Определение коэнзима Q10 в продукции фармацевтической и косметической промышленности методом вольтамперометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

(¿¡ЩкСйО^

Петрова Екатерина Викторовна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЭНЗИМА (Зю В ПРОДУКЦИИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ И КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

02.00.02 - аналитическая химия

28 ОКТ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

О1

Томск-2015

005563724

Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет»

доктор химических наук, доцент, Короткова Елена Ивановна

Стожко Наталия Юрьевна доктор химических наук, профессор, Уральский государственный экономический университет, кафедра физика и химии, заведующая кафедрой

Шелковников Владимир Витальевич кандидат химических наук, доцент, Национальный исследовательский

Томский государственный университет, кафедра аналитической химии, доцент

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Защита состоится «16» декабря 2015 г. в 14:30 на заседании диссертационного совета Д.212.269.04 при федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» по адресу: 634050, г. Томск пр. Ленина, 43а, 2-й корпус ТПУ, Малая химическая аудитория.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

С диссертацией можно ознакомиться е Научно-технической библиотеке ФГАОУ ВО НИ ТПУ по адресу: 634050, г. Томск, ул. Белинского, 55 и на сайте http://portal.tpu.ru/council/911/\тегкНз1

Автореферат разослан «18» октября 2015 г.

Ученый секретарь /) Т. М. Гиндуллина

диссертационного совета Д.212.269.04

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Коэнзим является важным компонентом

окислительно - восстановительной цепи митохондрий, а также единственным

жирорастворимым антиоксидантом, синтезируемым в организме человека.

Со(Зю играет важную роль в генерации клеточной энергии, усиливает

иммунную систему и защищает организм от действия свободных радикалов.

Старение, плохое питание, стресс и инфекции имеют сильное негативное

влияние на процесс выработки коэнзима <3ю в организме. После 35 лет

уменьшается способность организма генерировать коэнзим С^ю из продуктов

питания и развивается его дефицит в организме. Все это приводит к

потребности в дополнительном приеме коэнзима <3ю в виде биологически

активных добавок (БАД). По результатам многих клинических исследований

показана положительная тенденция применения БАД на основе коэнзима С2ю

при различных заболеваниях сердечно-сосудистой системы, так же

употребление препаратов на его основе способствуют лечению многих

заболеваний: онкологические заболевания, жировая дистрофия печени,

гепатиты, циррозы, болезнь Альцгеймера, сахарный диабет, рассеянный

Поэтому контроль качества БАД является актуальной задачей.

Коэнзим (2ю, являясь эффективным антиоксидантом, широко

используется в косметической промышленности. В составе косметических

средств по уходу за кожей лица и тела коэнзим <310 восстанавливает

упругость кожи, устраняет морщины, замедляет старение кожи. Поэтому

очень важно контролировать содержание коэнзима <3ю в косметических

препаратах на всех стадиях их производства.

В настоящее время для идентификации и определения коэнзима (^ш в

биологически активных добавках Европейская Фармакопея рекомендует

использовать жидкостную хроматографию со спектрофотометрическим

детектированием при 275 нм или спектрофотометрию. Однако,

электроаналитические методы, в частности вольтамперометрия, имея

з

высокую чувствительность и простоту аппаратурного оформления, могут быть использованы как альтернатива методам высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектрофотометрическим для определения коэнзима <3ю-

Цель работы. Разработать зольтамперометрический способ определения коэнзима (Зю для контроля его содержания в фармацевтических и косметических продуктах.

В соответствии с этим в работе поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние различных факторов на электрохимический сигнал коэнзима <3ю (природа фонового электролита, рН раствора, материал электрода).

2. Изучить физико-химические закономерности протекания реакции окисления-восстановления коэнзима (), 0 на СУЭ электроде. Предложить механизм протекания реакции окисления-восстановления коэнзима (Зю.

3. Оценить влияние вещестз различной природы на аналитический сигнал коэнзима С>ю.

4. Разработать вольтамперсметрическую методику определения коэнзима (Зю и установить основные метрологические характеристики разработанной методики.

5. Провести сравнительное определение содержания коэнзима (Зю в фармацевтических и косметическим препаратах вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами.

Научная новизна.

1. Впервые установлены физико-химические закономерности протекания реакции окисления - восстановления коэнзима (Зю на стеклоуглеродном электроде методом циклической вольтамперометрии. Предложены схемы протекания реакций окисления - восстановления коэнзима <3ю в водных нейтральных средах на стеклоуглеродном электроде.

