Электрохимические холинэстеразные сенсоры на основе углеродных нанотрубок и макроциклических лигандов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Юнусов Равиль Рэмилевич

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК И МАКРОЦИКЛИЧЕСКИХ

ЛИГАНДОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 ¿213

Казань - 2013

005538247

005538247

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им. A.M. Бутлерова федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Евтюгин Геннадий Артурович

Официальные оппоненты:

Евгеньев Михаил Иванович, доктор химических наук, профессор, профессор кафедры аналитической химии, сертификации и менеджмента качества ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», г. Казань

Гоголашвили Эдуард Лаврентьевич кандидат химических наук,

Начальник Центра химико-аналитических исследований ФГБУН «Институт органической и физической химии им.А.Е.Арбузова» КазНЦ РАН

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Башкирский государственный универ-

ситет», г.Уфа

Защита состоится «5» декабря 2013 г. в 14-30 на заседании диссертационного совета Д 212.081.30 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: ул. Кремлевская, 18, Химический институт им. А. М. Бутлерова КФУ, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета. Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, КФУ, Химический институт им. А.М. Бутлерова.

Автореферат разослан «£ » 2013 г.

Ученый секретарь у

диссертационного совета, ,1 ¡¡г .. е.

кандидат химических наук, доцент О^^ШбЩЛт, КазымоваМ.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Создание средств экспресс-контроля потенциально опасных химических и биологических факторов является приоритетной задачей развития современной аналитической химии, направленное на обеспечение безопасности общества и здоровья населения. Угрозы биологического и химического терроризма, а также растущие объемы применения химических средств защиты растений заставляют интенсифицировать исследования в указанной области. Применительно к веществам нервно-паралитического действия достижение требуемых характеристик чувствительности и селективности определения токсикантов достигается, в первую очередь, с применением фермента ацетилхо-линэстеразы (АХЭ). Являясь биологической мишенью для веществ нервно-паралитического действия, АХЭ реагирует на их присутствие снижением своей активности, что может быть зафиксировано различными физико-химическими методами. Несмотря на то, что механизм ингибирования АХЭ и способы регистрации ее активности в настоящее время хорошо изучены, остаются задачи обеспечения селективности отклика и повышения чувствительности определения пестицидов антихолинэстеразного действия. Их решение требует дальнейшего развития соответствующих методов регистрации сигнала, опирающихся на достижения современного материаловедения и аналитического приборостроения для подавления влияния компонентов матрицы образца и повышения чувствительности преобразователей сигнала.

Электрохимические способы регистрации сигнала холинэстеразных сенсоров выгодно отличаются от оптических методов простотой используемого оборудования, удобством реализации в виде компактных сенсоров, чувствительностью регистрации сигнала. Внедрение новых наноразмерных материалов, обеспечивающих коммуникацию биохимических и электрохимически активных компонентов, может существенно улучшить характеристики электрохимической регистрации сигнала об ингибировании холинэстераз, что расширит область контроля остаточных количеств пестицидов антихолинэстеразного действия.

Целью исследования явилось создание электрохимических холинэстеразных сенсоров для определения фосфорорганических пестицидов на основе новых наноразмерных материалов - носителей фермента и медиаторов электронного переноса, отличающихся улучшенными аналитическими и операционными характеристиками, а также их тестирование на модельных растворах фосфорор-

ганических пестицидов и искусственных объектах анализа.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить условия регистрации сигнала - тока окисления тиохолина - с использованием стеклоуглеродных электродов, модифицированных новыми меди-аторными системами - комбинированными покрытиями из окисленных углеродных нанотрубок (ОУН) и фталоцианина кобальта (ФЦК);

- определить рабочие условия иммобилизации АХЭ с применением поли-карбоксилированных макроциклических носителей - производных тиака-ликс[4]арена, а также углеродных наноразмерных материалов, для достижения высокой чувствительности регистрации ингибирования фермента;

- установить операционные характеристики измерения сигнала разработанных биосенсоров и аналитические характеристики определения с их помощью ацетилтиохолина (АТХ) и фосфорорганических пестицидов в зависимости от способа модификации преобразователя сигнала;

- провести тестирование модельных растворов ингибиторов и искусственных образцов загрязненных вод и фруктовых соков с помощью разработанных холинэстеразных сенсоров и определить требования к пробоподготовке образцов для учета матричного эффекта.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые:

- предложено использовать новые медиаторные системы на основе композиций углеродных материалов (ОУН и углеродная сажа (УС)) и ФЦК для снижения рабочего потенциала окисления тиохолина;

- разработаны способы иммобилизации АХЭ на макроциклических поли-карбоксилированных носителях натиакаликс[4]ареновой основе;

- проведено систематическое исследование влияния строения поверхностного слоя (природа медиатора и носителя фермента) и установлено влияние конфигурации макроциклического носителя и строения заместителей на кинетику ингибирования и операционные характеристики холинэстеразных сенсоров;

- проведено систематическое исследование аналитических характеристик определения фосфорорганических пестицидов с помощью биосенсоров, различающихся по способу модификации поверхности и иммобилизации фермента;

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые и надежные способы модификации электродов углеродными материалами, ФЦК и макроциклическими поликарбоксилированными

носителями фермента, обеспечивающими быстрый отклик и высокую точность измерения сигнала биосенсоров на субстрат и ингибиторы фермента;

- предложены высокочувствительные способы определения фосфороргани-ческих соединений - ингибиторов фермента - с хроноамперометрической регистрацией сигнала;

- разработаны способы пробоподготовки для снижения влияния компонентов матрицы при количественном определении пестицидов в водах различного назначения и для обнаружения веществ антихолинэстеразного действия в свежевыжатых фруктовых соках.

