Вольтамперометрический метод определения суммарной активности антиоксидантов в объектах искусственного и природного происхождения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Короткова Елена Ивановна

Вольтамперометрический метод определения суммарной активности антиоксидантов в объектах искусственного и природного происхождения

02.00.02 - аналитическая хими

003470224

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Томск 2009

003478224

Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета

Научный консультант: доктор химических наук, профессор |Ю. А. Карбаинов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Г. К. Будников доктор химических наук, профессор А. В. Гунцов доктор химических наук, профессор Г. М. Мокроусов

Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «07» октября 2009г в 14.30 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при Томском политехническом университете по адресу: 634050 г. Томск пр. Ленина,30

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Томского политехнического университета по адресу: г. Томск, ул, Белинского, 53.

Автореферат разослан:« 4 » сентября 2009 года.

Ученый секретарь

совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при Томском политехническом университете канд. хим. наук, доцент

Гиндуллина Т. М.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Антиоксиданты, как вещества, предотвращающие зарождение и развитие свободно - радикальных процессов окисления в объектах органического и неорганического происхождения, нашли широкое применение в химической, пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, биологии и медицине в последнее время. Особенно широко антиоксиданты применяются в составе биологически - активных добавок, косметических средств, фармацевтической продукции. Лавинообразный рост подобной продукции на рынке предъявляет все более серьезные требования к сертификации товара. В настоящее время в нормативных документах РФ не существует единого показателя антиоксидантной активности подобных препаратов. Для проверки их качества используются длительные, трудоемкие, не всегда сопоставимые и неточные исследования, опирающиеся иногда на неаттестованные методики. Необходимость введения новых методик и приборов, обеспечивающих надежные результаты по определению суммарной антиоксидантной активности подобных препаратов, является актуальной задачей, от решения которой зависит качество, эффективность и безопасность предлагаемых на рынке продуктов.

В последнее время в литературе предлагается большое число методов по определению антиоксидантов и их активности. Однако, эти данные имеют разрозненный характер, используют разные модельные системы, представления о характере их действия на радикалы различной природы. Полученные результаты имеют разные размерности, что не позволяет сопоставить их друг с другом. Достаточно мало аттестованных методик и сертифицированных приборов, способных быстро и на качественном уровне определить суммарную антиоксидантную активность продукции. Недостаточно сведений о влиянии ряда факторов на антиоксидантные свойства продукции, например, рН среды, природы самих антиоксидантов, растворителя и др. Недостаточно изученными факторами остаются эффективная концентрация антиоксидантов, время их активного действия и совместимость компонентов в смесях антиоксидантов. Поэтому обобщение информации и поиск новых подходов к определению антиоксидантов и их активности на данном этапе является весьма актуальной задачей.

Одними из перспективных и доступных методов определения активности антиоксидантов являются электрохимические методы, обладая низкой себестоимостью, высокой чувствительностью, возможностью анализировать как водные, так и неводные среды. В России большой вклад в развитие электрохимии антиоксидантов внесли такие ученые, как Г.К. Будников (Казанский государственный университет), Х.З. Брайнина (Уральский государственный экономический университет), З.А. Темердашев (Кубанский государственный университет) и другие.

Достаточно удобным для определения антиоксидантов и их активности является вольтамперометрический метод, так как он, как и антиоксиданты, весьма чувствителен к наличию в среде кислорода и его активных радикалов. Это позволило предложить новый подход к определению суммарной антиоксидантной активности объектов, используя в качестве модельной системы процесс электровосстановления кислорода в отсутствии и при наличии антиоксидантов различного происхождения. Поскольку с участием кислорода протекает большинство окислительных процессов в объектах органического и неорганического происхождения, такой подход должен быть успешным и в

некоторой степени моделировать характер взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами в организме человека и животных.

Цель работы: Развитие теории и практики вольтамперометрического метода определения активности антиоксидантов на основе модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант. Создание на этой основе методического обеспечения для определения суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи.

1. Обосновать выбор модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Рассмотреть влияние различных факторов: рН среды, природы растворителя, концентрации молекулярного кислорода, на процесс электровосстановления кислорода. Показать возможность использования относительного изменения тока электровостановления кислорода в присутствии антиоксидангов на ртутно - пленочном электроде как средство измерения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

2. Исследовать влияние поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам в различных объектах, на процесс электровосстановления кислорода. Рассмотреть закономерности влияния различных факторов (рН среды, материала электрода) на процесс электровосстановления кислорода в присутствии разных типов поверхностно активных веществ.

3. Изучить физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Предложить преимущественные механизмы взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами.

4. Осуществить и обосновать выбор количественных критериев оценки антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения на основании относительного изменения тока электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов.

5. Провести оценку антиоксидантной активности индивидуальных антиоксидантов, их смесей, объектов искусственного и природного происхождения. Выявить наиболее активные соединения. Рассмотреть влияние концентрации, времени взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными радикалами, рН среды, совместимости компонентов в смесях на антиоксидантную активность объектов.

6. Исследовать электрохимические свойства ряда антиоксидантов. Особое внимание уделить впервые синтезированным соединениям с антиоксидантными свойствами, таким, как производные антипирина, антипириламида, кумарина, имеющими фармацевтическое значение. Определить оптимальные условия получения аналитического сигнала с целью дальнейшей разработки методик их количественного определения. Установить взаимосвязь между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами (потенциалами окисления) антиоксидантов на примере ряда флавоноидов и витаминов.

7. Разработать методику определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения на основе полученных закономерностей. Рассчитать основные метрологические характеристики методики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ.

Провести сравнительные испытания методики с другими известными методами определения активности антиоксидантов. Разработать вольтамперометрический анализатор для определения показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Провести сертификацию нового анализатора. Научная новизна

1. Впервые предложен новый подход на основе метода вольтамперометрии и модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для оценки суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного (продукция пищевой, косметической, фармацевтической промышленности) и природного (экстракты растений, вытяжки торфа, биологические объекты) происхождения.

2. Впервые проведены и обобщены исследования по влиянию поверхностно активных веществ, сопутствующие антиоксидантам, на процесс электровосстановления кислорода. Показан неоднозначный характер данного влияния, зависящий от материала электрода, рН среды, типа поверхностно активных веществ. На основе изученных закономерностей показано, что только на платиновых металлах в кислых средах наблюдается пропорциональное уменьшение тока кислорода в присутствии поверхностно активных веществ. На этой основе разработан новый способ определения суммарного содержания поверхностно - активных веществ в водных средах. На ртутно - пленочном электроде подобной закономерности не обнаружено, что дает возможность использовать данный процесс для определения антиоксидантной активности объектов в присутствии поверхностно активных веществ.

3. Впервые установлены физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Получены новые уравнения для тока кислорода, осложненного наличием предшествующей и последующей химических реакций взаимодействия с антиоксидантами в условиях линейной полубесконечной диффузии на твердых электродах. На основе этого предложены и обоснованы преимущественные механизмы взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами. Установлено, что для каталазы, как фермента антиоксидантной природы, характерен механизм с последующей химической реакцией диспропорционирования и частичной регенерацией деполяризатора. В присутствии антиоксидантов фенольной природы наблюдается преимущественное протекание электродного процесса восстановления кислорода с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами. Для Н Б и Бе содержащих антиоксидантов характерен механизм с преимущественным протеканием предшествующей химической реакцией взаимодействия с молекулярным кислородом.

4. Впервые предложены и теоретически обоснованы новые количественные критерии определения антиоксидантной активности объектов по отношению к процессу электровосстановления кислорода: емкостный (мг/л)"1 критерий, отражающий степень изменения модельного сигнала в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л мин), отражающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени.

5. С использованием факторного эксперимента, метода крутого восхождения и центрального ортогонального композиционного планирования, впервые получены математические модели первого и второго порядков для определения активности антиоксидантов в зависимости от концентрации и времени их взаимодействия с кислородом и его активными формами. Полученные уравнения позволяют определять эффективные концентрации и время активного действия антиоксидантов по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

6. С использованием кинетического и емкостного критериев впервые выявлено значительное влияние ряда факторов, таких, как рН среды, природы растворителя при выделении компонентов растительного сырья, совместимости компонентов в смесях, на антиоксидантные свойства объектов. На примере токоферола моногликозида показано, что данный антиоксидант наиболее активен в нейтральной области рН (7,1 - 7.3). При фракционировании экстрактов растений выявлена наиболее активная этилацетатная фракция, которая рекомендована для наиболее полного извлечения антиоксидантов из растительного сырья. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов показано, что при увеличении числа компонентов (больше 2) их суммарная антиоксидантная активность падает, при этом аддитивности сигнала не наблюдается. На основе данных исследований предложена наиболее эффективная композиция из числа исследованных антиоксидантов на основе аскорбиновой кислоты и дигидрокверцетина в соотношении 1:1.

7. Методом циклической вольтамперометрии впервые установлены механизмы протекания электродных процессов окисления - восстановления ряда вновь синтезированных соединений с антиоксидантными свойствами, имеющими фармацевтическое значение (производные антипирина, антипириламида, кумарина). Показан обратимый характер протекания процессов, определены потенциалы окисления - восстановления исследуемых соединений. Найдены оптимальные условия получения аналитического сигнала (пиков окисления) для исследованных веществ.

8. Найдена взаимосвязь между электрохимическими свойствами (потенциалами окисления) и антиоксидантной активностью веществ. Получено уравнение, которое позволяет прогнозировать значения электрохимических потенциалов окисления и осуществлять целенаправленный синтез и анализ новых соединений с антиоксидантными свойствами.

Достоверность разработанных научных положений и сформулированных выводов обеспечена корреляцией полученных экспериментальных результатов с теоретическими, хорошей сопоставимостью с литературными данными, получением согласованных результатов сравнительных определений вольтамперометрического метода с независимыми аналитическими спектрофотометрическими, кинетическими, флуоресцентными методами, оценкой основных метрологических характеристик результатов определения с помощью методов математической статистики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ.

Практическая значимость работы. Исследование антиоксидантных свойств широкого круга объектов методом вольтамперометрии на основе процесса электровосстановления кислорода, позволило выявить наиболее активные антиоксиданты, их композиции, предложить способ фракционирования экстрактов растений и дать рекомендации для их дальнейшего использования в фитотерапии.

С использованием полученных результатов фирмой «Диадема» (г. Иркутск) разработана новая биологически - активная добавка «Лавитол», прошедшая необходимую процедуру сертификации и допущенная к применению как профилактическое средство сердечно - сосудистых заболеваний. Фирма «Биокор» (г. Новосибирск), используя результаты данной работы, выпустила на рынок новый кисломолочный продукт «Наринэ-2» с улучшенными свойствами.

При исследовании антиоксидантной активности нового синтезированного препарата токоферолмоногликозида выявлены оптимальная концентрация, время активного действия антиоксиданта, рН среды. Результаты данной работы внедрены в НИИ онкологии г. Томска для разработки рекомендаций к лечению и профилактике онкологических заболеваний с использованием данного препарата.

На основе результатов определения совместимости компонентов в смесях антиоксидантов разработаны эффективные антиоксидантные композиции, улучшающие качество питьевой минерализованной воды, косметической продукции. На основе полученных результатов фирма «Кора» (г. Москва) разработала новые косметические средства антиоксидантного назначения, способствующие эффективной защите и омоложению клеток кожи.

Разработан анализатор «Антиоксидант» для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Прибор прошел государственные испытания, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат ]Ш.С.31Л 13.А № 28715) и внесен в единый ГОСреестр СИ под номером 35466-07. В настоящее время анализатор прошел международную сертификацию в Чехии (г. Прага) (Сертификат 1ЕС № 603066-01/01 11.07.2008) и допущен к применению в аналитических и научно-исследовательских лабораториях Европы и Америки.

На защиту выносятся следующие положения:_

1. Обоснование выбора вольтамперометрического метода и модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

2. Результаты оценки влияния поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам, на процесс электровосстановления кислорода в зависимости от материала электрода, рН среды, типа поверхностно - активного вещества.

3. Физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Классификация антиоксидантов по механизмам их взаимодействия с кислородом и его активными формами.

4. Количественные критерии определения антиоксидантной активности объектов по отношению к процессу электровосстановления кислорода: емкостный (мг/л)"1 критерий, отражающий степень изменения модельного сигнала в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л-мин), отражающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени.

5. Результаты определения антиокеидантной активности по отношению к процессу электровостановления кислорода ряда индивидуальных веществ, объектов искусственного и природного происхождения.

6. Результаты определения электрохимических свойств (потенциалов окисления - восстановления) производных антипирина, антипириламида, кумарина, в модельных растворах и лекарственных формах. Выявленные зависимости между электрохимическими свойствами (потенциалами окисления) и антиокеидантной активностью ряда флавоноидов и витаминов.

7. Результаты сравнительных определений антиокеидантной активности некоторых биологически активных веществ с использованием метода вольтамперометрии и независимых аналитических методов анализа (спектрофотометрический, флуориметрический, амперометрический с использованием биосенсора).

8. Методика определения антиокеидантной активности объектов искусственного и природного происхождения по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

Апробация работы Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на следующих Международных и Всероссийских конференциях: VI Межд. конф. «Биоантиоксидант» (г. Москва 2002); Int. conf. "Euroanalysis-12", (Dortmund, Germany, 2002); Всерос. конф. «Актуальные проблемы аналитической химии» (г. Москва, 2002); Всерос. научно -практ. конф. «Химия и технология лекарственных препаратов и полупродуктов» (г. Новокузнецк 2002); I, II, III, IV Всерос. научн. конф. «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (г. Томск, 2000, 2002, 2004, 2006); 203rd Meeting of the electrochemical society (Paris, France 2003); XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (г. Казань 2003); Int. conf. Euro Food Chem XII (Brugge, Belgium 2003); Научно- практ. конф. «Технология органических веществ и высокомолекулярных соединений» (г.Томск,

2003); 3-rd, 4-th, 5- th Int. conf. "Instrumental Methods of Analysis" (Greece 2003, 2005, 2007); V Всерос. конф. «Экоаналитика - 2003». (Санкт- Петербург 2003); 7".-Int conf. on pharmacy and applied physical chemistry (Innsbruck, Austria 2003); 15th Int. symp. of pharmaceutical and biomedical analysis (Florence, Italy 2004); Int. conf. "Euroanalysis - 13" (Salamanca, Spain 2004); I семинара «Методы и средства определения антиокеидантной активности препаратов». (г.Москва, 2004); VII Всерос. науч. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», (г.Новосибирск

2004); 10th Int. conf. on electroanalysis (Ireland 2004); Всерос. научн. конф. «Электроаналитика-2005». (г.Екатеринбург 2005); научно - практ. конф, «Технологии и продукты здорового питания» (г. Москва 2005); Межд. симп. «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г. Тюмень 2005); Int. conf "Analytical chemistry and chemical analysis". (Kyev, Ukraine. 2005); 2-nd Int. symp. on Recent advances in food analysis. (Prague Czech Republic 2005); 8-ой Межд. семинар «Биотехнология-2005» (Пущино. 2005); 2-ой Всерос. конф. «Аналитические приборы 2005» (г Санкт-Петербург 2005); 9-th Annual meeting of the Israel analytical chemistry society (Tel-Aviv Israel 2006); 13-th World congress "Food in life". (Nantes. France 2006); Int. congress ICAS-2006. (Moscow, Russia 2006); III Всерос. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г.Барнаул, 2007); Int. conf. "4th Black Sea basin conference on analytical chemistry" (Sunny Beach, Bulgaria 2007); Int. conf. "Euroanalysis XIV". (Antwerp, Belgium 2007); Межд. XVIII Менделеевский съезд по общей и

прикладной химии (г.Москва 2007); II Всерос. конф. по аналитической химии с межд. участием (г. Туапсе 2007); Всерос. научно- практ. конф. «Здоровое питание -основа жизнедеятельности человека» (г.Красноярск 2008); VII Всерос. конф. «ЭМА - 2008» (г. Уфа 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 128 печатных работ в виде 43 статей (29 статей входит в список журналов, рекомендованных ВАК), материалов докладов и конференций, 4 патентов РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, б-ти глав, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 370 наименований, изложена на 368 страницах текста, содержит 70 таблиц, 104 рисунка и 3 приложения на 30-страницах.

Личный вклад автора Вклад автора состоял в формировании направления исследования, активном участии во всех этапах исследования, постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации и обсуждении экспериментальных данных. Диссертационная работа представляет собой обобщение результатов многолетних исследований, полученных автором лично, а также совместно с научным консультантом Ю.А. Карбаиновым, сотрудниками и аспирантами кафедры физической и аналитической химии Томского политехнического университета.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ. Программа "Развитие научного потенциала высшей школы". Подпрограмма: «Прикладные исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники» № 5.21.2005 Тема: «Создание комплекса по определению суммарной антиоксидантной активности объектов», Федеральной целевой программы (ФЦП) РФ. ГК № 02.512.11.2174 (2007-2008гг), ГК № 02.512.11.2282 (2009-2010гг) Тема: «Разработка анализатора для определения антиоксидантов в биологических объектах», РФФИ. № 07 - 08 - 00227 - а (20072009гг) Тема: «Разработка новых автоматизированных комплексов по определению антиоксидантов в объектах», Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. ГК № 4764р/5098 Тема: «Создание комплекса по исследованию свойств и сертификации биологически-активных добавок».

Автор выражает глубокую признательность и благодарность за совместное проведение исследований и обсуждение результатов работы д.х.н., проф. Я.И. Турьяну (г. Иерусалим Израиль), д.х.н., проф. Е.Б. Бурлаковой, д.х.н.. В.М. Мисину (ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН г. Москва), проф. д.м.н. Н.В. Чердынцевой (НИИ онкологии СО РАМН г. Томск), prof. Т. Kagiya (Kyoto Health Research Foundation Japan), д.х.н., проф. A.A. Бакибаеву (ТПУ г. Томск), prof. R. Nikolova, (Sofia University. Bulgaria), prof. I. Schepetkin (Montana State University USA), проф., д.х.н. А.И. Хлебникову (г.Барнаул. Алтайский ГТУ), д.х.н., проф. В.Д. Филимонову и аспиранту A.B. Воловоденко (ТПУ г. Томск), проф., д.х.н. MC. Юсубову (СМГУ г. Томск), докторанту СМГУ, к.б.н. И.В. Шиловой. Выражаю благодарность проф., д.х.н. H.A. Колпаковой за помощь в обсуждении результатов работы. Выражаю благодарность за помощь в оформлении материала сотрудникам ТПУ к.х.н. O.A. Аврамчик, к.х.н. Н.В. Башкатовой, аспирантам А.Н. Вторушиной, О.И. Липских.

Особая благодарность моему научному консультанту, безвременно ушедшему из жизни, проф., д.х.н. |Ю.А. Карбаинов>|

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика предмета исследования

Термин «антиоксидант» произошел от английского слова «antioxidant» и характеризовал вещество, препятствующее протеканию окислительных процессов в различных средах. Одним из первых широко распространенных применений антиоксидантов явилось предотвращение окислительных процессов деструкции полимеров. В данном случае антиоксиданты характеризовались как ингибиторы или стабилизаторы свободно-радикальных процессов окисления.

В последнее время антиоксиданты широко используются как регуляторы окислительного метаболизма в живых организмах. Они характеризуются способностью в малых количествах различными путями нейтрализовать свободные радикалы, обрывать цепные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ). В широком смысле «антиоксидант» может быть определен как вещество, которое защищает биологическую мишень от окислительного разрушения.

Механизмы действия антиоксидантов весьма разнообразны. Для того, чтобы охарактеризовать весь спектр действия различных классов антиоксидантов, было введено неспецифическое интегральное понятие, обозначенное в литературе как «суммарная антиоксидантная активность», характеризующая потенциальную возможность антиоксидантного действия всех компонентов, находящихся в образце, причем не по отдельности, а в совокупности их взаимодействия между собой в сложной системе, учитывая потенциальный синергизм их кооперативного антиоксидантного действия и вклад неизвестных, редко встречающихся или минорных антиоксидантов.

Выбор адекватных систем оценки антиоксидантной активности имеет первостепенное значение для правильной интерпретации полученных результатов, так как предполагает не просто идентификацию какого-то вещества или нескольких веществ, а выявление «функциональной» антиоксидантной активности по отношению к модельной системе, где протекают окислительно-восстановительные реакции.

Необходимость введения показателя суммарной антиоксидантной активности в контроль качества продукции обусловлено еще и потому, что повышенное содержание антиоксидантов в препаратах или неправильное их применение могут повлечь за собой нежелательные последствия. Антиоксиданты могут превратиться в свою противоположность - промоторов радикальных процессов, которые могут ингибировать белки - ферменты, модифицировать структуру мембран, обладать мутагенными свойствами.

В настоящее время существует множество методов оценки антиоксидантной активности. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. При этом суммарная антиоксидантная активность определяется по ингибированию модельного сигнала в присутствии антиоксидантов. Зачастую такие системы работают в узком диапазоне рН, концентраций антиоксидантов, природы среды. Для расширения возможности анализа в данной работе предложен новый подход, где в качестве модельной реакции используется процесс электровосстановления кислорода (ЭВ 02), который реализуется в несколько стадий с генерацией на поверхности электрода активных форм кислорода: к

02 +ё<->С>; Е°отн.,,в.э=+0.012В (1)

02- + Н+ <=> Н02 (2)

Н02 + н+ + е~ <-> Н202 Е°отн. н.в.э =+0.682 В (3)

Н202 + 2Н+ + 2е~ <-> 2Н20 Е°от н.в.э =+1.770 В (4)

Суммарный процесс:

02 + 4Н+ + 4е" <-> 2Н20 Е°01Н. ,,вэ.=+1.230 В (5)

При повышенном содержании Н202 в растворе возможно образование активных ОН" радикалов по схеме:

н2о2+о-- ->• о2+он-+он- (6)

В щелочных средах при рН>12 происходит преимущественное образование ОН" иона по схеме:

О" 2 +Н20+е<=± ОН" +НО; Е°от„. нвэ =+0.870 В (7)

Для определения концентрации молекулярного кислорода в различных средах широкое применение на практике нашел платиновый электрод, где реализуется 4-ех электронный механизм восстановления кислорода (5) с образованием молекул воды как конечного продукта. Платиновый электрод в сочетании с хлорид -серебряным электродом сравнения известен под названием «Электрод Кларка» и широко используется в большинстве стандартных кислородных датчиков.

На ртутных электродах стадии (1) - (3) и (4) можно изучать раздельно в связи с большим перенапряжением восстановления перекиси водорода на ртути. Кроме того, на ртутных электродах при различных парциальных давлениях кислорода как в водных, так и в неводных средах в области рН 2-10, порядок реакции по 02 равен единице, а по водороду - 0. Это указывает на то, что лимитирующей стадией процесса является стадия (1). Для определения активности антиоксидантов в данной работе предложено использовать первую волну ЭВ 02, соответствующую стадиям (1) - (3), когда на поверхности электрода образуются активные кислородные радикалы и перекись водорода как конечный продукт.

Время жизни анион радикала кислорода О'/ в безводных апротонных средах составляет около 20 часов. Гибель его обусловлена взаимодействием со следами влаги:

О* - +Н20 НОО* + НО- (8)

В водных средах время жизни анион радикала кислорода значительно меньше. Полагают, что оно составляет несколько секунд.

Закономерности процесса ЭВ 02 в присутствии поверхностно -активных

веществ (ПАВ)

Поверхностно-активные вещества, сопутствующие антиоксидантам в объектах искусственного и природного происхождения, оказывают основное мешающее влияние в вольтамперометрическом анализе. Особенно это известно для анализа металлов. Вопрос влияния ПАВ на процесс ЭВ 02 активно дискутируется в литературе. Большинство работ в этой области имеют противоречивый, не систематизированный характер. Однозначным остается факт, что характер влияния адсорбции ПАВ на процесс ЭВ 02 определяется условиями эксперимента (материал электрода, рН среды, природа растворителя, вид полярографии).

