Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов

Зиятдинова, Гузель Камилевна

Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Зиятдинова, Гузель Камилевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Казань МЕСТО ЗАЩИТЫ

2005 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов»

Автореферат диссертации на тему "Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов"

На правах рукописи

Зиятдинова Гузель Камилевна

ЭЛЕКтроХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЕМКОСТИ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

02.00.02- аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань-2005

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического института им. А.М.Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанского государственного университета им. В.И.Ульянова-Ленина"

Научный руководитель: академик РАЕН и МАНВШ, доктор химических наук, профессор Будников Герман Константинович Научный консультант: кандидат медицинских наук,

доцент Погорельцев Валерий Ильич

Официальные оппоненты доктор химических наук,

профессор Гармонов Сергей Юрьевич

кандидат химических наук,

доцент Казымова Марина Александровна

Ведущая организация: Уральский государственный

экономический университет

Защита состоится « 9 » июня 2005 г. в 14 ч. на заседании диссертационного Совета К 212.081.04 по химическим наукам Казанского государственного университета по адресу: ул. Кремлевская 18, КГУ, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская 18, КГУ, Научная часть.

Автореферат разослан « 6 » мая 2005 г.

Ученый секретарь Совета, кандидат химических наук

Л.Г.Шайдарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Антиоксиданты (АО) - это важнейший объект исследования и анализа в науках о жизни. Причин такого внимания много. Одна из них состоит в профилактике старения организма и свободнорадикальных патологий, таких как, заболевания сердечно-сосудистой системы, неврологические, онкологические и другие заболевания. Биоантиоксиданты создают систему антиоксидантной защиты, в которой они снижают одновременно как интенсивность свободнорадикального окисления, так и тяжесть клинических симптомов. Поэтому очень важной становится проблема контроля состояния анти-оксидантной системы организма человека, а, следовательно, и антиоксидантно-го статуса при патологиях различного типа с целью дальнейшей терапевтической коррекции. Клиническая диагностика антиоксидантного (оксидантного, так как эти две системы уравновешивают друг друга в рамках гомеостаза) статуса организма затруднена, поскольку в практической медицине отсутствуют лабораторно-биохимические методы, позволяющие дать интегральную оценку этого параметра. Существуют клинические методики, по которым оценивают отдельные лабораторные показатели (содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ): малонового диальдегида, диеновых коньюгатов; активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы), которые не всегда пригодны для доказательной диагностики и терапевтической коррекции патологического процесса.

Однако следует отметить, что в последнее время все большее внимание уделяется способам определения суммарного содержания АО, которое можно рассматривать как общий показатель состояния объекта анализа в оценке его антиоксидантных свойств, отражающей антиоксидантный статус организма. Существующие способы контроля АО основаны на применении хроматографии, спектрофотометрии и хемилюминесцентных методов, являющихся весьма трудоемкими, длительными и дорогостоящими. При этом в ряде случаев определяются или индивидуальные АО, или только отдельные их группы. Полученные результаты исследований часто несопоставимы, поскольку получены с использованием различных модельных систем.

Интенсивные исследования последних лет по созданию способов оценки антиоксидантных свойств биосубстратов свидетельствуют о том, что проблема разработки новых, экспрессных, универсальных и доступных методов их определения остается актуальной.

Основное свойство АО заключается в их способности легко окисляться и принимать участие в радикальных и окислительно-восстановительных реакциях. Поэтому определенную перспективу представляют способы скрининга ан-тиоксидантной емкости (АОЕ) биосубстратов с помощью электрохимических методов.

зателя "интегральная АОЕ", по которому можно сделать заключение о состоянии системы антиоксидантной защиты организма человека, а, следовательно, и об его антиоксидантном статусе.

В соответствии с целью исследования в работе поставлены следующие задачи:

• показать возможность применения гальваностатической кулонометрии и вольтамперометрии для определения индивидуальных АО различной природы в модельных растворах, лекарственных формах и биологических жидкостях человека;

• оценить возможность кулонометрического определения индивидуальных АО в присутствии биологической матрицы;

• разработать способы электрохимической оценки интегральной АОЕ биологических жидкостей, пригодных для клинических лабораторий;

• определить интегральную АОЕ крови и ее компонентов с применением электрогенерированных частиц брома и кислорода.

• выявить взаимосвязь между интегральной АОЕ и основными индивидуальными показателями антиоксидантного статуса: содержанием малонового диальдегида, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и металлов переменной валентности (Ре, Си, Мп, Сг и N1) и активностью каталазы.

Научная новизна. Определены стехиометрические коэффициенты в реакциях ряда АО (восемь соединений) с электрогенерированными галогенами и на основе экспериментальных и литературных данных предложены возможные схемы реакций. Установлены потенциалы окисления АО на стационарных электродах из платины, графита и стеклоуглерода в условиях вольтамперомет-рии, обсуждены соответствующие схемы реакций. Найдены условия электрохимической генерации супероксид анион-радикала. Рассчитаны кинетические параметры его реакций с важнейшими АО. Установлено, что процесс следует ЕС-механизму.

В работе применен подход к оценке интегральной АОЕ биологических жидкостей с использованием электрогенерированных частиц брома и кислорода. Электрохимическая генерация супероксид аинон-радикала позволяет смоделировать процессы, происходящие в живых системах.

Установлено, что компоненты плазмы крови окисляются в условиях вольт-амперометрии, ток окисления является мерой АОЕ. Определен круг низкомолекулярных АО, которые вносят вклад в АОЕ в этом случае.

Проведено определение интегральной АОЕ крови и ее компонентов при различных типах патологий, прослежено ее изменение в ходе медикаментозной терапии.

Установлены корреляционные зависимости между величинами АОЕ, полученными кулонометрически и вольтамперометрически.

Выявлена взаимосвязь между величиной интегральной АОЕ и содержанием малонового диальдегида, ЛПНП и металлов переменной валентности (Ре, Си, Мп, Сг и N1) и активностью каталазы.

Практическая значимость. Разработаны способы кулонометрического и вольтамперометрического определения фармпрепаратов: липоевой кислоты,

катехоламинов (адреналина и допамина), мексидола, рутина и кверцетина, витаминов А и Е, кальциферолов в модельных растворах и в их лекарственных формах с величинами 8г от 0,01 до 0,09; глутатиона и сывороточного альбумина в модельных растворах и в крови человека с величиной 8г от 0,01 до 0,09. Предложен способ определения суммарного содержания свободных жирорастворимых АО в сыворотке крови человека в пересчете на а-токоферол.

Разработан подход кулонометрического определения индивидуальных АО на фоне, содержащем компоненты биологического происхождения, в частности, сыворотки крови, позволяющий свести к минимуму мешающее влияние матрицы.

Обнаружено взаимное влияние природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола, то есть системы полифенол -ионол при различных соотношениях компонентов. При введении ионола наблюдается каталитический эффект. Установлены соотношения, при которых наблюдается максимальное увеличение волны окисления полифенолов, что связано с регенерацией молекулы полифенола.

Проведена оценка интегральной АОЕ крови и ее компонентов при различных типах патологий. На основе экспериментальных данных величина АОЕ предлагается для предварительного скрининга антиоксидантного статуса организма человека и как показатель качества лечения, в том числе и при оперативных вмешательствах, то есть может служить репером в ходе лечения пациентов с различными типами патологий.

Разработанные способы определения интегральной АОЕ характеризуются точностью, хорошей воспроизводимостью и экономичностью и могут быть рекомендованы к применению в клинических лабораториях для первичного скрининга антиоксидантного статуса организма человека и его последующей коррекции.

Назащиту выносятся:

1. Разработанные способы определения фармацевтических препаратов различной природы в модельных растворах и лекарственных формах методами гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных галогенов и вольтамперометрии.

2. Предложенные электрохимические способы определения глутатиона, сывороточного альбумина и жирорастворимых АО в биологических жидкостях.

3. Результаты исследования взаимного влияния природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола по данным вольтамперометрии.

4. Результаты определения интегральной АОЕ крови и ее компонентов с помощью электрогенерированного брома и супероксид-анион-радикала и обсуждение корреляции АОЕ с содержанием малонового диальдегида, ЛПНП и металлов переменной валентности (Бе, Си, Мп, Сг и N1) и активностью катала-зы.

5. Величины интегральной АОЕ крови и ее компонентов при различных типах патологических процессов в организме, в том числе и генетического характера. Влияние антиоксидантной терапии на интегральную АОЕ.

6. Разработанный вольтамперометрический способ оценки интегральной АОЕ плазмы крови.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены в устных докладах на VIII Научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2003 г.), Объединенной международной научной конференции "Новая геометрия природы" (Казань, 2003 г.), IX Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004 г.), Всероссийской конференции "Аналитика России" (Москва, 2004 г.), Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2005 г.) и стендовых докладах на III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003 г.), X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2003 г.), IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 2003 г.), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), IV Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2004 г.), VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием (Уфа, 2004 г.), V Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 статей и тезисы 15 докладов. Издано методическое пособие и получен патент РФ.

Диссертация выполнена при поддержке программы "Университеты России" (проект 06.01.004 "Реакции электрохимически генерированных частиц кислорода и галогенов с антиоксидантами и их применение в анализе сложных биологических объектов" и проект 06.01.085 "Возникающие реагенты в электроаналитической химии антиоксидантов") и научно образовательной программы CRDF и Минобразнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века" REC-007 "Развитие методов оценки антиоксидантных свойств биологического материала, основанных на электрохимии" и "Вольтамперометрическая оценка интегральной антиоксидатной емкости плазмы крови"), фанта АН РТ№ 07-7.3-176 "Создание научных основ определения интегральной антиоксидант-ной емкости биологических жидкостей и оценки антиокислительного статуса организма человека" и гранта Федерального агентства по образованию № А04-2.11-116 "Электрохимическая оценка антиоксидантных свойств соединений фенольного ряда".

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 187 страницах, содержит 42 таблицы, 37 рисунков и библиографию из 213 наименований. Работа состоит из предисловия, введения, литературного обзора, трех глав экспериментальной части, в которых описана постановка задачи, аппаратура, объекты и техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением, выводов и списка цитируемой литературы.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В литературном обзоре (глава 1) рассмотрены общие вопросы, связанные с АО как объектами анализа, способы их определения в биологических объектах, приведены соответствующие метрологические показатели. Дана характеристика общему показателю интегральнаяАОЕ и описаны способы его оценки.

Во второй главе представлены данные об объектах исследования, используемых методах и приборах, описаны условия эксперимента.

Главы 3 и 4 посвящены обсуждению полученных результатов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Электрогенерацию галогенов осуществляли на потенциостате П-5827 М при постоянной силе тока 5,0 мА из водных 0,2 М растворов КС1 и КВг в 0,1 М H2SO4 и Ы на фоне виннокислого буферного раствора с рН=3,56. Кроме того, электрогенерацию брома и иода проводили из 0,2 М (C2H5)4NBг в 0,1 М НС1О4 и 0,1 М (С2Н5)4М в 0,5 М NaCЮ4 в ацетонитриле, соответственно, со 100 % выходом по току. Конечную точку кулонометрического титрования определяли амперометрически с двумя поляризованными игольчатыми платиновыми электродами (ДЕ=300 мВ). Кривая кулонометрического титрования имеет вид.

Для автоматической регистрации вольтамперограмм использовали двухко-ординатный регистрирующий прибор ПДА-1 и анализатор "Экотест-ВА". Вольтамперограммы исследуемых растворов регистрировали на стационарных электродах с линейной разверткой потенциала. Для измерения использовали рабочие электроды из платины, графита и стеклоуглерода. Вспомогательный электрод состоял из платиновой проволоки, свернутой спиралью. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный каломельный и хлоридсереб-ряный электроды.

В работе использовали реактивы марок о.с.ч., х.ч., ч.д.а. и фармакопейной чистоты. Образцы крови и ее компонентов получали следующим образом. Брали артериальную (из артериального шунта у пациентов с ХПН) и венозную (из локтевой вены) кровь. Кровь помещали в пробирки, содержащие небольшое количество гепарина в качестве антикоагулянта. Плазму крови получали центрифугированием в течение 5 минут при 3000 об/мин. Для получения сыворотки цельную кровь помещали в чистые сухие центрифужные пробирки и оставляли стоять некоторое время, после чего осторожно тонкой стеклянной палочкой обводили стенки пробирки для отделения сгустка, а затем центрифугировали. Прозрачный центрифугат - сыворотка крови.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Электрохимическое определение индивидуальных антиоксидантов в биологических жидкостях и лекарственных формах

Методами гальваностатической кулонометрии и вольтамперометрии проведено определение индивидуальных АО в модельных растворах, лекарственных формах и биологических жидкостях. Для кулонометрического определения были исследованы кулонометрические титранты-окислители - галогены

Липоевая кислота. Результаты кулонометрического титрования позволили установить стехиометрические коэффициенты реакций липоевой кислоты с электрогенерированными хлором, бромом и иодом, протекающих по схемам:

СН2—СН2—СН—(СНД-СООН + 5С12 + 6Н20-»■ СН2—СН2—СН-(СН2)4-СООН +10 на (I)

Б- в БО}Н БСЬН

СН,—СН,—СН—(СН,)4-СООН +28г2+2Н,0-СН2—СН,—СН-(СН,)4-СООН +4НВг (2)

СН2-СН2—СН-(СН2)4-СООН + 2 !г + 2НгО 5- в

Результаты кулонометрического определения АО в модельных растворах представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты кулонометрического определения липоевой кислоты в модель-

ных растворах электрогенерированными галогенами

Титрант Введено, мкг Найдено, мкг 5,

48 48,0±0,9 0,02

сь 96 93±1 0,01

192 192±1 0,01

96 98±1 0,01

Вг2 192 198+5 0,01

т 287+3 0,01

96 96±3 0,02

192 191±4 0,02

288 282+3 0,02

Установлено, что в условиях вольтамперометрии липоевая кислота окисляется лишь на стеклоуглеродном электроде на фоне 0,05 М НгЭО^ На вольт-амперограммах наблюдается пик окисления при потенциале

Предельный ток окисления линейно возрастает с повышением концентрации липоевой кислоты в интервале концентраций: 1,15x1041,ТЗхЮ^М. Уравнение регрессии имеет следующий вид:

У=(1,07+0,03) + (0,152±0,003) X г=0,9999

Нижняя граница определяемых содержаний липоевой кислоты (по За критерию) составила 5,75х10-6 М.

