Электрохимические ДНК-сенсоры на основе электрополимеризованных материалов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах

ПОРФИРЬЕВА АННА ВЕНИАМИНОВНА

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТ РОПОЛ1ШЕР1ВОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ

02 00 02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань - 200?

003170186

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственно! о ного учреждения высшего профессионального образования "Казанский ный университет им В И Ульянова-Ленина"

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Евтюгин Геннадий Артурович

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Гормонов Сергей Юрьевич

доктор химических наук, профессор Бабкина Софья Сауловна

Ведущая организация Уральский государственный экономический

университет (г Екатеринбург)

образователь-государствен-

Защита диссертации состоится "/У" ¿/¿Of-¿oC- 2008 г в—ч на заседании диссертационного совета Д 212 081 03 при Ка)анском государственном университет гго адресу г Казань, ул Кремлевская, 18, Химический институт им А М Бутлерова, Ьутлеровская аудиюрия

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им Н И Лобачевского Каштского государственного университета

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу 420008, г Kajanb, ул Кремтевская, 18, КГУ, Отдел аттестации научных кадров

Автореферат разослан " ¿¿СЬЯ- 2008 г

Ученый секретарь диссертационного Ж/l^f МАКазымова

совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ01Ы

Актуальность проблемы Одним из актуальных направлений развития современной биоаналитической химии является создание ДНК-сенсоров, предназначенных для определения комплементарных нуклеотидных последовательностей, а также специфических белков и низкомо пекулярных соединений биологического значения Благодаря высокой концентрации заряда и значительному числу активных функциональных групп нуклеиновые кислоты обеспечивают многоточечное нековалентное связывание широкого круга определяемых соединений В последние годы большое внимание привлекают электрополимеризуемые материалы, получаемые т situ непосредственно на поверхности преобразователя сигнала К их достоинствам относятся простота получения, контроль состава и характеристик непосредственно на стадии синтеза, высокая адгешя к материалу электрода и возможность модификации параметров, таких как заряд и этектрохимическая активность, в зависимости от назначения и природы биологического компонента в составе биосенсора Несмотря на быстрое развитие данного направления, применительно к ДНК-сенсорам примеров использования этек-трополнмери ¡«ванных материалов относительно немного Вышесказанное определяет актуальность исследования, направленного на наиболее полную реалишшю преимуществ, создаваемых электрополимеризованными материалами в составе ДНК-сенсоров при иммобилизации и получении аналитического сигнала в отношении высоко- и низкомолекулярных соединений

Целыо данной работы явилось создание электрохимических ДНК-сенсоров, предназначенных для решения задач клинической диагностики, в основе которых лежит взаимодействие ДНК с полиэлектролитными электрохимически активными материалами, получаемыми путем электрополимеризации

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

- изучить условия эчектрополимеризации фенотиазиновых красителей и анилина на поверхности золотых и стеклоуглеродных электродов в зависимости от назначения Д1 IK-сенсора и способа i енерирования аналитического сигнала,

- разработать новые способы нанесения биологических компонентов - ДНК-зондов, нативной и денатурированной ДНК и аптамеров на а-тромбин - поверх электропо-лимеризованных материалов с учетом требовании чувствительности регистрации взаимодействий с определяемыми соединениями и формата измерения аналитического сигнала,

- изучить возможности регистрации гибридизации комплементарных ДНК-зонду олигонуклеотндных последовательностей на поверхности сенсоров, модифициро-

ванных сополимером шрамина и о-аминофенола, с помощью диффузионно свободных маркеров,

провести сравнительную характеристику пьезометрического и потенциометриче-ского определения и-тромбина с помощью аптасепсоров на основе комплексов ап-гамеров с элсктрополимеризованными анилином, метиленовым синим и метилено-вым зеленым,

-- разработать новый способ обнаружения аутоиммунных антигел к ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями с помощью потенциометрических сенсоров на основе полиэлектролитных комплексов ДНК с электрополимеризован-татми материалами и изучить механизм формирования сигнала с привлечением данных нмпеднметрических исследований переноса заряда на границе модифицирующий слой - электрод

Научная новизна работы заключается в том, что

- обосновано использование в составе ДНК-сенсоров продуктов электрополимери ¡а-ции фенотиазиновых красителей (метиленового синего и метиленового зеленого) и анилина, обеспечивающих улучшенные характеристики иммобилизации и аналитического сигнала для пьезометрического и потенциомефического определения взаимодействия ДНК (аптамер) - белок,

- показана возможность использования ДНК-сенсора на основе пленарных золотых электродов, модифицированные сополимером тирамина и о-аминофенола, для регистрации комплементарных олигонуклеотидных последовательностей по сигналу диффузионно свободных маркеров

- предложены и реализованы на примере определения а-тромбина и аутоиммунных антител к ДНК различной этиологии новые способы регистрации взаимодействий ДНК-белок, основанные на измерении потенциала ДНК-сенсора до и после его контакта с определяемыми компоне1ггами,

- обоснован механизм формирования сигнала потенциометрического ДНК-сенсора на основе полиэлектролитных комплексов ДНК - полианилин (полифенотиазин), связанный с изменением редокс-активности и допируютцей способности полимеров в зависимости от рН и присутствия специфически связывающегося белка в составе поверхностною слоя,

- разработаны пьеюметрические сенсоры для определения а-тромбина с улучшенными характеристиками связывания и чувствительности определения, достигнутыми за счет использования электрополимери ¡ованных полифенотиазинов в качестве матрицы биологических компонентов

Практическая значимость работы состоит в том, что

- предложены простые и удобные в использовании способы модификации золотых и стсклоугдеро дных электродов полиэлектролитными комплексами ДНК (аптамер) -иолианилин (полифенотиазиновый краситель), обеспечивающие возможность регистрации специфических взаимодействий с участием ДНК и высокочувствительного определения биоло1 ических компонентов диагностического значения,

- рлработашл методики тестирования сывороток крови для установления присутствия в них аутоиммунных антител к ДНК, предложены диагностические критерии сигнала ДНК-сенсоров для больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой,

- предложен новый формат изготовления пленочных золотых одноразовых сенсоров на основе пластин компакт-диска для записи и разборная ячейка для их использования

На 1ащигу выносятся

- результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновыч красителей и анилина на различных электродах и выводы о влиянии условий электрополимери-!ации на генерирование аналитического сигнала и возможность регистрации гибридизации комплементарных олигонуклеотидных последовательностей и специфических взаимодействий ДНК - белок (аптамер - белок),

- оценка влияния природы маркеров на сигнал ДНК-сенсора на основе пленарных золотых электродов, модифицированных ДНК-зондами и сополимером тирамина и о-аминофеиола и вывод о возможности регистрации взаимодействий с участием ДНК и олигонуклео гидов по электрохимическим характеристикам маркеров,

- результаты пьезометрического и импедиметрического изучения аптасенсоров на основе электродов, модифицированных полифенслиазинами или полианилином и аптамером на а-тромбин и выводы о влиянии природы матрицы на чувствительность определения а-тромбина и селективность сигнала в присутствии сывороточного альбумина человека,

- новый способ регистрации аффинных взаимодействий ДНК (аптамер) - белок по изменению потенциала стеклоуглеродного электрода, модифицированного поли-электролигным комплексом ДНК - полимер, до и после его контакта с белком, измеренного при различных рН и выводы о возможном механизме формирования сигнала для различных электрополимеризованных материалов

Апробация работы Результаты исследований докладывались на \1 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Флоренция, 2003), Международном симпозиуме "Новые тенденции развития биосенсоров на основе нуклеиновых кислот" (Флоренция, 2003), Всероссийской конференции с международным

участием "Электроаналитика-2005" (Екатеринбург, 2005), V научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005), Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2005), Международной конференции "Химия, химическая технология и биотехнология" (Томск, 2006), Международном конгрессе по аналитической химии ICAS-2006 (Москва, 2006), VI Республиканской школе студентов и аспирантов "Жить в XXI веке" (Ка;ань, 2006), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), II Всероссийской конференции с международным участием "Аналитика России" (Краснодар - "lvance, 2007), 111 Международном симпозиуме "Биосенсоры в обеспечении пищевой бе ¡опасности и жологическом мониторинге" (Фес, 2007)

Диссертация выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственною университета при поддержке РФФИ (грант № 06-03-32217 "Электрохимические ДНК-сенсоры с ферментативным усилением сигнала"), научно-обрачо-вательной программы CRDF и Минобрнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века", R.EC-007) Исследования в области создания пьезометрических сенсоров на гх-тромбин проводили на кафедре ядерной физики и биофизики университета Комениуса (Братислава, Словакия) В работе использовали оборудование Федерального центра коллективного пользования уникальным научным оборудованием Казанского государственного университета

Основные ре1ультаты изложены в 3 статьях и 10 тезисах докладов Получено положительное решение по заявке на патент РФ

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке и решении основных задач, проведении основных экспериментальных исследований в области создания ДНК-сенсоров и изучении их характеристик, интерпретации, анализе и систематизации полученных результатов

Структура II объем диссертации Диссертационная работа иможена на 166 страницах машинописного текста, включает 69 рисунков и 8 таблиц

Во Введении раскрыта актуальность темы исследования, определены цели и задачи, сформулированы научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту

В Литературном обзоре (глава 1) рассмотрены основные направления создания электрохимических ДНК-сенсоров для определения высоко- и низкомолекулярных соединений, а также обобщены результаты использования электрохимически по-лимеризованных материалов в составе биосенсоров

В Экспериментальной части (глава 2) представлены данные об объектах исследования, используемых методах и измерительном оборудовании, приведены условия эксперимента

Главы 3-5 посвящены обсуждению полученных результатов

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальная часть

Использовали ДНК из эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия), олигонуклео-тиды, предоставленные НПВП "Литех" и аптамеры, синтезированные Thermo Electron Corporation (Германия) и предоставленные для нсслс юваиия проф Т Хиаником (Университет Комениуса, Братислава, Словакия) Сыворогки крови человека (больных аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых доноров), а также сыворотки крови здоровых и иммунизированных кроликов были предоставлены кафедрой эндокринологии Казанской государе геенной медицинской академии (зав каф, проф Л И Анчикова) Электрополимеризацию анилина и фенотиазиновыч красителей проводили в режиме многократного циклирования потенциала соответственно из сичьных минеральных кислот и фосфатного или трис- буферного растворов

В качестве рабочих электродов для изготовления сенсоров исполыовали золотые пленочные электроды (0 07 см2) из компакт-дисков (CD-троды, разборная ячейка дая работы с электродами приведена на рис 1), пьезосенсоры с золотыми возбуждающими электродами, а также стеклоуглеродные электроды (0 0176 см") СУ2500 (НИИ Графит, г Москва), впрессованные втефлоновый корпус

Противоапектрод

Рабочий Объем Рисунок 1 - Конструкция разборной (500 мкл) ячейки для работы с пленарными золо-

тыми тонкопленочными электродами Тефлон - --------(CD-тродами)

Вольгамперометрическне измерения проводили в нетермостатированной трех-электроднои ячейке с платиновым противоэлектродом и хлоридсеребряным электродом сравнения с помощью вольтамперографов BAS CV-50W (BAS Inc, США), Эко-тест-ВА ("Эконикс-Эксперт", Москва) AUTOLAB POSTA Г 302 и (.lAUTOLAB (Есо-Chcmie, Голландия), пьезометрические измерения - с помощью электрохимического пьезоанализатора CHI-410 (СН Instruments Inc , США) с пьезокварцевым резонатором на основе АТ-среза кристалла кварца (f, = 8 мГц) с золотыми возбуждающими электродами (0 28 см2), импедиметрические - с помощью модуля FRA2 (AUTOLAB POSTAT 302)

Общая ьарок! эристика разработанных биосенсоров, приведена в табл 1 (ПАНИ - полианилин, ноли(МС) и поли(МЗ) - полимерные формы метиленового синего и метиленового зеленого, соответственно) Иммобилизацию ДНК, олигонуклеотидов и апгамеров проводили методами электростатической адсорбции с последующей кросс-сшивкой глугаровыч альдегидом или авидин-биотинового связывания поверх слоя электрополимеризоианног о материала

Таблица 1 ДНК-сенсоры на основе электрополимеризованных материалов

Преобразователь С пособ регистрации Модификатор Биокомпонент Назначение

CD-трод Вольтамперо-метрический Сополимер тирамина и о-амнпофепола ДНК, оли- гонуклео- тиды Определение гибридизации олию-нуктеошдов