2. Впервые изучено влияние ряда компонентов на ток электроокисления

коэнзима (Зю. Показано, что в присутствии витамина С, витамина В1 и

4

гиалуроновой кислоты ток электроокисления увеличивается. Предложены схемы взаимодействия коэнзима (Зю с изученными веществами.

3. Впервые исследована антиоксидантная активность коэнзима (Зю методом катодной вольтамперометрии с использованием процесса электровосстановлепия кислорода. Предложены схемы взаимодействия коэнзима (3ю с кислородом и его радикалами. Показано, что антиоксидантнымн свойствами обладает восстановленная форма коэнзима

<3.04. Разработан новый подход к определению коэнзима (Зю в продукции фармацевтической и косметической промышленности методом анодной постоянно-токовой вольтамперометрии. отличающийся высокой чувствительностью, простотой, экспрессностыо и удобством анализа. Проведено сопоставление результатов анализа независимым спектрофотометрическим методом.

Практическая значимость.

Разработана вольтамперометрическая методика определения коэнзима (3,0 в продукциях фармацевтической и косметической промышленности. Установлены метрологические характеристики методики. Показано, что вольтамперометрическая методика более чувствительна и требует менее сложной пробоподготовки, позволяет исключить использование токсичных реагентов и сократить время анализа по сравнению со спектрофотометрической методикой

Разработанная методика рекомендована к использованию в аналитических лабораториях фармацевтической и косметической промышленности для контроля содержания коэнзима (Зю в сырье и готовой продукции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования влияния различных факторов на электрохимический сигнал коэнзима (Зю (природа фонового

электролита, рН раствора, материал электрода).

5

2. Физико-химические закономерности протекания реакции окисления -

восстановления коэнзима Q10 на стеклоуглеродном электроде.

3. Оценка влияния веществ различной природы (витамина С, гиалуроновой кислоты, витамина Bi) на аналитический сигнал коэнзима Qio.

4. Вольтамперометрическая методика определения коэнзима Qio в продукции фармацевтической и косметической промышленности.

5. Результаты сравнительных испытаний определения содержания

коэнзима Qio в фармацевтических и косметическим препаратах вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами.

Степень достоверности и апробация результатов работы.

Достоверность полученных данных обусловлена представительным объемом проведенных экспериментов, использованием современных аналитических методов и метрологической обработки результатов, которые хорошо согласуются с литературными данными и результатами, полученными референтным спектрофотометрическим методом.

Публикации. Основное содержание диссертационной работы опубликовано в 9 научных работах, в том числе одна статья в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК, две статьи в научных изданиях, входящих в базу данных Scopus и 6 публикаций в материалах международных и всероссийских конференций.

Основные результаты работы были представлены на конференциях:

«Новые методы аналитической химии: Первая зимняя молодежная школа-

конференция с международным участием», Санкт-Петербург, 17 февраля -

22 марта 2013 «XVII Международный симпозиум имени академика М. А.

Усова студентов и молодых ученых», Томск, 1-5 апреля 2013; «VII

Всероссийской конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с

международным участием по химии и наноматериалам», Санкт-Петербург,

2-5 апреля 2013; «XIV Всероссийская научно-практическая конференция

имени профессора Л.П. Кулёва студентов и молодых ученых с

6

международным участием», Томск, 13 - 16 мая 2013; «Euroanalysis XVII: Analytical chemistry for human well-being and sustainable development», Warsaw, August 25 -29, 2013; «Химия и химическая технология в XXI веке: XV Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва», Томск, 26 - 29 Мая 2014;

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов:

1. Программа ФЦП, № 14.740-11.1369, (2011-2013), мероприятие 1.1. Тема соглашения - «Разработка высокочувствительных методик определения и исследование биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами в объектах природного и искусственного происхождения с целью совершенствования профилактики и лечения социально-значимых заболеваний» (Руководитель ассистент каф ФАХ ИПР Воронова О.А.).

2. Программа ФЦП, 14.В37.21.0811, (2012-2013), мероприятие 1.2.1. Тема соглашения — «Создание теоретических основ, высокочувствительных методик и сенсоров для электрохимических методов анализа биологически активных веществ» (Руководитель профессор каф ФАХ ИПР Короткова Е.И.)