Катехоламины. Исследована возможность кулонометрического определения катехоламинов: адреналина и допамина.

Адреналин реагирует быстро и количественно только с элекгрогенериро-ванными реакция протекает неоднозначно вследствие его высокой

реакционной способности.

В реакции адреналина с электрогенерированными Вг^ И участвуют три электрона. По результатам кулокометрического титрования можно предложить следующую схему реакции:

Аналогично протекает реакция с элекгрогенерированным иодом. Допамин взаимодействует лишь с электрогенерированными С1г И ВГг с участием двух электронов. Полученные результаты позволили предложить следующую схему:

Результаты кулонометрического определения катехоламинов в модельных раствор?х представлены в табл. 2. Правильность оценена по способу "введено" - "найдено".

Таблица 2

Результаты кулонометрического определения адреналина и допамина в модельных растворах

На основе полученных результатов проведено определения содержания основного компонента в лекарственных формах катехоламинов, что иллюстрирует табл. 3.

Таблица 3

Результаты кулонометрического определения катехоламинов в лекарственных препаратах

Объект Определяемое соединение Содержание, мг/мл Ттрант Найдено, мг/мл Яг

Адреналина гидротарчрат, раствор для инъекций Адреналин 1,0 Вг2 0,982±0,006 0,01

Ь 0,985±0,004 0,01

Допамин, рас-тюр для инъекций Допамин 5,0 С12 4,95±0,04 0,01

Вг2 4,98±0,07 0,01

Для вольтамперометрического определения катехоламинов применяли стационарные электроды из платины, графита и стеклоуглерода.

Кислород воздуха очень легко окисляет гидрохиноновый фрагмент молекул катехоламинов, а в щелочных средах окисление значительно ускоряется, поэтому определение проводили на фоне 0,1 М НгБО,).

На циклических вольтамперограммах адреналина и допамина наблюдаются обратимые пики окисления при 0,7,0,7 и 0,58 В на стационарных электродах из платины, графита и стеклоуглерода соответственно. Анодный ток связан с концентрацией катехоламинов.

Параметры градуировочных зависимостей тока окисления катехоламинов от их концентрации представлены в табл. 4.

Таблица 4

Параметры градуировочных зависимостей для анодного пика на фоне от концентрации катехоламинов

Определяемое соединение Электрод Нижняя гранита определяемых содержаний, М Диапазон концентраций, М Уравнение регрессии у=а+Ьх Я

а ЬхЮ-3

Допамин Графит СУ Л 3,3х10'5 1,1хЮ"5 6,5x10'5 6,5х10'5-И,6х]0"3 6,5х10"5*5,4х10'3 9,2хЮ"5+1,1х10'3 2±1,4 58±16 -0,4±0,1 60,8±0Д 336±6 2,82±0,02 0,9999 0,9993 0,9996

Адреналин Графит СУ И 1,6х10"5 3,3х10"5 1,1x10^ 2,2х10"'*1,8х10'3 1,6x10^1,1х10"3 1,2x10^1,4хЮ"3 -3±1 2,3±2,1 -0,5+0,1 120±10 " 1040±40 7,6±0,2 0,9997 0,9965 0,9982

Результаты вольтамперометрического определения катехоламинов в модельных растворах представлены в табл. 5.

Известно, что гидрохинон и родственные соединения, содержащие в своей структуре гидрохиноновый фрагмент, окисляются по двухэлектронному меха-

Таблица

Результаты вольтамнерометрического определения катехоламинов в модельных растворах (п=5, р=0,95)

Определяемое соединение Электрод Введено, мг Найдено, мг

0,3 0,2831,008 0,02

Графит 2,5 2,48+0,04 0,01

25,0 24,79±0,07 0,01

0,5 0,52±0,02 0,03

Допамин Стеклоуглерод 5,0 5,00+0,01 0,01

10,0 9,67+0,09 0,01

0,25 0,2410,01 0,06

14 2,5 2,47±0,02 0,01

5,0 4,97±0,03 0,01

0,08 0,076±0,003 0,03

Графит 1,0 0,99±0,03 0,02

5,0 4,98±0,08 0,01

0,06 0,057+0,002 0,03

Адреналин Стеклоуглерод 1,0 0,998±0,002 0,01

3,0 2,910,1 0,03

0,5 0,50+0,02 0,03

И 3,0 2,910,1 0,03

5,0 4,9610,06 0,01

низму. Электрохимическое окисление катехоламинов на электродах протекает согласно схеме 6 с образованием соответствующих хинонов.

Я = -СадНгШг ; -СН(ОН)СН^НСН5

На основе полученных данных определено содержание основного (действующего) вещества в фармацевтических препаратах катехоламинов (табл. 6).

Таблица 6

Результаты вольтамнерометрического определения содержания действующего вещества в лекарственных формах катехоламинов (п=5, р=0,95)

Объект Определяемое соединение Содержание, мг/мл Электрод Найдено, мг/мл

Адреналина гидротартрат, раствор для инъекций Адреналин 1,0 Графит Стеклоуглерод И 0,97±0,02 0,99±0,01 0,97±0,02 0,02 0,01 0,01

Допамин, раствор для инъекций Допамин 5,0 Графит Стеклоуглерод И 4,9±0,2 4,99±0,02 4,9±0,1 0,03 0,01 0,02

Мексидол. Предложен вольтамперометрический способ определения мек-сидола, являющегося АО, на стеклоуглеродном электроде на фоне 0,1 М Ы2804. На вольтамперограмме проявляется пик окисления при потенциале 0,5 В (рис.1).

Экспериментально установлено, что сукцинатный остаток не проявляет себя в условиях опыта. Определено содержания основного (действующего вещества) в фармпрепарате.

Флавонолы. Рутин и кверцетин окисляются на стационарных электродах из платины, графита и стеклоуглерода. Потенциалы окисления представлены в табл. 7.

Таблица 7

Потенциалы окисления флавонолов на стационарных электродах

Исходя из структуры флавонолов и имеющихся литературных данных, можно предположить, что в кислой среде в первую очередь окисляется гидро-ксильная группа кольца С (схема 7) с образованием устойчивой о-хиноидкой структуры, а затем другие ОН-группы.

Молекула рутина содержит гликозидный остаток в положении 3. Поскольку растворение проводили в щелочной среде, то в результате гидролиза, по-видимому, образуется ОН-группа в кольце С. В щелочной среде протекает только реакция окисления гидроксильной группы в кольце С.

Параметры градуировочных зависимостей для рутина и кверцетина представлены в табл. 8.

Таблица 8

Параметры градуировочных зависимостей высот ы волны окисления от концентрации флавонолов

Определяемое соединение Электрод Фоновый электролит Диапазон концентраций, М Уравнение регрессии У=а+ЬХ Я

а ЬхЮ"4

Руган 14 0,1 мьую4 7,9x10^+2,0x10"4 0,5+0,4 8,9+0,4 0,9973

Фосфатный буферный р-р, рН 7,4 3,1х10-5+2,0хЮ^ 3,2+0,3 9,9±0,3 0,9993

Графит 0,1МН2504 2,4Х10"5-2,5Х104 1,9±0,4 8,3±0,3 0,9987

Фосфатный буферный р-р, рН7,4 2,4ХЮ'5т2,5ХЮ4 1,3+03 5,2+0,2 0,9978

Кверцетин И 0,1 МН2504 8,7Х10'5+6,8Х10'4 0,07±0,03 3,56+0,07 0,9994

Фосфатный буферный р-р, РН7,4 «ЛхЮ-^ЛхЮ-4 -1,5±0,5 3,6±0,1 0,9981

Полученные результаты использовали для определения содержания рутина в таблетках рутина и аскорутина, а также кверцетина в таблетках кверцетина (табл. 9).

Таблица 9

Результаты вольтамперометрического определения рутина и кверцетина в лекарственных формах (п=5, р=0,95)

Объект Определяемое соединение Содержание, мг Электрод Фоновый электролит Найдено, мг Эг

Таблетки рутина Рутин 20 И 0,1 МН2804 рН 7,4 20±2 18±2 0,08 0,09

Графит 0,1 М Н2804 рН 7,4 20±1 19+2 0,05 0,09

Таблетки кверцетина Кверцетин 20 Р1 0,1 МН2504 рН 7,4 19±2 19,6+0,6 0,06 0,03

Таблетки аскорутина Рутин 50 Р1 0,1 М Н2504 рН 7,4 48±2 47+3 0,03 0,05

Графит 0,1 М Н2504 рН 7,4 51±2 45+4 0,04 0,08

Определение АО в биологических жидкостях, а не только в модельных системах, несомненно, представляет актуальную задачу.

Глутатион. Установлено, что реакции глутатиона с электрогенерирован-ными хлором и бромом протекают с участием 6 электронов. Исходя из результатов кулонометрического определения можно предложить следующие схемы взаимодействия:

НООС-НгС-НШС.

НООС-СН-(СН2)з—ССЖН №

Ч'Н-СНг^Н + 3 Вг5 + 3 Н20 -

нооошснгыос.

Н00С-СН-(СНг)2-С0]ЧН N112

'СН-СШ-ЭОзН + 6НВг

(8)

По аналогичной схеме протекает реакция с электрогенерированным хлором. С иодом реакция протекает с участием 2е согласно схеме 9.

НООС-Н!С-НЬЮСч

Чн-сн^н +12 НООС-^Н-(СН2)2-СОИН NH2

(9)

НООС-Н2С-ШОС.

,сош-сн2-соон

НООС-^!Н-(СН2)2-СОЫН ЫН2

Ч:Н-СН2-5-5-СН2-СН

ННОС-(СН2>2-СН-СООН

+ 2Н1

ш2

Глутатион окисляется на платиновом стационарном электроде только в кислой среде.

На вольтамперограммах глутатиона на фоне 0,05 М H2SO4 регистрируется волна с Е|д 0,95 В, высота которой связана с концентрацией глутатиона (рис. 2). При более высоких концентрациях глутатиона волна окисления приобретает форму пика.

Разработаны способы определения глутатиона в крови. В основе определения лежит предварительное осаждение белков трихлоруксусной кислотой с последующим осаждением и изолированием глутатиона раствором сульфата кадмия. При этом другие редуцирующие вещества, способные помешать определению, остаются в растворе. Осадок, содержащий глутатион, растворяли в 1 М НС1. Полученный прозрачный раствор титровали электрогенерированными бромом и иодом. Результаты кулонометрического определения глутатиона представлены в табл. 10.

Для вольтамперометрического определения интервал линейности градуи-ровочного графика 9,15х 10"5-г-2,14х I О"3 М укладывается в диапазон реальных содержаний глутатиона в крови с учетом разбавления. Результаты определения

Таблица 10

Результаты кулонометрического определения глутатиона в крови человека

(о=5, р=0,95)

№ Тнгрант Содержание глутатиона, г/л

1 Вг2 0,59±0,07 0,07

Ь 0,61±0,06 0,08

■у Вг2 0,54+0,04 0,08

0,57±0,07 0,09

глутатиона в образцах крови вольтамперометрическим методом сопоставляли с результатами кулонометрического определения (табл. 11).

Таблица 11

Результаты электрохимического определении глутатиона в крови человека

(п=5, р=0,95).

Предложенные способы электрохимического определения глутатиона в крови характеризуются хорошей воспроизводимостью и обеспечивают высокую производительность, что позволяет рекомендовать их для применения в клинических лабораториях.

Сывороточный альбумин проявляет сильные антиоксидантные свойства, которые связывают с наличием серосодержащих функциональных групп.

Результаты кулонометрического титрования позволили установить сте-хиометрические коэффициенты реакции с электрогенерированными бромом и иодом, которые составляют 1:73 и 1:64 соответственно как для лиофильного альбумина, так и в случае использования в качестве стандарта 10% раствора сывороточного альбумина. Электрогенерированные бром и иод реагируют с сульфгидрильными и дисульфидными группами, которые окисляются до суль-фо-группы с участием 6 и 5 электронов соответственно.

Предложен способ кулонометрического определения альбумина в сыворотке крови человека, основанная на предварительном осаждении белков сыворотки Ыа2504 и последующей экстракции альбумина диэтиловым эфиром. Результаты определения альбумина в сыворотке крови представлены в табл. 12.

Таблица 12

Результаты кулонометрического определения альбумина в сыворотке крови с помощью электрогенерированного брома

Найдено кулонометрически, г/л Яг Найдено контрольным методом*, г/л 5,

1 46+1 0,02 45±6 0,07

2 40±2 0,04 41±5 0,08

3 36±2 0,04 33±8 0,09

4 3812 0,04 37±5 0,07

5 30±2 0,05 28+6 0,09

* Спектрофотометрическое определение альбумина в сыворотке крови.

Жирорастворимые биоантиоксиданты (а-токоферол, ретинол, кальциферолы) играют важную роль в живых системах. Именно они инактивируют свободные радикалы и тем самым защищают мембраны клеток от перекисного окисления.

Установлено, что а-токоферол и ретинол окисляются на стационарном платиновом микроэлектроде на фоне 0,1 М НСЮ4 И 0,1 М СНзСООЫа в аце-тонитриле (рис. 3).

Предельный ток пика линейно возрастает с повышением концентрации а-токоферола от 6,56х10-4 до 4,48х10-3 М. Нижняя граница определяемых содержаний составляет 0,27 мМ.

На фоне 0,1 М СНзСОО№ в ацетонитриле также наблюдается две волны окисления а-токоферола, при этом линейная зависимость высот волн от концентрации отсутствует.

Первая ступень на вольтамперограммах а-токоферола соответствует, по-видимому, окислению до п-токоферилхинона по схеме 10. При потенциалах второй ступени, вероятно, происходят более глубокие превращения продуктов реакции по первой ступени.

На вольтамперограммах ретинола на фоне в ацетонитриле на-

блюдается две волны окисления приблизительно равной высоты при Е|/2 0,5 В и Е|д 0,78 В.

Это позволяет предположить, по аналогии с электрохимическим поведением спиртов с ненасыщенными связями в цепи сопряжения, что ретинол окисляется сначала до ретиналя, а затем до ретиноевой кислоты.

На фоне в ацетонитриле также проявляются две волны

окисления, но первая очень слабо выражена. Вторая волна окисления ретинола наблюдается при

Супд по величинам высот волн и потенциалам полуволн, механизмы окисления ретинола на фоне в ацетонитриле отли-

чаются. Действительно, как известно из литературных данных, в щелочной среде ретинол неустойчив вследствие окисления кислородом воздуха. Первоначальным продуктом окисления являются его 5,6- и 7,8-эпокиси. Возможное окисление на электроде этих продуктов в щелочной среде будет происходить при более положительных потенциалах.