Влияние ПАВ на электрохимическое поведение кислорода рассмотрено на модельных растворах, содержащих различные типы ПАВ, которые наиболее широко используются в промышленности и рекомендуются в литературе в качестве стандартных: лаурилсульфат натрия (ТЧаЛС) -анионное ПАВ, цетилпиридиний хлористый (ЦПС1) - катионное ПАВ, синтанол, оксиэтилированный на 12 молей додециловый спирт (ДС-12) - неионогенные ПАВ. Кроме того, в качестве суммарного стандарта ПАВ рассмотрен раствор, состоящий из равных количеств ЦПС1,НаЛС и ДС-12 в соотношении: 1:1:1 (X ПАВ).

Если для большинства электрохимических систем введение ПАВ в раствор вызывает ингибирование как катодных, так и анодных пиков, то по отношению к процессу ЭВ Ог такой зависимости не наблюдается. Это подтверждают снятые зависимости предельного тока ЭВ СЬ от логарифма концентрации ПАВ в растворе в широком диапазоне (рис. 1). Все они не имеют пропорционального характера и неоднозначны для разных типов ПАВ на трех типах электродов (ртутно-пленочном (РПЭ), стеклоуглеродном (СУЭ) и платиновом (РО при различных рН.

Причина такого поведения ПАВ возможно кроется в гидрофобности молекулярного кислорода и в механизме влияния ПАВ на молекулу кислорода на поверхности электрода, где сами органические вещества, адсорбируясь на электроде, принимают участие в передаче электрона от металла через адсорбированную частицу ПАВ к восстанавливающейся молекуле кислорода со скоростью большей, чем скорость диффузии 02, особенно для РПЭ. Кроме того, адсорбируясь на поверхности электрода, ПАВ затрудняют процессы адсорбции -десорбции продуктов реакции ЭВ О2, что в свою очередь ведет к невоспроизводимости результатов исследований. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными, объясняя столь неоднозначное влияние ПАВ на катодный ток О2.

Подтверждением вышеописанного механизма служит и сдвиг потенциала предельного тока 02 в отрицательную область с ростом концентрации ПАВ в растворе для СУЭ и платинового электрода.

Рис. 1. Зависимость тока ЭВ О2 от логарифма концентрации ПАВ (г/л) в водном растворе 0.1 М ШС104 при рН 3 (1), рН 6 (2) и рН 12 (3) на РПЭ, СУЭ и Р1 электроде для разных типов ПАВ.

Полученные результаты показали, что только на платиновом электроде наблюдается пропорциональное изменение тока и потенциала предельного тока кислорода в присутствии ПАВ в кислой среде (рН < 5). В данных условиях на металлах 1 группы (Р1 и другие) меняются механизм и характер замедленной стадии катодного восстановления 02, которое начинает подчиняться закономерностям необратимого электродного процесса. Причем в данных условиях наблюдается предварительная адсорбция ионов водорода, а в качестве замедленной выступает стадия взаимодействия адсорбированных атомов водорода с молекулой кислорода на поверхности электрода:

Н+(адс) + 02 + е —^ Н02 (9)

Следовательно, в кислых средах на металлах платиновой группы наблюдается ингибирование катодных волн 02 с ростом концентрации ПАВ в растворе, причем, зависимости = / С пав) имеют прямолинейный характер, различаясь в наклоне для разных типов ПАВ (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость тока ЭВ 02 от логарифма концентрации ПАВ на Рг электроде, г/л : синтанол (1), ДС-12 (2), ЫаЛС (3), I ПАВ (4), ЦПС1 (5)

Следует заметить, что при одновременном снижении катодных волн кислорода на платиновом электроде в кислой среде наблюдается их расширение и сдвиг потенциала при увеличении концентрации ПАВ в растворе. Такой характер изменения катодных волн позволяет предположить, что в данном случае вероятный механизм ингибирования электродного процесса ЭВ 02 в присутствии ПАВ заключается в торможении собственно электрохимической реакции (лимитирующей стадии процесса). В чистом фоновом растворе на поверхности Р1 электрода при рН < 5 в качестве переносчика электронов к восстанавливающейся молекуле 02 выступает адсорбированный атом водорода Н+ (адС) по реакции (29), которая является замедленной для всего процесса ЭВ Ог. Введение ПАВ вызывает блокировку части рабочей поверхности электрода, конкурируя с Н+ (адС). Это характерно для всех типов рассмотренных ПАВ в растворе.

На основании полученных результатов разработан вольтамперометрический способ определения суммарного содержания ПАВ в водных объектах высокой чистоты на платиновом электроде в подкисленной среде, используя процесс ЭВ 02. Способ защищен патентом РФ. На РПЭ механизм и закономерности процесса ЭВ 02 меняются, что дает возможность использовать данный процесс для определения показателя АОА природных и промышленных объектов даже в присутствии ПАВ.

Физико-химические закономерности влияния антиоксидантов на процесс электровосстановления кислорода в условиях вольтамперометрического

анализа

Как известно, электровосстановление кислорода на ртутном пленочном электроде при средних значениях скорости развертки потенциала (У=20 - 80 мВ/с) является квазиобратимым процессом и протекает в условиях смешанной кинетики, когда скорость диффузии кислорода в растворе сопоставима со скоростью протекания электрохимической стадии его восстановления. При оценке влияния природы антиоксидантов на процесс электровосстановления кислорода было замечено, что они по-разному влияют на данный процесс, при этом сами не являясь электрохимически активными в данной области потенциалов (Е=-0.1 -0.9В). В таблице 1 приведены исследуемые антиоксиданты и БАВ как искусственного, так и природного происхождения, условно разделенные на 3 группы, различающиеся по характеру влияния на процесс ЭВ 02 На рис. 3 приведены вольтамперограммы, характеризующие влияние антиоксидантов различных групп на процесс ЭВ 02.

Первая группа веществ увеличивает ток ЭВ 02 и сдвигает потенциал в сторону отрицательных значений (каталаза) (рис.За). К данной группе относится фермент антиоксидантной природы (каталаза), а также гуминовые кислоты, порфирины, фталоцианины металлов. Все эти вещества очень разные по своей природе, однако их объединяет одно общее свойство: все они относятся к металлокомплексам, имея в своей структуре ионы переходных металлов. Это свойство как раз и обуславливает каталитический характер влияния на процесс ЭВ 02. Сдвиг потенциала полуволны тока ЭВ 02 в отрицательную область позволил предположить наличие механизма ЕС* с последующей реакцией диспропорционирования продукта реакции и частичной регенерацией деполяризатора: молекулярного кислорода.

Таблица 1.

Группы изученных биологически активных веществ (БАВ), различающиеся по характеру влияния на процесс ЭВ 02__

№ группы 1 группа 2 группа 3 группа

Названия веществ Металлокомплексы (катал аза, фталоцианины, порфирины металлов, гуминовые кислоты) Соединения фенольной природы (витамины А, Е,С, В, аскорбаты металлов, флавоноиды, кумарины, коэнзим (Зю, экстракты растений). N, S, Se-содержащие биологически активные вещества (Se содержащие БАД, производные антипирина и антипирил амида)

Влияние на ЭВ 02 Увеличение тока ЭВ 02, сдвиг потенциала в отрицательную область Уменьшение тока ЭВ 02, сдвиг потенциала в положительную область. Уменьшение тока ЭВ 02, сдвиг потенциала в отрицательную область.

Предполагае мый электродный механизм. Механизм ЕС* с последующей реакцией диспропорциониров ания Механизм ЕС Механизм CEC

Примечание: Е - электродная стадия процесса, С - сопутствующая химическая реакция.

Рис. 3. Вольтамперограммы тока ЭВ 02 в отсутствии (1) и в присутствии разных групп антиоксидантов (2): а) 0.005г/мл каталазы, б) 0.005г/мл витамина С, с) 0.005г/мл селенита натрия. 3 - фоновый ток в отсутствии кислорода в растворе.

Вторая группа веществ наиболее многочисленная и изучена более подробно, т.к. именно эти вещества относят к классическим антиоксидантам, и их широко используют в качестве добавок в пищевой, косметической, фармацевтической промышленности. Все из указанных веществ уменьшали ток ЭВ 02, сдвигая потенциал в положительную область (рис.ЗЬ), проявляя механизм ЕС с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалам. Исследованы антиоксидантные свойства по отношению к процессу ЭВ 02 флавоноидов (рутина, кверцетина,

дигидрокверцетина, катехина), ряда витаминов (Е, А,С, В6), аскорбатов металлов, коэнзима Qio, экстрактов растений.

Третья группа веществ также уменьшает ток ЭВ 02, но сдвигает потенциал в отрицательную область (рис. Зс), увеличивая перенапряжение процесса. Предполагается, что вещества этой группы взаимодействуют преимущественно по СЕ механизму с молекулярным кислородом, растворенным в электролите или CEC механизму с предшествующей и последующей химическими реакциями взаимодействия антиоксиданта с молекулярным кислородом и продуктами его восстановления. Из экспериментальных результатов по данной группе изучены антиоксидантные свойства селен содержащих БАД, синтезированных производных антипирина, антипириламида, бенздиазепина, имеющих фармацевтическое значение.

Рассмотрим физико - химические закономерности влияния каждой группы из представленных веществ на процесс ЭВ 02 более подробно.

Закономерности влияния каталазы на процесс ЭВ 02.

При влиянии каталазы на процесс ЭВ 02 наблюдается увеличение тока ЭВ 02 и сдвиг потенциала полуволны в отрицательную область, что характеризует наличие последующей химической реакцией диспропорционирования, в результате которой происходит частичная регенерация деполяризатора (молекулярного кислорода).

Подобные процессы рассматривались в монографиях 3. Галюса, Ф. Шольца, Р. Комптона. Исходя из вышеописанных работ, продукт электродной реакции неустойчив и диспропорционирует под воздействием катализатора, в результате чего частично регенерируется исходный деполяризатор.

Для обратимых и квазиобратимых процессов в условиях малых V (до 50 мВ/с) потенциал полуволны был описан уравнением:

„ с0 0.071 0.020. 0.020. кхС°0х

Ер/2 = Е----lgn +-lg—-f- (10)

п п п V

При малых V (до 50мВ/с), ток пика не зависит от диффузии, и его можно представить в виде:

Ip = nFAC0x0(Dk1Z0)l/2 (11)

Где к] константа скорости последующей реакции диспропорционирования, л/моль-с, V - скорость развертки потенциала, мВ/с, п - количество электронов, участвующих в лимитирующей стадии электродного процесса, С0х° -концентрация деполяризатора, моль/л, А - площадь электрода, см2, D -коэффициент диффузии деполяризатора, см2/с, Z0 - концентрация катализатора, моль/л.

В случае процесса ЭВ 02 с последующей реакцией диспропорционирования перекиси водорода под воздействием каталазы схему процесса можно представить в следующем виде:

)2 + е~+Н+ <=±Н02' (12)

Н02+е"+Н+ <=> Н202 (13)

каталача

2Н202-* 2Н20 + 02 (14)

Данный электродный процесс удовлетворяет всем признакам наличия последующей химической реакции диспропорционирования и частичной регенерации деполяризатора - молекулярного кислорода.

1. Потенциал полуволны катодного восстановления кислорода в присутствии каталазы зависит от концентрации деполяризатора и 1ц 1/У в области малых значений V (до 50мВ/с) (рис. 4).

2. По уравнению |Ер - Ерд| = 0.041/п определено количество электронов, участвующих в лимитирующей стадии электродного процесса: п=1.

3. Форма волны не меняется, при этом происходит увеличение предельного тока деполяризатора и сдвиг потенциала в сторону отрицательных значений с увеличением концентрации каталазы в растворе при наличии последующей реакции диспропорционирования (рис. 5).

I, мкА

-Б в

15-

10

Рис.4 Зависимость потенциала пика от 18 1/У

о 0.3 0.6 0.9 -яв Рис. 5. Вольтамперограммы тока ЭВ СЬ в фоновом электролите (1), в присутствии 3-10"5 г/мл каталазы (2), 6-10"5 г/мл каталазы (3).

График зависимости предельного тока ЭВ СЬ от корня квадратного концентрации каталазы в растворе, показанного на рис. 6, в диапазоне концентраций от 4.31 • 10"8 до 6,51 • 10" моль/л имеет прямолинейный характер.

1р, мкА

у = 1,8902х + 28,204 _ = 0,9997 .

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

С(кат)ш10*. моль/л

Рис.6. Зависимость предельного тока ЭВ 02 от концентрации каталазы в

степени 'Л при V = 50 мВ/с, рН=6,86.

Используя тангенс угла наклона прямолинейной зависимости тока ЭВ Ог от корня квадратного концентрации каталазы в растворе (рис.6), можно определить константу последующей химической реакции диспропорционирования перекиси водорода под воздействием каталазы к[ по уравнению (11) (таблица 2).

Полученные значения хорошо согласуется с литературными данными (Гейровский Я., Кута И. Основы полярографии. - М.: Мир, 1965. - 559с) (табл. 2). Наибольшая константа скорости последующей реакции диспропорционирования наблюдается в нейтральной области рН=6.86, что связано с денатурацией фермента при значениях рН, отличающихся от нейтрального.

Таблица 2.

Значения констант скорости последующей реакции диспропорционирования перекиси водорода в присутствии каталазы при различных значениях рН (п=3,

р=0.95).

рН л/моль-с (метод вольтамперометрии) к1г л/моль-с (метод полярографии).

4,01 0.14 -10' -

6,86 1,11-Ю7 1,70-107

9,18 0.82 -10' -

12,45 0.10-10' -

Аптиоксиданты, взаимодействующие с активными кислородными радикалами по механизму ЕС.

Вопрос влияния последующей гомогенной химической реакции на электродный процесс активно обсуждается в различных литературных источниках. Однако, единого мнения о влиянии последующей химической реакции на предельный ток деполяризатора в условиях квазиобратимого электродного процесса нет.

В процессе систематизации литературных данных были выявлены и обобщены признаки наличия последующей химической реакции в электродном процессе по механизму ЕС. Показано, что для процесса ЭВ О2 в присутствии антиоксидантов фенольной природы, взаимодействующих с активными кислородными радикалами, данные признаки соблюдаются. Зависимость потенциала полуволны тока ЭВ 02 в присутствии антиоксидантов от ^ (V172) носит линейный характер, в то время как в отсутствии АО для данного процесса зависимость не линейна (рис.7). При уменьшении скорости развертки потенциала наблюдается сдвиг потенциала полуволны ЭВ О2 в присутствии антиоксиданта в положительную область, а также уменьшение предельного тока ЭВ О2. (рис.8). При уменьшении V1'2 в 10 раз, потенциал пика смещается на 2.3ЯТ/2гР и составляет 30 мВ при п=1 (количество электронов, участвующих в лимитирующей стадии процесса).

Полученные данные подтверждают наличие последующей химической реакции взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами по механизму ЕС для процесса ЭВ Ог. Однако, для более точной трактовки влияния последующей химической реакции на процесс ЭВ О2 рассмотрим данный механизм в условиях стационарной диффузии, что весьма допустимо при малых скоростях развертки потенциала.

предельного тока ЭВ 02 от скорости развертки потенциала: (1) в отсутствии АО в растворе, (2) в присутствии аскорбиновой кислоты С = 1*10" г/мл

Рис.8. Вольтамперограммы тока ЭВ 02 в фосфатном буфере (рН 6.86) в присутствии аскорбиновой к-ты (С = 1*10-5 г/мл) при: (1) У=30 мВ/с, (2) У=300 мВ/с

Представим общую схему электродного процесса с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами выражением (15).

áff.

не- -\Н

ш zr щ--

к

áff. К

diff.

е" -ни-

к2;-МЩСН

к^-МЦСН

(15)

реагируют

В данном случае предполагается, что антиоксиданты не реагируют с молекулярным кислородом ни на поверхности электрода, ни в глубине раствора. Для обоснования этого постулата были проведены измерения концентрации молекулярного кислорода в отсутствии и присутствии антиоксидантов, используя стандартный кислородный датчик (производства «МЭРА - Эльвро» Польша), позволяющий определять концентрацию молекулярного кислорода до 10"4 моль/л. Шкала данного датчика градуирована в % относительно исходного содержания молекулярного кислорода в растворе. В данном случае при добавлении в раствор в качестве антиоксидантов некоторых флавоноидов (дигидрокверцетина, рутина, катехина, кверцетина) даже в больших концентрациях (С=0.001 - 0.1 моль/л) изменение сигнала обнаружено не было. Этот факт позволил подтвердить постулат об отсутствии взаимодействия или незначительном взаимодействии АО второй группы с молекулярным кислородом в объеме раствора.

В работе Я.И. Турьяна (Turyan Y.I., Gorenbein P., Kohen R.//J. Electroanalytical Chem. - 2004. - Vol. 571, №571. - P. 183-188) для описания электродного процесса ЭВ 02 в присутствии антиоксидантов была использована теория реакционного слоя. При этом применялись следующие допущения:

1. Использовались условия стационарной диффузии, что может быть допустимо при малых скоростях развертки потенциала на стационарном ртутно -пленочном электроде.

2. Среди продуктов реакции по схеме (15) в раствор диффундирует только форма Н202 как конечный продукт.

3. Коэффициенты диффузии окисленной и восстановленной форм процесса ЭВ 02 принимались равными друг другу.

4. В качестве лимитирующей стадии выступала стадия (1) образования супероксид анион радикала. Остальные стадии электродного процесса являются обратимыми и протекают с достаточно большой скоростью.

5. Антиоксиданты реагируют с активными кислородными радикалами на поверхности электрода преимущественно в прямом направлении. Реакция взаимодействия антиоксидантов с молекулярным кислородом как на поверхности электрода, так и в глубине раствора не учитывалась.

6. Концентрация антиоксиданта была достаточно большой, поэтому ее изменениями в ходе электродного процесса можно пренебречь.

7. Влияние рН раствора нивелировалось использованием буферной системы в качестве фонового электролита.

Исходя из схемы (15) и принятых допущений, получено выражение для тока кислорода на электрод в присутствии (16) и отсутствии (17) антиоксидантов в растворе:

W\S)CAO (16)

Id = 2Fk'd[H202l (17)

где

к; =io ~%Siu{ (18)

к[ =10 ~3k2Sju2 (19)

к, = 10-4, d a (20)

где А, - кинетический ток в присутствии АО в растворе, 1а -диффузионный ток в отсутствии антиоксидантов в растворе, Р- постоянная Фарадея, к| и к2 - константы скорости последующих химических реакций взаимодействия антиоксиданта с активными кислородными радикалами, к^ - константа диффузионного тока, |Л -толщина диффузионного слоя, см.

С учетом равновесных стадий (2) и (3) в схеме (15), введем соответствующие константы равновесия:

К __(21)

иш

= К, = ехр

__L (Е-El)

RT\ 21

(22)

T-l-J, .. ЛrrUCA0 (23)

При определении относительного изменения тока в присутствии АО, получим следующее выражение для соотношения токов на электрод:

/ {к[ +к'2К2) I„ 2к'К2К^Н+]'

В случае присутствия АО в виде ионов, выражение (22) преобразуется в (23)

/ (к; +к'к2)

I, 2к'К2К3 (24)

Исходя из полученных уравнений, общий множитель перед концентрацией АО можно принять за константу в данных условиях эксперимента. Тогда мы получим выражение:

Т = Х-кСло (25)

V

В данном случае полученное уравнение не дает возможности рассчитать кинетические параметры процесса, но объясняет наличие линейной зависимости изменения тока ЭВ 02 от концентрации антиоксидантов в растворе. При этом понижение предельного тока ЭВ 02 в присутствии антиоксидантов будет наблюдаться при соотношении:

[к[ +к,2К2)САО<2к,(1К2Къ[Н'] (26)

В случае отсутствия взаимодействия веществ с кислородными радикалами, мы не будем наблюдать изменения сигнала ЭВ 02 в присутствии данных веществ, тогда выражения будут равны друг другу:

1к = 0:(к[ +к'2 К2)САО=2к',К2К,[Н-] (27)

И наконец, при

Л<0 :{к[ +к'2К2)САО> 2к'л К2Кг [#+ ] (28)

Таким образом, в условиях квазиобратимого электродного процесса ЭВ 02 при наличии последующей химической реакции взаимодействия АО с активными кислородными радикалами, уменьшение предельного тока обусловлено большими константами равновесия стадий образования Н02 (2) и перекиси водорода Н202 (3) на схеме (15) и соизмеримыми константами скоростей последующих химических реакций взаимодействия с антиоксидантами.

Процесс ЭВ 02 в присутствии N, S, Se содержащих антиоксидантов

Для подтверждения наличия взаимодействия антиоксидантов 3-ей группы (табл. 1) с молекулярным кислородом по механизму СЕ были проведены измерения концентрации молекулярного кислорода в отсутствии и присутствии антиоксидантов, используя стандартный кислородный датчик. В данном случае при добавлении в раствор в качестве антиоксидантов сульфита натрия, селенита натрия в концентрациях (С=0.0001 - 0.01 моль/л) идет уменьшение % содержания молекулярного кислорода в растворе. Этот факт позволил подтвердить наличие взаимодействия исследованных АО с молекулярным кислородом по механизму СЕ или CEC.

В случае влияния S, Se - содержащих антиоксидантов на процесс ЭВ 02 все признаки наличия предшествующей химической реакции соблюдаются. Наблюдается сдвиг потенциала в сторону отрицательных значений при увеличении концентрации антиоксиданта в растворе, растянутость пика (рис.9). Однако,

предельный ток ЭВ 02 зависит от скорости развертки потенциала в присутствии указанных антиоксидантов (рис.10). Это указывает на то, что предшествующая химическая реакция не является лимитирующей стадией процесса.

|,мкА

Рис.10. Зависимость тока ЭВ 02 Рис.9. Вольтамперограмма процесса ЭВ 02 в от скорости развертки отсутствии (1) и в присутствии Б АД потенциала в степени !Л в «Селенактив» С = 0.001 г/мл (2), С = 0,005 г/мл присутствии БАД

(3). «Селенактив» С= 0,001 г/мл.

Из приведенных данных можно предположить наличие следующего механизма протекания процесса (CEC):

02 диф >Of +R,SH ) Н02 + ё" <——> Hü'f + RS' (29)

но;- + RSH^-+ RS% (30)

RS'+RS'^=±RS-SR (31)

При этом лимитирующей стадий процесса является электрохимическая реакция (29) с константой скорости kRl. Остальные химические реакции протекают с достаточно большой скоростью и не лимитируют процесс.

Критерии оценки антиоксидантной активности объектов

Исходя из литературных данных, наиболее общепринятыми критериями оценки антиоксидантной активности объектов являются следующие:

1. Международный критерий ORAC (Oxygen radicals absorbance capacity -способность поглощать кислородные радикалы), отнесенный к стандартному антиоксиданту (например, тролоксу в неводных средах, так называемый тролоксовый эквивалент). Данный критерий рассчитывается по следующей обобщенной формуле:

ОКАС = к

(5образца - Бфона)

(32)

где ¿'образца - аналитический сигнал (площадь под пиком) образца, Б1р0_1тса -аналитический сигнал (площадь под пиком) тролокса - вещества взятого в данном случае за стандарт, 5ф0На - общая площадь фона, к - коэффициент разбавления или коэффициент пересчета (постоянная величина для каждого метода), подбирается эмпирически для удобства интерпретации результатов анализа.

В условиях вольтамперометрического анализа данный критерий рассчитывался по формуле:

где / — предельный ток электровосстановления кислорода в присутствии антиоксиданта в растворе, мкА , 10 — предельный ток электровосстановления кислорода в отсутствии антиоксиданта в растворе, мкА, — предельный ток электровосстановления кислорода в присутствии стандартного антиоксиданта в растворе, мкА.

