола в реакционной смеси, первой задачей после стабилизации биосенсоров являлась оптимизация методики одновременного определения холина и фенола в пробе. Было установлено, что присутствие холина не влияет на амперометрическую детекцию фенола при ранее выбранном рабочем потенциале -150 мВ. Однако присутствие фенола в пробе затрудняет амперометрическую детекцию холина вследствие электроокисления фенола.

Для решения данной проблемы были сняты циклические вольтамперограммы для холиноксидазного электрода в отсутствии и в присутствии стандартной концентрации фенола (рис. 4а). Из полученных вольтамперограмм следует, что при потенциале ниже +350 мВ влияние электроокисления фенола сводится к минимуму. Далее было проведено сравнение величин аналитических откликов на стандартные концентрации холина и фенола при различных потенциалах в стационарном режиме (рис. 46). Как видно из полученного графика, при потенциале +350 мВ исключается влияние фенола, и нет существенной потери в величине аналитического отклика на холин по сравнению с более высокими потенциалами.

Именно этот потенциал был выбран в качестве рабочего для проведения всех дальнейших экспериментов.

201 15 10

3 5

>-Г о

-5 -10

Без фенола

С фенолом (1*10 М) Jrf^SS»""

О 200

Е, мВ

а;

400

600

350-1 300

250 < 200

„ 150

1-1 100 50 0

-50

01вешнахалин(1*10 М) { '

0гве1ынафеюл(1*10" М)

200 300

Е,мВ

400 500

б)

Рис. 4. а) Циклические вольтамперограммы для холиноксидазного электрода, скорость развертки 40 мВ/с. б) Зависимости величии аналитических откликов на холин и фенол холиноксидазного электрода при различных стационарных потенциалах. Условия: концентрация фенола в ячейке l-10's М, концентрация холила в ячейке 1-10~4 М, 0,05 М HEPES с 0, 03 М KCl (pH = 7,5), комнатная температура.

В качестве субстратов эстераз крови были выбраны ацетилхолин, бутирилхолин, фенилацетат и фенилвалерат. Гидролиз этих субстратов под действием холинэстераз приводит к высвобождению холина и фенола, которые могут быть одновременно определены электрохимически. Для успешного использования выбранных субстратов необходимо было предварительно установить влияние этих соединений на определение холина и фенола. Для этого были сняты калибровочные зависимости для тирозиназных и холиноксидазных электродов в отсутствии и в присутствии субстратов (рис. 5а и 56).

35-, 30 25

О

> 20

без доп. реагентов C<¡ehc<ITOM(0,01MM) Й 15

сфенилвалерагомДОмМ) ей сфенипацетагом(0,5мМ) 10 са1ешлх<шином(1,5мМ) 5 с бупфилхопином (1 мМ)

без доп. реагентов схотином(ОД мЭД с феншюалерагом (0,2 мМ) с феншицегатом (0,5 мМ) с ацетилхолином (1,5 мМ) с бугирилхолином (1 мМ)

20 40 60

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Концентрация фенола, мкМ б)

100 120

Концентрация хсшина, мкМ а)

Рис. 5. а) Калибровочные зависимости для холиноксидазного электрода. Условия: концентрация холина в ячейке 1-Ш4 М, 0,05 М НЕР ES с О,OS МКС1 (рН = 7,5), комнатная температура. Калибровочные зависимости для тирозиназного электрода. Условия: концентрация фенола в ячейке 110'5 М, буфер 0,05МШ-фосфатный с O.lMNaCl (рН = 7,0), комнатная температура.

Из приведенных зависимостей следует, что влияние выбранных субстратов на амперометрическую детекцию холина и фенола отсутствует.

Анализ холинэстераз в смеси с использованием электрохимического двухэлектродного сенсора основан на принципе субстратной специфичности ферментов. Для

начального момента времени, величина скорости ферментативного гидролиза субстратов в

присутствии холинэстераз определяется согласно уравнению Михаэлиса-Ментен: 1^50 „

Уо = -7~,-- И 0

¡л

В том случае, когда реакция протекает под действием двух ферментов, выражение для начальной скорости будет представлять собой сумму начальных скоростей по каждому из

ферментов: 2 _ *j¡" ^St¡ p(i)

va 12 - JеОьФ^+я

+

■So

№

+Í0

■ЕР

Множители, стоящие перед концентрациями ферментов, назовем коэффициентами чувствительности ферментов по определенному субстрату. Тогда суммарная скорость гидролиза данного субстрата в начальный момент времени примет следующий вид:

Таким образом, экспериментально определив коэффициенты чувствительности ферментов по выбранным субстратам и измерив начальные скорости гидролиза пары субстратов под действием АХЭ и БХЭ, можно вычислить содержание каждой холинэстеразы в пробе:

{

Ri = XI [АХЭ] + yi[EX3] Е2=х2[АХЭ] + у2[БХЭ]

c=í> [АХЭ] = ■

Rl У1

R2 У2

XI yi XJ У2

[БХЭ] =

XI Ri Х2 Е-2

XI У1 Х2 У2

Типичный электрохимический ответ, полученный с помощью двухэлектродного сенсора, представлен на рис. б.

1400-,

: добавлещ смесь ферменгов>

Гидролиз ацетилхолина (ответ

1200 1000 800 600 400 200 0 -200 ^00 -600

холиноксидазного электрода)

добавлены субстраты

Гидролиз фенилацетата (ответ тирозиназного электрода)

100

200 300 400 500 600 t,C

Рис. 6. Типичный вид ответа двухэлектродного сенсора. Условия: двухэлектродная ячейка с перемешиванием, концентрации в ячейке: АХЭ - 4,4-10~т М, БХЭ - 8,9-Iff М, ацетилхолина - 1,5 мМ, фенилацетата - 0,5 мМ, 0,05 М HEPES с 0,03 М КС1 (рН = 7,5), комнатная температура.

Ответ состоит из двух кривых. Верхняя кривая соответствует отклику холиноксидазного биосенсора и отображает процесс гидролиза холинового эфира. Нижняя кривая соответствует отклику тирозиназного биосенсора и отображает процесс гидролиза фенилового эфира. На обеих кривых можно выделить участки, соответствующие спонтанному гидролизу субстрата и гидролизу субстрата в присутствии холинэстераз. За

начальную скорость ферментативного гидролиза принималась разность между тангенсами углов наклона начального участка кривой ферментативного и спонтанного гидролиза.

Для выбора оптимальных концентраций субстратов, которые в дальнейшем могут быть использованы как для определения коэффициентов чувствительности ферментов, так и для их дискриминационного анализа, необходимо было оценить взаимодействие ферментов с этими субстратами. Поэтому для каждой пары фермент-субстрат были установлены кинетические параметры. Для этого были измерены скорости реакции ферментативного гидролиза при различных начальных концентрациях субстратов для АХЭ и БХЭ. Кинетические параметры определялись с помощью линеаризации полученных данных в координатах Лайнуивера-Берка. Рассчитанные кинетические параметры для холинэстераз приведены в табл. 3.

Табл. 3. Кинетические параметры АХЭ и БХЭ по выбранным субстратам.

Фермент АХЭ БХЭ

Субстрат Кмзфф, мМ 1г эфф „-' лса| , Кмзфф, мМ 1г эфф -1 н-сас , ^

Ацетилхолин 0,13 ±0,03 25000 ±600 1,3 ± 0,3 2160 ±190

Бутирилхолин Нет гидролиза - 0,20 ±0,06 8450 ±940

Фенилацетат 0,5 ± 0,1 67 ±20 0,21 ±0,06 93 ± 10

Фенилвалерат Нет гидролиза - 0,12 ±0,04 179 ±28

Таким образом, для определения коэффициентов чувствительности эстераз, а также для их анализа в смеси, использовались следующие концентрации субстратов: для ацетилхолина - 1,5 мМ, для бутирилхолина - 1,0 мМ, для фенилацетата - 0,5 мМ, для фенилвалерата - 0,2 мМ. Среди рассматриваемых субстратов можно выделить три пары, пригодные для проведения смесей холинэстераз с использованием двухэлектродного сенсора, производящего одновременную детекцию фенола и холина, а именно: ацетилхолин + фенилвалерат, ацетилхолин + фенилацетат, бутирилхолин + фенилацетат.

tga=k по АХ

о

Я ьЗ

го ацгшлхолину

= к поБХ

с^Ю'.М

Рис. 7. Калибровочные зависимости для пары ацетилхолин + фенилацетат по БХЭ. Условия: двухэлектродная ячейка с перемешиванием, концентрация ацетилхолина 1,5 мМ в ячейке, концентрация фенилацетата 0,5 мМв ячейке, 0,05 М НЕРЕБ с 0,03 МКС! (рН= 7,5), комнатная температура.

Для каждой пары субстратов были определены коэффициенты чувствительности холинэстераз, а также линейные диапазоны определяемых концентраций ферментов. Для этого были получены зависимости скорости ферментативного гидролиза субстратов от концентрации фермента в ячейке. Пример такой зависимости приведен на рис. 7. За коэффициент чувствительности принимали тангенс угла наклона полученных зависимостей.

Вычисленные коэффициенты, а также линейные диапазоны суммированы в табл. 4. Проанализировав таблицу, можно сделать вывод, что максимальный линейный диапазон определяемых концентраций ферментов при одновременном анализе АХЭ и БХЭ достигается при использовании пары ацетилхолин + фенилвалерат. Для этой же пары субстратов характерен самый низкий предел обнаружения по БХЭ, что объясняется лучшей чувствительностью БХЭ к фенилвалерату по сравнению с фенилацетатом.

Табл. 4. Коэффициенты чувствительности и линейные диапазоны по АХЭ и БХЭ для каждой пары субстратов.

Фермент АХЭ БХЭ

—Характеристика Пара субстратоВ-^-^^ Кч, А/Мс Лин. диап.'Ю10, М Кч, А/Мс Лин. диап.'Ю10, М

Ацетилхолин 1,1 ±0,1 2,2 - 32,8 1,76 ±0,03 7,7 - 44,4

Фенилацетат 0,16 ±0,02 0,19 ±0,02

Ацетилхолин 0,94 ± 0,01 2,2 - 28,5 1,6 ±0,1 2,1-53,2

Фенилвалерат 0 0,63 ±0,10

Бутирилхолин 0 2,2 - 26,3 6,45 ± 0,07 7,7-35,5

Фенилацетат 0,12 ±0,01 0,17 ±0,01

В качестве тестовых были приготовлены и измерены 15 смесей, концентрации холинэстераз в которых подобраны с учетом ранее определенных линейных диапазонов. На каждую пару субстратов приходилось по 5 смесей. Результаты проведенного анализа представлены в табл. 5. Как видно из табл. 5, ошибка при определении концентраций холинэстераз в смеси не превышает 17 %, что говорит о достаточно высокой точности предложенного метода. Минимальная ошибка при определении концентраций холинэстераз была достигнута при использовании ацетилхолина и фенилвалерата в качестве субстратов. В табл. 6 и табл. 7 приведены максимальные и средние ошибки определения активностей холинэстераз по трем парам субстратов и с использованием наиболее удачной пары.