Уравнение регрессии для ретинола на фоне 0,1 М СНзСООЫа в АН имеет две области линейной зависимости (табл. 13).

Таблица 13

Градуировочные зависимости высоты первой волны окисления от концентрации ретинола на платиновом электроде

Фон Диапазон концентраций, М Уравнение регрессии у=а+Ьх К

а Ь

0,1 М НСЮ4 в аиетонитриле 8,22х10'5-г1,08х10*3 5+2 2,3+0,2 0,984

0,1 М СНзСООЫа в аиетонитриле 8,22х10'5+5,79Х10'4 7,54x10^1,66х103 5,8±0,5 22±2 2,7+0,1 5,0±0,1 0,997 0,999

Результаты вольтамперометрического определения ретинола и a-токоферола в модельных растворах представлены в табл. 14.

Таблица 14

Результаты вольтамперометрического определения ретинола и а-токоферола на платиновом электроде в модельных растворах

Определяемое соединение Фоновый электролит Введено, мг Найдено, мг Зг

Ретинол 0,1 М11СЮ4 а ацетонитриле 0,48 1,2 2,4 0,47±0,03 1,31±0,04 2,29±0,09 0,06 0,03 0,04

0,1 МСНзСООЫав ацетонитриле 2,4 4,8 7,1 2,19±0,09 4,6±0,2 7,2+0,2 0,04 0,04 0,03

а-Токоферол 0,1 М НС104 в аиетонитриле 17,4 34,8 46,3 17,40+0,04 37,0±0,3 45,6+0,6 0,01 0,01 0,01

Для кулонометрического определения жирорастворимых АО исследованы электрогенерированные титранты-окислители Установлено, что реак-

ция протекает быстро и количественно только с элекгрогенерированным Вг2. Титрант в реакцию не вступает.

Полученные результаты позволили установить стехиометрические коэффициенты реакции ретинола, эргокальциферола и холекальциферола с электро-генерированным Вг2, равные 1:2,1:7 и 1:3 соответственно. В связи с возможностью различных путей протекания процесса окисления строгие схемы реакции для ретинола и эргокальциферола привести сложно. Исходя из результатов ку-лонометрического титрования холекальциферола, можно предложить следующую схему взаимодействия (схема 11).

Результаты кулонометрического определения жирорастворимых АО в модельных растворах представлены в табл. 15.

Таблица 15

Результаты кулонометрического определения жирорастворимых антиокси-дантов с помощью электрогенерированного брома (п=5, р=0,95)

Определяемое соединение Введено, мкг Найдено, мкг

2378 2330±40 0,01

Ретинол 4756 4800±50 0,01

7134 7230±40 0,01

31 26±2 0,05

Эргокальциферол 63 63±3 0,03

78 88+3 0,03

50 56±4 0,05

Холекальциферол 75 74±2 0,02

100 103±7 0,04

На основе полученных данных предложен способ кулонометрического определения свободных жирорастворимых АО в сыворотке крови человека в пересчете на a-токоферол, основанная на экстракции жирорастворимых витаминов из сыворотки крови человека смесью петролейного эфира и спирта (1:1) и последующем кулонометрическом титровании электрогенерированным Результаты определения представлены в табл. 16.

На стеклоуглеродном электроде на фоне в диметилфор-

мамиде кислород восстанавливается с образованием супероксид анион-радикала (Ог"). На циклической вольтамперограмме наблюдается обратимый пик восстановления при -0,9 В (рис. 4).

Поскольку в биологических системах "поглотителями" свободных радикалов являются АО, представляет интерес изучить их влияние на процесс восстановления кислорода. АО проявляют слабые кислотные свойства. Донорами протонов были жирорастворимые АО: ретинол и а-токоферол, содержащие в структуре молекул гидроксильные группы.

Таблица 16

Результаты кулонометрического определения содержания свободных жирорастворимых Л О в сыворотке крови в пересчете на а-токоферол (п=5, р=0,95).

№ Содержание жирорастворимых ангиоксидантов в пересчете на а-токоферол, г/л 5,

1 1,9+0,1 0,05

2 1,7+0,1 0,06

3 1,5+0,1 0,07

4 1,4±0,1 0,06

5 1,45+0,09 0,06

6 0,51±0,06 0,08

7 1,5±0,2 0,07

8 1,27±0,09 0,06

9 0,61 ±0,08 0,08

10 0,78±0,07 0,08

При введении АО электрохимические характеристики пика восстановления О2 изменялись. Пик увеличивался по высоте и смещался в область более положительных потенциалов. С увеличением концентрации АО ток при потенциалах образования О2 линейно растет (рис. 5).

Восстановление кислорода в присутствии АО протекает обратимо, о чем свидетельствует наличие анодного пика на циклических вольтамперограммах и разность потенциалов анодного и катодного пиков, близкая к 60 мВ.

Сопоставление полученных и литературных данных позволяет говорить о том, что восстановление кислорода в присутствии АО протекает по ЕС-механизму, и имеет место протонизация супероксид анион-радикала:

По полученным вольтамперограммам рассчитаны константы скорости взаимодействия АО с супероксид анион-радикалом по величине относительного прироста тока восстановления кислорода в присутствии протонирующего агента. Они составили 2,97x103 л/мольс для ретинола и 2,10x103 л/мольс для а-токоферола.

Полученные результаты позволили предложить метод определения АО по относительному приросту тока восстановления кислорода в их присутствии.

Проведено определение ретинола и а-токоферола в модельных растворах, а также содержание действующего вещества (ретинола и а-токоферола) в фармпрепаратах (табл. 17).

Таблица 17

Результаты определения ретинола и а-токоферола в фармпрепаратах в пересчете на ацетат (п=5, р=0,95).

Индивидуальные АО на фоне биологической матрицы. Исследована возможность кулонометрического определения индивидуальных АО на фоне биологической матрицы, в частности, сыворотки крови. Изучены системы, содержащие сывороточный альбумин и сыворотку крови в качестве источников матричного эффекта.

Установлено, что основными мешающими компонентами при определении АО являются белки. Показано, что для устранения матричного эффекта необходимо осаждать белки, в частности, трихлоруксусной кислотой.

Фенолыше АО. Большое разнообразие фенольных соединений не противоречит общности их строения и близости важнейших свойств. Практически все они обладают антиокислительной активностью. Фенольные АО способны, даже в виде ничтожно малых добавок, эффективно воздействовать на процессы свободнорадикального окисления.

Таблица 18

Значения констант скорости взаимодействия некоторых фенольных антиоксидантов с супероксид анион-радикалом

Фенольные аигиоксиданты кх 10'3, л/моль-с Эр

Ионол 8,9±0,1 0,01

Кверцетин 9,4±0,5 0,02

Дигидрокверцегин 10,4±0,3 0,02

Рутин 9,3+0,5 0,02

Рассчитаны константы скорости взаимодействия фенольных АО с электрохимически генерированным супероксид анион-радикалом по ЕС-механизму. Результаты представлены в табл. 18. Константы скорости взаимодействия имеют один порядок и близки по своим значениям. Это говорит о том, что все исследуемые АО приблизительно в равной мере способны взаимодействовать с 02'

Изучено вольтамперометрическое поведение фенольных АО на стеклоуг-леродном электроде на фоне 0,1 М НСЮ4 в диметилформамиде. Все исследуемые соединения окисляются в этих условиях. Известно, что окисление ионола протекает согласно следующей схеме:

о) и я

Промежуточное соединение (2) реагирует с любым присутствующим в растворе нуклеофилом (вода, этанол и др.). В отсутствие подходящего нуклео-фила в реакцию вступает сам растворитель.

Исходя из структуры флавонолов и имеющихся литературных данных, можно предположить, что на первой ступени окисление затрагивает гидро-ксильную группу пиранового кольца С (схема 15) с образованием устойчивого радикала, а затем фенольные группы колец А и В. Молекула рутина содержит гликозидный остаток в положении 3. Поэтому, вероятно, в окислении участвует одна из гидроксильных групп кольца В.

Представляет интерес изучить взаимное влияние природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола в их смесях, имеющих значение в фармации. При введении ионола наблюдали изменение электрохимических характеристик пиков окисления полифенолов. Поскольку наиболее информативной является первая ступень, то влияние ионола рассматривается по ее изменению. Пик увеличивался по высоте и смещался в область менее положительных потенциалов.

Таким образом, в системе полифенол - ионол наблюдается каталитический эффект от введения ионола. Окисление полифенолов протекает с образованием радикала, который вступает в реакцию с ионолом, в результате чего происходит регенерация молекулы исходного полифенола (схема 16).

Максимальное увеличение тока пика наблюдается при соотношении компонентов 1:1 независимо от первоначальной концентрации полифенола. Исключение составляет рутин, для которого при низкой концентрации максимальный каталитический эффект в присутствии ионола наблюдается в соотношении 1:2. Это, вероятно, связано с присутствием в молекуле рутина гликозид-ного остатка.

Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантиой

емкости биологических объектов и возможности их применения в клинической практике

Следует отметить, что в последнее время все большее внимание уделяется способам определения суммарного содержания АО, которое можно рассматривать как общий показатель состояния объекта анализа в оценке его антиокси-дантных свойств, отражающей антиоксидантный статус организма.

Разработан способ кулонометрического определения интегральной АОЕ биологических жидкостей с помощью электрогенерированного брома. Электрохимическое окисление бромид-ионов на платиновом электроде в кислых средах приводит к образованию Вг2, Вг3, а также короткоживущих радикалов брома (Вг*), адсорбированных на поверхности платинового электрода. Образующиеся при электроокислении соединения брома и сам бром легко вступают в различные радикальные и окислительно-восстановительные реакции, а также в реакции электрофильного замещения и присоединения по кратным связям и это, как уже отмечали выше, позволяет охватить широкий круг биологически активных веществ различной структуры, обладающих антиоксидантными свойствами. Поэтому электрогенерированный бром можно предложить в качестве реагента для оценки суммарных антиоксидантных свойств биологических жидкостей, в частности, крови и ее компонентов. Для количественной оценки введена характеристика интегральная АОЕ, выраженная в единицах количества электричества (Кулонах) на 1 л крови (или другой субстанции).

Единица Кулон как стандарт выступает в роли универсальней единицы измерения, поскольку позволяет выразить АОЕ в пересчете на различные индивидуальные АО, используя константу Фарадея и число электронов, участвующих в реакции АО с электрогенерированным бромом.

Метод апробирован на большом числе здоровых доноров и пациентов (всего около 300 человек) с различными патологиями. Интерес представляют пациенты с детским церебральным параличом (ДЦП).

Установлено, что независимо от формы заболевания, АОЕ цельной крови и плазмы достоверно снижена по сравнению с контрольной группой, что иллюстрирует табл. 19. В большей степени уменьшение АОЕ происходило у пациентов с лёгкими формами заболевания. Так, АОЕ цельной крови у детей с диагнозом спастическая диплегия снизилась на 20,5 %, в то время как при более лёгких правосторонних и левосторонних гемипаретических формах заболевания снижение АОЕ крови составило 50 и 31 % соответственно.

Таблица 19

Интегральная антиоксидантная емкость цельной крови и плазмы у детей с различными формами церебрального паралича

Группы обследования Число детей в группе АОЕ, кКл/л

цельная кровь 8, плазма крови Эг

Здоровые 10 42 ±3,5 0,07 18,2 + 0,6 0,02

Спастическая диплегия 10 33,4 + 0,6 0,03 - -

Двойная гемиплегия 10 30,9 + 0,8 0,04 10,3 ±0,4 0,05

Гиперкинетическая форма 9 24,5 + 0,9 0,05 - -

Левосторонний гемипарез 11 29 + 3 0,1 13 + 2 0,2

Правосторонний гемипарез 10 21+6 0,4 9 + 2 0,3

Известно, что для больных ДЦП наблюдается повышенная генерация эн-домутагенов в организме, которая, скорее всего связана с ненормальной активизацией метаболических циклов, которые содержат интермедиаты-эндомутагены радикальной природы в качестве промежуточных продуктов. В нормальных условиях эндомутагены метаболических циклов не опасны, однако в условиях патологии их генерация резко возрастает, и уровень начинает превышать физиологические возможности защитных систем.

В настоящее время убедительно показана роль процессов окисления в механизмах нарушений функции почек различной этиологии. Хроническая почечная недостаточность (ХПН) не является исключением. Поэтому проведены исследования интегральной АОЕ крови и ее компонентов у пациентов с ХПН, находящихся на программном гемодиализе.

Установлено, что гемодиализ достоверно повышает АОЕ плазмы и цельной крови, но эти величины не достигают уровня контрольной группы. Поэтому пациентам должна проводиться дополнительная антиоксидантная терапия.

Проведено исследование влияния антиоксидантной терапии витамином Е и ксимедоном на АОЕ плазмы и цельной крови. Результаты определения АОЕ представлены в табл. 20.

Таблица 20

Результаты определения АОЕ цельной крови и плазмы после курса лечения препаратами-антиоксидантами (р=0,95)

Интегральная АОЕ, кКл/л

Препарат плазма цельная кровь

до терапии после терапии до терапии после терапии

Ксимедон(п=9) 12,210,6 16±1,5 22,8+0,9 30,410,4 --

Витамин Е (п=22) 12,2+0,6 19,2+0,8 22,8+0,9 37+1,3

Впервые установлено, что ксимедон также достоверно увеличивает АОЕ (33,3 % для крови и 31,1 % для плазмы), хотя и в меньшей степени, чем витамин Е, что позволяет расширить область применения данного препарата.

Прослежена взаимосвязь интегральной АОЕ крови и ее компонентов с основными показателями состояния антиоксидантной защиты организма человека, в частности, с активностью каталазы, и такими маркерами окислительного

стресса, как содержание малонового диальдегида, липопротеинов низкой плотности и металлов переменной валентности (Ре, Си, Мп, Сг), что иллюстрирует табл.21.