3. Программа ФЦП, 14.В37.21.1183, (2012-2013), мероприятие 1.3.1. Тема соглашения — «Сравнительные исследования антиоксидантной активности природных объектов физико-химическими методами анализа» (Руководитель ассистент каф ФАХ ИПР Дорожко Е.В.)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6-ти глав, выводов, списка литературы (140 ссылок) и приложений. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 35 рисунков и 11 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулирована цель исследований, показана научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе описана история открытия коэнзима Ою- Представлены основные биохимические Лункции, выполняемые коэнзимом рю в организме: перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий и антиоксидантная. Приведены сведения о физико-химических свойствах коэнзима С*ю, отмечена его способность к окислительно-восстановительным превращениям. Систематизированы сведения об основных методах определения коэнзима Ою: хроматсграфнческих, спектрофотометрических и электрохимических. Показаны преимущества и недостатки существующих на данный момент методов определения коэнзима Ою- Показаны преимущества применения вольтамперометрическьх методов для определения коэнзима Ою в фармацевтических и косметических препаратах.

Вторая глава посвящска описануло используемой аппаратуры и методик измерений. Описаны объекты исследования, состав косметических средств и биологически активных добавок-, используемых в анализе. Исследования проводились на вольтамперометркческом анализаторе «ТА-2» (ООО «Томьаналит» г. Томск) в трехэлектродной ячейке, где в качестве рабочего использовали стеклоуглеродный электрод, хлорид - серебряные электроды как сравнения и вспомогательный электроды.

В третьей главе описаны физико-химические закономерности протекания реакции восстановления коэнзима Ою на стеклоуглеродном электроде в водных средах, подобраны оптимальные условия определения коэнзима 0,о в продукции косметической и фармацевтической промышленности.

Четвертая глава посвящена исследованию антиоксидантной активности коэнзима 0ю, используя процесс электровосстановления кислорода в качестве модельного процесса.

В пятой главе рассмотрено влияние веществ различной природы на аналитический сигнал коэнзима Ою в модельных средах. Показано, что наибольшее влияние оказывают витамин С, витамин В] и гиалуроновая кислота.

Шестая глава посвящена разработке вольтамперометрической методики определения коэнзима СЬо в продукции косметической и фармацевтической промышленности методом вольтамперометрии, установлены основные метрологические характеристики разработанной методики. Определено содержание коэнзима <3ю в косметических средствах и БАД вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами.

Результаты и обсуждение

При создании любой аналитической методики очень важным шагом является определение влияния различных факторов на аналитический сигнал исследуемого вещества. В вольтамперометрии такими факторами являются материал индикаторного электрода, природа фонового электролита и рН раствора.

Как убихинон (окисленная форма коэнзима <3ю), так и убихинол (восстановленная форма коэнзима СЫ) хорошо растворимы в следующих растворителях: ацетоне, диэтиловом эф^ре, хлороформе, этаноле. В последующем для приготовления стандартных растворов, а также процесса экстракции в качестве растворителя использовали этанол. Для получения воспроизводимого аналитического сигнала коэнзима (Зю исследовали влияние материала индикаторного электрода. В условиях постоянно-токовой развертки потенциала получили аналитический сигнал коэнзима на стеклоуглеродном электроде (СУЭ), в дальнейшем принято использовать его в качестве индикаторного электрода. В качестве электродов сравнения и вспомогательного использовали хлоридсеребрянные электроды (ХСЭ).

Выбор фонового электролита. Аналитический сигнал коэнзима СЗю на

СУЭ получили при использовании в качестве фонового электролита

9

фосфатного буферного раствора рН 6.86 (рис. 1) и безводного ацетонитрила (0.1 М раствор №СЮ4) (рис. 2)

30 I, т кА

15

20

10

0

-5

-М 1 ^^

15

-20 "гг^у—3

-25 -4

-30 —5 Е, В

Рисунок 1. Циклические

вольтамперограммы коэнзима С5ю на СУЭ в фосфатном буфере (рН 6.86) (I) при разных значениях концентрации СоОю з электрохимической ячейке: 10 (2), 20 (3). 30 (4), 40 (5) цМ Сорю. Скорость развертки потенциала 100 мВ с"'.

Рнсунок 2. Циклические

зольтамперограммы коэнзима СЬо на СУЭ в безводном ацетонитриле (0.1 М ЫаСКЭД (¡) при разных значениях концентрации СоСЬо в электрохимической ячейке: 10 (2), 20 (3), 30 (4), 40 (5) рМ СоОю. Скорость развертки потенциала 100 мВ-с"1.

На рисунке 3 представлена зависимость высоты аналитического сигнала коэнзимам С},,, в зависимости от типа буферного раствора.