Можно заключить, что средняя ошибка определения холинэстераз предложенным методом по 15 тестовым смесям не превышает 8 %. Таким образом, использование электрохимического двухэлектродного сенсора позволяет с высокой точностью одновременно определять холинэстеразы в смеси вплоть до концентрации 2 Ю~10 М, что в десятки раз ниже средней концентрации этих ферментов в крови человека. Предлагаемый метод не требует значительных временных затрат на пробоподготовку, а само измерение, как правило, занимает не более 15 минут.

Табл. 5. Результаты дискриминаг^онного анализа холинэстеразпых смесей.

Созданные концентрации Определенные концентрации Ошибка

[БХЭ] 101и, М | [АХЭ] 101и, М [БХЭ]'10Ш, М | [АХЭ] '10ш, М [БХЭ], % | [АХЭ1, %

субстраты: ацетилхолин + фенилацетат

26,6 13,1 25,8 15,0 3 15

35,5 13,1 33,4 15,0 6 15

17,8 6,6 16,8 7,4 6 12

26,6 11,0 28,0 9,1 5 17

35,5 4,4 35,9 4,2 1 5

субстраты: ацетилхолин + фенилвалерат

17,8 6,6 18,2 7,1 2 7

17,8 15,3 19,5 15,1 10 1

8,9 11,0 8,8 12,0 1 9

5,3 4,4 5,2 4,5 2 2

17,8 3,3 17,9 3,1 1 б

субстраты: бутирилхолин + фенилацетат

3,2 6,6 3,4 6,3 6 5

17,8 11,0 17,4 12,7 2 16

8,9 13,1 9,3 12,3 4 6

23,3 11,0 26,4 11,2 1 2

17,8 6,6 18,2 7,1 2 8

Табл. 6. Средние и максимальные ошибки определения АХЭ и БХЭ при использовании трех пар субстратов.

Фермент Максимальная ошибка определения по 15 смесям, % Средняя ошибка определения по 15 смесям, %

АХЭ 17 8

БХЭ 13 4

Табл. 7. Средние и максимальные ошибки определения АХЭ и БХЭ при использовании пары аг/етилхолин + фенилвалерат.

Фермент Максимальная ошибка определения по 5 смесям, % Средняя ошибка определения по 5 смесям, %

АХЭ 9 5

БХЭ 10 3

Итак, в настоящей работе продемонстрирована возможность использования электрохимических сенсорных систем для одновременного анализа активностей эстераз в смеси. В связи с тем, что разработка данного метода направлена на определение активностей ферментов в цельной крови, ключевыми являются два вопроса: чувствительность электрохимических биосенсоров, которая определяет степень разбавления цельной крови, и количество сенсорных элементов, от которого зависит количество одновременно анализируемых эстераз. Поэтому следующей задачей данной работы является исследование возможности улучшения аналитических характеристик электрохимических биосенсоров за счет использования ПЭНА.

3. Улучшение аналитических характеристик электрохимических биосенсоров за счет использования ПЭНА.

ПЭНА делят на полимерные звезды и полимерные щетки. И те, и другие состоят из полимерных цепей (лучей), связанных с остовом (ядром) концевыми группами. Основным отличием полимерных звезд от полимерных щеток является то, что размер остова в случае звезд очень мал по сравнению с длиной лучей. Совсем недавно стало возможным получать ПЭНА с узким молекулярно-массовым распределением, т.е. суперразветвленные звезды и щетки с одинаковым количеством лучей и одинаковой степенью их полимеризации. Уже сейчас достаточно очевидно, что данные полимерные объекты отличаются от линейных аналогов в первую очередь большей объемной плотностью заряда и более жесткой топологической структурой, благодаря чему они обладают значительным потенциалом при их использовании для создания биосенсоров по методу ПНП. Именно поэтому представляется целесообразным исследование возможности применения ПЭНА в качестве компонентов наноструктурированных покрытий электрохимических биосенсоров.

Для изготовления тирозиназных и холиноксидазных электродов использовались следующие нелинейные полиэлектролиты: поликатионные звезды (ПКЗ) (лучи -полидиметиламиноэтилметакрилат, число лучей = 17, 6, степень полимеризации каждого луча = 180, 170 (Mw/M„<1.3), кватернизация метилйодидом; остов - сесквиоксан) и полианионные звезды (ПАЗ) (лучи - полиакриловая кислота, число лучей = 21, 5, степень полимеризации каждого луча = 100, 90 (M,v/Mn<1.2); остов - р-циклодекстрин, a-D-глюкоза) и полианионная щетка (ПАЩ) (молекулярная щетка: основная цепь - поли-2-гидрокси-этилметакрилат, степень полимеризации = 1500, боковые цепи - полиакриловая кислота, степень полимеризации = 50). В качестве линейных полиэлектролитов использовались ПДМДААС1 и полианетолсульфонат натрия (ПАС). Надо отметить, что ПДМДААС1 относится к группе линейных поликатионов, которые обеспечивают наиболее эффективную иммобилизацию тирозиназы и холшюксидазы по методу ПНП, поэтому ПДМДААС1 является хорошим контролем для изучения ПЭНА как составляющих электрохимических сенсоров, созданных по методу ПНП.

В табл. 8 приведены результаты электрохимического исследования различных конструкций холиноксидазных электродов, изготовленных с использованием ПЭНА. Из табл. 8 видно, что при использовании полимерных звезд и полимерных щеток происходит увеличение активности электродов по сравнению с контрольной системой с линейным поликатионом ПДМДААС1 (№1), за исключением конструкции, в которой была проведена попытка зафиксировать холиноксидазу между слоями противоположно заряженных полимерных звезд (№7). Скорее всего, в данном случае при нанесении последнего слоя происходит вытеснение холиноксидазы из слоя ПКЗ в результате образования комплекса между более сильными полиэлектролитами. Данный эффект был также зафиксирован и с линейными полиэлектролитами, такими как полиаллиламин и ПАС.

Из данных таблицы очевидно, что наличие подслоя перед нанесением последних двух слоев - ПКЗ и фермента - приводит к значительному увеличению активности сенсоров (№3, №4, №5, №6, №8, №10, №11), при этом наибольшее увеличение активности достигается в том случае, когда подслой формируют полимерные звезды и щетки (№3, №8, №11). По-видимому, это связано со способностью молекул фермента адсорбироваться не только на поверхности предварительно сформированного слоя, но и включаться внутрь полиэлектролитной пленки. Надо отметить, что такого положительного влияния подслоя на активность холиноксидазных сенсоров не наблюдалось для линейных полимеров, в частности, для ПДМДААС1 и ПАС.

Табл. 8. Результаты изучения активности холиноксидазных электродов различных конструкций.

Число лучей № Конструкция пленки, полученной методом ПНП 1/1(ПДМДААС1/ Холиноксидаза)

ПКЗ (17 лучей) 1 (ПДМДААС1/Холиноксидаза) 1,0

ПАЗ (21 луч) 2 (ПКЗ/Холиноксидаза) 1,5 j

3 (ПКЗ/ПАЗ/ПКЗ/Холииоксидаза) 4,6

4 (ПДМДААСШАЗ/ПКЗ/Холиноксидаза) 1,9

* 5 (ПДМДААС1/ПАЗ/ПДМДААС1/Холиноксидаза) 3,0

6 (ГЩМДААСШАС/ПКЗ/Холиноксидаза) 2,2

7 (ПКЗ/Холиноксидаза/ПАЗ) 0,2

8 (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Холиноксидаза) 3,5

ПКЗ (6 лучей) 9 (ПКЗ/Холиноксидаза) 1,3

ПАЗ (5 лучей) 10 (ПКЗ/ПАЗ/ПКЗ/Холшюксидаза) 1,9.

11 (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Холиноксидаза) 4,7

Также из таблицы можно видеть, что конструкции с большим количеством лучей характеризуются большей активностью, за исключением системы №11, где использование ПАЩ вместо ПАЗ позволяет получить более активную конструкцию, чем в случае конструкции №10, а также №3 и №8. Возможно, это объясняется тем, что при малом компенсировании зарядов между ПКЗ и ПАЩ (ввиду малой длины боковых полиэлектролитных цепей ПАЩ) количество адсорбировавшейся ПКЗ возрастает с уменьшением числа лучей ПКЗ вследствие меньшего электростатического отталкивания одноименно заряженных ПКЗ друг от друга.

Таким образом, для холиноксидазных электродов было достигнуто увеличение активности в 4,7 раза.

В табл. 9 представлены результаты электрохимического исследования различных конструкций тирозиназного сенсора. Контрольной системой также являлась система с ПДМДААС1. Учитывая результаты, полученные для холиноксидазного биосенсора, в качестве объектов исследований были выбраны простая конструкция с ПКЗ, в случае

которой наблюдается наименьшее увеличение активности холиноксидазных сенсоров, и более сложные конструкции со звездами и щетками, в случае которых было получено наибольшее увеличение активности холиноксидазных сенсоров. Также в случае тирозиназных электродов интересно было исследовать конструкцию, в которой первой адсорбировалась ПАЗ, поскольку данные АСМ показали наличие более плотной пленки на графите в случае ПАЗ по сравнению с ПКЗ. В случае тирозиназных сенсоров данные АСМ могут быть использованы, поскольку адсорбция тирозиназы по методу ПНП ведется непосредственно на графит, а в случае холиноксидазы поверхность графитовых электродов предварительно покрывается слоем диоксида марганца, который обладает большой шероховатостью и делает невозможным изучение холиноксидазных электродов методами АСМ.

Табл. 9. Результаты изучения активности тирозиназных электродов различных конструкций.

Конструкция пленки, полученной методом ПНП '^(ПДМДААО/Гирозиназа)

(ПДМДААИ/Тирозиназа) 1,0

(ПКЗ/Тпрозииаза) 1,7

(ПКЗ/ПАЗ/ПКЗ/Тирозиназа) 0,9

(ПАЗ/ПКЗ/Тирозиназа) 0,4

Из таблицы видно, что увеличение активности происходит только для простой конструкции с ПКЗ. Также не наблюдается эффекта увеличения активности электрода при формировании подслоя, показанного для холиноксидазных биосенсоров. Сравнение топографии поверхности пленок (ПДМДААСШирозиназа) и (ПКЗ/Тирозиназа) методами АСМ показало, что эффективные топографические характеристики, рассчитанные для пленки ПКЗ (эффективная степень заполнения поверхности ВОПГ - 35 %, эффективный суммарный объем объектов — 3-106 нм3) оказались схожими с характеристиками для пленки ПДМДААС1 (эффективная степень заполнения поверхности ВОПГ - 29 %, эффективный суммарный объем объектов - 5-Ю6 нм3). Расчет топографических характеристик для пленки (ПКЗ/Тирозиназа) является затруднительным в связи со сложностью определения параметров фона, поскольку при адсорбции фермента на слой ПКЗ образуется абсолютно плотная пленка, тогда как после адсорбции тирозиназы на слой ПДМДААС1 образуется пленка, эффективная степень заполнения поверхности ВОПГ которой < 100 %. Скорее всего, причиной повышения активности для конструкции с ПКЗ является большее количество адсорбировавшейся тирозиназы.

