Разработка метода инверсионно-вольтамперометрического титрования для определения тиольных, дисульфидных групп и сульфидной серы в природных водах и биожидкостях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
|
Скиба, Татьяна Васильевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Новосибирск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2012
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
СКИБА Татьяна Васильевна
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ТИТРОВАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЛЬНЫХ, ДИСУЛЬФИДНЫХ ГРУПП И СУЛЬФИДНОЙ СЕРЫ В ПРИРОДНЫХ ВОДАХ И БИОЖИДКОСТЯХ
02.00.02 - аналитическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
6 ДЕК 2012
Новосибирск - 2012
005056810
005056810
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН
Научный руководитель кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Захарчук Нина Федоровна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор, зав. лабораторией Стожко Наталья Юрьевна ФГБОУ ВПО «Уральский государственный экономический университет»
г. Екатеринбург
кандидат химических наук, научный сотрудник Александрова Татьяна Павловна ФГБУН Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН г. Новосибирск
Ведущая организация ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»
Защита состоится «19» декабря 2012 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 003.051.01 в ФГБУН Институте неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН по адресу: просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН Института неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН
Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор физико-математических наук
ß
'."Л. Надолинный
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Окислительный стресс - это нарушение в организме баланса между прооксидантами и компонентами системы антиокси-дантной защиты (АОС). Защитные свойства относительно окислителей и активных радикалов проявляют, прежде всего, тиолы (ЛвН). Являясь физиологическим показателем активности внутриклеточной системы защиты от действия реактивного кислорода, и благодаря их способности подвергаться окислительно-восстановительным превращениям (2Я8Н <-» ЯБЗЯ + 2Н* + 2е" - тиолдисульфидный статус), они могут быть использованы для непосредственной диагностики антиоксидантного статуса организма. Соотношение восстановленной (-БН) и окисленной (-ББ-) форм тиоловых антиоксидантов в крови отражает степень повреждающего воздействия окислительного стресса и может служить для совершенствования диагностики заболеваний, прогнозирования их исхода, и оценки лечебных и профилактических средств. Сероводород и его растворимые соли - сульфиды издавна известны, как чрезвычайно токсичные соединения, оказывающие губительное влияние на состояние экосистем и жизнедеятельность населяющих ее организмов, включая человека. В зависимости от объекта и продолжительности воздействия диапазон токсичности может варьироваться в широких пределах. В то же время все чаще появляются сведения биологов и биохимиков о том, что отравления сероводородом можно получить не только в случае прямого контакта с отравляющим веществом, но и в результате сероводородной аутоинтоксикации, обусловленной неправильным пищеварением, курением, протеканием воспалительных процессов и т.д. Обсуждается также положительная роль сероводорода в биохимических процессах при низких (<10"9 моль дм"3) уровнях концентраций. Поэтому очень важной становится проблема контроля над состоянием тиолдисульфидного звена АОС и сульфидной серы, в идеальном случае - в клиниках, поскольку является залогом успешной диагностики и терапевтической коррекции при патологиях различного вида. В последнее десятилетие наблюдается «взрыв» в количестве публикаций, посвященных развитию различных физико-химических методов для исследования тиолов в биологических объектах и оценки уровней токсичного и биологически значимого воздействия сероводорода на живой организм. Однако многие из описанных методов либо не доведены до уровня конкретных методик анализа биологических объектов, либо трудоемки и малодоступны из-за высокой стоимости анализа и требований к квалификации работников, что препятствует их внедрению в широкую клиническую практику. Кроме того, во всех упомянутых в литературе методах искомую концентрацию определяют относительно концентрации образцов сравнения (ОС) ЛБН или сульфидной серы, которые из-за высокой летучести и способности легко окисляться кислородом воздуха, приходится готовить и проверять их титр трудоемкими классическими методами каждые три часа. Из-за нарушения
этого правила результаты измерений существующими методами часто несопоставимы друг с другом, что нарушает их интерпретацию. Поэтому поиск нового подхода к разработке способов определения тиолов, дисульфидов и сульфидной серы в водных и биологических средах и установки титра ОС, отличающегося высокой чувствительностью, точностью и экспрессностью, пригодного для использования, как в специализированных лабораториях, так и небольших клиниках, является весьма актуальной задачей.
Цель работы: развитие нового электрохимического метода - инверси-онно-вольтамперометрическое титрование (ИВТ) для определения органических тиолов, дисульфидов, растворимых сульфидов и разработки экспрессных, высокоточных и высокочувствительных методик исследования тиолди-сульфидного статуса (ТДС) цельной крови и ее фракций и определения сульфидной серы в водных и биологических средах.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
- разработать основные принципы инверсионно-вольтамперометрического титрования до точки эквивалентности (ИВТ-1), с регистрацией всего двух (ИВТ-2) и трех (ИВТ-3) точек;
- исследовать электрохимическое поведение солей меди, свинца, кадмия, ртути и серебра в условиях образования их тиолятов;
- исследовать инверсионно-вольтамперометрическое поведение серебра в зависимости от природы электрода и состава фонового электролита в условиях титрования А§Ж)3 тиолами и сульфидами;
- разработать ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 методики определения низкомолекулярных тиолов и дисульфидов в цельной крови и её фракциях;
- исследовать ТДС крови и её фракций методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 в норме, при различных патологиях, до и после медикаментозной терапии;
- разработать высокочувствительные методики определения растворимых сульфидов в воде и слюне человека;
- разработать методики для экспрессного и высокоточного контроля титра нестабильных ОС органических тиолов, неорганических сульфидов и азотнокислого серебра.
Научная новизна работы.
1. Впервые инверсионно-вольтамперометрический (ИВ) сигнал использован в качестве аналитического в условиях титрования и разработаны основные принципы нового электрохимического метода анализа - инверсионно-вольтамперометрическое титрование.
2. Впервые предложен способ и расчетные уравнения для обратного титрования с регистрацией всего трех точек на кривой титрования - ИВТ-3.
3. Впервые предложен способ и расчетные уравнения для непосредственного определения искомой концентрации, основанный на определении доли электроактивного компонента, вступившей во взаимодействие с искомым компонентом реакции с учетом фактора эквивалентности - ИВТ-2.
4. Впервые разработаны простые альтернативные друг другу ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 способы исследования ТДС цельной крови и её фракций, не требующие предварительного отделения матрицы и разделения определяемых компонентов.
5. Разработана высокочувствительная методика определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах и слюне с пределами обнаружения <5-10"'° моль-дм"3. Впервые предложено проводить анализ слюны с целью диагностики процессов сероводородной аутоинтоксикации организма.
6. Предложен новый, альтернативный классическому титрованию экспрессный (<3 мин.) и высокоточный (Sr < 1.5%) ИВТ-2 способ установки титра органических тиолов, неорганических сульфидов и азотнокислого серебра.
Практическая значимость. Исследование в динамике ТДС методами ИВТ в комплексе с показателями процесса перекисного окисления липидов при кардиохирургических вмешательствах позволяет обнаружить наиболее опасную стадию операции и может служить диагностически значимым показателем про- и антиоксидантного равновесия в экстремальных условиях (НИИ патологии кровообращения им. E.H. Мешапкина, Новосибирск). ИВТ способы исследования ТДС использованы для оценки адаптационных резервов организма и их искусственной коррекции, для диагностики и прогнозирования заболеваний, выявления хронических патологий, для неспецифической профилактики и терапии. Исследована эффективность действия биологических добавок в реабилитации больных с онкологическими заболеваниями крови (Центральная клиническая больница СО РАН).
Разработанные методики определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах и слюне характеризуются высокой чувствительностью и хорошими метрологическими параметрами. Это создает перспективу для их широкого внедрения в областях экологического и биологического мониторинга объектов с суб-микромолярным содержанием сульфидов. На защиту выносятся следующие положения:
■ обоснование выбора ИВ-сигнала в качестве аналитического в условиях титрования;
■ результаты исследований по оптимизации условий регистрации ИВ-сигнала серебра в качестве аналитического в условиях титрования AgN03 тиолами и сульфидами;
■ расчетные уравнения экспрессных методов титрования ИВТ-2 и ИВТ-3 для нахождения концентрации определяемых веществ;
■ результаты исследований стехиометрии протекания изучаемых реакций в растворе;
■ методики и результаты исследования ТДС в цельной крови и ее фракциях в норме и при различных заболеваниях;
■ методики определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах, слюне;
■ методики контроля титра нестабильных ОС органических тиолов, неорганических сульфидов и азотнокислого серебра.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на семи конференциях: IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006); XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2007); VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2007); VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2008» (Уфа-Абзаково, 2008); VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008); Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва-Клязьма, 2010); IX научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2012).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ - 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных научных журналах и 7 тезисов докладов.
