Определение витаминов и коэнзимов Q9 и Q10 в объектах со сложной матрицей методом жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Химический факультет

На правах рукописи

005052870

БЕНДРЫШЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ И КОЭНЗИМОВ О, И О,0 В ОБЪЕКТАХ СО СЛОЖНОЙ МАТРИЦЕЙ МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Специальность — 02.00.02 — аналитическая химия

О 4 ОПТ 2012

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2012

005052870

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

чл.-корр. РАН, профессор Шпигун Олег Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Центр Биоинженерии РАН Варламов Валерии Петрович

кандидат химических наук, начальник лаборатории фармацевтического анализа ООО «Технология лекарств» Чериобровкин Михаил Геннадьевич

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный университет»

Защита состоится 31 октября 2012 г. в 15 ч. 00 мин. в аудитории 446 химического факультета на заседании Диссертационного совета Д 501.001.88. по химическим наукам в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 28 сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

В современном химическом анализе существует задача определения витаминов и коэнзимов (2 в объектах различной природы, прежде всего в различных фармпрепаратах, продуктах питания, кормах, плазме крови и биологических тканях. Особую сложность представляет собой определение этих соединений в объектах, имеющих сложный состав, например, в продуктах питания. Существует большое число методик, ориентированных на определение витаминов и коэнзимов в различных матрицах. Однако подобные методики обладают рядом недостатков. Как правило, они позволяют одновременно определять только небольшое число соединений. При этом круг объектов, на который они ориентированы, в большинстве случаев ограничен одним или несколькими типами (например, плазма крови). При переходе от одного типа объектов к другому такие методики зачастую перестают работать и дают ошибочные результаты, например, методики, позволяющие определять водорастворимые витамины в фармацевтических препаратах, перестают работать при переходе к анализу продуктов питания. Пробоподготовка, которая используется во многих методиках, довольно сложна и не всегда обеспечивает необходимые степени извлечения и воспроизводимость, а используемые варианты детектирования не позволяют добиться требуемой селективности. Особенно остро необходимость в селективных и экспрессных методиках чувствуется при анализе продуктов питания (в том числе витаминизированных). Приведенные на сегодняшний момент в литературе способы определения витаминов и коэнзимов противоречивы и неоднозначны.

Задачу определения соединений в объектах со сложной матрицей можно решать различными путями. Для улучшения чувствительности и селективности можно либо использовать селективную пробоподготовку, либо обеспечить селективное разделение определяемых и мешающих соединений, либо вариант детектирования, позволяющий проводить селективное определение соединений без полного разделения. Для каждой из групп определяемых соединений существуют различные возможности использования того или иного пути или их комбинаций.

Таким образом, задача разработки новых подходов для определения витаминов и коэнзимов О, обеспечивающих определение широкого круга соединений в различных объектах со сложной матрицей с высокой селективностью и чувствительностью является актуальной. При этом используемые процедуры пробоподготовки должны быть максимально экспрессными и воспроизводимыми. Наилучшим методом для одновременного селективного определения соединений выбранных групп является жидкостная хроматография. Цель работы

Цель данной работы состояла в разработке способов определения водо- и жирорастворимых витаминов, а также коэнзимов О в объектах со сложной матрицей (пищевых продуктах, кормах, БАДах, премиксах, биологических объектах) методом ВЭЖХ. Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач: 1. Оптимизация пробоподготовки и выбор условий пробоподготовки, обеспечивающих количественное извлечение и определение наибольшего числа водорастворимых витаминов. - х

2. Исследование возможности использования упрощенных и ускоренных процедур пробоподготовки для определения жирорастворимых витаминов. Оценка возможности использования различных растворителей в качестве экстрагентов. Разработка экспрессных способов пробоподготовки.

3. Исследование стабильности окисленных и восстановленных форм коэнзимов Q9 и Qio в биологических матрицах. Разработка способа пробоподготовки, обеспечивающего сохранность исходного соотношения окисленных и восстановленных форм коэнзимов.

4. Исследование влияния различных параметров на селективность хроматографического разделения определяемых соединений. Выбор условий хроматографического разделения определяемых соединений для различных вариантов детектирования.

5. Оценка возможностей различных вариантов детектирования. Выбор варианта детектирования, обеспечивающего селективное определение соответствующей группы соединений в объектах с матрицами различной сложности. Выбор параметров детектирования.

6. Разработка способов определения водорастворимых витаминов, жирорастворимых витаминов и коэнзимов Qg и Qio, в объектах со сложной матрицей, включающих в себя пробоподготовку, хроматографическое разделение и детектирование определяемых соединений разными вариантами детекторов.

Научная новизна работы

1. Установлено влияние состава неподвижных и подвижных фаз и температуры на хроматографическое разделение водорастворимых витаминов, влияние полярных взаимодействий с сорбентом на порядок элюирования, селективность и асимметрию. Влияние температуры на хроматографическое поведение водорастворимых витаминов незначительно.

2. Предложено использовать для разделения витаминов гибридную неподвижную фазу Gemini С18, которая обеспечивает преимущество в эффективности и снижение асимметрии пиков разделяемых соединений по сравнению с колонками на основе гидрофобизованного силикагеля.

3. Предложены водно-этанольные смеси в качестве подвижной фазы для определения жирорастворимых витаминов. Использование этанола в качестве основного компонента подвижной фазы позволяет снизить стоимость анализа по сравнению с традиционными метанольными и ацетонитрильными фазами.

4. Показана неэффективность использования для экстракции жирорастворимых витаминов из образцов с полярной матрицей (каолин, мел) неполярных и слабополярных растворителей.

5. Показано, что добавка воды (5-10%) при экстракции жирорастворимых витаминов метанолом из твердых объектов ускоряет процесс экстракции и улучшает воспроизводимость без снижения степени извлечения за счет растворения агломератов, нерастворимых в метаноле.

6. Показана возможность использования градиентного элюирования для снижения мешающего влияния матрицы и роста чувствительности определения ретинола и ретинола ацетата.

7. Продемонстрирована возможность одновременного определения окисленных и восстановленных форм коэнзимов Q9 и Qio методом ВЭЖХ-МС. Показано, что использование источника химической ионизации при атмосферном давлении позволяет

получать одинаковые масс-спектры при использовании различного оборудования, что делает предложенный подход более универсальным. Практическая значимость работы

1. Предложены способы определения водорастворимых витаминов с различными вариантами детектирования. Способ позволяет проводить одновременное определение 14 водорастворимых витаминов за 14 мин. в случае использования масс-селективного детектирования или 12 водорастворимых витаминов за 35 мин. в случае использования спектрофотометрического детектирования. При этом используемые процедуры пробоподготовки обеспечивают количественное извлечение витаминов из различных матриц.

2. Продемонстрировано, что определение водорастворимых витаминов при помощи квадрупольного МС анализатора дает значимый выигрыш в стоимости, по сравнению с тандемным МС, при достаточной чувствительности определения, и существенный рост селективности, по сравнению со спектрофотометрическим детектированием.

3. Показана возможность использования в качестве экстрагента во время пробоподготовки твердых образцов 0,5% фосфорную кислоту при проведении ВЭЖХ-МС определения водорастворимых витаминов.

4. Расширен круг объектов, в которых возможно определение водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ-МС (витаминные препараты и добавки, витаминизированные минеральные воды, соки, спиртосодержащие напитки, витаминизированные корма, премиксы, молочные продукты, сухие пищевые продукты).

5. Предложен новый осадитель (смесь фосфорной и трихлоруксусной кислот) для коагуляции молочных продуктов во время пробоподготовки для определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ, позволяющий более эффективно осуществлять коагуляцию белков и обеспечивающий сохранность аскорбиновой кислоты.

6. Разработаны способы пробоподготовки молочных продуктов, позволяющие сократить требуемое время пробоподготовки для определения жирорастворимых витаминов в два и более раза.