О ОД 0,2 0,3

Концентрация козизама О, , Ст«10®

Рисунок 3. Зависимость предельного тока восстановления (А) и окисленния (Б) в зависимости от природы фонового электролита (1 — фосфатный буферный раствор рН 6.86; 2 - безводный ацетонитрил (0.1 М раствор ЫаСЮ^

Аналитический сигнал коэнзима (Зю в апротонных средах оказался плохо выраженным и нестабильным. С течением времени пики окисления и восстановления коэнзима (3,0 изменяли свою форму и уменьшались. Предположительно это связано с тем, что присутствующие в фоновом растворе перхлорат ионы являются очень сильными окислителями, тем

о

О ОД 0,2 0,3

Концентрация коэнзима (.>,». Ст*103

< 60 £

г 40 20

• РЯД1 а Ряд2

самым снижая устойчивость компонентов системы. Также, токи электровосстановления и электроокисления коэнзима <3ю в апротонных средах оказались значительно ниже, чем в водных.

В дальнейшем, для создания вольтамперомнтрической методики определения коэнзима О10 в косметических и фармацевтических препаратах, установили использовать водные буферные растворы для стабилизации аналитического сигнала, улучшения его воспроизводимости, а также для увеличения чувствительности разрабатываемой методики.

Выбор рН фонового электролита.

Для определения оптимального фонового электролита для аналитического определения коэнзима Ою готовили фоновые буферные растворы со следующими значениями рН: 4.80, 6.86, 8.0. Эксперимент проводился в условиях постоянно-токовой вольтамперометрии. В качестве индикаторного электрода использовали СУЭ.

Влияние рН фонового электролита на электрохимический сигнал окисления-восстановления коэнзима СЬо приведено на рисунке 4.

Рисунок 4. Зависимость предельного тока окисления (А) и восстановления (Б) коэнзима (Зю от его концентрации на СУЭ при разных значениях рН среды.

Из рисунка 4 видно, что при увеличении кислотности среды анодный ток окисления увеличивается, а катодный ток восстановления уменьшается. Предполагается, что в кислой среде происходит протонизация молекулы коэнзима СЬо, что облегчает его окисление. В щелочной среде наблюдается увеличение тока восстановления коэнзима <3ю вследствие полной

диссоциации гидроксилной группы (-ОН) гидрохинонной части молекулы коэнзима <3ш, и как следствие облегчение процесса восстановления.

Известно, что молекула коэнзима СЬо чувствительна к физико-химическим воздействиям, например, в щелочной и кислой среде, а также под действием света она становится нестабильна и начинает самопроизвольно трансформироваться. Поэтому, для создания методики в качестве фонового электролита приняли использовать фосфатный буферный раствор с рН 6.86. Это обусловлено стабильностью молекулы коэнзима СЫ в водных нейтральных средах. 3 качестве индикаторного электрода рекомендовали использовать СУЭ.

Получив катодный и анодный пики восстановления и окисления коэнзима Ою, пришли к выводу о целесообразности использования метода анодной вольтамперометрии,

Физико-химические закономерности протекания реакции окисления - восстановления коэнзима О10 на стеклоуглеродном

электроде

Для исследования обратимости электрохимического сигнала

восстановления коэнзима (^ю получили зависимость тока электровосстановления коэнзима (¡)10 от IV112 (рис. 5). Представленная на

Рисунок 5. График зависимости высоты РисУнке 5 зависимость \=%Шт) имеет

тока восстановления СоСЗю от скорости нелинейный характер, что указывает развертки потенциала в степени 1/2 в

фосфатном буферном растворе на СУЭ. на квазиобратимость

Концентрация Со(2ю 5-Ю"5 М.

электрохимического процесса

восстановления коэнзима 0Ш на СУЭ.

На основании проведенных исследований был предложен механизм окисления-восстановления коэнзима 0,0 на СУЭ в водных нейтральных средах :

Рисунок 6. Процесс окисления-восстановления коэнзима 0>ю. Как видно из схемы протекания процесса (рис. 6), электродный процесс сопровождается наличием последующей химической реакции.

Наличие последующей химической реакции, как для обратимого, так и необратимого электродных процессов можно определить по следующим критериям:

1. Линейной зависимости потенциала пика от логарифма IV1'2 (в случае обратимых и квазиобратимых процессов);

2. Сдвига потенциала в область положительных значений при уменьшении скорости развертки потенциала.

В данной работе показано, что для процесса

электровосстановления коэнзима (Зт на СУЭ данные критерии соблюдаются. Зависимость Е = 2) носит линейный характер (рис. 7).

Рисунок 7. Зависимость потенциала На рисунке 8 представлена предельного тока ЭВ Со<Зю от логарифма

скорости развертки потенциала в степени 'Л. вольтамперограмма тока

Концентрация Со<Зю 5 • 10"5 М

электровосстановления (ЭВ)

коэнзима (2ю в водной нейтральной среде на СУЭ при IV = 30 и 300 мВ/с.