Работа является частью исследований, проводимых в аналитической лаборатории ИНХ СО РАН в рамках решения задач, обозначенных в проекте МНТЦ № 2132 «Sensors and instruments for évaluation of the microelemental and immune status of organisms», a также в интеграционном проекте №6 СО РАН «Молекулярные механизмы функционирования защитно-репарационных систем человека; разработка дифференциальных комплексных методов диагностики и терапии заболеваний с аутоиммунными, онкологическими патологиями».
Личное участие автора состоит в анализе литературных данных, проведении экспериментальной работы для решения поставленных задач, систематизации, обобщении и интерпретации полученных результатов. Подготовка материалов для публикаций проводилась совместно с научным руководителем и соавторами.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка цитируемой литературы из 188 наименований. Содержит 150 страниц текста, 42 рисунка и 22 таблицы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследований, сформулирована научная новизна, практическая значимость работы и положения, выносимые на защиту.
В первой части литературного обзора (глава I) обсуждены работы, посвященные проблемам биологической и клинической значимости тиоло-вых соединений, их роли в механизмах антиоксидантой системы защиты организма от окислительного стресса. Представлен обзор работ,
посвященный методам определения тиольных и дисульфидных групп, входящих в состав различных биотиолов. Дано обоснование разработки нового доступного для любой клинической лаборатории метода исследования ключевого звена АОС - тиолдисульфидного статуса живой клетки. Вторая часть литературного обзора посвящена роли сероводорода и растворимых сульфидов, токсичной и биологически значимой. Дан обзор способов их определения в водных и биообъектах. Показано, что чувствительность существующих физико-химических методов недостаточна для определения сульфидной серы в особо чистой воде (< 5-Ю"9 моль-дм"3) и, соответственно, в важном биообъекте-индикаторе аутоинтоксикации организма - слюне.
В главе II изложены предпосылки к созданию метода ИВТ, описаны его основные принципы и расчетные уравнения.
Суть предлагаемого в диссертации метода ИВТ заключается в измерении вольтамперометрического инверсионного максимума тока (1т) в условиях титрования вместо амперометрического диффузионного тока (/</). Возникший на основе двух электрохимических методов (инверсионной вольтамперомет-рии и амперометрического титрования - АТ) метод ИВТ объединил достоинства обоих методов, исключив их недостатки, и представляет собой абсолютно независимый метод с уникальными свойствами и принципиально новыми возможностями. С одной стороны - это простой, надежный, высокочувствительный, экспрессный метод измерения теоретически обоснованного аналитического сигнала (/„) с использованием современного компактного и недорогого оборудования. С другой стороны, возможность определения огромного круга веществ, как электрохимически активных, так и не способных к обмену электронами. Процедура титрования до точки эквивалентности и способы расчета не отличаются от таковых для метода АТ. Но, благодаря свойствам ИВ-сигнала, обусловленного протеканием единственной электродной реакции Ох ± е" <-» Лес! со 100% выходом по току, отпадает необходимость определять точку эквивалентности графически. Достаточно рассчитать уравнение регрессии. Кроме того, имеется возможность количественно связать величину тока с концентрациями, как титранта, так и аналита в растворе. Это позволяет исключить процедуру титрования до точки эквивалентности и получать информацию о концентрации искомого компонента с регистрацией всего 3-х (ИВТ-3) и даже 2-х (ИВТ-2) точек. Как и в методе АТ, для ИВТ могут быть использованы самые разнообразные химические реакции. Идеально подходят реакции комплексообразования и осаждения:
пМе" + тВу- -> Мепх'В„>- (1)
Метод ИВТ-3 идентичен методу косвенной инверсионной вольтампе-рометрии с элементами титрования. В качестве титранта выступает компонент реакции 1 - Мех'. Определяемым веществом (5) является Ву~. Измеряется максимум инверсионного тока Мехл, взятого в избытке, до (/о), и после (//) введения пробы и стандартной добавки (12) в раствор определяемого
вещества. Если Уяч» Упр и Уяч» Уа, расчет концентрации в анализируемой пробе основывается на следующих предпосылках: А = кСИеУш (2), =кс„ у„ -к-С.У. <3)
- к-с:sv,
т
Urv-küc.v. (4).
/2 — кСшУш к CSVS к CdVc т т
Из соотношений 2-4 следует: /0 -Л _Cs-Vs = QS (5)
Cä-Vd Qd
откуда следует: с = & 5г, (6)
s V S
где УМе и СМе - объём и концентрация стандартного раствора реагента Мех+ в нем; Vs и Cs - объём анализируемой пробы и искомая концентрация анали-та в нем; Vd и Q - объём добавки стандартного раствора искомого вещества и его концентрация; Qj выражает количество вещества, содержащегося в стандартной добавке; к — коэффициент пропорциональности, V// и Sj = Irh - абсолютное снижение сигналов, обусловленное введением в анализируемый раствор пробы и добавки, соответственно.
Метод ИВТ-2. Основная идея непосредственного количественного определения веществ путем вольтамперометрического титрования по двум точкам состоит в нахождении избытка Ме**, стехиометрично взаимодействующего с В^ в соответствии с реакцией 1. Возможны два варианта ИВТ-2 анализа.
1. Определяемым (S) является Ву~, а в качестве титранта выступает Ме' . В этом случае для расчета искомой концентрации требуется лишь часть экспериментальных данных, описанных для метода ИВТ-3, а именно: максимальный инверсионный ток (аналитический сигнал - АС) Мех\ взятого в избытке, до (10) и после (/,) введения в ячейку аликвоты пробы. Тогда справедливым является уравнение:
А_/.-Л _ "Cs-Vs _aQs (7)
'о mCil,-VM, Qu,
где Д — относительное снижение АС может служить мерой для непосредственной оценки количества аналита пробы (QKs = Qs), вступившего во взаимодействие с заданным количеством титранта {СмеУш = блл) в ходе химической реакции 1 в растворе. Отсюда концентрацию анализируемой пробы можно рассчитать, пользуясь уравнением:
С (8)
где а— фактор эквивалентности, равный отношению n/m.
Как видно из расчетных уравнений 6 и 8, методы ИВТ-3 и ИВТ-2 являются альтернативными друг другу и могут быть использованы для проверки правильности полученных результатов.
В случае анализа проб с концентрацией <10"8 моль-дм"3 (V„p~ Vm), чтобы избежать учета разбавления пробы, предлагается альтернативный алгоритм (1а) процедуры ИВТ-2 анализа. В электролитическую ячейку совместно с аликвотой пробы Vs вводят строго контролируемое количество титранта Mexi (CMeVj), и измеряют ИВ-сигнал, обусловленный его остатком в растворе после реакции с определяемым веществом (10). Затем в ячейку вносят в качестве добавки вторую порцию (CMVKlt2) титранта и вновь измеряют
его ИВ-сигнал (//). В этом случае расчет искомой концентрации в анализируемой пробе Cj основывается на следующих предпосылках: h = k(CUtV¡,e -aCsVs) (9), /, = k(CMeV^ ~aCsVs + CMeV'Me) (10)
д _ /, - /„ _ C„, ■ Vi (1 a _ CKh(kVl - V^) (12)
lo Cile-V¡ü-aCs-Vs s aW,
Здесь Д - относительное повышение ИВ-сигнала Me ' на добавку.
2. Если определяемым компонентом (5) реакции 1 является Мех+, а в качестве титранта выступает вещество EF. В этом случае в электролитическую ячейку сначала вводят строго контролируемое количество титранта (УВСВ), добавляют первую порцию (FS'CS) анализируемой пробы в полтора-два раза большую, чем введенное количество ИГ и после тщательного перемешивания раствора измеряют АС (10) избыточного количества искомого вещества Ме"+. Затем в ячейку вводят вторую порцию (F*C?) анализируемой
пробы в полтора-два раза меньше, чем V¡CS, и опять измеряют
ИВ-сигнал Ме ' (/,). Его искомую концентрацию рассчитывают с помощью формул, основанных на следующих предпосылках:
I0=k{V¡Cs-aVBCB) (13), /, = k(V¡Cs-aVBCB+V¡Cs) (14)
/,-/„ =VS2CS (15), A_/,-/„ CSV¡ (16).
h CSVS —ceCgVß
Откуда c _ «AC,VB (17)
При исследовании модельных растворов с известными концентрациями и аликвотами растворов Ме"+ и Ву\ пользуясь уравнениями 7, 11 и 16, легко предварительно рассчитать значения АраСЧ и сравнить их с экспериментально полученными (Дзкс„) путем исследования зависимости А = flCsVs = Qs)- Эта же зависимость может служить источником информации при исследовании полноты и скорости реакции 1. Результаты достоверны, если Аэксп - АраСЧ.
В главе III представлены данные об используемых материалах, оборудовании и объектах исследования. Описаны процедуры приготовления модельных образцов и проб для анализа.
В главе IV обсуждены подходы к разработке методик ИВТ для определения тиольных и дисульфидных групп. Представлены алгоритмы анализа
9
цельной крови и ее фракций и результаты исследования ТДС в норме и при различных заболеваниях.