На защиту выносятся:

-результаты модификации стеклоуголеродных электродов углеродными наноматериалами и ФЦК, позволяющей снизить рабочий потенциал окисления тиохолина до 50 - 150 мВ при сохранении высокой скорости отклика и отсутствии отравления электрода тиольными соединениями;

-условия карбодиимидной ковалентной иммобилизации АХЭ на модифицированных преобразователях сигнала, обеспечивающие уменьшение расхода фермента и увеличение чувствительности определения фосфорорганических пестицидов за счет сохранения высокой диффузионной проницаемости слоя для субстрата и ингибитора и уменьшенного расхода фермента на единицу поверхности электрода;

- рабочие условия измерения сигнала ацетилхолинэстеразных сенсоров на субстрат и ингибиторы в зависимости от способа модификации и фермент-ингибиторной специфичности, свидетельствующие об отсутствии мешающего влияния гетерогенного характера реакции на измеряемые параметры биосенсора.

- определение наномолярных количеств пестицидов (параоксон, малаоксон, малатион) с чувствительностью, зависящей от природы карбоксилированных заместителей и конфигурации тиакаликс[4]аренов, в модельных растворах, водах и фруктовых соках.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований докладывали на Итоговой научной конференции Химического института им.А.М.Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, 2011), Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Научно-образовательного центра «Материалы и технологии 21 века» при Казанском (Приволжском) федеральном университете (Казань, 2011), III Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Уфа - Абзаково, 2012), Симпо-

зиуме НАТО «Portable chemical sensors for the rapid detection of chemical and biological agents and other weapons of terrorism» (Лунд - Сногхольм, Швеция, 2011).

Публикации. По результатам исследований опубликованы 2 статьи в международных реферируемых журналах, 1 глава в коллективной монографии и 3 тезисов доклада на конференциях различного уровня.

Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке и решении основных задач, проведении основных экспериментальных исследований в области модификации электродов макроциклическими рецепторами и углеродными материалами, изучении их вольтамперных и импедиметрических характеристик, разработке методик определения субстрата и ингибиторов холинэстераз, оценке кинетических параметров ингибирования, интерпретации и систематизации полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованных библиографических источников (141 источник). Диссертация изложена на 127 страницах компьютерной верстки, содержит 22 рисунка и 16 таблиц.

Во Введении раскрыта актуальность темы исследования, определены цели и задачи, сформулированы научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

В Литературном обзоре (глава 1) рассмотрены особенности функционирования холинэстеразных сенсоров для определения фосфорорганических пестицидов. В частности рассмотрены особенности взаимодействия холинэстеразы с необратимыми ингибиторами,

В Экспериментальной части (глава 2) представлены данные об объектах исследования, используемых методах и измерительном оборудовании, приведены условия формирования чувствительного слоя разработанных биосенсоров, условия измерения и способы обработки сигнала в отношении определяемых соединений.

Главы 3 и 4 посвящены обсуждению полученных результатов.

Диссертация выполнена на кафедре аналитической химии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» при поддержке грантов РФФИ 09-03-92420_КЭ «Композиты на основе углеродных нанотрубок и электрохимически активных полимеров для создания новых биосенсоров» и 11-03-381а «Амплификация сигнала электрохимических (био)сенсоров путем самосборки полиэлектролитов с включением наноразмерных медиаторных систем», а

также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (мероприятие № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук, госконтракт № 16.740.11.0496 от 16 мая 2011 г. «Электрохимические ДНК-сенсоры для детектирования белков и токсинов на основе наноразмерных медиаторных систем»),

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть

Амперометрические холинэстеразные сенсоры изготавливали на основе стеклоуглеродных электродов (СУЭ) с площадью рабочей поверхности 2.5 мм2, модифицированных ФЦК и ОУН, ФЦК и УС, ФЦК и карбоксилированными тиакаликс[4]аренами (структурные формулы приведены в табл.1). Кроме того, ингибирование фермента изучали на печатных графитовых электродах, изготовленных методом трафаретной печати на полуавтоматическом принтере DEK 248 (DEK, Англия). В работе использовали АХЭ (КФ 3.1.1.7) из электрического органа угря («Sigma-Aldrich», Германия, 687 Е/мг белка). Ковалентную иммобилизацию фермента проводили путем карбодиимидного связывания с помощью N-(З-диметиламинопропил)-Л^'-этилкарбодиимид хлорида и JV-гидроксисукцин-имида. Субстратом ферментативной реакции служил ацетилтиохолин хлорид (АТХ). Продукт его гидролиза (тиохолин) регистрировали по току окисления при 50-200 мВ отн. Ag/AgCl.

В качестве модельных необратимых ингибиторов АХЭ использовали стандартные образцы фосфорорганических пестицидов Pestanal («Sigma-Aldrich», США). Степень ингибирования иммобилизованной АХЭ рассчитывали как относительное уменьшение тока окисления тиохолина, измеренного до и после инкубирования биосенсора в растворе ингибитора в течение 15 мин. Окисление ти-оновых пестицидов перед измерением проводили с использованием электроге-нерированного хлора, получаемого в гальваностатическом электролизе в растворе пестицида, содержащем 0.1 M NaCl.

Электрохимические измерения проводили в трехэлектродной нетермостатированной ячейке в режиме постояннотоковой вольтамперометрии и хроноам-перометрии с помощью потенциостата-гальваностата AUTOLAB PGSTAT 302N («Metrohm Autolab b.v.», Голландия). Электрохимический импеданс измеряли с помощью модуля FRA2 AUTOLAB PGSTAT 302N в присутствии эквимолярной

смеси феррицианидов калия. Расчет сопротивления переноса заряда проводили по эквивалентной схеме Рэндлса.