Уменьшение активности электродов при наличии в конструкции подслоя, в отличие от холиноксидазных электродов, для тирозиназных сенсоров по-видимому происходит по нескольким причинам. Первая причина состоит в том, что используемые оксидазы различны по структуре и свойствам, выделены из различных объектов. Вторая причина - гидрофильно-

липофильный баланс поликатионов. Так, ранее был показан эффект уменьшения активности тирозиназы и увеличения активности холиноксидазы в составе соответствующих биосенсоров при возрастании гадрофобности линейного поликатиона. В-третьих, необходимо учесть, что холиноксидазные пленки формируются на поверхности диоксида марганца, тогда как тирозиназные - на графите.

Итак, в ходе данной работы была показана принципиальная возможность использования электрохимического мультисенсора для одновременного определения активностей эстераз в смеси, кроме того, чувствительность тирозиназного и холиноксидазного электродов удалось улучшить в 1,7 раза и в 4,7 раза, соответственно, за счет использования ПЭНА. Другой важной задачей является увеличение спектра сенсоров, пригодных для анализа эстераз крови в смеси. Поэтому следующим этапом данной работы было исследование возможности создания чувствительного и стабильного алкогольоксидазного биосенсора по методу ПНП, что предусматривает его включение в состав электрохимического мультисенсора.

4. Создание алкогольоксидазного биосенсора по методу ПНП.

Принцип определения этилового спирта с помощью алкогольоксидазного сенсора представлен на рис. 8а. Как и в случае холиноксидазного сенсора, образующийся в результате ферментативной реакции пероксид водорода детектируется с помощью предварительно иммобилизованного на поверхности графита диоксида марганца.

В работе была исследована возможность включения в состав наноструктурированных пленок полиэлектролитов алкогольоксидазы - фермента, состоящего из 8 субъединиц. Необходимо отметить, что создание биосенсоров по методу ПНП, чувствительным элементом в которых является ферменты, обладающие субъединичной структурой, все еще остается большой проблемой. Так, в литературе не описаны алкогольоксидазные биосенсоры, созданные на основе тонких пленок полиэлектролитов. В качестве поликатиона для проведения первого эксперимента нами был использован ПДМДААС1. Алкогольоксидаза при нейтральных рН несет суммарный отрицательный заряд. Концентрация алкогольоксидазы из Натепи!а ро1утогрИа в рабочем растворе составляла 1-Ю4 М. На основе литературных данных в качестве рабочего буфера был взят 0,05 М Ка-фосфатный буфер с 0,1 М N301, рН 7,5.

Типичный ответ электродов, покрытых пленкой (ПДМДААС1/Алкогольоксидаза) на 5-10"2 М этанола представлен на рис. 86. Полученная зависимость силы тока от времени характеризует два процесса, происходящих при добавлении этанола в электрохимическую ячейку: в первые несколько секунд происходит неспецифическая реакция, характеризующаяся увеличением силы тока на величину, независящую от концентрации этанола, после чего следует ферментативный процесс, который характеризуется зависящим от концентрации добавленного в ячейку этанола наклоном кривой.

Таким образом, была показана возможность использования метода послойного нанесения полиэлектролитов для создания алкогольоксидазных сенсоров. Однако полученные электроды нестабильны: И^Ю за 10 измерений - 19 %, а также малоактивны: линейный диапазон измеряемых концентраций этанола и предел обнаружения по этанолу составили соответственно 0,01-0,05 М и 1,2 мМ. Аналитические характеристики полученных сенсоров улучшали за счет оптимизации как методики изготовления сенсоров, так и процесса из.мерсния этилового спирта.

С2Н,-ОН

Мп(У1) (Мп02)

\

Алкогольоксидаза

НгОX

Неспецифическая реакция

Графит +350 мВЧ-vs.Ag/AgCl

' Мп(ШШ) (Мп0/Мп203)

а)

СНзСНО

500-,

400-

300-

_г

200-

100-

0-

Ферментативный процесс

2000

3000

Ьс

Рис. 8. а) Принцип работы алкоголъоксадазного биосенсора, б) Типичный ответ электрода, покрытого пленкой (ПДМДААС1/Алкогольоксидаза), на 5-10'2 Мэтанола. Условия измерения: алкогольоксидаза из Напзепи1а ро1утогрЪа (1-10'4 М), ячейка с перемешиванием, 0,05 ММа-фосфатный буфер с 0,1 МЫаС1, рН 7,5, комнатная температура.

В оптимизацию методики изготовления алкогольоксидазных сенсоров входило изучение влияния используемой концентрации алкогольоксидазы из двух источников СНатепи1а ро1утогрка и Р1сЫа раНопев) на активность сенсоров. Было показано, что алкогольоксидаза из РгсЫа раэюг^ея обладает большей удельной активностью, однако она нестабильна при хранении, и уже на 6-7 день после растворения фермента в рабочем буфере его активность падает на 90-100 %. В тоже время алкогольоксидаза из Натепи1а ро1утогрЪа не теряет своей активности в течение нескольких недель хранения рабочего раствора фермента. В связи с этим, для дальнейшей работы использовалась алкогольоксидаза, выделенная из Натепи1аро1утогрЬа, в оптимальной концентрации

Также была проведена оптимизация состава сенсоров по типу поликатиона и числу слоев (Поликатион/Алкогольоксидаза). Было показано, что в случае линейного поликатиона активность электродов, покрытых (ПДМДААС1/Алкогольоксидаза)2 в 3,5 раза больше активности электродов, покрытых пленкой (ПДМДААС1/Алкогольоксидаза)] (табл. 10). При этом дальнейшее увеличение слоев не приводит к росту активности аткогольоксидазных биосенсоров, что может быть связано как с тем, что после нанесения двух слоев дополнительной адсорбции фермента не происходит, так и с тем, что при увеличении толщины полиэлектролитной пленки происходят диффузионные затруднения для проникновения пероксида водорода к диоксиду марганца.

Дополнительной возможностью увеличения активности алкогольоксидазных сенсоров, как это было показано для тирозиназных и холиноксидазных электродов, является использование ПЭНА. Были рассмотрены две конструкции сенсоров с использованием полимерных звезд и щеток. Выбор данных конструкций обусловлен максимальной активностью холиноксидазных электродов (строение которых схоже со строением алкогольоксидазных электродов), покрытых аналогичными пленками. Из данных табл. 10 видно, что при использовании полимерных звезд и щеток происходит значительное увеличение активности алкогольоксидазных сенсоров, при этом использование молекулярной щетки позволяет увеличить активность алкогольоксидазных электродов в 5,3 раза в сравнении с контрольной конструкцией с линейным поликатионом. Подобный эффект наблюдался и в случае холиноксидазных электродов.

Табл. 10. Результаты изучения активности алкогольоксидазных электродов различных конструкций.

Конструкция пленки, полученной методом ПНП нА/с

(ПДМ ДААС1/Алкогольоксидаза) 1 7,6 ±1

(ПДМДААС1/Алкогольоксидаза)2 26,8 ± 6

(ПКЗ/ПАЗ/ПКЗ/Алкогольоксидаза)1 14,4 ±8

(ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза)1 40 ±6

(ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза)2 43,0 ± 7

(ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза)4 10,1 ±4

(ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза/ПКЗ/Алкогольоксидаза)1 30± 16

Для наиболее активной конструкции было изучено влияние количества наносимых слоев, содержащих фермент, на активность алкогольоксидазных сенсоров. Как видно из данных, приведенных в таблице, при нанесении последующих слоев не наблюдается увеличения активности сенсоров. Таким образом, в результате оптимизации методики изготовления алкогольоксидазных сенсоров была найдена оптимальная концентрация фермента, также была подобрана оптимальная конструкция сенсоров, за счет чего было достигнуто значительное увеличение активности биосенсоров. Следующим этапом данной работы является оптимизация условий определения этилового спирта с использованием полученного сенсора.

В оптимизацию процесса определения этанола с использованием полученных сенсоров входило изучение влияния рН и ионной силы рабочего буфера на активность полученных биосенсоров. Было показало увеличение активности алкогольоксидазного сенсора в 1,8 раза при изменении рН с 7,5 на 8,0 (рис. 9а). При поддержании рН рабочего буфера равным 8,0 и варьировании ионной силы путем изменения концентрации ЫаС1, было

обнаружено, что при ионной силе равной 0,65 мМ сенсоры на основе алкогольоксидазы

наиболее активны, за счет чего было достигнуто дополнительное увеличение активности

сенсоров (рис. 96). 40-,

35 30 О ос

в 20 ЬЙ 15 10 5 0

60

50-

< 40 -|

ад

30-

20-

10

0,60

0,65

0,70

0,75

рН I, мМ

а) б)

Рис. 9. а) Зависимость активности электродов, покрытых пленкой (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза) от значения рН Ыа-фосфатного буфера с 0,1 МИаС1. б) Зависилюсть активности электродов, покрытых пленкой

(ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза), от значения ионной силы рабочего буфера (рН = 8,0). Условия измерения: 5-Ш2 М этанола, ячейка перемешиванием, комнатная температура.

Далее была исследована операционная алкогольоксидазного биосенсора (рис. 10а).

60-] 60-,

50- • 50-

^40-Д 30- ад 20- • 1—__ • • • |40-1 30- £Р 20-

10- 10-

0- ■ 1 ' |-»-1—г-1 "-г" 0-

I 1 I ' I

9 10 11

0123456789 10 01234567

Номер измерения Номер измерения

а) б)

Рис. 10. а) Зависимость активности электродов, покрытых пленкой (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/ачкоголъоксидаза), от числа измерений, б) Зависимость величины ответов электродов, покрытых пленкой (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза), от числа измерений (добавка 1 мг/мл БСА в буфер при измерениях). Условия измерения: 5-1 (Г Ы этанола, ячейка с перемешиванием, 0.05 М Ш-фосфатный бу/рер с 0.05 М(рН8), комнатная температура.