Стеклоуглерод [ (отенцио-мегрический ПАНИ, поли(МЗ), поли(МС) ДНК Определение ау-тоиммунньгх антитез к ДНК

Стеклоуглерод Потетщио-vit-трпческий, импедиметри-ческий поли(МЗ), поли (МС), ПАНИ Аптамеры Определение тромбина

Пьезо кварцевый резонатор Пьезометрический поли(МЗ), поли (МС) Аптамеры Определение тромбина

ДНК-сенсоры на основе золотых электродов, модифицированных сополимером тирамина и о-аминофенола

Предварительно было изучено электрохимическое поведение метиленового зеленого (МЗ) на золотых микродисковых электродах Было показано, что обратимое окисление маркера (I) осложнено адсорбцией и ускоряется в присутствии ДНК и олигонуклеотидов за счет адсорбционного накопления деполяризатора

Предложены протоколы измерения сигнала в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии и количественные характеристики влияния олигонуклеотидов

Чтобы оценить возможность регистрации гибридизационных взаимодействий по сигналу МЗ, электрод, модифицированный TGTAAAGCCCCGCATTGCTC (ДНК-зонд), инкубировали в растворе комплементарного олигонуклеотида GAGCAATGCGGGGCTTTACA При этом сигнал маркера снижался на 15-20% вследствие частичного экранирования заряда фосфатного остова ДНК-зонда и увеличения толщины поверхностного слоя в результате встраивания в него комплементарною олигонуклеотида Предел обнаружения составил 2 наномоль при количестве ДНК-зонда на электроде 0 2 наномоль Некомплементарный олигонуклеотид dT20 влияет на ток окисления МЗ незначительно

Чтобы повысигь поверхностную концентрацию ДНК-зонда, впервые предложено использовать для иммобилизации сополимер тирамина и о-аминофенола, наносимый на пленочные золотые электроды, изготовленные из компакт-дисков для перезаписи (CD-RW) Электроды закрепляли в разборной ячейке из политетрафторэтилена (рис 1), в качестве уплотнителыюй мембраны использовали пленку Paraftlm и политетрафторэтилен Продукт полимеризации, проводимой при сканировании потенциала, предположительно имеет строение (2)

В отличие от ранее описанного политирамина сополимер (2) не пассивирует электрод и позаотяет проводить измерения токов маркера после присоединения ДНК-¡онда кросс-сшивкой глутаровым альдегидом В модельных экспериментах с нативной ДНК вместо ДНК-зонда на поверхности сенсора в серии многократных ишерений из одного раствора наблюдается увеличение сигнала МЗ за счет электростатического накопления деполяризатора Аналогичные изменения наблюдались при использовании в качестве маркера гидрохинона Инкубирование сенсора, включающею ДНК-зонд, приводит к некоторому уменьшению сигнала Разнонаправленное изменение сигнала гидрохинона в присутствии на поверхности одно- и двуни-тевых олигонуклеотидов позволяет использовать сенсор для регистрации тибридизации (обнаружения олигонуклеотидов, комплементарных ДНК-зонду) В качестве примера на рис 2 представлена концентрационная зависимость сигнала, полученная с гидрохиноном

Изменение сигнала маркеров в серии последовательных измерений из одного раствора обусловлено, по-видимому, разным характером накопления электрохимически активных компонентов в поверхностном слое биосенсора

I 105

90

75

60

-10

-9

-8

1дС, М

Рисунок 2 - Зависимость тока окисления гидрохинона от концентрации комплементарного ДНК-зонду олигонуклеотида М-1 Г илрохинон 6 0 \:М

Лнтлсснсоры для определения а-тромбина на основе электрополимерщоваиных материалов

а-Тромбин является удобной моделью для разработки новых принципов измерения сигнала апгасенсоров, а также имеет значение для контроля коагуляции крови и тромбообразования, в том числе, в хирургической практике Эффективность связывания аптамера с тромбином во многом определяется условиями иммобилизации аи-тамера на поверхности сенсора Для изучения связывания сначала было проведено исследование взаимодействия аптамера и тромбина на полимерных материалах, получаемых на основе фенотиазиновых красителей и анилина

Аптасенсоры на основе полимерных форм фенотиазиновых красителей Полимеризацию МЗ и МС проводили путем циклирования потенциала из их слабощелочных растворов Наиболее стабильная пленка и воспроишодимые параметры сигнала аптасенсоров на ее основе были получены для десяти циклов полимеризации Пьезометрическая оценка поверхностной концентрации продукта полимеризации МС - поли(МС) - дала удельное количество полимера (7 2±1 4), для МЗ - (0 11±0 07) на-номоль см"г МЗ даег, по-видимому, эквимолярный комплекс окисленной и восстановленной форм красителя, далее называемый также поли(МЗ) Для последующей иммобилизации З'-биотинированного аптамера, специфически связывающего тромбин, 5'-ООТТООТСТООТТООТТТТТТТТТТ1 ТТТТ-3' электрод сначала модифицировали авидином, осаждаемым из раствора при циклировании потенциала По сравнению с электростатической адсорбцией при постоянном анодном потенциале данный способ существенно сокращает продолжительность процедуры После иммоби-лшации авидина электрод инкубировали в растворе аптамера Полученный аптасен-

и

сор инкубировали в растворах а-тромбина и сывороточного альбумина человека (ША) Типичные концентрационные зависимости приведены на рис 3

В табл 2 приведены сравнительные аналитические характеристики определения а-тромбина на полимерных матрицах и на золотом электроде, модифицированном авидином и его тиолированном аналогом - ныотравидином

По сравнению с авидином и ныотравидином, иммобилизованными на чистом ¡олотом электроде, положительно заряженные полифенотиазиновые красители подавляют неспецифическую сорбцию белка

Рисунок 3 - Зависимости сигнала пьезокварцевых аптасепсоров от концентрации а-тромбииа и сывороточного альбумина человека (НЭА)

Таблица 2 Определение а-тромбина с помощью аптасепсоров на основе пьезокварцевых резонаторов с различными модифицирующими покрытиями

Модификатор Д^ Гц, = а + Ьх С, нМ

а -Ь Б Я

Поли(МЗ)+авидин 5 5±1 7 0 80±0 04 1 077 -0 9858

Поли(МС)+авидин 21 0±4 0 1 70±0 11 0 711 -0 9916

Поли(МЗ)+авидин+Н8А 2 0±1 2 0 711.0 04 2 349 -0 9397

Поли(МС)+авидин+Н8А 7 8±6 4 1 50±0 16 12 590 -0 9544

Авидин 14 5±3 1 0 82±0 09 0313 -0 9956

Ньютравидин 14 3±3 2 0 81±0 09 0 308 -0 9962

Потенциометрические измерения тромбина проводили на стеклоуглеродных электродах, покрытых электрополимеризованными фенотиазиновыми красителями Кулопометрические измерения показали образование 35 наномоль поли(МЗ) и 75 на-номоль поли(МС) в расчете на мономер на 1 см2 поверхности стеклоуглерода Сигнал

сенсора обусловлен влиянием биокомпонснтов на распределение рН вблизи поверхности сенсора и рН-ювисимое равновесие окисления/восстановления модификатора Ко сравнению с пьезосенсорами, потенциомегрический сигнал более чувствителен к неспецифическим белкам Максимальное смещение потенциала аптасенсора относительно контроля и щученном интервале концентраций ША не превышало 7 мВ при погрешности измерения 5%

Присутствие а-громбина увеличивает сигнал за счет образования комплекса с аптамером Максимальное изменение потенциала аптасенсора составило 26 мВ (±3 5% для трех независимых измерений) Для подавления десорбции биокомпонентов поверхностного слоя процедуру иммобилизации изменили - на электрод наносили смесь авидина и Н8Л, в которую вносили глутаровый альдегид Не ¡ависимо от способа иммобилизации погенциометрический сигнал аптасенсора пока ¡ал максимум в области связывания а-1ромбина, установленной по результатам пьезокварцевого мик-ровэвешиваиия Предельные значения сшнала аптасенсора для двух способов иммобилизации практически совпадали

Аптасенсор на основе ПАНИ Полимеризацию анилина проводили в серной кислоте при десяти циклах сканирования потенциала, соответствующих осаяодению I 2М) 2 мкмоль/см2 полимера в расчете на мономерное ¡вено Измерение сигнала проводили, инкубируя апгасенсор в растворе тромбина при рН 7 6 (максимум связывания) и измеряя сигнал при рН 3 0 (область электрохимической активности полимера) Ишенение сигнала потенциометрического аптасенсора оказалось незначительным в силу недостаточной прочности связывания тромбина в кислой среде Результаты измерения для различных условий иммобилизации компонентов слоя приведены на рис 4

ш г

рНЗО

рН 7 6

-7 -в

|дс, м

Ю 21 5

Ш 18 15

12$

6

рНЗО

-7 -в 1д С, М

Рисунок 4 - Зависимость сигнала потенциометрического аптасенсора на основе ПАНИ и авидина, иммобилизованного путем электростатической сорбции (А) и в матрице альбумин - глутаровый альдегид (Б), о г концентрации тромбина Сплошная и пунктирная линии показывают изменение потенциала в контрольном измерении

Присутствие в поверхностном стое HSA, составляющего матрицу для иммобилизации авидина, приводит к сипчронному смещению зависимости к большим значения потенциала При этом сохраняются как относительные вариации потенциала с концешрациеи тромбина, так и положение максимума

Измерение электрохимического импеданса модифицированных электродов проводили в присутствии эквимолярнои смеси [Fe(CN)s]3"'4" Для расчета параметров импеданса использовали эквивалентную схему Рэнделса (Randies) (3), где Rs - сопротивление переноса заряда в растворе, Rct -сопротивление переноса заряда в полимерном слое, Zw - сопротивление Варбурга, связанное с переносом ионов из раствора в полимерную пленку (обычно им пренебрегают), СРЕ - постояннофазовый элемент, приближающийся в данном случае к ем ко о и поверхностного слоя

Поскольку ПАНИ обладает собственной электропроводностью, модель Рэнделса не вполне точно описывает поведение сенсора, но позвотяет оценить параметры импеданса для различных составов поверхностного слоя сенсора В наибольшей степени присоединение тромбина влияет на сопротивление переноса заряда, описываемое для электростаттгческой адсорбции авидина ур (4) Погрешность измерения составила 10% для шести измерений, интервал концентраций тромбина 10 10 - 10"7 М

При электростатической адсорбции нанесение авидина снижает сопротивление переноса заряда н емкость в результате частичной нейтрализации заряда поверхностного слоя Закрепление аптамера меняет сопротивление разнонаправлено в зависимости от рН В кистой среде сопротивление несколько снижается, возможно, из-за дополнительного привнесения отрицательного заряда олигонуклеотида, тогда как в щелочной среде сопротивление резко возрастает, во ¡можно, в силу диффузионного торможения переноса маркера Значение емкости меняется противоположным образом -увеличивается в кислой среде, что соответствует увеличению числа носителей заряда, одноименного заряду феррицианида, и снижается в щелочной в результате общей нейтрализации поверхностного слоя Внесение тромбина в раствор приводит к закономерному изменению параметров импеданса, частично или полностью компенсирующему описанное влияние на импеданс авидина и тромбина Наиболее закономерно изменение сопротивления и емкости поверхностного слоя в кислой среде

СРЕ

(3)

рН 3 0 R«, кОм, = 29 0 + 2 6х ^[Тромбин] рН 7 6 R,,,, МОм, = 12 + 0 lxlg[l ромбин]

(4)

Определение аутоиммунных антител к ДНК

Обнаружение ауюиммунных шгтител к ДНК является важным диагностическим признаком, устанавливающим аутоиммунную природу заболевания При создании ДНК-сенсора для определения аутоиммунных антител к ДНК использовали на-швную ДНК, иммобилизованную поверх полианит ша и полифенотиазинов Выделение, стандартизацию и обработку сывороюк больных аутоиммунными заболеваниями - системной красной волчанкой (СКВ) и аутоиммунным тиреоидитом (АИТ), а также V становление их титра проводили по стандартным методикам на кафедре эндокрино-Ю1 ии Казанской государс 1венной медицинской академии