Таблица 21

Параметры корреляционных зависимостей интегральной АОЕ крови и ее компонентов от индивидуальных показателей антиоксидантного статуса организма человека

Параметр Уравнение регрессии у=а+Ьх Я

а ЬхЮ'

Активность каталазы 2±1 980±40 0,9887

Содержание малонового диальдегида 23,1±0,3 -(780+30) -0,9942

Липопротеины низкой плотности 20,0±0,9 -(1000±200) -0,7852

Железо 16,2±0,4 Ч5,4±0,8) -0,9044

Медь 16,3 ±0,4 Ч5±1) -0,8579

Марганец 15,4±0Д -(23+4) -0,8923

Хром 16,1+0,3 4213+34) -0,9103

Это подтверждает взаимосвязь процессов с участием радикальных частиц, АО (как низкомолекулярных, так и белков, в частности, ферментов), ионов металлов переменной валентности и субстратов перекисного окисления липидов. А, кроме того, показывает эффективность использования общих показателей, например, интегральной АОЕ, для оценки состояния живого организма, в частности, его антиоксидантного статуса.

Определенные возможности для анализа биологических жидкостей предоставляет вольтамперометрия. Установлено, что компоненты плазмы крови окисляются на стеклоуглеродном электроде на фоне фосфатного буферного раствора (рН 7,4) при потенциале 0,38 В относительно насыщенного хлоридсе-ребряного электрода. При этом на вольтамперограммах наблюдается волна или четко выраженный пик окисления, ток которого линейно возрастает с увеличением объема введенной плазмы крови (рис. 6). Максимальный ток окисления отражает концентрацию АО, а потенциал пика или полуволны характеризует их восстанавливающую способность. Поэтому величину тока можно считать ме-

Рис. 6. Вольтамперограммы окисления плазмы крови различного объема (мл) на стеклоуглеродном электроде на фоне фосфатного буферного раствора (рН 7,4): 1 - 0; 2 - 0,15; 3 - 0,2; 4 - 0,3. Скорость изменения потенциала 200 мВ/с.

Выявлены АО, которые вносят вклад в интегральную АОЕ плазмы крови. Учитывая содержание основных низкомолекулярных АО в плазме, можно сделать вывод, что это аскорбиновая и мочевая кислоты, а также серосодержащие 24

рой АОЕ плазмы крови.

аминокислоты. Вклад остальных водорастворимых АО настолько незначителен, что не может быть зафиксирован в условиях вольтамперометрии. Это и было подтверждено экспериментально. При введении АО в плазму крови наблюдалось увеличение тока окисления пропорционально концентрации АО.

Проведенные клинические исследования показали, что при патологических процессах воспалительного характера величины АОЕ, достоверно различаются (табл. 22). Наименьшая АОЕ плазмы крови наблюдается в случае туберкулеза легкого.

Таблица 22

Результаты вольтамперометрического определения интегральной АОЕ плазмы крови пациентов с различными нозологическими характеристиками.

Диагноз Пнте!{.»льная АОЕ, мкА 5Г

Хроническая обструктивная болезнь легких 2,С±0,2 0,01

Бронхиальная астма 3,6±0,2 0,04

Туберкулез легкого 0,4б±0,09 0,09

Гнойные инфекции хирургического профиля 4,6±0,3 0,05

Для пациентов с гнойными инфекциями хирургического профиля прослежено изменение интегральной АОЕ плазмы крови в ходе лечения. Установлено, что медикаментозная терапия достоверно повышает уровень АОЕ крови уже в ходе лечения.

Параллельно определяли интегральную АОЕ плазмы крови методом гальваностатической кулонометрии. Корреляционный анализ показал, что существует прямо пропорциональная зависимость между величинами АОЕ, полученными вольтамперометрически и кулонометрически Ь=1,07±0,04, Я =0,9934).

Разработан вольтамперометрический способ определения АОЕ плазмы крови по ее реакции с электрохимически генерированными супероксид анион-радикалами.

Как уже отмечалось выше, на стеклоуглеродном электроде на фоне 0,05 М (С2Н5)4Ш в диметилформамиде кислород воздуха восстанавливается с образованием О2 при -0,9В (отн. хлоридсеребряного электрода).

Как и в случае индивидуальных АО, при введении плазмы крови в раствор наблюдается изменение электрохимических характеристик пика восстановления кислорода. Он увеличивается по высоте и смещается в область более положительных потенциалов, что указывает на последующую химическую реакцию продуктов обратимой элементарной стадии. Процесс по первой волне может быть представлен следующей схемой 18:

(18)

оУ+э-р + о2

где 8 - компоненты плазмы крови, дезактивирующие продукт переноса электрона на молекулу кислорода.

На основе полученных результатов предложен вольтамперометрический способ оценки интегральной АОЕ плазмы крови За аналитический сигнал принят относительный прирост тока восстановления кислорода в присутствии плазмы крови в пересчете на а-токоферол.

Определена интегральная АОЕ плазмы крови пациентов отделения гнойной хирургии. Результаты представлены в табл. 23. Уровень АОЕ плазмы для пациентов достоверно ниже, чем для контрольной группы (на 55,6 %). Для пациентов с гнойными инфекциями хирургического профиля наблюдается достоверное увеличение АОЕ плазмы крови после лечения (на 58,3 %).

Таблица 23

Результаты вольтачперометрического определения интегральной АОЕ плазмы крови по реакции с супероксид анион-радикалом в пересчете на а-токоферол

(п=5, р=0,95)

Группы АОЕ плазмы крови в пересчете на а-токоферол, мг/л

до лечения Б, после лечения Яг

Контроль 800±10 0,01 - -

86±2 0,02 13618 0,04

169±11 0,03 27019 0,02

338+4 0,01 535+7 0,01

24319 0,01 38619 0,01

15319 0,02 24218 0,02

378±6 0,01 536110 0,01

48518 0,01 766+9 0,01

48319 0,01 740+7 0,01

49519 0,01 78319 0,01

49018 0,01 772+9 0,01

Несмотря на то, что АОЕ по реакции с супероксид анион-радикалом определяли в неводной среде, проведенный корреляционный анализ показал прямо пропорциональную зависимость между величинами интегральной АОЕ, поту-ченными вольтамперометрически и кулонометрически до и после лечения (У=а+ЬХ, где а= -1393±64, Ь=146±5,11=0,99464 и а- 2191±149, Ь=145±8,

Таким образом, компоненты плазмы крови реагируют с электрогенериро-ванными радикальными частицами кислород? и брома. Обнаруженное значимое различие в АОЕ плазмы крови в ходе терапии позволяет рекомендовать методику вольтамперометрического определения АОЕ для оценки качества лечения

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы кулонометрического и вольтамперометрического определения фармпрепаратов: липоевой кислоты, адреналина и допамина, мек-сидола, рутина и кверцетина, витаминов А и Е, кальциферолов в модельных растворах и в их лекарственных формах с величинами Уста-

новлены стехиометрические коэффициенты реакций указанных соединений с электрогенерированными титрантами - галогенами.

2. Предложены способы определения глугатиона и сывороточного альбумина в модельных растворах и в крови человека с величиной

Разработан способ определения суммарного содержания свободных жирорастворимых АО в сыворотке крови человека в пересчете на а-токоферол.

3. Найдены условия кулонометрического определения индивидуальных АО на фоне, содержащем компоненты биологического происхождения, в частности, сыворотки крови, позволяющий свести к минимуму мешающее влияние матрицы.

4. Найдены условия электрохимической генерации супероксид анион-радикала. Рассчитаны кинетические параметры его реакций с важнейшими АО. Установлено, что процесс следует ЕС-механизму.

5. Обнаружено взаимное влияние природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола, то есть системы полифенол - ионол при различных соотношениях компонентов. При введении ионо-ла наблюдается каталитический эффект. Установлены соотношения, при которых наблюдается максимальное увеличение тока окисления полифенолов, что связано с регенерацией молекулы полифенола.

6. Разработан способ кулонометрической оценки интегральной АОЕ с помощью электрогенерированного брома. Впервые установлено, что интегральная АОЕ по реакции с электрогенерированным бромом коррелирует с содержанием малонового диальдегида, липопротеинов низкой плотности и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг) и активностью каталазы. Это подтверждает взаимосвязь процессов с участием радикальных частиц, АО (как низкомолекулярных, так и белков, в частности, ферментов), ионов металлов переменной валентности и субстратов перекисного окисления липидов. А, кроме того, показывает эффективность использования общих показателей, например, интегральной АОЕ, для оценки состояния живого организма, в частности, его антиоксидантного статуса.

7. Предложены вольтамперометрические способы определения интегральной АОЕ плазмы крови по реакции с супероксид анион-радикалом и по окислению компонентов плазмы на стеклоуглеродном электроде на фоне фосфатного буферного раствора Проведенные клинические исследования показали, что величины интегральной АОЕ плазмы крови, полученные кулонометрически и вольтамперометрически, коррелируют между собой.

8. Проведена оценка интегральной АОЕ крови и ее компонентов при различных типах патологических процессов в организме: хронической почечной недостаточности, врожденных патологиях сердца, заболеваниях органов дыхания, гнойных инфекциях хирургического профиля, детском церебральном параличе. Оценена эффективность медикаментозной терапии, в том числе и дополнительной антиоксидантной.

9. Предложенные электрохимические способы оценки интегральной АОЕ биологических жидкостей являются универсальными. С их помощью можно

проводить первичный скрининг и качественную оценку состояния здоровья человека и проводимого лечения через антиокислительный статус.

Выражаю благодарность к.м.н., зав. отделением гемодиализа Центра вне-почечных методов очищения организма Талгату Султановичу Танееву, к.м.н. Дине Дамировне Гаинетдиновой, д.м.н., зав. кафедрой медицинской генетики КГМУ, профессору Валерию Васильевичу Семенову, а также д.ф.-м.н., зав. лабораторией аналитической спектроскопии, профессору Альберту Харисовичу Гильмутдинову, к.ф.-м.н., ассистенту кафедры общей физики Александру Викторовичу Волошину, к.х.н., старшему научному сотруднику ИОФХ им. А.Е.Арбузова Анатолию Андреевичу Лапину, д.х.н., профессору Евгению Николаевичу Офицерову за проявленный интерес к работе и плодотворное сотрудничество.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зиятдинова, Г.К. Определение интегральной антиоксидантной емкости крови методом гальваностатической кулонометрии [Текст] / Г.К. Зиятдинова, И.Ф. Абдул-лин, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (21-26 сентября 2003г.). Казань, 2003.- Тез. докл.- Т.4.- С.236.

2. Погорельцев, В.И. Интегральная антиоксидантная емкость крови в первичном скрининге патологического процесса в организме человека [Текст] / В.И. Погорельцев, Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // Объединенная международная научная конференция "Новая геометрия природы" (25 августа - 5 сентября 2003г.). Казань, 2003. Труды конф.- Т.2.- С.273-275.

3. Зиятдинова, Г.К. Электрохимическое определение жирорастворимых антиок-сидантов в сыворотке крови человека [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Д.М. Гильметдинова // IV Всероссийская конференция молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (23-25 июня 2003г.). Саратов, 2003.- Тез. докл.-С.157.

4. Зиягдинова, Г.К. Кулонометрическое определение сывороточного альбумина в крови человека [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // III Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXXI века" (14-15 февраля 2003г.). Казань, 2003.- Тез. докл.- С.40.

5. Зиятдинова, Г.К Определение глутатиона в крови человека методами куло-нометрии и вольтамперометрии [Текст] // VIII Научно-практическая конференция молодых ученых КГМУ (27 июня 2003г.). Казань, 2003.- Тез. докл.- С.26.

6. Зиятдинова, Г.К. Применение кулонометрии для оценки антиоксидантной емкости крови больных хронической почечной недостаточностью [Текст] / Г.К. Зиятди-нова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // X Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" (7-11 апреля 2003г.). Москва, 2003,- Тез. докл.-С193.

7. Зиятдинова, Г.К. Эффективность проведения антиоксидантной терапии ксимедоном и витамином Е при хроничегкой почечной недостаточности [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // X Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" (7-11 апреля 2003г.). Москва, 2003.- Тез. докл - С.193.

8. Зиятдинова, Г.К. Определение интегральной антиоксидантной емкости плазмы крови по ее реакции с супероксид анион-радикалом [Текст] / IV Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра

Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века'" (1б-17 марта 2004г.). Казань, 2004.- Тез. докл.- С.34.

9. Зиятдинова, Г.К. Вольтамперометрическое определение рутина и кверцетина [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // VI Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа с международным участием (23-27 мая, 2004г.). Уфа, 2004.- Тез. докл.- С.8-9.

10.Зиятдинова, Г.К. Электрохимическая оценка интегральной антиоксидантной емкости биологических жидкостей [Текст] / IX Всероссийская научно-практическая конференция "Молодые ученые в медицине" (20-21 апреля, 2004г.). Казань. 2004.-Тез. докл.-С. 127-128.

11 .Погорельцев, В.И. Определение антиоксидантной емкости крови у больных легочной патологией [Текст] / В.И. Погорельцев, Л.Н. Копылов, И.С. Саркаров, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // XIII Национальный конгресс по болезням органов дыхания (10-14 ноября, 2003г.). Санкт-Петербург, 2003.-Тез. докл.- С.253.

12.Абдуллин, И.Ф. Кулонометрия в фармацевтическом анализе: от аналита к обобщенным показателям [Текст] / И.Ф. Абдуллин, Г.К. Будников, Н.Н. Чернышева, Г.К. Зиятдинова / Международный Форум "Аналитика и аналитики" (2-б июня 2003г.). Воронеж, 2003.- Каталог рефератов и статей.- Т.2.- С.380.

13.Зиятдинова, Г.К. Возможности электрохимических методов в оценке антиок-сидантной емкости некоторых биологических жидкостей [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // Всероссийская конференция "Аналитика России" (27 сентября - 1 октября, 2004г.). Москва, 2004.- Тез.докл.- С.210.

H.Ziyatdinova, G.K Correlation between total antioxidant capacity of plasma and microelements contents [Text] / G.K. Ziyatdinova, A.A. Lapin, H.C. Budnikov, V.N. Zelenkov // International congress and exhibition "Advanced methods of diagnosis, prophylactics and treatment" (19-21 november, 2004). Hannover, 2004.- Book ofAbstr.- P.95-96.

15.Зиятдинова, Г.К: Вольтамперометрическая оценка интегральной антиокси-дантной емкости плазмы крови. // V Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (2б-27 апреля 2005г.). Казань, 2005.-Тез. докл.- С.47.

1б.3иятдинова, Г.К. Электрохимическое определение липоевой кислоты [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // Журн. аналит. химии. 2004.-Т.59,№3.-С.324-32б.

17.3иятдинова, Г.К. Определение сывороточного альбумина в крови методом гальваностатической кулонометрии с применением электрогенерированных окислителей [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // Журн. аналит. химии. 2004.- Т.59, № 7.- С.742-744.