Использование данного критерия весьма удобно в работе, так как ток ЭВ со стандартным антиоксидантом можно снять один раз, а затем использовать это значение в рутинных анализах, не повторяя данную процедуру, при одинаковых условиях анализа. Кроме того, данный критерий безразмерен, и его можно использовать для сравнения результатов различных методов анализа.

2. Биохимический критерий 1С50, отражающий концентрацию антиоксиданта при ингибировании модельного сигнала на 50%. Размерность: моль/л или мг/л. По результатам определений строят график зависимости степени ингибирования модельного сигнала от концентрации добавляемого антиоксиданта. Данный критерий трактован здесь как «биохимический», в связи с его широким использованием в биохимических исследованиях.

Данный критерий весьма удобно использовать для сравнительных определений антиоксидантной активности различными методами и для исследования антиоксидантных свойств индивидуальных веществ, особенно имеющих биохимическое значение.

3. Определение антиоксидантной активности образца по градуировочному графику.

В данном случае необходим выбор стандартного антиоксиданта, по которому строится градуировочный график изменения модельного сигнала от известной концентрации антиоксиданта в растворе. Далее для исследуемого образца определяется величина модельного сигнала и по градуировочному графику определяется показатель антиоксидантной активности в пересчете на стандартный антиоксидант (косвенное определение). Размерность данного критерия выражена в единицах концентрации стандартного антиоксиданта (моль/л или мг/л).

Удобство использования данного критерия заключается в том, что можно один раз построить градуировочную зависимость, а потом ее использовать в рутинных анализах, периодически проверяя наличие отклонений, согласно регламентируемой процедуре выполнения измерений в аналитических лабораториях.

В данной работе, наряду с общеизвестными критериями, для оценки антиоксидантной активности объектов предложено использовать 2 новых

(33)

критерия:

1. Емкостный критерий отражает степень изменения тока ЭВ О2 в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе. Размерность: мл/г.

При исследовании физико-химических закономерностей процесса ЭВ О2 в присутствии антиоксидантов в условиях стационарной диффузии при малых значениях скорости развертки потенциала был сделан вывод, что активность антиоксидантов можно определять, используя относительное изменение тока ЭВ 02 в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе.

По формуле (34) рассчитывается емкостный критерий антиоксидантной активности, Кемк (мл/г):

где /гток ЭВ 02 в присутствии АО в растворе, мкА, /„-ток ЭВ О2 в отсутствии АО в растворе, мкА; С - концентрация АО в растворе, г/мл.

Данный критерий отражает степень изменения модельного сигнала (тока ЭВ О2) в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе и определяется по тангенсу угла наклона графика зависимости относительного изменения тока ЭВ 02 от концентрации антиоксиданта в растворе.

Данный критерий освобождается от необходимости использовать стандартный антиоксидант, однако, применение его в аналитической практике затруднено из-за несоответствия диапазонов концентраций различных антиоксидантов, используемых в различных отраслях промышленности. Данный критерий имеет эмпирический характер, и его удобно использовать для исследования антиоксидантных свойств индивидуальных веществ в одинаковом концентрационном диапазоне.

2. Кинетический критерий отражает количество кислорода и активных кислородных радикалов, прореагировавших с антиоксидантом (или суммарным содержанием антиоксидантов) за минуту времени. Размерность: мкмоль/л мин. Формула:

где I —предельный ток электровосстановления кислорода в присутствии антиоксиданта в растворе, мкА , /0 — предельный ток электровосстановления кислорода в отсутствии антиоксиданта в растворе, мкА, С0 — исходная концентрация кислорода в растворе, мкмоль/л (приравнивается к растворимости кислорода в исследуемом электролите при н.у.), ? — время экспозиции рабочего электрода при постоянном потенциале предельного тока кислорода, характеризующее протекания реакции взаимодействия антиоксиданта с активными кислородными радикалами, мин.

По процедуре выполнения анализа снимались вольтамперограммы тока ЭВ 02 в фоновом электролите, а затем с добавкой антиоксиданта или исследуемого образца. Так как добавки антиоксиданта были достаточно малы (0.1 мл) по сравнению с объемом фонового электролита (10 мл), то изменениями концентрации молекулярного кислорода при добавке раствора с антиоксидантом можно пренебречь. Вольтамперограммы фиксировались каждый раз после выдерживания рабочего электрода в исследуемом растворе при потенциале

К

(34)

С I

(35)

предельного тока ЭВ Oi (Е= -0.3 В для водных сред, Е= -0.6В для неводных сред) в течение 3 минут (рис. 11).

По полученным результатам строились графики зависимости функции

/1

1--как доли прореагировавшего с антиоксидантом кислорода, от времени

\ h)

протекания процесса при постоянном содержании антиоксиданта в растворе (рис. 12).

По линейной части графика и по тангенсу угла наклона касательной к данному участку кривой рассчитывался кинетический критерий антиоксидантной активности образцов — К, мкмоль/лмин по формуле (35). Например, для аскорбиновой кислоты (С= 0.1 мг/мл) его величина равна 1.15 мкмоль/л-мин.

Использование относительного изменения тока электровосстановления кислорода позволяет значительно повысить точность метода, избежать влияния растворителя, окружающей среды и других побочных факторов на определение суммарной антиоксидантной активности образцов.

Рис. 11. Вольтамперограмма тока электровосстановления

кислорода в присутствии аскорбиновой кислоты. Верхняя линия — фоновый ток в отсутствии образца в растворе. Нижние линии характеризуют уменьшение тока кислорода в зависимости от времени протекания реакции между кислородными формами и веществом в растворе.

Рис. 12.. Зависимость относительного изменения тока ЭВ 02 от времени протекания процесса в присутствии аскорбиновой кислоты при С= 0.01г/мл, фоновый электролит: фосфатный буфер рН = 6.86.

Кинетический критерий носит эмпирический характер. Он введен для удобства в интерпретации результатов определения суммарного показателя антиоксидантной активности сложных объектов (экстрактов растений, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности). Данный критерий также освобождается от необходимости привлечения стандартного антиоксиданта,

что весьма удобно для сравнительных определений антиоксидантной активности объектов.

Используя изученные закономерности и предложенные критерии, были исследованы антиоксидантные свойства ряда индивидуальных соединений, а также объектов искусственного и природного происхождения. Для определения антиоксидантной активности объектов основными рабочими условиями проведения эксперимента выбраны следующие: рабочий электрод - ртутно-пленочный, электрод сравнения и вспомогательный электрод - хлорид -серебряные, фоновый электролит - фосфатный буфер для водных сред (рН=6.86), 0.1М №004 для апротонных сред (диметилформамид).

Антиоксидантная активность некоторых флавоноидов по отношению к процессу ЭВ 02

На основе полученных закономерностей определена антиоксидантная активность ряда флавоноидов (рутина, кверцетина, дигидрокверцетина и катехина). Предложен способ определения оптимальных концентрации и времени активного действия исследованных флавоноидов по отношению к процессу ЭВ 02, используя методы планирования эксперимента. В качестве функции отклика (У) было выбрано относительное изменение тока ЭВ 02 в присутствии исследуемого АО:

С использованием центрального ортогонального композиционного планирования получены уравнения регрессии для рассматриваемых флавоноидов с учетом значимости коэффициентов в оптимальной области факторного пространства:

Рутин у=0.0699+0.0212x1-0.0 112х2+0.0078 х,2

Кверцетин у=0.1504-0.0373х2-0.0112х,х2-0.0731 х,2+0.0250 х22

Дигидрокверцетин у=0.0859-0.029х,-0.0134х2-0.0116х,х2+0.125 х(2 Катехин у=0.0275+0.0083х1+0.0090х2+0.0030х,х2-0.0104х12-

0.0144х22

На основе полученных двухфакторных поверхностей отклика для каждого из веществ были определены оптимальные интервалы концентраций (Х^ и время активного действия (Х2) флавоноидов, а также их антиоксидантная активность, рассчитанная по кинетическому критерию.

По данным таблицы 3 наибольшую активность из рассмотренных флавоноидов проявил кверцетин, также, как и наибольшее время активного действия. Наименьшую концентрацию при наибольшей активности показал рутин.

Таблица 3.

Значения антиоксидантной активности образцов по отношению к процессу ЭВ 02 при оптимальных значениях концентрации и времени взаимодействия

Флавоноид С,4 *106, моль/л мин К, мкмоль/л-мин

Рутин 0.82 ±0.04 40 0.12+0.09

Катехин 1.40+0.06 20 0.23 ±0.05

Кверцетин 1.55 ±0.04 45 0.27 ±0.03

Дигидрокверцетин 3.20+0.03 30 0.14±0.06

Антиоксидантные свойства производных кумарина

Кумарины представлены группой веществ, в основе которых лежит бициклическое ядро бензопирона (табл. 4). Методом вольтамперометрии исследованы антиоксидантные свойства некоторых вновь синтезированных производных кумаринов. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Значения антиоксидантной активности производных кумаринов по отношению к

процессу ЭВ 02 (р=0.95, п=5)

№ X У я К, мкмоль/л-мин Келт мл/г

1 с=о Р(0)(0Е1)2 Н 0.11 + 0.02 0.20 ± 0.05

2 Р(0)(0Е() С(0)0Е1 Н 0.10 ±0.08 0.19 ±0.03

3 с=о Р(0)(0Е1)(0Н) н 0.09 ± 0.07 0.13 ±0.06

4 со Р(0)(ОЕ1)2 6-Вг 0.13 ±0.04 0.21 ± 0.02

5 с=о Р(0)(0Е1)2 6-С1 0.17 ±0.06 0.26 ± 0.04

6 с=о Р(0)(0Е1)2 7-Ы(Е1)2 0.53 ± 0.05 0.36 ± 0.04

Где X, У, Я - заместители в структуре синтезированных кумаринов:

Для всех рассмотренных веществ наблюдается ингибирование катодного тока кислорода и сдвиг потенциала в положительную область. Также видна взаимосвязь между значениями емкостного и кинетического критериев, что говорит об активном влиянии на процесс ЭВ 02 обоих факторов времени и концентрации исследуемых производных кумаринов в растворе.

Показано, что вновь синтезированные производные кумаринов обладают неплохой антиоксидантной активностью по отношению к процессу ЭВ 02, не уступающих по своим показателям природным аналогам, извлечение которых из растительного сырья достаточно трудоемкий и долговременный процесс.

Антиоксидантные свойства некоторых витаминов.

Среди витаминов наиболее известны как эффективные антиоксиданты водорастворимые витамины С, группы В, жирорастворимые витамины Е, А. Показатель антиоксидантной активности объектов определялся по относительному уменьшению тока ЭВ 02, используя кинетический критерий - К. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5.

Значения антиоксидантной активности, рассчитанных по кинетическому критерию для водорастворимых витаминов С, В6, жирорастворимых витаминов

Е,А (р=0.95, п=5)

Название витаминов К, мкмоль/л-мин

С=0.599 мг/мл С=1.195 мг/мл

Витамин А 10.01 ±0.07 12.91 ±0.03

Витамин Е 9.26 ± 0.04 11.29 ±0.08

С=0.100 мг/мл С= 1.000 мг/мл

Витамин С 1.15±0.08 1.43±0.02

Витамин В6 0.32±0.04 0.35±0.07

Как видно из таблицы 5 активность витаминов зависит от их концентрации в растворе. Наиболее активен по отношению к процессу ЭВ 02 витамин А из жирорастворимых и витамин С из водорастворимых витаминов из представленных в таблице.

Антиоксидантные свойства ве содержащих БЛД

В данной работе исследовалась антиоксидантная активность ряда пищевых (биологически активных) добавок в различных диапазонах концентраций, содержащих селен.

Антиоксидантную активность селен - содержащих препаратов определяли с использованием емкостного критерия. Результаты исследований приведены в таблице 6.

Спектр действий селена внутри организма довольно широк. Он выполняет каталитическую, структурную и регуляторную функции, взаимодействует с витаминами, ферментами и биологическими мембранами, участвует в окислительно-восстановительных процессах, обмене жиров, белков и углеводов. Как видно из таблицы 6, все изученные образцы проявили в большей или меньшей степени антиоксидантную активность. Сравнительный анализ позволяет выделить такие образцы как «Селенактив»и «СеленЕС+.Г+2п», которые наряду с их несомненной антиоксидантной активностью имеют и другие полезные свойства.

В БАД «Селенактив» 8е содержится в форме ксантена в сочетании с витамином Е. Очевидно это сочетание наиболее эффективно, поскольку 8е в данной форме усиливает как собственные антиоксидантные свойства биомолекулы так и свойства витамина Е.

Таблица 6.

Значения антиоксидантной активности Бе -содержащих БАД, рассчитанные по

емкостному критерию

Название БАД Дополнительн ые компоненты форма Бе Све, мкг/табл. Г г/мл Кемы мл/г 8г

Селенактив витамин Е ксантен 35 0.1 27.66 0.08

Селен ЕС+1+гп 12, витамины С, Е,ВьВ2иВ6 органичес кий Бе 10 0.1 12.2 0.09

Селен ЕС витамины С и Е органичес кий Бе 10 0.1 10.12 0.08

Селцинк плюс 2п; витамины С, Е селенит натрия 50 0.1 4.52 0.08

Полученные данные позволяют рекомендовать данные пищевые добавки в целях профилактики многих заболеваний, нормализации обмена веществ и укрепления организма. Однако, в данном случае необходимо строго соблюдать дозировку указанных веществ.

Определение показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхоиедения

На основе полученных закономерностей влияния антиоксидантов на процесс электровосстановления кислорода была определена антиоксидантная активность

объектов искусственного (продукция пищевой, косметической, фармацевтической промышленности) и природного (экстракты растений, вытяжки из торфов) происхождения. Достаточно обширная база данных по суммарной антиоксидантной активности (АОА) собрана для экстрактов растений. На рисунке 13 показана диаграмма значений АОА для водно-этанольных экстрактов растений флоры Сибири.

Рис. 13. Сравнительная диаграмма суммарной АОА исследуемых растительных объектов: 1-лист брусники, 2-злаки овса посевного, 3-корни полыни обыкновенной, 4-трава репешка обыкновенного, 5-злаки ячменя, 6-трава княжика сибирского, 7-трава чертополоха, 8-хвоя сосны обыкновенной, 9-цветы

тысячелистника обыкновенного, 10-плоды рябины сибирской, 11-сопло ольхи.

С целью разработки эффективных фитопрепаратов для профилактики различных заболеваний на основе экстрактов растений было проведено фракционирование экстрактов, и выявлена наиболее эффективная фракция, более полно извлекающая БАВ с антиоксидантными свойствами (таблица 7 на примере растения Альфредии).

Таблица 7.

Значения антиоксидантной активности фракций экстракта надземной части А1/гесИа сегпиа, полученного обработкой 70% этанолом, по отношению к процессу ЭВ Ог

(р=0.95, п=5)

Фракция Кинетический критерий АОА (К), мкмоль/л-мин

Хлороформная 0.57 ±0.03

Этилацетатная 0.65 ± 0.04

Бутанольная 0.56 ±0.06

Водный остаток 0.16 ±0.05

С использованием тонкослойной хроматографии выявлено следующее распределение биологически активных веществ по фракциям: основное количество флавоноидов сконцентрировалось в этилацетатной фракции, кумарины обнаружены в хлороформной и этилацетатной фракциях, фенолкарбоновые кислоты и тритерпеновые соединения - в хлороформной, этилацетатной и бутанольной фракциях. Следовательно, наиболее полно фенольные соединения, обладающие антиоксидантными свойствами, извлекает этилацетатная фракция, которая также показала наибольшую активность по отношению к процессу ЭВ 02.

В работе рассмотрена возможность применения метода катодной вольтамперометрии на основе процесса ЭВ 02 к исследованию суммарной антиоксидантной активности продукции косметической промышленности. На

примере исследования антиоксидантных свойств сырья и готовой продукции фирмы «Кора» (г. Москва) определены оптимальные композиции экстрактов растений, введение которых позволило повысить общий антиоксидантный уровень продукции, улучшив ее качество (таблица 8).

Таблица. 8.

Значения суммарной антиоксидантной активности косметической продукции,

рассчитанные по емкостному критерию (п=5, р=0.95)

Название I II III

К, мл/г К, мл/г К, мл/г

тоник 89.88±0.05 79.66±0.03 75.44±0.07

крем без экстрактов с экстрактами 15.56±0.08 90.69±0.05 12.11±0.06 92.70±0.08 12.11±0.06 88.43±0.03

гель без экстрактов 2.76 ±0.02 2.06 ±0.01 1.87 ±0.01

с экстрактами 49.80±0.05 50.64±0.01 44.06±0.02

Примечание. I - исходный продукт; II - разбавление в два раза;

III - разбавление в три раза Из продукции пищевой промышленности рассмотрена антиоксидантная активность пищевых консервантов (таблица 9). Все указанные вещества хоть и в малой степени, но проявили антиоксидатную активность. Полученные данные объясняются структурными особенностями веществ, а именно влиянием электронных эффектов на кислотно-основные свойства веществ.

Таблица 9.

Значения АОА некоторых консервантов, рассчитанных по емкостному и

Название К мл/г К мкмоль/л-мин

Сорбиновая кислота 15.32±0.08 0.49±0.09

Бензойная кислота 7.46±0.08 0.13±0.06

4-оксибензойная кислота 34.2Ш.05 0.89±0.08

Метиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты 15.26±0.06 0.51±0.07

Этиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты 44.41±0.10 1.08±0.06

Пропиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты 77.89±0.08 1.31±0.09

Бутиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты 98.13±0.06 1.49±0.07

В работе рассмотрена возможность использования метода катодной вольтамперометрии и процесса ЭВ 02 в анализе суммарной антиоксидантной активности биологических объектов на примере сыворотки крови мышей в норме и патологии. Методами планирования эксперимента определены оптимальные условия пробоподготовки биологических объектов для метода вольтамперометрии. Анализ полученных данных позволил сделать вывод о значительном уменьшении суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови мышей в патологическом состоянии (таблица 10). Однако, для выявления закономерностей влияния патологии (в частности онкологии) на антиоксидантный статус организма требуется более обширный статистический материал.

Таблица 10.

Значения антиоксидантной активности сыворотки крови мышей, рассчитанные по критерию ОЯАС относительно стандартного антиоксиданта (аскорбиновой

Объект Units ORA С

Сыворотка крови с карциномой Эрлиха 7-ые сутки 0.07 ± 0.03

Сыворотка крови здоровой мыши 0.32 ± 0.07

Аскорбиновая кислота 1 ± 0.02

Одним из немаловажных факторов, влияющих на антиоксидантную активность объектов, является рН среды. Особенно это важно для БАД, фито- и фарм- препаратов на основе антиоксидантов, которые употребляются с пищей, т.к. кислотная среда желудка может разрушить полезный антиоксидантный комплекс, принимаемый с пищей. Влияние данного фактора было рассмотрено на примере определения АОА токоферола моногликозида (ТМГ) - водорастворимой формы витамина Е (рис. 14). Показана не только существенная роль рН в определении АОА (таблица 11), но и характер введения препарата в организм животного (мышей). При введении ТМГ с пищей, кислотная среда желудка разрушала препарат, делала его бесполезным для организма. Только при рН = 7.1-7.3 (рН крови) АОА препарата была наивысшей, ТМГ защищал мышей от губительного действия радиации в экспериментальных исследованиях in vivo при введении препарата в кровь животных.

1 Ii/Io

0.8

2

0.6

3

Э.4

j 4

_ Ñ 0.2

О 1.5 3.0 4.5 с, 10моль/л 1-5 3.0 4.5 с,1о!юль/л (1), 3.2 (2), 4.2 (3), 5.5 (4), 6.8 (5), 7.3 (6), 8.5 (7), 9.1 (8).

Рис. 14. Зависимость относительного изменения тока ЭВ 02 от концентрации ТМГ

(водорастворимая форма витамина Е) в растворах с

различными значениями рН: 2.2

Таблица 11

Значения антиоксидантной активности токоферола моноглюкозида, рассчитанные по емкостному критерию, при разных значениях рН _(п=5, р=0.95) _

рН К, мл/г рН К, мл/г

2.2 1.38.±0.07 6.8 103.94 ±0.06

3.2 9.89 ±0.10 7.3 253.61 ±0.04

4.2 13.87±0.11 8.5 99.22 ± 0.03

5.5 28.10±0.11 9.1 65.81 ±0.12

Исследование электрохимических свойств антиоксидантов методом циклической вольтамепрметрии.

Следует отметить, что многие антиоксиданты, обладая хорошими восстановительными способностями, легко окисляются и восстанавливаются на электроде, поэтому для большинства антиоксидантов электрохимические свойства достаточно хорошо изучены. Это касается флавоноидов, большинства витаминов.

Проведение исследований электрохимических свойств антиоксидантов преследовало в данной работе две цели: 1. определение потенциалов окисления -восстановления, поиск оптимальных условий для аналитического определения некоторых вновь синтезированных антиоксидантов, таких как производные антипирина, антипириламида. 2. Выявление взаимосвязи между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами исследуемых соединений фенольной природы.

В последнее время группе антипиринов уделяется большое внимание в связи с их широким использованием в медицине как болеутоляющих и противовоспалительных средств. Особый интерес представляют галогенпроизводные антипиринов (С1, Вг, I антипирины) (рис.15).

■о Рис. 15. Структурная формула антипирина и его галоген-

производных, где X - Н, С1, Вг, I.

Экспериментальное исследование проводилось в условиях дифференциального режима циклической вольтамперометрии. В качестве рабочего и вспомогательного электродов использовались стеклоуглеродные, а электрода сравнения - хлорид-серебряный электрод. На рис. 16, 17 представлены характерные циклические вольтамперограммы для антипирина и градуировочный график зависимости тока электроокисления антипирина (аналитический сигнал) от

его концентрации в растворе в диапазоне 3-10 определения в лекарственной форме.

- 2-10 моль/л, достаточном для его

Рис.16. Циклические вольтамперограммы антипирина на СУЭ в фоновом электролите 0.1 М №СЮ4 в С2Н5ОН: 5.96-10"4 моль/л (2), 8.92-10"4 моль/л (3); 1 - фоновая кривая.

С, моль/л

О 0.0004 0.0003 Ф.0012 0.0016 0.002

Рис. 17. Градуировочная зависимость тока электроокисления от

концентрации антипирина на СУЭ в фоновом электролите 0.1 М КаС104 в С2Н5ОН.

Подобные зависимости были получены для всех исследуемых антипиринов. Следует отметить, что форма циклических вольтамперных кривых и разность потенциалов анодных и катодных пиков, удовлетворяет условию при п=1:

а к у—» з

wF и

(36)

что, говорят об обратимости процесса окисления и восстановления антипирина и его галогенпроизводных.

В таблице 12 приведены значения потенциалов окисления - восстановления галоген производных антипирина, из которых видно, что легче всего окислению подвергается антипирин, затем йод-, бром- и хлор- производные, что согласуется с литературными данными.

Таблица 12

Потенциалы пиков окисления и восстановления

Название Е В Е В

антипирин +1.29+0.01 +1.25+0.01

С1-антипирин +1.39+0.02 +1.34+0.02

Вг-антипирин +1.3910.03 +1.33+0.03

1-антипирин +1.31+0.01 +1.25+0.01

Наличие взаимосвязи между антиоксидантной активностью (АОА) и потенциалами окисления веществ было оценено на примере ряда флавоноидов (катехин, рутин, кверцетин и дигидрокверцетин). Электрохимические свойства флавоноидов были изучены с помощью метода циклической вольтамперометрии. Исследование проводилось в условиях дифференциального режима на стеклоуглеродном электроде (СУЭ). В таблице 13 приведены значения потенциалов окисления и восстановления веществ. На рис. 18. представлена зависимость между потенциалами окисления исследованных флавоноидов и значениями их АОА.