ДНК-сенсор на основе ПАНИ изготавливали на основе стеклоуглеродного шектрода аналогично аптасенсору на тромбин ДНК электростатически адсорбирова-1И поверх слоя полимера и закрепляли кросс-сшивкой глутаровым альдегидом Как показало сравнение вольтамперограмм и параметров электрохимического импеданса, ДНК образует с ПАНИ полиэлектролитный комплекс, стабилизируя его протониро-ванную форму Это выражается в характеристических изменениях пиков вочьтампе-рограмм и рН-зависимости сопротивления переноса заряда и СРЬ

В присутствии 1 0-2 0 мкг/см2 ДНК при рН 2 - 3 наблюдалась инверсия зависимости потенциала сенсора от рН, возможно, и ¡-за в тияния ДНК на доступность различных участков полимера в реакции с допирующими кислотами

Общая схема регистрации взаимодействия ДНК - белок представлена на рис 5 Количественную характеристику изменения потенциала после инкубирования сыворотки крови и ДНК на электроде проводили следующими способами

- по положению минимума на кривых изменения потенциала во времени (метод минимумов)

- по смещению кривой изменения потенциала после прохождения минимума, анпроксимируемои линейной функцией (метод вычета базовой линии, см рис 6)

- по разности потенциалов, зафиксированных через 20 мин до и после инкубирования с сывороткой крови (метод фиксированного времени)

Если для измерения испольювать термостатированную сыворотку крови больного СКВ, содержащую аутоиммунные атттитела с наибольшим сродством к нативной ДНК, кривая изменения сигнала ДНК-сенсора при различных разведениях сыворотки имеет характерный сигмоидный вид, типичный для иммуноаналиэа (рис 7)

В случае нетермостатированной сыворотки зависимость имеет колоколообраз-ный характер Спад сигнала в области малых разбавлений связан с влиянием белков сывороточного комплемента, которые в силу собственной буферной емкости компенсируют изменения а потоке ионов водорода в пределах поверхностного слоя

рН

рН 7 5 рН 7 5

1 2

рНЗО

,)Н30

Рисунок 5 - Измерение сигнала потен-циометрического ДНК-сснсора на основе ПАШ

1 - иммобилизация ДНК,

2 - измерение потенциала сенсора,

3 - инкубирование ДНК-сенсора,

4 - измерение сигнала ДНК-сенсора

160

ДЕ

? 180

140

0 1000 2000 3000 0 1000 2000 3000

с 1, с

Рисунок 6 - Определение количественных характеристик взаимодействия ДНК-аутоиммуные антитела по динамических кривым изменения потенциала ДНК-сенсора А - метод минимумов, Б - метод вычитания базовой линии

т 52 г

ш 43 44 40 36

1 5 1 10 1 20 1 50 1 100 1 500 Разбавление

80 70 60 50 40

1 5 1 10 1 20 1 50 1 100 1 500 Разбавление

Рисунок 7 - Зависимость сигнала ДНК-сенсора от разведения термостатированной при 56°С (I) и нетермостатированной (2) сыворотки крови больного СКВ Ме

тод минимумов

Аналогичные зависимости были получены для сывороток больных АИТ Мак снмум изменения сигнала приходится на разведение т 20 - 1 50 В контрольном изме рении вместо разбавленной сыворотки крови использовали рабочий буферный рас

твор При этом изменение сигнала ДНК-сенсора составляло для метода минимумов около 40 мВ, для метода вычитания базовой линии - 13 мВ при погрешности измерения сигнала ±3 мВ Если сыворотка крови не содержала антител к ДНК, изменения сигнала ДНК-сенсора носили нерегулярный характер и незначительно от тачались от сигнала в контрольном измерении

Сигнал также 01сутств0вал при замене одного из компонентов поверхностного слоя другим, не способным к специфическим взаимодействиям (включение вместо ПАНИ желатина или вместо ДНК нафиона) Вероятно, изменение потенциала комплекса Г1АНИ+ДНК после инкубирования в сыворотке связано с влиянием антител на буферные свойства поверхностного слоя и доступность центров связывания для до-пирующих реагентов Для участия допируюших ионов в генерировании сигнала были проведены эксперименты с ПАНИ, полученным в присутствии щаветевои, соляной и тетрафторбористоводородной кислот Наилучшие результаты тестирования сывороток были получены, если в качестве электрочита использовали соли кислот, присутствовавших в растворе на стадии полимеризации Если же ПАНИ синтезировали в присутствии соляной кислоты, а измерения проводили на фоне сульфата натрия, динамика изменения сигнала сывороток больного и здорового донора совпадала

Способ обнаружения аутоиммунных аитшел по потенциалам ДНК-сенсора был апробирован на реальных образцах сыворотки крови больных АИТ Во всех случаях кривые разбавления сывороток с высоким значением ГПО (титр антител к тироидяой пероксидазе) отличались закономерным увеличением сигнала в средней области разбавлений (1 20 - I 50) Сигналы сывороток, показавших низкий титр ашител, либо не отличались значимо от контрольного измерения, либо были ниже него в интервале разбавлений, отвечающем максимуму отклика на антитела Результаты тестирования сывороток крови больных аутоиммунными заболеваниями позволили сформулировать критерии выявления антител к ДНК в зависимости от их этиологии (табл 3)

Разработанный метод определения антитет к ДНК был также апробирован в контроле иммунизации лабораторных животных Кривые разведения, полученные на сыворотках крови кроликов до и после их иммунизации комплексом ДНК - ДНКаза I, демонстрировали схоцный максимум сигнала при разбавлениях около 1 50, хотя абсолютные значения сигнала были меньше, чем в случае антител к ДНК человека

В области допирования ПАНИ введение ДНК снижает сопротивление переноса заряда за счет стабилизации солевой формы эмералдина, присутствие антител незна-чотельно влияет на данный параметр

ДНК-сенсоры на основе электродов, модифицированных полифенотиазина-ми По сравнению с апгасенсором на тромбин следовало ожидать большего влияния ДНК на характеристики электрохимического превращения полифенотиазинов в силу

более высокой плотности заряда биополимера Схема измерения не отличалась от измерений с помощью сенсоров на основе ДНК (рис 5) Кривые изменения потенциала во времени в отличие от аналогичных зависимостей, полученных на ПАНИ, не содержали минимумов и монотонно возрастали Сигнал измеряли методом фиксированною времени На рис 8 представлены зависимости сигнала от разбавления сывороток крови больного АИТ(ТПО 1200) и здоровою донора

Таблица 3 Диагностические критерии выявчения аутоантитет к ДНК СКВ - системная красная волчанка, ЛИТ - аутоиммунный тиреоидит

Заболевание Разбавление сыворотки Метод вычитания базовой чшши Метод минимумов

Е, мВ % Е, мВ %

Здоровый донор 1 20 13 3 45 0

1 50 15 15 53 17

СКВ 1 20 26 94 81 80

1 50 23 72 75 67

АИТ 1 20 23 70 69 53

1 50 19 50 71 58

Результаты потенциометрического определения антител коррелируют с данными импедиметрических измерений (табл 4)

Таблица 4 Характеристики импеданса ДНК-сенсоров Разбавление сыворотки 1 20

Модификатор рН 3 0 рН 7 2

Ка, кОм СРЕ, мкФ Ке„ К ОМ СРЕ, мкФ

ПАНИ 186 27 247 23

ПАПИ+ДНК 12 8 36 372 1 8

ПАНИ+ДНК+АИТ (ТПО 1200) 145 79 268 1 8

ПАНИ +ДНК+ СКВ 88 20 0 244 33

При погрешности измерения 10% (дтя шести измерений) наблюдаемые изменения сопротивления после контакта ДНК-сенсора с разбавленной сывороткой незначимы При переходе от ПАНИ к комплексу ПАНИ+ДНК емкость возрастает в 1 5 раза в силу увеличения числа носителей заряда в поверхностном слое К тому же эффекту приводит инкубирование ДНК-сенсора в сыворотке, причем для антител к нативной

ДНк (сыворо1ки крови больного СКВ) различие в значениях емкости намного больше, чем для сыворотки больного А141 При рН 7 2 осаждение ДНК поверх стоя ПАНИ увеличивает сопротивление переноса заряда почти в 1 5 раза ДНК придает отрицательный заряд поверхностному слою незаряженного ПАНИ, что тормозит перенос в пленку феррициатмда Анттела независимо от их происхождения частично компенсируют отрицательный заряд ДНК, что нескочько снижает сопротивление Изменения емкости при рН 7 2 незначимы Они огражаюг постоянство распределения заряда в слое ПАНИ, который остается при данном рН незаряженным при всех вариациях состава биокомпонентов слоя

1 40

Поли(МС)

1 5 1 10 1 20 1 50 1 100 1 500 Разбавление

Поли(МЗ)

1 5 1 10 1 20 1 50 1 100 1 500 Разбавление

Рисунок 8 - Зависимость сигнала ДНК-сенсора на основе тюли(МС) и поли(МЗ) от ра5бавления сыворотки крови больного АИI (1ПО 1200) и адорового донора (ТПО 3)

Наибольшее различие в ходе кривых наблюдалось при ра)бавлениях 1 20 1 50 Поли(МЗ) дает несколько лучшее разрешение кривых, чем поли(МС) Термоста-тирование сыворотки приводит к монотонному изменению сигнала сенсора в соответствии с (5)

F, мВ = (44 0±1 0) + (10 5± 1 2)lgV n=7, R = 0 9709 (5)

Здесь V - абсолютное значение ратбавлсния сыворотки (например, для разбавления 1 I V = 1/(1+1) = 0 5), обратно пропорциональное концентрации антител

ДНК-сенсоры на основе полифенотиазннов позвопяют надежно различить сыворотки больных и здоровых доноров в области средних разбавлений, совпадающих с условиями определения тех же антител с помощью сенсоров на основе ПАНИ

Изучено влияние количества ДНК в поверхностном счое и продолжительности инкубирования ДНК-сенсора на регистрируемый сит на ч И для поли(МС), и для поли(МЗ) с увеличением продолжительности инкубирования сигнал растет до 10-12 минуты, после чего падает в 1 5 раза, по-видимому, вследствие слишком плотного заполнения поверхностного слоя белком Влияние содержания ДНК максимально в области средних концентраций (рис 9) По-видимому, более пологий пик в случае

поли(МС) объясняем ся его более высокой поверхностной концентрацией, а значит, повышенной способностью связывать ДНК Последующее снижение отклика связано с диффузионным торможением переноса ионов водорода через слой ДНК Биосснсоры на основе поли(МС) и поли(МЗ) демонстрируют также близкую зависимость сигнала от концентрации индифферентного электролита

С (ДНК), мг/мл С(ДНК), мг/мл

Рисунок 9 - Влияние концентрации ДНК в смеси для иммобилизации на сигнал ДНК-сенсора на основе поли(МЗ) и полн(МС) Сыворотка крови больного АШ, ТПО 1200,

разбавление 1 50

В табл 5 представлено сравнение характеристик сигнала ДНК-сенсоров на основе различных модификаторов при тестировании сывороток крови больного АИТ (ТПО 1200) и здорового донора (ТПО 3) при райавлении 1 20

Таблица 5 Сравнительная характеристика сигнала ДНК-сенсоров на основе различных модифицирующих слоев 1 - Метод вычитания базовой линии, 2 - Метод минимумов, 3 - Метод фиксированного времени

Модификатор ТПО 1200 ТПОЗ

1 2 3 1 2 3

ПАНИ + ДНК 20 55 13 45

Поли(МЗ) + ДНК 51 12

Поли(МС)+ ДНК 43 31

Желатин + ДНК 33 22

ПАНИ + Нафион 10 37 24 12 54 31

Хотя метод минимумов более удобен для использования, он дает меньшее разрешение сигналов сывороток крови здорового и больного доноров ДНК-сенсор на основе поли(МЗ) дает не только большие абсолютные значения сигнала, но и лучше других различает специфическое и неспецифическое связывание белков При этом

следует отметить, что тот же сенсор имеет несколько худшие показатели воспроизводимости и стабильности поверхностно! о слоя Результаты импедиметрических измерений в системе полифенотиазины - ДНК - антитела приведены в 1абл 6

Таблица 6 Характеристики электрохимического импеданса ДНК-сенсоров на основе полифенотиазинов Сыворотка АИТ (ТГ10 1200)