Таблица 1. Список использованных в работе тиакаликс[4]аренов

Шифр Название тиакаликс[4]арена Структура

1а 5,11,17,23-Тетра-тире т-бутил-25,26, 27,28- тетракис-[(ди(гидроксикарбо-нилметил)иминокарбонил)-метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (конус) "О он

16 5,11,17,23-Тетра-/ирет-бутил-25,26, 27,28-тетракис-[(ди(гидроксикарбо-нилметил)иминокарбонил)-метокси]-2,8,14,20-тетратиакадикс[4]арен (частичный конус) р но Ьн

1в 5,11,17,23-Тетра-треот-бутил-25,26, 27,28-тетракис-[(ди(гидроксикарбо-нилметил)иминокарбонил)-метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (1,3-алътернат) но он он но \,н

2а 5,11,17,23-Тетра-»грет-бутил-25,26, 27,28-тетра[(гидроксиацетамидоацет-амидокарбонил)метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (конус) "Жгг Н 1о У он он/ но

Продолжение табл. 1

26 5,11,17,23-Тетра-т/?ет-бутил-25,26, 27,28-тетра[(гидроксиацетамидо-ацетамидокарбонил)метокси]-2,8,14,20-тетратиака-ликс[4]арен (частичный конус) > О-Х О-/ \»о ОН НО

2в 5,11,17,23-Тетра-/ярет?г-бутил-25,26, 27,28-тетра[(гидроксиацетамидо-ацетамидокарбонил)метокси]-2,8,14,20-тетратиа-каликс[4]арен (1,3-альтернат) но^о °<иуон N4 НЬГ оу V нЙ но-' о о^он

3 5,11,17,23-Тетра-/яреяг-бутил-25,26,27-тритидрокси-28-(2'-[2"-(гидрокси-карбонил)этиленкарбониламино]этокси)-2,8,14,20-тетра-тиакаликс[4]арен ннй 1 мн г МО

4 5,11,17,23-Тетра-треш-бутил-25,26,27-три(цианопропокси)-28-(2'-[2"-(гидроксикарбонил)этиленкар-бониламино]этокси)-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (1,3-альтернат)

5 п-трет - Бутилтиакаликс[4]арен

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРА НА ОПЕРАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ХОЛПНЭСТЕРАЗНЫХ

СЕНСОРОВ

В качестве модификаторов электродов при создании ацетилхолинэстераз-ных сенсоров в работе были использованы материалы, улучшающие электрохимические характеристики сенсоров при определении продукта ферментативной реакции - тиохолина. К ним относятся ФЦК, ОУН и УС. Необходимость их использования обусловлена высоким перенапряжением окисления тиохолина, препятствующим применению сенсоров в присутствии электрохимически активных примесей, а также необходимостью увеличения удельной площади поверхности преобразователя сигнала для повышения эффективности иммобилизации АХЭ. Также в работе в качестве модификаторов поверхности сенсоров были использованы тиакаликс[4]арены, способные образовывать наноструктурированные покрытия. Их присутствие увеличивает эффективность ковалентной иммобилизации фермента при сохранении проницаемости слоя для низкомолекулярных носителей заряда. В структуре ОУН, УС и тиакаликс[4]аренов присутствуют карбоксильные группы, участвующие в карбодиимидной сшивке фермента.

Модифицированные электроды были изучены методом спектроскопии электрохимического импеданса (сопротивление переноса заряда /?2 для электродов, модифицированных различными комбинациями углеродных наноматери-лов, ФЦК и макроциклических рецепторов, приведено на рис.1).

1 - СУЭ; 2 - УС; 3 - ОУН; 4 - ФЦК (0.13 мкг/мм2); 5 - ФЦК

0.39 мкг/мм2; 6 - ОУН + 0.13 мкг/мм2 ФЦК; 7 - ОУН + 0.13

кг/мм2 ФЦК и тиакаликс[4]арен 16; 8 - ОУН + 0.13 кг/мм2 ФЦК +

1 234 56789 10

тиакаликс[4]арен 5; 9 - УС + ФЦК 0.39 мкг/мм2 + тиакаликс [4]арен 16; 10 - УС+ ФЦК 0.39 мкг/мм2 + тиакаликс[4]арен 5

Рисунок 1 - Зависимость сопротивления переноса заряда от способа модификации СУЭ

ФЦК в отсутствие углеродных наноматериалов оказывает в целом блокирующее действие на прямой перенос электрона, возрастающее с увеличением поверхностной концентрации ФЦК. Введение в состав композитных покрытий одновременно углеродных наноматериалов и ФЦК нивелирует блокирующий эффект последнего. Значения сопротивления и емкости остаются примерно постоянными в пределах погрешности измерения параметров импеданса. Как и в случае самого СУЭ, увеличение содержания ФЦК на наноуглеродных материалах ухудшает условия электронного переноса независимо от природы наноугле-родного материала. Однако для УС эффект проявляется существенно больше, чем для ОУН. При добавлении макроциклических рецепторов, несущих карбоксильных группы и свободных от них, к ОУН переход от тиакаликс[4]арена 16 к незамещенному тиакаликс[4]арену 5 практически не влияет назначение сопротивления, тогда как для УС внедрение поликарбоксилированных рецепторов увеличивает сопротивление относительно незамещенного тиакаликс[4]арена практически вдвое. Поликарбоксилированные тиакаликс[4]арены, осажденные на СУЭ отдельно или совместно со ФЦК, увеличивают сопротивление переноса заряда в силу частичного или полного блокирования поверхности электрода.