Рис. 18. Зависимость между значениями АОА,

рассчитанными по

кинетическому критерию и потенциалами окисления флавоноидов. г = 0.96. Уравнение регрессионной зависимости:

К= 0.82 - 1.48 -Еок

Рассмотрев несколько групп сходных по структуре соединений, можно с уверенностью говорить, что наблюдается взаимосвязь между потенциалами окисления веществ и их АОА по отношению к процессу ЭВ 02. Чем легче окисляется вещество, т.е. чем меньше его потенциал окисления, тем больше его АОА по отношению к процессу ЭВ 02.

0.36 0.4 €.44 0.48

Таблица 13.

Потенциалы пиков окисления - восстановления исследуемых флавоноидов и значение кинетического критерия их АОА по отношению к процессу ЭВ 02 (п=5,

р=0.95)

Флавоноид Е В ^ОКч и ^ В то и К, мкмоль/(л-мин)

Рутин 0.48 ±0.02 0.31 ±0.03 0.12±0.05

Дигидрокверцетин 0.44 ±0.04 0.24 ±0.02 0.14 ±0.04

Катехин 0.41 ±0.04 0.20 ±0.03 0.23 ±0.02

Кверцетин 0.37± 0.03 0.14 ±0.02 0.27 ±0.03

Сравнительные испытания определения антиоксидантной активности объектов с использованием разных методов

На сегодняшний день спектр методов определения суммарной антиоксидантной активности веществ весьма разнообразен. Однако зачастую сравнивать данные, полученные разными методами, не представляется возможным, поскольку методы основаны на различных принципах измерения, модельных системах, имеют разную размерность показателя АОА. Иногда сравнивать численные значения нецелесообразно, но можно провести корреляцию между результатами, полученными разными методами.

В первом случае в качестве метода сравнения был выбран спектрофотометрический метод с неферментативной системой генерации кислородных радикалов.

Спектрофотометрическая методика (СФМ) определения антиоксидантной активности основывалась на способности антиоксидантов конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анион радикалы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД'Н) и феназинметасульфата (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием формазана (синего цвета). В присутствии антиоксидантов процент восстановления НСТ уменьшается.

Сравнение результатов определения АОА разными методами было проведено на примере определения АОА ряда флавоноидов с использованием критерия 1С50, показывающего концентрацию антиоксиданта при ингибировании модельного сигнала на 50% (таблица 14).

Таблица 14.

Значения критерия ГС50, определенные спектрофотометрическим и

вольтамперометрическим методами, для ряда флавоноидов (р=0.95, п=5)

Название вещества Спектрофотометрический Вольтамперометрический

метод, 1С*50 х 102 (М) метод, 1С50 х 102 (М)

Рутин 0.13 + 0.02 0.82 ±0.04

Дигидрокверцетин 0.53 ±0.04 1.03 ±0.05

Бензойная кислота 3.5510.03 4.19 ±0.05

Аскорбиновая к-та 3.72 ±0.03 4.87±0.03

Кверцетин 5.17± 0.02 5.89±0.03

Катехин 7.92 ±0.04 8.22±0.04

Из данных таблицы 14 видно, что численного совпадения результатов нет, что и было ожидаемо, поскольку модельные реакции методов различны. Однако

можно говорить о корреляции результатов полученных двумя разными методами, что является косвенным доказательством правильности представленных результатов. Оба метода были поставлены в одной лаборатории на одних и тех же образцах.

Подобные исследования были проведены на комплексах меди с органическими лигандами. Кроме неферментативной системы в данном случае использовалась еще и ферментативная ксантин / ксантиноксидазная система генерации супероксид анион радикалов. Результаты сравнительных испытаний представлены в таблице 15.

Как видно из представленных данных, большая сходимость результатов наблюдается между СФМ с ферментативной системой и вольтамперометрическим методом.

Таблица 15.

Значения антиоксидантной активности синтезированных комплексов меди, измеренная тремя различными способами (р=0.95, п=5)

Соединение Спектрофотометрический метод с Вольтамперо метрический метод, 1С50, цм Д,% методы а,с

а Ксантин оксидазная система 1С;о, цМ б РМЗМАБН система, ГС50, цМ

СиЬ,(Ж>з)2 0.79 ± 0.03 0.45 ± 0.05 0.85 ± 0.09 7.31

[СиЬз(Шз)2]-2Н20 2.14 ±0.05 0.79 ± 0.04 1.95 ±0.04 -9.31

Си(Ж>з)2 2.33 ± 0.06 1.10 + 0.02 2.35 + 0.02 0.85

Для достоверности результатов в работе было проведено сравнение трех методов: флуориметрического, амперометрического с использованием биосенсора на основе супероксидисмутазы (СОД) и вышеописанного вольтамперометрического. определения АОА производных ацетилсалициловой кислоты (табл. 16).

Таблица 16.

Значения антиоксидантной активности производных ацетилсалициловой кислоты, измеренные 3-мя методами.

№ обра зца а Ь с Д,% (с-а) с Д,% (с-Ь) с

Метод биосенсоров (ОЯАС ипкэ) Метод вольтамперо- метрии (ОЯАС ип^) Флуориметри-ческий метод (ОЯАС ипйв)

1 93.7 96.3 96.3 +2.6 0.0

2 92.2 95.7 94.1 +2.0 -1.7

3 86.3 78.7 82.1 -5.1 +4.1

4 83.3 76.8 80.2 -3.8 +4.2

5 81.8 74.2 75.9 -7.7 +2.2

6 66.9 72.5 70.0 +4.4 -3.5

7 62.4 71.5 69.3 +9.9 -3.1

Все методы были воспроизведены и выполнены в одной лаборатории (Rome University Italia). За основной метод был взят флуориметрический метод, по отношению к нему считались погрешности методов. Показатель АОА определялся с помощью критерия, выраженного в единицах ORAC, по формуле (32)

По результатам, представленным в таблице 16 видно, что полученные данные хорошо коррелируют между собой. А погрешность метода вольтамперометрии относительно метода флуориметрии имеет как положительные, так и отрицательные значения, в результате чего можно говорить, что имеет место случайная составляющая погрешности в пределах 10 %.

Методика определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

На данный момент существует ряд методик определения как антиоксидантной активности, так и суммарного количества антиоксидантов в различных объектах. Однако достаточно мало методик, прошедших метрологическую аттестацию. Этот факт связан с множеством проблем:

• нет стандартных образцов антиоксидантов;

• методы основаны на различных принципах и модельных реакциях, поэтому результаты измерений, полученные разными методами, имеют разную размерность и практически несопоставимы друг с другом;

• нет единой размерности и нормированного показателя АОА.

Для выхода из сложившейся ситуации и успешной аттестации методики было предложено оценивать показатель антиоксидантной активности в объектах искусственного и природного происхождения в пересчете на концентрацию аскорбиновой кислоты по градуировочному графику относительного изменения тока электровосстановления кислорода от ее концентрации в растворе (рис. 19)

Рис. 19. Зависимость относительного изменения тока ЭВ 02 от концентрации аскорбиновой кислоты на РПЭ в фоновом электролите 0.025 М фосфатном буфере (рН = 6.86)

Далее из данной зависимости по величине относительного изменения тока ЭВ 02 в присутствии исследуемого объекта определяется показатель антиоксидантной активности исследуемых объектов. На основании полученных данных выведено уравнение регрессии зависимости относительного изменения тока ЭВ 02 от концентрации аскорбиновой кислоты в растворе фонового электролита в диапазоне концентраций С= 0-г 1 мг/мл:

1оЛ = 0.910 + 0.427хС (36)

Проведена проверка гипотезы линейности данного градуировочного графика. Оценена адекватность математической модели по критерию Фишера. В представленном диапазоне концентраций модель адекватна.

Для подготовки методики к метрологической аттестации были определены метрологические характеристики методики, представленные в таблице 17. По полученным метрологическим показателям для рассматриваемых поддиапазонов концентрации аскорбиновой кислоты принято решение приписать наибольшую погрешность (23%) для всей области концентраций линейного участка градуировочной характеристики.

Таблица 17.

Метрологические характеристики методики определения показателя антиоксидантной активности по отношению к процессу ЭВ 02 в пересчете на

концентрацию аскорбиновой кислоты при р = 0.95, п=3,1=10

Измеряемая концентрация, С, (мг/мл) 0.100 0.500 0.999

Показатель повторяемости 5™, (мг/мл) 0.0045 0.0476 0.0719

Показатель внутрилабораторной прецизионности, 8ято, мг/мл 0.0119 0.0549 0.0852

Показатель точности, Дш 0.0232 0.1078 0.1669

8,% 22.9% 21.5% 16.7%

Вольтамперометрический анализатор «Антиоксидант»

На основании предложенной методики был разработан вольтамперометрический анализатор «Антиоксидант» для определения показателя АОА в различных объектах. Внешний вид анализатора представлен на рис. 20 Анализатор представляет собой настольный лабораторный прибор. 2

Рис.1

Рис. 20. 1. Корпус, 2. Держатель электродов, 3. Разъемы для фиксации электродов, 4. Стаканчик с анализируемым раствором, 5. Магнитная мешалка, 6. Выключатель питания, 7. Держатель предохранителя, 8. Ввод сетевого кабеля, 9. Ввод кабеля связи с ПК.

Прибор прошел государственные испытания с целью утверждения типа СИ, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому

регулированию и метрологии РФ (Сертификат 1Ш.С.31.113.Л № 28715) и внесен в единый ГОСреестр СИ под номером 35466-07. В настоящее время анализатор прошел международную сертификацию в Чехии (г. Прага) и допущен к применению в аналитических и научно-исследовательских лабораториях Европы и Америки.

Анализатор «АОА» и вольтамперометрическая методика определения суммарной антиоксидантной активности объектов нашли широкое применение в аналитических и научно-исследовательских лабораториях России и за рубежом.

Основные результаты и выводы

1. Предложен и обоснован новый подход на основе метода вольтамперометрии и модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для оценки суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. На основе исследования влияния различных факторов: материала электрода, рН среды, природы растворителя, концентрации молекулярного кислорода, на процесс электровосстановления кислорода показана возможность использования относительного изменения тока электровостановления кислорода в присутствии антиоксидангов на ртутно -пленочном электроде как средство измерения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

2. Проведены и обобщены исследования по влиянию поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам в различных объектах, на процесс электровосстановления кислорода. Показан неоднозначный характер данного влияния, зависящий от материала электрода, рН среды, типа ПАВ. Показано, что только на платиновых металлах в кислых средах наблюдается пропорциональное уменьшение тока ЭВ 02 в присутствии ПАВ. На ртутно - пленочном электроде подобной закономерности не обнаружено, что дает возможность использовать данный процесс для определения антиоксидантной активности в присутствии поверхностно активных веществ.

3. Изучены физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Предложены преимущественные механизмы взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами. Установлено, что для каталазы, как фермента антиоксидантной природы, характерен механизм с последующей химической реакцией диспропорционирования и частичной регенерацией деполяризатора. В присутствии антиоксидантов фенольной природы наблюдается преимущественное протекание электродного процесса восстановления кислорода с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами. Для N. 8 и 8е содержащих антиоксидантов характерен механизм с преимущественным протеканием предшествующей химической реакцией взаимодействия с молекулярным кислородом.

4. Установлены два новых количественных критерия для определения антиоксидантной активности объектов: емкостный (мг/л)"1 критерий, отражающий степень изменения тока электровосстановления кислорода в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л мин), показывающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени. Данные критерии

освобождали от необходимости использовать стандартный антиоксидант и использовались в работе наряду с общеизвестными критериями ОЯАС, отражающему способность поглощать кислородные радикалы, отнесенному к стандартному антиоксиданту (безразмерная величина), критерием 1С50, моль/л, показывающему концентрацию антиоксиданта при ингибировании модельного сигнала на 50%, критерием суммарной антиоксидантной активности, моль/л, рассчитанному по градуировочному графику в пересчете на концентрацию стандартного антиоксиданта.

5. Проведена оценка антиоксидантной активности по отношению к процессу электровосстановления кислорода индивидуальных антиоксидантов различной природы: каталазы, гуминовых кислот, фталоцианинов металлов, ряда флавоноидов, производных кумарина, витаминов Е, А, С, группы Вб, аскорбатов металлов, коэнзима Ою, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), селенсодержащих БАД, производных антипирина, антипириламида, бенздиазепина, имеющих фармацевтическое значение. Показано, что большую активность из этого ряда проявляют кверцетин, рутин, витамины С, А, Е, аскорбаты кальция и магния. Показано, что антиоксидантная активность объектов зависит от концентрации антиоксидантов, времени их взаимодействия с кислородом и его активными радикалами, рН среды, совместимости компонентов в смесях антиоксидантов и их соотношении.

6. Проведена оценка суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного (продукция пищевой, косметической, фармацевтической промышленности) и природного (экстракты растений) происхождения. Выявлено значительное влияние ряда факторов (рН среды, природы растворителя при выделении компонентов растительного сырья, совместимости компонентов в смесях) на антиоксидантные свойства объектов. На примере токоферола моногликозида показано, что данный антиоксидант наиболее активен в нейтральной области рН (7.1 - 7.3). При фракционировании экстрактов растений выявлена наиболее активная этилацетатная фракция, которая рекомендована для наиболее полного извлечения биологически - активных веществ из растительного сырья. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов показано, что при увеличении числа компонентов (больше 2) их суммарная антиоксидантная активность падает, при этом аддитивности сигнала не наблюдается. На основе данных исследований предложена наиболее эффективная композиция из исследованных антиоксидантов (аскорбиновая кислота, дигидрокверцетин (1:1)). На примере косметической продукции показано, что введение смеси экстрактов растений (солодка, люцерна, хмель, клевер) увеличивает суммарную антиоксидантную активность продукции.

7. Получены математические модели первого и второго порядков для определения активности антиоксидантов на примере флавоноидов в зависимости от концентрации и времени их взаимодействия с кислородом и его активными формами. Полученные уравнения позволяют оценивать эффективные концентрации и время активного действия антиоксидантов по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

8. Проведены исследования электрохимических свойств ряда антиоксидантов. Особое внимание уделено впервые синтезированным соединениям с антиоксидантными свойствами, таким, как производные антипирина, антипириламида, кумарина. Установлены механизмы протекания электродных

процессов окисления - восстановления исследованных веществ, показан обратимый характер протекания процессов. Методом циклической вольтамперометрии найдены потенциалы окисления - восстановления данных веществ, определены оптимальные условия получения аналитического сигнала, построены градуировочные зависимости, определен диапазон определяемых концентраций: 3-10д - 2-Ю"3 моль/л, достаточный для их определения в лекарственной форме

9. Установлена взаимосвязь между значениями потенциалов окисления -восстановления веществ и их антиоксидантной активностью по отношению к процессу электровосстановления кислорода на примере ряда флавоноидов и витаминов.

10. Разработана методика выполнения измерений (МВИ) показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения на основе полученных закономерностей В соответствии с регламентированной процедурой аттестации МВИ рассчитаны основные метрологические характеристики анализа (показатель повторяемости, точности, внутрилабораторной прецезионности. Проведены сравнительные испытания методики с другими, уже зарекомендовавшими себя методами определения антиоксидантной активности, в частности, методом спектрофотометрии с двумя разными системами генерации кислородных радикалов: ферментативной на основе ксантин/ксантиноксидазной системы и неферментативной РМЗ/ИАОН системой, флуориметрическим, амперометрическим на основе биосенсора с СОД, кинетическим методами. Полученные данные показали хорошую сходимость результатов, расхождение между которыми для большинства методов не превышает 10%.

11. Разработан новый вольтамперометрический анализатор «Антиоксидант» для определения показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Прибор прошел государственные испытания с целью утверждения типа СИ, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат 1Ш.С.31.113.А № 28715) и внесен в единый ГОСреестр СИ под номером 3546607. В настоящее время анализатор прошел международную сертификацию в Чехии (г. Прага) и допущен к применению в аналитических и научно-исследовательских лабораториях Европы и Америки.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Ю. А. Карбаинов, Е. И. Короткова. Влияние различных факторов на ток электровосстановления кислорода в вольтамперометрии на электродах ограниченного объема // Журн. Аналит. химии, 1991, т.46, № 2, С. 328-333.

2. Ю. А. Карбаинов, Е. И. Короткова. Влияние состава водно-спиртовых смесей и адсорбции ПАВ на величину ост. тока в ИВ. // Изв. ВУЗов. Химия и хим. технология, 1990, № 3, С.139-143.

3. Е. И. Короткова. Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов // Журн. физич. химии, 2000, Т. 74, № 9. С. 1704— 1706.

4. Е. И. Короткова. Влияние антиоксидантов на процесс электровосстановления кислорода. // Теория электроаналитической химии и метод ИВ. Материалы симпозиума , Томск, 28 сентября - октября 2000г. Томск: Изд-во ТПУ, 200, С. 242—244.

5. Е. I. Korotkova, Yu. A. Karbainov, А. V. Shevchuk. Study of antioxidant properties by voltammetry. Hi. Electroanal. Chem. 2002. V. 508. № 1. 56-60.

6. E. И. Короткова, Ю. А. Карбаинов, О. А. Аврамчик. Вольтамперометрическое определение антиоксидантной активности растительного сырья и некоторых продуктов питания // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2002.Т.45 № 3, с. 110-112.

7. Н. В. Юдина, А. В. Зверева, Е. И. Короткова, О. А. Аврамчик. Гуминовые кислоты в процессе электровосстановления кислорода. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2002. Т.45, № 3, с. 106-108.

8. В. Д. Филимонов, Ю. А. Карбаинов, Е.И. Короткова, Н.В. Башкатова, В. В. Воловоденко. Исследование связи между электрохимическими параметрами ряда производных карбазола и антипирина и их квантово-химическими характеристиками. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2002. № 3, с. 75-79.

9. E.I. Korotkova, Y.A. Karbainov, О.А. Avramchik. Investigation of antioxidant and catalytic properties of some biologically active substances by voltammetry. // Anal and Bioanal Chem, 2003, v. 375, N 1-3,465-468.

10. О.А. Аврамчик, Е.И. Короткова, Н.И. Белоусова, Е.В. Белоусов, А.Э. Куценко, Г.Ц. Дамбаев. Применение оксигенированных инфузионных растворов в лечении больных бронхиальной астмы. // Бюллетень сибирской медицины, 2003, т.2, №1, с. 78-83.

11. Е.И. Короткова, Н.В. Башкатова, Ю.А. Карбаинов. Физико-химические закономерности электродных процессов в инверсионной вольтамперометрии органических соединений с предшествующей реакцией протонизации. // Изв. Вузов. Серия «Химия и химич. Технология», 2003, т. 46, №3, с. 115-118.

12. E.I. Korotkova, О.А. Avramchik, Y.A. Karbainov, К.М. Kostyrev. Investigation of antioxidant properties of some foodstuff by voltammetry // Book Proceed Int. Conf. Euro Food Chem XII. Brugge, Belgium, 24-26 September 2003., v. 1, p. 199-202

13. Е.И. Короткова, О.А. Аврамчик, M.C. Юсубов, М.В. Белоусов, Т.И. Андреева. Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья методом катодной вольтамперометрии // Химико - фармацевтический журнал, т. 37, №9,2003, с. 55-57.

14. E.I. Korotkova, Karbainov, Y.A., Avramchik, O.A., Bakibaev, A.A. New electrochemical sensor for antioxidant activity determination. // In book "Instrumental Methods of Analysis. Modern Trends and Applications. Conference Proceedings of 3rd International conference". ZITI, Greece, 2003, P.707-710.

15. H.B. Юдина, A.B. Савельев, A.A. Иванов, Е.И. Короткова, О.И. Ломовский. Каталитические свойства механоактивированных гуминовых препаратов в процессе электровосстановления кислорода.// Журнал прикладной химии т. 77, №1,2004.С. 48-53

16. Е.И. Короткова, Е.А. Мамаева, Н.В. Башкатова, А.А. Бакибаев. Электрохимическое определение антиоксидантных свойств 1,4 -бенздиазепинов.// Химико-фармацевтический журнал, №3,2004, с. 52-54

17. Korotkova E.I., О.А. Avramchik, Karbainov Y.A., KagiyaT. V., Tcherdyntseva N.V. Study of antioxidant properties of a water-soluble vitamin E derivative - Tocopherol monoglucoside (TMG) by differential pulse voltammetry // Talanta, V.63 (3), 2004, pp. 729-734.

18. Е.И. Короткова, О.А. Аврамчик, И.Г. Каморзина, Ю.А.Карбаинов, А.Н.Лукина. Новый вольтамперометрический метод определения антиоксидантной активности косметической продукции // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. №8,2004, с13-17

19. Т.И. Андреева, Е.И. Комарова, М.С. Юсубов, Е.И. Короткова. Антиоксидантная активность коры калины обыкновенной. // Химико -фармацевтический журнал, 2004, т.38, №10. с. 26-29.

20. Ю.А. Карбаинов, Е.И. Короткова, Н.В. Башкатова, Г.Б. Слепченко. Необратимые электродные процессы в катодной вольтамперометрии органических соединений с предшествующей химической реакцией протонизации. // Изв. ВУЗов. Серия Химия и химическая технология, 2004, т.47, вып. 9, стр. 116-119

21. О.А. Avramchik, E.I. Korotkova, E.V. Plotnikov, A.N. Lukina, Y.A. Karbainov. Antioxidant and electrochemical properties of calcium and lithium ascorbates.// J. Pharmaceutical and biomedical analysis, v.37,2005, p. 1149-1154.

22. N.V. Bashkatova, E.I. Korotkova, Yu.A. Karbainov, A.Yu. Yagovkin, A.A. Bakibaev. Electrochemical, quantum- chemical and antioxidant properties of antipyrine and its derivatives. // J. Pharmaceutical and biomedical analysis, v.37, 2005, p. 1143-1147.

23. Е.И. Короткова, В.И. Чернов, A.H. Лукина, Л.А. Гончаров. Прибор и метод определения суммарной антиоксидантной активности пищевых добавок.// Материалы научно - практ. конф, «Технологии и продукты здорового питания», г. Москва. 6-8 июня 2005г. с. 102-109.

24. Е.В. Дорожко, Е.И. Короткова, Ю.А. Карбаинов. Исследование антиоксидантных свойств глутатиона методом вольтамперометрии.// Материалы Международ, симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», г. Тюмень. 12-16 сентября 2005г. с.53-55.

25. E.I. Korotkova, О.А. Avramchik, Т.М. Angelov, Y.A. Karbainov. Investigation of antioxidant activity and lipophilicity parameters of some preservatives.// Electrochim. Acta. v.51. N 2.2005.324-332

26. Е.И. Короткова, A.H. Лукина, Л.А. Гончаров, B.M. Мисин. Анализатор для определения суммарной антиоксидантной активности объектов. // 8-ой Международный семинар-презентация инновационных научно-технических

проектов «Биотехнология-2005». 18-19 ноября 2005г. Пущино. - Материалы научно - практич. конференции, Пущино, 2005, с. 163-168.

27. Schepetkin I., Potapov A., Khlebnikov A., Korotkova Е„ Lukina А., Malovichko G., Kirpotina L., Quinn MT. Decomposition of reactive oxygen species by copper(II) bis(l-pyrazolyl)methane complexes. // J. Biol. Inorg. Chem. 2006; v.ll, N 4, p. 499-513.

28. A.H. Лукина, Е.И. Короткова, Ю.А. Карбаинов. Исследование антиоксидантных свойств некоторых аскорбатов и смесей на их основе.// Материалы Междун. Научн. конф. «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск 11-16 сентября 2006г.- Томск, т.2, с.91- 93.

29. Ю.А. Карбаинов, Е.И. Короткова. Вопросы теории вольтамперометрии антиоксидантов. // Материалы Междун. Научн. конф. «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск 11-16 сентября 2006г.- Томск, т.2, с.248-249.