Из представленной

вольтамперограммы видно, что при уменьшении скорости развертки потенциала наблюдается сдвиг потенциала катодной волны ЭВ коэнзима С)|0 в положительную область, а так же уменьшение предельного тока ЭВ коэнзима (Зш.

Таким образом, в данной главе исследовали закономерности

восстановления коэнзима С?ю на СУЭ. Показано, что на поверхности электрода идет квазиобратимый процесс осложненный наличием последующей химической реакции (рис. 6)

Исследование антиоксидантной активности коэнзима <310.

В данной работе для исследования антиоксидантных свойств коэнзима С?ю использовали вольтамперометрический метод, основанный на модельной реакции электровосстановленмя кислорода н.^ ртутно-пленочном электроде в области потенциалов от 0 до -1.2 В протекающий по следующему механизму:

02 + е 02" 02* + Я Н о2"

При введении коэнзима (Зю в электрохимическую ячейку на поверхности электрода происходила следующая реакция взаимодействия коэнзима с кислородом:

СоС>Н2 + Ог'~ Со<ЗН* + но2" со<зн* + но2" -»• Сод + н2о2

Для оценки антиоксидантной активности коэнзима <3ю в зависимости от его концентрации в электрохимической ячейке строили зависимости относительного изменения предельного тока ЭВ 02 от времени взаимодействия коэнзима (Зю с активными кислородными радикалами:

Рисунок 8. Вольтамперограмма тока ЭВ Сор ш в фосфатном буфере (рН = 6.86) на СУЭ при скорости развертки 30 мВ/сек (1) и 300 мВ/сек (2). Концентрация Со(2ш 9-10"4 М.

1о

Степень уменьшения тока ЭВ 02 являлась показателем антиоксидантной активности исследуемых веществ. По тангенсу угла наклона полученных зависимостей были определены коэффициенты антиоксидантной активности коэнзима СЬо в зависимости от концентрации по кинетическому критерию Ктн (мкмоль/л-мин):

где, // - ток ЭВ 02 в присутствии АО в растворе, мкА;

1а - ток ЭВ 02 в отсутствии АО в растворе, мкА:

С°г - исходная концентрация кислорода в растворе, мкмоль/л;

/ - время протекания реакции взаимодействия антиоксиданта с активными кислородными радикалами, мин.

Результаты определения антиоксидантной представлены на рисунке 9.

1,2

0,1 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5

Концентрация коэнзнма Ою, мМ

Рисунок 9. Значения показателя антиоксидантной активности коэнзима СЬо в зависимости от его концентрации в растворе.

Как видно из рисунка 9 максимальное значение коэффициента антиоксидантной активности коэнзима О,0 наблюдается в области концентраций от 0.5-10"3 до МО"3 моль/дм3. Таким образом, использование вольтамперометрического метода позволило наиболее полно исследовать антиоксидантные свойства коэнзима От, предположить вероятный механизм взаимодействия коэнзима СЬо с активными формами кислорода.

Влияния соединений различной природы на аналитический сигнал

коэнзима Ою-

В ходе дальнейших исследований изучили влияние антиоксидантов и витаминов различной природы, наиболее часто встречающихся в кремах и БАД, на аналитический сигнал коэнзима <3ю- В качестве объектов исследования выбрали следующие вещества: витамин С, витамины группы В (В,, Вб, В12), гиалуроновая кислота, глутатион, бензоат натрия. Исследования проводили в условиях постояннотоковой анодной вольтамперометрии, в качестве индикаторного электрода использовали СУЭ, в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода - ХСЭ. Фоновый электролит -фосфатный буферный раствор рН 6.86. Область потенциалов от -1.2 до 1.2 В, скорость развертки потенциала 100 мВ/сек. Увеличение аналитического сигнала коэнзима С>10 свидетельствует о том, что при введении исследуемого вещества в модельный раствор коэнзима <2ю, происходит его восстановление.

При съемке вольтамперограмм окисления модельных растворов коэнзима СЬо в присутствии исследуемых веществ, увеличение аналитического сигнала наблюдалась в присутствии витамина С, витамина В, и гаилуроновой кислоты (рис. 10).

Рисунок 10. Вольтамперограммы электроокисления коэнзима (3)0 - 2 (Ст = 0,0012 г/дм3); в присутствии витамина С (Сга = 0,025 г/дм3) - А; в присутствии витамина В, (Сш = 0,065 г/дм3) - Б; в присутствии гиалуроновой кислоты (Сга = 0.055 г/дм3 ) - В.