Модификатор рНЗО рН 7 2

Ru, кОм СРЕ, мкФ Ret, кОм СРЕ, мкФ

Поли(МЗ) 210 17 180 14

Поли(МЗ) + ДНК 222 18 91 14

Поли(МЗ) + ДНК + AT 289 17 122 8

Поли(МС) 87 25 58 19

Поли(МС) + ДНК 172 13 139 6

Поли(МС)+ ДНК + AT 130 6 42 3

Для поли(МЗ) внесение в состав поверхностного слоя ДНК незначительно влияет на сопротивление и СРЕ при рН 3 0 и в 2 раза снижает сопротивление при рН 7 2 Закрепление антител поверх ДНК у величивает диффузионное сопротивление переноса редокс-маркера (эквимолярной смеси Fe(CN)6W4") и значения R,.t независимо от рН раствора В щелочной области, где аффинность в¡аимодействия ДНК-белок выше, при этом несколько снижается емкость поверхностного слоя, вероятно, за счет экранирующего действия белков, компенсирующих отрицательный заряд биополимера Согласованное изменение сопротив гения переноса заряда и емкости поверхностного слоя при переходе от рН 7 2 к рН 3 0 в присутствии антител к ДНК косвенно подтверждает предположение о том, что сигнал ДНК-сенсора определяется смещением редокс-потенциала полифенотиазина, а не переносом низкомолекулярных допи-рующих агентов, как в случае полианилина

Для поли(МС) изменение сопротивления переноса заряда происходит в том же направлении, что и для поли(МЗ), но несколько больше по величине Очевидно, более высокая поверхностная концентрация данного модификатора усиливает вклад электростатических взаимодействий с ДНК в пределах поверхностного слоя Присоединение антител к слою поли(МС)+ДНК ведет к снижению емкости поверхностного слоя в 2 раза Вероятно, ДНК не полностью ткрывает поли(МС), так что взаимодействие белка происходит не только с ДНК, но и неспецифически с полимерной формой красителя

ВЫВОДЫ

1 Модификация золотых п стеклоуглеродных электродов электрополимеризованными материалами улучшает ус ювия иммобилизации ДНК, олигонуклеотидов и аптамеров и позволяет получить потен циометрический и пьезоме|рический сигнал об их взаимодействии со специфически связывающимися белками (антитела к ДНК, а-тромбин) или комплементарными олигонуклсотидами

2 Иммобилизация ДНК-зонда на тонкопленочных золотых электродах, покрытых сополимером тирамина и олчинофенола, позволяет проводить определение до п < 10 "' моль комплементарных олигонуклеотидов по току окисления маркера - зидрохинона, скорость переноса которою меняется в зависимости от состава поверхностного стоя и комплементарности зонда мишени

3 Разработаны аптасенсоры на а-тромбин на основе пьезокварцевых резонаторов с зо-гагыми электродами, модифицированными полимерными формами метиленового синего и метиленового зеленого, авидином и биотинированным аптамером на а-тромбин, позволяющие определять ю 5 нМ а-тромбина Применение полимерных матриц по-звотнло снизить предел обнаружения и повысить селективность сигнала в присутствии неспецифических белков (на примере альбумина) по сравнению с традиционными методами иммобилизации

4 Показана возможность погенциометрического и импеднметрического определения а-тромбина на сгектоуглеродных электродах, модифицированных полианилином и по-лнфенотиазинами, по влиянию определяемого белка на рН-зависимость потенциала полимерного слоя и его проницаемость для носителей заряда

4 Предложен новый способ тетектирования аутоиммунных антител к ДНК в сыворотке крови больных различной эгиологни по изменению электрохимических характеристик полиэлектролитных комппексов ДНК с электрополимеризованными материалами (потенциал сенсора, сопротивление переноса заряда и емкость поверхностного слоя), измеряемых до и после контакта биосснсора с тестируемой сывороткой В случае по-тишшлина изменение потенциала обусловлено влиянием процессов допирования на электрохимические свойства полимера при изменении рН раствора Для полифенотиа-зшшв сигнал биосенсора связан с влиянием белков на рН-зависимость окислительно-восстановительною потенциала полимерных форм красителей Разработаны диагностические критерии для антител к ДНК в сыворотках крови больных системной красной волчанкой и аутоиммунным тиреоидитом

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикация):.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1 Порфирьева, А В Ампсрометрический ДНК-сенсор на основе планарных золотых электродов, модифицированных сополимером тирамина и о-аминофенола [Текст]/ А В Порфирьева, Е f' Стойкова, С В Ьеляко на, Г А Евтюгин, Г К Будников // Ученые записки Казан ун-та Сер ест наук - 2006 - I 148, кн 2 - С 9-20

2 Порфирьева, А В Погенциометричсский ДНК-сенсор для определения аутоиммунных антител к ДНК [Текст]/ А В Порфирьева, Г А Евтюгин, Е Ю Подшивалина, ЛИАнчикова, Г К Будников// Журн аналит химии - 2007 - Т 62, № 12 - С 1309-1316

3 Porfirieva, A Polyphenolhiazme modified electrochemical aptasensor for detection ot human a-thrombm [Text]/ A Porfirieva G Evtugyn, T Hianik // Electroanalysis - 2007 - V 19 - P 1915-1920

Тезисы докладов

1 Будников, Г К У1леродные электроды, модифицированные полианнлином, и биосенсоры на и\ основе [Текст)/ Г К Будников, Г А Евтюгин, ЕЕ Стойкова, АН Иванов, О В Масленникова, А В 11орфирьева//"Олектроаналитика - 2005" Всерос научн конф с межд участием Екатеринбург, 23-27 мая 2005 г Тез докл - 2005 - Г 6

2 Евтюгин ГА Биохимические и химические сенсоры на основе электродов, модифицированных фенотиазинами [Текст]/ Г А Евтюгин, Г К Будников, Е Е Стойкова, А В Порфирьева, Р II Шалямова, С В Белякова // Труды Межд конф "Химия, химическая технология и биотехнология", Томск, 11-16 септ 2006 -Т2-С220-221

3 Budnikov, I! С Phenothia/ine derivatives as electrochemical indicators for DNA sensors [Text]/ H С Budnikov, О E Goldtarb, S V Beljakova, G A Evtugyn, E V Suprun, A V Porfirieva, V G Vmter / 17 Intern Symposium on Bioelectrochemistrv and Bioenergetics Florence, Italy, June 19-24 - 2003-P 198

4 Evtugyn, G A lyraminc copolymers as matrix for the development of DNA sensors [Text]/ GA Evtugyn, S V Beljakova, A V Porfirieva, E E Stoikova, H С Budnikov//Workshop on "New trends in nucleic acid based biosensors" Book of Abstracts Firenze, 25-28 Oct 2003 - P 49

5 Budnikov, H С DNA polyelectrolyte complexes as recognition elements for anti-DNA antibodies detection [Text]/ H С Budnikov, G A Fvtugyn A V Porfirieva, E Ju Podshivalma, L I Anchikova, G R Vagapova // International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006, 25-30 June, Moscow, Russia Book of Abstracts - 2006 - V 1 - P 134

6 Евтюгин, Г А Новые )лектрохимические сенсоры для регистрации взаимодеиствий ДНК -белок [Текст] /ГА Евтюгин А В Порфирьева, Г К Будников, Т Хианик // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (23-28 сентября 2007 г) Тез докл , Москва, 2007 -Т4-С47

7 Evtugyn, G A Potentiometnc DNA-sensors for the detection of autoimmune diseases based on electropolymenzed materials [Text] / G A Evtugyn, A V Porfirieva, M S Cheburova, H С Budnikov // Third International Workshop on "Biosensors tor tood safety and environmental monitoring" October 18-20,2007, Fez Morocco - 2007 - P 19

8 Евтюгин, Г А Электрополимеризованные материалы в составе электрохимических сенсоров генерирование сигнала, микроконцентрирование и разделение [Текст] / ГА Евтюгин, А Н Иванов, Г К Будников, А В Порфирьева // "Аналитика России" Матер II Всерос конф с межд участием Краснодар - 2007 - С 77

9 Порфирьева, А В Потенциометрический сенсор на основе комплексов ДНК-полианилин для определения аутоиммунных антител к ДНК [Текст] / А В Порфирьева, Е Ю Подшивалина // VI Респ школа студентов и аспирантов " Жить в XXI веке " Казань - 2006 - С 8-10

10 Порфирьева А В Электрохимические ДНК-сенсоры на основе электродов, модифицированных полианилином, для определения антител к ДНК [Текст] / А В Порфирьева, ЕЮ Подшивалина, М С Чебурова, О В Масленникова // V Научн конф молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века", Казань, 26-27 апреля 2005 г Тез докл - 2005 - С 70

Отпечатано в ООО «Печатный двор» г Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф 207

Тел 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51 Лицензия ПД №7-0215 от 0111 2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 12 05 2008г Уел п л 1,3 Заказ № К-6534 Тираж 90 экз Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать - ризография

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ (Литературный обзор).

1.1. Особенности строения нуклеиновых кислот, аптамеров и аутоиммунных антител к ДНК как элементов биосенсоров

1.1.1. Особенности строения нуклеиновых кислот.

1.1.2. Аптамеры.

1.1.3. Аутоиммунные антитела к ДНК.

1.2. Электрохимические ДНК-сенсоры.

1.2.1. Общая характеристика электрохимических ДНК-сенсоров.

1.2.2. Способы электрохимической регистрации ДНК и взаимодействий ДНК с низкомолекулярными соединениями.

1.2.2.1 "Прямая" электрохимия ДНК.

1.2.2.2. Регистрация сигнала ДНК с помощью электрохимически активных меток и маркеров.

1.2.3. Определение антител к ДНК.

1.3. Применение электрополимеризованных материалов в ДНК-сенсорах.

1.3.1. Получение и свойства полианилина.

1.3.2. Полипиррол в составе ДНК-сенсоров.

1.3.3. Полифенотиазины в составе электрохимических сенсоров.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Приборы и оборудование.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Получение биочувствительного слоя биосенсоров.

2.3.1.1. Электрополимеризация.

2.3.1.2. Иммобилизация ДНК, аптамеров и олигомеров.

2.3.2. Измерение сигнала биосенсоров.

3. ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЗОЛОТЫХ ЭЛЕКТРОДОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ СОПОЛИМЕРОМ ТИР АМИНА И о-АМИНОФЕНОЛА

3.1. Электрохимическое поведение МЗ на золотых электродах.

3.2. Использование в качестве матрицы сополимеров тирамина и о-аминофенола.

4. АПТАСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА НА ОСНОВЕ

ЭЛЕКТРОПОЛИМЕРИЗОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ

4.1. Аптасенсоры на основе полимерных форм фенотиазиновых красителей

4.1.1. Определение тромбина методом пьезокварцевого микровзвешивания.

4.1.2. Потенциометрические аптасенсоры на тромбин.

4.2. Аптасенсор на основе полианилина.

4.2.1. Потенциометрический аптасенсор на основе полианилина.

4.2.2. Импедиметрические измерения.

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ К ДНК.

5.1. ДНК-сенсор на основе полианилина.

5.1.1. Потенциометрические измерения.

5.1.2. Импедиметрические измерения.

5.2. ДНК-сенсоры на основе электродов, модифицированных полифенотиазинами.

5.2.1. Потенциометрические ДНК-сенсоры.

5.2.2. Импедиметрические измерения.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота; МЗ - метиленовый зеленый; MC - метиленовый синий; ПАНИ - полианилин поли(МЗ) - полимерная форма метиленового зеленого; поли(МС) - полимерная форма метиленового синего;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

С - концентрация, нМ, мкМ и мМ;

Сит - предел обнаружения, М или мг/л;

СРЕ - постояннофазовый элемент (constant phase element);

Е - потенциал или сигнал ДНК-сенсора, мВ;

Ret - сопротивление переноса заряда; i - катодный или анодный ток, мкА.

Актуальность проблемы. Одним из актуальных направлений развития современной биоаналитической химии является создание ДНК-сенсоров, предназначенных для определения комплементарных нуклеотидных последовательностей, а также специфических белков и низкомолекулярных соединений биологического значения. Актуальность таких исследований обусловлена как высокой потребностью в ДНК-сенсорах, связанной с решением задач медицинской диагностики, экотоксикологии, фармакологии и молекулярной биологии, так и с уникальностью характеристик самих нуклеиновых кислот как природных молекулярных рецепторов с широкой пластичностью и специфичностью распознавания. ДНК-сенсоры уже находят практическое применение в решении реальных задач диагностики патогенных микроорганизмов и обнаружении дисфункций организма, связанных с нарушениями иммунитета. ДНК рассматриваются как универсальные шаблоны и составные элементы в синтезе молекулярных электронных устройств - проводящих нано-проволок, молекулярных логических элементов и транзисторов.