30. A.S. Boev, E.I. Korotkova, А.А. Bakibaev. Voltammetric method of B6 vitamin determination. // Inter, conf. "Chemistry, Chemical engineering and Biotechnology", Tomsk, 11-16 September 2006.- Book of abstracts v.2. p. 165-166.

31. И.В. Шилова, E.A. Краснов, Е.И. Короткова, М.Г. Нагаев, A.H. Лукина. Антиоксидантная активность экстрактов наземной части лабазника вязолистного. // Химико - фармацевтический журнал, т. 40, № 12. 2006г. с. 2224.

32. Л.И. Драчева, Е.И. Короткова, А.Н. Лукина, Антиоксидантные свойства пробиотиков // Ж. Молочной промышленности. № 12 2006г. с. 62-63

33. Л.В. Драчева, Е.И. Короткова, А.Н. Лукина. Исследование антиоксидантной активности биокомпозиций на основе пробиотиков // Пищевая промышленность, № 3, 2007г. с.14 - 15.

34. А.А. Ivanov, N.V. Yudina, E.I. Korotkova, O.I. Lomovsky. Antioxidants in the Water-Soluble Carbohydrate Fractions of the Moss Sphagnum Fuscum and Sphagnum Peat. // Solid Fuel Chemistry, v.42, N 2,2008, p.68-73.

35. И.В. Шилова, H.B. Кувачева, Е.И. Короткова, E.A. Краснов, O.B. Никитина, А.Н. Лукина, Н.А. Некратова, А.И. Пяк. Антиоксидантные свойства биологически активных веществ ALFREDIA CERNUA и A. NIVEA (ASTERACEAE). // Растительные ресурсы, вып. 1, 2008, с. 114-121.

36. Л.В. Драчева, Е.И. Короткова, Е.В. Дорожко. Применение вольтамперометрического метода при изучении биоантиоксидантов. // Пищевая промышленность. № 4, 2008, с. 28-29.

37. И.В. Шилова, А.Н. Вторушина, Е.И. Короткова. Черника обыкновенная - источник биологически активных веществ с антиокисдантными свойствами. // Сб. статей Всероссийской научно-практической конференции «Здоровое питание - основа жизнедеятельности человека», Красноярск, 2008, с.250-254.

38. А.А. Бакибаев, Е.И. Короткова, О.И. Липских. Метод вольтамперометрии в исследовании каталитических свойств каталазы и супероксиддисмутазы. // Изв. ВУЗов. Серия Химия и химии, технология, т.51, №5,2008, С. 48 -50.

39. А.А. Бакибаев, А.С. Боев, Е.И. Короткова. Вольтамперометрическое определение пиридоксина (витамина В6) на модифицированном платиновом

электроде. // Изв. ВУЗов. Серия Химия и химич. технология, т.51, №5, 2008, С. 21 -24.

40. Е. И. Короткова. Калькулятор для антиоксидантов. // Инновации. Регионы. Бизнес. Аналитика, №2,2008, с. 23-27

41. И. Короткова, В.И. Чернов, A.A. Бакибаев, А.Н. Мержа. Анализатор для определения суммарной антиоксидантной активности объектов. Патент РФ № 2005138705/22(043204) от 12.12.2005.

42. Короткова Е.И., Карбаинов Ю.А.. Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов. // Патент РФ № 2224997 от 6.06.2002г.

43. Е.И. Короткова, Ю.А. Карбаинов, Т.И. Хаханина. Вольтамперометрический способ определения ПАВ в жидких средах. Патент РФ № 2001395 (РФ). 1993г.

44. Боев A.C., Короткова Е.И., Бакибаев A.A., Медведев Д.М. Способ определения витамина В6 в биологически активных добавках. Патент на изобретение РФ № 2006104582/28(004965) от 14.02.2006г.

Подписано к печати 31.08.2009. Формат 60x84/16. Бумага -Классика». Печать RISO. Усл. печ. л. 2,56. Уч.-изд. л. 2,31. _Заказ 965. Тираж 100 экз._

1 Томский политехнический университет

Система менеджмента качества 1509001 I Томского политехнического университета сертифицирована

NATIONAL QUALITY ASSURANCE по стандарту ISO 9001:2000 изшишво^го. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30.

Условные обозначения и сокращения

Введение

ГЛАВА I. Методологические и методические аспекты определения антиоксидантов в объектах

1.1. Методологическое значение антиоксидантов

1.1.1. Терминология антиоксидантов и антиоксидантной активности

1.1.2. Классификация антиоксидантов

1.1.3. Механизмы действия антиоксидантов

1.2. Методы и модельные системы определения антиоксидантной активности объектов

1.2.1. Хемилюминесцентные методы

1.2.2. Кинетические методы

1.2.3. Фотоколориметрические, спектрофотометрические, ЭПР методы

1.2.4. Электрохимические методы

1.2.4.1. Кулонометрическое определение интегральной антиоксидантной емкости объектов

1.2.4.2. Потенциометрический метод определения суммарной антиоксидантной активности объектов

1.2.4.3. Амперометрические и вольтамперометрические методы

1.2.5. Методы, основанные на взаимодействии антиоксидантов с кислородом и его активными радикалами

1.3. Восстановление кислорода в биологических средах

ГЛАВА И. Обоснование выбора электровосстановления кислорода как модельного процесса для определения антиоксидантной активности объектов 57 2.1. Процесс электровосстановления кислорода (ЭВ 02) в водных и неводных средах

2.1.1. Влияние материала электрода

2.1.2. Влияние природы растворителя

2.1.3. Влияние рН раствора

2.1.4. Влияние состава электролита

2.1.5. Обоснование использования электровосстановления кислорода как модельного процесса для оценки антиоксидантной активности объектов.

2.2. Закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии поверхностно активных веществ

2.2.1. Влияние ПАВ на процесс ЭВ 02 на ртутно-пленочном, стеклоуглеродном и платиновом электродах при различных рН.

2.2.2. Закономерности процесса ЭВ Ог на платиновом электроде в присутствии ПАВ

ГЛАВА III. Физико - химические закономерности процесса ЭВ От в присутствии антиоксидантов

3.1. Аппаратурное и методическое оформление

3.2. Влияние природы антиоксидантов на процесс ЭВ

3.2.1. Физико - химические закономерности влияния каталазы на процесс ЭВ Ог

3.2.2. Закономерности влияния антиоксидантов фенольной природы на процесс ЭВ

3.2.3. Физико-химические закономерности процесса ЭВ Ог в присутствии N, S, Se содержащих антиоксидантов

3.2.4. Закономерности процесса ЭВ 02 в присутствии антиоксидантов, взаимодействующих с кислородом и его активными радикалами по параллельной схеме

ГЛАВА IV Определение суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения

4.1. Критерии оценки антиоксидантной активности объектов

4.2. Процедура проведения эксперимента

4.3. Методы планирования эксперимента в оптимизации определения антиоксидантной активности объектов

4.4. Исследование антиоксиданной активности металлокомплексов, катализирующих процесс ЭВ СЬ

4.4.1. Антиоксидантная активность каталазы

4.4.2. Антиоксидантные свойства гуминовых кислот, полученных из торфов

4.5. Вольтамперометрическое определение антиоксиданной активности соединений фенольной природы

4.5.1. Антиоксидантные свойства некоторых флавоноидов и оптимизация параметров их активности

4.5.2. Антиоксидантные свойства производных кумарина

4.5.3. Антиоксидантные свойства некоторых производных фенола в апротонных средах

4.5.4. Антиоксидантные свойства коэнзима Qjo

4.5.5. Антиоксидантные свойства некоторых витаминов

4.5.5.1. Антиоксидантная и биологическая активность жирорастворимых витаминов Е, А

4.5.5.2. Оценка антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты и некоторых ее солей

4.5.5.3. Антиоксидантные свойства витаминов группы Вб

4.6. Исследование антиоксидантных свойств N, Se содержащих соединений

4.6.1. Антиоксидантная активность Se содержащих БАД

4.6.2. Антиоксидантные свойства производных антипирина, антипириламида и бенздиазепина

4.7. Вольтамперометрический метод определения суммарной антиоксидантной актвности объектов , искусственного и природного происхождения

4.7.1. Антиоксидантные свойства лекарственного растительного сырья

4.7.1.1. Водные, водно - этанольные экстракты ряда растений флоры Сибири

4.7.1.2. Антиоксидантные свойства лабазника вязолистного

4.7.1.3. Антиоксидантные свойства экстрактов растения Альфредии

4.7.1.4. Антиоксидантные свойства экстрактов побегов черники обыкновенной

4.7.2. Исследование антиоксидантных свойств препаратов фармацевтического назначения

4.7.3. Оценка антиоксидантной активности продукции косметической промышленности

4.7.4. Исследование антиоксидантной активности продукции пищевой промышленности

4.7.4.1. Антиоксидантные свойства пищевых консервантов

4.7.4.2. Оптимальная антиоксидантная композиция для улучшения качества питьевой минеральной воды

4.7.5. Вольтамперометрическое определение антиоксидантной активности биологических объектов

ГЛАВА V. Исследование электрохимических свойств антиоксидантов методом циклической вольтамперометрии

5.1. Антиоксиданты фармацевтического назначения

5.1.1. Антипирин и его галоген — производные

5.1.2. Производные антипириламида

5.2. Некоторые антиоксиданты фенольной природы

5.2.1. Электрохимические свойства некоторых флавоноидов

5.2.2. Некоторые производные кумарина

5.2.3. Коэнзим Qio

5.3. Взаимосвязь между антиоксидантными свойствами соединений фенольной природы и их электрохимическими параметрами

ГЛАВА VI. Методика определения показателя суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения

6.1. Сравнительные испытания методик определения антиоксидантной активности объектов с использованием разных методов

6.1.1. Спектрофотометрическое и вольтамперометрическое определение

6.1.2. Определение антиоксидантной активности производных ацетилсалициловой кислоты тремя различными методами

6.1.3. Определение суммарной антиоксидантной активности БАВ кинетическим и вольтамперометрическим методами

6.2. Подготовка вольтамперометрической методики к аттестации

6.3. Утверждение типа вольтамперометрического анализатора по определению показателя антиоксидантной активности объектов

Обсуждение результатов

Выводы

Актуальность темы. Антиоксиданты, как вещества, предотвращающие зарождение и развитие свободно — радикальных процессов окисления в объектах органического и неорганического происхождения, нашли широкое применение в химической, пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, биологии и медицине в последнее время. Особенно широко антиоксиданты применяются в составе биологически - активных добавок, косметических средств, фармацевтической продукции. Лавинообразный рост подобной продукции на рынке предъявляет все более серьезные требования к сертификации товара. В настоящее время в нормативных документах РФ не существует единого показателя антиоксидантной активности подобных препаратов. Для проверки их качества используются длительные, трудоемкие, не всегда сопоставимые и неточные исследования, опирающиеся иногда на неаттестованные методики. Необходимость введения новых методик и приборов, обеспечивающих надежные результаты по определению суммарной антиоксидантной активности подобных препаратов, является актуальной задачей, от решения которой зависит качество, эффективность и безопасность предлагаемых на рынке продуктов.

В последнее время в литературе предлагается большое число методов по определению антиоксидантов и их активности. Однако, эти данные имеют разрозненный характер, используют разные модельные системы, представления о характере их действия на радикалы различной природы. Полученные результаты имеют разные размерности, что не позволяет сопоставить их друг с другом. Достаточно мало аттестованных методик и сертифицированных приборов, способных быстро и на качественном уровне определить суммарную антиоксидантную активность продукции. Недостаточно сведений о влиянии ряда факторов на антиоксидантные свойства продукции, например, рН среды, природы самих антиоксидантов, растворителя и др. Недостаточно изученными факторами остаются эффективная концентрация антиоксидантов, время их активного действия и совместимость компонентов в смесях антиоксидантов. Поэтому обобщение информации и поиск новых подходов к определению антиоксидантов и их активности на данном этапе является весьма актуальной задачей.

Одними из перспективных и доступных методов определения активности антиоксидантов являются электрохимические методы, обладая низкой себестоимостью, высокой чувствительностью, возможностью анализировать как водные, так и неводные среды. В России большой вклад в развитие электрохимии антиоксидантов внесли такие ученые, как Г.К. Будников (Казанский государственный университет), Х.З. Брайнина (Уральский государственный экономический университет), З.А. Темердашев (Кубанский государственный университет) и другие.

Достаточно удобным для определения антиоксидантов и их активности является вольтамперометрический метод, так как он, как и антиоксиданты, весьма чувствителен к наличию в среде кислорода и его активных радикалов. Это позволило предложить новый подход к определению суммарной антиоксидантной активности объектов, используя в качестве модельной системы процесс электровосстановления кислорода в отсутствии и при наличии антиоксидантов различного происхождения. Поскольку с участием кислорода протекает большинство окислительных процессов в объектах органического и неорганического происхождения, такой подход должен быть успешным и в некоторой степени моделировать характер взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами в организме человека и животных.

Цель работы: Развитие теории и практики вольтамперометрического метода определения активности антиоксидантов на основе модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант. Создание на этой основе методического обеспечения для определения суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи.

1. Обосновать выбор модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Рассмотреть влияние различных факторов: рН среды, природы растворителя, концентрации молекулярного кислорода, на процесс электровосстановления кислорода. Показать возможность использования относительного изменения тока электровостановления кислорода в присутствии антиоксидангов на ртутно — пленочном электроде как средство измерения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

2. Исследовать влияние поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам в различных объектах, на - процесс электровосстановления кислорода. Рассмотреть закономерности влияния различных факторов (рН среды, материала электрода) на процесс электровосстановления кислорода в присутствии разных типов поверхностно активных веществ.

3. Изучить физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Предложить преимущественные механизмы взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами.

4. Осуществить и обосновать выбор количественных критериев оценки антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения на основании относительного изменения тока электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов.

5. Провести оценку антиоксидантной активности индивидуальных антиоксидантов, их смесей, объектов искусственного и природного происхождения. Выявить наиболее активные соединения. Рассмотреть влияние концентрации, времени взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными радикалами, рН среды, совместимости компонентов в смесях на антиоксидантную активность объектов.

6. Исследовать электрохимические свойства ряда антиоксидантов. Особое внимание уделить впервые синтезированным соединениям с антиоксидантными свойствами, таким, как производные антипирина, антипириламида, кумарина, имеющими фармацевтическое значение. Определить оптимальные условия получения аналитического сигнала с целью дальнейшей разработки методик их количественного определения. Установить взаимосвязь между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами (потенциалами • окисления) антиоксидантов на примере ряда флавоноидов и витаминов.

7. Разработать методику определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения на основе полученных закономерностей. Рассчитать основные метрологические характеристики методики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ. Провести сравнительные испытания методики с другими известными методами определения активности антиоксидантов. Разработать вольтам перометрический анализатор для определения показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Провести сертификацию нового анализатора.

Научная новизна

1. Впервые предложен новый подход на основе метода вольтамперометрии и модельной системы: кислород, активные формы кислорода — антиоксидант для оценки суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного (продукция пищевой, косметической, фармацевтической промышленности) и природного (экстракты растений, вытяжки торфа, биологические объекты) происхождения.

2. Впервые проведены и обобщены исследования по влиянию поверхностно активных веществ, сопутствующие антиоксидантам, на процесс электровосстановления кислорода. Показан неоднозначный характер данного влияния, зависящий от материала электрода, рН среды, типа поверхностно активных веществ. На основе изученных закономерностей показано, что только на платиновых металлах в кислых средах наблюдается пропорциональное уменьшение тока кислорода в присутствии поверхностно активных веществ. На этой основе разработан новый способ определения суммарного содержания поверхностно -активных веществ в водных средах. На ртутно - пленочном электроде подобной закономерности не обнаружено, что дает возможность использовать данный процесс для определения антиоксидантной активности объектов в присутствии поверхностно активных веществ.

3. Впервые установлены физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Получены новые уравнения для тока кислорода, осложненного наличием предшествующей и последующей химических реакций взаимодействия с антиоксидантами в условиях линейной полубесконечной диффузии на твердых электродах. На основе этого предложены и обоснованы преимущественные механизмы взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами. Установлено, что для каталазы, как фермента антиоксидантной природы, характерен механизм с последующей химической реакцией диспропорционирования и частичной регенерацией деполяризатора. В присутствии антиоксидантов фенольной природы наблюдается преимущественное протекание электродного процесса восстановления кислорода с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами. Для N, S и Se содержащих антиоксидантов характерен механизм с преимущественным протеканием предшествующей химической реакцией взаимодействия с молекулярным кислородом.

4. Впервые предложены и теоретически обоснованы новые количественные критерии определения антиоксидантной активности объектов по отношению к процессу электровосстановления кислорода: емкостный (мг/л)"1 критерий, отражающий степень изменения модельного сигнала в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л мин), отражающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени.

5. С использованием факторного эксперимента, метода крутого восхождения и центрального ортогонального композиционного планирования, впервые получены математические модели первого и второго порядков для определения активности антиоксидантов в зависимости от концентрации и времени их взаимодействия с кислородом и его активными формами. Полученные уравнения позволяют определять эффективные концентрации и время активного действия антиоксидантов по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

6. С использованием кинетического и емкостного критериев впервые выявлено значительное влияние ряда факторов, таких, как рН среды, природы растворителя при выделении компонентов растительного сырья, совместимости компонентов в смесях, на антиоксидантные свойства объектов. На примере токоферола моногликозида показано, что данный антиоксидант наиболее активен в нейтральной области рН (7,1 — 7.3). При фракционировании экстрактов растений выявлена наиболее активная этилацетатная фракция, которая рекомендована для наиболее полного извлечения антиоксидантов из растительного сырья. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов показано, что при увеличении числа компонентов (больше 2) их суммарная антиоксидантная активность падает, при этом аддитивности сигнала не наблюдается. На основе данных исследований предложена наиболее эффективная композиция из числа исследованных антиоксидантов на основе аскорбиновой кислоты и дигидрокверцетина в соотношении 1:1.

7. Методом циклической вольтамперометрии впервые установлены механизмы протекания электродных процессов окисления - восстановления ряда вновь синтезированных соединений с антиоксидантными свойствами, имеющими фармацевтическое значение (производные антипирина, антипириламида, кумарина). Показан обратимый характер протекания процессов, определены потенциалы окисления — восстановления исследуемых соединений. Найдены оптимальные условия получения аналитического сигнала (пиков окисления) для исследованных веществ.

8. Найдена взаимосвязь между электрохимическими свойствами (потенциалами окисления) и антиоксидантной активностью веществ. Получено уравнение, которое позволяет прогнозировать значения электрохимических потенциалов окисления и осуществлять целенаправленный синтез и анализ новых соединений с антиоксидантными свойствами.

Достоверность разработанных научных положений и сформулированных выводов обеспечена корреляцией полученных экспериментальных результатов с теоретическими, хорошей сопоставимостью с литературными данными, получением согласованных результатов сравнительных определений вольтамперометрического метода с независимыми аналитическими спектрофотометрическими, кинетическими, флуоресцентными методами, оценкой основных метрологических характеристик результатов определения с помощью методов математической статистики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ.

Практическая значимость работы. Исследование антиоксидантных свойств широкого круга объектов методом вольтамперометрии на основе процесса электровосстановления кислорода, позволило выявить наиболее активные антиоксиданты, их композиции, предложить способ фракционирования экстрактов растений и дать рекомендации для их дальнейшего использования в фитотерапии.

С использованием полученных результатов фирмой «Диадема» (г. Иркутск) разработана новая биологически - активная добавка «Лавитол», прошедшая необходимую процедуру сертификации и допущенная к применению как профилактическое средство сердечно - сосудистых заболеваний. Фирма «Биокор» (г. Новосибирск), используя результаты данной работы, выпустила на рынок новый кисломолочный продукт «Наринэ-2» с улучшенными свойствами.

При исследовании антиоксидантной активности нового синтезированного препарата токоферолмоногликозида выявлены оптимальная концентрация, время активного действия антиоксиданта, рН среды. Результаты данной работы внедрены в НИИ онкологии г. Томска для разработки рекомендаций к лечению и профилактике онкологических заболеваний с использованием данного препарата.

На основе результатов определения совместимости компонентов в смесях антиоксидантов разработаны эффективные антиоксидантные композиции, улучшающие качество питьевой минерализованной воды, косметической продукции. На основе полученных результатов фирма «Кора» (г. Москва) разработала новые косметические средства антиоксидантного назначения, способствующие эффективной защите и омоложению клеток кожи.

Разработан анализатор «Антиоксидант» для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Прибор прошел государственные испытания, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.А № 28715) и внесен в единый ГОСреестр СИ под номером 35466-07. В настоящее время анализатор прошел международную сертификацию в Чехии (г. Прага) (Сертификат IEC № 603066-01/01 of 11.07.2008) и допущен к применению в аналитических -и научно-исследовательских лабораториях Америки.

На защиту выносятся следующие положения:

Европы и

1. Обоснование выбора вольтамперометрического метода и модельной системы: кислород, активные формы кислорода — антиоксид ант для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

2. Результаты оценки влияния поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам, на процесс электровосстановления кислорода в зависимости от материала электрода, рН среды, типа поверхностно - активного вещества.

3. Физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Классификация антиоксидантов по механизмам их взаимодействия с кислородом и его активными формами.

4. Количественные критерии определения антиоксидантной активности объектов по отношению к процессу электровосстановления кислорода: емкостный (мг/л)"1 критерий, отражающий степень изменения модельного сигнала в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л-мин), отражающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени.

5. Результаты определения антиоксидантной активности по отношению к процессу электровостановления кислорода ряда индивидуальных веществ, объектов искусственного и природного происхождения.

6. Результаты определения электрохимических свойств (потенциалов окисления - восстановления) производных антипирина, антипириламида, кумарина, в модельных растворах и лекарственных формах. Выявленные зависимости между электрохимическими свойствами (потенциалами окисления) и антиоксидантной активностью ряда флавоноидов и витаминов.

7. Результаты сравнительных определений антиоксидантной активности некоторых биологически активных веществ с использованием метода вольтамперометрии и независимых аналитических методов анализа (спектрофотометрический, флуориметрический, амперометрический с использованием биосеисора).