7. Разработан способ экстракции жирорастворимых витаминов из объектов, матрица которых содержит большое количество полярных соединений.

8. Предложен способ хроматографического определения жирорастворимых витаминов с различными вариантами детектирования. Способ позволяет проводить определение 6 витаминов и витамерных форм за 20 мин.

9. Предложен способ пробоподготовки биологических тканей и плазмы крови, обеспечивающих неизменное соотношение окисленных и восстановленных форм коэнзимов в процессе пробоподготовки и хранения образцов.

10. Разработан способ одновременного хроматографического определения окисленной и восстановленной форм коэнзимов (¿9 и <3ю с масс-спектрометрическим детектированием.

В работе защищаются следующие положения:

Условия пробоподготовки при определении водорастворимых витаминов в фармпрепаратах, БАДах, кормах, пищевых продуктах, напитках и молочных продуктах.

Зависимости параметров хроматографического разделения водорастворимых витаминов от природы неподвижной фазы, природы и рН подвижной фазы, температуры и профиля градиента.

Условия хроматографического разделения и детектирования 14 водорастворимых витаминов со спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием. Результаты определения водорастворимых витаминов в реальных объектах.

Условия пробоподготовки при определении жирорастворимых витаминов в фармпрепаратах, БАДах, премиксах и молочных продуктах.

Зависимость степеней извлечения жирорастворимых витаминов из объектов с полярной матрицей от природы экстрагирующего растворителя.

Условия хроматографического разделения и детектирования шести жирорастворимых витаминов и витамерных форм со спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием. Результаты определения жирорастворимых витаминов в реальных объектах.

Условия пробоподготовки образцов плазмы крови и биологических тканей, позволяющие сохранять исходные соотношения окисленной и восстановленной форм коэнзимов Q9 и Qio.

Условия одновременного хроматографического разделения и детектирования окисленных и восстановленных форм коэнзимов Q9 и Qio с масс-спектрометрическим детектированием. Результаты определения коэнзимов Q? и Qio в реальных объектах. Апробация работы

Основное содержание работы изложено в 6 публикациях. Результаты исследований докладывались на International conference on Instrumental methods of analysis. Modern trends and application. (Ираклион, Греция, 2005); International congress on analytical science «ICAS-2006» (Москва, 2006). Предложенные схемы пробоподготовки и способы определения витаминов в продуктах питания. БАДах, премиксах, кормах, фармпрепаратах и напитках используются при проведении анализа в Аналитическом центре Химического факультета МГУ им. Ломоносова. Структура и объем работы

Диссертация изложена на 232 страницах машинописного текста и включает 58 рисунков, 80 таблиц и список цитируемой литературы из 297 наименований.

Основное содержание работы

Теоретическая часть работы состоит из трех глав. Первая, вторая и третья главы посвящены методам определения водорастворимых витаминов, жирорастворимых витаминов и коэнзимов Q. В главах рассмотрены основные подходы к определению витаминов и коэнзимов в объектах с различными типами матриц. Особое внимание уделено хроматографическим методам определения. Рассмотрены различные варианты детектирования, используемые при хроматографическом определении. Специальные секции посвящена рассмотрению методик, сочетающих в себе хроматографическое разделение с масс-селективным детектированием. Использование масс-селективного детектирования в сочетании с хроматографическим разделением позволяет добиться дополнительной селективности при анализе проб сложного состава. Однако, многие методологические вопросы, затрагивающих сочетание двух методов, остаются открытыми и требуют более детального рассмотрения при создании гибридного метода. Рассмотрены как способы определения индивидуальных соединений, так и способы, позволяющие определять одновременно несколько веществ или несколько форм одного вещества.

Отдельные разделы посвящены проблемам пробоподготовки при извлечении исследуемых соединений из объектов со сложной матрицей.

В четвертой главе перечислены реагенты и аппаратура, используемые в работе, а также описана техника эксперимента. В ходе работы использовали следующие хроматографические системы: Система ВЭЖХ-МС (Shiraadzu, Япония), состоящая из квадрупольного масс-спектрометрического детектора LCMS-2010A, оснащенного двумя источниками ионизации: источником химической ионизации при атмосферном давлении и источником электрораспылительной ионизации, насоса, системы четырехканального градиентного элюирования, двухволнового спектрофотометрического детектора, системного контроллера, дегазатора подвижной фазы и крана ввода пробы.

Система ВЭЖХ-МС (Agilent Technologies, США), состоящая из хроматографа Agilent 1100 с бинарным градиентным насосом, автоматической системой ввода пробы, термостатом колонок, диодно-матричным и квадрупольным масс-спектрометрическим детектором серии SL с источниками электрораспылительной ионизации и химической ионизации при атмосферном давлении.

Система ВЭЖХ (Agilent Technologies, США), состоящая из хроматографа Agilent 1200 с четырехканальным градиентным насосом, автоматической системой ввода пробы, термостатом колонок, диодно-матричным и флуориметрическим детектором.

Система ВЭЖХ Dionex 3000 (Dionex) состоящая из автосэмплера градиентного насоса, термостата колонки, крана ввода пробы и электрохимического детектора.

Регистрацию хроматограмм осуществляли с помощью персонального компьютера и программных пакетов LC-MS solution, ChemStation и Chromeleon.

В работе использовали неорганические и органические реагенты квалификации х.ч. и ч.д.а., в качестве растворителей использовали бидистиллированную деионизованную воду (установка очистки воды Milli-Q plus 185 (Millipore, Бедфорд, США); омическое сопротивление не ниже 18.2 МОм), органические растворители квалификации «для градиентной ВЭЖХ». В главе 4 также приведены условия проведения различных экспериментов (методики).

Пятая глава посвящена разработке способов совместного определения водорастворимых витаминов с различными вариантами детектирования. На первом этапе исследовали влияние различных факторов на разделение водорастворимых витаминов. Исследование закономерностей удерживания витаминов на различных неподвижных фазах на первом этапе проводили в градиентном режиме элюирования с использованием фосфатных буферных растворов в качестве подвижной фазы А, ацетонитрила в качестве фазы В, и спектрофотометрическим детектированием, и лишь затем перешли к использованию подвижных фаз на основе летучих органических кислот и их солей и масс селективному детектированию.

В ходе работы исследовали влияние на удерживание витаминов природы неподвижной фазы, рН подвижной фазы, температуры. Исследование влияния неподвижной фазы выполняли с использованием колонок Synergi Hydro-RP, Luna С 18(2), Gemini С18, Synergi Polar RP, Luna PFP(2), Zorbax Eclipse XDB C18, Zorbax SB-C18, Kroraasil С18. Влияние природы неподвижной фазы исследовали во всем используемом диапазоне рН (1,5-7,5 (для ряда колонок 2,5-7,5). При исследовании использовали градиентное элюирование.

Выяснилось, что колонки Synergi Polar RP и Luna PFP(2) не обладают достаточной емкостью и селективностью для разделения витаминов, и от их дальнейшего использования пришлось отказаться. При использовании колонка Kromasil С18 при содержании ацетонитрила в подвижной фазе менее 5% наблюдалось явление коллапса С18 групп, емкость и эффективность колонки значительно падала. Поскольку при градиентном разделении витаминов на начальном этапе процентное содержание ацетонитрила в подвижной фазе зачастую ниже 5%, дальнейшее использование колонки прекратили.

Остальные исследованные неподвижные фазы в целом показали приемлемые характеристики разделения модельной смеси витаминов. Общие закономерности влияния рН подвижной фазы на времена удерживания витаминов для всех исследуемых неподвижных фазах выглядят идентично. Однако, природа неподвижной фазы может заметно влиять на порядок элюирования витаминов и на селективность разделения некоторых пар витаминов. Зависимости времен удерживания водорастворимых витаминов от рН для колонки Luna С18(2) приведена на рис. 1.