18.Будников, Г.К. Электрохимическое определение глутатиона [Текст] / Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова, Я.Р. Валитова / Журн. аналит. химии. 2004.- Т.59, № 6.-С.645-648.

19.Абдуллин, И.Ф. Интегральная антиоксидантная емкость крови по данным метода гальваностатической кулонометрии [Текст] / И.Ф. Абдуллин, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // Вестник Татарстанского отделения Российской экологической академии. 2003.- № 3.- С.35-39.

20.Будников, Г.К. Определение некоторых жирорастворимых антиоксидантов методами кулонометрии и вольтамперометрии [Текст] / Г.К. Будников, Г.К. Зиятди-нова, Д.М. Гильметдинова//Журн. аналит. химии. 2004.- Т.59, № 7.- С.736-741.

21. Зиятдинова. Г К. Кулонометрическое определение индивидуальных низкомолекулярных антиоксидантов в присутствии компонентов матрицы сложной биологической природы [Текст] / ПК. Зиятдинова, Г.К. Будников // Вестник Татарстанского отделения Российской экологической академии. 2004.- №1,- С.48-51.

22.Чернышева, Н.Н. Обобщенные показатели объектов анализа и возможности электрохимических методов [Текст] / Н.Н. Чернышева, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будни-ков // Вестник Татарстанского отделения Российской экологической академии. 2004.-№1.-С.54-61.

23.3иятдинова, Г.К. Реакции супероксид анион-радикала с антиоксидантами и их применение в вольтамперометрии [Текст] / Г.К. Зиятдинова, Д.М. Гильметдинова, Г.К. Будников//Журн. аналит. химии. 2005.- Т.60, № 1.- С.56-59.

24.3иятдинова, Г.К. Определение некоторых катехоламинов методами кулоно-метрического титрования и циклической вольтамперометрии [Текст] / Г.К. Зиятдино-ва, Г.К. Будников // Журн. аналит. химии. 2005.- Т.60, № 5.- С.501-506.

25.3иятдинова, Г.К. Оценка состояния антиоксидантной защиты организма человека при наличии воспалительных процессов по данным кулонометрических измерений [Текст] // Г.К. Зиятдинова, В.И. Погорельцев, Г.К. Будников // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2005.- № 1.- С.42-44.

26.Будников, Г.К. Антиоксиданты как объекты биоаналитической химии [Текст] /Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова//Журн. аналит. химии. 2005.- Т.60, № 7.- С.701-715.

27.Ziyatdinova, G.K. The evaluation of the total antioxidant capacity of human plasma using constant-current coulometry [Text] // G.K. Ziyatdinova, V.N. Zelenkov, A.A. Lapin, H.C. Budnikov // In: Functional foods for cardiovascular diseases ed. by D.M. Martirosyan (USA). 2004.-P.58-64.

28.Погорельцев, В.И. Применение метода гальваносгатической кулонометрии в клинической диагностике антиоксидантного статуса организма человека [Текст] / В.И. Погорельцев, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // Казань: Изд-во КГМУ, 2004.-47с.

29.Погорельцев, В.И., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Способ определения интегральной антиоксидантной емкости биологических жидкостей [Текст]. / В.И. Погорельцев, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // Заявка на патент РФ № 2002134634 от 23.12.02. с положительным решением о выдаче патента.

30.Будников, Г.К. Антиоксиданты: медико-биологические и химико-аналитические аспекты [Текст] / Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // Вестник Татарстанского отделения Российской экологической академии. 2005.- № 1.- С.3-16.

31.Ziyatdinova, G.K. Electrochemical determination of total antioxidant capacity of human plasma [Text] // G.K. Ziyatdinova, H.C. Budnikov, V.I. Pogorel'tzev // Anal. Bioanal. Chem. 2005,- V.381, № 8.-V.1546-1551.

Соискатель

Сдано в набор 3.05.2005 г. Подписано в печать 4.05.2005 г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная № 1 Печать на ризографе Гарнитура Times NR, 11 Печ.л.1,75 Тираж 100 экз. Заказ №19

Издательство Казанского университета 420008 Казань, ул.Кремлевская, 18

i гтюышр i

*. Мягткш j , ' l.?..-: А?» /

949

09 НЮН 2005

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Зиятдинова, Гузель Камилевна

Условные обозначения и сокращения.

Предисловие.

ВВЕДЕНИЕ.,.

Глава 1. АНТИОКСИДАНТЫ КАК ОБЪЕКТЫ БИОАНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Общие замечания.

1.2. Система антиоксидантной защиты организма человека и ее наиболее важные органические компоненты.

1.3 Способы определения индивидуальных антиоксидантов в 0 биологических объектах.

1.3.1. Низкомолекулярные биоантиоксиданты.

1.3.2. Высокомолекулярные антиоксиданты.

1.4. Оценка антиоксидантной емкости биологических материалов как критерий состояния системы антиоксидантной защиты.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Приборы.

2.2. Электроды.

2.3. Растворы и реактивы.

2.4. Объекты исследования.

2.5. Методика и условия проведения эксперимента.

Глава 3. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

3.1. Липоевая кислота.

3.2. Катехоламины.

3.3. Мексидол.

3.4. Флавонолы.

3.5. Глутатион.

3.5.1. Электрохимическое определение глутатиона в крови человека.

3.6. Сывороточный альбумин человека.

3.7. Жирорастворимые антиоксиданты.

3.7.1. Анодная вольтамперометрия.

3.7.2. Кулонометрическое определение общего содержания свободных жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови человека.

3.7.3. Вольтамперометрическое определение ретинола и а-токоферола по реакции с супероксид анион-радикалом.

3.8. Кулонометрическое определение индивидуальных антиоксидантов в присутствии биологической матрицы. ш 3.9. Вольтамперометрия растительных и синтетических фенольных антиоксидантов.

Глава 4. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЕМКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

4.1. Кулонометрическая оценка антиоксидантного статуса.

4.1.1. Интегральная антиоксидантная емкость крови при хронической почечной недостаточности.

4.1.1.1. Антиоксидантная емкость крови и тип мембраны диализатора.

4.1.1.2. Взаимосвязь антиоксидантной емкости и общих клинико-биохимических показателей крови.

4.1.1.3. Корреляция антиоксидантной емкости плазмы крови с содержанием металлов переменной валентности.

4.1.2. Антиоксидантная емкость крови при врожденных патологиях сердца.

4.1.3. Оценка состояния антиоксидантной защиты организма при наличии воспалительных процессов.

4.1.4. Интегральная антиоксидантная емкость крови при детском церебральном параличе.

4.2. Оценка интегральной антиоксидантной емкости плазмы крови по реакции с супероксид анион-радикалом по данным циклической вольтамперометрии.

4.3. Вольтамперометрическое определение интегральной антиоксидантной емкости плазмы крови.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов"

На рубеже столетий стало очевидно, что аналитическая химия, как и химия в целом, смещает свои интересы в сторону биологии и медицины. Появилась потребность в новых методах и способах определения, в частности, индивидуальных биологически активных веществ, выполняющих важные функции в живых системах, а также общих показателей, характеризующих состояние биологического объекта. Отметим, что многие процессы, протекающие в живом организме, контролируются в рамках гомеостаза, поэтому изменения в отдельных показателях не всегда отражают истинное состояние, в то время как достоверное изменение интегрального показателя позволяет сделать выводы о состоянии биологической системы.

Ряд проблем настоящей диссертации навеян общением с медиками, в котором была проявлена озабоченность и интерес к окислительному стрессу, в котором может оказаться организм человека. С этим связаны цели и задачи диссертации и заметный прикладной аспект исследования. В последние годы неоднократно отмечали, что аналитик не только создает и использует методы аналитической химии для решения поставленных задач, но и не теряет своего интереса при обсуждении полученных результатов, которые могут быть связаны с междисциплинарными областями, например, на стыке химии, биологии и медицины. Это нашло отражение при написании диссертации.

Поскольку часть работы посвящена оценке интегральных показателей в клинической практике, то в начале каждого раздела главы 4 дается комментарий о медицинском аспекте проводимых исследований, который является как бы введением в проблему.

Выражаю благодарность за содействие в получении образцов для анализа и проявленный интерес к работе к.м.н., зав. отделением гемодиализа Центра внепочечных методов очищения организма Талгату Султановичу Танееву, к.м.н. Дине Дамировне Гайнетдиновой, д.м.н., зав. кафедрой медицинской генетики КГМУ, профессору Валерию Васильевичу Семенову, а также д.ф.-м.н., зав. лабораторией аналитической спектроскопии, профессору Альберту Харисовичу Гильмутдинову, к.ф.-м.н., ассистенту Александру Викторовичу Волошину, к.х.н., старшему научному сотруднику Анатолию Андреевичу Лапину, д.х.н., профессору Евгению Николаевичу Офицерову.

Отмечу, что мои шаги в кулонометрии были сделаны еще в студенческие годы под руководством профессора Ильдара Фартовича Абдуллина, которого я вспоминаю с теплотой и благодарностью.

Выражаю искреннюю признательность и благодарность научному руководителю, д.х.н., профессору Герману Константиновичу Будникову и научному консультанту, к.м.н., доценту Валерию Ильичу Погорельцеву за ценные рекомендации, советы и помощь в проведении работы.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Антиоксиданты (АО)- это важнейший объект исследования и анализа в науках о жизни. Причин такого внимания много. Одна из них состоит в профилактике старения организма и свободнорадикальных патологий, таких как, заболевания сердечнососудистой системы, неврологические, онкологические и другие заболевания. Биоантиоксиданты создают систему антиоксидантной защиты, в которой они снижают одновременно как интенсивность свободнорадикального окисления, так и тяжесть клинических симптомов. Поэтому очень важной становится проблема контроля состояния антиоксидантной системы организма человека, а, следовательно, и антиоксидантного статуса при патологиях различного типа с целью дальнейшей терапевтической коррекции. Клиническая диагностика антиоксидантного (оксидантного, так как эти две системы уравновешивают друг друга в рамках гомеостаза) статуса организма затруднена, поскольку в практической медицине отсутствуют лабораторно-биохимические методы, позволяющие дать интегральную оценку этого параметра. Существуют клинические методики, оценивающие отдельные лабораторные показатели (содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ): малонового диальдегида, диеновых коньюгатов; активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы), которые не всегда пригодны для доказательной диагностики и терапевтической коррекции патологического процесса.

Однако следует отметить, что в последнее время все большее внимание уделяется способам определения суммарного содержания АО, которое можно рассматривать как общий показатель состояния объекта анализа в оценке его антиоксидантных свойств, отражающей антиоксидантный статус организма. Существующие способы контроля АО основаны на применении хроматографии, спектрофотометрии и хемилюминесцентных методов, являющихся весьма трудоемкими, длительными и дорогостоящими. При этом в ряде случаев определяются или индивидуальные АО, или только отдельные их группы. Полученные результаты исследований часто ф, несопоставимы, поскольку получены с использованием различных модельных систем.

Интенсивные исследования последних лет по созданию способов оценки антиоксидантных свойств биосубстратов свидетельствуют о том, что проблема разработки новых, экспрессных, универсальных и доступных методик для их определения остается актуальной.

Основное свойство АО заключается в их способности легко окисляться и принимать участие в радикальных и окислительно-восстановительных реакциях. Поэтому определенную перспективу представляют способы скрининга антиоксидантной емкости (АОЕ) биосубстратов с помощью ^ электрохимических методов.

Цель работы: показать возможность применения электрохимических методов для определения широкого круга индивидуальных биологически активных веществ различного строения, объединяемых понятием "антиоксидант", в лекарственных формах и биологических жидкостях и для оценки общего показателя "интегральная АОЕ", по которому можно сделать заключение о состоянии системы антиоксидантной защиты организма человека, а, следовательно, и об его антиоксидантном статусе.

В соответствии с целью исследования в работе поставлены следующие задачи:

• разработать способы электрохимической оценки интегральной АОЕ Ф биологических жидкостей, пригодные для клинических лабораторий;

• определить интегральную АОЕ крови и ее компонентов с применением электрогенерированных частиц брома и кислорода при различных типах патологичесих процессов в организме;

• выявить взаимосвязь между интегральной АОЕ и основными индивидуальными показателями антиоксидантного статуса: содержанием малонового диальдегида, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг и Ni) и активностью катал азы.

Научная новизна. Определены стехиометрические коэффициенты в реакциях ряда АО (восемь соединений) с электрогенерированными галогенами и на основе экспериментальных и литературных данных предложены возможные схемы реакций. Установлены потенциалы окисления АО на стационарных электродах из платины, графита и стеклоуглерода в условиях вольтамперометрии, обсуждены соответствующие схемы реакций. Найдены условия электрохимической генерации супероксид анион-радикала. Рассчитаны кинетические параметры его реакций с важнейшими АО. Установлено, что процесс следует ЕС-механизму.

В работе применен подход к оценке интегральной АОЕ биологических жидкостей с использованием электрогенерированных частиц брома и кислорода.

Выбор электрогенерированного брома и его соединений в качестве кулонометрического титранта обусловлен их способностью вступать в радикальные и окислительно-восстановительные реакции, а также в реакции электрофильного замещения и присоединения по кратным связям, что позволяет охватить широкий круг биологически активных соединений, проявляющих антиоксидантные свойства.

Электрохимическая генерация супероксид аинон-радикала позволяет смоделировать процессы, происходящие в живых системах.

Установлено, что компоненты плазмы крови окисляются в условиях вольтамперометрии, ток окисления является мерой АОЕ. Определен круг низкомолекулярных АО, которые вносят вклад в АОЕ в этом случае.

Выявлена взаимосвязь между величиной интегральной АОЕ и содержанием малонового диальдегида, ЛПНП и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг) и активностью каталазы. $ Практическая значимость. Разработаны способы кулонометрического и вольтамперометрического определения фармпрепаратов: липоевой кислоты, катехоламинов (адреналина и допамина), мексидола, рутина и кверцетина, витаминов А и Е, кальциферолов в модельных растворах и в их лекарственных формах с величинами Sr от 0,01 до 0,09; глутатиона и сывороточного альбумина в модельных растворах и в крови человека с величиной Sr от 0,01 до 0,09. Предложен способ определения суммарного содержания свободных жирорастворимых АО в сыворотке крови человека в пересчете на а-токоферол. ^ Разработан подход кулонометрического определения индивидуальных

АО на фоне, содержащем компоненты биологического происхождения, в частности, сыворотки крови, позволяющий свести к минимуму мешающее влияние матрицы.