8. Методика определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

Апробация работы Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на следующих Международных и Всероссийских конференциях: VI Межд. конф. «Биоантиоксидант» (г. Москва 2002); Int. conf. "Euroanalysis-12", (Dortmund, Germany, 2002); Всерос. конф. «Актуальные проблемы аналитической химии» (г. Москва, 2002); Всерос. научно -практ. конф. «Химия и технология лекарственных препаратов и полупродуктов» (г. Новокузнецк 2002); I, II, III, IV Всерос. научн. конф. «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (г. Томск, 2000, 2002, 2004, 2006); 203rd Meeting of the electrochemical society (Paris, France 2003); XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (г. Казань 2003); Int. conf. Euro Food Chem XII (Brugge, Belgium 2003); Научно- практ. конф. «Технология органических веществ и высокомолекулярных соединений» (г.Томск, 2003); 3-rd, 4-th, 5- th Int. conf. "Instrumental Methods of Analysis" (Greece 2003, 2005, 2007); V Всерос. конф. «Экоаналитика - 2003». (Санкт-Петербург 2003); 7".- Int conf. on pharmacy and applied physical chemistry (Innsbruck, Austria 2003); 15th Int. symp. of pharmaceutical and biomedical analysis (Florence, Italy 2004); Int. conf. "Euroanalysis — 13" (Salamanca, Spain 2004); I семинара «Методы и средства определения антиоксидантной активности препаратов». (г.Москва, 2004); VII Всерос. науч. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», (г.Новосибирск 2004); 10th Int. conf. on electroanalysis (Ireland 2004); Всерос. научн. конф. «Электроаналитика-2005». (г.Екатеринбург 2005); научно - практ. конф, «Технологии и продукты здорового питания» (г. Москва 2005); Межд. симп. «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г. Тюмень 2005);

Int. conf "Analytical chemistry and chemical analysis". (Kyev, Ukraine. 2005); 2i nd Int. symp. on Recent advances in food analysis. (Prague Czech Republic 2005); 8-ой Межд. семинар «Биотехнология-2005» (Пущино. 2005); 2-ой Всерос. конф. «Аналитические приборы 2005» (г Санкт-Петербург 2005); 9-th Annual meeting of the Israel analytical chemistry society (Tel-Aviv Israel 2006); 13-th World congress "Food in life". (Nantes. France 2006); Int. congress ICAS-2006. (Moscow, Russia 2006); III Всерос. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г.Барнаул, 2007); Int. conf. "4th Black Sea basin conference on analytical chemistry" (Sunny Beach, Bulgaria

2007); Int. conf. "Euroanalysis XIV". (Antwerp, Belgium 2007); Межд. XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (г.Москва 2007); II Всерос. конф. по аналитической химии с межд. .участием (г. Туапсе 2007); Всерос. научно- практ. конф. «Здоровое питание - основа жизнедеятельности человека» (г.Красноярск 2008); VII Всерос. конф. «ЭМА - 2008» (г. Уфа

2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 128 печатных работ в виде 43 статей (29 статей входит в список журналов, рекомендованных ВАК), материалов докладов и конференций, 4 патентов РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6-ти глав, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 370 наименований, изложена на 368 страницах текста, содержит 70 таблиц, 104 рисунка и 3 приложения на 30-страницах.

выводы

1. Предложен и обоснован новый подход на основе метода вольтамперометрии и модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для оценки суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. На основе исследования влияния различных факторов: материала электрода, рН среды, природы растворителя, концентрации молекулярного кислорода, на процесс электровосстановления кислорода показана возможность использования относительного изменения тока электровостановления кислорода в присутствии антиоксидангов на ртутно -пленочном электроде как средство измерения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.

2. Проведены и обобщены исследования по влиянию поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам в различных объектах, на процесс электровосстановления кислорода. Показан неоднозначный характер данного влияния, зависящий от материала электрода, рН среды, типа ПАВ. Показано, что только на платиновых металлах в кислых средах наблюдается пропорциональное уменьшение тока ЭВ 02 в присутствии ПАВ. На ртутно - пленочном электроде подобной закономерности не обнаружено, что дает возможность использовать данный процесс для определения антиоксидантной активности в присутствии поверхностно активных веществ.

3. Изучены физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Предложены преимущественные механизмы взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами. Установлено, что для каталазы, как фермента антиоксидантной природы, характерен механизм с последующей химической реакцией диспропорционирования и частичной регенерацией деполяризатора. В присутствии антиоксидантов фенольной природы наблюдается преимущественное протекание электродного процесса восстановления кислорода с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами. Для N, S и Se содержащих антиоксидантов характерен механизм с преимущественным протеканием предшествующей химической реакцией взаимодействия с молекулярным кислородом.

4. Установлены два новых количественных критерия для определения антиоксидантной активности объектов: емкостный (мг/л)"1 критерий, отражающий степень изменения тока электровосстановления кислорода в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л мин), показывающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени. Данные критерии освобождали от необходимости использовать стандартный антиоксидант и использовались в работе наряду с общеизвестными критериями ORAC, отражающему способность поглощать кислородные радикалы, отнесенному к стандартному антиоксиданту (безразмерная величина), критерием ICso, моль/л, показывающему концентрацию антиоксиданта при ингибировании модельного сигнала на 50%, критерием суммарной антиоксидантной активности, моль/л, рассчитанному по градуировочному графику в пересчете на концентрацию стандартного антиоксиданта.

5. Проведена оценка антиоксидантной активности по отношению к процессу электровосстановления кислорода индивидуальных антиоксидантов различной природы: каталазы, гуминовых кислот, фталоцианинов металлов, ряда флавоноидов, производных кумарина, витаминов Е, А, С, группы В6, аскорбатов металлов, коэнзима Qi0, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), селенсодержащих БАД, производных антипирина, антипириламида, бенздиазепина, имеющих фармацевтическое значение. Показано, что большую активность из этого ряда проявляют кверцетин, рутин, витамины

С, А, Е, аскорбаты кальция и магния. Показано, что антиоксидантная активность объектов зависит от концентрации антиоксидантов, времени их взаимодействия с кислородом и его активными радикалами, рН среды, совместимости компонентов в смесях антиоксидантов и их соотношении.

6. Проведена оценка суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного (продукция пищевой, косметической, фармацевтической промышленности) и природного (экстракты растений) происхождения. Выявлено значительное влияние ряда факторов (рН среды, природы растворителя при выделении компонентов растительного сырья, совместимости компонентов в смесях) на антиоксидантные свойства объектов. На примере токоферола моногликозида показано, что данный антиоксидант наиболее активен в нейтральной области рН (7.1 — 7.3). При фракционировании экстрактов растений выявлена наиболее активная этилацетатная фракция, которая рекомендована для наиболее полного извлечения биологически — активных веществ из растительного сырья. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов показано, что при увеличении числа компонентов (больше 2) их суммарная антиоксидантная активность падает, при этом аддитивности сигнала не наблюдается. На основе данных исследований предложена наиболее эффективная композиция из исследованных антиоксидантов (аскорбиновая кислота, дигидрокверцетин (1:1)). На примере косметической продукции показано, что введение смеси экстрактов растений (солодка, люцерна, хмель, клевер) увеличивает суммарную антиоксидантную активность продукции.

7. Получены математические модели первого и второго порядков для определения активности антиоксидантов на примере флавоноидов в зависимости от концентрации и времени их взаимодействия с кислородом и его активными формами. Полученные уравнения позволяют оценивать эффективные концентрации и время активного действия антиоксидантов по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

8. Проведены исследования электрохимических свойств ряда антиоксидантов. Особое внимание уделено впервые синтезированным соединениям с антиоксидантными свойствами, таким, как производные антипирина, антипириламида, кумарина. Установлены механизмы протекания электродных процессов окисления — восстановления исследованных веществ, показан обратимый характер протекания процессов. Методом циклической вольтамперометрии найдены потенциалы окисления - восстановления данных веществ, определены оптимальные условия получения аналитического сигнала, построены градуировочные зависимости, определен диапазон определяемых концентраций: 3-10"4 о

2-10" моль/л, достаточный для их определения в лекарственной форме

9. Установлена взаимосвязь между значениями потенциалов окисления -восстановления веществ и их антиоксидантной активностью по отношению к процессу электровосстановления кислорода на примере ряда флавоноидов, жирорастворимых витаминов Е, А.

10. Разработана методика выполнения измерений (МВИ) показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения на основе полученных закономерностей. В соответствии с регламентированной процедурой аттестации МВИ рассчитаны основные метрологические характеристики анализа (показатель повторяемости, точности, внутрилабораторной прецезионности). Все процедуры расчетов проводились в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ. Проведены сравнительные испытания методики с другими, уже зарекомендовавшими себя методами определения антиоксидантной активности, в частности, методом спектрофотометрии с двумя разными системами генерации кислородных радикалов: ферментативной на основе ксантин/ксантиноксидазной системы и неферментативной PMS/NADH системой, флуориметрическим, амперометрическим на основе биосенсора с СОД, кинетическим методами. Полученные данные показали хорошую сходимость результатов, расхождение между которыми для большинства методов не превышает 10%.

11. Разработан новый вольтамперометрический анализатор «Антиоксидант» для определения показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Прибор прошел государственные испытания с целью утверждения типа СИ, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.A № 28715) и внесен в единый ГОСреестр СИ под номером 35466-07. В настоящее время анализатор прошел международную сертификацию в Чехии (г. Прага) и допущен к применению в аналитических и научно-исследовательских лабораториях Европы и Америки.

1. Золотов Ю.А. Аналитическая химия и медицина. // Журн. аналит. химии. -2001.- Т.56, №11.- с.1125.

2. Pospisil J. Antioxidants. Prague.- 1968. - 193р.

3. Эммануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. Торможение процессов окисления жиров. М.: Пищепромиздат, 1961. - 359 с.

4. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты. Реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988. - 247 с.

5. Бурлакова Е.Б., Алексеенко Е.Б., Молочкина Е.М. и др. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М.: Наука, 1975. - 211 с.

6. Хавинсон В.Х., Баранов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В. Свободнорадикальное окисление и старение.— СПб.: Наука, 2003.- 327 с.

7. Белякова Н.А., Семесысо С.Г. Антиоксидантная активность биологических жидкостей человека. Методология и клиническое значение.// Эфферентная терапия.- 2005.-T.l 1, № 1.- с.5-23.

8. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. — М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. 343 с.

9. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

10. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники. Сер. биофизика / ВИНИТИ.- 1991. Т.29, №1. - С. 1-252.

11. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Л.: Наука, 1985. - 230 с.

12. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. Пособие для врачей. — М.: Медицина, 2001. — 78 с.

13. Ланкин В.З., Вихерт A.M., Тихазе А.К. и др. Роль перекисного окисления липидов в этиологии и патогенезе атеросклероза. // Вопросы медицинской химии.- 1989. №3. - С. 18-24.

14. Панасенко О.М., Сергиенко В.И. Свободнорадикальная модификация липопротеинов крови и атеросклероз // Биологические мембраны. 1993. - Т.10, №4. - С. 341-382.

15. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Сафина А.Ф. Окислительный стресс при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда. // Успехи современной биологии. 1997. - №3. - С. 362-373.

16. Александровский Ю.А., Поюровский М.В., Незнамов Г.Г. Неврозы и перекисное окисление липидов. М.: Наука, 1991. - 144 с.

17. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.А., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992. — 148 с.

18. Witz G. Active oxygen species as factors in multistage carcinogenesis. // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. — 1991. — V. 198, №7.-P. 675-682.

19. Sahu S.C. Role of oxygen free radicals in the molecular mechanisms of carcinogenesis: a review. // Environmental carcinogenesis and ecotoxicology reviews. 1991.-V.9,№ 1.-P. 83-112.

20. Практическая онкология: избранные лекции. — СПб.: Центр ТОММ, 2004. 784 с.

21. Bartos G. Total antioxidant capacity // Adv. Clin. Chem.— 2003.— Vol. 37.—P. 219-292.

22. Дремина Е.Г., Шаров B.C., Владимиров Ю.А. Определение антиоксидантной активности биологических и лекарственных препаратов: методологические аспекты // Пульмонология.— 1995.— № 1,—С. 73-75.

23. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функция в растениях. М.: Наука, 1993. - 272 с.

24. Young l.S. Measurement of total antioxidant capacity // J. Clin. Pathol.— 2001Vol. 54, № 5.— P. 339.

25. Клебанов Г. И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И. В. и др. Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестн. РАМН.- 1999.- № 2.- С. 15-22.

26. Chung H.S., Chang L.C., Lee S.K. et al. Flavonoid constituents of Chorizcinthe diffusa with potential cancer chemopreventive activity //"J Agric. Food Chem. — 1999.-Vol. 47.-36-41.

27. Абдуллин И.Ф., Турова E.H., Будников Г.К. Органические антиоксиданты как объекты анализа. // Заводская лаборатория. 2001. -Т.67, №6. - С. 3-13.

28. Halliwell В. Antioxidant characterization. Methodology and mechanism. // Biochemical Pharmacology. 1995.-V.49, №10.-P. 1341-1348.

29. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. — Oxford.: Clarendon Press, 1989. 793 p.

30. Antolovich M., Prenzler P.D., Patsalides E., McDonald S., Robards K. Methods for testing antioxidant activity // Analyst. 2002. - V.127, №. — P. 183-198.

31. Koracevic D., Koracevic G., Djordjevic У. et al. Method for the measurement of antioxidant activity in human fluk // J. Clin. Pathol.- 2001.- Vol. 54, № 5.-P. 356-361.

32. Lands L.C., Grey V.L., Grenier C. Total.plasma antioxidant capacity in cystic fibrosis // Pediatr Pulmonol.— 2000. Vol. 29, №2.- P. 81-87.

33. Olson J.A. Carotenoids and human health // Arch. Latinoamer. Nutr.— 1999.— Vol. 49, №3, Suppl. 1.—P. 11.

34. Биохемилюминесценция / Под ред. А.И. Журавлева. М.: Наука, 1983. -345 с.

35. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo / Сборник науч. статей — М.: Наука, 1992. — 110 с.

36. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Кинетика жидкофазного окисления дифенилметана при умеренных температурах // Кинетика и катализ. 1996. - Т.37, №4. - С. 542-552.

37. Васильев Р.Ф., Вичутинский А.А., Черкасов А.С. Хемилюминесценция, активированная производными антрацена // Доклады АН СССР. 1963. -Т. 149, №1. - С. 124-127.

38. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. О переносе энергии с химически возбуждаемых карбонильных соединений на производные антрацена и кислород // Известия АН СССР. Сер. физическая. 1973. -Т.37, №4. - С. 747-752.

39. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. Ингибирование сывороточными антиоксидантами окисления люминола в присутствии гемоглобина и пероксида водорода // Вопросы медицинской химии. 1997. - Т.43, №2. - С. 87-92.

40. Навас М.Х., Хименец A.M., Асуэро А.Г. Определение восстановительной способности настоек семени канарского канареечника методом хемилюминесценции // Журн. Аналит. химии. -2004. Т.59, №1. - С. 84-86.

41. Беляков B.A., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Кинетика окси-хемилюминесценции и ее использование для анализа антиоксидантов // Кинетика и катализ. 2004. - Т.45, №3. - С. 355-362.

42. Большакова И.В., Лозовская Е.Л., Сапежинский И.И. Антиоксидантные свойства ряда экстрактов лекарственных растений // Биофизика. — 1997. Т.42, №2. - С. 480-483.

43. Арзамасцев А.П., Шкарина Е.И., Максимова Т.В., Пахомов В.П., Никулина И.Н., Лозовская Е.Л., Чумакова З.В., Сапежинский И.И.

44. Оценка показателей антиоксидантной активности препаратов на основе лекарственного растительного сырья // Химико-фармацевтический журнал. 1999. - Т.ЗЗ, №11.- С. 17-20.

45. Наумов В.В., Храпова Н.Г. Определение активности слабых антиоксидантов хемилюминесцентным методом // Кинетика и катализ. -1984. Т.25, №3. - С. 563-570.

46. Шарипов Г.Л., Казаков В.П., Толстиков Г.А. Химия и хемилюминесценция 1,2-диоксикетанов. М.: Наука, 1990. — 288 с.

47. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Хемилюминесценция при окислении непредельных органических соединений в растворах // Известия АН СССР. Сер. химическая. 1983. - №12. - С. 2709-2717.

48. Письменский А.В., Психа Б.Л., Харитонов В.В. Кинетическая модель окисляемости метиллинолеата II Нефтехимия. — 2000. Т.40, №2. — С. 123-129.

49. Письменский А.В., Психа Б.Л., Харитонов В.В. Механизм и эффективность ингибирующего действия 1,3-ди(4-фениламинофенокси)-2-пропанола и 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола при окислении метиллинолеата // Нефтехимия. 2001. - Т.41, №5. - С. 377-383.

50. Ермилова Е.В., Кадырова Т.В., Краснов Е.А., Писарева С.И., Пынченков В.И. Антиокислительная активность экстрактов водяники черной. // Химико-фармацевтический журнал. 2000. - Т.34, №11. -С. 28-30.

51. ХасановВ.В., Дычко К.А., Рыжова Г.Л. Кинетический метод свободно-радикального окисления сульфит-иона для определения антиоксидантов в биообъектах // Химико-фармацевтический журнал. 2001. - Т.35, №12. - С. 36-37.

52. Наумов В.В., Васильев Р.Ф. Анти- и прооксидантное действие токоферола // Кинетика и катализ. 2003. - Т.44, №1. - С. 111-115.

53. Сизова Н.В., Веретникова О.Ю., Ефремов А.А. Оценка антиоксидантной активности эфирных масел методом микрокалориметрии // Химия растительного сырья. 2002. - №3. - С. 57-60.

54. Афанасьев В.А., Заиков Г.Е. Физические методы в химии. М.: Наука, 1984.- 174 с

55. Fogliano V., Verde V., Randazzo G., Ritieni A. Method for measuring antioxidant activity and its application to monitoring the antioxidant capacity of wines // Journal Agricultural and Food Chemistry. 1999. - V.47, №3. -P. 1035-1040.

56. Tubaro F., Micossi E., Ursini F. The antioxidant capacity of complex mixtures by kinetic analysis of crocin bleaching inhibition // Journal of the American Oil Chemists's Society. 1996. - V.73, №3. - P. 173-176.

57. Singleton V.L., Rossi J.A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents // American Journal of Enology and Viticulture. 1965. -V. 16, №3. - P. 144-158.

58. Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения / Сборник докладов. М.: Изд-во РУДН, 2005. - 221 с.

59. Benzie I.F., Strain J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP)as a measure of bantioxidant powerQ: the FRAP assay // Analytical Biochemistry. 1996. - V.239, №1. - p. 70-76.

60. Moyer R.A., Hummer K.E., Finn C.E., Frei В., Wrolstad R.E. Anthocyanins, phenolics, and antioxidant capacity in diverse small fruits: vaccinium, rubus, and ribes // Journal of Agricultural and Food Chemistiy. 2002. - V.50, №3. -P. 519-525.

61. Luximon-Ramma A., Bahorun Т., Soobrattee M.A., Aruoma O.I. Antioxidant activities of phenolic, proanthocyanidin, and flavonoid components in extracts of Cassia fistula // Journal Agricultural and Food Chemistry. 2002. - V.50, №18. - P. 5042-5047.

62. Абдуллин И.Ф., Турова E.H., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., ГайсинаГ.Х. Электрогенерированный бром реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов // Заводская лаборатория. - 2002. - Т.68, №9. - С. 12-15.

63. Абдуллин И.Ф., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Интегральная антиоксидантная емкость крови по данными метода гальваностатической кулонометрии // Вестник Татаского отделения Российской экологической академии. 2003. - №3. - С. 35-39.

64. Ziyatdinova G.K., Budnikov Н.С., Pogorel'tzev V.I. Electrochemical determination of the total antioxidant capacity of human plasma // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2005. - V.381, №8. - P. 1546-1551.

65. Зиятдинова Г.К. Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов. Дисс. канд. хим. наук. — Казань, 2005. - 187с.

66. Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Реакции супероксид анион-радикала с антиоксидантами и их применение в вольтамперометрии // Журн. Аналит. химии. 2005. - Т.60, № 5. - С. 56-59.

67. Брайнина Х.З., Иванова А.В., Шарафутдинова Е.Н. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов методом потенциометрии // Известия ВУЗов. Пищевая технология.- 2004.- №4-с.73-75

68. Шарафутдинова Е.Н. Потенциометрия в исследовании антиоксидантной активности объектов растительного происхождения. Автореф. дис. канд. хим. наук. Екатеринбург, 2007. - 24с.

69. Brainina Kh. Z., Ivanova A.V., Sharafutdinova E.N, Lozovskaya E.L., Shkarina E.l. Potentiometry as a method of antioxidant activity investigation //Talanta.-2007.- Vol. 71, N 1.- P. 13-18.

70. Фролова H.A., Колычев И.А., Цюпко Т.Г., Темердашев З.А. ВЭЖХ определения антиоксидантов в лекарственном растительном сырье / Материалы II Веер. Конф.: Аналитика России. 7-12 октября 2007. — Краснодар. -2007. с.471.

71. Chevion S., Berry Е.М., Kitrossky N., Kohen R. Evaluation of plasma low molecular weight antioxidant capacity by cyclic voltammetry // Free Radical Biology And Medicine 1997. - V.22, №6. - P. 411-421.

72. Chevion S., Roberts M.A., Chevion M. The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant capacity // Free Radical Biology And Medicine. -2000. V.28, №6. - P. 860-870

73. Kohen R., Vellaichamy E., Hrbac J., Gati I., Nirosh O., Quantification of the overall reactive oxygen species scavenging capacity of biological fluids and tissues // Free Radical Biology And Medicine 2000. - V.28, №6. - P. 871879.

74. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Новый прибор для определения антиоксидантной активности пищевых продуктов, биологическиактивных добавок, растительных лекарственных экстрактов и напитков // Приборы и автоматизация. — 2004. №11. -С. 45-48.

75. Яшин А .Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П., Экспрессный электрохимический метод определения антиоксидантной ативности пищевых продуктов // Пиво и напитки. 2004. - №6. - С. 44-46.

76. Hitchman M.L., Mesurement of dissolved oxygen. — Geneva.: John Wiley&Sons Inc., 1978. 255 p.

77. Будников Г.К., Майстренко B.H., Вяселев M.P. Основы современного электрохимического анализа-М.: Мир, 2003, 592 с.

78. Осина М.А., Богдановская В.А., Тарасевич М.Р. Биоамперометрическое определение производных фенола с использованием композита лакказа-нафион // Электрохимия. 2003. - Т.39, №4. - С. 450-456.

79. Ge В., Lisdat F. Superoxide sensor based on cytochrome С immobilized on mixed-thiol SAM with a new calibration method // Analytica Chimica Acta. -2002. V.454, № 1. - P. 53-64.

80. Ignatov S., Shishniashvili D., Ge В., Scheller F.W., Lisdat F. Amperometric biosensor based on a functionalized gold electrode for detection of antioxidants // Biosensors and Bioelectronics. 2002. - V. 17, № 3. - P. 191199.

81. Campanella L., Bonanni A., Favero G., Tomassetti M. Determination of antioxidant properties of aromatic herbs, olives and fresh fruit using an enzymatic sensor // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2003. — V.375, № 8. - P. 1011-1016.

82. Бумбер А.А., Корниенко И.В., Профатилова И.А., Внуков В.В., Корниенко И.Е., Гарновский А.Д. Полярографический метод в изучении антиоксидантной активности аминокислот и белков. // Журнал общей химии. 2001. - Т.71, №8. - С. 1387-1390.

83. Громовая В.Ф., Шаповал Г.С., Луйк А.И. применение импульсной вольтамперометрии для изучения антиокислительной активности физиологическиактивных веществ // Химико-фармацевтический журнал. 1994. - Т.28, №11. - С. 11-14.

84. Громовая В.Ф., Шаповал Г.С., Мионюк И.Е., Луйк А.И. Электрохимическое исследование антиоксидантной активности крови // Журнал обшей химии. 1997. - т.67, № 3. - С. 510-513.

85. Кольтгоф И.М., Лингейн Дж.Дж., Полярография. — Л.: Госхимиздат, 1948.-508 с.

86. Багоцкий B.C. Основы электрохимии. М.: Химия, 1998. - 399 с.

87. Антропов Л.И. Теоретическая электрохимия. М.: Высшая шлола, 1969. -510с.

88. Корыта И., Дворжак И., Богачкова В. Электрохимия. М.: Мир, 1977. -472 с.

89. Гейровский Я., Кута И. Основы полярографии. М.: Мир, 1965. - 559с.

90. Kuta J., Koryta J. Reduction of oxygen at the mercury electrode // Collect, of Czechoslovak Communications. 1965. - V.30, №12. -P. 4095 - 4110.

91. Фрумкин A.H., Некрасов Л.Н. Вращающийся дисковый электрод // Доклады АН СССР. 1959. - Т. 126, №1. - С. 115-118.

92. Фрумкин А.Н., Хрущева Е.И., Шумилова Н.А., Тарасевич М.Р. Вращающийся дисковый электрод // Электрохимия. 1965. - T.l 1, №1. -С. 17-19.

93. Вилинская B.C., Лензнер Б.И., Кноц Л.А., Тарасевич М.Р. Вращающийся дисковый электрод // Электрохимия. 1971. - Т.7, № 12. - С. 1763-1769.