Рн рН

Рис. 1 Зависимости времен удерживания витаминов от рН подвижной фазы. Колонка Luna С18(2) 250x4.6мм А) 1-никотинамид, 2-тиамин, 3-пиридоксин, 4-пнридоксаль, 5-никотиновая кислота, б-пиридоксамин, 7-аскорбиновая кислота; В) 1-биотин, 2-рибофлавин, 3-рибофлавин-5-фосфат, 4-цианокоболамин, 5-фолиевая кислота, 6-пантотеновая кислота

Различное влияние рН на удерживание прежде всего обусловлено природой витаминов. Часть витаминов являются кислотами, которые протонируются при понижении рН, что приводи к увеличению времени удерживания. Другая группа витаминов имеет основные свойства. За счет этого при понижении рН вещества становятся заряженными и время их удерживания уменьшается. Третья группа соединений не имеет ярко выраженной кислотной или основной природы и времена удерживания у этой группы практически не зависят от рН. Исходя из проведенных исследований, с учетом того, что ряд витаминов нестабилен в нейтральной и щелочной средах, целесообразно проводить разделение витаминов при рН 1,5-2.

Природа неподвижной фазы оказывает влияние на селективность и порядок элюирования витаминов. По результатам экспериментов, исследованные неподвижные фазы можно разделить на две группы. К первой группе относятся фазы Luna С 18(2) Zorbax Eclipse XDB С18 и Gemini С18, а ко второй Synergi Hydro RP и Zorbax SB-C18. Различие между этими группами хорошо заметно при рН 1.5-1.8. Ряды селективности для неподвижных фаз Luna С 18(2) и Synergi Hydro RP приведены на рис. 2.

При разделении витаминов на неподвижных фазах Luna С 18(2), Zorbax Eclipse XDB С18 и Gemini С18 при рН 1.5-1.8 (для Zorbax Eclipse XDB С18 при рН 2) никотиновая кислота элюируется перед аскорбиновой кислотой. Пики этих соединений хорошо разрешены между собой и с пиком никотинамида. Пики тиамина, никотинамида и

других полярных соединений симметричны, разрешения достаточно для одновременного количественного определения тиамина, никотинамида, никотиновой кислоты и аскорбиновой кислоты. Времена удерживания для пар рибофлавин-рибофлавин-5-фосфата и тиамин-тиамин фосфат практически совпадают, что не позволяет разделить эти соединения. Кроме того, время удерживания цианокоболамина также очень близко к времени удерживания рибофлавин-5-фосфата. Следует отметить, что времена удерживания соединений на колонке Gemini С18 несколько меньше, чем на остальных колонках.

—•—Luna С18 —*—Synergi Hydro

—L 5 L 7 L 8 L1 " "р- 13

L, i 12 - 11

О.ОО 0,50 1.QO 1.50 2.00 2.50 З.ОО 3.50 4,оО 4 50 5.00 5.50 б.ОО 6 50 7.00 7.50 8.00 8.50 goo

Рис. 2 Ряды селективности для неподвижных фаз Luna С18(2) и Synergi Hydro RP. рН подвижной фазы 1.7. Условные обозначения: 1-пиридоксамин, 2-тиамин фосфат, З-тиамин, 4-никотинамид, 5-аскорбиновая кислота, 6-никотиновая кислота, 7-пиридоксаль, 8-ниридоксин, 9-пантотеновая кислота, 10-фолиевая кислота, 11-цианокоболамнн, 12-рибофлавин-5-фосфат, 13-рибофлавин, 14-биотин

При разделении с использованием колонок Synergi Hydro и Zorbax SB CI8 при рН 1.5-1.8 аскорбиновая кислота элюируется перед никотиновой кислотой, при этом пики соединений не разделены до базовой линии. Пики никотинамида и тиамина несколько несимметричны, причем ни при одном из значений рН не удается добится одновременного полного разрешения пиков тиамина, никотинамида, аскорбиновой кислоты и никотиновой кислоты.

Различие в селективности и порядке элюирования витаминов на разных фазах связаны, скорее всего, с наличием у второй группы неподвижных фаз гидрофильного эндкеппинга, или каких-либо других полярных групп или вставок, обеспечивающих дополнительные взаимодействия с полярными соединениями, что и приводит к несколько лучшей селективности в парах рибофлавин-рибофлавин-5-фосфат и тиамин-тиамин фосфат, а так же к увеличению времени удерживания никотиновой кислоты и некоторой несимметричности пиков тиамина и никотинамида. Подтверждением этой гипотезы может служить тот факт, что порядок элюирования соединений на колонке Luna PFP(2), имеющей дополнительные полярные группы, аналогичен порядку элюирования на колонках Synergi Hydro и Zorbax SB С18.

К сожалению, полного разделения всех исследуемых витаминов и витамерных форм не удается достигнуть ни при одном из значений рН ни на одной из неподвижных фаз. Однако, в реальных медицинских препаратах, премиксах, БАДах и витаминизированных продуктах, как правило, витамины присутствуют только в одной из форм, поэтому в большинстве случаев можно подобрать подходящие условия для разделения присутствующих витаминов. Наилучшего разрешения удается добиться при значении рН 1.5-1.8.

Следует отметить, что гибридные фазы типа Gemeni С18 впервые применены для разделения водорастворимых витаминов. Как уже упоминалось выше, порядок элюирования водорастворимых витаминов при использовании Gemini С18 аналогичен порядку элюирования на фазах Luna С18(2) и Zorbax XDB С18, при этом емкость исследованной колонки несколько ниже, чем у традиционных фаз с тем же размером частиц, а эффективность немного выше. По видимому, это связано с тем, что глубина полимерного слоя и, как следствие, глубина пор фазы Gemini С18 меньше чем у фаз на традиционном силикагеле, что приводит с одной стороны к некоторому снижению эффективной площади сорбента и снижению емкости, а с другой стороны уменьшает пути диффузии в сорбенте, что снижает размывание пиков и увеличивает эффективность, При этом Gemini С18 позволяет варьировать рН в более широком диапазоне, что дает принципиальную возможность более широкого выбора условий разделения.

Одним из основополагающих условий для достижения наиболее эффективного разделения веществ является выбор оптимального градиентного режима. Используя различные градиентные профили, можно добиться хорошего разрешения хроматографических пиков веществ, имеющих близкие времена удерживания, а также существенно снизить общее время проведения анализа.

При варьировании условий градиентного элюирования изменяли начальную концентрацию ацетонитрила, продолжительность начального изократического участка, скорость увеличения концентрации ацетонитрила, конечную концентрацию ацетонитрила, продолжительность элюирования. В конце каждого хроматографического определения на короткое время увеличивали концентрацию ацетонитрила до 50% для того чтобы элюировать сильноудерживаемые примеси с колонки. После каждого градиентного элюирования хроматографическую систему уравновешивали при исходных условиях в течение 6 минут. При подборе оптимальных условий градиентного элюирования в качестве тестовой смеси использовали стандартную смесь витаминов.

Установлено, что наилучшего разделения слабоудерживаемых соединений удается достигнуть при нулевом содержании ацетонитрила в подвижной фазе на начальном этапе градиента. Оптимизированный профиль градиента приведен в табл. 1. Скорость потока подвижной фазы — 0,8 мл/мин.

Таблица X. Программа градиентного элюирования

Время, мин Концентрация MeCN, %

0 0

6 0

15 18

28 18

29 60

30 60

31 0

35 0

При исследовании влияния температуры провели серию экспериментов при температурах термостата колонки от 20 до 60°С включительно с шагом в 10°С. Верхний предел выбирался из соображений стабильности неподвижной фазы. Все эксперименты проводили в градиентном режиме №1.