Результаты исследования методом спектроскопии электрохимического импеданса показали, что происходит увеличение истинной площади поверхности электрода, покрытого наноуглеродными материалами, относительно чистого СУЭ. ФЦК, не обладая собственной электропроводностью в выбранном интервале потенциалов, снижает скорость электронного обмена в соответствии со степенью заполнения поверхности. При этом использование композиций ФЦК и наноуглеродных материалов практически нивелирует его влияние на сопротивление переноса заряда. Наибольшей эффективностью обладают ОУН, присутствие которых снижает сопротивление до 10 раз, независимо от присутствия в слое ФЦК. Замена поликарбоксилированных рецепторов на незамещенный тиа-каликс[4]арен незначительно меняет параметры импеданса. Напротив, УС при высокой эффективности катализа электронного обмена на границе электрод-раствор обладает меньшей способностью к сорбционному удерживанию других компонентов слоя, что не позволяет сохранить низкое сопротивление заряда при осаждении на электрод макроциклических рецепторов и ФЦК.

Совершенствование конструкции холинэстеразных сенсоров направлено на снижение рабочего потенциала измерения сигнала и увеличение абсолютных значений регистрируемых токов. Исследование модифицированных ОУН элек-

тродов с помощью спектроскопии электрохимического импеданса показало увеличение эффективности электронного переноса. Также несколько уменьшился разброс характеристик электродов (токи заряжения, дрейф регистрируемых токов во времени) в связи с нивелированием вариаций рельефа поверхности при очистке СУЭ перед нанесением модификатора. В серии последовательных измерений на одном электроде и параллельных измерений на различных электродах погрешность измерения тока окисления тиохолина не превышала 2% (6 измерений). Кроме того, ОУН играют роль трехмерной матрицы для включения ФЦК в состав модифицирующего слоя. ФЦК служит катализатором окисления тиохолина, образующегося при гидролизе ATX (1).

На циклических вольтамперограммах, регистрируемых с помощью АХЭ-сенсора на основе СУЭ, модифицированного ОУН и ФЦК, пик окисления тиохолина наблюдается при потенциале -100 ... -50 мВ, в то время как на чистом СУЭ - при 500 мВ, на электроде, модифицированном только ОУН, - при 50-200 мВ. Введение ФЦК в слой ОУН на поверхности сенсора дополнительно снижает потенциал окисления тиохолина на 100 мВ и заметно уменьшает фоновые токи заряжения, что предположительно связано со стерическим блокированием отрицательного заряда немодифицированных карбоксилатных групп нанотрубок и снижением влияния на фоновые токи положительного заряда тиохолина и продукта его окисления - дисульфида. Линейный участок концентрационной зависимости тока окисления, регистрируемого методом хроноамперометрии при потенциале +50 мВ на электроде, модифицированном ФЦК и ОУН, описывается уравнением I, мкА = 0.0006 +226хС, мМ (Д = 0.9988).

Наличие свободных карбоксильных групп ОУН на поверхности модифицированного СУЭ позволяет иммобилизовать большее количество АХЭ и увеличить сигнал по сравнению с немодифицированным электродом. Для установления аналогичной зависимости в отношении ингибиторов был изучен сигнал сенсора на основе ОУН и ФЦК в отношении малаоксона. Результаты, полученные для различных количеств иммобилизованного фермента на электроде, представлены на рис.2. Как видно, увеличение тока окисления тиохолина сопряжено со снижением чувствительности определения ингибитора.

(CH3)3N+CH2CH2-SH-^-*- 1/2 (CH3)3N+CH2CH2-S-S-CH2CH2N+(CH3)3

(1)

—•— I, мкА -А- |%

63

64

60

0.0

56

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 С ед.активности/электрод

Рисунок 2 - Зависимость тока окисления тиохолина (I, мкА) и степени ингибиро-вания АХЭ (1%) после 15 мин. инкубирования в растворе 20 мкг/л малаоксона от количества фермента, иммобилизованного на электроде (Е/электрод). Электрод

Исходя из соотношения погрешности измерения и чувствительности измерения ингибирования признано целесообразным использовать в дальнейшем концентрацию фермента 0.0065 Е АХЭ на электрод.

При использовании УС максимум тока окисления тиохолина наблюдается в интервале +100. ..+150 мВ, совместно с ФЦК - при потенциале 0 мВ. В дальнейшем для измерения сигнала электрод поляризовали при +100 мВ, что обеспечило наиболее стабильный и воспроизводимый отклик ацетилхолинэстеразного сенсора на тиохолин. Зависимость сигнала от количества АХЭ, взятого для иммобилизации, имело вид, сходный с полученным в присутствии ОУН.

Помимо наноуглеродных материалов, в качестве матрицы для иммобилизации АХЭ были изучены поликарбоксилированные производные тиака-ликс[4]аренов, различающиеся по длине цепи заместителей нижнего обода и конфигурации макроцикла. Они также могут неспецифически концентрировать фосфорорганические пестициды, повышая чувствительность их определения. На рис. 3 представлена зависимость сигнала ацетилхолинэстеразных сенсоров, модифицированных тиакаликс[4]аренами 16, 3 и 4, от их количества на электроде. Сначала при увеличении поверхностной концентрации тиакаликс[4]аренов анодный ток окисления тиохолина растет, что обусловлено увеличением количества АХЭ в слое.