94. Багоцкий B.C., Тарасевич М.Р., Филиновский В.Ю. Расчет кинетических параметров сопряженный реакций 02 и Н202 на вращающемся дисковом электроде // Электрохимия. 1969. - Т.5, №10. - С. 1218-1220.

95. Тарасевич М.Р., Хрущева С.И., Филиновский В.Ю. Вращающийся дисковый электрод с кольцом. — М.: Наука, 1987. 247 с.

96. Тарасевич М.Р., Бурштейн Р.Х., Радюшкина К.А. Исследование параллельно-последовательных стадий реакций кислорода и перекиси водорода. Восстановление кислорода на платиновом электроде // Электрохимия. 1970. - Т.6, №3. - С. 372-375.

97. Дамьянович А.А. Современные проблемы электрохимии. — М.: Мир, 1971.-450 с.

98. Bockris J.O'M., Abdu R. A theoretical study of the electrochemical reduction of oxygen // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1998. - V.448, №2 -P. 189-204.

99. Мельников В.И. Влияние поверхносто-активных веществ на кинетику катодного восстановления кислорода и коррозию железа в 1н. растворе серной кислоты.: Дисс.к-та хим. наук. Киев. 1970. - 210с.

100. Тарасевич М.Р. Обобщенное кинетическое уравнение электровосстановления молекулярного кислорода // Электрохимия. -1981. Т. 17, №8. - С. 1208-1212.

101. Tammeveski K., Tenno Т., Claret J., Ferrater C. Electrochemical reduction of oxygen on thin-film Pt electrodes in 0.1 M KOH // Electrochimica acta. -1997. V.42, №5. - P. 893-897.

102. Тарасевич M.P. Исследование параллельно-последовательных стадий реакций кислорода и перекиси водорода. Механизм электровосстановления кислорода на платиновых металлах // Электрохимия. 1973. - Т.9, №4. - С. 599-603.

103. Vracar L.M., Sepa D.B., Damjanovic A. Palladium electrod in oxygen-saturited aqueous solutions // Journal of the Electrochemical Society. 1989. - V.136, №7. - P. 1973-1977.

104. Захаров. M.C., Баканов В.И., Пнев B.B. Хронопотенциометрия. М.: Химия. 1978.-200 с.

105. ПЗ.Багоцкий B.C., Яблокова И.Е. Механизм электрохимического восстановления перекиси водорода и кислорода на ртутном электроде // Журнал физической химии. 1953. - Т.27, №12. - С. 1663-1667.

106. Sarapuu A., Tammeveski К., Tenno Т.Т., Sammelselg V., Konttuti К., Schiffrin D.J. Electrochemical reduction of oxygen on thin-film Au electrodes in acid solution // Electrochemistry Communication!. 2001. - V.3, №8. — p. 446-450.

107. Тарасевич M.P., Сабиров Ф.З., Бурштейн P.X. Механизм электрохимического восстановления кислорода на пирографите // Электрохимия. 1971. Т.7, №4. - С. 405-407.

108. Андрусева С.И., Тарасевич М.Р., Радюшкина К.А. к вопросу об электровосстановлении кислорода на углеродистых материалах // Электрохимия. 1977. Т. 13, №2. - С. 253-256.

109. Lai M.E., Bergel A. Electrochemical reduction of oxygen on glassy carbon: catalysis by catalase // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2000. -V.494, №1. - P. 30-40.

110. Vaik K., Schiffrin D.J., Tammeveski K. Electrochemical reduction of oxygen on anodically pre-treated and chemically grafted glassy carbon electrodes in alkaline solutions // Electrochemistry Communications. 2004. - V.6, №1. -P. 1-5.

111. Тарасевич M.P., Захаркин Г.И., Смирнова P.M. Изучение реакций1.окислорода и перекиси водорода с помощью О . Механизм образования Н2О2 на палладии, золоте и пирографите // Электрохимия. 1971. Т.7, №8. -С. 1298-1301.

112. Heyrovsky М., Vavricka S. Heterogeneous electron transfer to molecular oxygen in aqueous solutions // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1992. -V.332, №1-2. -P. 309-313.

113. Heyrovsky M., Vavricka S. Electroreduction of molecular-oxygen in one 4-electron step on mercury// Journal of Electroanalytical Chemistry. — 1993. — V.353, №1-2. P. 335-340.

114. Штейиберг Г.В., Кукушкина И.А., Дрибинская A.B., Тарасевич М.Р. Электрокаталитическая активность углей различной структуры в реакции восстановления кислорода // Электрохимия. 1984. - Т.20, №7. - С. 940-944.

115. Vago E.R., Weldige К., Rohwerder М., Stratmann М. Electroreduction of oxygen on octadecylmercaptan self-assembled monolayers // Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 1995. - V.353, №3-4 - P. 316-319.

116. Raj C.R., Abdelrahman A.I., Ohsaka T. Gold nanoparticle-assisted electroreduction of oxygen // Electrochemistry Communications. 2005. -V.7, № 9. - P. 888-893.

117. Chithra R., Renuka R. Electroreduction of oxygen on mercury in the presence of titanium silicalite, TS-1 // Journal of Applied Electrochemistry. 2003. -V.33, № 5. - P. 443-446.

118. Tammeveski К., Kontturi К., Nichols R.J., Potter R.J., Schiffrin D.J. Surface redox catalysis for 02 reduction on quinone-modified glassy carbon electrodes // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2001. - V.515, №1-2. - P. 101112.

119. Sarapuu A., Vaik K., Schiffrin D.J., Tammeveski K. Electrochemical reduction of oxygen on anthraquinone-modified glassy carbon electrodes in alkaline solution // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2003. - V.541, №1. - P. 23-29.

120. Manisankar P., Gomathi A., Velayutham D. Oxygen reduction at the surface of glassy carbon electrodes modified with anthraquinone derivatives and dyes // Journal of Solid State Electrochemistry. 2005. - V.9, №9. - P. 601-608.

121. Брейзер M., Лунд X., Органическая электрохимия. M.: Химия, 1988. -469 с.

122. Брык Д.В., Макитра Р.Г., Пириг Я.Н., Стефанык Ю.В. Влияние свойств растворителей на растворимость кислорода // Журнал прикладной химии. 1988.-Т.61,№1.-С. 91-97.

123. Hitchman M.L., Mesurement of dissolved oxygen. Geneva.: John Wiley & Sons Inc., 1978. - 255 p.

124. Chu D., Gilman S. The influence of methanol on 02 electroreduction at a rotating Pt disk electrode in acid electrolyte // Journal Electrochemical Society.-1994.-V.141, №7.-P. 1770-1773.

125. Короткова Е.И. Закономерности процесса электровосстановления кислорода, осложненного адсорбцией ПАОВ, и их использование в аналитической практике.: Дисс. .к-та хим. наук. Томск, 1995. - 242 с.

126. Электрохимия металлов в неводных растворах / Сб. Статей. — М.: Мир, 1974.-440с.

127. Манн Ч., Барнес К. Электрохимические реакции в неводных системах. — М.: Химия, 1974.-478 с.

128. Maricle J.M., Hodson W.G. Super-anion of oxygen in aprotonic solvents. // Analytical Chemistry. 1965. - V.37, №12. - P. 1562-1565.

129. Peover M.E., White B.S. Electrolytic reduction of oxygen in aprotic solvents: The superoxide ion // Electrochimica Acta. 1966. - V.ll, №8. - P. 10611066.

130. Sawyer D.T., Roberts J.L. Electrochemistry of oxygen and superoxide ion in dimethylsulfoxide at platinum, gold and mercury electrodes // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1966. - V.12, №2-P. 90-101.

131. Johnson E.L., Pool K.H., Hamm R.E. Effect of several metal ions upon polarographic reduction of oxygen indimethyl sulfoxide// Analytical Chemistry. 1967. - V.39, №8-P. 888-891.

132. Афанасьев И.Б. Анион-радикал кислорода в химических и биохимических процессах // Успехи химии 1979. - Т.48, №6. - С. 9771014.

133. Ml.Luehrs D.C., Leddy L.G. Polarography of metal ions in hexamethylphosphoramide // Journal of Electroanalytical Chemistry. — 1973. -V.41, №1. — P. 113-115.

134. Sawyer D.T., Gidian M.J. The chemistry of superoxide ion // Tetrahedron. — 1979. V.35,№12.-P. 1471-1481.

135. Sawyer D.T., Valentine J.S. How super is superoxide? // Accounts of Chemical Research. 1981. - V. 14, №12. - P. 393-400.

136. Будников Г.К., Каргин О.Ю., Абдуллин И.Ф. Переносчики электронов в электрохимических методах анализа // Журн. Аналит. химии. — 1989. — Т.44, №10. С. 183-190.

137. Sawyer D.T., Seo Е.Т. One-electron mechanism for the electrochemical reduction of molecular oxygen // Inorganic Chemistry. 1977. - V.16, №2. — P. 499-501.

138. Divisek J., Kastening B. Electrochemical generation and reactivity of the superoxide ion in aqueous solutions // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1975. - V.65, №2. - P. 603-621.

139. Gootsby A.D., Sawyer D.T. Electrochemical reduction of superoxide ion and oxidation of hydroxide ion in dimethyl sulfoxide// Analytical Chemistry. -1968. V.40, №1. - P. 83-86.

140. Некрасов Л.Н., Духанова Л.А., Дубровина Н.И., Выходцева Л.Н. исследование реакции катодного восстановления кислорода в растворах диметилформамида методом вращающегося дискового электрода с кольцом // Электрохимия. 1970. - Т.6, №3. - С. 388-390.

141. Vasudevan D., Wendt Н. Electroreduction of oxygen in aprotonic media // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1995. - V.392, №1-2. - P. 69-74.

142. Радгошкина К.А., Зонина E.O., Тарасевич M.P. Электровосстановление кислорода на пирографите в ацетонитрильных растворах // Электрохимия. 1984. - Т.20, №7. - С. 977-980.

143. Афанасьев И.Б., Пригода С.В., Самохвалов Г.И. Время жизни анион-радикала кислорода в диметилформамиде // Журнал общей химии. — 1977. Т.47, № 11. - С. 2507-2510.

144. Cofre P., Sawyer D.T. Electrochemical reduction of dioxigen to perhidroxil (HO'2) in aprotonic solvents that contain Bronsted acids // Analytical Chemistry. 1986. - V.58, №6. - P. 1057-1062.

145. Артемова B.M., Деркулова B.C., Макарова Л.Е. О влиянии некоторых добавок на электровосстановление кислорода в среде ДМФА на твердых электродах // Вопросы химии и химической технологии. — 1984. — Т.74, №1. С. 13-17.

146. Кузьминский Е.В., Машкин О.А., Васильев С.А. Электровосстановление воды и кислорода из апротонных органических электролитов // Украинский химический журнал. 1989. - Т.55, №4. — С. 380-382.

147. Bregoli L.I., The influence of platinum crystallite size on the electrochemical reduction of oxygen in phosphoric acid. // Electrochimica Acta. 1978. — V.23, №6. P.489-492.

148. Hsuch K.-L., Gonzalez E. R., Srinivason S. Effect of phosphoric acid concentration on oxygen reduction kinetics at platinum. // Journal of the Electrochemical Society. 1984. -V. 131, №4. - P.823-828.

149. Clouser S.J., Huang J.C., Yeager E. Temperature-dependence of the tafel slope for oxygen reduction on platinum in concentrated phosphoric-acid // Journal of Applied Electrochemistry. 1993. - V.23, №6. - P. 597-605.

150. Grady W.E., Zagal J. Mechanism of oxygen reduction in super acids // Journal of the Electrochemical Society. 1982. - V.129, №8. -P.336-337.

151. Srinivason S., Gonzalez E.R., Hsuch K.L. Electrolyte effects on oxygen reduction kinetics on platinum's a rotating ring-disk electrode analysis // Journal of Electrochemical Society. 1982. - V.129, №8. - P. 338-339.

152. Wroblowa H., Gupta N. Electroreduction of oxygen in molten NaOH // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1984. - V.161, №2 - P. 295-304.

153. Chevalet J., Rouelle F., Gierst L., Lambert J.P. Electrogeneration and some properties of the superoxide ion in aqueous solutions // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1972. - V.39, №1. - P. 201-216.

154. Brezina M., Hofmanova-Matejkova A. Electrochemical generation of superoxide ion on carbon paste electrodes // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1973. - V.44, №3. - P. 460-462.

155. Adanrov P.K., White R.E., Oxygen reduction on silve in 6.5 M caustic soda solution // Journal of the Electrochemical Society. 1988. - V.135, №10 -P. 2509-2517.

156. Vago E.R, Calvo E.J. Electrocatalysis of oxygen reduction at Fe304 oxide electrodes in alkaline-solutions // Journal of Electroanalytical Chemistry. — 1992. V.339,№l-2-P. 41-67.

157. Gyenge E.L, Oloman C.W. Influence of surfactants on the electroreduction of oxygen to hydrogen peroxide in acid and alkaline electrolytes // Journal of Applied Electrochemistry. 2001. - V.31, №2. - P. 233-243.

158. Opperman G.IT., Standen G.F.Van., Bohmer R.G. Effects of certain surfactants on the voltammetric determination on copper, lead, cadmium. // South African Journal of Chemistry. v.41, № 1. - P.26-34.

159. Каплин A.A., Поскребышева Jl.M., Иванов Ю.А., Белоусов Ю.П., Толстых Б.П. Разработка анализатора и метода контроля для определения суммарных органических микропримесей в деионизированной воде. // Электронная техника. ~ 1971. — сер. 12, №1. -с.46.

160. Некрасов Л.Н., Дубровина Н.И. Влияние различных факторов на процессы адсорбции ряда органических веществ // Электрохимия. — 1968. Т.4, №3. - С.362-365.

161. Некрасов Л.Н., Дубровина Н.И. Полярографических анализ некоторых поверхносто-активных органических веществ // Электрохимия. 1973. -Т.9, №12. - С.1868-1870.

162. Крюкова Т. Полярографический анализ. М.: Госхимиздат. 1959. - 600с.

163. Milberg С., Kratobvil J.P., Zuman P. Surface orientation of cholanoic acids from suppression of polarographic maxima // Journal of Colloid and Interface Science. 1988. - V.126, №1. - P.63-68.

164. Evans D.H., Lingane J.J. The chronopotentiometric reduction of oxygen at gold electrode // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1963. - V.6, №4. -P.283-299.

165. Rajendran Т., Jeyaraman R., Rajasekaran B. Effect of 2,4-diaryl-3-azaicyclo-3,3,l-nonan-9-ones on polarographic maxima of oxygen. Lead and Ni // Indian Journal of Chemistry. 1983. - V.22, №6. - P.485-489.

166. Tebbutt P., Hahn C.E.W. The effect of halothane on the reduction of oxygen on gold A method for simultaneous determination of oxygen and halothane on a single working electrode // Journal of Electroanalytical Chemistiy. 1989. -V.261, № 1. - P.205-216.

167. Novotny L., Navratil T. Effect of surfactants and related biological active substances on the O2/H2O2 voltammetry and its utilization for determinationof the total surfactant content 11 Electroanalysis. 1998. - V.10, №8. - P.557-561.

168. Navratil Т., Novotny L. Detection of bioactive surfactants in aqueous solutions on the basis of I^Cb-voltammetry // Fresenius J Anal Chem. 2000. - V.366, №2. - P.249-253.

169. Нонхибел Д., Уолтон Дж. Химия свободных радикалов. М.: Мир, 1977. -567 с.

170. Ингольд К. Теоретические основы органической химии. М.: Мир, 1973. -520 с.

171. Розанцев Э.Г., Шолле В.Д. Органическая химия свободных радикалов. -М.: Химия, 1979.-334 с.

172. Сайке П. Механизмы реакций в органической химии. М.: Химия, 1991. -558 с.

173. Денисов У.Т. Циклические механизмы обрыва цепей в реакциях окисления органических соединений // Успехи химии. — 1996. Т.65, №6. - С. 547-563.

174. Шольц Ф. Электроаналитические методы: теория и практика: пер. с англ.; под ред. В.Н. Майстренко. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006. — 326 с.

175. Дамаскин Б.Б., Петрий О.А., Цирлина Г.А. Электрохимия. М.: Химия, 2006. - 670с.

176. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В. А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: «Слово», 2006. — 556с.

177. Гусев В.А., Брусов О.С., Панченко Л.Ф. Супероксиддисмутаза -радиобиологическое значение и возможности // Вопр. мед. химии. -1980. Т. 26, вып. 3.-е. 291-299.

178. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа, пер. с польск. М.: Мир, 1974. - 552 с.

179. Compton Richard G., Banks Craig E. Understanding voltammetry. -University of Oxford, UK.: World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., 2007. -371 p.

180. Turyan Y.I., Gorenbein P., Kohen R. Theory of the oxygen voltammetric electroreduction process in the presence of an antioxidant for estimation of antioxidant activity // J. Electroanalytical Chem. 2004. - Vol. 571, №571. -P. 183-188

181. Turyan Ya.I., Chemical Reactions in Polarography.- Moscow: Khimiya, 1980. P.22

182. Bors W., Michel C. Antioxidant capacity of flavanols and gallate esters: Pulse radiolysis studies // Free Radic. Biol. Med.- 1999.- Vol. 27.- P. 1413-1426.

183. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты // Успехи химии. 1985. -Т.54. - с. 1540-1558

184. Химия биологически активных природных соединений / Под ред. Преображенского Н.А., Евстигнеевой Р.П. М.: Химия, 1976. — 137 с.

185. Методы и средства определения антиоксидантной активности препаратов. Материалы I семинара. / Под ред. Е.Б. Бурлаковой. -Москва: ИБХФ, 2005. 250с.

186. Korotkova E.I., Karbainov Yu.A., Shevchuk A.V. Study of antioxidant properties by voltammetry // J. Electroanalutical Chemistry. 2002. - V. 508, № 1. - P. 56-60.

187. Аврамчик О. А Закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов и их применение в аналитической практике. Дисс. канд. хим. наук. Томск, 2006. - 176 с.

188. М. Б. Фиалко, В. Н. Кумок Лекции по планированию эксперимента. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1977.- 131с.

189. С. Н. Саутин Планирование эксперимента в химии и химической технологии.- Л.: Наука, 1975. 48с.

190. Е.И. Короткова. Практикум по планированию и организации эксперимента. Томск: Изд-во ТПУ, 1984.- 97с.

191. Красовский Г.И., Филаретов Г.Ф. Планирование эксперимента. Минск: Изд-во Белорусского ГУ, 1982. - 302 с

192. E.I. Korotkova, Y.A. Karbainov, О. A. Avramchik. Investigation of antioxidant and catalytic properties of some biologically active substances by voltammetry. // Analutical and Bioanalutical Chemistry, 2003, v. 375, N 1-3, 465-468.

193. Комиссаров И.Д., Климова А.А., Логинов А.Ф. Исследование свойств гуминовых кислот // Гуминовые препараты. 1971. - №1. - с. 200-212.

194. Христева Л.А. Возможности применения гуминовых кслот // Гуминовые удобрения: Теория и практика их применения. 1977. - Т. 6. - с. 3-15.

195. Калабин Г.А., Каницкая JI.B., Кушеарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. М.: Химия, 2000. - 407с.

196. Зезеров Е.Г., Хрипунова И.И. Исследование тканевого дыхания растений. // Ж. Биохимия. 1961. - Т. 26, № 1. - с. 30-37.

197. Кутюрин В.М. Метод амперометрии в исследовании тканевого дыхания растений. // Журн. Аналит. химии. 1963. - Т. 23, № 6. - с. 44-36.

198. Юдина Н.В., Савельев А.В., Иванов А.А., Короткова Е.И., Ломовский О.И. Каталитические свойства механоактивированных гуминовых препаратов в процессе электровосстановления кислорода // Журнал прикладной химии, 2004, т. 77, №1, С. 48-53.

199. Трубецкой О.А., Трубецкая О.Е., Резникова О.И. и др. Гуминовые кислоты как ингибиторы радикальных процессов // Известия АН. Серия биология. 1999. - № 2. - с. 216-220

200. Орлов Д.С. Гуминовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: Изд-во МГУ, 1990. - 325 с.213. комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993.-с. 36-45.

201. Mehta А.С., Seshadri T.R. Flavonoids as antioxidants/ J. Sci. Ind. Res 1958-Vol. 18b.-P. 24-28.

202. Bors W., Heller W., Michel C., Saran M. Flavonoids as antioxidants: determination of radicalscavenging efficiencies // Methods Enzymol.— 1990 — Vol. 186.-P. 343-355.

203. Costantino L., Rastelli G., Albasini A. Inhibitory activity of flavonols towards the xanthine oxidase enzyme // Int. J. Pharmaceutics 1992 - Vol. 86 — P. 1723.

204. Chang W.S., Lee Y.J., Chiang H.C. Inhibitory effects of flavonoids on xanthine oxidase // Anticancer Res.- 1993.- Vol. 13 P. 2165-2170.

205. Cos P., Ying L., Calomme M. et al. Structure-activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers //J. Nat. Prod.- 1998.- Vol. 61- P. 71-76.

206. Cotelle N., Bernier J.L., Catteau J.P. et al. Antioxidant properties of hydroxyl-flavones // Free Radic. Biol. Med.- 1996.- Vol. 20.- P. 35-43.

207. Magnani L., Gaydou E.M., Hubaud J.C. Spectrophotometric measurement of antioxidant properties of flavones and flavonols against superoxide anion // Anal. Chim. Acta.- 2000.- Vol. 411.- P. 209-216.

208. Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M. Structure-activity relationships for antioxidant activity of a series of flavonoids in a liposomal system // Free Radic. Biol. Med.- 1998.-Vol. 24.-P. 1355-1363.

209. Kim D.O., Lee C.Y. Comprehensive study on vitamin С equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of various polyphenolics in scavenging a free radical and its structural relationship // Crit. Rev. Food Sci. Nutr.- 2004 Vol. 44,- P. 253273.

210. Lien E.J., Ren S., Bui H.H., Wang R. Quantitative structure-activity relationship analysis of phenolic antioxidants // Free Radic. Biol. Med 1999 - Vol. 26 — P. 285-294.

211. Cao G., Sofic E., Prior R.L. Antioxidant and proantioxidant behavior of flavonoids: structure-activity relationships // Free Radic. Biol. Med- 1997 — Vol. 22.- P. 749-760.

212. Decker E.A. Phenolics: prooxidants or antioxidants? // Nutr. Rev 1997 — Vol. 55.-P. 396-407.

213. Rusznyak S., Szent-Gyogyi A. Vitamin P: Flavonols as vitamins // Nature — 1936.-Vol. 138.-P.27

214. Bojilova A., Nikolova R., Ivanov C. Investigation of properties of a novel coumarin derivatives // Tetrahedron. 1996. - Vol. 52, №38. - P. 597-612

215. Nikolova R., Bojilova A. Synthesis of a novel coumarin derivative,// Tetrahedron. 1998. - Vol. 54, N 14. - P. 407-420

216. Beyer R.E. The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation // Free Radic. Biol. Med. 1990. - Vol.8. - p. 545-565

217. Beyer R.E. The analysis of the role of coenzyme Q in free radical generation and as an antioxidant // Biochem. Cell Biol. 1992.- Vol.70 - P.390-403

218. Kagan V., Serbinova E., Packer L. Antioxidant effects of ubiquinones in microsomes and mitochondria are mediated by tocopherol recycling // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1990.-Vol. 169.-P. 851-857.

219. Tomasetti M., Littarru G.P., Stocker R., Alleva R. Coenzyme QJ0 enrichment decreases oxidative DNA damage in human lymphocytes // Free Radic. Biol. Med.- 1999.-Vol. 27.-P. 1027-1032.