Как и предполагалось, с увеличением температуры наблюдается уменьшение времен удерживания соединений. Однако, существенного снижения времен удерживании добиться не удалось, максимальное изменение при переходе от 20 к 60 °С составляло 1,52 минуты для всех витаминов. Уменьшение времен удерживания для различных

витаминов происходит практически синхронно, поэтому добиться улучшения разделения варьированием только температуры хроматографической колонки не удалось. Кроме того, выяснилось, что повышение температуры приводит к увеличению флуктуации базовой линии, поэтому все дальнейшие эксперименты проводили при температуре 20 °С.

Хроматограмма модельной смеси витаминов, полученная в оптимизированных условиях разделения приведена на рис. 3.

Таким образом, оптимальными условиями разделения витаминов являются следующие: градиентный профиль №1, элюент А: фосфорная кислота 0.6%, рН 1.70 (для Zorbax XDB С18 рН2), элюент В: ацетонитрил, температура колонки 20°С. Для разделения никотиновой и аскорбиновой кислот, следует использовать колонки Luna С 18(2) Zorbax XDB CI8 или Gemini CI8, а при необходимости разделять пары рибофлавин-рибофлавин-5-фосфат и тиамин-тиамин фосфат неподвижные фазы Synergi Hydro CI8 или Zorbax SB-C18.

S 9 j

i..------

Рис. 3. Хроматограмма стандартного раствора витаминов. Колонка Luna С18 (2) 250x4.6 мм. Градиент №1 (см. в табл. 1). СФ детектирование: 0-3.2 мин 292 нм, 3.2-7 мин 254 нм, 7-13 мин 292 нм, 13-18 мин 200 нм, 18-20 мин 297 нм, 20-21 мин 360 нм, 21-22,5 мин 270 нм, 23-24 мин 200 нм. Витамины: 1-пиридоксамин, 2-тиамин, 3-никотинамид, 4-никотиновая кислота, 5-аскорбиновая кислота, 6-пиридоксаль, 7-пиридоксии, 8-иантотеиовая кислота, 9-фолиевая кислота, 10-цианокоболамин, 11-рибофлавин, 12-биотин.

Для количественного определения каждого из витамина проводили подбор длины волны спектрофотометрического детектирования, позволяющей добиться наилучших пределов обнаружения и достаточного разрешения между пиком определяемого витамина и соседними пиками. Для ряда реальных объектов оптимальные длины волн могут не совпадать с максимумами поглощения. Это связано с собственным поглощением компонентов матрицы анализируемого образца. При оптимизации условий определения идентификацию пиков витаминов на полученных хроматограммах проводили с помощью предварительно записанной библиотеки спектров.

Пределы обнаружения, диапазоны линейности и использованные длины волн детектирования приведены в табл. 2.

Для рибофлавина и пиридоксина также подобрали условия флуориметрического детектирования (см. табл. 3), обеспечивающие лучшие пределы обнаружения и селективность.

При анализе сложных объектов спектрофотометрическое детектирование не всегда может обеспечить необходимую селективность определения витаминов, а флуориметрическое детектирование недоступно для большинства витаминов. Поэтому, для определения витаминов на фоне сложных матриц использовали масс спектрометрическое детектирование. При переходе от спектрофотометрического к масс-селективному детектированию необходимо учитывать некоторые особенности последнего. Использование фосфатных (как и других нелетучих) буферных растворов в качестве элюентов с масс-спектрометрическим детектором невозможно. Необходимо подобрать легколетучий водно-органический буферный раствор, в котором можно максимально разделить все водорастворимые витамины. В качестве органической фазы В использовали ацетонитрил, применение которого является типичным для обращенно-фазового варианта жидкостной хроматографии и имеет ряд преимуществ перед также широко используемым метанолом.

Таблица 2. Длины волн детектирования и метрологические характеристики определения витаминов

Витамин Длина волны, нм Предел обнаружения, мг/л Диапазон линейности, мг/л

Тиамин 244 0.01 0.03-100

Тиамин фосфат 244 0.02 0.06-100

Никотинамид 244 0.03 0.09-300

Никотиновая к-та 244 0.05 0.2-200

Аскорбиновая к-та 254 0.03 0.1-200

Пиридоксин 292 0.02 0.06-100

Пиридоксаль 292 0.1 0.3-100

Пиридоксамин 292 0.3 0.9-100

Пантотеновая к-та 200 0.2 0.6-200

Фолиевая к-та 297 0.006 0.02-100

Цианокоболамин 360 0.05 0.2-100

Рибофлавин— фосфат 270 0.02 0.06-50

Рибофлавин 270 0.005 0.02-10

Биотин 200 0.06 0.2-100

Таблица 3. Условия флуориметрического детектирования и пределы обнаружения для рибофлавина и пиридоксина

Витамин X возбуждения, нм X испускания, нм Диапазон линейности, мг/л Пределы обнаружения, мг,л

Пиридоксин 292 400 0.01-20 0.003

Рибофлавин 440 520 0.002-5 0.0005

Прямая замена фосфатного буферного раствора на летучий ацетатный (с поправкой на достижимые значения рН) при использовании неподвижной фазы Бупе^і Нуёго-КР привела к ухудшению формы пиков большинства витаминов, а также увеличению

количества самих пиков, например, для тиамина, фолиевой кислоты, рибофлавина.

Поскольку сочетания свойств подвижных и неподвижных фаз могут влиять на поведение витаминов, разработку способа определения водорастворимых витаминов с масс спектрометрическим детектированием проводили на нескольких неподвижных фазах: Synergi Hydro RP, Luna С 18(2), Zorbax XDB С18, Gemini С18. Предварительный подбор условий проводили, используя колонки 250x4,6мм.

В качестве подвижной фазы А в режиме градиентного элюирования опробовали уксусную, муравьиную и трифторуксусную кислоты для диапазона рН 2-3.5 (1,5 для трифторуксусной) и 50 мМ ацетатно-аммонийные, формиатно-аммонийные и трифторацетатно-аммонийные буферы для значений рН от 3.5 до 7. Значение рН варьировали с шагом 0.5. Помимо выбора рН и состава подвижной фазы осуществляли подбор профиля градиентного элюирования. Параллельно с подбором

хроматографических условий проводили выбор условий масс селективного детектирования и оценку пределов обнаружения витаминов.

Поскольку масс селективный детектор обладает исключительной селективностью, нет необходимости добиваться полного разделения всех витаминов. Достаточно добиться отделения пиков витаминов от неудерживаемых и слабоудерживаемых соединений, элюирующихся со временами удерживания, близкими к мертвому, разделить витамины, имеющие близкие массы и добиться элюирования витаминов несколькими группами. Отсутствие необходимости полностью разделять все витамины позволяет, в дальнейшем, применить колонки меньшего размера, сократить время анализа и улучшить пределы обнаружения за счет возросшей эффективности. Использованный профиль градиентного элюирования приведен в табл. 1.

Наилучших результатов (по сравнению с неподвижными фазами Synergi Hydro-RP и Luna С 18(2)) удалось добиться при использовании колонок Gemini С18 и Zorbax Eclipse XDB С18 в градиентном режиме на растворах кислот при низких рН (рис. 4).

1.2 —_______ _ i Í

Рис. 4 Хроматограмма модельной смеси водорастворимых витаминов.

Пики: (1) - пиридоксамин, (2) - тиамин, (3) - тиамин фосфат, (4) - пнридоксаль, (5) - пиридоксин, (6) -аскорбиновая ксилота, (7) - никотиновая кислота, (8) - никотинамид, (9) - фолиевая кислота, (10) -цианокобаламин, (11) - рибофлавин, (12) - рибофлавин фосфат.

Колонка: Gemini С18 250 х 4.6 мм, 5 мкм; элюент: А — уксусная кислота (рН 2.9), В — ацетонитрил; скорость потока 0.8 мл/мин; градиентное элюирование (0-6 мин 0% В, 15-28 мин 18% В, 29-30 мин 60% В, 31-35 мин 0% В); спектрофотометрическое детектирование на длине волны 270 нм.