В таблице 1 представлены обобщенные результаты по влиянию веществ различной природы на аналитический сигнал коэнзима Ою-

Таблица 1. Влияние веществ различной природы на аналитический сигнал коэнзима Ою (п=3, Р=0.95)___

Исследуемое вещество Соотношение концентрации Ток электроокисления коэнзима Qio, I, мкА

коэнзима Qio к концентрации исследуемого вещества (г/дм3: г/дм3) До введения исследуемого вещества в раствор После введения исследуемого вещества в раствор

Аскорбиновая кислота 1:10 33.7 ±6.5 57.5 ± 13.1

Гиалуроновая кислота 1:40 31.1 ±4.6 42.3 ± 6.3

Глутатион 1:25 30.3 ±4.5 33.1 ±5.0

Витамин В, 1:30 30.2 ±4.0 40,7 ±8,1

Витамин Вб 1:40 30.9 ±4.6 29.7 ±4.5

Витамин В|2 1:40 26.9 ± 4.0 27.1 ±4.1

Бензоат натрия 1:2 28.1 ±4.2 26.9 ±4.0

Лимонная кислота 1:20 29.0 ± 4.4 28.6 ±4.3

Стеариновая кислота 1:1 27.5 ±4.1 28.0 ±4.2

Как показали результаты экспериментов, такие вещества как: витамин С, витамин В[ и гиалуроновая кислота способны восстанавливать коэнзим. Влияние остальных веществ на аналитический сигнал коэнзима СЬ0 оказалось незначительным, находясь в пределах погрешности. При аналитическом определении содержания коэнзима С?ю влияние витамина С, витамина Вь • гиалуроновой кислоты устраняется на стадии пробоподготовки при осаждении в осадок веществ, не растворимых в этаноле.

Разработка вольтамперомстрнческой методики определения коэнзима (Зю в фармацевтических и косметических препаратах

Для разработки методики определения содержания коэнзима (¿¡о в объектах косметической и фармацевтической промышленности был использован аналитический сигнал коэнзима СЬо при анодной развертке потенциала при Е = 0.5 В на СУЭ в области линейной зависимости предельного тока окисления коэнзима <3ю от его концентрации в растворе. Это область находилась в диапазоне концентраций от 0.05-Ю"3 до МО"3 моль/дм3 (рис. 11). Предел обнаружения коэнзима Ою составил 5-Ю"5 моль/дм3.

180 160 140 120 ■Й 100 ^ 80 60 40 20

у = 181Д9Х " О* = 0,9966

---- - -

) ОД 0/1 0,6 0,8 1 Концентрация Со^* мМ

Рисунок 11. Грздунровочный график зависимости аналитического сигнала коэнзима <3ю от его концентрации в фосфатном буферном растворе рН 6.86 на СУЭ

Подготовку проб биологически активных добавок и кремов, содержащих коэнзим Ою, осуществляли следующим образом: на аналитических весах брали навеску крема массой 5 г с точностью до 0.001 г (или с помощью дозатора отбирали 5 см3 исследуемого БАД), вносили в колбу объемом 50 см3, растворяли навеску пробы в 50 мл 96-% этилового спирта. Полученный раствор нагревали в термостате до температуры 35°С, интенсивно перемешивали в течение 15 минут, после чего центрифугировали в течение 20 минут при скорости 4500 об/мин. Далее для анализа дозатором отбирали аликвоту полученной надосадочной жидкости объемом 0.5 см3.

Все измерения проводились на вольтамперометрическом анализаторе «ТА-2» (ООО «Томьаналит» г. Томск) с подключенной к нему трехэлектродной ячейкой, состоящей из индикаторного СУЭ, хлорид-серебрянных электродов сравнения и вспомогательного. Использовали постоянно-токовую вольтамперометрию со скоростью развертки потенциала 100 мВ/с. Оптимальным фоном являлся фосфатный буферный раствор с рН 6.86. Для количественного определения содержания коэнзима Ою в косметических и фармацевтических препаратах сначала проводили съемку вольтамперограмм фонового электролита не менее трех раз. После получения доказательств отсутствия загрязнений в фоновом растворе и воспроизводимой фоновой кривой переходили к работе с исследуемым веществом. Количественно дозатором вносили определенный объем исследуемого раствора и проводили съемку вольтамперограмм в соответствии с последовательностью описанной выше. Расчет концентрации коэнзима (Зю в исследуемом растворе проводили методом добавок

Правильность методики количественного химического анализа определения коэнзима <3ю в модельных растворах проверялась методом «введено-найдено» (таблица 2).