Благодаря высокой концентрации заряда и значительному числу активных функциональных групп нуклеиновые кислоты обеспечивают многоточечное нековалентное связывание широкого круга определяемых соединений. Поскольку главными условиями эффективности распознавания являются стерическая доступность функциональных групп ДНК и сохранение ее нативной структуры в составе биосенсоров, при конструировании ДНК-сенсоров особое внимание уделяется способам включения ДНК в состав биочувствительного слоя.

В связи с этим в последние годы большое внимание привлекают электрополимери-зуемые материалы, получаемые in situ непосредственно на поверхности преобразователя сигнала. К их достоинствам относятся простота получения, контроль состава и характеристик непосредственно на стадии синтеза, высокая адгезия к материалу электрода и возможности модификации характеристик, таких как заряд и электрохимическая активность, в зависимости от назначения и природы биологического компонента в составе биосенсора.

В настоящее время электрополимеризованные материалы начинают играть все возрастающую роль в развитии способов миниатюризации сенсоров, в том числе, при создании батарей сенсоров и при переходе к наноразмерным центрам распознавания молекулярных устройств. Помимо обеспечения связывания биологического компонента, они непосредственно участвуют в генерировании аналитического сигнала благодаря своим элек-трохромным свойствам, редокс-активности и способности к удерживанию низкомолекулярных компонентов - допантов.

Несмотря на быстрое развитие данного направления биосенсорики, применительно к ДНК-сенсорам примеров использования электрополимеризованных материалов относительно немного. Большинство из них связано с использованием полипиррола, который выполняет функцию матрицы для иммобилизации ДНК-зондов и свои особые свойства (электропроводность, удерживание допирующих компонентов) практически не проявляет. Применительно к полианилину ДНК используют как матрицу для получения линейных полимеров регулярного строения, другие электрополимеризованные материалы в составе ДНК-сенсоров практически не описаны.

Вышесказанное указывает на актуальность исследования, направленного на наиболее полную реализацию преимуществ, создаваемых электрополимеризованными материалами в составе ДНК-сенсоров как матрицы для иммобилизации и способа получения аналитического сигнала в отношении высоко- и низкомолекулярных соединений.

В этой связи, целью данной работы явилось создание электрохимических ДНК-сенсоров, предназначенных для решения задач клинической диагностики, в основе которых лежит взаимодействие ДНК с полиэлектролитными электрохимически активными материалами, получаемыми путем электрополимеризации.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить условия электрополимеризации фенотиазиновых красителей и анилина на поверхности золотых и стеклоуглеродных электродов в зависимости от назначения ДНК-сенсора и способа генерирования аналитического сигнала;

- разработать новые способы нанесения биологических компонентов - ДНК-зондов, на-тивной и денатурированной ДНК и аптамеров на а-тромбин - поверх электрополимери-зованных материалов с учетом требований чувствительности регистрации взаимодействий с определяемыми соединениями и формата измерения аналитического сигнала;

- изучить возможности регистрации гибридизации комплементарных ДНК-зонду олиго-нуклеотидных последовательностей с помощью диффузионно свободных маркеров на поверхности сенсоров, модифицированных электрополимеризованными материалами;

- провести сравнительную характеристику пьезометрического и потенциометрического определения а-тромбина с помощью аптасенсоров на основе комплексов аптамеров с электрополимеризованными анилином, метиленовым синим и метиленовым зеленым;

- разработать новый способ обнаружения аутоиммунных антител к ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями с помощью потенциометрических сенсоров на основе полиэлектролитных комплексов ДНК с электрополимеризованными материалами и изучить механизм формирования сигнала с привлечением данных импедиметри-ческих исследований переноса заряда на границе модифицирующий слой - электрод.

Научная новизна работы заключается в том, что:

- обосновано использование в составе ДНК-сенсоров продуктов электрополимеризации фенотиазиновых красителей (метиленового синего и метиленового зеленого) и анилина, обеспечивающих улучшенные характеристики иммобилизации и аналитического сигнала для пьезометрического и потенциометрического определения взаимодействия ДНК (аптамер) - белок;

- показана возможность использования ДНК-сенсора на основе планарных золотых электродов, модифицированных сополимером тирамина и о-аминофенола, для регистрации комплементарных олигонуклеотидных последовательностей по сигналу диффузионно свободных маркеров.

- предложены и реализованы на примере определения а-тромбина и аутоиммунных антител к ДНК различной этиологии новые способы регистрации взаимодействий ДНК-белок, основанные на измерении потенциала ДНК-сенсора до и после его контакта с определяемыми компонентами;

- обоснован механизм формирования сигнала потенциометрического ДНК-сенсора на основе полиэлектролитных комплексов ДНК - полианилин (полифенотиазиновый краситель), связанный с изменением редокс-активности и допирующей способности полимеров в зависимости от рН и присутствия специфически связывающегося белка в составе поверхностного слоя;

- разработаны пьезометрические сенсоры для определения а-тромбина с улучшенными характеристиками связывания и чувствительности определения, достигнутыми за счет использования электрополимеризованных полифенотиазинов в качестве матрицы биологических компонентов.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- предложены простые и удобные в использовании способы модификации золотых и стеклоуглеродных электродов полиэлектролитными комплексами ДНК (аптамер) - полианилин (полифенотиазиновый краситель), обеспечивающие возможность регистрации специфических взаимодействий с участием ДНК и высокочувствительного определения биологических компонентов диагностического значения;

- разработаны методики тестирования сывороток крови для установления присутствия в них аутоиммунных антител к ДНК, предложены диагностические критерии сигнала

ДНК-сенсоров для больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой;

- предложен новый формат изготовления пленочных золотых одноразовых сенсоров на основе пластин компакт-диска для записи и разборная ячейка для их использования.

На защиту выносятся:

- результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых красителей и анилина на различных электродах и выводы о влиянии условий электрополимеризации на генерирование аналитического сигнала и возможность регистрации гибридизации комплементарных олигонуклеотидных последовательностей и специфических взаимодействий ДНК - белок (аптамер - белок);

- оценка влияния природы маркеров на сигнал ДНК-сенсора на основе планарных золотых электродов, модифицированных ДНК-зондами и сополимером тирамина и о-аминофенола и вывод о возможности регистрации взаимодействий с участием ДНК и олигонуклеотидов по электрохимическим характеристикам маркеров;

- результаты пьезометрического и импедиметрического изучения аптасенсоров на основе электродов, модифицированных полифенотиазинами или полианилином и аптамером на а-тромбин и выводы о влиянии природы матрицы на чувствительность определения а-тромбина и селективность сигнала в присутствии сывороточного альбумина человека;

- новый способ регистрации аффинных взаимодействий ДНК (аптамер) - белок по изменению потенциала стеклоуглеродного электрода, модифицированного полиэлектролитным комплексом ДНК - полимер, до и после его контакта с белком, измеренного при различных рН и выводы о возможном механизме формирования сигнала для различных электрополимеризованных материалов.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Флоренция, 2003), Международном симпозиуме "Новые тенденции развития биосенсоров на основе нуклеиновых кислот"

Флоренция, 2003), Всероссийской конференции с международным участием "Электро-аналитика-2005" (Екатеринбург, 2005), V научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2005), Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2005); Международной конференции "Химия, химическая технология и биотехнология" (Томск, 2006), Международном конгрессе по аналитической химии 1СА8-2006 (Москва, 2006), VI Республиканской школе студентов и аспирантов "Жить в XXI веке" (Казань, 2006), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), II Всероссийской конференции с международным участием "Аналитика России" (Краснодар - Туапсе, 2007), III Международном симпозиуме "Биосенсоры в обеспечении пищевой безопасности и экологическом мониторинге" (Фес, 2007).

Основные результаты изложены в 3 статьях и 10 тезисах докладов. Получено положительное решение по заявке на патент РФ.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке и решении основных задач, проведении основных экспериментальных исследований в области создания ДНК-сенсоров и изучении их характеристик, интерпретации, анализе и систематизации полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 69 рисунков и 8 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 203 ссылки на отечественные и зарубежные работы.

1. Модификация золотых и стеклоуглеродных электродов электрополимеризованными ма териалами улучшает условия иммобилизации ДНК, олигонуклеотидов и аптамеров и позво ляет получить потенциометрический и пьезометрический сигнал об их взаимодействии со специфически связывающимися белками (антитела к ДНК, а-тромбин) или комплементар ными олигонуклеотидами.2. Иммобилизация ДНК-зонда на тонкопленочных золотых электродах, покрытых сополи мером тирамина и о-аминофенола, позволяет проводить определение до nxlO"1 моль ком плементарных олигонуклеотидов по току окисления маркера - гидрохинона, скорость пере носа которого меняется в зависимости от состава поверхностного слоя и комплементарно сти зонда мишени.3. Разработаны аптасенсоры на а-тромбин на основе пьезокварцевых резонаторов с золо тыми электродами, модифицированными полимерными формами метиленового синего и метиленового зеленого, авидином и биотинированным аптамером на а-тромбин, позво ляющие определять до 5 нМ а-тромбина. Применение полимерных матриц позволило сни зить предел обнаружения и повысить селективность сигнала в присутствии неспецифиче ских белков (на примере альбумина) по сравнению с традиционными методами иммобили зации.4. Показана возможность потенциометрического и импедиметрического определения а тромбина на стеклоуглеродных электродах, модифицированных полианилином и по лифенотиазинами, по влиянию определяемого белка на рН-зависимость потенциала поли мерного слоя и его проницаемость для носителей заряда.4. Предложен новый способ детектирования аутоиммунных антител к ДНК в сыворотке крови больных различной этиологии по изменению электрохимических характеристик по лиэлектролитных комплексов ДНК с электрополимеризованными материалами (потенциал сенсора, сопротивление переноса заряда и емкость поверхностного слоя), измеряемых до и после контакта биосенсора с тестируемой сывороткой. В случае полианилина изменение потенциала обусловлено влиянием процессов допирования на электрохимические свойства полимера при изменении рН раствора. Для полифенотиазинов сигнал биосенсора связан с влиянием белков на рН-зависимость окислительно-восстановительного потенциала поли мерных форм красителей. Разработаны диагностические критерии для антител к ДНК в сы воротках крови больных системной красной волчанкой и аутоиммунным тиреоидитом.

1. Scheller, F.W. Research and development in biosensors Text. / F.W.Scheller, U.Wollenberger, A.Warsinke, F.Lisdat // Current Opinion in Biotechnology.- 2001.- V.12.-P.35-40.

2. Евтюгин, Г.А. Основы биосенсорики Текст. / Г.А.Евтгогин, Г.К.Будников, Е.Е.Стойкова // Казань: Казанский государственный университет им.В.И. Ульянова - Ленина- 2007.- 82 с.

3. Овчинников, Ю.А. Основы биоорганической химии Текст. / Ю.А. Овчинников // М.: Просвещение.- 1987.- 815.

4. Tombelli, S. Analytical applications of aptamers Text. / S.Tombelli, M.Minunni, M.Mascini // Biosensors and Bioelectronics.- 2005.- V.20.- P.2424-2434.

5. Neidle, S. Nucleic acid structure and recognition Text. / S.Neidle // Oxford: Oxford University Press.- 2002.- 272 p.

6. Кольман, Я. Наглядная биохимия Текст. /Я.Кольман, К.-Г.Рем //М.: Мир.- 2000.- 469 с.

7. Франк-Каменецкий, М.Д. Век ДНК Текст. / М.Д.Франк-Каменецкий // М.: Книжный дом университет.- 2004.- 240 с.

8. Евдокимов, Ю.М. Нуклеиновые кислоты как основа для создания биосенсоров Текст. / Ю.М.Евдокимов, Г.Скуридин, В.И.Салянов, А.С.Семейкин, М.Палумбо // Молекулярная биология.- 1989.- Т.23, № 6.- 1581-1588.

9. Elington A. D. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA Text. / A. D. Elington, J. Szostak//Nature.- 1990,- V.344.- P. 467-468.

10. Deisingh, A.K. Aptamer-based biosensors: biomedical applications Text. / A.K. Deisingh // HEP.- 2006.- V.173.- P.341-357.