модифицирован ОУН и ФЦК

1Е-14 1Е-12 1Е-10

С моль/мм2

Рисунок 3 - Зависимость сигнала АХЭ сенсоров, модифицированных тиака-ликс[4]аренами 16,3 и 4 и ФЦК, от количества тиакаликс[4]арена (Ста) на поверхности. Хроноамперометрические измерения при +200 мВ, 1.0 мМ АТХ

С последующим увеличением концентрации макроциклов свыше 0.01 нМ/мм2 наблюдается уменьшение токов. Это связано с уменьшением проводимости поверхностного слоя сенсора в связи с включением в него избытка неактивных компонентов. В дальнейших исследованиях использовали поверхностную концентрацию тиакаликс[4]аренов 0.03 нМ/мм2. Она обеспечивала достаточное количество центров связывания для иммобилизации фермента и почти не снижала проводимость поверхностного слоя сенсора. Характеристики определения АТХ с помощью разработанных сенсоров приведены в табл. 3. При высоких концентрациях АТХ (около 10 мМ) токи снижаются в силу автоингибирования фермента.

В серии конформеров частичный конус (16, 26) и 1,3-альтернат (1в, 2в) показывают более высокую чувствительность сигнала (угол наклона градуиро-вочной зависимости) по сравнению с конфигурацией конус. Минимальная чувствительность наблюдается для сенсора с 1а конус с максимальным количеством карбоксильных групп в заместителях. Тиакаликс[4]арены 3, 4 с одной карбоксильной группой обладают наибольшей чувствительностью и минимальным пределом обнаружения субстрата. Добавление тиакаликс[4]арена 16 и 5 в поверхностный слой ОУН и УС снижает чувствительность определения АТХ.

Константу Михаэлиса Кш ) вычисляли методом Лайнуивера-Берка путем построения зависимости в двойных обратных координатах 1/1 - 1/сАТХ, где I -сигнал биосенсора, а Сдтх - концентрация субстрата.

Таблица 3. Аналитические характеристики определения АТХ с помощью биосенсоров, модифицированных различными компонентами совместно с ФЦК

Модификаторы + ФЦК Фермент, Е / электрод ДОК, мМ мМ кт (каж.), мМ I, мкА = а + b х сАтх, М

а b R

ОУН 0.00625 0.01 - 1.0 0.01 0.78 0.0463 463.2 0.9904

УС 0.00625 0.01 - 1.0 0.01 0.72 0.0529 507.4 0.9924

ОУН+16 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 0.74 0.0577 344.0 0.9278

УС+ 16 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 0.78 0.0809 372.2 0.9812

ОУН+ 5 0.0125 0.1 - 1.0 0.1 2.71 0.0369 259.6 0.9978

УС+ 5 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 0.50 0.0369 244.9 0.9547

1а 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 0.75 0.0127 162.4 0.9737

16 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 1.40 0.0189 455.1 0.9872

1в 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 0.61 0.0264 383.4 0.9892

2а 0.0125 0.01 -1.0 0.01 1.20 0.0171 306.9 0.9863

26 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 1.12 0.0198 332.4 0.9835

2в 0.00625 0.1 - 1.0 0.1 1.22 0.0456 498.8 0.9930

3 0.00625 0.01 - 1.0 0.01 1.93 0.0066 509.0 0.9993

4 0.00625 0.01 - 1.0 0.01 1.81 0.0032 666.9 0.9931

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОСЕНСОРОВ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ

С целью изучения влияния наноматериалов, использованных для модификации поверхности сенсора и иммобилизации фермента, на поведение ингиби-торных биосенсоров проведено сравнительное исследование биосенсоров для определения необратимых ингибиторов АХЭ - фосфорорганических пестицидов в модельных растворах. Эксперименты проводили, используя в качестве преобразователя сигнала печатные графитовые электроды. Предварительно было показано, что электрохимические реакции на них не отличались от процессов на СУЭ.

Для оценки влияния использованных модификаторов на взаимодействие иммобилизованного фермента с пестицидами были рассчитаны кажущиеся константы бимолекулярного взаимодействия фермент-ингибитор. Для этого использовали уравнение (2) принимая регистрируемый ток окисления тиохолина мерой скорости ферментативной реакции.

4 /_ , где 10 и / - сигнал сенсора до и после инкубирования в рас-

Щ_— ^ £ ^ /<-\\

I 1 творе ингибитора, ^п(каж)' кажущаяся константа бимолеку-

лярного взаимодействия, С[ - концентрация ингибитора, т -время инкубирования Рассчитанные значения &щкаж) представлены в табл.4. Для всех изученных биосенсоров значения Лп(хаж)> полученные для малаоксона, оольше, чем для параоксона, хотя для нативного фермента соотношение обратно (0.287 и 0.114 мкМ"1 мин'1, соответственно). Сравнение показывает, что для параоксона иммобилизация фермента слабо влияет на необратимое ингибирование АХЭ, тогда как для малаоксона иммобилизация увеличивает изменение активности на порядок величины.

Таблица 4. Кажущиеся константы бимолекулярного ингибирования иммобилизованной АХЭ ки (каж), мкМ"1мин"', для холинэстеразных сенсоров с различными модификаторами и ФЦК в составе поверхностного слоя.