Хорошее разделение витаминов наблюдали также при увеличении рН ацетатно-аммонийных буферных растворов до 4-7, однако при этом пики некоторых витаминов раздваивались (пиридоксамин, тиамин, фолиевая кислота, никотинамид, рибофлавинфосфат). При дальнейшем увеличении рН наблюдали значительное снижение эффективности неподвижной фазы, пики витаминов становились несимметричными, иногда наблюдали раздвоение для пиков витаминов. Вероятно, причиной раздвоения хроматографических пиков некоторых витаминов является совокупность влияния подвижной и неподвижной фаз. Возможно, при определенных значениях рН ацетатных или формиатных буферных растворов происходит образование нескольких форм одного витамина. Колонка Gemini С18 обеспечивает несколько лучшую эффективность по сравнению с колонкой Zorbax XDB С18. Примеры разделения витаминов на колонке подобного типа в литературе не встречаются. Использование гибридной неподвижной фазы обеспечивает лучшую селективность за счет сокращения путей диффузии, больший рабочий диапазон рН, который обеспечивает в случае необходимости более гибкое

варьирование хроматографических условий, и позволяет полностью избежать взаимодействий анализируемых соединений с активными группами силикагеля, которые в данном сорбенте полностью закрыты особым полимерным слоем. По-видимому, именно полное исключение взаимодействий витаминов с силанольными и силоксановыми группами приводит к тому, что искажения формы и возникновения дополнительных пиков при использовании Gemini С18 практически не происходит.

От использования трифторуксусной кислоты в качестве подвижной фазы дальнейшем решено было отказаться. Выяснилось, что при анализе реальных объектов использование трифторуксусной кислоты зачастую приводит к образованию дополнительных пиков и артефактов на хроматограмме. Кроме того, трифторуксусная кислота может приводить к сокращению срока службы и порче прибора.

Как уже упоминалось выше, при масс-селсктивном детектировании не обязательно добиваться полного разделения всех витаминов, достаточно просто добиться какого-то удерживания, чтобы отделить анализируемые соединения от слабоудерживаемых компонентов матрицы, и разделения хотя бы на несколько групп веществ, элюирующихся примерно в одно и то же время (чтобы не снизился выход по ионизации отдельных компонентов). В связи с этим, для снижения времени анализа и получения менее размытых пиков целесообразно использовать хроматографические колонки меньших размеров. К сожалению, в нашем распоряжении не было колонки Gemini С18 меньших размеров, поэтому дальнейшие исследования проводили с использованием колонки Zorbax Eclipse XDB CI8 150x4,6мм. Для этой колонки осуществлялась дальнейшая оптимизация условий разделения и детектирования витаминов.

В ходе работы выяснилось, что наилучшие результаты разделения витаминов на колонке Zorbax Eclipse XDB CI8 в градиентном режиме достигаются при использовании следующих подвижных фаз: Вариант 1: А — раствор уксусной кислоты с рН 2.9, В — ацетонитрил; Вариант 2: А — раствор муравьиной кислоты с рН 2.5, В — ацетонитрил. В ходе оптимизации условий определения разработали модифицированный профиль градиента, приведенный в табл. 4. Времена удерживания витаминов для элюентов на основе уксусной и муравьиной кислот с добавками ацегонитрила приведены в табл. 5 и 6.

В ходе исследования оптимизировали условия масс-спектрометрического детектирования. Оценивали чувствительность определения при использовании различных режимов ионизации при атмосферном давлении (электрораспылительной и химической, в режиме регистрации положительных ионов), варьировали напряжение фрагментора.

В качестве критерия выбора наиболее подходящего источника ионизации, рассматривали отношение сигнал/шум, характеризующее пределы обнаружения. При использовании ацетатно- (формиатно-) аммонийного буферного раствора и ацетонитрила в качестве подвижной фазы в масс-спектрах исследуемых соединений, снятых в режиме регистрации положительных ионов, присутствовали протонированные молекулы, ионы, соответствующие аддуктам с аммонием, различные фрагментарные ионы определяемых соединений и многозарядные ионы (для ЭРИ). Преобладающим являлся аддукг состава [М+Н]+. Наилучшего соотношения сигнал/шум для большинства водорастворимых витаминов удалось достигнуть в режиме элеетрораспылительной ионизации с регистрацией положительных ионов Дальнейшие определения проводили в этом режиме. С учетом зависимости чувствительности определения от напряжения фрагментора и на основании времен удерживания компонентов модельной смеси витаминов, мы разработали

программный режим масс-спектрометрического детектирования для обоих растворов кислот (табл. 7 и 8).

Таблица 4. Программа градиентного элюирования для колонки Zorbax Eclipse XDB С18 150x4.6мм

Время, мин Концентрация MeCN, %

0.0 0

4.6 0

8.2 40

13.4 40

13.8 60

14.2 60

14.6 0

16.6 0

Таблица 5. Времена удерживания витаминов и селективности (а). Элюент: уксусная кислота (рН 2.9) и ацетонитрил

Витамин tR, мин а

Пиридоксамин 1.9

Тиамин 2.1 1.08

Тиаминфосфат 2.2 1.06

Аскорбиновая кислота 2.5 1.13

Пиридоксаль 3.1 1.23

Никотиновая кислота 3.1 1.02

Никотинамид 3.6 1.15

Пиридоксин 3.7 1.04

Пантотеновая кислота 10.5 2.84

Фолиевая кислота 12.7 1.21

Цианокобаламин 13.5 1.06

Рибофлавин 13.7 1.02

Биотин 13.9 1.02

Рибофлавин-5'-фосфат 15.2 1.10

Таблица 7 Параметры программного режима масс-спектрометрического определения

(элюент: уксусная кислота (рН 2.9) и ацетонитрил)

Таблица б. Времена удерживания витаминов Оя) и селективности (а). Элюент: муравьиная кислота (рН 2.5) и ацетонитрил

Витамин tR, мин а

Пиридоксамин 1.9

Тиамин 2.3 1.15

Тиаминфосфат 2.3 1.02

Аскорбиновая кислота 2.8 1.20

Никотинамид 3.1 1.10

Никотиновая кислота 3.3 1.06

Пиридоксаль 3.7 1.14

Пиридоксин 5.1 1.35

Пантотеновая кислота 10.8 2.14

Фолиевая кислота 12.5 1.15

Цианокобаламин 13.5 1.08

Рибофлавин-5'-фосфат 13.7 1.01

Рибофлавин 13.8 1.00

Биотин 14.0 1.02

Таблица 8 Параметры программного режима масс-спектрометрического определения

(элюент: муравьиная кислота (рН 2.5) и ацетонитрил)

Время, мин Витамин Опр. ион, m/z Напр. фраг., В Время, мин Витамин Опр. ион, m/z Напр. фраг., В

Тиамин 265 Гиамин 265

Тиаминфосфат 345 Тиаминфосфат 345

Никотиновая кислота 124 Никотиновая кислота 124

0.0-9.0 Никотинамид 123 100 0.0-4.5 Никотинамид 123 100

Пиридоксин 170 Тиридоксаль 168

Пиридоксаль 168 Тиридоксамин 197

Пиридоксамин 169 Аскорбиновая кислота 194

Аскорбиновая кислота 194 4.5-8.0 Пиридоксин 170 150

9.0-11.5 Пантотеновая кислота 220 150 8.0-11.5 Пантотеновая кислота 220 150

11.5-12.5 Фолиевая кислота 295 250 11.5-12.9 Фолиевая кислота 295 200

Рибофлавин 377 'ибофланин 377

12.5-14.2 Биотин 489 100 12.9-22.0 5ибофлавинфосфат 457 150

Цианокобаламин 1355 эиотин 489

14.2-22.0 Рибофлавинфосфат 457 200 Дианокобаламин 1355

Хроматограмма модельной смеси четырнадцати витаминов в условиях №1 с использованием программного режима при масс-спектрометрическом детектировании представлена нарис. 5.