Обнаружено взаимное влияние природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола, то есть системы полифенол - ионол при различных соотношениях компонентов. При введении ионола наблюдается каталитический эффект. Установлены ^ соотношения, при которых наблюдается максимальное увеличение волны окисления полифенолов, что связано с регенерацией молекулы полифенола.

4. Результаты определения интегральной АОЕ крови и ее компонентов с помощью электрогенерированного брома и супероксид-анион-радикала и обсуждение корреляции АОЕ с содержанием малонового диальдегида, ЛПНП и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг) и активностью каталазы.

По материалам диссертации опубликовано 16 статей и тезисы 15 докладов. Издано методическое пособие и получен патент РФ.

Диссертация выполнена при поддержке программы "Университеты России" (проект 06.01.004 "Реакции электрохимически генерированных частиц кислорода и галогенов с антиоксидантами и их применение в анализе сложных биологических объектов" и проект 06.01.085 "Возникающие реагенты в электроаналитической химии антиоксидантов") и научно образовательной программы CRDF и Минобразнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века" REC-007 "Развитие методов оценки антиоксидантных свойств биологического материала, основанных на электрохимии" и "Вольтамперометрическая оценка интегральной антиоксидатной емкости плазмы крови"), гранта АН РТ № 07-7.3-176 "Создание научных основ определения интегральной антиоксидантной емкости биологических жидкостей и оценки антиокислительного статуса организма человека" и гранта Федерального агентства по образованию № А04-2.11-116 "Электрохимическая оценка антиоксидантных свойств соединений фенольного ряда".

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

выводы

1. Разработаны способы кулонометрического и вольтамперометрического определения фармпрепаратов: липоевой кислоты, адреналина и допамина, мексидола, рутина и кверцетина, витаминов А и Е, кальциферолов в модельных растворах и в их лекарственных формах с величинами Sr от 0,01 до 0,09. Установлены стехиометрические коэффициенты реакций указанных соединений с электрогенерированными титрантами-галогенами.

2. Предложены способы определения глутатиона и сывороточного альбумина в модельных растворах и в крови человека с величиной Sr от 0,01 до 0,09. Разработан способ определения суммарного содержания свободных жирорастворимых АО в сыворотке крови человека в пересчете на а-токоферол.

5. Обнаружено взаимное влияние природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола, то есть системы полифенол - ионол при различных соотношениях компонентов. При введении ионола наблюдается каталитический эффект. Установлены соотношения, при которых наблюдается максимальное увеличение тока окисления полифенолов, что связано с регенерацией молекулы полифенола.

6. Разработан способ кулонометрической оценки интегральной АОЕ с помощью электрогенерированного брома. Впервые установлено, что интегральная АОЕ по реакции с электрогенерированным бромом коррелирует с содержанием малонового диальдегида, липопротеинов низкойплотности и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг ) и активностью каталазы. Это подтверждает взаимосвязь процессов с участием радикальных частиц, АО (как низкомолекулярных, так и белков, в частности, ферментов), ионов металлов переменной валентности и субстратов перекисного окисления липидов. А, кроме того, показывает эффективность использования общих показателей, например, интегральной АОЕ, для оценки состояния живого организма, в частности, его антиоксидантного статуса.

7. Предложены вольтамперометрические способы определения интегральной АОЕ плазмы крови по реакции с супероксид анион-радикалом и по окислению компонентов плазмы на стеклоуглеродном электроде на фоне фосфатного буферного раствора. Проведенные клинические исследования показали, что величины интегральной АОЕ плазмы крови, полученные кулонометрически и вольтамперометрически, коррелируют между собой.

9. Предложенные электрохимические способы оценки интегральной АОЕ биологических жидкостей являются универсальными. С их помощью можно проводить первичный скрининг и качественную оценку состояния здоровья человека и проводимого лечения через антиокислительный статус.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Зиятдинова, Гузель Камилевна, Казань

1. Золотов, Ю.А. Аналитическая химия и медицина Текст. // Журн. аналит. химии. 2001- Т.56, № 11.- С. 1125.

2. Ghiadoni, L. Cyclooxygenase is the main source of oxydative stress in essential hypertension Text. / L. Ghiadoni, A. Virdis, S. Taddei, A. Magagna, A. Salvetti // Am. J. of Hypertension. 1998.- V.l 1, № 4.- P.174 A.

3. Hennekens, C.H. Current knowledge and future directions for reseach on antioxidant vitamins in prevention of cancer, cardiovascular and eye diseases Text. // Pure and Applied Chemistry. 1997.- V.69, № 10.- P.2141-2144.

4. Середенин, С.Б. Фармакологическая защита генома Текст. / С.Б.

5. Середенин, А.Д. Дурнев // М., 1992.- 160с.

6. Yu, В.Р. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species Text. // Physiolog. Rev. 1994.- V.74, № 1.- P.139-162.

7. Haliwell, B. Protection against oxidants in biological systems: the superoxide theory of oxygen toxicity. Free radicals in biology and medicine Text. / B. Haliwell, J.M.C. Gutteridge // Oxford: Clarendon press, 1989.-P.86-179.

8. Дубинина, E.E. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса Текст. // Вопр. мед. химии. 2001.- Т.47, № 6.- С.561-581.

9. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в живых системах Текст. / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И. Деев, А.В. Козлов, А.Н. Осипов,

10. Д.И. Рощупкин // Биофизика. Т.29. (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1991.- 252 с.

11. Halliwell, В. Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause, or consequence Text. / Lancet. 1994.- V.344, № 8924.- P.721-724.

12. Янковский, О .Я. Токсичность кислорода и биологические системы (эволюционные, экологические и медико-биологические аспекты) Текст. // С-П.: Игра, 2000.- 294с.

13. Diplock, А.Т. Antioxidants and free radical scavengers. Free radical damage and its control Text. / Ed. by C.A. Rise-Evans, R.H. Burdon // Amsterdam: Elsevier, 1994.-P.l 13-130.

14. Chance, P.A. A hydroperoxide metabolism in mammalian organs Text. / P.A. Chance, H. Sies, A.A. Boveris // Physiol. Rev. 1979.- V.59, № 3.-P.527-605.

15. Ames, B.M. Uric acid produces an antioxidant defense in humans against oxidant and radical-caused aging and cancer: a hypothesis Text. / B.M. Ames, R. Cathcart, E. Schwiers, P. Hochstein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981.- V.73, № 11.- P.6858-6862.

16. Stocker, R. Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance Text. / R. Stocker, Y. Yamamoto, A. McDonagh, A.N. Glazer, B.N. Ames // Science. 1987.- V.235, № 4792.- P.1043-1045.

17. Frei, B. Ascorbate is an outstanding antioxidant in human blood plasma Text. / B. Frei, L. England, B.N. Ames // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989.- V.86, № 16.- P.6377-6381.

18. Guorong, Z. Cyclodextrin ferrocene inclusion complex modified carbon paste electrode for amperometric determination of ascorbic acid Text. / Z. Guorong, W. Xiaolei, S. Xinguang, S. Tianling // Talanta. 2000.- V.51, № 5.-P.1019-1025.

19. Ijeri, V.S. Chemically modified electrodes based on macrocyclic compounds for determination of vitamin С by electrocatalytic oxidation Text. /V.S.1.eri, P.V. Jaiswal, A.K. Srivastava // Anal. Chim. Acta. 2001.- V.439, № 2.-P.291-297.

20. Nanqin, G. Determination of ascorbic acid based on peroxidase oscillator reaction Text. / G. Nanqin, C. Ruxiu, L. Zhixin // Anal. Chim. Acta. 2002.-V.466, № 2.- P.257-260.

21. Ensafi, A.A. Determination of ascorbic acid by electrocatalytic voltammetry with methylene blue Text. // Anal. Lett. 2003.- V.36, № 3.- P.591-604.

22. Schlotte, V. Effect of uric acid and chemical analogues on oxidation of human low density lipoprotein in vitro A review Text. / V. Schlotte, A. Sevanian, P. Hochstein, K.U. Weithmann // Free Radic. Biol. Med. 1998.-V.25, № 7.- P.839-847.

23. Abuja, P.M. Ascorbate prevents prooxidant effects of urate in oxidation of human low density lipoprotein Text. // FEBS Letters. 1999.- V.446, № 23.- P.305-308.

24. Winston, G.W. A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids Text. / G.W. Winston, F. Regoli, A.J. Dugas, J.H. Fong // Free Radic. Biol. Med. 1998.- V.24, № 3.- P.480-493.

25. Ai-Min, Y. Catalytic oxidation of uric acide at the polyglycine chemically modified electrode and its trace determination Text. / Y. Ai-min, Z. Hai-Li, C. Hong-Yuan // Analyst. 1997.- V.122, № 8.- P.839-841.

26. Jyh-Myng, Z. Selective voltammetric method for uric acid detection using pre-anodized Nafion-coated glassy carbon electrodes Text. / Z. Jyh-Myng, J. Jia-Jen, G. Ilangovan // Analyst. 1998.- V.123, № 6.- P.1345-1350.

27. Holger, E. Electrochemical characterization of uric acid at a platinum electrode Text. / E. Holger, K. Meinhard // Anal. Chim. Acta. 2001.-V.449, № 1-2.- P.129-134.

28. Huang, Т.Н. Analysis of thiols with tyrosinase-modified carbon paste electrodes based on blocking of substrate reducing Text. / Т.Н. Huang, T. Kuwana, A. Warsinke // Biosens. and Bioelectron. 2002.- V.17, № 11-12.-P.l 107-1113.

29. Shukla, J. Analysis of cystine in human blood for monitoring of cases of burns Text. / J. Shukla, K.S. Pitre // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2002.-V.27, № 5.- P.821-826.

30. Stone, C.G. A mechanistic evaluation of the amperometric response of reduced thiols in quinone mediated systems Text. / C.G. Stone, M.F. Cardosi, J. Davis // Anal. Chim. Acta. 2003.-V.491, № 2.- P.203-210.

31. Seymour, Е.Н. Electrochemical detection of glutathione: an electrochemically initiated reaction pathway Text. / E.H. Seymour, S.J. Wilkins, N.S. Lawrence, R.G. Compton // Anal. Lett. 2002.- V.35, № 8.-P.1387-1399.

32. Wang, W. Determination of glutathione in single human hepatocarcinoma cells by capillary electrophoresis with electrochemical detection Text. / W. Wang, H. Xin, H. Shao, W. Jin // J. Chromatogr. B. 2003.- V.789, № 2.-P.425-429.

33. Великородный // Журн. аналит. химии. 2001.- Т.56, № 2.- С. 195-200.

34. Kleszczewski, T. Flow-injection spectrophotometric determination of L-ascorbic acid in biological matters Text. / T. Kleszczewski, E. Kleszczewska // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2002.-V.29, № 4.- P.755-759.

35. Yongjun, M. Flow-injection chemiluminescence determination of ascorbic acid by use of the cerium (IV) Rhodamin В system Text. / M. Yongjun, Z. Min, J. Xiaoyong, Z. Baozhu, C. Hui, G. Naiyun // Anal. Chim. Acta. 2002.- V.464, № 2.- P.289-293.

36. Yuming, H. Chemiluminescence flow-injection sensor for the determination of ascorbic acid with an immobilized reagent Text. / H. Yuming, Z. Zhujun // Anal. Lett. 2003.- V.36, № 13.- P.2783-2792.

37. Zhilong, G. A fiber optic biosensor for uric acid based on immobilized enzymes Text. / G. Zhilong, Z. Zhujun // Anal. Lett. 1996.- V.29, № 5.-P.695-709.

38. Galban, J. Direct determination of uric acid in serum by a fluorometric-enzymatic method based on uricase Text. / J. Galban, Y. Andreu, M.J. Almenara, S. De Marcos, J.R. Castillo // Talanta. 2001.- V.54.- № 5.- P.847-854.

39. Nie, L. Direct chemiluminescence determination of cysteine in human serum using quinine-Ce (IV) system Text. / L. Nie, H. Ma, M. Sun, X. Li, M. Su, S. Liang // Talanta. 2003.- V.59, № 5.- P.959-964.

40. Zhen, S. Spectrophometric determinetion of reduced glutathione in human blood using N-p-(2-benzothiazoyl)phenyl.maleimide [Text] / S. Zhen, W. Hong, L. Shu-Cai, Z. Zhi-Min, Z. Hua-Shan // Anal. Lett. 2002.- V.35, № 14.- P.2269-2278.

41. Shu-Cai, L. Direct spectrofluorometric determination of glutathoine in biological samples using 5-maleimidyl-2-(m-methylphenyl)benzoxazole Text. / L. Shu-Cai, W. Hong, Z. Zhi-Min, Z. Xian, Z. Hua-Shan // Anal. Chim. Acta. 2002.- V.451, № 2.- P.211-219.

42. Zhenghua, S. Sensitive determination of sub-nanogram amounts of rutin by its inhibition of chemiluminescence with immobilized reagents Text. / S. Zhenghua, H. Shuang // Talanta. 2002.- V.57, № 1.- P.59-67.

43. Yuji, S. Determination of total bilirubin in serum by a color reaction using p-dimethylaminobenzaldehyde Text. // Anal. Science. 1997.- V.13, № 2.-P.291-294.

44. Kazuya, K. Fluorescence reaction of bilirubin with zinc ion in dimethyl sulfoxide and its application to assay of total bilirubin in serum Text. / K. Kazuya, D. Yuuko, M. Miki, T. Yasuto // Anal. Chim. Acta. 1998.- V.365, № 1-3.- P.177-182.

45. Yuji, S. Spectrophotometric determination of urine bilirubin by p-dimethylaminobenzaldehyde Text. // Anal. Science. 1998.- V.14, № 3.-P.609-612.

46. Yolanda, A. Determination of direct bilirubin by a fluorimetric-enzymatic ^ method based on bilirubin oxidase Text. / A. Yolanda, J. Galban, S. De

47. Marcos, J.R. Castillo // J. Anal. Chem. 2000.- V.368, № 5.- P.516-521.

48. Yolanda, A. Study of fluorometric-enzymatic method for bilirubin based on chemically modified bilirubin-oxidase and multivariate calibration Text. /

49. A. Yolanda, M. Ostra, C. Ubide, J. Galban, S. De Marcos, J.R. Castillo // Talanta. 2002.- V.57, № 2.- P.343-353.

50. Muchova, J. Determination of low-molecular weight antioxidant in serum of persons with Down's syndrome Text. / J. Muchova, I. Garaiova, M. Sustrova, S. Hruskova, Z. Durackova // Chemical Papers Chemicke Zvesti. 1998.-№52.- P.537.