Модификаторы + ФЦК *П(каж), МКМ-'МИН1

Параоксон Малаоксон

ОУН 0.255±0.006 1.103+0.053

УС 0.539±0.115 0.853+0.090

ОУН+ 16 0.290±0.023 1.094+0.051

УС+ 16 0.458+0.019 1.162+0.067

ОУН+ 5 0.114+0.008 0.661+0.041

УС+ 5 0.277+0.025 1.139+0.113

1а 0.315+0.010 1.070+0.063

16 0.737+0.063 1.124+0.106

1в 0.289+0.018 1.508+0.120

2а 0.539+0.025 1.108+0.133

26 0.300+0.027 1.329+0.090

2в 0.319+0.018 1..072+0.060

3 0.221+0.009 0.891+0.061

4 0.370+0.029 0.404+0.011

При степени ингибирования 10-50 % (10-200 мкг/л параоксона и 2 - 50

16

мкг/л малаоксона) зависимость степени ингибирования от логарифма концентрации пестицида может быть аппроксимированы линейной функцией. Полная концентрационная зависимость степени ингибирования, измеренная при помощи разработанных биосенсоров, количественно выражается логистической функцией (2),

где 1% - степень ингибирования АХЭ, %, ст - конго/ л , А центрация пестицида, мкг/л, А1 и А2 - верхний и 1/о = А2+---— (2)

| с, нижнии пределы ингибирования, х0 - параметр,

I х0 J близкий к 150, р - мера чувствительности опреде-

ления ингибирования В табл. 5 и 6 представлены параметры логистической функции зависимости степени ингибирования от концентрации пестицидов в модельных растворах.

Таблица 5. Аналитические характеристики определения параоксона, мкг/л, с помощью разработанных ацетилхолинэстеразных сенсоров

Модификаторы + ФЦК /о/о 1+Ы 4*0

а, а2 х0 Р Я

ОУН 1.40±0.23 100.00+8.32 50.31+10.84 1.4104+0.2612 0.9907

УС 9.43+1.79 100.00+10.27 58.68+11.56 1.0420+0.2413 0.9889

ОУН+16 4.59+0.56 86.77+4.59 44.13+3.52 1.4941+0.2567 0.9871

УС+ 16 1.50+0.57 100.00+11.03 37.43+9.62 1.0502+0.2769 0.9826

ОУН+ 5 8.35+1.46 89.30+3.01 94.43+3.07 1.9293+0.2036 0.9993

УС+ 5 0.00+0.30 100.00+9.49 46.89+5.82 0.9895+0.2854 0.9956

1а 4.06+1.74 93.94+4.56 42.94+3.40 1.1765+0.1903 0.9952

16 6.82+1.02 100.00+8.27 49.97+7.38 1.0241+0.2147 0.9911

1в 6.25+1.33 100.00+4.03 55.84+4.62 1.1488+0.1247 0.9956

2а 3.24+0.71 100.00+2.59 39.78+1.39 1.0480+0.1124 0.9983

26 0.00+0.42 100.00+10.03 38.25+6.55 1.2069+0.2440 0.9930

2в 3.98+1.09 77.58+2.60 28.86+1.74 1.3014+0.1746 0.9915

3 1.47+0.14 100.00+4.25 59.54+3.70 1.1917+0.1292 0.9983

4 4.30+1.77 100.00+9.08 98.83+10.94 0.9858+0.1832 0.9937

Таблица 6. Аналитические характеристики определения малаоксона, мкг/л, с помощью разработанных ацетилхолинэстеразных сенсоров

Модификаторы + ФЦК 1%-Л1+ 4 Аг г \р 1+Ы и»;

А, А2 Хо Р 11

ОУН 9.90±0.71 87.78+1.52 12.22+0.50 1.6874+0.1141 0.9881

УС 15.16±1.67 100.00+8.89 21.20+2.22 1.7566+0.2128 0.9859

ОУН+16 4.81+2.61 85.57+5.11 11.17+1.53 1.3643+0.2800 0.9886

УС+ 16 9.62+1.56 74.93+5.45 8.57+112 2.0690+0.4661 0.9929

ОУН+ 5 4.56+1.40 99.55+10.96 27.04+380 1.0764+0.1744 0.9966

УС+ 5 6.02+2.28 100.00+5.02 12.26+1.45 1.0956+0.1579 0.9965

1а 5.79+2.53 100.00+7.09 14.13+136 1.2158+0.2319 0.9926

16 14.65+2.76 80.63+5.72 11.64+1.17 1.4328+0.2018 0.9772

1 в 0.00+0.98 98.01+2.89 6.74+0.47 0.9780+0.0602 0.9996

2а 0.00+5.74 100.00+9.50 10.33+1.11 0.9440+0.2578 0.9916

26 7.77+1.39 100.00+14.19 11.54+1.58 1.0481+0.1994 0.9913

2в 12.13+0.56 94.86+1.70 14.97+0.65 1.4873+0.0832 0.9991

3 3.62+1.39 100.00+5.86 15.15+1.14 1.3480+0.1926 0.9916

4 0.00+5.92 100.00+11.21 31.11+246 1.2901+0.2951 0.9938

Недостатком использования логистических функций является относительная сложность расчетов, однако такая функция наиболее полно описывает исходные данные. Это следует из больших значений Я и из анализа остатков - отклонений экспериментальных данных от аппроксимирующих функций. Они меньше по абсолютным значениям и распределены более однородно в зависимости от концентрации пестицида по сравнению с линейной зависимостью.

В табл.7 представлены показатели 115 и 150 (концентрации ингибиторов, вызывающие 15% и 50% ингибирования) разработанных биосенсоров для параок-сона и малаоксона. Критерием чувствительности сигнала биосенсоров к определяемым пестицидам может служить показатель 150, а 1и можно считать пределом обнаружения пестицида по критерию За (погрешность измерения ингибирования 5%).