Таблица 2. Результаты количественного определения коэнзима <3ю в модельных средах (Р = 0.95, п = 3).______

Введено, С- Ю5 моль/дмЗ Найдено, ОЮ5 моль/дмЗ £,%

5 6.9 38

20 24,5 23

40 47,4 19

60 68,4 14

80 86,1 8

100 105,4 5

Из таблицы 2 следует, что данные, полученные по предлагаемой методике удовлетворительны.

Определены следующие метрологические характеристики методики:

1. Показатель повторяемости

2. Показатель внутрилабораторной прецизионности

3. Показатель точности методики

Обобщенные результаты показателей качества методики для диапазона исследуемых концентраций коэнзима, приведены в таблице 3.

Таблица 3. Значение показателей точности, повторяемости, внутрилабораторной прецизионности (р = 0.95, п = 2,1 = 15)_

Диапазон измерений, мМ Показатели прецизионности (относительные значения) Показатель точности (границы относительной погрешности при Р = 0.95), ±Д, %

Показатель повторяемости, стг, % Показатель воспроизводимости ок, %

От 0,05 до 0,1 8 11 50

От 0,1 до 0,4 5 11 35

От 0,4 до 1 4 7 22

Указанные выше показатели качества результатов анализа являются установленными характеристиками погрешности для совокупности результатов анализа, полученных при соблюдении требований методики при ее реализации в отдельной лаборатории.

Используя разработанную вольтамперометрическую методику определили содержание коэнзима Ою в БАД и косметических продуктах, в качестве метода сравнения использовался спектрофотометрический метод.

В таблице 4 представлены результаты определения содержания коэнзима Ою в косметических средствах.

Таблица 4. Найденные значения концентрации коэнзима СЬо косметических кремах, определенные вольтамперометрическим спектрофотометрическими методами (п=3, Р-0.95)_

Наименование крема Вольтамперометрический метод C„-10s, моль/дм3 Спектрофотометрический метод С„'105, моль/дм3

Тайм Эксперт Коэнзим Q10 форте (крем для лица) 4,37 = 2.185 4.33± 1.732

Nivea QIO plus (крем для PVK) 4,90 ± 2.45 4,86 ± 1.944

Дневной крем против морщин Eveline cosmetics 8.70 ±4.35 8.05 == 3.22

Declare age Control омолаживающий крем с CoQio 9.20 ±4.6 8.90 ±3.56

По результатам исследований найдено низкое содержание коэнзима Qio в таких кремах как Тайм Эксперт Коэнзим Qi0 форте и Nivea Q10 plus- Низкое содержание коэнзима Qio в данных кремах может быть связано с нарушением технологии производства данных кремов, с неправильным хранением или с тем, что производители изначально добавили такое количество коэнзима Q10 в крема.

В таблице 5 представлены результаты по определению содержания коэнзима QI0 в БАД.

Таблица 5. Найденные значения концентрации коэнзима С>ю в биологически-активных добавках, определенные вольтамперометрическим и спектрофотометрическими методами (п=3, РЮ.95)

Исследуемый БАД

«Кудесан

Форте»

раствор

«Кудесан»

раствор

Содержание по

сертификату, С„,-104, моль/дм3 2,5

Допускаемые отклонения по ТУ, Ст-Ю', моль/дм' 2,3-2,8

4,8-5,5

Вольтамперометрическ ий метод, Сга-104, моль/дм'

2,6 ±0,91

5,0 ± 1.1

Спектрофотометрическ ий метод, Ст'104, моль/дм3

2,4 ± 0.96

4.9 ± 1.96

Как следует из данных таблицы 5, содержание коэнзима <3ю во всех двух формах БАД соответствовало заявленной дозировке, находясь в пределах допустимых в ТУ пограничных значений.

выводы

1. Изучены физико-химические закономерности протекания реакции окисления - восстановления коэнзима Q на поверхности СУЭ. Предположено, что на СУЭ электроде в водных нейтральных средах идет квазиобратимый процесс, осложненный наличием последующей химической реакцией при участии двух протонов и двух электронов (механизм ЕС -electrochemical-chemical).

2. Исследованы антиоксидантные свойства коэнзима Q

вольтамперометрическим методом в зависимости от его концентрации в ячейке. Предложен механизм взаимодействия коэнзима Q10 с кислородом и

его активными радикалами.

3. Оценено влияние веществ различной природы, содержащихся в косметических и фармацевтических продуктах, на аналитический сигнал коэнзима Q Выявлено, что наибольшее влияние на аналитический сигнал коэнзима Q оказывают витамин С, гиалуроновая кислота и витамин Bi.