Известно, что тиолы легко связываются с ионами различных металлов (Ме'+) с образованием устойчивых меркаптидов состава Ме[8-11]х. А это значит, что теоретически соль этих металлов может быть использована в качестве титранта при определении тиолов. Для выбора сигнал образующего реагента исследовали ИВ-поведение меди, свинца, кадмия, ртути и серебра в отсутствии и в присутствии сульфгидрильных групп в растворе аммиачного буфера, в котором происходит наиболее полная диссоциация тиольных соединений. Наиболее надежные результаты получили при использовании ИВ-сигналов кадмия, ртути, серебра. Однако растворы солей ртути исключили из-за их токсичности и медленной стабилизации АС в отсутствии тиолов, соли кадмия из-за необходимости применения ртугно-графитовых электродов и замедленной скорости реакции с тиолами. Кроме того, соли этих металлов образуют прочные комплексы с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) - основного антикоагулянта крови в медицинской практике. В качестве сигнал образующего реагента идеальным оказался раствор азотнокислого серебра. С растворами тиолов AgNOз реагирует немедленно. ИВ-сигнал серебра стабилизируется после первой же его регистрации независимо от используемого рабочего электрода (Р1 или СС-стеклоуглеродный), характеризуется отличной сходимостью. ЭДТА не образует прочного комплекса с А£+ и не изменяет характер ИВ-сигнала.
Для обоснования правомерности использования ИВ-сигнала серебра в качестве аналитического при титровании тиолов раствором А§ЫОз изучили его поведение на Р1 электроде (8 = 2 мм2) в растворе аммиачного буфера (фон № 1) и аммиачного буфера, содержащего от 0.005 до 1.0 моль-дм"3 Ыа280з (фон № 2) в отсутствии и в присутствии органических тиолов и дисульфидов (рис. 1 и 2). На фоне № 1 окисление накопленного на поверхности электрода серебра протекает обратимо = 0.031) (рис. 1а). Круто восходящая
ветвь «псевдополярограммы» (рис. 16-1) также подтверждает обратимый характер электродного процесса. Очевидно, предельный ток уменьшается из-за взаимодействия Ag+ с тиолами, присутствующими в крови (рис. 16-2). Величина сигнала с достоверностью аппроксимации >0.99 прямо пропорционально зависит от количества А§ЫОэ в растворе (рис. 1с-1) и времени электролиза (табл. 1). Дисульфиды не взаимодействуют с ионами А§+ (рис. 1с-1). Присутствие в растворе цельной крови не нарушает кинетику процесса. Параметр йЕ^'й^и остается прежним. Приведенные факты весьма важны, поскольку позволяют в дальнейшем развить метод анализа такого сложного объекта, как цельная кровь. В присутствии Ыа2803 (фон Лг°2) растворение осадка серебра протекает квазиобратимо. Параметр (1Е„/с1^и= 0.040 (табл. 1). ИВ-сигнал сдвигается к отрицательным значениям потенциала, его величина уменьшается по мере добавления в раствор сульфита натрия (калия) и дости-
гает плато в интервале концентраций Ыа2БОз в ячейке от 0.01 до 0.10 моль-дм'3. Тем не менее, зависимость 1т - СА^0з остается прямо пропорциональной (рис. 1с-2). Оптимальная концентрация №2503 в ячейке находится в диапазоне от 0.04 до 0.08 моль-дм'3, достаточном для полного и быстрого завершения реакции восстановительного расщепления дисуль-фидных групп в сульфидрильные:
К-ЗБ-Я + ИазБОз + Н20 гЯБН + Иа^ (18)
0,26 03 0-25
о я 0.22
£■„ = 0.031 1^ + 0.12 Я2 = 0.9976
2.0 2.2 2.« 2,6 2,8 3,0
мВс"1
0,2 0.0 -0,2 -0,4 -О.в -О.в
Ет, В
0.2 0.4 О.в
QAgy цмоль
Рис. 1. Зависимости потенциала максимума ИВ-тока серебра от логарифма скорости развертки потенциала (а), величины максимума ИВ-тока серебра от потенциала электролиза в отсутствии (1) и в присутствии (2) 0.005 мл цельной крови (б), от количества А^Оз в ячейке:», о-в отсутствии и в присутствии 0.5 цмоль вЗЯС, соответственно (с). Условия эксперимента: фон - аммиачный буфер (а, б, с-1), аммиачный буфер + 0.08 моль-дм"' КагБО, (с-2), = 0.4 цмоль (а, б), и = 250 мВ-с1 (б, с), и = 30 с, Е, = -0.5 В (а, с)
С тиолами азотнокислое серебро реагирует в эквимолярном соотношении: А§>Ю3 + ЯБН = + НЫ03 (19)
Фактор эквивалентности равен 1. Максимум ИВ-тока серебра (рис. 2а) линейно снижается при введении в ячейку ЯБН и с достоверностью аппроксимации >0.99 подчиняется уравнению регрессии 1т = -67.6 + 33.7 (рис. 2а). Рассчитанное из этого уравнения количество ИЗН (0.502 цмоль) с погрешность < 0.2% соответствует введенному в зону химической реакции количеству тиолов. Значения 5 (рис. 2а) и А (рис. 26) с достоверностью аппроксимации >0.99 прямо пропорционально зависят от количества ЯБН в растворе. Экспериментальные значения Д (Л2 >0.99) соответствуют предварительно рассчитанным значениям QвsнlQAg■ Все эти экспериментальные факты подтверждают правомерность использования ИВ-сигнала серебра в качестве аналитического в процессе титрования органических тиолов солями серебра любым из трех методов ИВТ-1, ИВТ-2 или ИВТ-3.
Суммированные результаты выше названных исследований представлены в табл. 1.
Таблица1
Коэффициенты уравнения регрессии Y=aX±b для зависимостей Ет =J{lS и)< 1т =ЛОлгтЛ) и Д =AQrsh) (п = 6, Р = 0.95)
Уравнение регрессии Y=aX±b Фон a b R2 Диапазон линейности
E„ = algu±b 1 0.031±0.01 0.15+0.02 0.9994 100ч-800
2 0.04010.02 0.09Ю.005 0.9980 (мВс1)
/„, = aQ.Afsoift,±b 1 2.84+0.07 -0.0710.003 0.9978 0.01+0.50
2 2.21±0.06 -0.05Ю.003 0.9975 (цмоль)
Д = aQusH ±b 1 2.02+0.03 0.01+0.002 0.9992 0.02-И .0
2 1.98+0.04 -0.02M.001 0.9984 (цмоль)
1 - Аммиачный буфер; 2 - Аммиачный буфер + 0.0В мольдм" Ыа25(Х Условия экспериментов, как на рис. 2
Рис. 2. ИВ-кривые серебра на фоне № 1 (а) и зависимость относительного снижения (Д) аналитического сигнала /„, от количества БН-групп в растворе (б). Раствор содержит: фон + 0.5 цмоль AgNO^ (1) + х цмоль БН-групп в форме
смеси 05Н+С5Н последовательно, л = 0.05 (2), 0.125 (3), 0.20 (4), 0.25 (5)
0.35 (6), 0.40 (7). Расчетные (о) и экспериментальные (•) данные. Условия эксперимента: Е, = -0.50 В, и = 30 с, и = 250 мВ с"1
Что особенно важно, в присутствии цельной крови (рис. За, б) или любой ее фракции в растворе коэффициенты уравнения регрессии не изменяются. Прирост Ash (точки о и •), соответствующий стандартным добавкам SH-групп (рис. Зс-З), также практически равен расчетным (о) значениям. Более того, уравнение регрессии Д¡н = 2.02QSH + 0.01 (R2 = 0.9969) с погрешностью не более 1% соответствует уравнениям регрессии, полученным для модельных растворов (рис. 26 и табл. 1). При этом значения Д5н не зависят от того, присутствует или отсутствует в электролите Na2S03. То же самое наблюдается при исследовании плазмы, эритроцитарной массы или сыворотки крови. Это значит, что матрица крови не изменяет кинетику реакции 19 и стехиометрия не нарушается в присутствии вышеупомянутых биологических жидкостей.