Количественные характеристики хроматографического определения витаминов в условиях №1 с использованием масс-селективного детектирования представлены в табл. 9,

ТО

j-----/V

V_

Рис. 5. Реконструкция хроматограммы модельной смеси водорастворимых витаминов по выделенным ионам.

Пики: (1) - тиамин, (2) - тиаминфосфат, (3) - рибофлавин, (4) - рибофлавинфосфат, (5) - никотиновая кислота, (6) - никотинамид, (7) - пантотеновая кислота, (8) - пиридоксин, (9) - пиридоксаль, (10) -пиридоксамин, (11) - биотин, (12) - фолиевая кислота, (13) - цианокобаламин, (14) - аскорбиновая кислота.

Условия, Колонка: Zorbax Eclipse XDB С18 150x4.6 мм, 5мкм; элюент: А — уксусная кислота (pH 2.9), В — ацетонитрил; скорость потока 0.8 мл/мин; градиентное элюирование (0-4.6 мин 0% В, 10-17.8 мин 18% В, 18.4-19.0 мин 60% В, 19.6-22 мин 0% В); электрораспылительная ионизация, режим регистрации положительно заряженных ионов, масс-селективное детектирование по заданным ионам (m/z 123,124,168, 169,170,194,220,265,345,377,442,457,489,1355).

Таблица 9. Количественные характеристики хроматографического определения водорастворимых

Витамин Калибр. уровень1 Уравнение линейной зависимости2 Коэфф. коррел., R2 Диапазон линейност и, мг/л Предел обнаружения

мкг/л нг

Тиамин 8 5 = 47668 с 0.999 0.150-50 50 1

Тиаминфосфат 8 5=73251 с 0.999 0.1-50 30 0.6

Рибофлавин 8 5 = 618779 с 0.999 0.01-5 3 0.06

Рибофлавинфосфат 8 5 = 147493 с 0.996 0.06-50 20 0.4

Никотиновая кислота 8 5 = 123092 с 0.998 0.05-50 15 0.3

Никотинамид 8 5 = 181312с 0.999 0.04-50 12 0.2

Пантотеновая кислота 8 5 = 253351 с 0.999 0.06-50 20 0.4

Пиридоксин 8 5 = 337231 с 0.998 0.01-50 3 0.06

Пиридоксаль 8 5 = 221227 с 0.999 0.03-50 10 0.2

Пиридоксамин 8 5 = 47565 с 0.997 0.09-50 30 0.6

Биотин 8 5 =83543 с 0.999 0.05-50 16 0.3

Фолиевая кислота 8 5= 16186с 0.998 0.06-50 20 0.4

Цианокобаламин 8 5 = 23915 с 0.999 0.150-50 50 1

Аскорбиновая кислота 7 5 = 200293 С 0.999 0.8-150 250 5

Характеристики хроматографического определения в условиях №2 в целом аналогичны приведенным. Пределы обнаружения в условиях №2 430 мкг/л для аскорбиновой кислоты, 5—50 мкг/л для остальных витаминов. Следует отметить, что пределы обнаружения, достигаемые в режиме электрораспылительной ионизации,

достаточно низки практически для всех витаминов, что позволяет работать с реальными объектами без предварительного концентрирования. К сожалению, для качественного и количественного определения цианокобаламина необходимо проводить предварительное концентрирование, поскольку даже в обогащенных продуктах питания витамин В12 содержится в количествах, на 1-3 порядка меньших, чем полученные значения пределов обнаружения.

За счет оптимизации условий градиентного элюирования время анализа уменьшилось с 35 до 16.6 мин, время элюирования последнего витамина— с 14.0 до 9.9 мин.

Предложенные подходы использовали при анализе реальных объектов. Во время пробоподготовки твердых образцов экстракцию витаминов проводили 1% раствором фосфорной кислоты, а для осаждения белков в молочных продуктах использовали смесь фосфорной и трихлоруксусной кислот. Предложенный осадитель позволяет более эффективно (по сравнению с традиционными) коагулировать белки не прибегая к нагреванию. Как правило, в сочетании с масс-спектрометрическим детектором используют только летучие экстрагент. Однако, объем пробы, вводимый в хроматограф, составляет всего 20 мкл, а содержание фосфорной кислоты в вытяжке сопоставимо с содержанием в ней экстрагируемых из образцов нелетучих соединений. Эксплуатация хромато-масс-спектрометра в течении нескольких месяцев не выявила никаких проблем, возникающих вследствие использования фосфорной кислоты.

Результаты определения витаминов в некоторых объектах приведены ниже, в табл. 10 и 11. Полученные результаты хорошо согласуются с паспортными данными.

Таблица 10. Результаты определения витаминов в соке, сухих хавтраках и печенье (п - 3, Р = 0,95)

Витамин Сок Тонус Сух. Завтрак «СНОСА» Печенье «Расти Большой»

Найдено, мг/л Паспорт, мг/л Найдено, мг/100г Паспорт, мг/ЮОг Найдено, мг/ЮОг Паспорт, мг/ЮОг

Витамин В[ 1.03±0.07 1.1 0.7б±0.05 0.7 2.210.2 2.2+0.22

Витамин Вз 1.23±0.04 1.2 0.8210.05 0.8 2.36+0.06 2.3+0.23

Витамин Вз 13.8+0.8 13.5 9.1+0.3 9.0 21±1 21.0+1.05

Пантотеновая кислота 4.610.3 4.5 3.0+0.2 3 1.7+0.3 -

Витамин В6 1.5+0.1 1.5 1.06+0.06 1.0 3.1+0.1 3.110.31

Биотин 0.12+0.01 0.11 0.07+0.01 0.075 н.о. -

Фолиевая кислота 0.16±0.01 0.15 0.11+0.01 0.1 0.45+0.03 -

Цианокобаламин н.о. 0.0008 н.о. 0.00075 н.о. -

Аскорбиновая кислота 34±4 45 29+2 30 32.8+0.5 3416.8

Таблица 11. Результаты определения витаминов в молочной смеси «Агуша», витаминном препарате «Ундевит» и кормовой добавке «Финишер» (п = І,Р = 0,95)

Витамин «Агуша» «Ундевит» Корм «Финишер»

Найдено, мг/1000 г Паспорт, мг/1000 г Найдено, мг/драже Паспорт, мг/драже Найдено, мг/ЮОг Паспорт, мг/ЮОг

Витамин В| 0.40Ю.04 0,4 1.910.1 2 1.0410.08 1

Витамин В, 0,6210.03 0,6 2.010.1 2 1.3+0.3 1

Витамин В3 4,110,1 4 1911 20 2612 25

Пантотеновая кислота 3.0+0.2 3 3.010.1 3 5.11Ю.08 5

Витамин В6 0.4210.03 0,4 3.1+0.1 3 5.210.5 5

Фолиевая кислота 0.0610.01 0,06 0.07110.003 0.07 0.0410.01 0,03

Аскорбиновая кислота 6213 60 73+3 75 4413 50

Биотин - - - - 0.05Ю.01 0.05

Цианокоболамин - - 0.00210.0006 0.002 - -

Следует отметить, что результаты определения витаминов в тех же объектах, полученные с использованием спектрофотометрического детектирования, совпадали с полученными при масс спектрометрическом детектировании в случае объектов с простой матрицей (фармпрепараты, кормовая добавка и т.п.), однако были завышены для целого ряда витаминов в случае анализа объектов с более сложной матрицей.