51. Будников, Г.К. Электрохимическое детектирование органических соединений в потоке жидкости (обзор) Текст. / Г.К. Будников, М.И. Евгеньев // Заводск. лаборатория. 2001.- Т.67, № 9.- С.5-11.

52. Евгеньев, М.И. Электрохимическое детектирование в высокоэффективной жидкостной хроматографии органических веществ Текст. / М.И. Евгеньев, Г.К. Будников // Журн. аналит. химии. 2000.-Т.55, № 11.- С.1206-1213.

53. Long, Н. Liquid chromatography with multi-channel electrochemical detection for the determination of epigallocatechin gallate in rat plasmap utilizing an automated blood sampling device Text. / H. Long, Y. Zhu, M.

54. Cregor, F. Tian, L. Coury, C.B. Kissinger, P.T. Kissinger // J. Chromatogr.

55. B. 2001.- V.763, № 1-2.- P.47-51.

56. Huang, J. Total plasma homocysteine determination using ion-exchange Ф; chromatography Text. / J. Huang, M. Williams // J. Liquid Chromatogr.

57. Relat. Technol. 2000.- V.23, № 20.- P.3143-3153.

58. Ying, L. Homocysteine determination in human plasma by HPLC with fluorimetric detection Text. / L. Ying, L. Yi-Quan, Z. Xi-Mei, L. Zhi-Hong // Chin. J. Chromatogr. 2000.- V.18, № 1.- P. 49-51.

59. Reddy, M.N. A rapid and simple assay no determine total homocysteine and other thiols in pediatric samples by HPLC and fluorescence detection Text. / M. N. Reddy, C. Behnke // J. Liquid Chromatogr. and Relat. Technol. 1997.- V.20, № 9.- P.1391-1408.

60. Song, Z. Determination of thiols in urinary sample by capillary-column chromatography with amperometric detection at a carbon electrode Text. / Z. Song, H. Fang, Z. Jianwei, W. Lijing, Z. Feng, Y. Pengyuan // Talanta. 2002.- V.58, № 3.- P.451-458.

61. Manach, C. Quercetin is recovered in human plasma as conjugated derivatives which retain antioxidant properties Text. / C. Manach, C. Morand, V. Crespy, C. Demigne, O. Texier, F. Regerat, C. Remesy // FEBS Lett. 1998.- V.426, № 3.- P.331-336.

62. Mielsen, S.E. Column-switching high performance liquid chromatographic assay for the determination of quercetin in human urine with ultraviolet absorbance detection Text. / S.E. Mielsen, L.O. Dragsted // J. Chromatogr. B. 1998.- V.707, № 1-2,- P.81-89.

63. Ishii, K. High-performance liquid chromatographic determination of quercetin in human plasma and urine utilizing solid-phase extraction and ultraviolet detection Text. / K. Ishii, T. Furuta, Y. Kasuya // J. Chromatogr. B. 2003.- V.794, № 1.- P.49-56.

64. Murcovic, M. Analysis of anthocyane glicosides in human serum Text. / M. Murcovic, U. Adam, W. Pfannhauser // Fresen. J. Anal. Chem. 2000.-V.366, № 4.- P.379-381.

65. Shahrzad, S. Determination of gallic acid and its mehabolites in human plasma and urine by HPLC Text. / S. Shahrzad, I. Bitsch // J. Chromatogr. 1998.- V.705, № 1.-P.87-95.

66. Sochor, J. HPLC analysis of tiaprofenic acid in the samples of whole blood using L-L and S-L extraction Text. / J. Sochor, J. Klimes, J.Sedlacek, B.to

67. Somolikova, D. Slovencik // J. Liquid Chromatogr. Relat. Technol. 2000.-V.23, № 20.- P.3191-3201.

68. Kun, L. Revers-phase HPLC for the determination of pherulic acid in Chuanxiong, serum and cerebrospinal liquid of animals Text. / L. Kun, D. Ming-Yu, L. Hong-Xia, L. De-Lin // Chin. J. Chromatogr. 2000.- V.18, № 6.- P.518-520.

69. Hiroyuki, K. Selective and sensitive determination of lipoic acid in biological and food samples by gas chromatography with flame photometric detection Text. / K. Hiroyuki, H. Noritoshi, M. Masami // Trends in Anal. Life Sci. 1997.- V.l, №1.- P.63-67.

70. Zhang, F.X. Colorimetric detection of thiol-containing amino acids using gold nanoparticles Text. / F.X. Zhang, L. Han, L.B. Israel, J.G. Daras, M.M. Maye, N.K. Ly, C.-J. Zhong // Analyst. 2002.- V.l27, № 4.- P.462-465.

71. Hwa, J.B. Determination of vitamin E in porcine plasma after total administration of vitamin E-enriched feedstuffs using high-performanceliquid chromatography Text. / J.B. Hwa, C. Byoung-Sun, C.B. Chul //

72. Anal. Lett. 2001.- V.34, № 13.- P.2303-2310.

73. Fanali, S. Separation of 5-, y- and a-tocopherols by CEC Text. / S. Fanali, P. Catarcini, M.G. Quaglia, E. Camera, M. Rinaldi, M. Ricardo // J. Pharm. And Biomed. Anal. 2002.- Y.29, № 6.- P.973-979.

74. Ha, S.-E. Chromatographic behavior of fat-soluble vitamins investigation by revers-phase liquid chromatography with water-isopropanol mixter as mobile phase Text. / S.-E. Ha, Y.-E. Та // Spectrosc. Spectral Anal. 2002.-V.22, № 4.- P.693-694.

75. Jiang, C. Study of retention and resolution of tocopherols by supercritical fluid chromatography Text. / C. Jiang, R. Qilong, P. Wu // J. Chromatogr.

76. A. 2003.- V.1005, № 1-2.- P.155-164.

77. Yamauchi, R. Analysis of vitamin E and its oxidation products by HPLC with electrochemical detection Text. / R. Yamauchi, H. Noro, M. Shimoyamada, K. Kato // Lipids. 2002.- V.37, № 5.- P:515-522.

78. Kavran, B.G. Separation of chlorins and carotenoids in capillary electrokinetic chromatography Text. / B.G. Kavran, G.O. Fazil // Chimia. 2003.- V.57, № 7-8. P.384.

79. Van Merris, V. Simple guantification of endogenous retinols in bovine serum by high-performance liquid chromatography-diode-array detection Text. / V. Van Merris, E. Meyer, K. De Wasch, Q. Burvenich // Anal. Chim. Acta. 2002.- V.468, № 2.- P.237-244.

80. Casal, S. Simultaneous determination of retinol, P-carotene and a-tocopherol in adipose tissue by high-performance liquid chromatography Text. / S. Casal, B. Macedo, M.B.P.P. Oliveira // J. Chromatogr. B. 2001.- V.763, № 1-2.-P.1-8.

81. Рагино, Ю.И. Простой способ оценки концентрации витаминов Е и А в липопротеидах низкой плотности Текст. / Ю.И. Рагино, Е.В. Каштанова // Клин. лаб. диагн. 2002.- № 12.- С. 11-13.

82. Rousseau, G. Determination of ubiquinone-9 and 10 levels in rat tissues and blood by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection Text. / G. Rousseau, F. Varin // J. of Chromatogr. Sci. 1998.- V.36, № 5.-P.247-252.

83. Schwihhelova, Z. Quantitative assay of vitamin E (a-tocopherol) in the tissues by HPLC Text. / Z. Schwihhelova, J. Wilhelm // Chemical Papers -Chemicke Zvesti. 1998.- № 52.- P.538.

84. Van Pelt, C.K. Quantitative subfemtomole analysis of a-tocopherol and deuterated isotopomers in plasma using tabletop GC/MS/MS Text. / C.K. Van Pelt, P. Huggarty, J.Th. Brenna // Anal.Chem. 1998.- V.70, № 20.- P. 4369-4375.

85. Yamamoto, Y. Plasma ratio of ubiquinol and ubiquinone as a marker of oxidative stress Text. / Y. Yamamoto, S. Yamashita // Mol. Aspects. Med.1997.- V.18, № SI.- P.79-84.

86. Dueker, S.R. Ion trap mass spectrometry for kinetic studies of stable isotope labeled vitamin A at low enrichments Text. / S.R. Dueker, R.S Mercer., A.D. Jones, A.J. Clifford // Anal. Chem. 1998.- V.70, № 7.- P.1369-1374.

87. Gamache, P.H. Simultaneous analysis of fat soluble carotenoids, retinoids, tocopherols, vitamin К and coenzyme Q10 in plasma Text. / P.H. Gamache, I.N. Acworth // Northeast Regional Chromatography Discussion Group.1998.- Book of Abstr.- P.6.

88. Луйк, А.И. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов Текст. / А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук // М.: Медицина, 1984.- 224с.

89. Соркина, Д.А. Структурно-функциональные свойства белков Текст. /

90. Д.А. Соркина, И.Н. Залевская //Киев: Выща школа, 1990.- 216с. 110. Tseng, W.-L. Analysis of albumins, using albumin blue 580, by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence Text. / W.-L. Tseng, T.-C.

91. Chie, J.-M. Weng, H.-T. Chang // J. Liq. Chromatogr. and Relat. Technol.2001.- V.24, № 19.- P.2971-2982.

92. Murayama, K. Multivariate determination of human serum albumin and gamma-globulin in a phosphate buffer solution by near infrared spectroscopy Text. / K. Murayama, K. Yamada // J. Near Infrared. Spectrosc. 1998.- V.6, № 1.- P.375-381.

93. Oliva, F.Y. Electrochemical behaviour of human serum albumin; Ti02 nanocrystalline electrodes studied as a function of pH Text. / F.Y. Oliva, L.B. Avalle, O.R. Camara // J. of Electroanal. Chem. 2002.- V.534, № 1.-P. 19-29.

94. Satoka, A. Determination of human serun albumin by chemiluminescence immunoassay with luminol using a platinum-immobilized flow-cell Text. / A. Satoka, I. Takeshi, M. Takehiro, S. Kiyotaka // Anal. Chim. Acta. 2001.-V.436, № 1.- P.103-108.

95. Li, W.-R. Direct spectrometric determination of proteins in body fluids using a near-infrared cyanine dye Text. / W.-R. Li, H. Wang, T.-X. Yang, H.-S. Zhang // Analyt. and Bioanalyt. Chem. 2003.-V.377, № 2.- P.350-355.

96. Jin, F. Total protein determination by particle beam/hollow cathode optical emission spectroscopy Text. / F. Jin, K. Lenghaus, L. Hickman, R.K. Marcus //Anal. Chem. 2003.- У .15, № 18.- P.4801-4810.

97. Jiang, С. Spectrofluorimetric determination of human serum albumin using a tetracycline-europium complex Text. / C. Jiang, L. Li // Anal. Lett. 2004.-V.37, № 6.- P.l 129-1137.

98. Yunkun, Z. Rapid and sensitive determination of proteins by light-scattering technique with Eriochrome blue black R Text. / Z. Yunkun, C. Wenbao, C. Yunxiang // Talanta. 2003.- V.59, № 3.- P.477-484.

99. Wang, L.Y. Selective determination of nanogram y-globulin in human blood serum by resonance light scattering of functionalized nano-PbS Text. / L.Y. Wang, H.Q. Chen, L. Li., L. Dong, T.T. Xia, L. Wan // Clin. Chim. Lett. 2004.- Y.15, № 3.- P.319-321.

100. Cao, Q.-Y. Fluoroimmunosensing system using ferulic acid as the substrate for the determination of transferrin Text. / Q.-Y. Cao, F.-C. Gong, G.-L. Shen, R.-Q. Yu // Anal. Lett. 2003.- V.36, № 14.- P.3035-3049.

101. Liu, R. Resonance light-scattering method for the determination of BSA and HSA with sodium dodecyl benzene sulfonate or sodium lauryl sulfate Text. / R. Liu, J. Yang, C. Sun, X. Wu, L. Li, Z. Li // Anal. Bioanal. Chem. 2003.-V.377, № 2.- P.375-379.

102. Kim, Y.-O. Determination of melatonin in biological samples by capillary electrophoresis Text. / Y.-O. Kim, H.-Y. Chung, S.-T. Chung, J.-H. Kim, J.-H. Park, S.-Y. Han, K.-S. Kil, D.-H. Cho // J. Chromatogr. A. 1999.-V.850, № 1-2.- P.369-374.

103. Максимова, T.B. Способы определения антиокислительной активности Текст. / T.B. Максимова, И.Н. Никулина, В.П. Пахомов, Е.И. Шкарина, З.В. Чумакова, А.П. Арзамасцев // Пат. РФ № 2170930. РЖХим. 2001.- № 24.- С.34., Реф. 01.24-19Г.346П.

104. Шкарина, Е.И. Изучение антиоксидантных свойств препаратов на Ф основе лекарственного растительного сырья Текст. // Афтореф. дис. .канд. фарм. наук.: 15.00.02- Защищена 16.04.01.; М., 2001.- 28с.

105. Roginsky, V. Total chain-breaking antioxidant capability of some beverages as determined by the Clark electrode technique Text. / V. Roginsky, T. Barsukova//J. Medicinal Food. 2001.- V.4, № 4.- P.219-229.

106. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo Текст. / Сборник науч. статей. // М.: Наука, 1992.- 110с.

107. Доброхотова, Е.Г. К определению окислительно-восстановительногоравновесия (ОВР) в биологических средах Текст. / Е.Г. Доброхотова, А.Г. Шлейкин / III Всесоюзная конф. "Биоантиоксидант" (27-29 июня,f1989г.). Москва, 1989. Тез. докл.- Т.1.- С.247.

108. Громовая, В.Ф. Электрохимическое исследование антиоксидантной активности компонентов крови Текст. / В.Ф. Громовая, Г.С. Шаповал, И.Е. Миронюк, А.И. Луйк // Журн. общей химии. 1997,- Т.67, № 3.-С.510-513.

109. Kohen, R. Quantification of the overall reactive oxygen species scavenging capacity of biological fluids and tissues Text. / R. Kohen, E. Vellaichamy, J. Hrbac, I. Gati, O. Tirosh // Free Radic. Biol. Med. 2000.- V.28, № 6.-P.871-879.