Модельные растворы для исследования представляли собою физиологический раствор (0.5 % NaCl) смеси RSH и RSSR, содержащий имитатор микроэлементного состава крови (0.04 моль-дм"3 К+, 1.5 ммоль-дм"3 Са2+, 1.6 ммоль-дм"3 Mg2+, 0.11 ммоль-дм"3 Zn2+, 8.0 ммоль-дм'3 Fe3+, 15.7 цмоль-дм"3 Си2+, 1.0 цмоль-дм"3 РЬ2+, 0.05 цмоль-дм"3 Hg2+, Cd2+) и антикоагулянт
(5.9 ммоль-дм'3 ЭДТА или 0.4% глюгицир - молярная смесь 1:2 натрия
Рис. 3. ИВ-кривые серебра на фоне № 1 (а) и № 2 (б). Растворы содержат: а) - фон + 0.50 рмоль AgNOj + 0 01 мл цельной крови + 0.11 и 0.22 цмоль GSH, последовательно; 6) - фон + 0.50 цмоль AgN03 + 0.01 мл цельной крови + 0.05,0.10 и 0.15 (.смоль GSH, последовательно, с) - Кривые титрования для определения RSH (1) и суммы RSH (2), т.е. нативных тиолов крови
плюс образовавшихся вследствие восстановительного расщепления RSSR. Зависимость относительного понижения максимума инверсионного тока серебра от стандартных количеств SH-групп в растворе (Дот = А, - А„р) (3). Расчетные (□) и экспериментальные (о, •) значения As».
Условия эксперимента: Е, = -0.50 В, I, = 30 с, и= 300 мВ-с"'.
Рис. 4. ИВ-кривые серебра, полученные в случае исследования ТДС модельного образца, содержащего 10.0
ммоль-дм'3 GSH и 2.5 ммоль-дм"' GSSG методами прямого и обратного ИВТ-1. Растворы содержат: а) Фон № 1 + 0.01 мл пробы (1) + х цмоль AgNOj последовательно; х = 0.12 (2), 0.15 (3), 0.20(4) и 0.25 (5). б) Фон № 2 + 0.5 цмоль AgN03 + 0.01 мл пробы (1) + дг мл GSH. * = 0.10 (2), 0.20 (3), 0.30 (4) и 0.33 (5). Условия эксперимента: Е, = -0.5 В, г, = 30 с, о =300 мВс'
На рис. 4 показан пример анализа модельного раствора, содержащего тиолы и дисульфиды в концентрации 10.0 GSH + 2.5 GSSG ммоль-дм"3 методом ИВТ-1. Здесь процедура анализа и расчетные уравнения не отличаются от хода анализа, предложенного В.В. Соколовским для определения ТДС методом АТ. Но поскольку в предлагаемом методе имеется возможность контролировать и вычитать величину остаточных токов, отпадает необходимость графически определять точку эквивалентности. Достаточно рассчитать уравнение регрессии. Сначала на фоне № 1 титруют сульфгидрильные группы пробы контрольным раствором AgN03 (рис. 4а). Во второй аликвоте пробы на фоне № 2 титруют дисульфиды в виде RSH (рис. 46). В этом случае
предпочтительно использовать обратное титрование, так как возникающие при разрыве дисульфидных связей БН-группы, склонные к реоксидации кислородом воздуха, немедленно осаждаются избытком ионов серебра. Оставшееся свободным количество AgNOз оттитровывают контрольным раствором любого НЗН. Количество ЯБН, израсходованное на титрование избыточного количества АдИОз, находят с помощью уравнения регрессии без построения кривой титрования. Таким образом, определяется сумма, состоящая из нативных и образованных вследствие реакции 18 ЯБН: о -о ■
Концентрацию дисульфидных групп находят по разности между суммарной концентрацией и определенной в ходе прямого титрования: „
— 2
где £)А!,- количество (цмоль) А§М03, введенное в ячейку; Qцsff — контрольное количество ЯБН (ОБН, СБН или АСБН), израсходованное на титрование избытка А§Ы03; Упр - объём пробы, взятой для анализа. Найденные концентрации ОБН (10.2) и ОББв (2.45) ммоль-дм'3 в исследуемом модельном образце с погрешностью не более 2 °/о соответствуют заданным. Именно применение ИВ-сигнала в качестве аналитического в условиях титрования позволяет использовать методы ИВТ-2 и ИВТ-3 для определения искомых концентраций. Рис. 5 и данные табл. 2 демонстрируют правомерность использования всех трех, предложенных в работе методов для определения тиолов и дисульфидов. Даже в одном эксперименте с регистрацией всего четырех точек титрования можно получить альтернативные результаты для оценки их правильности, поскольку количества разных ОС используются для нахождения искомой концентрации (уравнение 6 и 8). Для расчета искомой концентрации в методе обратного ИВТ используются контрольные количества обоих участников реакции в растворе (С„р = ()Ах - (¿[^н/Упр)- Но ИВТ-2 метод имеет ряд преимуществ: отпадает необходимость приготовления стандартных растворов ЯБН через каждые три-четыре часа, что приводит к существенному упрощению и ускорению анализа. Появление систематических расхождений между результатами, полученными методами ИВТ-2 и ИВТ-3, как правило, свидетельствует об изменении концентрации контрольного раствора ИЗН и необходимости его корректировки.
К сожалению, на результаты определения С^н ИВТ-2 способом в некоторых случаях, особенно при наличии патологий, влияет реоксидация БН-групп в момент их образования. При определении БН- и -БЗ-групп в одной пробе (рис. 6), когда избыточный объем раствора соли серебра в стадии определения 58-групп вносят в реакционную смесь не однократно, а отдельными порциями в процессе анализа, такое явление не наблюдается для любых проб крови. При этом такой способ (мы его назвали комбинированным ИВТ - КИВТ) значительно упрощает процедуру анализа, экономит время и особенно необходим, если биологический материал для исследования имеется в малых количествах
Таблица2
Сравнительные результаты и метрологические характеристики, полученные при исследовании ТДС модельных образцов (1,2,3) и цельной крови (4) методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 одновременно (п = 6, Р = 0.95)
Проба Результат, Сх±сг (ммоль дм'3)
ИВТ-1 ИВТ-2 ИВТ-3
ЯБН ЯБН ИЗБ!*. ЯБН
1 10.3+0.2 2.45±0.06 9.9Ю.14 2.51±0.03 14.9±0.5 14.9М.5
2 7.48+0.10 2.41+0.05 7.50±0.09 2.51±0.03 7.5410.12 7.54+0.12
3 14.6±0.48 4.98+0.15 15.2±0.35 4.99±0.09 14.8±0.53 14.8±0.53
4 16.8±0.46 5.42+0.13 16.9±0.39 5.47+0.14 16.7±0.42 16.7±0.42
Заданный состав (ммольдм"') модельных образцов: 10.0 СБН + 2.5 СЭ50 (1); 7.5 вБН + 2.5 СББС (2); 10 0 СБН+ 5.0 ОБИ + 5.0 ОББв (3). Цельная кровь от здорового донора 45 лет (4).
ОI 0.1 о ? Е.
■ * ¡/Аи
~ Я;/
-О 298,-1.99
0 О 01
Рис. 5. Определение сульфгидрильных групп крови (а) и ТДС модельного образца, содержащего 10.0 СБН + 2.5 ОЯЭО ммоль дм"3 (б и с) методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 одновременно.
Растворы содержат:
а) - фон № 1 + 0.5 цмоль А£Ш3 (1о) + 0.01 мл пробы (/,) + 0.15 (/,) + 0.25 (/,) цмоль вБИ;
б) - фон № 1 + 0.5 цмоль AgNOз (1а) + 0.02 мл пробы (/,) + 0.10 (12) + 0.20 (1з) цмоль СБН; с) - фон №2 + 0.5 цмоль А§Ш, (!„) + 0.01 мл пробы (/,) + 0.075 (12) + 0.15 Цз) цмоль вБИ
(кровь из пальца). На рис. 6 приведён пример реализации предложенного алгоритма анализа. Здесь сначала методом прямого титрования или ИВТ-2 (рис. 6а) определяют количество Л§М03, израсходованное на взаимодействие с БН-группами в первой стадии анализа а^СА!) А„р, эквивалентное количеству БН-групп в аликвоте пробы, и рассчитывают концентрацию нативных БН-групп в пробе с помощью уравнения О1^ Апр/ Упр. Затем, не прерывая перемешивания раствора, вносят в ячейку дополнительную порцию раствора А§МОэ и сульфит натрия. Рассчитывают суммарное количество соли серебра (0^), введенное в ячейку, как сн (^ + ) ■ После
этого обратным титрованием стандартным раствором любого ЯБН определяют количество БН-групп (О.у/), израсходованных на взаимодействие остат-
ка свободных ионов серебра. Концентрацию дисульфидов рассчитывают
с помощью уравнения: о^ - до^ - оа
1 ? »
А I»
а /
4,-042 /
: Л г
// I/ 1-
Г . 1 I | |
Рис 6. ИВ-кривые серебра, полученные в случае исследования ТДС цельной крови методом КИВТ в одной апиквоте пробы. Растворы содержат: а) - фон № 1 + 0.2 цмоль AgNOэ (Г„) + 0.005 мл пробы (1„р). 6) - + еще 0.3 цмоль AgNOз + 0.1 г №280з (1) + х цмоль СБН. х = 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5). Условия эксперимента, как на рис. 4
Найденные здесь концентрации (ммоль-дм") тиолов (17.0) и дисульфидов (5.6) с погрешностью, не превышающей 3%, соответствуют результатам, полученным при исследовании ТДС этой же крови методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 (табл. 2). Результаты, полученные альтернативным КИВТ методом, когда концентрация нативных БН-групп в первой стадии анализа определяется методом прямого ИВТ, не отличаются от полученных в предыдущем опыте. В отличие от амперометрического и кулонометрического титрований тиолов предлагаемые в настоящей работе методы исключают из процедуры анализа операцию разрушения эритроцитов путем центрифугирования при 6000 об/мин, что значительно сокращает время, необходимое для анализа и не требует дополнительного оборудования. Правильность предложенного подхода исследования тиолдисульфидного равновесия в цельной крови и ее фракциях проверили способом «введено - найдено» (табл. 4). Незначимые расхождения между величинами введено и найдено свидетельствует об отсутствии систематической погрешности в результатах.