220. Kaikkonen J., Tuomainen T.-P., Nyyssonen K., Salonen J.T. Coenzyme Qio: Absorption, antioxidative properties, determinants, and plasma levels // Free Radic. Res.- 2002.- Vol. 36.-P. 389-397.

221. Festenstein G.N., Heaton F.W., Lowe J.S., Morton R.A. A constituent of the unsaponifiable portion of animal tissue lipids // Biochem. J 1955 - Vol.59.- P. 558-566.

222. Негреску E.B., Лебедев A.B., Балденков Г.Н. и др. Аитиоксиданты, перекисное окисление липидов и рецепторзависимое увеличение концентрации Са2+ в тромбоцитах человека // Вопросы медицинской химии.- 1992.-№1.-С.36-39.

223. Pobezhimova Т.Р., Voinikov V.K. Biochemical and physiological aspects of ubiquinone function // Membr.Cell Biol.- 2000.- Vol. 13.- P. 595-602

224. Schopfer F., Riobo N., Carreras M.C. et al. Oxidation of ubiquinol by peroxynitrite: implications for protection of mitochondria against nitrosative damage // Biochem. J.- 2000.- Vol.349.- P.35-42

225. Guo Q., Packer L. ESR studies of ascorbic acid-dependent recycling of the vitamin E homologue Trolox by coenzyme Q0 in murine skin homogenates // Redox Rep.- 1999.- Vol. 4.- P. 105-111

226. Stocker R., Bowiy V.W., Frei B. Ubiquinol-10 protects human low density lipoprotein more efficiently against lipid peroxidation than does alpa-tocopherol //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.-Vol. 88.-P. 1646-1650.

227. Tribble D.L., van den Berg J.J.M., Motchnilc P.A. et al. Oxidative susceptibility of low density lipoprotein subtractions is related to their ubiquinol-10 and a -tocopherol content // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 - Vol. 91.- P. 11831187.

228. Lonnrot K., Metsa-Ketela Т., Molnar G. et al. The effect of ascorbate and ubiquinone supplementation on plasma and CSF total antioxidant capacity // Free Radic. Biol. Med.- 1996.- Vol. 21.-P.211-217.

229. Aejmelaeus R., Metsa-Ketela Т., Laippala P. et al. Ubiquinol-10 and total peroxyl radical trapping capacity of LDL lipoproteins during ageing the effects of Q10 supplementation // Mol. Asp. Med.-1997.- Vol. 18.-P. 113-120.

230. Tappel A.L. The inhibition of hematin-catalyzed oxidations by a-tocopherol // Arch. Biochem.- 1954.-Vol.50.-P.473-485

231. Azzi A., Stocker A. Vitamin E: non-antioxidant roles // Progr. Lipid Res. -2000.- Vol.39. -P.231-255

232. Бурлакова Е.Б., Крашаков C.A., Храпова Н.Г. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов — Черноголовка, 1992 — 56с.

233. Чудинова В.В., Алексеев С.М., Захарова Е.И, Евстигнеева Р.П. Перекисное окисление липидов и механизм антиоксидантного действия витамина Е // Биоорганическая химия 1994.-№ 10 - С. 1029-1046

234. Betancor-Femandez A., SiesH.,Stahl W., Polidori М.С. In vitro antioxidant activity of 2,5,7,8-tetramethyI-2-(2 -carboxyethyl)-6-hydroxychroman (alpha-CEHC), a vitamin E metabolite // Free Radic. Res.- 2002.- Vol.36.- P.915-921.

235. Yamamoto K., Niki E. Interaction of a -tocopherol with iron: antioxidant and prooxidant effects of a-tocopherol in the oxidation of lipids in aqueousdispersion in the presence of iron // Biochim. Biophys. Acta 1988 - Vol.958-P. 19-23

236. Mariorino M., Zamburlini A., Roveri A.,(Jrsini F. Prooxidant role of vitamin E in copper induced lipid peroxidation // FEBS Lett. 1993.- Vol. 330 - P. 174176

237. Михеева E.B. Вольтамперометрическое определение витаминов в многокомпонентных сухих витаминизированных смесях. Дисс.канд.хим. наук. — Томск: Изд-во ТПУ, 2005. — 152 л.

238. Tamba М., O'Neil P. Redox reactions of thiol free radicals with the antioxidants ascorbate and chlorpromazine: Role in radioprotection // J. Chem. Soc. Perkins Trans. 2,- 1991.-Vol. 11.- P. 1681-1685.

239. Колоти лова А.И., Глушанков Е.П. Витамины (химия, биохимия и физиологическая роль).- JL: Изд-во ЛГУ, 1976 248 с.

240. Niki Е. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals // Am. J. Klin. Nutr.-1991.- Vol. 54.- P. 1119-1124.

241. Машковский М.Д. Лекарственные средства:. 14-ое изд. в 2 томах. -М.: Медицина, 2000. т. 1. - 540 с.

242. Rasmussen L., Husted S.E., Johnsen S.P. Calcium ions in medicine// Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 2003. - Vol.47. - P. 1038-1040.

243. Angelucci F., Aloe L., Vasquez P.J., Mather A.A. Role of calcium ions in pharmacology // The International Journal of Neuropsychopharmacology. -2003. -N6.-P. 225-231.

244. Чекман И.С., Горчакова H.A., Николай С.Л. Магний в медицине. -Кишинев, 1992.- 101 с.

245. Ebel Н., Gunther Т. Magnesium metabolism: a review // J. Clin. Chem. & Clin. Biochem. 1998. - v. 18. - P. 257-270.

246. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов I-IV групп: справ. / Под. ред. В.А. Филова и др. Л.: Химия, 1988. - 512с.

247. Е.И. Короткова, O.A. Аврамчик, Ю.А. Карбаинов. Изучение антиоксидантной активности и токсичности аскорбатов лития / Тез. докл. VII Всер.науч.конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», Новосибирск, 11-16 октября 2004, т.2, с. 177.

248. O.A. Avramchik, E.I. ICorotkova, E.V. Plotnikov, A.N. Lukina, Y.A. Karbainov. Antioxidant and electrochemical properties of calcium and lithium ascorbates.// J. Pharmaceutical and biomedical analysis, v.37, 2005, p. 11491154.

249. Chu Y.F., Sun J., Wu X. et al. Study of lithium compounds properties // J. Agric. Food Chem. 2002. - Vol. 50, N23. - P. 6910 - 6916.

250. Березов T.T., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, -3-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1998.-704 с.

251. Notsu Н., Tatsuma Т. and Fujishima A. Tirosinase-mofied boron-doped diamond electrodes for the determination of phenol derivatives // J.Electrohem. Chem. 2002. - Vol. 523. - P. 86-92.

252. A.S. Boev, E.I. Korotkova, A.A. Bakibaev. Voltammetric method of B6 vitamin determination. / Inter, conf. "Chemistry, Chemical engineering and

253. Biotechnology", Tomsk, 11-16 September 2006.- Book of abstracts v.2. p. 165-166.

254. A.S. Boev, E.I. Korotkova, A.A. Bakibaev. Voltammetruk method of B6 vitamin determination. / Inter. Congress on Analytical Sciences ICAS-2006. June 25-30 2006, Moscow, Russia.- Book of abstracts, Moscow, Russia, 2006. v. 1, p.277

255. Березина H.H., Николаева-Федорович H.B. Влияние органических загрязнений в воде на результаты электрохимических измерений // Электрохимия. 1967. т.З. № 2. - с.255-259.

256. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод.- М.: Химия. 1984.-353с.

257. Дамаскин Б.Б. Принципы современных методов изучения электрохимических реакций. М.: МГУ. 1965. - 104с.

258. Городовых Е.В., Семенова А.В., Стромберг А.Г. Новые исследования в полярографии. Кишинев: Штиинца. 1972. — 35с.

259. Pietta P.-G. Flavonoids as Antioxidants // Journal of Natural Products. 2000. -V.63, № 7. - P. 1035-1042.

260. Fukumoto L.R., Mazza G. Assessing Antioxidant and Prooxidant Activities of Phenolic Compounds // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000. -V.48, №8.-P. 3597-3604.

261. Burda S., Oleszek W. Antioxidant and Antiradical Activities of Flavonoids // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2001. - V.49, № 7. - P. 27742779.

262. Михайленко E.T., Радзинский B.E., Захаров K.A. Лекарственные растения в акушерстве и гинекологии. Киев.: Здоровье, 1987. - 192с.

263. Турова А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение. — М.: Медицина, 1974.-424с.

264. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск.: Наука, 1990.-327с.

265. М.С. Юсубов, Е.И. Короткова, Т.И. Андреева, Е.Н. Кохмарова. Поиск источников биоантиоксидантов во флоре Сибири. / Тез. докл. VI Международной конф. «Биоантиоксидант», 16-19 апреля, 2002г., г. Москва, с. 651-652.

266. Е.И. Короткова, О.А. Аврамчик, М.С. Юсубов, М.В. Белоусов, Т.И. Андреева. Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья методом катодной вольтамперометрии // Химико -фармацевтический журнал, т. 37, №9, 2003, с. 55-57.

267. Т.И. Андреева, Е.И. Комарова, М.С. Юсубов, Е.И. Короткова. Антиоксидантная активность коры калины обыкновенной. // Химико -фармацевтический журнал, 2004, т.38, №10. с. 26-29.

268. Иванов В.Д., Комиссаренко Н.Ф., Ладыгина Е.Я. Фракционирование экстрактов растений // Фармация. 1983. -Т.32, № 4. — С. 11-13.

269. Minica-Dukic N.M., Budincevic М.М., Mihajlovic В.А. Gasic О. Antioxidant activity of plant phenolic. Flavonoids and phenolic acids // Journal of Serbian Chemical Society. 1994. - V.59, № 11. - P. 823-828.

270. Takahama U., Youngman R.G. Elstner E.F. Transformation of quercetin by singlet oxygen generated by a photosensitized reaction // Photobiochemistry and photobiophysics. 1984. - V.7, № 3. - P. 175-181.

271. Базыкина Н.И., Николаевский A.H., Филиппенко T.A., Калоерова В.Г. Оптимизация условий экстрагирования природных антиоксидантов из растительного сырья // Химико фармацевтический журнал. - 2002. -Т.36, №2. - С.46-49.

272. Кемертелидзе Э.П., Цицишвили В.Г., Алания М.Д и др. Исследование антиоксидантных свойств некоторых экстрактов растений // Хим. природ, соед. 2000. - №1. - с. 42 - 46.

273. Шкарина Е.И., Максимова Т.В., Никулина И.Н. и др. Влияние экстрактов растений на антиоксидантную защитную систему организма // Химико -фармацевтический журнал. 2001. - т. 35, №6. - С. 40 - 47.

274. Короткова Е.И., Аврамчик О.А., Юсубов М.С., Белоусов М.В., Андреева Т. И. Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья методом катодной вольтамперометрии // Химико-фармацевтический журнал. — 2003. т. 37, №9. - с. 55-57.

275. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. 1987. - Ленинград: Наука - Т.З. - 325с.

276. Беспалов В.Г., Лимаренко А.Ю., Петров А.С. и др. // Раст. Ресурсы. — 1993. т. 3, №1. - С. 9-18.

277. Крылов Г.В. Травы жизни и их искатели. Томск: Изд-во Красное знамя, 1992.-356 с.

278. Максютина Н.П., Комисаренко Н.Ф., Прокопенко А.П. Растительные лекарственные средства. — Киев: Здоровье, 1985. — 190 с.

279. Краснов Е.А., Березовская Т.П., Алексеюк Н.В. и др. Выделение и анализ природных биологически активных веществ. — Томск: Изд-во Томского ун-та, 1987.-64с.

280. И.В. Шилова, Е.А. Краснов, Е.И. Короткова, М.Г. Нагаев, А.Н. Лукина. Антиоксидантная активность экстрактов наземной части лабазникавязолистного. II Химико фармацевтический журнал, т. 40, № 12. 2006г. с. 22-24.

281. Флора СССР / Под ред. В. Л. Комарова. М.: Наука, 1963. - Т. XXVIII. -234 с.

282. Никифоров Ю. В. Зеленая аптека Горного Алтая. Горно - Алтайск.: Изд-во ГАГУ, 1990. - 48 с.

283. Крылов Г. В., Казакова Н. Ф., Степанов Э. В. Зеленая аптека. -Кемерово: КемГУ, 1993.-120 с.

284. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейство Asteraceae (Compositae). СПб.: Слово, 1993.-450 с.

285. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронич. М.: Химия, 1983. -250с.

286. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Е. Сироткиной. Томск: Изд-во ТПУ, 1987. - 120с. .

287. Лекарственные растения (Растения-целители). Изд. 2-ое / под ред. А.Ф. Гаммерман, Г.Н. Кадаев и др. — М.: Высшая школа, 1975— 400 с.

288. Murase Н., Yamaochi R., Kato К., Kunieda Т., Terao J. Synthesis of a novel vitamin derivative, 2-(a-D-Glucopyranosyl)Methyl-2,5,7,8-TetramethylChroman-6-Ol by a-glucosidase-catalysed transglucosyglation // Lipids. 1997.- V.32, № 1. - P. 73-78.

289. Nair C.K.K., Rajagopalan R., Wani K., Huilgol N.G., Kagiya V.T., Kapoor S. Mechanism of radioprotection by TMG, a water soluble vitamin E // Journal of Radiation Research. 1999. - V.40, № 4. - P. 451.

290. Cheong N., Perrault A.R., Iliakis G. In vitro rejoining of DNA double strand breaks: a comparison of genomic-DNA with plasmid-DNA-based assays // International Journal of Radiation Biology. 1998. - V.73, № 5. - P. 481-491.

291. Rajagopalan R., Wani K., Nuilgol N.G., Kagiya T.V., Nair C.K.K. Inhibition of y-radiation indused DNA damage in plasmid pBR322 by TMG, water-soluble derivative of vitamin E // Journal of Radiation Research. 2002. -V.43,№2.-P. 153-159.

292. Kapoor S., Mucherjee Т., Kagiya T.V., Nair C.K.K. Redox reactions of tocopherol monoglucoside aqua of solutions: a plus radiolysis studies // J Journal of Radiation Research. 2002. - V.43, № 1. - P. 99-106.

293. Регистрационное удостоверение №96/316/2 «Иодантипирин». ВФС 422776-96.

294. Патент РФ 2025126 Средство для лечения и профилактики вирусного клещевого энцефалита, индуцированного в эксперименте. / Яворовская В.Е., Саратиков А.С., Федоров Ю.В., Евстропов А.Н., Соляник Р.Г., Аносова Г.В., Прищеп Т.П., Шмидт Е.В.

295. Патент РФ 2141826 Средство для профилактики и лечения клещевого энцефалита «Иодантипирин». / Саратиков А.С., Яворовская В.Е., Хоружая Т.Г., Сокерина О.А., Лепехин А.В., Портнягина Е.В.

296. Патент РФ 2190402 Противовирусное средство. / Трубачев В.И., Яблоков С.К., Рогачева О.Е.

297. Патент РФ 2175548 Средство для профилактики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций. / Саратиков А.С., Яворовская В.Е., Лепехин А.В., Помогаева А.П., Пучкова Н.Н.

298. Гриценко Л.Н. Противовирусные и иммуномодулирующие свойства производных пиразолона и салицилатов при Коксаки ВЗ- вирусной инфекции. Автореферат дисс. канд. мед. наук. Томск, 1990. — 24с.

299. Смирнов Л.Д., Дюмаев К.Н. Р-Оксипроизводные шестичленных азотистых гетероциклов, синтез, ингибирующая активность и биологические свойства (обзор). // Химико -фармацевтический журнал. -1982. -№4.-С.28 44.

300. Клебанов Г.И., Любицкий О.Б., Васильева О.В., Климов Ю.В., Пензулаева О.Б. и др. Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина. // Вопросы медицинской химии. 2001. - Т. 47, №3. - С. 288 - 300.

301. Пашин Е.Н., Шведова А.А. Влияние синтетического антиоксиданта эмоксипина на тонус коронарных сосудов. // Фармакол. и токсикол. — 1989.-№1.-С. 17-19.

302. Рудык Б.И., Сабадышин Р.А. Влияние эмоксипина на состояние перекисного окисления липидов у больных с хронической сердечной недостаточностью. // Кардиология. 1991. — №11. — С. 52 - 54.

303. Лазебник Л.Б., Фришберг A.M., Дроздов В.Н. Место антиоксиданта эмоксипина в комплексной терапии острого осложненного инфаркта миокарда. // Кардиология. 1994. - Т.34. - № 1 - 2. - С. 122 - 126.

304. Швед Н.И., Белозецкая-Смиян С.И. Коррекция эмоксипином нарушений перекисного окисления липидов у больных деформирующим остеоартрозом.//Врач. дело. 1991. - №10. - С. 101 - 103.

305. Короткова Е.И., Мамаева Е.А., Башкатова Н.В., Бакибаев А.А. Электрохимическое определение антиоксидантных свойств 1,4 — бенздиазепинов // Химико-фармацевтический журнал. 2004. - №3. - с. 52-54

306. Глущенко Н.Н. Антиоксиданты в косметике / Тез. докл. VI Междунар. конф. Биоантиоксидант. 16-19 апреля 2002. Москва — 2002. - С. 117119.

307. Короткова Е.И., Аврамчик О.А., Каморзина И.Г., Карбаинов Ю.А., Лукина А.Н. Новый вольтамперометрический метод определения антиоксидантной активности косметической продукции // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2004. - №8. - с 13-17.

308. Yamazaki Н., Yoneda Т, Yamaguchi Т. Safety assessment of food preservatives at daily intake level by platelet function // Japanese Journal of Food Chemistry. 1998. - V.5, №2. - P. 130-140.

309. Lord H., Pawliszyn J. Microextraction of drugs // Journal of Chromatography A. 2000. - V.902, № 1. - P. 17- 63.

310. Fennema O.R. Food Chemistry New York: Marcel Dekker Inc, 1996. -543 p.

311. Soni M.G., Burdock G.A., Taylor S.L., Greenberg N.A. Safety assessment of propyl paraben: a review of the published literature // Food and Chemical toxicology. 2001. - V.39, № - P. 513-532.

312. Polonen I. Preservation efficiency of sorbic acid and benzoic acid in the ensiling of slaughterhouse by-products and their subsequent metabolism in farmed fur animals, Ph.D. thesis. Helzinki, 2000. -54 p.

313. Soni M., Taylor S., Greenberg N., Burdock G. Evaluation of the health aspects of methyl paraben: a review of published literature // Food and Chemical Toxicology. 2002. - V.40, № 10. - P. 1335-1373.

314. Hansch C., Fujita T. p-o-7i Analysis. A method for the correlation of biological activity and chemical structure // Journal of the American chemical society. 1964.- V.86, №> 8. - P. 1616-1626.

315. E.I. Korotkova, O.A. Avramchik, T.M. Angelov, Y.A. Karbainov. Investigation of antioxidant activity and lipophilicity parameters of some preservatives.// Electrochim. Acta. v.51. N 2. 2005. 324-332

316. Берштейн И.Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Ленинград: Химия, 1975. — 185 с.

317. Bartoli G.M., Bartoli S., Galeotti Т., Bertoli E. Spectroptotometric study of oxygen radical species generation // Biochim. Biophys. Acta. — 2004. Vol. G20. - P.205 -211.

318. Lewin G. Popov I. Study of antioxidant properties of blood // Med. Hypotheses. 1994. - Vol. 42, N4. - P.269-275.

319. Ион-радикалы в электродных процессах. / под ред. Е.И. Хрущевой, сб. статей. М.: Наука, 1983. - 336 с.

320. Электродные процессы в растворах органических соединений: Учеб. пособие / Под ред. Б.Б. Дамаскина. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985. 312 с.

321. Китаев Ю.П., Троепольская Т.В., Будников Г.К. Промежуточные продукты в электрохимических реакциях. М.:Наука, 1982. - 216 с.

322. Томилов А.П., Майрановский С.Г., Фиошин М.Я., Смирнов В.А. Электрохимия органических соединений. JL: Химия, 1968. - 592 с.

323. Андронати С.А., Воронина Т.А. Целенаправленный поиск новых нейротропных препаратов. Рига.: Зинатне, 1983. - с. 94-109.

324. Вальдман А.В., Александровский Ю.А. Психофармакология невротических расстройств. М.: Медицина, 1987. — 287 с.

325. Кептя Э.Б., Мухин Е.А. Повышение устойчивости организма к гипероксическому стрессу диазепамом. // Стресс и адаптация. Кишинев, 1978.-С. 176- 177.

326. Ting Wu, Yueqing Guan, Jiannong Ye // Food Chemistry. 2007. - Vol. 100. -p1573-1579

327. Xueqin Xu, Lishuang Yu, Guonan Chen Flavonoids determination in electrochemical analysis // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2006. - Vol. 41. - P. 493-499

328. R. Aguilar-Sanchez, F. Ahuatl-Garcia, M.M. Davila-Jimenez, M.P. Elizalde-Gonzalez, M.R.G. Guevara-Villa Chromatographic analysis of flavonoids // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005. - Vol. 38. — P. 239-249

329. Yamamoto Y., Yamashita S. Plasma ratio of ubiquinol and ubiquinone as a marker of oxidative stress.- 1997.- V. 18, №S1- P. 79-84.

330. Gamache P.H., Acworth I.N. Simultaneous analysis of fat soluble carotenoids, retinoids, tocopherols, vitamin К and coenzyme Qi0 in plasma // Northeast Regional Chromatography Discussion Group 1998 - Book of Abstr. - P. 6.

331. Будников Г.К., Улахович H.A., Медянцева Н.П. Основы электроаналитической химии. Казань: Изд-во Казанского ун-та, 1986. -288с

332. Квантово-химические расчеты в органической химии и молекулярной спектроскопии / под ред. К.Я. Бурштейн, П.П. Шорыгин. М.: Наука, 1989.- 104 с.

333. Фларри Р. Квантовая химия. Введение: Пер. с англ. М.: Мир, 1985. -472 с.

334. Marco Nonella. A quantum chemical investigation of structures, vibrational spectra and electron affinities of the radicals of quinone model compounds. // Photosynthesis Research 1998. - Vol. 55. - p. 253-259.

335. Ambrose James F., Carpenter Lawrence L., Nelson Robert F. Electrochemical and spectroscopic properties of cation radicals. // J. Electrochem. Soc. 1975. -Vol. 122.-p. 876-894.

336. Тихомиров B.A., Герман Э.Д. Расчеты методом MNDO поверхностей потенциальной энергии распада анион-радикалов 1,2-дифтор- и 1,2-дииодэтанов. // Электрохимия. — 1993. — Т. 29, №5. — С. 622 — 625.

337. Минкин В.И., Симкин Б.Я., Миняев P.M. Квантовая химия органических соединений. Механизмы реакций. -М.: Химия, 1986. 248 с.

338. Филимонов В.Д., Сироткина Е.Е. Химия мономеров на основе карбазола. Новосибирск.: Наука, 1995. - 400 с.

339. N.V. Bashkatova, E.I. Korotkova, Yu.A. Karbainov, A.Yu. Yagovkin, A.A. Bakibaev. Electrochemical, quantum- chemical and antioxidant properties of antipyrine and its derivatives. // J. Pharmaceutical and biomedical analysis, v.37, 2005, p. 1143-1147.

340. Schepetkin I., Potapov A., Khlebnikov A., Korotkova E., Lukina A., Malovichko G., Kirpotina L., Quinn MT. Decomposition of reactive oxygen species by copper(II) bis(l-pyrazolyl)methane complexes. // J Biol Inorg Chem. -2006. v. 11, N 4. - p. 499-513.

341. E. I. Korotkova, Yu. A. Karbainov, A. V. Shevchuk. Study of antioxidant properties by voltammetry. //J. Electroanal. Chem. 2002. V. 508. № 1. 56-60.