Как видно из графика, представленного на рис. 1 Оа, полученный сенсор недостаточно стабилен, несмотря на высокую активность в выбранных оптимальных условиях. Полученные параметры операционной стабильности представлены в табл. 11. Известно, что для стабилизации сенсоров на основе алкогольоксидазы используются добавки Сахаров и балластных белков типа бычьего сывороточного альбумина (БСА) в рабочий буфер как при изготовлении электродов, так и при измерениях. Поэтому в качестве стабилизаторов алкогольоксидазного сенсора были выбраны трегалоза и БСА. Также по аналогии с

успешной стабилизацией тирозиназного и холиноксидазного сенсоров ГА была проведена попытка стабилизировать полученный алкогольоксидазный сенсор за счет обработки пленки (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза) 1 % раствором ГА. Однако после обработки ГА алкогольоксидазные сенсоры полиостью потеряли свою активность, что может быть связано с инактивацией алкогольоксидазы, имеющей субъединичную структуру.

Табл. 11. Стабилизация алкогольоксидазного сенсора с помощью добавок трегалозы и БСА в рабочий буфер.

[Добавка в рабочий буфер А, % ИЗБ, %

I Нет добавки -4 ± 1 19

Трегалоза (10 мг/мл при изготовлении) -11 ±3 73

Трегалоза (0,1 мг/мл при измерении) -4 ±2 22

1 БСА (1мг/мл при измерении) -0,2 ± 0,8 7

Было показано, что добавление выбранных стабилизаторов в рабочий буфер не влияет на первоначальную активность алкогольоксидазного сенсора. При этом лишь при добавлении БСА в буфер при измерениях сенсор на основе пленки (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/ажогольоксидаза) стабилен - его активность практически не изменяется в процессе работы, о чем свидетельствуют полученные параметры операционной стабильности (рис. 106, табл. 11).

Аналитические характеристики полученного алкогольоксидазного биосенсора представлены в табл. 12.

Табл. 12. Аналитические характеристики электродов, покрытых пленкой (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/алкоголъоксидаза).

Характеристика Значение 1

Область линейности по этанолу, мМ 0,5 - 5,0

Предел обнаружения этанола, мкМ 43 ±3

Чувствительность по этанолу, нА/(см-М-мс/) 0,47 ±0,03

Время ответа, с 16 ± 5

Операционная стабильность (по 10 измерениям), % ЯвИ = 7, А = -0,2 ±0,8

Предел обнаружения (8/М=3) и чувствительность полученного биосенсора были определены из начального участка зависимости активности алкогольоксидазного сенсора от концентрации этанола (рис. 116).

а) 6)

Рис. 11. а) Калибровочная зависимость по этиловому спирту для электрода, покрытого пленкой (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/алкогольоксидаза). б) Начальный участок зависимости. Условия измерения: ячейка с перемешиванием, 0,05 М Ма-фосфатный буфер с 0,05 М ШС! (рН8,0), содержащий БСА (1 мг/мл), комнатная температура.

Таким образом, метод ПНП позволил создать чувствительный и стабильный биосенсор на основе алкогольоксидазы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что уменьшение активности тирозиназпого и холиноксидазного электродов, покрытых пленкой (ПДМДААС1/Фермент), в процессе работы связано с неустойчивостью верхнего слоя фермента. Проведена стабилизация биосенсоров ковалентной прошивкой слоя фермента ГА. ЯБО и декремент падения активности для оптимизированных конструкций составили 5 % и -0,9 ± 0,4 % для тирозиназных и 1 % и -0,1 ± 0,1 % для холиноксидазных электродов.

2. Разработана методика одновременного амперометрического определения холина и фенола в двухэлектродной ячейке. Показано отсутствие влияния холиновых и фениловых эфиров на амперометрическую детекцию холина и фенола. Вычислены кинетические параметры и линейные диапазоны определяемых концентраций АХЭ и БХЭ по трем парам субстратов: ацетилхолин + фенилвалерат, ацетилхолин + феиилацетат и бутирилхолин + фенилацетат.

3. Показана принципиальная возможность использования электрохимического мультисенсора для одновременного определения активностей эстераз в смеси па примере анализа АХЭ и БХЭ с помощью двухэлектродного сенсора, состоящего из тирозиназного и холиноксидазного электродов. Средние ошибки определения АХЭ и БХЭ по 15 смесям составили 8 % и 4 %, соответственно. Минимальные средние ошибки определения АХЭ и БХЭ по 5 смесям, полученные при использовании пары субстратов ацетилхолин + фенилвалерат, составили 5 % и 3 %, соответственно.

4. Показано, что использование звездообразных катионных полиэлектролитов и молекулярных полиэлектролитных щеток позволяет увеличить активность электродов,

созданных по методу ПНП, в 4,7 раза в случае холиноксидазных и в 1,7 раза в случае тирозиназных сенсоров. Оптимальной конструкцией в случае холиноксидазы является (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Холиноксидаза), в случае тирозиназы - (ПКЗ/Тирозиназа).

5. Разработана методика создания алкогольоксидазных сенсоров по методу ПНП. Оптимизирован процесс изготовления сенсоров (оптимальная концентрация алкогольоксидазы из Hcmsenula polymorpha - 1,6-10"4 М, оптимальная конструкция -(ПКЗ/ПКЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза)) и процесс измерения этилового спирта (рН = 8,0; I = 0,65 мМ). Проведена стабилизация полученного сенсора за счет добавки 1 мг/мл БСА в рабочий буфер при анализе этилового спирта. Получены аналитические характеристики электродов, покрытых пленкой (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза). Операционная стабильность характеризуется RSD = 7 % и декрементом падения активности, который равен -0,2 ± 0,8 %, предел обнаружения этилового спирта составил 43 ± 3 мкМ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sigolaeva L.V., Dubacheva G.V., Kurochkin I.N. Design of amperometric phenolic biosensor on the basis of layer-by-layer technology. // Book of Abstracts of the II International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development", Moscow, 2003. P. 215.

2. Дубачева Г.В., Сиголаева JI.B., Курочкин И.Н. Разработка методики конструирования тирозиназного биосенсора по технологии «слой-за-слоем». // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов". Секция «Химия», отделение «Кинетика и катализ», Москва, 2004. С. 11.

3. Sokolovskaya L.G., Dubacheva G.V., Sigolaeva L.V., Yaroslavov A.A., Kurochkin I.N. Amperometric phenol biosensor based on layer-by-layer technology. // Book of Abstracts of The Eighth World Congress on Biosensors "Biosensors 2004", Granada, Spain, 2004. P3-7-58.

4. Дубачева Г.В., Евтушенко Е.Г., Соколовская Л.Г. Амперометрический фенольный биосенсор на основе технологии «слой-за-слоем». // Материалы IX-го Всероссийского слета студентов, аспирантов и молодых ученых - лауреатов конкурса «Ползуновские гранты», г. Сочи, 2004. С. 86-89.

5. Дубачева Г.В., Еременко А.В., Курочкин И.Н., Никитин И.П., Никитина С.Е., Сиголаева Л.В., Соколовская Л.Г., Ярославов А.А. Сенсорный элемент для анализа биологически активных соединений в растворах. // Патент Российской Федерации № 44483 на полезную модель, приоритет от 25.11.2004, зарегистрирован 27.03.2005.

6. Дубачева Г.В., Сиголаева Л.В., Курочкин И.Н. Тирозиназные электроды на основе наноструктурированных пленок полиэлектролитов. // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов". Секция «Химия», отделение «Науки о живом», Москва, 2005. С. 72.

7. Дубачева Г.В., Соколовская Л.Г., Сиголаева JI.B., Ярославов А.А., Ерёменко А.В., Курочкин И.Н. Тирозиназные биосенсоры на основе наноструктурированных пленок полиэлектролитов. // Сенсорные Системы, 2006. Т. 20. № 4. С. 336-343.

8. Дубачева Г.В., Порус М.В., Соколовская Л.Г., Сиголаева Л.В., Пергушёв Д.В., Ярославов A.A., Ерёменко A.B., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д. Наноструктурироваиные пленки полиэлектролитов - основа создания высокочувствительных тирозиназных биосенсоров. // Российские Нанотехнологии, 2007. Т. 2. № 1-2. С. 154-159.

9. Дубачева Г.В., Порус М.В., Сиголаева Л.В., Пергушов Д.В., Тур Д.Р., Панков B.C., Зезин А.Б., Ярославов A.A., Ерёменко A.B., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д. Наноструктурированные пленки полиэлектролитов - основа создания высокочувствительных тирозиназных биосенсоров. Особенности формирования фермент-полиэлектролитных структур. // Российские Нанотехнологии, 2008. Т. 3. № 3-4. С. 154-161.

10. Порус М.В., Дубачева Г.В., Сиголаева Л.В., Ерёменко A.B., Курочкин И.Н. Определение активностей холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродяой сенсорной системы. // Сенсорные Системы, 2008. Т. 22. № 1. С. 88-95.

11. Dubacheva G.V., Poms M.V., Sigolaeva L.V., Pergushov D.V., Tur D.R., Papkov V.S., Zezin A.B., Yaroslavov A.A., Eremenko A.V., Kurochkin I.N., Varfolomeev S.D. Nanostructured Polyelectrolyte Films for Engineering Highly Sensitive Tyrosinase Biosensors: Specifics of Enzyme/Polyelectrolyte Structures. // Nanotechnologies in Russia, 2008. V. 3. № 3-4. P. 221227.

12. Дубачева Г.В. Зависимость каталитических свойств ферментов, иммобилизованных на поверхности сенсоров, от природы используемого полиэлектролита. // Материалы четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Секция «Биокатализ и биокаталитические технологии», Москва, 2007, С. 271.

13. Дубачева Г.В., Соколовская Л.Г., Порус М.В., Осипова М.С. Влияние природы полиэлектролитов на каталитические свойства ферментов, иммобилизованных на поверхности сенсоров. // Материалы четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Секция «Биокатализ и биокаталитические технологии», Москва, 2007, С. 272.

14. Бадалян A.M., Дубачева Г.В. Изучение закономерностей включения тирозиназы в комплексы с полиэлектролитами нелинейной архитектуры. // Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Секция «Химия», Подсекция «Науки о живом», Москва, 2008. С. 262.

15. Быконя А.Н., Дубачева Г.В. Разработка ампсрометрического сенсора на основе алкогольоксидазы для определения этилового спирта. // Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Секция «Химия», Подсекция «Науки о живом», Москва, 2008. С. 264.

16. Торгонская A.A., Дубачева Г.В. Сравнение кинетических параметров ферментов в пленках полиэлектролитов линейной и нелинейной архитектуры. // Материалы докладов

XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Секция «Химия», Подсекция «Науки о живом», Москва, 2008. С. 306. 17. Kurochkin I.N., Eremenko A.V., Makhaeva G.F., Sigolaeva L.V., Dubacheva G.V. Multi-strips assay and multimodal biosensors for environmental and medical monitoring of neurotoxins. // Book of Abstracts of The NATO Advanced Research Workshop 983370 "Counteraction to Chemical and Biological Terrorism at a National and Local Level in the East Europe Countries". Dnepropetrovsk, Ukraine, 2008. P. 31.