Таблица4
Оценка правильности результатов измерения концентраций 8Н- и -вв-групп (ммоль-дм"3) в крови здорового донора н ее фракциях методом "введено-найдено"
(п = 6, Р = 0.95)
Проба Аналит Сд- С, Су /Сг-Сд-СУ
1 -БН 15.5+0.4 15.0 30.3±0.6 0.20 0.61
4.8+0.2 5.0 10.0±0.3 0.2 0.30
2 -вн 30.5+1.2 20.0 51.6+1.1 1.1 1.37
8.7±0.2 7.0 15.4±0.4 0.32 0.38
3 -БН 1.22Ю.04 0.50 1.75±0.06 0.03 0.04
-Бв- 0.38Ю.01 0.30 0.71±0.04 0.03 0.04
ЬК = 0.841/((Т1.)3 +(<х4.)г ' - цельная кровь, 2 - эритроцитарная масса, 3 - плазма. » -т = 0.48.
Правильность полученных результатов может быть оценена и через результаты фракционного анализа. Если объем крови принять за единицу, то БН- или -ББ-группы крови распределятся по фракциям согласно уравнению: тСэр + (1 - т)Ст = Скр, где от = У31/У,р - объемная доля эритроцитарной массы по отношению к объему крови, Сзр Ст и С^ - концентрации аналита в эритроцитарной массе, плазме и цельной крови, соответственно. Тогда в соответствии с результатами табл. 4, сумма произведений 0.48x30.5 ммоль-дм"3 и 0.52x1.22 ммоль-дм"3 левой части уравнения, равная 15.2 ммоль-дм"3 с погрешностью менее 1% соответствует найденному содержанию БН-групп в цельной крови (15.5 ммоль-дм"3).
Достоверность полученных в процессе разработки ИВТ способов исследования тиолов и дисульфидов в крови позволили провести обследование 23-х больных лимфогранулематозом (ЛГМ) в период стойкой клинико-гематологической ремиссии (КГР) после многократных курсов цитостатиче-ской и лучевой терапии. Кроме того, обследовали кровь больных ЛГМ, получивших курс полихимиотерапии (ПХТ). В реабилитационной программе для этих больных были использованы биосорбенты и поливитамины. Контрольную группу в количестве 23-х человек составили практически здоровые добровольцы, находящиеся на обычной диете и водной нагрузке, некурящие. Применяли систему контроля качества выполняемых анализов, включающую оценку повторяемости, воспроизводимости и правильности результатов анализа. Для оценки последней характеристики погрешности использовали результаты независимых методов или применяли метод добавок в сочетании с методом разбавления. Полученные результаты подвергали статистической обработке. В табл. 5 представлены средние (Сх) значения концентраций ± среднее квадратичное отклонение (5). Для сравнения средних значений данных анализов исследуемых групп и определения степени достоверности различий использовали разностный метод ¿-критерия Стьюдента.
Как видно из табл. 5, достоверно (р < 0.05) наблюдается более низкая буферная емкость тиолдисульфидного звена АОС больных ЛГМ по сравнению со здоровыми людьми и это свидетельствует о том, что интенсивность окислительно-восстановительных процессов для таких больных значимо менее выражена. Особенно это касается больных ЛГМ, получивших курс полихимиотерапии. Как оказалось, у них самая низкая буферная емкость БН <-> ББ. Значение К = БН/ББ ниже 2.4 ед. косвенно характеризует истощение адаптационных резервов организма. После проведения курса восстановительной терапии (ВТ) сорбентами и поливитаминами средние показатели К заметно изменились в сторону достижения равновесия. Количество БН-групп увеличилось, а -ББ-групп - уменьшилось так, что тиолдисульфидный коэффициент достиг значений, характерных для относительно здоровых лиц (2.4 - 4.0 ед.). Улучшилось качество жизни пациентов. Тем не менее, буферная емкость БН «-> ББ системы, которая определяется в большей мере количеством БН-групп, оста-
лась достоверно ниже, чем это наблюдается для пациентов контрольной группы.
Таблица5
Средние показатели ТДС крови больных лимфогранулематозом и относительно здоровых добровольцев (Р = 0.95)
Показатель Больные лимфогранулематозом Контрольная группа (п = 23)
ПХТ (п =9) КГР (п = 23)
До курса ВТ После курса ВТ До курса ВТ После курса ВТ
БН-, моль-дм"3 10.611.8 12.811.6 12.212.0 13.511.5 15.1Ю.9
-БЭ-, моль-дм"3 4.811.2 3.8Ю.9 4.511.3 4.5Ю.8 4.5Ю.4
А"=8Н/88 2.2Ю.З 3.4Ю.5 2.7+0.4 3.1Ю.42 3.4Ю.4
Глава V посвящена разработке методик определения сульфидной серы в природных, питьевых водах и слюне методом ИВТ.
Неорганические сульфиды наравне с тиолами образуют трудно растворимые соединения с рядом металлов: пМе*+ + /пБ2" -> Ме„8„. Наименьшие величины произведений растворимости (ПР) 4.0-10"53 и 6.3-Ю'50 характерны для сульфидов ртути (II) и серебра (I), соответственно. А это значит, что применение солей каждого из этих металлов в качестве титрантов открывает перспективу исследования нанограммовых концентраций водорастворимых сульфидов в растворах. Однако растворы солей ртути - высоко токсичны, поэтому в качестве титрующего реагента при определении сульфидов выбрали раствор нитрата серебра, тем более, что в предыдущем разделе доказана правомерность его использования в качестве аналитического. К сожалению, РЬэлектрод способен адсорбировать продукты реакции А§Ы03 с сульфидами, поэтому в качестве рабочего выбрали ОС-электрод. В связи с этим дополнительно изучили поведение ИВ-сигнала серебра на ОС-электроде, которое не отличается от такового для Р1-электрода. Все закономерности, алгоритмы анализа и расчетные уравнения, описанные в предыдущем разделе, сохраняются. В выбранных условиях титрования стехиометрия реакции Ыа23 + 2А^03 -> А§28 + 2ЫаЫ03 в растворе не нарушается. Об этом свидетельствует полное совпадение расчетных Д = 2<2ли/(2/1я и экспериментальных значений. В области исследуемых концентраций ниже 1-10"6 моль-дм"3 использовали более чувствительный режим поляризации электрода - дифференциально-импульсный (рис. 7).
Анализ воды. Для определения сульфидов в воде использовали методы прямого и обратного ИВТ. Однако метод обратного ИВТ уступает методу прямого ИВТ, где нет необходимости применять более неустойчивые по сравнению с тиолами стандартные образцы сульфидов, требующие ежедневного приготовления и проверки титра раствора. Правильность определения сульфидов в природных и питьевых водах проверили методом «введено-найдено»
Рис 7. Дифференциально-импульсные ИВ-кривые серебра в случае обратного титрования раствора, содержащего 3.5 пмольдм"' Ыа25. Раствор содержит 10 мл пробы + 0.10 цмоль АеШ5 (1) + 5.0 (2) + 7.5 (3) + 10.0 (4)
+ 12.5 (5) + 15.0 (6) пмоль Условия эксперимента: £,= -0.4 В; (,= 60 с; амплитуда = 0.05 В, и= 30 мВ с"1
и сопоставлением результатов независимых методов прямого и обратного ИВТ. Расхождения между результатами «введено» и «найдено» при измерении сульфидов в природных и питьевых водах методом прямого ИВТ незначимы (табл. 6). Найденные с помощью методов прямого и обратного ИВТ концентрации сульфидов в анализируемых пробах вод подчиняются уравнению регрессии у = 0.993.x - 0.05 (Я2 = 0.9953) с коэффициентом корреляции, близким 1.0, во всем диапазоне концентраций. Наименьшие значения концентраций
Таблицаб
Оценка правильности результатов (моль-дм'3) измерения концентрации сульфнд-нонов в природных и питьевых водах методом прямого ИВТ (п = 7)
Проба' Найдено в пробе, CX±S Введено, С, Найдено в пробе с добавкой, Ci±S /С, -Сх- С J К
1 (7.1±0.12) 10"5 5.0-10'5 (12.3±0.20)10"s 0.2 0.20
2 (3.4+0.11) 10'7 3.0-10'7 (6.2Ю.17) 10"7 -0.2 0.17
3 (5.4М.28) Ю-9 6.010"9 (11.5+0.55) 10"9 0.1 0.52
4 (2.9±0.14)10'8 зою-8 (5.8±0.23) 10"8 -0.1 0.23
* - 1 и 2 — артезианская вода через 1 месяц и 1 год после сдачи скважины в эксплуатацию, соответственно, 3 - речная вода, р. Обь, 4 - водопроводная вода (ИНХ СО РАН).