Шестая глава диссертации посвящена разработке метода определения жирорастворимых витаминов. На начальном этапе подобрали условия разделения ретинола, ретинола ацетата, холькальциферола, эргокальциферола, токоферола и токоферол ацетата. В большинстве работ для разделения жирорастворимых витаминов используются подвижные фазы на основе ацетонитрила или метанола. Однако, метанол довольно токсичен, в связи с чем его использование желательно ограничить, а ацетонитрил довольно дорог. Исходя из соображений меньшей стоимости и токсичности, как альтернатива и дополнение к ацетонитрилу и метанолу, в качестве органического компонента подвижной фазы опробовали этанол. Этанол обладает несколько большей элюирующей силой, по сравнению с ацетонитрилом и метанолом, что позволяет варьировать условия разделения в более широких пределах. Подбор условий осуществляли на неподвижных фазах Диасфер С18, Диасфер С16, Luna С18(2), Synergy Hydro RP, Gemini С18, Onyx. Помимо изократического варианта элюирования опробовали и градиентный.

Установлено, что ни одна из предложенных бинарных подвижных фаз на основе этанола и метанола не обеспечивает полного разделения эргокальциферола и холькальциферола за приемлемое время, причем простое снижение элюирующей силы не приводит к желаемым результатам. Наилучший результат достигается при использовании неподвижных фаз, которые помимо гидрофобных взаимодействий с разделяемыми соединениями обеспечивают еще и полярные взаимодействия (фазы с полярным эндкэппингом, например Synergi Hydro RP, или фазы с неплотным или отсутствующим эндкэпингом). Установлено, что использование ацетонитрила в тех же концентрация, что и метанола приводит к существенному увеличению времени удерживания токоферола и токоферола ацетата. По-видимому это связано с природой самого растворителя, который до некоторой степени может проявлять свойства основания, в отличии от метанола, который обладает слабыми кислотными свойствами. Этанол обладает несколько более сильной элюирующей способностью по сравнению с метанолом, а закономерности удерживания витаминов при использовании этанола аналогичны. При использовании изократического режима элюирования, в отсутствии необходимости разделять эргокальциферол и холькальциферол целесообразно использовать элюент состоящий из этанола и воды, рис. 6.

Рис. 6 Хроматограмма раствора модельной смеси шести витаминов. Колонка Диасфер 110-С18, 150^4,6 мм. Элюент: этанол - вода 95:5, скорость потока 0,8 мл/мин. Концентрация витаминов в смеси, мг/л: А - 18,0; А (ацетат) - 22,7; I), 10,0; I), - 40,(1: Е - 105,0; Е (ацетат) - 150,0. Детектирование спектрофотометрическое при 285 нм

Как видно из хроматограммы и данных таблицы, добиться разрешения витаминов Di и D3 за желаемое время не удалось. Для улучшения разрешения между пиками витаминов Dt и D3 можно использовать более длинную колонку и подвижную фазу с меньшей элюирующей способностью. Однако, эксперименты показали, что за приемлемое время анализа достигнуть полного разделения не удается, поскольку время удерживания токоферола и токоферола ацетата значительно возрастает. Для того, чтобы достигнуть разделения всех шести витаминов за приемлемое время и при этом добиться полного разделения эргокальциферола и холькальциферола можно использовать подвижную фазу более сложного состава. Для возможности более широкого варьирования параметров элюирования в качестве мобильной фазы выбрана трёхкомпонентная система: этанол-вода-ацетонитрил. В качестве неподвижной фазы использовали колонку Synergi Hydro RP, поскольку она обладает гидрофильным эндкэпингом, позволяющим эффективнее разделять эргокальциферол и холькальциферол. Хроматограмма, полученная в подобранных, условиях приведена на рис. 7.

Рис. 7 Хроматограмма модельной смеси жирорастворимых витаминов в оптимальных условиях. Колонка вупегй! 4и Ну(1го-1*Р 250*4.6 мм; скорость потока 2,0 мл/мин, температура 35°С. Элюент: этанол - вода - ацетонигрил 5:5:90. Детектирование при 285 нм.

Подбор условий разделения жирорастворимых витаминов в режиме градиентного элюирования также проводили с использованием колонки Эупе^ Нуёго-КР. Основной задачей при подборе условий градиентного элюирования было «растянуть» начальный участок хроматограммы. Элюирование начинали с большей концентрацией воды в подвижной фазе, затем содержание воды уменьшали. Опробовали серию градиентных профилей элюирования. Наилучший профиль приведен в табл. 12. Хроматограмма, полученная в предложенных условиях, приведена на рис. 8.

Таблица 12. Профиль градиентного элюирования для определения жирорастворимых витаминов. Скорость потока 1,5 мл/мин, температура 35°С. (остальную долю в элюенте составляет аиетонитрил).

Время Содержание воды, % Содержание этанол, %

0 13 0

6 13 0

7 3 6

17 3 6

29 13 0

А_Я-А _

Рис. 8. Хроматограмма модельной смеси жирорастворимых витаминов в градиентном режиме табл. 12. Колонка Synergi 4u Hydro-RP 250*4.6 мм; скорость потока 1,5 мл/мин, температура 35°С. Детектирование 285 нм.

В ходе исследований опробовали 4 варианта детектирования жирорастворимых витаминов: спектрофотометрическое, флуориметрическое, электрохимическое и масс спектрометрическое. Достигнутые пределы обнаружения и подобранные условия детектирования приведены в табл. 13.

Таблица 13. Характеристики разных вариантов детектирования жирорастворимых витаминов.

Вещество Спектрофотометр ич Флуориметрическое Электрохимическое Масс спектрометр.

Предел, мг/л X, нм Предел, мг/л ^-воэб/^исп., нм Предел, мг/л Потенц, мВ Предел, мг/л т/г, режим. АРСІ+

А 0,01 325 0.001 325/470 0,0007 +1400 0.01 269

А(ацетат) 0,003 325 0.003 325/470 0,008 +1400 0,01 269

о2 0,03 265 - - 0.002 +1400 0,0002 385 (367)

Оз 0,03 265 - - 0.002 + 1400 0,0002 397 (379)

Е 0,2 295 0.06 290/340 0.01 + 1400 0.2 431

Е(ацетат) 0,3 295 20 290/340 0,03 + 1400 0,3 472

Следует отметить, что целесообразность использования того или иного варианта детектирования зависит от природы анализируемого объекта и используемого способа пробоподготовки. Наилучшую селективность обеспечивает масс спектрометрический вариант детектирования. Это практически единственный вариант детектирования, который позволяет определять витамин Б в сложных образцах без предварительного концентрирования. Использование электрохимического варианта детектирования обеспечивает низкие пределы обнаружения, однако, в ряде случаев, при анализе реальных объектов возникает большое мешающее влияние матрицы. Флуориметрическое детектирование не позволяет проводить определение витамина Б и токоферол ацетата, однако обеспечивает снижение пределов обнаружения ретинола, токоферола и ретинола ацетата. Спектрофотометрическое детектирование является широко распространенным, универсальным, достаточно чувствительным, но наименее селективным. Спектрофотометрическое детектирование подходит для определения жирорастворимых витаминов в объектах с относительно простым составом.

При исследовании возможных путей оптимизации пробоподготовки исследовали несколько типов реальных объектов. Для каждого из них необходимо использовать свою стратегию пробоподготовки. Разумеется, рассмотренные типы реальных объектов не охватывают всего многообразия существующих в природе и на производстве матриц. Однако, изученные образцы являются одними из наиболее часто встречающихся в практике витаминного анализа.