Подписано в печать 07.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1121 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эстеразы крови и методы их определения

1.1.1. Эстеразы крови и здоровье человека

1.1.1.1. Ацетилхолинэстераза

1.1.1.2. Бутирилхолинэстераза

1.1.1.3. Карбоксилэстераза

1.1.2. Методы определения активностей эстераз крови

1.1.3.1. Методы определения эстераз

1.1.3.2. Методы определения эстераз в смеси

1.1.3.3. Мультисенсоры как новый подход к проведению ферментативного анализа

1.2. Метод послойного нанесения полиэлектролитов как перспективный подход к созданию биосенсоров

1.2.1. Метод послойного нанесения полиэлектролитов

1.2.2. Холиноксидаза и биосенсоры на ее основе

1.2.3. Тирозиназа и биосенсоры на ее основе

1.2.4. Тирозиназный и холиноксидазный биосенсоры, созданные в лаборатории Экобиокатализа

1.2.5. Полимеры в методе послойного нанесения полиэлектролитов *

1.3. Строение, синтез и свойства полимерных звезд

1.3.1. Строение и синтез полимерных звезд

1.3.2. ATRP-полимеризация

1.3.3. Синтез и свойства полианионной звезды

1.3.4. Синтез и свойства поликатионной звезды

1.3.5. Моделирование поведения полимерных звезд в водных растворах

1.4. Алкогольоксидаза и биосенсоры на ее основе

1.4.1. Структура и свойства алкогольоксидазы

1.4.1.1. Особенности структуры алкогольоксидазы

1.4.1.2. Свойства алкогольоксидазы

1.4.2. Биосенсоры на основе алкогольоксидазы

1.4.2.1. Амперометрические сенсоры на основе алкогольоксидазы

1.4.2.2. Методы иммобилизации алкогольоксидазы при изготовлении амперометрических сенсоров

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Изготовление тирозиназных биосенсоров

2.2.2. Электромодификация графитовых электродов М11О

2.2.3. Изготовление холиноксидазных биосенсоров

2.2.4. Приготовление образцов для АСМ

2.2.5. Получение АСМ-изображений

2.2.6. Обработка топографии поверхностей

2.2.7. Спектрофотометрическое определение активностей холинэстераз

2.2.8. Титрование активных центров холинэстераз

2.2.9. Электрохимический анализ фенола и холнна в одноэлектродной ячейке

2.2.10. Циклическая вольтамперометрия

2.2.11. Электрохимический анализ фенола и холина в двухэлектродной ячейке

2.2.12. Одновременное определение скорости ферментативного гидролиза холиновых и фениловых эфиров под действием холинэстераз

2.2.13. Квазиупругое динамическое светорассеяние

2.2.14. Определение активности тирозиназы и холиноксидазы в водных растворах

2.2.15. ИК-спектроскопия

2.2.16. Изготовление алкогольоксидазных биосенсоров ;

2.2.17. Определение активности алкогольоксидазных биосенсоров

2.2.18. Обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Использование электрохимических биосенсоров на основе тирозиназы и холиноксидазы для анализа эстераз в смеси

3.1.1. Стабилизация тирозиназных и холиноксидазных электродов, изготовленных по методу послойного нанесения полиэлектролитов

3.1.1.1. Стабилизация тирозиназного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов 103 3.1.1.1. Стабилизация холипоксидазного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов

3.1.2. Оптимизация условий одновременного электрохимического определения фенола и холина

3.1.2.1. Оптимизация рабочего потенциала холипоксидазного электрода

3.1.2.2. Влияние холиновых и фениловых эфиров на электрохимическое определение фенола и холина

3.1.3. Определение холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродного электрохимического биосенсора

3.1.3.1. Определение коэффициентов чувствительности холинэстераз по выбранным субстратам

3.1.3.2. Дискриминационный анализ холинэстераз в смеси 122 3.2. Использование полиэлектролитов нелинейной архитектуры для создания электрохимических биосенсоров

3.2.1. Использование полиэлектролитов нелинейной архитектуры для улучшения аналитических характеристик тирозиназного и холпноксидазного биосенсоров

3.2.1.1. Взаимодействие тирозиназы и холиноксидазы с полиэлектролитами нелинейной архитектуры в водных растворах

3.2.1.2. Влияние полимерных звезд на активности тирозиназы и холиноксидазы в водных растворах

3.2.1.3. ИК-спектры комплексов тирозиназы и холиноксидазы с полимерными звездами

3.2.1.4. Электроды, полученные на основе комплексов ферментов с полимерными звездами

3.2.1.5. Электроды различных конструкций на основе холиноксидазы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры

3.2.1.6. Электроды различных конструкций на основе тирозиназы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры

3.2.2. Создание алкогольоксидазного биосенсора по методу послойного нанесения полиэлектролитов

3.2.2.1. Включение алкогольоксидазы в состав наноструктурированных пленок полиэлектролитов

3.2.2.2. Оптимизация методики изготовления алкогольоксидазных биосенсоров

3.2.2.2.1. Выбор оптимальной концентрации алкогольоксидазы, используемой для создания сенсоров

3.2.2.2.2. Оптимизация состава биосенсоров по типу поликатиона

3.2.2.3. Оптимизация условий количественного определения этилового спирта

3.2.2.3.1. Оптимизация рН рабочего буфера

3.2.2.3.2. Влияние ионной силы рабочего буфера на активность сенсоров

3.2.2.4. Исследование операционной стабильности алкогольоксидазного биосенсора

3.2.2.5. Определение кинетических характеристик алкогольоксидазы, иммобилизованной по методу послойного нанесения полиэлектролитов

Эстеразы являются одними из ключевых ферментов крови человека, уровень их активности является исключительно важным показателем в токсикологии, фармакологии и нейробиологии. Изменение активности этих ферментов в крови приводит к развитию целого ряда функциональных нарушений организма, в том числе вызванных контактом с фосфорорганическими соединениями и карбаматами, широко использующимися в сельском хозяйстве в качестве пестицидов и инсектицидов. Для клинических исследований и ранней диагностики таких нарушений необходимо знать соотношение уровней активности этих ферментов в крови. Таким образом, акгуальной задачей является создание высокочувствительных и стабильных биоаналитических устройств, позволяющих быстро и надежно определять активности эстераз в крови человека.

Поскольку каждая из эстераз локализована преимущественно в одном компоненте крови, обычно при проведении анализа исходный препарат цельной крови подвергают фракционированию, что делает общую схему анализа довольно сложной и требует значительного времени. При этом анализ большого количества образцов представляет собой длительную и трудоемкую процедуру. Упрощение схемы определения активностей эстераз, а также существенное увеличение скорости проведения анализа может быть достигнуто, во-первых, за счет анализа активностей эстераз в препаратах цельной крови,, что исключает фракционирование, а во-вторых, за счет использования методик, позволяющих одновременно определять уровни активностей этих ферментов в образце.

На сегодняшний день в литературе имеется единственный пример разработанного1 метода одновременного определения активностей эстераз в образце цельной крови, основанного на многоступенчатой схеме флуориметрического измерения скорости гидролиза различных субстратов (ацетил-, бутирил- и пропионилтиохолинов) под действием холинэстераз [1]. Данный метод характеризуется высокой чувствительностью и высокой скоростью проведения анализа, однако тип субстратов, используемых в данном методе, ограничивается только тиохолинсодержащими соединениями, что накладывает ограничения на количество определяемых таким методом ферментов.

В настоящей работе разрабатывается подход к определению активностей эстераз в смеси, основанный на использовании электрохимического мультисснсора. Данный метод позволит проводить одновременный анализ эстераз с использованием смеси субстратов, что позволит дополнительно упростить схему анализа, снизить его стоимость, сократить время его проведения, а также увеличить его информативность вследствие возможности регистрации динамики развития электрохимического отклика. Необходимо отметить, что на сегодняшний день существует широкий спектр мультисенсорных устройств с оптической и электрохимической регистрацией аналитического отклика, позволяющих быстро и надежно решать задачи, связанные со скринингом ферментов, их потенциальных ингибиторов, а также в ряде случаев количественно определять содержание субстратов и ингибиторов в пробе [2-6]. При этом в литературе нет ни одного примера количественного анализа ферментов с использованием мультисенсоров.

Возможность применения такого подхода для анализа эстераз в смеси в данной работе исследуется на примере определения активностей ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы с использованием холин- и фенол-содержащих субстратов и двухэлектродного сенсора, состоящего из холинового и фенолыюго амперометрических датчиков, ранее разработанных в нашей лаборатории с использованием метода послойного нанесения полиэлектролитов [7]. Перспективность использования данного двухэлектродного сенсора заключается в возможности дальнейшего увеличения количества сенсорных элементов, что позволит одновременно определять активности нескольких эстераз крови. Так, одной из задач данной работы является разработка алкогольоксидазного биосенсора по методу послойного нанесения полиэлектролитов, использование которого вместе с тирозиназным и холиноксидазным сенсорами дает-возможность одновременно определять активности ацетилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы и карбоксилэстеразы. Следует также отметить, что метод j, послойного нанесения полиэлектролитов, представляющий собой простую и эффективную технику создания многослойных ультратонких органических пленок на твердой поверхности, допускает миниатюризацию аналитических систем, что в свою К очередь делает возможным создание в будущем микроэлектромеханических мультисенсоров с малыми, менее 1 мкм, размерами чувствительных элементов.

Поскольку потенциальное использование электрохимического мультисенсора связано с анализом образцов цельной крови, что подразумевает сильное разбавление исследуемых проб, то очень важным аспектом этой работы являются аналитические характеристики биосенсоров, созданных по методу послойного нанесения полиэлектролитов, а именно их стабильность и чувствительность. Совсем недавно были синтезированы уникальные полимеры — полиэлектролиты нелинейной архитектуры, к которым относят полимерные звезды, молекулярные, сферические и цилиндрические щетки [8, 9]. До настоящего времени существовали определенные трудности получения полиэлектролитов нелинейной архитектуры. Полимеры такого типа с узким молекулярно-массовым распределением удалось пока синтезировать только небольшому числу научных групп в мире. Уже сейчас достаточно очевидно, что данные полимерные объекты отличаются от линейных аналогов в первую очередь большей объемной плотностью заряда и более жесткой топологической структурой. И именно благодаря этим свойствам полиэлектролиты нелинейной архитектуры обладают значительным потенциалом при создании биосенсоров по методу послойного нанесения полиэлектролитов.