сульфидов обнаружены в речной воде, что хорошо согласуется с литературными данными. Найденная концентрация сульфидов в водопроводной воде в 3 раза ниже ЦДК (8.8-10"8 моль-дм'3), установленной для сероводорода в питьевых водах. Содержание растворимых сульфидов в воде из скважины превышает установленные нормы.
Предел обнаружения (За) сульфидов для методов прямого и обратного ИВТ составляет 2.0-10"'° и 5.0-10"'° моль-дм"3, соответственно при t, = 180 с.
Анализ слюны. При исследовании наномолярных концентраций сульфидов в биологических пробах с ограниченным количеством анализируемого материала, таких как слюна, У„р приближается к Vm и требуется делать поправку на разбавление. Чтобы избежать учета разбавления пробы, анализ слюны проводили методом ИВТ-2 в строгом соответствии с алгоритмом 1а.
Для расчета искомой концентрации использовали уравнение 12, которое для реакции взаимодействия AgNOз с сульфидами с учетом фактора эквивалентности представляет собой соотношение: ^ _ ^^(АУ^ - Ум) ^ в табл. 7 пред"" 2ДГ
яр
ставлены результаты определения сульфидной серы в слюне. Наименьшие концентрации сульфидов определяются в слюне здорового некурящего человека (№ 1). У условно здорового курящего мужчины (№ 2) и некурящего, но страдающего хроническими заболеваниями (№ 3), прослеживаются явные признаки аутоинтоксикации организма, о чем свидетельствует повышение уровня концентрация сероводорода в этих пробах на 2 порядка по сравнению со слюной № 1. В случае с пробой № 2 диагностируется скрытая аутоинтоксикация, очевидно, обусловленная образованием сероводорода в желудочно-кишечном тракте в результате курения. Более выраженная аутоинтоксикация, которая уже сопровождается неприятным запахом изо рта, наблюдается у мужчины со слюной № 3. Предел обнаружения сульфидов <5 пмоль-дм"3.
Таблица7
Оценка систематических расхождений результатов определения сульфидной серы в слюне людей, полученных методами ИВТ-2 и ИВТ-3 (п = 6, Р = 0.95, Рта6л = 5.05, <та6л = 2.57)
Проба Содержание в пробе, моль-дм"5 с 1 ЭКСП Аэксп
ИВТ-2 ИВТ-3
Сд- &(%) Сх
1 1.85-10* 1.7 - - -
2 1.24-10'7 1.5 - - - -
3 5.21-10"7 1.5 5.18-10'7 2.3 2.33 0.52
* - 1 - слюна условно здорового некурящего мужчины, 2 - слюна условно здорового курящего мужчины, 3 - слюна некурящего мужчины, но страдающего хроническими заболеваниями (запоры, сахарный диабет) и имеющего неприятный запах изо рта (халитозис)
В главе VI обсуждаются результаты исследования по применению метода ИВТ-2 в качестве альтернативного классическим титриметрическим методам для определения и контроля над устойчивостью во времени титра ОС нестабильных веществ /Й7/, Ма25, НС1, К1 и AgNOз.
Стандартизации ОС для определения нестабильных веществ совсем не тривиальная задача. От исследователя требуется особая тщательность, должная предосторожность и несомненная проверка правильности результатов. К сожалению, многочисленные классические способы стандартизации ОС страдают рядом недостатков и не отвечают многим требованиям, которые согласно мнению Лоуренса и Комитета, скорее всего, и являются источником систематических погрешностей и разногласий между результатами различных публикаций при определении сульфидной серы, как в природных, так и в биологических образцах. Применение предложенного в настоящей
работе метода ИВТ-2 для стандартизации ОС нестабильных веществ исключает практически все недостатки классического титрования - визуальная регистрация точки эквивалентности, длительность проведения анализа, узкий диапазон определяемых концентраций, относительно высокая погрешность результатов анализа, низкая чувствительность. Об этом свидетельствуют суммированные результаты, полученные в условиях титрования свежеприготовленных ОС сульфида натрия и глутатиона восстановленного методом ИВТ-2 и известными классическими методами (табл. 8). Как видно, по сравнению с результатами известных методов титрования ИВТ-2 имеет явные преимущества. Вся процедура анализа занимает не более 5 минут, практически
Таблица8
Сопоставление результатов (моль-дм"3), полученных независимыми методами, при стандартизации свежеприготовленных образцов сравнения и С8Н (п = 9)
Введено (С) ИВТ-2 Классический метод
и мин Найдено, Сх X % 1, мин Найдено, Сх "к, %
Амперометрическое тит] рование
5.0-10"3 1.5-104 5.0-10"6 3-5 5.06-10'3 1.52-10"4 4.94-10"6 1.1 1.3 1.2 1.2 1.3 -1.2 10-15 4.93-10"' 1.40-10"' н/о 2.8 5.1 -1.4 -6.7
Титрование К3[Ре(СЫ)6]
1.0-10"3 1.0-10"* 5.0-10* 3-5 9.92-10-* 9.93-10'5 4.95-10"6 1.1 1.3 1.5 -0.8 -0.7 -1.0 15-20 9.81-10"4 9.18-105 н/о 3.4 7.1 -1.9 -8.2
* / — время, затраченное на единичное измерение, **Я = (Сх— С)/С.
Таблица9
Сравнение расчетных и экспериментальных значений Д, полученных при исследовании свежеприготовленных ОС и Ь-СвН моногидрата методом ИВТ-2
(п = 6, Р = 0.95)
Введено, мл-моль-дм'3 ^ расч Д эксп Уравнение регрессии Д = а А +Ь расч эксп
V С ''Vе,
Иагв (а = 2}
0.50-1.0-10° 0.05-1.0-10'3 0.10-1.0 10"' 0.20-1.0-10"3 0.20 0.40 0.80 0.203 0.395 0.803 ДР«,= 0.991Д„ОТ +0.002 Я2 = 0.9996
0.10-1.0- Ю-4 0.10-5.0-10* 0.10 0.096 -
Ь-СЭН (а = 1)
0.50-1.0-10'3 0.05 1.0 Ю 3 0.10-1.0-10 0.25-1.0-10"3 0.10 0.20 0.50 0.102 0.197 0.497 Драп = 1 006Ажа, - 0.004 Я2 = 0.9997
0.08-1.0-10"4 0.04-1.0-10"5 0.10-1.0 105 0.20-1.010"5 0.050 0.125 0.250 0.050 0.123 0.253 ДР«,= 0.998ДЭЮ, +0.001 Я2 = 0.9996
0.05-1.0-10"4 0.80-5.0-10"6 0.80 0.798 -
отсутствуют потери аналита в процессе титрования, за счет увеличения чувствительности метода расширился диапазон определяемых концентраций, снизилась погрешность результатов измерения. Особенное достоинство предлагаемого метода стандартизации растворов — возможность быстрой корректировки концентрации ОС, как в процессе их приготовления, так и хранения во времени путем сравнения расчетных и экспериментальных значений А (табл. 9).
Никаких препятствий не возникло при стандартизации ОС иодида калия, хлористоводородной кислоты и корректировки свежеприготовленного из навески AgN03 ОС азотнокислого серебра. Для установки титра раствора AgN03 предложена методика ИВТ-2 (алгоритм 2) по титрованному раствору KCl. Для расчета искомой концентрации использовали уравнение:
"'^-Vi.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны основные принципы нового метода электрохимического анализа - ИВТ. Возникший на основе двух электрохимических методов - ИВ и AT - метод ИВТ объединил достоинства обоих методов, исключив их недостатки, и представляет собой абсолютно независимый метод с уникальными свойствами и принципиально новыми возможностями.
2. Разработаны алгоритмы и расчетные уравнения экспрессных методов титрования с регистрацией всего двух (ИВТ-2) и трех (ИВТ-3) точек для нахождения концентрации определяемых веществ и исследования стехиометрии протекающих в растворе реакций.
3. Обоснована правомерность применения инверсионного сигнала серебра в качестве аналитического в условиях титрования AgN03 тиолами и сульфидами. Доказано, что в выбранных условиях эксперимента присутствие матрицы крови, её фракций и слюны не влияют на кинетику электрохимических реакций на поверхности рабочего электрода и химических реакций в растворе.