11. Tasset, D.M. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes Text. / D.M.Tasset, M.F.Kubik, W.Steiner // J. Mol. Biol.- 1997.- V.272.- P.688-698.

12. Stubbs, M.T. The clot thickens: clues provided by thrombin structure Text. / M.T.Stubbs, W.Bode //Trends Biochem. Sci.- 1995.- V.20.- P.23-28.

13. Kubik, M.F. High-affinity RNA ligands to human a-thrombin Text. / M.F.Kubik, A.W. Stephens, D.Schneider, RA.Marlar, D.Tasset//Nucl. Acids Res.- 1994.- V.22.- P.2619-2626.

14. Bock, L.C. Selection of single - stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin Text. / L.C.Bock, L.C.Griffin, J.A.Latham, E.H.Vermass, J.J.Toole //Nature.- 1992.-V.355.-P.564-566.

15. Tsiang, M. Selection of a suppressor mutation that restores affinity of an oligonucleotide inhibitor for thrombin using in vitro genetics Text. / M.Tsiang, C.S.Griffin, K.E.Dunn, L.K.Leung //J.Biol. Chem.- 1995.- V.270.-P. 19370-19376.

16. Macaya, R.F. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution Text. / R.F.Macaya, P.Schultze, F.W.Smith, J.A.Roe, J.Feigon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993.- V.90.- P. 3745-3749.

17. Wang, K.Y. A tertiary structure of a DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin determines activity Text. / K.Y.Wang, S.H.Krawczyx, N.Bischofberger, S.Swaminathan, P.H.Bolton // Biochemistry.- 1993.- V.32.- P. 11285-11292.

18. Wang, K.Y. A DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA Text. / K.Y.Wang, S.McCurdy, R.G.Shea, S.Swaminathan, P.H.Bolton // Biochemistry,- 1993.-V.32.- P.1899-1904.

19. Bigazzi, P.E. Autoimmunity caused by xenobiotics Text. / P.E.Bigazzi // Toxicology.- 1997.-V.119.-P.1-21.

20. Ройт, А. Основы иммунологии/А.Ройт//М.: Мир.- 1991.- 327c.

21. Vonherrath, M.G. Virus-induced autoimmune disease. Text. / M.G.Vonherrath, M.B.A.01dstone // Current Opinion in Immunology - 1996.- V.8.- P.878-885.

22. Невинский, Г.А. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии (обзор) Текст. / Г.А.Невинский, Т.Г.Канышкова, В.Н.Бунева // Биохимия.-Т.65,№11.-С.1473-1487.

23. Напп, В.Н. Antibodies to DNA Text. / B.H.Hann // The New England Journal of Medicine.- 1998.-V.338.-P.1359-1368.

24. Cerchia, L. Nucleic acid aptamers in cancer medicine Text. / L.Cerchia, J.Hamm, D.Libric, B.Tavitiand, V.Franciscisa // FEBS Letters.- 2002.- V.528.- P.12-16.

25. Keusgen, M. Biosensors: new approaches in drug discovery Text. / M.Keusgen // Naturwis- senschaften.- 2002.- V.89.- P.433-444.

26. Mascini, M. DNA electrochemical biosensors Text. / M.Mascini, I.Palchetti, G.Marrazza // Fresenius J.Anal.Chem.- 2001.- V.369.- P. 15-22.

27. Dai, L. DNA-Sensors Text. / L. Dai // Intelligent macromolecules for smart devices. From material synthesis to device applications. London-Berlin: Springer.- 2004.- P.446-460.

28. Fojta, M. Electrochemical sensors for DNA interactions and damage Text. / M.Fojta // Elec- troanalysis.- 2002.- V.14.- P. 1449-1463.

29. Sun W. Direct electrochemistry of single-stranded DNA on an ionic liquid modified carbon paste electrode Text. / W.Sun, Y.Li, M.Yang, S.Liu, K.Jiao // Electrochem.Commun. 2008.-V.10.-P. 298-301..

30. Wang, J. Amplified label-free electrical detection of DNA hybridization Text. / J.Wang, A.- N.Kawde//Analyst.- 2002.- V.127.- P.383-386.

31. Gooding, J.J. Electrochemical DNA hybridization biosensors. Text. / J.J.Gooding // Electro- analysis.- 2002.- V.14.- P. 1149-1156.

32. Erdem, A. Electrochemical DNA biosensors based on DNA-drug interactions Text. / A.Erdem, M.Ozsoz // Electroanalysis.- 2002.- V.14.- P.965-974.

33. Marrazza, G. Disposable DNA electrochemical biosensors for environmental monitoring Text. / G.Marrazza, I.Chianella, M.Mascini //Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.387.- P.297-307.

34. Nakayama, M. DNA sensors using ferrocene-oligonucleotide conjugate Text. / M.Nakayama, T.Ihara, K.Nakano, M.Maeda // Talanta.- 2002.- V.56.- P.857-866.

35. He, F. Detection of P.aeruginosa using nano-structured electrode-separated piezoelectric DNA biosensor Text. / F. He, S. Liu // Talanta -2004.- V.62.- P. 271-277.

36. Yao, G. Molecular-beacon-based array for sensitive DNA analysis Text. / G.Yao, W.Tan // Anal.Biochem.- 2004.- V.33L- P.216-223.

37. Liu, J. PNA-DNA hybridization study using labeled streptavidin by voltammetry and surface plasmon fluorescence spectroscopy Text. / J.Liu, L.Tiefenauer, S.Tian, P.E.Nielsen, W.Knoll // Anal. Chem.- 2006.- V.78.- P. 470-476.

38. J.G.Bruno, J.L.Kiel In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores with electro- chemiluminescence detection Text. / J.G.Bruno, J.L.Kiel // Biosens. Bioelectron.- 1999.- V.14.-P.457-464.

39. Vo-Dinh, T. Biosensors and biochips: advances in biological and medical diagnostics Text. / T.Vo-Dinh, B.Cullum // Fresenius J. Anal. Chem.- 2000.- V.366.- P.540-551.

40. Minunni, M. Biosensors as new analytical tool for detection of genetically modified organ isms (GMOs) Text. / M. Minunni, S. Tombelli, E. Mariotti, M. Mascini // Fresenius J. Anal. Chem.- 2001.- V.369.- P.589-593.

41. Lucarelli, F. Electrochemical DNA biosensor as a screening tool for the detection of toxi cants in water and wastewater samples Text. / F.Lucarelli, I.Palchetti, G.Marazza, M.Macini // Talanta.- 2002.- V.56.- P.949-957.

42. Marazza, G. Detection of human lipoprotein E genotypes by DNA biosensors coupled with PCR Text. / G.Marazza, S.Tombelli, M.Mascini, A.Manzoni // Clin.Chim.Acta.- 2001.- V.307.-P.241-248.

43. Hianik, T. The study of the binding of globular proteins to DNA using mass detection and electrochemical indicator methods Text. / T.Hianik, V.Ostatn, Z.Zajacov // J. Electroanal. Chem.- 2004.- V.564.- P. 19-24.

44. Chang, T. Ultrasensitive electrical detection of protein using nanogap electrodes and nanoparticle-based DNA amplification Text. / T.Chang, C.Tsai, C.Sun, C.Chen, L.Kuo, P.Chen //Biosens.Bioelectron.- 2007.- V.22.- P.3139-3145.

45. Lu, Y. New highly sensitive and selective catalytic DNA biosensors for metal ions Text. / Y. Lu, J. Liu, J. Li, P. J. Bruesehoff, C. M.-B. Pavot, A. K. Brown // Biosens. Bioelectron.-20003.- V.8.- P.529-540.

46. Fojta, M. Electrode potential controlled DNA damage in the presence of copper ions and their complexes Text. / M.Fojta, L.Havran, T.Kubikarova, E.Palecek // Bioelectrochemistry.-2002.- V.56.- P.25-27.

47. Bagni, G. DNA biosensor for rapid detection of genotoxic compounds in soil samples Text. / G. Bagni, S.Hernandez, M.Mascini, E.Sturchio, P.Boccia, S.Marconi // Sensors 5 (2005) 394-410.

48. Rusling, J.F. Sensors for toxicity of chemicals and oxidative stress based on electrochemical catalytic DNA oxidation Text. / J.F.Rusling // Biosens. Bioelectron.- 2004.- V.20.- P. 1022-1028.

49. Tarun, M. Genotoxicity screening using biocatalyst/DNA films and capillary LC-MS/MS Text. / M.Tarun, B.Bajrami, J.F.Rusling // Anal. Chem.- 2006.- V.78.- P.624-627.

50. Wu, S. Electrodeposition of silver-DNA hybrid nanoparticles for electrochemical sensing of hydrogen peroxide and glucose Text. / S.Wu, H.Zhao, H.Ju, C.Shi, J.Zhao // Electrochem. Commun.- 2006.- V.8.- P. 1197-1203.

51. Oliveira-Brett, A.M. Electrochemical oxidation mechanism of guanine and adenine using a glassy carbon microelectrode Text. / A.M.Oliveira-Brett, V.Diculescu, J.A.P.Piedale // Bioelec-trochemistry.- 2002.- V.56.- P.61-62.

52. Meric, B. Indicator-free electrochemical DNA biosensor based on adenine and guanine sig nals Text. / B. Meric, K. Kerman, D. Ozkan, P. Kara, M. Ozsoz // Electroanalysis.- 2002.-V.14.-P.1245-1250.

53. Wang, J. Scanning electrochemical microscopic imaging of surface-confined DNA probes and their hybridization via guanine oxidation Text. / J.Wang, F.Zhou // J.Electroanal. Chem.-2002.-V.537.-P.95-102.

54. Oliveira-Brett, A.M. Voltammetric determination of all DNA nucleotides Text. / A.M. Oliveira-Brett, J.A.P. Piedade, L.A. Silva, V.C. Diculescu // Anal.Biochem.- 2004.- V.332.-P.321-329.

55. Palecek, E. Past, present and future of nucleic acids electrochemistry Text. / E. Palecek // Talanta.- 2002.- V.56.- P.809-819.

56. Pivodi, M.I. Electrochemical genosensor design: immobilisation of oligonucleotides onto transducer surface and detection methods Text. / M.I. Pivodi, A. Merkoci, S. Alegret // Biosens. Bioelectron.- 2000.- V.15.- P.291-303.

57. Wang, J. Indicator-free electrochemical DNA hybridization biosensor Text. / J. Wang, G. Rivas, J.R. Fernandes, J.L.L. Paz, M. Jiang, R. Waymire // Anal.Chim.Acta.- 1998.- V.75.-P. 197-203.

58. Wang, J. Carbon-nanotube-modified glassy carbon electrodes for amplified label-free electrochemical detection of DNA hybridization Text. / J. Wang, A.-N. Kawde, M. Musameh // Analyst.- 2003.- V.128.- P.912-916.

59. Koehne, J. Ultrasensitive label-free DNA analysis using an electronic chip based on carbon nanotube nanoelectrode arrays Text. / J.Koehne, H.Chen, J.Li, A.MCassell, Q. Ye , H.Tee Ng, J. Han, M Meyyappan //Nanotechnology.- 2003.- V.14.- P.1239-1245.

60. Zhu, N. Electrochemical DNA biosensors based on platinum nanoparticles combined carbon nanotubes Text. / N.Zhu, Z.Chang, P.He, Y.Fang // Anal.Chim.Acta.- 2005.- V.545.- P.21-26.

61. Xu, С Electrochemical detection of sequence-specific DNA using a DNA probe labeled with aminoferrocene and chitosan modified electrode immobilized with ssDNA Text. / С Xu, H. Cai, P. He, Y. Fang // Analyst- 2001.- V.126.- P.62-65.

62. Wang, J. Carbon-nanotube-modified electrodes for amplified enzyme-based electrical detection of DNA hybridization Text. / J.Wang, A.-N.Kawde, M.R.Jan // Biosens.Bioelectron.-2004.-V.20.-P.995-1000.

63. Wang, J. Dual enzyme electrochemical coding for detecting DNA hybridization Text. / J. Wang, A.-N. Kawde, M. Musameh, G. Rivas // Analyst.- 2002.- V.127.- P.1279-1282.

64. Carpini, G. Oligonucleotide-modified screen-printed gold electrodes for enzyme-amplified sensing of nucleic acids Text. / G.Carpini, F.Lucarelli, G.Marrazza, M.Mascini // Biosens. Bio-electron.-2004.-V.20.-P. 167-175.