Таблица 7. Значения 1и и 150 иараоксона и малаоксона, рассчитанные по логистической функции концентрационной зависимости сигнала

Модификаторы + ФЦК Параоксон, мкг/л Малаоксон, мкг/л

Iis Iso Iis Iso

ОУН 13.71 49.30 2.53 12.66

УС 4.29 48.02 2.88 17.26

ОУН + 16 12.12 50.82 2.70 13.31

УС+ 16 6.49 36.36 2.67 10.83

ОУН+ 5 27.03 97.32 3.87 24.95

УС+ 5 8.12 46.89 1.57 10.90

1а 8.01 44.60 2.27 12.77

16 5.08 43.30 2.14 12.87

1в 7.72 49.71 1.17 7.02

2а 6.03 37.32 1.65 10.33

26 9.09 38.25 1.10 9.82

2в 7.60 42.77 1.60 13.36

3 12.73 58.06 3.41 14.33

4 12.08 90.22 8.11 31.11

Найденные значения 115 хорошо согласуются со значениями кщкаЖ), представленными в табл.4. Наименьшими пределами обнаружения при определении параоксона обладают сенсоры, модифицированные УС (115 = 4.29 мкг/л, кц1КЛЖ)~ 0.539±0.215), и тиакаликс[4]ареном 16 (115 = 5.08 мкг/л, кЩшж) = 0.737±0.063 икМ^мин'1). При обнаружении малаоксона наилучшие показатели показали биосенсоры, включающие тиакаликс[4]арен 26 частичный конус (1]5 = 1.10 мкг/л, ^Щкаж) = 1.329±0.090 мкМ^мин1) и 1в 1,3-альтернат (Iis = 1.17 мкг/л, &П(каж) = 1.508±0.120 мкМ 'мин"1).

Ацетихолинэстеразные сенсоры, модифицированные ОУН, ФЦК и тиака-ликс[4]ареном 16, были использованы для оценки возможности применения в контроле реальных объектов. Для этого использовали бутилированную питьевую воду «Волжанка» (Ундоровский завод минеральной воды «Волжанка»), приобретенную в местной торговой сети, и водопроводную воду г. Казани, отобранную непосредственно по месту проведения анализа. Для оценки влияния матрицы образцов и эффективности сенсоров при определении пестицидов ис-

пользовали метод «введено-найдено». Измерения степени ингибирования, проведенные по той же методике в образцах воды без введения ингибиторов, не показали ни значимого снижения сигнала, ни активации фермента. Таким образом, компоненты матрицы исследованных образцов не оказывали необратимого действия на фермент. Результаты определения представлены в таблице 8.

Таблица 8. Оценка правильности определения пестицидов в воде методом «введено-найдено» с помощью ацетилхолинэстеразных сенсоров, п = 3, Р<0.05

Модификаторы + Параоксон, мкг/л Малаоксон, мкг/л

ФЦК Введено Найдено Введено Найдено

Питьевая вода "Волжанка 1

ОУН 30.0 33.3 ±3.1 2.0 2.2 ±0.4

ТиакаликсГ4]арен 16 30.0 25.2 ±4.0 10.0 8.9 ± 2.2

Водопроводная вода

ОУН 30.0 32.1 ±0.5 5.0 6.2 ± 0.5

Тиакаликс[41арен 16 30.0 25.3 ±3.9 10.0 8.7 ± 1.0

Биосенсор, модифицированный ОУН, всех случаях показывает несколько завышенные результаты, в то время как с сенсором, модифицированным тиака-ликс[4]ареном 16, результаты определения пестицидов оказываются заниженными по сравнению с введенным количеством ингибиторов.

Для повышения эффективности определения малатион предварительно окисляли до малаоксона по оригинальной методике с использованием хлора, генерированного in situ в процессе электролиза, проводимого в присутствии хлорида натрия. Избыток хлора после электролиза удаляли муравьиной кислотой. Для контроля методом «введено-найдено» были использованы сенсоры на основе тиакаликс[4]аренов 16, 1в и 26, характеризующиеся наименьшим пределом обнаружения малаоксона. Инкубирование биосенсоров в растворах, полученных при электролиза в отсутствие пестицида, не приводило к значимому изменению сигнала биосенсора. Результаты, полученные при тестировании бутилированной воды, содержащей 2.6 мкг/л малатиона, приведены в табл.9. Наиболее точные результаты были получены при использовании биосенсора, модифицированного тиакаликс[4]ареном 16. Все три протестированных сенсора могут быть использованы для обнаружения малатиона на уровне 2.5 мкг/л (10 мкг/л с учетом разбавления раствора при пробоподготовке), что отвечает установленному нормативу содержания в питьевых водах.

Таблица 9. Оценка правильности определения малатиона методом «введено -найдено» после его электрохимического окисления, п = 3, Р<0.95

Модификаторы + ФЦК Концентрация малатиона, мкг/л

Введено Найдено

Тиакаликс[4]арен 16 2.6 2.6 ±0.3

Тиакаликс[4]арен 1в 2.6 2.5 ± 1.3

Тиакаликс[4]арен 26 2.6 3.2 ±0.9

Для контроля правильности определения малатиона в свежевыжатых соках из винограда и апельсина методом «введено-найдено» были использованы сенсоры на основе тиакаликс[4]аренов 16, 1в и 26. Инкубирование биосенсоров в растворах соков, не содержащих пестицид, после проведения электролиза не меняло сигнал сенсоров. Характеристики чувствительности определения малатиона приведены в табл. 10.

Таблица 10. Чувствительность определения малатиона с помощью ацетилхолинэстеразных сенсоров, модифицированных тиакаликс[4]аренами и ФЦК

Концентрация малатиона, мкг/л

Модификаторы + ФЦК Виноградный сок Апельсиновый сок

1.5 15о 1.5 150

Тиакаликс[4]арен 16 5 500 5 400

Тиакаликс[4]арен 1в 5 500 5 400

Тиакаликс[4]арен 26 5 450 5 350

Результаты измерений показали сильное влияние матрицы исследуемых соков на сигнал ацетилхолинэстеразных сенсоров. По сравнению с водными растворами пестицида значительно увеличивается предел обнаружения и резко снижается чувствительность сигнала к малатиону. Причинами этого могут быть неполное окисление малатиона до малаоксона и маскирование ингибирующего действия пестицида компонентами матрицы сока Увеличение времени электролиза сока с введенным известным количеством малатиона с 1 до 5 мин. не меняло степени ингибирования фермента. Следовательно, наиболее вероятным является взаимодействие компонентов матрицы сока или с малатионом, или с продуктами его окисления.