4. Разработаны не требующие предварительной пробоподготовки методики исследования ТДС цельной крови и отдельных ее фракций с использованием двух отдельно взятых проб.
5. Предложены унифицированные экспрессные способы исследования ТДС цельной крови и ее фракций в норме и при различных заболеваниях непосредственно в одной аликвоте пробы.
6. Разработаны высокочувствительные и селективные методики ИВТ-исследования концентраций сульфидов в природных и питьевых водах и слюне с пределом обнаружения <5-Ю"10 и <510"9 моль-дм"3 для вод и слюны, соответственно. Предложенная ИВТ-2 методика использована для диагностики сероводородной аутоинтоксикации организма.
7. Метод ИВТ-2 применен для создания экспрессных и надежных методик стандартизации ОС неустойчивых во времени веществ органических тиолов, неорганических сульфидов, хлороводородной кислоты, йодистого калия и азотнокислого серебра.
Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:
1. Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С., Титова Т.В. Исследование тиолдисульфидного равновесия в цельной крови и ее фракциях методом инверсионно-вольтамперометрического титрования // Журн. аналит. химии. - 2008. - Т. 63 - № 2. -С. 189-198.
2. Titova T.V., Borisova N.S., Zakharchuk N.F. Determination of sub-micromolar amounts of sulfide by standard free anodic stripping voltammetry and anodic stripping voltammetric titration // Anal. Chim. Acta. - 2009. - V. 653. - P. 154-160.
3. Скиба T.B., Борисова H.C., Захарчук Н.Ф. Инверсионно-вольтампе-рометрический способ экспрессной установки титра нестабильных образцов сравнения // Аналитика и контроль. - 2011. - Т. 15. - № 4. - С. 439-449.
4. Zakharchuk N.F., Borisova N.S., Titova Т. V. Voltammetric titration. Basic principles and perspectives // Materials of International Scientific Conference «Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology». Tomsk, 2006. - V. 2 - P. 173-175.
5. Титова T.B. Определение серосодержащих веществ методом инверсионно-вольтамперометрического титрования // Материалы XLV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2007-С. 153-154.
6. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С. Титрование органических тиолов, сульфид-ионов и свободных ионов кальция с инверсионно-вольт-амперометрической индикацией точки эквивалентности // Тез. докл. VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке». Томск, 2007 - С. 239.
7. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С. Определение серосодержащих веществ и ионов щелочноземельных металлов в питьевых водах и биологических жидкостях методом инверсионно-вольтамперометрического титрования // Материалы VII Всерос. конф. по электрохим. мет. анализа с междун. участием. Уфа - Абзаково, 2008 - С. 114.
8. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С. Безэталонный способ определения электрохимически неактивных веществ с использованием инверсионно-вольтамперометрического сигнала // Материалы VIII научн. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». Томск, 2008 - С. 152-153.
9. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф. Стандартизация растворов малоустойчивых веществ методом вольтамперометрического титрования по двум точкам //' Тез. докл. Съезда аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности». Москва -Клязьма, 2010-С. 292.
10. Скиба Т.В., Захарчук Н.Ф. Определение сульфидной серы в слюне методом инверсионно-вольтамперометрического титрования по 2-м точкам (ИВТ-2) // Материалы IX научн. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». Красноярск, 2012 -С. 115.
Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001.
Подписано к печати и в свет 12.11.2012. Формат 60x84/16. Бумага № 1. Гарнитура "Times New Roman" Печать оперативная. Печ. л. 1,2. Уч.-изд. л. 1,1. Тираж 120. Заказ № 97 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. А.В. НИКОЛАЕВА СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
СКИБА Татьяна Васильевна
Разработка метода инверсионно-вольтамперометрического титрования для определения тиольных, дисульфидных групп и сульфидной серы в природных водах и биожидкостях
Специальность 02.00.02 - аналитическая химия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель: кандидат химических наук, Н.Ф. Захарчук
Новосибирск - 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
СОКРАЩЕНИЯ......................................................................................................................5
ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................7
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................................................12
1.1. Тиоловые соединения в механизме антиоксидантной защиты организма от окислительного стресса. Тиолдисульфидное соотношение.........................................12
1.2. Методы исследования тиолдисульфидной системы и отдельных ее составляющих...................................................................................................................14
1.2.1. Спектроскопические методы.............................................................................15
1.2.2. Хроматографические методы............................................................................16
1.2.3. Электрохимические методы..............................................................................21
1.2.4. Прочие методы....................................................................................................27
1.2.5. Заключение..........................................................................................................28
1.3. Сероводород и неорганические сульфиды - токсиканты экосистем или биологически активые компоненты?..............................................................................29
1.4. Методы исследования сульфид-ионов в природных водных и биообъектах.....32
1.4.1. Классические методы (методы визуальной титриметрии).............................32
1.4.2. Спектроскопические методы.............................................................................35
1.4.3. Хроматографические методы............................................................................39
1.4.4. Электрохимические методы..............................................................................42
1.4.5. Прочие методы....................................................................................................49
1.4.6. Заключение..........................................................................................................50
ГЛАВА 2. ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ.......52
2.1. Предпосылки к созданию метода инверсионно-вольтамперометрического титрования (ИВТ).............................................................................................................52
2.2. Инверсионно-вольтамперометрическое титрование по трем точкам (ИВТ-3)...56
2.3. Инверсионно-вольтамперометрическое титрование по двум точкам (ИВТ-2) ..57
2.4. Заключение.................................................................................................................61
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................................62
3.1. Аппаратура.................................................................................................................62
3.2. Реактивы.....................................................................................................................62
3.3. Приготовление модельных образцов......................................................................63
3.4. Приготовление проб крови и ее фракций...............................................................63
3.5. Приготовление проб воды........................................................................................64
3.6. Приготовление проб слюны.....................................................................................64
ГЛАВА 4. ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ТИОЛОВ И ДИСУЛЬФИДОВ...........................................................65
4.1. Выбор сигналообразующего реагента.....................................................................65
4.2. Инверсионно-вольтамперометрическое титрование органических тиолов и дисульфидов до точки эквивалентности........................................................................77
4.2.1. Исследование модельных образцов..................................................................77
4.2.2. Анализ цельной крови и ее фракций................................................................80
4.3. Инверсионно-вольтамперометрическое титрование тиолов и дисульфидов по трем и двум точкам..........................................................................................................85
4.3.1. Исследование модельных растворов................................................................86
4.3.2. Исследование цельной крови и ее фракций.....................................................89
4.4. Заключение.................................................................................................................98
ГЛАВА 5. ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКИХ СУЛЬФИДОВ..............................................................................100
5.1. Инверсионно-вольтамперометрический сигнал серебра на стеклоуглеродном рабочем электроде..........................................................................................................100
5.2. Исследование модельных растворов.....................................................................103
5.3. Анализ воды.............................................................................................................107
5.4. Анализ слюны..........................................................................................................109
5.5. Заключение...............................................................................................................113
ГЛАВА 6. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ОБРАЗЦОВ СРАВНЕНИЯ НЕУСТОЙЧИВЫХ ВО ВРЕМЕНИ ВЕЩЕСТВ......................................................................................................114
6.1. Стандартизация образцов сравнения RSH и Na2S...............................................115
6.1.1. Стандартизация образцов сравнения Na2S методом
вольтамперометрического титрования по двум точкам.........................................115
6.1.2. Стандартизация образцов сравнения Na2S и RSH методом инверсионно-вольтамперометрического титрования по двум точкам.........................................118
6.2. Стандартизация образцов сравнения хлороводородной кислоты и йодида калия ..........................................................................................................................................122
6.3. Стандартизация образцов сравнения азотнокислого серебра.............................126
6.4. Заключение...............................................................................................................129