65. Palecek, E. Electrochemical enzyme-linked immunoassay in a DNA hybridization sensor Text. / E. Palecek, R.Kizek, L.Havran, S.Billova, M.Fojta // Anal.Chim.Acta.- 2002.- V.469.-P.73-83.

66. Lai, R.Y. Rapid, sequence-specific detection of unpurified PCR amplicons via a reusable electrochemical sensor Text. / R.Y. Lai, E.T. Lagally, S. Lee, H.T. Soh, K.W. Plaxco, A.J. Hee-ger// Proc. Nath. Acad. Sci.- 2006.- V.103.- P.4017-4021.

67. Radi, A.-E. Reagentless, reusable, ultrasensitive electrochemical molecular beacon aptasen- sor Text. / A.-E.Radi, J.L.A.Sanchez, E.Baldrich, C.K.O'Sullivan // J.Am.Chem.Soc- 2006.-V.128.-P.117-124.

68. Yang, M. Genosensor technology and the detection of interfacial nucleic acid chemistry Text. / M. Yang, M. McGovern, M. Thompson // Anal.Chim.Acta.- 1997.- V.346.- P.259-275.

69. Bardea, A. Amplified electronic transduction of oligonucleotide interactions: novel routes for Tay-Sachs biosensors Text. / A.Bardea, A.Dagan, I.Willner // Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.385.-P.33-43.

70. Xie, H. Highly sensitive amperometric detection of genomic DNA in animal tissues Text. / H. Xie, Y.H. Yu, P. Mao, Z. Gao //Nucleic Acids Research.- 2004.- V.326 №2.-P.el- el5. DOI: 10.1093/nar/gnh016.

71. Oliveira-Brett, A.M. Electrochemical detection of in situ adriamycin oxidative damage to DNA Text./ A.M.Oliveira-Brett, M.Vivan, I.M.Fernandez, J.A.P.Piedade // Talanta.- 2002.-V..56.- P. 959-970.

72. Ibrahim, M.S. Voltammetric studies of interaction of nogalamycin antitumor drug with DNA Text. / M.S. Ibrahim // AnaI.Chim.Acta.- 2001.- V.443.- P.63-72.

73. Zhong, J. Sensing phenothiazine drugs at a gold electrode co-modified with DNA and gold nanoparticles Text. / J.Zhong, Z.Qi, H.Dai, C.Fan, G.Li, N.Matsuda // Anal.Sci.- 2003.- V.19.-P.653-657.

74. Kara, P. Electrochemical genosensor for the detection of interaction between methylene blue and DNA Text. / P.Kara, K.Kerman, D.Ozkan, B.Meric, A.Erdem, Z.Ozkan, M.Ozsoz // Elec-trochem.Commun.- 2002.- V.4.- P.705-709.

75. Rohs, R. Methylene Blue binding to DNA with alternating AT base sequence: minor groove binding is favored over intercalation Text. / R.Rohs, H.Sklenar // J. Biomolecular Structure Dynamics.- 2004.- V.21, № 5.- P.699-711.

76. Tani, A. Methylene blue as an electrochemical discriminator of single and double-stranded oligonucleotides immobilised on gold substrates Text. / A. Tani, A.J. Thomson, J.N. Butt // Analyst-2001.-V.126.-P.1756-1759.

77. Gu, J. DNA sensor for recognition of native yeast DNA sequence with methylene blue as an electrochemical hybridization indicator Text. / J. Gu, X. Lu, H. Ju // Electroanalysis.- 2002.-V.14.-P.949-954.

78. Fojta, M. Voltammetric microanalysis of DNA adducts with osmium tetroxide,2,2'bipyridine using a pyrolitic graphite electrode Text. / M. Fojta, L. Havran, R. Kizek, S. Billova // Talanta.-2002.- V.56.- P.867-874.

79. Thorp, H.H. Cutting out the middleman: DNA biosensors based on electrochemical oxidation Text. / H.H. Thorp // Trends in Biotechnol.-1998.- V. 16.- P. 117-121.

80. El-Maali, N.A. Tris(2,2'-bipyridil)dichloro-ruthenium(III) modified carbon paste electrodes for electrocatalytic detection of DNA Text. / N.A. El-Maali, J. Wang // Sensors Actuators B.-2000.-V.76.-P.211-214.

81. Korbut, О. Damage to DNA indicated by an electrically heated DNA-modified carbon paste electrode Text. / 0. Korbut, M. Buckova, P. Tarapcek, J. Labuda, P. Grundler // J.Electroanal. Chem.- 2001.- V.506.- P. 143-148.

82. Yang, Z.-S. Electrochemically induced DNA cleavage by copper-bipyridyl complex Text. / Z.-S.Yang, Y.-L.Wang, Y.-Z.Zhang// Electrochem.Commun.- 2004.- V.6.- P.158-163.

83. Fojt, L. Sensitive determination of oligodeoxynucleotides by anodic adsorptive stripping voltammetry at surface-roughened glassy carbon electrode in the presence of copper Text. / L. Fojt, S.Hason // J.Electroanal.Chem.- 2006.- V.586.- P.136-143.

84. Ostatna, V. Electrochemical responses of thiolated oligodeoxynucleotides in cobalt- containing solutions Text. / V.Ostatna, F.Jelen, T.Hianik, E.Palecek // Electroanalysis.- 2005.-V.17.-P.1413-1420.

85. Berganza, J. DNA microdevice for electrochemical detection of Escherichia coli 0157:H7 molecular markers Text. / J. Berganza, G. Olabarria, R. Garcia, D. Verdoy, A. Rebollo, S. Arana // Biosens.Bioelectron.- 2007.- V.22.- P.2132-2137.

86. Katayama, Y. Bioaffinity sensor to antibodies using DNA modified Au electrode Text. / Y. Katayama, M. Nakayama, H. Irie, K. Nakano, M. Maeda // Chem. Lett.- 1998.- P. 1181-1182.

87. Babkina, S.S. Amperometric DNA biosensor for the determination of autoantibodies using DNA interaction with Pt(II) complex Text. / S.S Babkina, N.A. Ulakhovich, Yu.I. Zyavkina // Anal. Chim. Acta.- 2004.- V.502.- P.23-30.

88. Evtugyn, G. Affinity biosensors based on disposable screen-printed electrodes modified with DNA Text. / G. Evtugyn, A. Mingaleva, H. Budnikov, E. Stoikova, V. Vinter, S. Eremin // Anal. Chim.Acta .- 2003.- V.479.- P. 125-134.

89. Handbook of Organic Conductive Molecules and Polymers. V.2. (Ed. H.S.Nalwa), 1997. J.Wiley & Sons.

90. Erdem, E. The chemical synthesis of conductive polyanilinc doped with dicarboxylic acids Text. / E.Erdem, M. Karakisla, M. Sacak // Eur.Polymer J.- 2004.- V.40.- P.785-791.

91. Malinauskas, A. Self-doped polyanilines Text. / . A. Malinauskas // J. Power Sources.- 2004.-V.126.-P.214-220.

92. Mazeikiene, R. Deposition of polyaniline on glass and platinum by autocatalytic oxidation of aniline with dichromate Text. / R.Mazeikiene, A.Malinauskas // Synthetic Metals.- 2000.-V.108.-P.9-14.

93. MacDiarmid, A. G. Polyaniline: synthesis and characterization of the emeraldine oxidation state by elemental analysis Text. / A.G. MacDiarmid, J.C. Chian, A.F. Richter, N.L.D. Soma-siri, A.J. Epstein // Conducting Polymers.- 1987. - p. 105-120

94. MacDiarmid A. G. Polyanilines: a novel class of conducting polymers Text./ A. G. MacDiarmid, A. J. Epstein // Faraday Discuss. Chem. Soc. 1989. - V.88. - p. 317-332.

95. Genies E.M. Polyaniline: A historical survey Text./ E. M. Genies, A. Bogly, M. Lap- kowsky, С Tsintavis // Synth. Met. 1990. - V.36. - p. 139-182

96. Yang R. Large-area Chromogenics; Materials and Devices for Transmittance ControlText. / R. Yang, С M. Lampert, С G. Granqvist // SPIE Optical Engineering Press. 1990.- p. 335-365

97. MacDiarmid A. G. Conjugated Polymers and Related Materials: the Interconnection of Chemical and Electronic Structure Text./ A. G. MacDiarmid, W. R. Salaneck, I. Lundstrom // Oxford Scientific Press. 1992.

98. Prakash, R. Electrochemistry of polyaniline: study of the pH effect and electrochromism Text. / R. Prakash // J.Appl.Polymer Sci.- 2002.- V.83.- P.378-385.

99. Orata D. Determination of ion populations and solvent content as functions of redox state and pH in polyanilineText. / D. Orata, D.A. Buttry // J. Am. Chem. Soc- 1987. - V.109. - P. 3574-3581.

100. Kang, E.T. Polyaniline: A polymer with many interesting intrinsic redox states Text./ E.T. Kang, K.G. Neoh, K.L. Tan // Prog. Polym. Sci.- 1998.- V.23.- P. 277-324.

101. Park, S.M. Handbook of Organic Conductive Molecules and Polymer Text. / S.M. Park H.S. Nalwa // Wiley, New York.- 1997.- V.3.- 429 p. '

102. Cui, C.Q. Origin of the difference between potentiostatic and cyclic potential sweep deposi tions of polyaniline Text./ C.Q. Cui, L.H. Ong, T.C. Tan, J.Y. Lee // J. Electroanal. Chem. 1993.-V.346.-P. 477-482.

103. Cui, C.Q. Extent of incorporation of hydrolysis products in polyaniline films deposited by cyclic potential sweepText. / C.Q. Cui, L.H. Ong, T.C. Tan, J.Y. Lee // Electrochim. Acta 1993.-V.38.-P.1395-1404.

104. Yang, H. The application of fast scan cyclic voltammetry. Mechanistic study of the initial stage of electropolymerization of aniline in aqueous solutions Text./ H. Yang, A.J. Bard // J. Electroanal. Chem. 1992.- V.339.- P.423-443.

105. Mondal, S. K. Analysis of electrochemical impedance of polyaniline films prepared by gal- vanostatic, potentiostatic and potentiodynamic methods Text./ S.K. Mondal, K. Prasad, N. Mu-nichandraiah // Synthetic Metals 2005.- V.148.- P.275-286.

106. Wei, X. Synthesis of highly sulfonated polyaniline Text./ X. Wei and A.J. Epstein // Synth. Met. 1995.-V.74.- P.123-125.

107. Lin, H.K. Synthesis of new water-soluble self-doped polyaniline Text./ ILK. Lin, S.A. Chen // Macromolecules 2000.- V.33.- P. 8117-8118.

108. Karyakin, A.A. The influence of defects in polyaniline structure on its electroactivity: opti mization of 'self-doped' polyaniline synthesis Text./ A.A. Karyakin, LA. Maltsev, L.V. Lu-kachova // J. Electroanal. Chem. 1996.- V.402.- P.217-219.

109. Mazeikiene, R. Voltammetric study of the redox processes of self-doped sulfonated poly aniline Text./ R. Mazeikiene, G. Niaura, A. Malinauskas // Synth. Met. 2003.- V.139.- P. 89-94.

110. Lai, E.K.W. Electrochemical oxygen reduction at composite films of Nafion, polyaniline and Pt Text./ E.K.W. Lai, P.D. Beattie, F.P. Orfino, E. Simon, S. Holdcroft // Electrochim. Acta 1999.-V.44.-P. 2559-2569.

111. Xiao, Y. Electrocatalytic intercalator-induced winding of double-stranded DNA with poly- anilineText. / Y. Xiao, A.B. Kharitonov, F. Patolsky, Y. Weizmann, I. Willner // Chem. Com-mun.2003.-V.13.-P.1540-1541.

112. Tian, S. Polyaniline doped with modified gold nanoparticles and its electrochemical properties in neutral aqueous solution Text./ S. Tian, J. Liu, T. Zhu, W. Knoll // Chem. Commun. 2003.-V.21.-P.2738-2739.

113. Zhang, L. The electrocatalytic oxidation of ascorbic acid on polyaniline film synthesized in the presence of camphorsulfonic acid Text./ L. Zhang, S. Dong // J. Electroanal. Chem.- 2004.-V.568.-P.189-194.