выводы

1. Использование наноразмерных материалов - носителей фермента и медиаторов электронного переноса (фталоцианин кобальта, окисленные углеродные нано-трубки, углеродная сажа, карбоксилированные тиакаликс[4]арены) - в качестве модификаторов углеродных электродов в составе холинэстеразных сенсоров позволяет направленно регулировать чувствительность биосенсоров в отношении субстрата и ингибиторов холинэстераз, меняя предел обнаружения в 3-8 раз и наклон градуировочных зависимостей малаоксона и параоксона - в два раза.

2. Совместное использование фталоцианина кобальта с окисленными углеродными нанотрубками, углеродной сажей или карбоксилированными тиака-ликс[4]аренами снижает рабочий потенциал окисления тиохолина до 100-200 мВ отн. А{»/А§С1 и позволяет проводить измерения сигнала холинэстеразного сенсора в хроноамперометрическом режиме.

3. Разработан способ иммобилизации ацетилхолинэстеразы путем карбодиимид-ного связывания на окисленных наноуглеродных материалах (нанотрубки, сажа) и поликарбоксилированных макроциклических рецепторах на тиакаликсарено-вой платформе, позволивший сократить количество иммобилизованного фермента, упростить процедуру изготовления биосенсора и контролировать в широких пределах сигнал биосенсора в отношении ацетилтиохолина и чувствительность определения фосфорорганических ингибиторов фермента (параоксон и малаоксон).

4. Использование поликарбоксилированных тиакаликс[4]аренов в конфигурации конус по сравнению с конфигурациями частичный конус и 1,3-альтернат снижает количество иммобилизованного фермента при сохранении сигнала биосенсора и уменьшает чувствительность определении ацетилтиохолина.

5. С помощью разработанных биосенсоров проведена количественная характеристика ингибирования иммобилизованной ацетилхолинэстеразы параоксоном и малаоксоном и установлен характер влияния наноразмерных модификаторов на бимолекулярную константу ингибирования, предел и чувствительность определения ингибиторов. Наименьшими пределами обнаружения параоксона обладают биосенсоры, модифицированные углеродной сажей и тиакаликс[4]ареном 16, несущим 8 карбоксильных групп, в конфигурации частичный конус. При обнаружении малаоксона наименьшими пределами обладают сенсоры, модифицированные тетракарбоксилированным тиакаликс[4]ареном 26 (частичный конус) и макроциклом 1в с 8 карбоксильными группами (конус).

6. Электрохимическое окисление малатиона в электролизе в присутствии хлорида натрия позволяет проводить определение до 2 мкг/л малатиона в бутилиро-ванной и водопроводной воде и до 5 мкг/л - в свежевыжатом виноградном и апельсиновом соках при использовании в качестве модификаторов фталоциани-на кобальта и тиакаликс[4]аренами 16, 1в и 26.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ivanov, A.N. Acetylcholinesterase biosensor based on single-walled carbon nano-tubes - Co phtalocyanine for organophosphorus pesticides detection [Text] / A.N. Ivanov, R.R.Younusov, G.A.Evtugyn, F.Arduini, D.Moscone, G.Palleschi // Talanta -2011,-V.85,- P.216-221.

2. Evtugyn, G.A. Cholinesterase biosensors based on screen-printed electrodes modified with Co-phtalocyanine and polycarboxylated thiacalixarenes [Text] / G.A. Evtugyn, R.R. Younusov, A.N.Ivanov, R.R.Sitdikov, A.V.Galuchin, H.C.Budnikov, I.I.Stoikov, I.S.Antipin // Electroanalysis - 2012,- V.24, №3,- P.554-562.

3. Evtugyn, G. Nanomaterials in the cholinesterase biosensors for inhibitor determination / G.Evtugyn, R.Younusov, A.Ivanov // In: Portable Chemical Sensors: Weapons against Terrorism (D.P.Nikolelis Ed.). NATO Science for Pease and Security Series A: Chemistry and Biology, Springer Science + Business Media B .V.- 2012.- P.227-244.

4. Evtugyn, G.A. Electrochemical biosensors for nerve agent detection based on nanostructured biorecognition layers [Text] / G.A.Evtugyn, A.N.Ivanov, R.R.Younusov // NATO ARW Symposium «Portable chemical sensors for the rapid detection of chemical and biological agents and other weapons of terrorism». Lund -Snogeholm Slotts. 2011.- P.22-23.

5. Иванов, A.H. Холинэстеразные биосенсоры на основе углеродных нанотрубок и углеродной сажи [Текст] / Иванов А. Н., Юнусов Р. Р., Будников Г. К., Евтю-гин Г. А. // VIII Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012»: Материалы конф. Уфа-Абзаково, 3-9 июня 2012 г. / Отв. ред. В.Н. Майстренко,- Уфа: РИЦ БашГУ, 2012. - с.95.

6. Юнусов, P.P. Ацетилхолинэстеразный биосенсор на основе нанокомпозитов одностенных углеродных нанотрубок и фталоцианина кобальта [Текст] / Р.Р.Юнусов, А.Н.Иванов // X Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии 21 века». Казань,- 2011.- С. 117.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 28.10.2013 г. Печ.л. 1,5 Заказ № К-7320. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.