110. Клебанов, Г.И. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов Текст. / Г.И. Клебанов, И.В. Бабенкова, О.Ю. Теселкин, О.С. Комаров, Ю.А. Владимиров И Лабораторное дело. 1988.- № 5.- С.59-62.

111. Клебанов, Г.И. Антиоксидантная активность сыворотки крови Текст. / Г.И. Клебанов, О.Ю. Теселкин, И.В. Бабенкова, О.Б. Любицкий, Ю.А. Владимиров // Вестник РАМН. 1999.- №2.-С. 15-22.

112. Erel, О. A novel automated method to measure total antioxidant response against potent free radical reactions Text. // Clin. Biochem. 2004.- V.37, № 2.- P.112- 119.

113. Aime, S. A novel 19F-NMR method for the investigation of the antioxidant capacity of biomolecules and biofluids Text. / S. Aime, S. Calzoni, G. Digilio, S. Giraudo, M. Fasano, D. Maffeo // Free Radic. Biol. Med. 1999.-V.27, № 3-4.- P.356-363.

114. Chevion, S. The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant capacity Text. / S. Chevion, M.A. Roberts, M. Chevion // Free Radic. Biol. Med. 2000.- V.28, № 6.- P.860-870.

115. Whifehead, T.P. Enhanced chemiluminescent assay for antioxidant capacity in biological fluids Text. / T.P. Whifehead, G.H.G. Thorpe, S.R.J. Maxwell // Anal. Chim. Acta. 1992.- V.266, № 2.- P.265-277.

116. Регистр лекарственных средств России "Энциклопедия лекарств" Текст. / Под ред. Г.Л. Вышковского // М.: РЛС, 2002.- Вып. 9.- 1504с.

117. Шульпекова, Ю.О. Применение тиоктовой кислоты в гастроэнтерологии Текст. / Ю.О. Шульпекова, В.Т. Ивашкин // Рос. мед. журн. 2000.- Т.8, № 15-16.- С.630-635.

118. Машковский, М.Д. Лекарственных средства Текст. // Харьков: Торсинг, 1998.- Т.2.- 576с.

119. Машковский, М.Д. Лекарственных средства Текст. // Харьков: Торсинг, 1998.- Т.1.- 624с.

120. Лукьянова, Л.Д. Особенности антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен Текст. / Л.Д. Лукьянова, В.Е. Романова // Хим.-фарм. журн. 1990.- № 8.- С.9-11.

121. Manual of Laboratory Operations: Lipid and Lipoprotein Analysis Text. / Eds. A. Hainline, J. Karon, K. Lippel // HEW Pub. 1982.- V.I.- P.75-82.

122. Современные методы в биохимии Текст. / Под. ред. Ореховича В.Н. // М.: Медицина, 1977.- С.66-68.

123. Goth, L. A simple method for determination of serum catalase and revision of reference range Text. // Clin. Chim. Acta. 1991,- V.196, № 2-3.- P.143-152.

124. Bast, A. Interplay between lipoic acid and glutathione in the protection against microsomal lipid peroxidation Text. / A. Bast, G.R.M.M. Haenen // Biochim. Biophys. Acta. 1988.- V.963, № 3.- P.558-562.

125. Packer, L. Alpha-lipoic acid as a biological antioxidant Text. / L. Packer, E.H. Witt, HJ. Tritschler // Free Radic. Biol. Med. 1995.- V.19, № 2.-P.227-250.

126. Podda, M. Alpha-lipoic acid supplementation prevents symptoms of vitamin E deficiency Text. / M. Podda, HJ. Tritschler, H. Ulrich, L. Packer // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.-V.204, № 1.- P.98-106.

127. Kagan, V. Antioxidant action of thioctic acid and dihydrolipoic acid Text. / V. Kagan, S. Khan, C. Swanson, A. Shvedova, E. Serbinova, L. Packer // Free Radic. Biol. Med. 1990.- V.9S, № 1.- P. 15-24.

128. Биогенные амины Текст. / Под ред. В.В. Меньшикова. // М., 1967.-381с.

129. Бейзер, М.М. Электрохимия органических соединений Текст. // М.: Мир, 1976.- 736с.

130. Salah, N. Polyphenolic flavanols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants Text. / N. Salah, N.J. Miller, G.

131. Paganga, L. Tijburg, G.P. Bolwell, C. Rice-Evans // Arch. Biochem. Biophys. 1995.- V.332, № 2.- P.339-346.

132. Ng, T.B. Antioxidative activity of natural products from plants Text. / T.B. Ng, F. Liu, Z.T. Wang // Life Sci. 2000.- V.66, № 8.- P.709-723.

133. Silva, M.M. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids: a reexamination Text. / M.M. Silva, M.R. Santos, G. Caroco, R. Rocha, G. Justino, L. Mira // Free Radic. Res. 2002.- V.36, №11.- P. 1219-1227.

134. Brett, A.M.O. Electrochemical oxidation of quercetin Text. / A.M.O.Brett, M-E. Ghica // Electroanalysis. 2003.- V.15, № 22.- P. 1745-1750.

135. Bray, T.M. Tissue glutathione, nutrition, and oxidative stress Text. / T.M. Bray, C.G. Taylor // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1993. V.71, № 9.- P.746-751.

136. Deneke, S.M. Thiol-based antioxidants Text. // Curr. Top. Cell Regul. 2000.- V.36.- P.151-180.

137. Meister, A. Glutathione Text. / A. Meister, M.E. Anderson // Ann. Rev. Biochem. 1983.- V.52.- P.711-760.

138. Wlodek, L. Beneficial and harmful effects of thiols Text. // Pol. J. Pharmacol. 2002.- V.54, № 3.- P.215-223.

139. Biothiols in health and desease Text. / Eds. L. Parker, E. Cadenas, M. Dekker // NY, 1995.-P.305-372.

140. Балаховский, С.Д. Методы химического анализа крови Текст. / С.Д. Балаховский, И.С. Балаховский // М.: Медгиз, 1953.- 747с.

141. Wolosiak, R. Antioxidative properties of albumins in enzymatically catalyzed model systems Text. / R. Wolosiak, M. Klepacka // Electronic J. of Polish Agricult. Univ. 2002.- V.5, № 1.

142. Dobrian, A. In vitro formation of oxidatively, modified and reassembled human LDL-antioxidant effect of albumin Text. / A. Dobrian, R. Mora, M. Simionescu, N. Simionescu // Biochim. et Biophys. Acta. 1993.- V.l 169, № 1.- P. 12-24.

143. Надиров, Н.К. Токоферолы (витамины группы Е) биологически активные вещества Текст. // М.: Знание, 1981.- 64с.

144. Электрохимия органических соединений Текст. / Под ред. А.П. Томилова, Л.Г. Феоктистова // М.: Мир, 1976.- 736с.

145. Березовский, В.М. Химия витаминов Текст. // М.: Пищевая промышленность, 1973,- 632с.

146. Гороховский, В.И. Практикум по электрохимическим методам анализа Текст. / В.И. Гороховский, В.М. Гороховская // М.: Высшая школа, 1983.- 191с.

147. Halliwell, В. How to characterize a biological antioxidant Text. // Free Radic. Res. Commun. 1990.- V.9.- № 1.- P. 1-32.

148. Halliwell, B. Free radicals and antioxidants: a personal view Text. // Nutr. Rev. 1994.- V.52, № 8.- P.253-265.

149. Chevion, M. A site-specific mechanism for free radical induced biological damage: the essential role of redox active transition metals Text. // Free Radic. Biol. Med. 1988.- V.5, № 1.- P.27-37.

150. Органическая электрохимия Текст. / Под ред. В.А. Петросяна, Л.Г. Феоктистова//М.: Химия, 1988.- 1024с.

151. Ершов, В.В. Пространственно-затрудненные фенолы Текст. / В.В. Ершов, Г.А. Никифоров, А.А. Володькин // М.: Химия, 1972.- 352с.

152. Avila, V. Antioxidant properties of natural flavonoids: quenching and generation of singlet molecular oxygen Text. / V. Avila, S.G. Bertolotti, S. Criado, N. Pappano, N. Debattista, N.A. Garcia // Int. J. of Food Sci. Tech. 2001.- V.36, № 1.- P.25-34.

153. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты Текст. // Вестник РАМН. 1998.- № 7.- С.43-51.

154. Comporti, М. Iron release, oxidative stress and erythrocyte ageing Text. / M. Comporti, C. Signorini, G. Buonocore, L. Ciccoli // Free Radic. Biol. Med. 2002.-V.32, № 7.-P.568-576.

155. Svistunenko, D.A. Free radical in blood: a measure of haemoglobin autoxidation in vivo Text. / D.A. Svistunenko, N.A. Davies, M.T. Wilson, R.P. Stidwill, M. Singer, C.E. Cooper // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 1997.- № 12.- P.2539-2544.

156. Gonen9, A. Lipid peroxidation and antioxidant systems in hemodialyzed patients Text. / A. Gonen?, Y. Atak, M.N. Orman, B. Simsek / Dialysis & Transplantations. 2002.- V.31, № 2.- P.88-96.

157. Балашова, T.C. Гемолитико-уремический синдром как клиническое проявление оксидантного стресса Текст. / Т.С. Балашова, Н.И. Багирова, Д.В. Зверев, JI.T. Теблоева, А.А. Кубатиев // Терапевтический архив. 1996.- № 3.- С.20-23.

158. Kimak, Е. Serum lipoprotein(a) concentrations and apolipoprotein(a) phenotypes in hemodialysis, chronic ambulatory peritoneal dialysis and post-transplant patients Text. / E. Kimak, J. Solski // Ren. Fail. 2002.- V.24, №2.- P.187-195.

159. Mimic-Oka, J. Alteration in plasma antioxidant capacity in various degrees of chronic renal failure Text. / J. Mimic-Oka, T. Simic, L. Djukanovic, Z. Reljic, Z. Davicevic / Clin. Nephrol. 1999.- V.51, № 4.- P.233-241.

160. Lukoseviciene, R. A study of oxidative stress markers and antioxidant system activity in the serum of hemodialysis patients Text. / R. Lukoseviciene, G. Ziaukiene, J. Urbeliene, Z. Kalpokaite, I. Glemziene / Medicina. 2003.- V.39, № 1.- P.115-118.

161. Гузовский, E.B. Диализная мембрана со встроенным витамином Е -новый инструмент в повышении качества жизни больных с почечной недостаточностью Текст. // Нефрология и диализ. 2000.- Т.2, № 4,-С.357-359.

162. Westhuyzen, J. Oxidative stress and erythrocyte integrity in end-stage renal failure patients hemodialysed using a vitamin E-modified membrane Text. / J. Westhuyzen, D. Saltissi, V. Stanbury // Ann. Clin. Lab. Sci. 2003.- V.33, № 1.- P.3-10.

163. Внутренние болезни Текст. / Под ред. А.И. Мартынова, Н.А. Мухина,

164. B.C. Моисеева//М.: Тэотар-мед", 2001.- Т.1.- 580с.

165. Соодаева, С. К. Роль свободнорадикального окисления в патогенезе ХОБЛ Текст. // Атмосфера. Пульмонология и аллергология. 2002.- № 1.- С.24-25.

166. Терещенко, В.Ю. Обоснование и эффективность внутрикостной комбинированной терапии и ксимедона в комплексном лечении хронического остеомиелита Текст. // Дисс. на соиск. уч. ст. д. м. н. Казань, 2000.- с.267.

167. Lejeune, J. Le mongolisme, premiere exemple d'aberration autosomique humaine Text. / J. Lejeune, R. Turpin, M. Gautier // Ann. Genet. 1959.-V.l, № 2.- P.41-49.

168. Прокофьева-Бельговская, А.А. Основы цитогенетики человека Текст. // М: Медицина, 1969.- 544с.

169. Nagy, S. A chromosomal anomaly in a cose of Lupus erythematosus associated with haemolytic icterus Text. / Acta Med. Sci. Hung. 1963,-V.19.- P.357-361.

170. Черепнёв, Г.В. Потенциальная роль антимутагенного эффекта препарата ксимедона в модификации иммунореактивности Текст. / Г.В. Черепнёв, К.В. Малышев, Ю.Д. Слабнов, В.В. Семенов, B.C. Резник // Эксперимент, и клин, фармакол. 2000.- Т.63, № 6.- С.43-48.

171. Дурнев, А.Д. Мутагены. Скрининг и фармакологическая профилактика воздействий Текст. / А.Д. Дурнев, С.В. Середенин // М.: Медицина, 1998.- 326с.

172. Дизрегуляционная патология Текст. / Под ред. Г.Н. Кржановского // М.: Медицина, 2001.- 632с.

173. Liu, R.H. Potential genotoxicity of chronically elevated nitric oxide: a review Text. / R.H. Liu, J.N. Hotchkiss // Mutat. Res. 1995.- V.339, № 2.-P.73-89.

174. Fang, J.L. Determination of DNA adducts of malonaldehyde in humans: effects of dietary fatty acid composition Text. / J.L. Fang, C.E. Vaca, L.M. Valsta, M. Mutanen // Carcinogenesis. 1996.- V.17, № 5.- P.1035-1040.

175. Зайчик, А.Ш. Основы патохимии Текст. / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов // СПб.: "Элби СПб", 2001.- С.688.

176. Харитонов, B.C. Агонисты пуриновых рецепторов предохраняют геном растительных и животных клеток от повреждений кластогенами Текст. /B.C. Харитонов, В.В. Семёнов, Б.И. Барабанщиков // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2001.- № 7.- С.66-70.

177. Yang, H-H. Elucidation of the mechanism of dioxygen on metal-free carbon electrodes Text. / H-H. Yang, R.L. McCreery // J. Electrochem. Soc. 2000.-V.147, № 9.-P.3420-3428.

178. Будников, Г.К. Полярографическое определение кислот по реакции с электрохимически генерированными анион-радикалами Текст. / Г.К. Будников, О.Ю. Каргина, С.В. Лапшина //Журн. аналит. химии. 1988.-Т.43, № 4.- С.636-638.

179. Будников, Г.К. Реакция электрохимически генерированных анион-радикалов с фосфорилированными мочевинами Текст. / Г.К. Будников, О.Ю. Каргина, С.В. Лапшина, Э.А. Гурылев, З.Я. Латыпов // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1988.- № 3.- С.528-532.

180. Leeuwenburgh, С. Oxidative stress and antioxidants in exercise Text. / C. Leeuwenburgh, J.W. Heinecke // Curr. Med. Chem. 2001.- V.8, № 7.-P.829-838.