ВЫВОДЫ............................................................................................................................130
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................131
БЛАГОДАРНОСТИ...........................................................................................................150
СОКРАЩЕНИЯ
АОС - система антиоксидантной защиты
ТДС - тиолдисульфидный статус, тиолдисульфидное соотношение ИВТ - инверсионно-вольтамперометрическое титрование
ИВТ-1 - инверсионно-вольтамперометрическое титрование до точки эквивалентности ИВТ-2 - инверсионно-вольтамперометрическое титрование по двум точкам ИВТ-3 - инверсионно-вольтамперометрическое титрование по трем точкам КИВТ - комбинированное инверсионно-вольтамперометрическое титрование СРО - свободнорадикальное окисление
ДТНБ - 5,5-дитио-бис-2-нитробензойная кислота (реактив Эллмана)
в8Н - глутатион восстановленный
С88в - глутатион окисленный
С 811 - цистеин
С88С - цистин
НСуБ -гомоцистеин
АС8Н - ацетилцистеин
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГХ - газовая хроматография
КЭ - капиллярный электрофорез
КИВА - катодная инверсионная вольтамперометрия
ХМЭ - химически модифицированный электрод
ПИА - поточно-инжекционный анализ
ПО - предел обнаружения
ТРАФ - тетрартутьацетатфлуоресцеин
ИСЭ - ион-селективный электрод
Ag-ИCЭ - сульфидсеребряный электрод
АС - аналитический сигнал
РПЭ - ртутный пленочный электрод
вС - стеклоуглеродный электрод
ТМГЭ - толстопленочный модифицированный графитовый электрод ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ^ - предельный диффузионный ток
1т - вольтамперометрический инверсионный максимум тока
ИВА - инверсионная вольтамперометрия
АТ - амперометрическое титрование
ВА - вольтамперометрия
Е, - потенциал электролиза
X) - время электролиза
и - скорость развертки потенциала
Ет - потенциал пика
ДДВ - дважды дистиллированная вода
ТФМК - трифенилметановый краситель
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Окислительный стресс - это нарушение в организме баланса между прооксидантами и компонентами системы антиоксидантной защиты (АОС). Защитные свойства относительно окислителей и активных радикалов проявляют, прежде всего, тиолы (118Н). Являясь физиологическим показателем активности внутриклеточной системы защиты от действия реактивного кислорода и благодаря их способности подвергаться окислительно-восстановительным превращениям (2Я8Н 118811 + 2Н+ + 2е" - тиолдисульфидный статус), они могут быть использованы для непосредственной диагностики антиоксидантного статуса организма. Соотношение восстановленной (-8Н) и окисленной (-88-) форм тиоловых антиоксидантов в крови отражает степень повреждающего воздействия окислительного стресса и может служить для совершенствования диагностики заболеваний, прогнозирования их исхода, и оценки лечебных и профилактических средств. Сероводород и его растворимые соли - сульфиды издавна известны, как чрезвычайно токсичные соединения, оказывающие губительное влияние на состояние экосистем и жизнедеятельность населяющих ее организмов, включая человека. В зависимости от объекта и продолжительности воздействия, диапазон токсичности может варьироваться в широких пределах. В то же время все чаще появляются сведения биологов и биохимиков о том, что отравления сероводородом можно получить не только в случае прямого контакта с отравляющим веществом, но и в результате сероводородной аутоинтоксикации, обусловленной неправильным пищеварением, курением, протеканием воспалительных процессов и т.д. Обсуждается также положительная роль сероводорода в биохимических процессах при низких (<10"9 моль л"1) уровнях концентраций. Поэтому очень важной становится проблема контроля над состоянием тиолдисульфидного звена антиоксидантной системы и сульфидной серы, в идеальном случае - в небольших клиниках, поскольку является залогом успешной диагностики и терапевтической коррекции при патологиях различного вида. В последнее десятилетие наблюдается «взрыв» в количестве публикаций, посвященных ,развитию различных физико-химических методов для исследования тиолов в биологических объектах и оценки уровней токсичного и биологически значимого воздействий сероводорода на живой организм. Однако
многие из описанных методов либо не доведены до уровня конкретных методик анализа биологических объектов, либо трудоемки и малодоступны из-за высокой стоимости анализа и требований к квалификации работников, что препятствует их внедрению в широкую клиническую практику. Кроме того, во всех упомянутых в литературе методах искомую концентрацию определяют относительно концентрации образцов сравнения или сульфидной серы, которые из-за высокой летучести и способности легко окисляться кислородом воздуха, приходится готовить и проверять их титр трудоемкими классическими методами каждые три часа. Из-за нарушения этого правила результаты измерений существующими методами часто несопоставимы друг с другом, что нарушает их интерпретацию. Поэтому поиск новых подходов к разработке способов определения тиолов, дисульфидов и сульфидной серы в водных и биологических средах и установки титра образцов сравнения, отличающегося высокой чувствительностью, точностью и экспрессностью, пригодного для использования, как в специализированных лабораториях, так и небольших клиниках, является весьма актуальной задачей.
В связи с этим определены цели работы:
Развитие нового электрохимического метода (инверсионно. 1 » у 11 ' '
I I > '
вольтамперометрическое титрование) для определения органических тиолов, дисульфидов, растворимых сульфидов и разработки экспрессных, высокоточных и высокочувствительных методик исследования тиолдисульфидного статуса цельной крови и ее фракций и определения сульфидной серы в водных и биологических средах.
Для достижения поставленных целей сформулированы следующие задачи:
- разработать основные принципы инверсионно-вольтамперометрического титрования до точки эквивалентности (ИВТ-1), с регистрацией всего двух (ИВТ-2) и трех (ИВТ-3) точек;
- исследовать электрохимическое поведение солей меди, свинца, кадмия, ртути и серебра в условиях образования их тиолятов;
- исследовать инверсионно-вольтамперометрическое поведение серебра в зависимости от природы электрода и состава фонового электролита в условиях титрования его соли тиолами, сульфидами и хлоридами;
- разработать ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 методики определения низкомолекулярных тиолов и дисульфидов в цельной крови и её фракциях;
- исследовать ТДС крови и её фракций методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 в норме, при различных патологиях, до и после медикаментозной терапии;
- разработать высокочувствительные методики определения растворимых сульфидов в воде и слюне человека;
- разработать методики для экспрессного и высокоточного контроля титра нестабильных образцов сравнения органических тиолов, неорганических сульфидов, хлороводородной кислоты, йодида калия и азотнокислого серебра.
Научная новизна работы
- Впервые инверсионно-вольтамперометрический сигнал использован в качестве аналитического в условиях титрования и разработаны основные принципы нового электрохимического метода анализа - инверсионно-вольтамперометрическое титрование (ИВТ);
- Впервые предложен способ и расчетные уравнения для обратного титрования с регистрацией всего трех точек на кривой титрования (ИВТ-3);
- Впервые предложен способ и расчетные уравнения для непосредственного ,
, | ; 1 , , 1 I •" 1 'I 1 , 1
определения искомой концентрации, основанный на определении доли электроактивного компонента, вступившей во взаимодействие с искомым компонентом реакции с учетом фактора эквивалентности (ИВТ-2);
- Впервые разработаны простые альтернативные друг другу ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 способы исследования тиолдисульфидного статуса цельной крови и её фракций, не требующие предварительного отделения матрицы и разделения определяемых компонентов;
- Разработана высокочувствительная методика определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах и слюне с пределами обнаружения <5ТО"10 моль-л"1. Впервые предложено проводить анализ слюны с целью диагностики процессов сероводородной аутоинтоксикации организма;
- Предложен новый, альтернативный классическому титрованию экспрессный (< 3 мин) и высокоточный (Бг < 1.5%) ИВТ-2 способ установки титра органических тиолов, неорганических сульфидов, хлороводородной кислоты, йодида калия и азотнокислого серебра.
Практическая значимость работы. Исследование в динамике тиолдисульфидного статуса методами ИВТ в комплексе с показателями процесса перекисного окисления липидов при кардиохирургических вмешательствах позволяет обнаружить наиболее опасную стадию операции и может служить диагностически значимым показателем про- и антиоксидантного равновесия в экстремальных условиях (НИИ патологии кровообращения им. E.H. Мешалкина, г. Новосибирск). ИВТ способы исследования тиолдисульфидного статуса использованы для оценки адаптационных резервов организма и их искусственной коррекции, для диагностики и прогнозирования заболеваний, выявления хронических патологий, для неспецифической профилактики и терапии. Исследована эффективность действия биологических добавок в реабилитации больных с онкологическими заболеваниями крови (Центральная клиническая больница СО РАН).
Разработанные методики определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах и слюне характеризуются высокой чувствительностью и хорошими метрологическими параметрами. Это создает перспективу для их широкого внедрения в областях экологического и биологического мониторинга объектов с суб-микромолярным содержанием сульфидов. , ,
' > I 1
На защиту выносятся:
- Обоснование выбора инверсионно-вольтамперометрического сигнала в качестве аналитического в условиях титрования;
- Результаты исследований по оптимизации условий регистрации ИВ-сигнала серебра в качестве аналитического в условиях титрования его соли тиолами, сульфидами, галогенидами;
- Расчетные уравнения экспрессных методов титрования ИВТ-2 и ИВТ-3 для нахождения концентрации определяемых веществ;
- Результаты исследований стехиометрии протекания изучаемых реакций в растворе;
- Методики и результаты исследования тиолдисульфидного статуса (ТДС) в цельной крови и ее фракциях в норме и при различных заболеваниях;
- Методики определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах, слюне;
- Методики контроля титра нестабильных образцов сравнения органических тиолов, неорганических сульфидов, хлороводородной кислоты, йодида калия и азотнокислого серебра.
Личное участие автора состоит в анализе литературных данных, проведении экспериментальной работы для решения поставленных задач, систематизации, обобщении и интерпретации полученных результатов. Подготовка материалов для публикаций проводилась совместно с научным руководителем и соавторами.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на шести конференциях: IV Международной научной конференции "Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий" (Томск, 2006); XLV Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2007); VIII Всероссийской научно-практической конференци