Таким образом, целью данной работы является исследование возможности применения электрохимических сенсорных систем для одновременного определения активностей эстераз в смеси, а также исследование возможности улучшения аналитических характеристик биосенсоров на основе тирозиназы, холиноксидазы и алкогольоксидазы за счет использования полиэлектролитов нелинейной архитектуры.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

4. ВЫВОДЫ

1. Показано, что уменьшение активности тирозиназного и холиноксидазного электродов, покрытых пленкой (ПДМДААС1/Фермент), в процессе работы связано с неустойчивостью верхнего слоя фермента. Проведена стабилизация биосенсоров ковалентной прошивкой слоя фермента глутаровым альдегидом. RSD и декремент падения активности для оптимизированных конструкций составили 5 % и -0,9 ± 0,4 % для тирозиназных и 1 % и -0,1 ± 0,1 % для холиноксидазных электродов.

2. Разработана методика одновременного амперомегрического определения холина и фенола в двухэлектродной ячейке. Показано отсутствие влияния холиновых и фениловых эфиров на амперометрическую детекцию холина и фенола. Вычислены кинетические параметры и линейные диапазоны определяемых концентраций АХЭ и БХЭ по трем парам субстратов: ацетилхолин + фенилвалерат, ацетилхолин + фенилацетат и бутирилхолин + фенилацетат.

3. Показана принципиальная возможность использования электрохимического мультисенсора для одновременного определения активностей эстераз в смеси на примере анализа АХЭ и БХЭ с помощью двухэлектродного сенсора, состоящего из тирозиназного и холиноксидазного электродов. Средние ошибки определения АХЭ и БХЭ по 15 смесям составили 8 % и 4 %, соответственно. Минимальные средние ошибки определения АХЭ и БХЭ по 5 смесям, полученные при использовании пары субстратов ацетилхолин .+ фенилвалерат, составили 5 % и 3 %, соответственно.

4. Методом квазиупругого светорассеяния доказано образование комплексов звездообразных катионных полиэлектролитов с холиноксидазой и тирозиназой. Изучение активности комплексов (ПКЗ:Фермент) в молярном соотношении (1:1), (1:5) и (1:10) в водных растворах, а также сравнение ИК-спектров ферментов и комплексов (ПКЗ:Фермент) в соотношении (1:5) для тирозиназы и холиноксидазы, показало отсутствие сильных взаимодействий между ферментом и полиэлектр олптом в исследуемых комплексах. Сравнение активности электродов, покрытых пленкой (ПКЗ/Ферменг) и электродов, на поверхности которых были адсорбированы комплексы (ПКЗ:Фермент) в соотношении (1:5), показало, что более активные сенсоры получаются при послойном нанесении полиэлектролитов.

5. Показано, что использование звездообразных катионных полиэлектролитов и молекулярных полиэлектролитных щеток позволяет увеличить активность электродов, созданных по методу ПНП, в 4,7 раза в случае холиноксидазных и в 1,7 раза в случае тирозиназных сенсоров. Оптимальной конструкцией в случае холиноксидазы является (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Холиноксидаза), в случае тирозиназы - (ПКЗ/Тирозиназа).

6. Разработана методика создания алкогольоксидазных сенсоров по методу ПНП. Оптимизирован процесс изготовления сенсоров (оптимальная концентрация алкогольоксидазы из Hansenula polymorpha - 1,6*10"4 М, оптимальная конструкция — (ПКЗ/ПК1Ц/ПКЗ/Алкогольоксидаза)) и процесс измерения этилового спирта (рН = 8,0; I -0,65 мМ). Проведена стабилизация полученного сенсора за счет добавки 1 мг/мл БСА в рабочий буфер при количественном анализе этилового спирта. Получены аналитические характеристики электродов, покрытых пленкой (ПКЗ/ПАЩ/ПКЗ/Алкогольоксидаза). Операционная стабильность характеризуется RSD = 7% и декрементом падения активности А — -0,2 ± 0,8 %, предел обнаружения этилового спирта составил 43 ± 3 мкМ.

1. Shawn R. F., Doctor B.P. Rapid, quantitative, and simultaneous determination of AChE and BChE levels in unprocessed whole blood. // U.S. Patent № 6746850 B2, 08.06.2004.

2. Zhu H., Klemic J.F., Chang S. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. // Nat. Genet., 2000. V. 26, P. 283-289.

3. Salisbury C.M., Maly D.J., Ellman J.A. A red-fluorescent substrate microarray for lipase fingerprinting. // J. Am. Chem. Soc., 2002. V. 124. P. 14868-14870.

4. Ma H., Horiuchi K.Y., Wang Y. Nanoliter homogenous ultra-high throughput screening microarray for lead discoveries and IC50 profiling. // ASSAY and Drug Dev. Technol., 2005. V. 3(2). P. 177-187.

5. Sieber S.A., Mondala T.S., Head S.R. Microarray platform for profiling enzyme activities in complex proteomes. //J. Ain. Chem. Soc., 2004. V. 126. P. 15640-15641.

6. Solna S., Sapelnikova S., Skadal P. Multienzyme electrochemical array sensor for determination of phenols and pesticides.// Talanta, 2005. V. 65. P. 349-357.

7. Plamper F.A., Becker Н., Lanzendorfer М., Patel М., Wittemann A., BallauiT М., Miiller А. Н. Е. Synthesis, Characterization and Behavior in Aqueous Solution of Star-Shaped Poly(acrylic acid). //Macromol. Chem. Phys., 2005. V. 206. P. 1813-1825.

8. Ordentlich A., Barak D., Kronman C. Dissection of human acetylcholinesterase active centre determinants of substrate specifity. // J. Biol. Chem., 1993. V. 268(23). P. 1708317095.

9. Willson В., Henderson J. D. Blood esterase determinations as markers of exposure. // Rev. of Environ. Contamin. and Toxicol., 1992. V. 128. P. 55-69.

10. Lindstrom J. Mutation Causing Muscle Weakness. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1998. V. 95. P. 9070-9071.

11. Zhang X.J., Yang L., Zhao Q. Induction of acetylcholinesterase expression during apoptosis in various cell types. // Cell Death and Differentiation, 2002. V. 9. P. 790-800.

12. Keesey J. Biochemica Information. // Boehringer Mannheim Biochemicals, 1987.

13. Al-Kassab A.S., Vijayakumar E. Profile of serum cholinesterase in systemic sepsis syndrome (septic shock) in intensive care unit patients. // Eur. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1995. V.33.P. 11-14.

14. Ohayo-Mitoko G.J.A., Kromhout H., Simwa J.M. Self reported symptoms and inhibition of acetylcholinesterase activity among Kenyan agricultural woikers. // Occup. Environ. Med., 2000. V. 57. P. 195-200.

15. Solberg Y., Belkin M. The role of excitotoxicity in organophosphorus nerve agents central poisoning. // Trends in Pharmacol. Sci., 1997. V. 18. P. 183-185.

16. Francis P. Т., Palmer A. M., Snape M. The cholinergic hypothesis of Alzheimer's disease: a review of progress. // J. Neurol. Neurosurg Psychiatry, 1999. V. 66. P. 137-144.

17. Schulpis K.H., Karikas G.A., Tjamouranis J. Acetylcholinesterase activity and biogenic amines in phenylketonuria. // Clin. Chem., 2002. V. 48(10). P. 1794-1796. {

18. Ilermona S., Haim Z. Peripheral anionic site. Human Cholinesterases and Anticholinesterases, 1993, P. 14-15.

19. McGuire M.C., Noguera C. P., Bartels C.F. Identification of the structural mutation responsible for the dibucaine-resistant (atypical) variant form of human serum cholinesterase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86(3), 953-957.

20. Noguera C.P., McGuire M.C., Graeser C. Identification of a frameshift mutation responsible for the silent phenotype of human serum cholinesterase, Gly 117 (GGT—GGAG). // Am. J. Hum. Genet., 1990. V. 46(5). P. 934-942.

21. Noguera C.P., Bartels C.F., McGuire M.C. Identification of 2 different point mutations associated with the fluoride-resistant phenotype for human butyrylcholinesterase. // Am. J. Hum. Genet., 1992. V. 51(4). P. 821-828.

22. Bartels C.F., Jensen F.S., Lockridge O. DNA mutations associated with the human butyrylcholinesterase K-variant and its linkage to the atypical variant mutation and other polymorphic sites. // Am. J. Hum. Genet., 1992. V. 50(5). P. 1086-1103.

23. Bartels C.F., James K., Ladu B.N. DNA mutations associated with the human butyrylcholinesterase J-variant. // Am. J. Hum. Genet., 1992. V. 50(5). P. 1104-1114.

24. Jensen F.S., Bartels C.F., Ladu B.N. Structural basis of the butyrylcholinesterase Invariant segregating in 2 Danish families. // Pharmacogenetics, 1992. V. 2(5). P. 234-240.

25. Ruiz-Espejo F., Cabezas-Herrera J., Illana J. Cholinesterase activity and acetylcholinesterase glycosylation are altered in human breast cancer. // Breast Cancer Res. and Treatm., 2002. V. 72. P. 11-22.

26. Gawin F.H., Ellinwood E.H. Cocaine and other stimulants, actions, abuse and treatment.//The new Engl. J. ofmed., 1988. V. 318(18). P. 1173-1182.

27. Landry D.W, Zhao K., Yang G.X.-Q., Glickman M., Georgiadis T.M. Antibody-catalyzed degradation of cocaine. // Science, 1993. V. 259. P. 1899-1901.

28. Sun H., Yazal J.E1., Lockridge O., Schopfer L.M., Brimijoin S., Pang Y.'-P. Predicted Michaelis-Menten complexes of cocaine-butyrylcholinesterase. // J. Biol. Chem., 2001. V. 276. P.9330-9336.

29. Sitar D.S. Clinical pharmacokinetics of bambuterol. // Clin. Pharmacokinet., 1996, V. 31(4). P. 245-256.

30. Lockridge O., Masson P. Pesticides and susceptible populations: people with Butyrylcholinesterase genetic variants may be at risk. // Neurotoxicol., 2000. V. 21. P. 113-126.

31. Махаева Г.Ф., Малыгин B.B., Мартынов И.В. Отставленная нейротоксичность при действии фосфорорганических пестицидов. //Агрохимия, 1987. № 12. С. 103-124.

32. Yen Т., Nightingale B.N., Bums J.C. Butyrylcholinesterase (BCHE) Genotyping for Post-Succinylcholine Apnea in an Australian Population. // Clin. Chem., 2003. V. 48(8). P. 1297-1308.

33. Satoh Т., Hosokawa M. The mammalian carboxylesterases: from molecules to functions. // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol, 1998. V. 38. P. 257-188.

34. Satoh Т., Taylor P., Bosron W.P., Sanghani S.P., Hosokawa M., La Du B.N. Current progress on esterases: from molecular structure to function. // Drug Metab. Dispos., 2002. V. 30(5). P. 488-493.

35. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.J. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. // Biochem. Pharmacol., 1961. V. 7. P. 88-95.

36. Richardson R.J. Organophosphates: Chemistry, Fate, and Effects. // Acad. Press., 1992. P. 299-323.

37. Heymann E. Enzymatic Basis of Detoxication. // Acad. Press., 1980. V. 2. P. 291323.

38. Satoh T. Role of carboxylesterases in xenobiotic metabolism. // Revs. Biochem. Toxicol., 1987. Y. 8. P. 155-181.

39. Prokai L., Prokai-Tatrai K. Metabolism -based drug design and drug targeting. // Pharm. Sci. Tech. Today., 1999. V. 2(11). P. 457-463.

40. Fukuto T.R. Mechanism of action of oiganophosphorus and caibamate insecticides. // Environ. Health. Perspect., 1990. V. 87. P. 245-254.

41. Maxwell D.M. The specificity of carboxylesterase protection, against the toxicity of organophosphorus compounds. //Toxicol. Appl. Pharmacol., 1992. V. 114. P. 306-312.

42. Padilla S., Lassiter T.L., Hunter D. Methods in Molecular Medicine. V. 22: ■ -Vf Л *

43. Neurodegeneration Methods and Protocols. // Humana Press Inc., 1999. P. 237-245.

44. Henn B.C., McMaster S., Padilla S. Measurin g cholinesteiase activity, in humanvsaliva. // J. of Tox. and Env. Health, 2006. V. 69. P. 1805-1818.

45. Katsu Т., Kayamoto T. Determination of cholinesterase in blood serum with a benzoate-sensitive membrane electrode. // Anal. Chim. Acta, 1991. V. 254. P. 95-97.

46. Ivanov A., Evtugyn G., Budnikov H. Cholinesterase sensors based on screen-printed electrodes for detection of organophosphorus and carbamic pesticides. // Anal Bioanal Chem., 2003. V. 377. P. 624-631.

47. Morelis R.M., Coulet P.R., Simplot A. Rapid and sensitive discrimination of acetylcholinasterase activity in amniotic fluid with a cholin sensor. // Clin. Cim. Acta, 1991. V. 203. P. 295-304.

48. Palleschi G., Lavagnini M.G., Moscone D. Determination of serum cholinesterase activity and dibucain numbers by an amperometric choline sensor. // Bios, and Bioel., 1990. V. 5 P. 27-35.

49. Yao T. Flow injection analysis in blood serum by use of choline-sensitive electrode as an amperometric detector. // Analyt. Chim. Acta, 1983. V. 153. P. 169-174.

50. Stoytcheva M., Zlatev R., Valdez B. Electrochemical sensor based on Arthrobacter globiformis for cholinesterase activity determination. // Bios, and Bioel., 2006. V. 22(1). P. 1-9.

51. Stern S. H., Johnsen B. A, Fonnum F. Carboxylesterases, importance for the detoxification of organophosphorus anticholinesterases and trichothecenes. // Biochem. Pharmacol., 1985. V. 34 (15). P. 2779-2785.

52. Dass P., Mejia M., Landes M., Jones R„ Stuart В., Thyssen J. Cholinesterase: review of methods. // Clin. Chem, 1994. V. 34. P. 135-157.

53. Kuhn D., Heymann E. Identification of the chloramphenicol-hydrolyzing enzyme of guinea pig liver as one of the nonspecific carboxylesterases. // Biochem. Pharmacol., 1982. V. 31(5). P. 781-786.

54. Katsu Т., Hanada N. Ion-selective electrode for salicylate assay in bloom serum. // Anal. Chim. Acta, 1996. V. 321. P. 21-25.

55. Chanda S.M., Mortensen S.R., Moser V.C., Padilla S. Tissue-specific effects of chlorpyrifos on carboxylesterase and cholinesterase activity in adult rats: An in vitro and in vivo comparison. // Fundam. Appl. Toxicol., 1997. V. 38. P. 148-157.

56. Saboori A. M., Newcombe D. S. Human monocyte carboxylesterase. Purification and kinetics. //J. Biol. Chem., 1990. V. 265(32). P. 19792-19799.

57. Kolf-Clauw M., Jez S. Acetyl- and pseudo-cholinesterase activities of plasma, erythrocytes, and whole blood in male beagle dogs using Ellman's assay. // Vet. Human Toxicol., 2000. V. 42(4). P. 216-219.

58. Zhu Q., Uttamchandani M., Li D. Enzymatic profiling system in a small-molecule microarray. // Org. Lett., 2003. V. 5(8). P. 1257-1260.

59. Chen G.Y.J., Uttamchandani M., Zhu Q. Developing a strategy for activity-based detection of enzymes in a protein microarray. // Chem. Bio. Chem., 2003. V. 4. P. 336-339.

60. Львов Ю.М., Дехер Г. Сборка мультислойных упорядоченных пленок последством чередующейся адсорбции противоположно заряженных макромолекул. // Кристаллогр. 1994. Т. 39. № 4. С. 696-716.

61. Keller S., Kim H., Mallouk, T. Layer-by-layer assembly of intercalation compounds and heterostructures on surfaces: towards molecular "beaker" epitaxy. // J. Am. Chem. Soc., 1994. V. 116. P. 8817-8818.

62. Lvov, Y., Ariga, K., Ichinose, I., Kunitake, T. Assembly of multicomponent protein films by means of electrostatic layer-by-layer adsorption. // J. Am. Chem. Soc., 1995. V. 117. P. 6117-6123.

63. Yoo D., Shiratori S., Rubner, M. Controlling bilayer composition and surface, wettability of sequentially adsorbed multilayers of weak polyelectrolytes. // Macromol., 1998. V. 31. P. 4309-4318.

64. Mamedov A., Kotov N. Free-Standing Layer-by-Layer Assembled Films of Magnetite Nanoparticles. // Langm., 2000. Y. 16. P. 5530-5533.

65. Cassagneau Т., Mallouk Т., Fendler J. Layer-by-layer assembly of thin film Zener diodes from conducting polymers and CdSe nanoparticles. // J. Am. Chem. Soc., 1998. V. 120. P. 7848-7859.i

66. McShane M.J., Lvov Y.M. Layer-by-layer electrostatic self-assembly and biomaterial applications. Encyclopedia of nanoscience & nanotechnology. // New-York: M. Dekker Publ., 2004. P. 1-26. }

67. Schlenoff J.B., Farhat T. Ion transport and equilibria in polyelectrolyte multilayers. // Langm., 2001. V. 17. P. 1184-1192.

68. Lvov Y., Decher G., Mohwald H. Assembly, structural characterization* and thermal behavior of layer-by-layer deposited ultrathin films of poly(vinylsulfate) and poly(allylamine). // Langm., 1993. V. 9. P. 481-486.

69. Decher G., Lehr В., Lowack K., Lvov Y., Schmitt J. New nanocomposite films for biosensors: layer-by-layer adsorbed films of polyelektrolytes, proteins or DNA. // Biosens. And Bioelectron., 1994. V. 9. P. 677-684.

70. Anzai J., Kobayashi Y., Suzuki Y., Takeshita H., Chen Q., Osa Т., Hoshi Т., Du X. Enzyme sensors prepared by layer-by-layer deposition of enzymes on a platinum electrode through avidin-biotin interaction. // Sens, and Actuat., 1998. V. 52. P. 3-9.

71. Trau D., Renneberg R. Encapsulation of glucose oxidase microparticles within a nanoscale layer-by-layer film: immobilization and biosensor applications. // Biosens. and Bioelectron., 2003. V. 18. P. 1491-1499.

72. Ram M.K., Bertoncello P., Ding H., Paddeu S., Nicolini C. Cholesterol biosensors prepared by layer-by-layer technique. // Biosens. and Bioelectr., 2001. V. 16. P. 849-856.

73. Wang J., Liu G., Lin Y. Amperometric choline biosensor fabricated through electrostatic assembly of bienzyme/polyelectrolyte hybrid layers on carbon nanotubes. // Analyst, 2006. V. 131. P. 477-483.

74. Liw G., Lin Y. Biosensor based on self-assembling acetylcholinesterase on carbon nanotubes for flow injection/amperometric detection of organophosphate pesticides and nerve agents. // Anal. Chem., 2006. V. 78. P. 835-843.

75. Ohta-Fukuyama M., Miyake Y., Emi S., Yamano T. Identification and properties of the prosthetic group of choline oxidase from Alcaligenes sp. II J. Biochem., 1983. V. 88. P. 197203.

76. Ikuta S., Imamura S., Misaki H., Hariuti Y. Purification and characterization of choline oxidase from Arthrobacter globiformis. // J. Biochem., 1977. V. 82. P. 1741-1749.

77. Yamada, H., Mori, N., Tani, Y. Properties of choline oxidase of cylindrocarpon didymium M-l. //Agric. Biol. Chem., 1979. V. 43. P. 2173- 2177.

78. Hatefi, Y., Stiggall, D.L. Metal-containing flavoprotein dehydrogenases. The Enzymes. // 3rd Ed. Boyer P.D. Ed., 1975. V. 13. P. 175-297.

79. Schachl K., Alemu H., Kalcher K., Moderegger H., Svancara I., Vytras K. Amperometric determination of hydrogen peroxide with a manganese dioxide film-modified screen printed carbon electrode.// J. Anal. Chem., 1998. V. 362. P. 194-200.

80. Fengli Qu, Minghui Yang, Jianhui Jiang,Guoli Shen, Ruqin Yu, Amperometric biosensor for choline based on layer-by-layer assembled functionalized carbon nanotube and polyaniline. // Anal. Biochem. 2005. V. 344. P. 108-114.

81. Sanchez-Ferror A., Rodriguez-Lopez J.N., Garcia-Canovas F., Garcia-Carmona F. Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism. // Biochim. Biophys. Acta, 1995. V. 1247. P. 1-11.

82. Himmelwright R.S., Eickman N.C., Lubien C.D., Lerch K., Solomon E. Chemical and spectroscopic studies of the binuclear copper active site of Neurospora Tyrosinase: comparison to hemocyanins. //J. Am. Chem. Soc., 1980. V. 102. P. 7339-7344.

83. Streffer K., Vijgenboom E., Tepper A., Makower A., Scheller F.W., Canters G.W., Wollenberger U. Determination of phenolic compounds using recombinant tyrosinase from Streptomyces antibioticus. // Anal. Chim. Acta, 2000. V. 427. P. 201-210.

84. Campuzano S., Serra В., Pedrero M., Manuel de Villena F.J., Pingarron J.M. Amperometric flow-injection determination of phenolic compounds at self-assembled monolayer-based tyrosinase biosensors. // Anal. Chim. Acta., 2003. V. 494. P. 187-197.