4. Подобраны оптимальные условия вольтамперометрического определения коэнзима Q в косметических и фармацевтических препаратах: индикаторный электрод - СУЭ, анодная постоянно-токовая вольтамперометрия с областью потенциалов от - 1.2 В до 1.2 В, скорость развертки потенциала 100 мВ/с, использование калий дигидрофосфата рН 6.86 в качестве фонового электролита. Определения проводились в диапазоне

-3 -3 3

концентраций от 0.05-10 до 1-10 моль/дм.

5. Проведены сравнительные определения содержания коэнзима Q в

фармацевтических и косметических препаратах вольтамперометрическим и спектрофотометричеким методами.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Воронова О. А Имунноферментный и вольтамперометрический методы анализа суммарной активности антиоксидантов в плазме крови при сердечнососудистой патологии / Воронова (Аврамчик) О. А., Короткова Е. И., Плотников Е. В., Гусакова А. М., Суслова Т. Е., Дорожко Е. В., Петрова Е. В., Кустова (Якименко) А. А. // Фундаментальные исследования. - 2013 - №. 8-3. - С. 570-574

2. Petrova Е. V. Investigation of Coenzyme Q10 by Voltammetry / Petrova E. V., Korotkova E. I., Kratochvil В., Voronova O. A., Bulycheva E, V., Dorozhko E. V. // Procedía Chemistry. - 2014 - Vol. 10. - p. 173-178

3. Dimitrova S. Production of Metabolites with Antioxidant and Emulsifying Properties by Antarctic Strain Sporobolomyces salmonicolor ALi / Dimitrova S., Pavlova K., Lukanov L., Korotkova E. I., Petrova E. V., Zagorchev P., Kuncheva M. //Applied Biochemistry and Biotechnology. - 2013 - Vol. 169 - №. 1. - p. 301311

4. Петрова E. В. Одновременное определение окисленной и восстановленной формы коэнзима Qio методом вольтамперометрии / Петрова Е. В., Воронова (Аврамчик) О. А., Булычева Е. В. // Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XV Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва: в 2 т., Томск, 26-29 Мая 2014. - Томск: ТПУ, 2014 - Т. 1 - С. 220222

5. Петрова Е. В. Разработка методики определения коэнзима QI0 в фармацевтических препаратах вольтамперометрическим методом / Петрова Е. В., Воронова (Аврамчик) О. А., Короткова Е. И. // Новые методы аналитической химии : Первая Зимняя молодежная школа-конференция с международным участием, Санкт-Петербург, 17 Февраля-22 Марта 2013. -СПб: Соло, 2013 - С. 86.

6. Петрова Е. В. Электрохимические свойства коэнзима Qm на

стеклоуглеродном электроде / Петрова Е. В., Воронова (Аврамчик) О. А. //

23

Менделеев - 2013: сборник тезисов докладов VII Всероссийской конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам , Санкт-Петербург, 2-5 Апреля 2013. -СПб: Соло, 2013 - С. 141-143.

7. Петрова Е. В. Электрохимические свойства коэнзима Q]0 / Петрова Е. В., Воронова О. А. // Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции имени профессора Л.П. Кулева студентов и молодых ученых с международным участием: в 2 т., Томск, 13-16 Мая 2013. - Томск: ТПУ, 2013 - Т. 1 - С. 281-283

8. Petrova Е. V. Voltammetric determination of coenzyme Qi0 / Petrova E. V., Voronova O. A., Retinsky K. P. // Problems of Geology and Subsurface Development: Proceedings of the 17-th International Sientific Symposium of Students, postgraduates and young Scientists devoted to the 150-th Anniversary of Academician V.A. Obruchev and 130-th Anniversary of Academician M.A. Usov, Founders of Siberian Mining School, Tomsk, April 1-6, 2013. - Tomsk: TPU Press, 2013 - Vol. 2 - p. 828-830.

9. Petrova E. V. Electrochemical determination of coenzyme Qi0 / Dorozhko E. V., Petrova E. V., Voronova O. A., Bulycheva E. V., Dyorina К. V. // Euroanalysis XVII: Analytical chemistry for human well being and sustainable development. Book of Abstract, Warsaw, August 25-29, 2013. - Warsaw: BEL Studio Sp. 2013-p. 392.

Подписано в печать 13.10.2015. Тираж 100 экз. Кол-во стр. 24. Заказ 32-15 Бумага офсетная. Формат А5. Печать RISO. Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбх» 634034, г.Томск, ул. Усова 7, оф. 046. Тел. 8-9528074686