114. Евтюгин, Г.А. Электрохимические биосенсоры на основе графитовых электродов, модифицированных полианилином, для определения фосфорорганических пестицидов Текст. / Г.А.Евтюгин, Г.К.Будников, А.Н.Иванов // Укр.хим.журн.- 2005.- Т.71, № 9.-С.51-59.

115. Strehlitz, В Sensor for amperometric determination of ammonia and ammonia-forming enzyme reactions Text./ B. Strehlitz, B. Grundig, H. Kopinke // Anal. Chim. Acta.- 2000.- V.403.-P. 11-23.

116. Shih, Y. A creatinine deiminase modified polaniline electrode for creatinine analysis Text./ Y. Shih, H. Huang//Anal. Chim. Acta.- 1999.- V.292.- P.143-150.

117. Luo, Y.-C. Urea biosensor based on PANi(urease)-Nafion®/Au composite electrode Text. / Y.-C.Luo, J.-S.Do // Biosens.Bioelectron.- 2004.- V.20.- P. 15-23.

118. Kanungo, M. Studies on electropolymerization of aniline in the presence of sodium dodecyl sulfate and its application in sensing urea Text. / M.Kanungo, A.Kumar, A.Q.Contractor // J.Electroanal.Chem.- 2002.- V.528.- P.46-56.

119. Kan, J. Polyaniline-uricase biosensor prepared with template process Text. / J.Kan, X.Pan, C.Chen //Biosens.Bioelectron.- 2004.- V.19.- P.1635-1640.

120. Zhou, H. Glucose biosensor based on platinum microparticles dispersed in nano-fibrous polyaniline Text. / H.Zhou, H.Chen, S.Luo, J.Chen, W.Wei, Y.Kuang // Biosens.Bioelectron.-2005.- V.20.- P.1305-1311.

121. Pan, X. Polyaniline glucose oxidase biosensor prepared with template process Text. / X.Pan, J.Kan, L.Yuan // Sensors Actuators В.- 2004.- V.102.- P.325-330.

122. Timur, S. Thick film sensors based on laccases from different sources immobilized in polyaniline matrix Text. / S.Timur, N.Pazarhoglu, R.Pilloton, A.Telefoncu.// Sensors Actuators B.-2004.-V.97.-P. 132-136.

123. Nickels,P. Polyaniline nanowire synthesis templated by DNA Text. / P.Nickels, W.U. Dittmer, S.Beyer, J.P.Kotthaus, F.C.Simmel //Nanotechnology.- 2004.- V.15.- P. 1524-1529.

124. Shi, L. Electrical contacting of glucose oxidase by DNA-templated polyaniline wires on surfaces Text. / L.Shi, Y.Xiao, I.Willner // Electrochem.Commun.- 2004.- V.6.- P. 1057-1060.

125. Gu, H. Conductive polymer-modified boron-doped diamond for DNA hybridization analysis Text. /H.Gu, X.Su, K.P.Loh // Chem.Phys.Letters.- 2004.- V.388.- P.483-487.

126. Wu, J. A biosensor monitoring DNA hybridization based on polyaniline intercalated graphite oxide nanocomposite Text. / J.Wu, Y.Zou, X.Li, H.Liu, G.Shen, R.Yu // Sensors Actuators B.-2005.-V.104.-P.43-49.

127. Zhu, N. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltam- metric detection of DNA hybridization Text. / N.Zhu, Z.Chang, P.He, Y.Fang // Electro-chim.Acta.- 2006.- V.5L- P.3758-3762.

128. Gamier, F. Toward intelligent polymers: DNA sensors based on oligonucleotide- functionalized polypyrroles Text. / F.Gamier, H.Korri-Yousouffi, P.Srivastava, B.Mandrand, TJDelair // Synth.Metals.-1999.- V.100.- P.89-94.

129. Gamier, F. Conjugated polymer-based DNA chip with real time access and femtomol detection threshold Text. / F.Gamier, B.Bouabdallaoui, P.Srivastava, B.Mandrand, C.Chaix // Sensors Actuators В.- 2007.- V.123.- P. 13-20.

130. Bidan, G. Conducting polymers as a link between biomolecules and microelectronics Text. / G.Bidan, M.Billon, T.Livache, G.Mathis, A.Roget, L.M.Torrez-Rodrigez // Synth.Metals.-1999.-V.102.-P.1363-1365.

131. Jiang, M. Recognition and detection of oligonucleotides in the presence of chromosomal DNA based on entrapment within conducting-polymer networks Text. / M.Jiang, J.Wang // J.Electroanal. Chem.- 2001.- V.500.- P.584-589.

132. Ramanaviciene, A. Pulsed amperometric detection of DNA with an ssDNA/polypyrroIe- modified electrode Text. / A.Ramanaviciene, A. Ramanavicius // Anal.Bioanal.Chem.- 2004.-V.379.- P.287-293.

133. Damos, F.S. Study of poIy(methylene blue) ultrathin films and its properties by electrochemical surface plasmon resonance Text. / F.S.Damos, R.C.S.Luz, L.T.Kubota // J.Electroanal.Chem.- 2005.- V.58L- P.231-240.

134. Liu, J. The electrochemical polymerization of methylene blue and properties of poly(methylene blue) Text. / J.Liu, S.Mu // Synthetic Metals.- 1999.- V.107.- P.159-165.

135. Brett, C.M.A. Poly(methylene blue) modified electrode sensor for haemoglobin Text. / C.M.A.Brett, G.Inzelt, V.Kertesz // Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.385.- P.l 19-123.

136. Karyakin, A.A. Electropolymerized azines: a new group of electroactive polymers Text. / AA.Karyakin, E.E.Karyakina, H.-L.Schmidt // Electroanalysis.- 1999.- V.l 1.- P. 149-155.

137. Karyakin, A.A. Electropolymerized azines. P.H. In a search of the best electrocatalyst of NADH oxidation Text. / A.A.Karyakin, E.E.Karyakina, W.Schuhmann, H.-L.Schmidt // Electroanalysis.- 1999.- V.1L- P.553-557.

138. Cooper, J.A. Photoelectrochemical determination of ascorbic acid using methylene blue immobilized in a-zirconium phosphate Text. / J.A. Cooper, K.E.Woodhouse, A.M.Chippindale, R.G.Compton//Electroanalysis.- 1999.- V.ll.- P.1259-1265.

139. Hassan, S.S.M. Methylene blue potentiometric sensor for selective determination of sulfide ions Text. / S.S.M.Hassan, S.A.M.Marzouka, H.E.M.Sayour // Anal.Chim.Acta.- 2002.-V.466.- P.47-55.

140. Tan, L. Electrochemical determination of heparin using methylene blue probe and study on competition of Ba2+ with methylene blue for binding heparin Text. / L.Tan, S.Yao, Q.Xie // Ta-lanta.- 2007.- V.71.- P.827-832.

141. Zhou, D. The electrochemical polymerization of methylene green and its electrocatalysis for the oxidation of NADH Text. / D.Zhou, H.Fang, H.Chen, H.Ju, Y.Wang // Anal.Chim.Acta.-1996.-V.329.-P.41-48.

142. Ulyanova, Y.V. Poly(methylene green) employed as molecularly imprinted polymer matrix for electrochemical sensing Text. / Y.V.Ulyanova, A.E.Blackwell, S.D.Minteer // Analyst.-2006.-V.131.-P.257-261.

143. Liu, B. A reagentless amperometric biosensor based on the coimmobilisation of horseradish peroxidase and methylene green in a modified zeolite matrix Text. / B.Liu, F.Yan, J.Kong, J.Deng//Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.386.- P.31-39.

144. Yang, R. A H2O2 biosensor based on immobilization of horseradish peroxidase in electro- polymerized methylene green film on GCE Text. / R. Yang, C.Ruan, J.Deng // J. Appl.EIectrochem.- 1998.- V.28.- P.1269-1275.

145. Wang, B. Sol-gel-derived amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on methylene green incorporated in Nafion film Text. / B.Wang, S.Dong // Talanta.- 2000.- V.51.- P.565-572.

146. Gao, Q. Preparation of poly(thionine) modified screen-printed carbon electrode and its application to determine NADH in flow injection analysis system Text. / Q.Gao, X.Cui, F.Yang, Y.Ma, X.Yang // Biosens.Bioelectron.- 2003.- V.19.- P.277-282.

147. Bard, A.J. Electrochemical Methods. Fundamentals and Applications / A.J.Bard, 1..R.Foulkner, J.Wiley & Sons, New York. - 1980.- 718 p.

148. Situmorang, M. Immobilisation of enzyme throughout a polytyramine matrix: a versatile procedure for fabricating biosensors Text. / M.Situmorang, J.J.Gooding, D.B.Hibbert // Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.394.- P.211-223.

149. Situmorang, M. Electrodeposited polytyramine as an immobilisation matrix for enzyme biosensors Text. / M.Situmorang, J.Gooding, D.B.Hibbett, D.Barnett // Biosens.Bioelectron.-1998.-V.13.-P.953-962.

150. Becker, R. C. Thrombin: structure, biochemistry, measurement, and status in clinical medicine Text. / R. С Becker, F. A. Spencer// J. Thrombosis Thrombolysis.- 1998.- P. 215-229.

151. Garden S. R. A fluorescent coagulation assay for thrombin using a fiber optic evanescent wave sensor Text. / S.R.Garden, G.J.Doellgast, K.S. Killham, N.J. Strachan // Biosens. Bioelec-tron.- 2004.- V.19.- P.737-734

152. Pavlov, V. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin Text. / V. Pavlov, Y. Xiao, B. Shlyahovsky, I. Willner // J. Am. Chem. Soc- 2004.-V.126.-P.11768-11769.

153. Tung, H. A novel near-infrared fluorescence sensor for detection of thrombin activation in blood Text. / C.H.Tung, R.E. Gerszten, F.A. Jaffer, R. Weissleder // Chem. Biochem.- 2002.-V.3.-P.207-211.

154. Bini, A. Analytical performances of aptamer-based sensing for thrombin detection Text. / A.Bini, M.Minunni, S.Tombelli, S.Centi, M.Mascini // Anal. Chem.- 2007.- V.79.- P.3016-3019.

155. Hianik T. Detection of aptamer-protein interactions using QCM and electrochemical indicator methods Text. / T.Hianik, V.Ostatnar, Z.Zajacovar, E.Stoikova, G.Evtugyn // Bioorg. Med. Chem. 1.etters.- 2005.- V.15.- P.291-295.

156. Scaly, J.M. Electrochemical impedance: analysis and interpretation Text. / J.M.Scaly, D.C.Silverman, M.W.Kendig (editors). ASTM, Philadelphia.- 1993.- 480 p.

157. Mondal, S.K. Analysis of electrochemical impedance of polyaniline films prepared by gal- vanostatic, potentiostatic and potentiodynamic methods Text. / S.K.Mondal, K.R.Prasad, N.Munichandraiah // Synthetic Metals.- 2005.- V.148.- P.275-286.

158. Takhistov, P. Electrochemical synthesis and impedance characterization of nano-patterned biosensor substrate Text. / P.Takhistov // Biosens.Bioelectron.- 2004.- V.l 9.- P. 1445-1456.

159. Randies, J. E. B. Kinetics of rapid electrode reactions Text. / J.E.B.Randles // Discussions Faraday Soc- 1947.- V.I.- P. 11-19.

160. Mondal, S.K. Analysis of electrochemical impedance of polyaniline films prepared by gal- vanostatic, potentiostatic and potentiodynamic methods Text. / S.K.Mondal, K.R.Prasad, N.Munichandraiah.// Synthetic Metals- 2005.- V.148.- P.275-286

161. Lubert, K-H. The influence of protons on the impedance of polyaniline films Text. / K- H-Lubert, L.Dunsch // Electrochim.Acta.- 1998.- V.43.- P.813-822.

162. Alberts, B. An introduction to the molecular biology of the cell Text. / B.Alberts, D.Bray, A.Johnson, J.Lewis,M.Raff, K.Roberts, P.Walter // Essential Cell Biology. New York: Garland Publishing. Inc.- 1998.- 340 p.

163. Moss, T. DNA-protein interactions: principles and protocols Text. / T. Moss (Ed.) // Meth ods in molecular biology. Humana Press. - 2001.- 656 p.

164. Hamdani, K. Polyaniline pH electrodes Text. / K.Hamdani, K.L. Cheng // Microchemical J.-1999.-V.61.-P.198-215.