85. Forzani E.S., Solis M.V. Electrochemical Behavior of Polyphenol Oxidase Immobilized in Self-Assembled Structures Layer by Layer with Cationic Pollyallylamine. // Anal. Chem., 2000. V. 72. P. 5300-5307.

86. Forzani E.S., Teijelo M.L., Nart F., Calvo E.J., Soils V.M. Effect of the polycation nature on the structure of layer-by-layer electrostatically self-assembled multilayers of polyphenol oxidase. // Biomacromol., 2003. V. 4. P. 869-879.

87. Дубачева Г.В., Соколовская Л.Г., Сиголаева Л.В., Ярославов А.А., Ерёменко А.В., Курочкин И.Н. Тирозиназные биосенсоры на основе наноструктурированных пленок полиэлектролитов. // Сенс. Сист., 2006. Т. 20. С. 336-343.

88. Hou S.F., Yang K.S., Fang H.Q., Chen H.Y. Amperometric glucose enzyme electrode by immobilizing glucose oxidase in multilayers self-assembled monolayers surface. // Talanta, 1998. V. 47. P. 561-567.

89. Nakano K., Doi K., Tamura K., Katsumi Y., Tazaki M. Self-assembling monolayer formation of glucose oxidase covalently attached on 11-aminoundecanethiol monolayers on gold. // Chem. Commun., 2003. P. 1544-1545 .

90. Buhleier E., Wehner W., Voegtle F. "Cascade"- and "nonskin-chain-like" syntheses of molecular cavity topologies. // Synthesis, 1978. P. 155-158.

91. Kim Y-G., Oh S-K, Crooks R. M. Preparation and Characterization of 1-2 nm Dendrimer-Encapsulated Gold Nanoparticles having Very Narrow Size-Distributions. // Chem. Mater., 2004. V. 16. P. 167-172.

92. Crespilho F.N., Huguenin F., Zucolotto V., Olivi P., Nart F.C., Oliveira Jr. Dendrimers as nanoreactors to produce platinum nanoparticles embedded in layer-by-layer films for methanol-tolerant cathodes. // Electrochem. Commun., 2006. V. 8. P. 348-352.

93. Alexander S. Adsorption of chain molecules with a polar head a scaling description. // J. de Phys., 1977. V. 38. P. 983-987.

94. Gennes P. G. Scaling theory of polymer adsorption. // J. de Phys., 1976. V. 37. P. 1445-1453.

95. Tsitsilianis C., Voulgaris D. Poly(2-vinylpyridine) based star-shaped polymers. Synthesis of heteroarm star (AnBn) and star-block (AB)n copolymers. // Macromol. Chem. Phys., 1997. V. 198. P. 997-1007.

96. Heinrich M., Rawiso M., Zilliox J.G., Lesieur P., Simon J.P. Small angle X-ray scattering from salt-free solutions of star-branched polyelectrolytes. // Eur. Phys J. E., 2001. V. 4. P. 131-142.

97. Heyes С., Groll J., Moller M., Nienhaus U. Synthesis, patterning and applications of star shaped poly(ethylene glycol) biofunctionalized surfaces. // Mol. Biosyst., 2007. V. 3. P. 419-430.

98. Held D., Muller A.H.E. Synthesis and solution properties of star-shaped poly(tert-butyl acrylate ). // Macromol. Symp., 2000. V. 157. P. 225-239.

99. Zilliox J.G., Rempp P., Parrod J. J., Preparation of star-shaped macromolecules by anionic copolymerization. // Polym. Sci. Pol. Sym., 1968. V. 22. P. 145-156.

100. Blaul J., Wittemann M., Ballauf M., Rehahn M. Osmotic coefficient of a synthetic rodlike polyelectrolyte in salt-free solution as a test of the Poisson-Boltzmann Cell Model. // J. Phys. Chem., 2000. V. 104. P. 7077-7081.

101. Plamper F., Walther A., Ballauf M., Mueller A.H.E. Nanoblossoms: Light-Induced Conformational Changes of Cationic Polyelectrolyte Stars in the Presence of Multivalent Counterions. //Nanoletters, 2007. V. 70. P. 167-171.

102. Ballauf M. Phase equilibria in rodlike systems with flexible side chains. // Macromol., 1986. V. 19. P. 1366-1374.

103. Lyulin A.V., Duenweg В., Borisov O.V., Darinckii A.A. Computer simulation studies of a single polyelectrolyte chain in poor solvent. // Macromol., 1999. V. 32. P. 32643274.

104. Klein Wolterlink J., van Male J., Cohen Stuart M.A., Koopal L.K., Zhulina E.B., Borisov O.V. Annealed star-branched polyelectrolytes in solution. // Macromol., 2002. V. 35. P. 9176-9190.

105. Kurtzman C.P. Synonymy of the yeast genera Hansenula and Pichia demonstrated through comparisons of deoxyribonucleic acid relatedness. // Ant. Leeuwenh., 1984. V. 50. P. 209-217.

106. Suiter G., Harder W., Veenhuis M. Structural and functional aspects of peroxisomal membranes in yeasts. // FEMS Microbiol. Rev., 1993. V. 11. P. 285-296.

107. Evers M., Harder W., Veenhuis M. In vitro dissociation and reassembly of peroxisomal alcohol oxidase of Hansenula polymorpha and Pichia pastoris. IIFEBS Lett., 1995. V. 368. P. 293-296.

108. Hopkins Т., Muller F. Biochemistry of alcohol oxidase. Microbial growth on CI compounds. Proc. 5th Intern. Symp. // Eds. H. van Verseveld & J. Duine. Dordrecht: Martinus Nijhoff Publishers, 1987. P. 150-157.

109. Harder W., Trotsenko Y., Bystrykh L., Egli T. Metabolic regulation in methylotrophic yeasts. Microbial Growth on CI Compounds. Proc. 5th Intern. Symp. // Eds. H. W. van Verseveld, & J. Duine. Dordrecht: Martinus Nijhoff Publishers, 1987. P. 139-149.

110. Geissler J., Ghisla S., Kroneck P. Flavin-dependent alcohol oxidase from yeast. Studies on the catalytic mechanism and inactivation during turnover. // Eur. J. Biochem., 1986. V. 160. P. 93-100.

111. Pavlishko H., Gayda H., Gonchar M. Alcohol oxidase and its bioanalytical application. // Visnyk of L'viv Univ. Biology series, 2004. V. 35. P. 3-22.

112. Sherry В., Abeles R. Mechanism of action of methanol oxidase, reconstitution of methanol oxidase with 5-deazoflavin, and inactivation of methanol oxidase by cyclopropanol. // Biochem., 1985. V. 24. P. 2594-2605.

113. Svensson K., Bulow L., Kriz D. Investigation and evaluation of a method for determination of ethanol with the SIRE Biosensor PI00, using alcohol dehydrogenase as recognition element. // Biosens. and Bioelectron., 2005. V. 21. P. 705-711.

114. Tsai Y., Huang J., Chiu C. Amperometric ethanol biosensor based on poly(vinyl alcohol)-multiwalled carbon nanotube-alcohol dehydrogenase biocomposite. // Biosens. and Bioelectron., 2007. V. 22. P. 3051-3056.

115. Mitsubayashi К., Коп Т., Hashimoto Y. Optical bio-sniffer for ethanol vapor using an oxygen-sensitive optical fiber. // Biosens. and Bioelectron., 2003. V. 19. P. 193-198.

116. Huang Y., Fangqiong W. Plant Tissue-based chemiluminescence biosensor for ethanol. // J. Anal. Sc., 2006. V. 22. P. 965-969.

117. Wen G., Zhang Y., Shuang S. Application of a biosensor for monitoring of ethanol. // Biosens. and Bioelectron., 2007. V. 23, P. 121-129.

118. Akyilmaz E., Dinckaya E. A mushroom (Agaricus bisporus) tissue homogenate based alcohol oxidase electrode for alcohol determination in serum. // Talanta, 2000. V. 53. P. 505-509.

119. Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas E. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite. // Electroch. Acta., 1998. V. 43. P. 3575-3579.

120. Patel N.G., Meier S., Cammann K. Screen-printed biosensors using different alcohol oxidases. // Sens, snd Actuat., 2001. V. В 75. P. 101-110.

121. Liden.H., Vijayakumar A., Gorton L. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection. // J. of Pharm. and Biomed. Anal., 1998. V. 17. P. 1111-1128.

122. Karyakin A., Karyakina E., Gorton L. Prussian-Blue-based amperometric biosensors in flow-injection analysis. // Talanta, 1996. V. 43. P. 1597-1606.

123. Boujtita M., Hart J., Pittson R. Development of a disposable ethanol biosensor based on a chemically modified screen-printed electrode coated with alcohol. // Biosens. and Bioelectron., 2000. V. 15. P. 257-263.

124. Guzma'n-Va'zquez de Prada A., Pena N., Mena M. Graphite-Teflon composite bienzyme amperometric biosensors for monitoring of alcohols. // Biosens, and Bioelectron., 2003. V. 18. P. 1279-1288.

125. Vijayakumar A., Csoregi E., Gorton L., Heller A. Alcohol biosensors based on coupled oxidase-peroxidase systems. //Anal. Chim. Acta., 1996. V. 327. P. 223-243.

126. Kirgoz U., Odaci D., Timur S. A biosensor based on graphite epoxy. composite electrode for aspartame and ethanol detection. // Anal. Chim. Acta., 2006. V. 570. P: 165-169.

127. Guerrieri A., Monaci L., Quinto М., Palmisano F. A disposable amperometric biosensor for rapid screening of anticholinesterase activity in soil extracts. // Analyst, 2002, V. 127. P. 5-7.

128. Khan G.F., Wernet W. A highly sensitive amperometric creatinine sensor. // Anal. Chim. Acta., 1997, V. 351. P. 151-158.

129. Mao L., Yamamoto K. Amperometric on-line sensor for continuous measurement of hypoxanthine based on osmium-polyvinylpyridine gel polymer and xanthine oxidase bienzyme modified glassy carbon elcctrode. // Anal. Chim. Acta, 2000, V. 415. P. 143-150.

130. Woedtke Т., Julich W.-D., Hartmann V., Stieber M., Abel P.U. Sterilization of enzyme glucose sensors: problems and concepts. // Biosens. & Bioelectr., 2002, V. 17. P. 373382.

131. Yamato H., Koshiba Т., Ohwa M., Wernet W., Matsumura M. A new method for dispersing palladium microparticles in conducting polymer films and its application to biosensors. // Synth. Metals, 1997. V. 87. P. 231-236.

132. Синицин А.П., Райлина Е.И., Лазинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. // М.: «Мир», 1994. С. 138-145.

133. Forcani E., Teijelo M., Nart F., Calvo E., Solis V. Effect of the polycation nature on the structure of layer-by-layer electrostatically self-assembled multilayers of polyphenol oxidase. // Biomacromol., 2003. V. 4. P. 869-879.