Для зерновых премиксов, блендов, сухих фармпрепаратов, БАДов целесообразно использовать простую экстракцию без сапонификации, поскольку образцы довольно просты по составу матрицы и формам жирорастворимых витаминов и не содержат больших количеств жиров. На полноту извлечения жирорастворимых витаминов влияет, прежде всего, природа растворителя, используемого в качестве экстрагента. При выборе оптимальных условий проведения экстракции тестировали несколько наиболее распространенных растворителей: метанол, этанол, гексан, диэтиловый эфир, дихлорметан, бутанол, ацетонитрил. Экстракцию проводили в ультразвуковой ванне. Для предотвращения окисления витаминов в экстрагент добавляли ВНТ. Для оценки эффективности растворителей и процедуры однократной экстракции в целом, провели повторные экстракции теми же растворителями из образцов, уже подвергавшихся экстракции. Наилучшим экстрагентом оказался метанол. Использование метанола позволяет извлечь 90 и более % витаминов однократной экстракцией и добиться почти

100% извлечения при повторном экстрагировании. При использовании в качестве экстрагентов других растворителей степени извлечения витаминов были значительно ниже.

Из полученных данных можно сделать вывод, что гексан плохо подходит для экстракции витаминов из зерновых премиксов, поскольку степени извлечения в любом из опробованных способов экстракции не превышают 70% для токоферола ацетата и еще ниже для остальных витаминов. Поскольку растворимость жирорастворимых витаминов в гексане высокая, то низкие степени извлечения, особенно при использовании экстракции в аппарате Сокслета, должны иметь какую-то другую причину. Витамины вносятся в зерновые премиксы в виде сухих порошкообразных смесей, жирорастворимые компоненты которых (прежде всего витамины А и Е), как правило, предварительно наносят на инертный носитель. В качестве инертного носителя используют каолин, мел, силикагель или другие аналогичные вещества. Нанесение жирорастворимых витаминов на инертный носитель, во-первых, позволяет более гомогенно распределить жирорастворимые витамины по объему смеси, не смачивая ее какими либо растворителями, а во-вторых, улучшает стабильность витаминов при хранении. Поверхность веществ, используемых в качестве носителей довольно полярная. Наиболее вероятно, что неполярный //-гексан плохо смачивает полярную поверхность носителя и не может проникнуть в его поры. Не имея доступа ко всей поверхности и к порам, н-гексан не способен количественно экстрагировать жирорастворимые витамины из образца. Для проверки этой гипотезы провели экстрагирование н-гексаном жирорастворимых витаминов из коммерческих препаратов витаминов А, О и Е, в которых в качестве инертного носителя используется каолин. Данные препараты и их аналоги используются при производстве зерновых премиксов при внесении витаминов в рецептуру. Достигнутые в ходе эксперимента степени извлечения витаминов н-гексаном не превышали 15-20%. Данный факт подтверждает предположение о том, что использование каолина, мела и аналогичных полярных неорганических веществ в пробе в качестве инертных носителей витаминов затрудняет экстракцию неполярными растворителями.

Для определения жирорастворимых витаминов в молочных продуктах предложены две методики пробоподготовки. Первая методика включает в себя осаждение белков метанолом (разведение 4:1) и центрифугирование. Поскольку большинство потерь витаминов связаны с их окислением, во время пробоподготовки к пробе добавляется небольшое количество антиоксиданта, бутилгидрокситолуола. В большинстве случаев, вводимый в хроматографическую систему раствор был абсолютно прозрачен и гомогенен. В некоторых случаях наблюдали небольшую опалесценцию раствора. Тем не менее, такой раствор всё равно использовали для анализа. Поскольку используемая хроматографическая колонка оснащена предколонкой С18, никаких осложнений не наблюдали даже в этом случае. Предложенный подход опробован на широком спектре молочных и молочнокислых продуктов и проверен методом добавок табл. 14. В целом, метод показал хорошие результаты, оказался экспрессным (время пробоподготовки и время анализа занимают в совокупности 40 минут) и простым. Главными недостатками предложенного подхода является привязка метода к искусственно обогащенным витаминами образцам, то есть метод не позволяет определить природные формы витаминов и не дает возможности определять витамины в случае нахождения их в нескольких витамерных формах.

Второй вариант пробоподготовки представляет собой модификацию методики сапонификации. К 1 мл образца прибавляли 0,2 мл 50% КОН. Оптимальное время реакции составляло 20 минут. При этом температуру реакционной смеси поднимали до 80°С. Затем, после протекания сапонификации, добавляли 4 мл метанола. После добавления метанола смесь тщательно встряхивали и центрифугировали. Надосадочную жидкость вводили в хроматограф. По сравнению с существующими методиками предложенный способ анализа молочных продуктов является более простым и экспрессным. Предложенный подход может быть использован как для анализа образцов обогащенных витаминами, так и для образцов, содержащих только природные витамины.

Результаты определения витаминов в реальных объектах с использованием разных вариантов пробоподготовки и детектирования приведены в табл. 14 и 15. Как видно из приведенных значений, полученные результаты определения хорошо согласуются с паспортными данными. Результаты, полученные с использованием метода добавок, аналогичны приведенным ниже.

Таблица 14. Результаты определение витаминов А, Б, Е в молочных продуктах (л = 3, Р = 0,95)

«Агуша» розовая (МС детект., сапонификация) «Агуша» синяя (МС детект., сапонификац) «Агуша» оранж. (СФ детектиров. осаж. белков)

Витамин Найдено мг/1000г Паспорт мг/1000г Найдено мг/1000г Паспорт мг/1000г Найдено мг/1000г Паспорт мг/1000г

А 0,бЗ±0,05 0,55-0,65 0,42±0,05 0,45-0,55 0,45±0,02 0,5±0,05

о. 10±1 10 9±1 10 н.о. 10

Е 10,0±0,6 10±1 7,6±0,5 8 7,9±0,4 8

Таблица 15. Результаты определение витаминов А, Б, Е в витаминных премиксах и фармпрепаратах (л = 3, Р = 0,95)

Премикс (Экстракция МеОН. СФ) Фармпрепарат «Витрум» БАД «Алфавит»

Витамин Найдено г/100г Паспорт г/100г Найдено мг/драже Паспорт мг/драже Найдено мг/табл. Паспорт мг/табл.

А 0,65±0,01 0,6±0,06 1.50±0.07 1.515 3260±90МЕ ЗЗЗЗМЕ

0,0098±0,0008 0,01 ±0,001 0,0097±0.0006 0,010 100±5МЕ. 100МЕ

Е 10,6±0,5 10,0±0,6 32±2 30 10,1±0,1 10

Седьмая глава посвящена разработке методики определения коэнзимов <39 и <3ю. Сначала осуществили подбор условий разделения окисленной и восстановленной форм коэнзимов. В рамках исследований для разделения исследуемых соединений - 09Н2, 09, ОюНг И Ою - опробовали более десяти неподвижных фаз и три варианта элюентов: метиловый спирт-ацетонитрил, этиловый спирт-ацетонитрил и изопропиловый спирт-ацетонитрил. В итоге наилучшей неподвижной фазой оказалась обращено-фазовая колонка с гидрофильным эндкеппингом Эупе^ Нуёго-ЯР 4,60x250 мм. Для проведения дальнейших экспериментов выбрана подвижная фаза, в состав которой входило 60% изопропилового спирта и 40% ацетонитрила. В данных условиях время анализа при скорости потока элюента 1 мл/мин не превышало 15 минут. При этом разделение окисленной формы 0д и восстановленной формы ОюНг не достигается, однако, поскольку масс спектры этих соединений различаются, а в дальнейшем планировалось использовать масс селективное детектирование, в этом нет необходимости.

На следующем этапе подобрали условия масс спектрометрического детектирования. Опробовали варианты электрораспылительной ионизации (при добавлении модификаторов в подвижную фазу) и химической ионизации при атмосферном давлении. Оба варианта ионизации позволяют проводить определение коэнзимов

(электрораспылительная ионизация при добавлении в подвижную фазу метиламина и регистрацией положительных ионов, в основном аддуктов), однако, при использовании электрораспылительной ионизации масс спектры определяемых соединений зависят от масс спектрометрического оборудования. При использовании режима химической ионизации при атмосферном давлении масс спектры соединений, полученные на разных приборах, идентичны, поэтому в дальнейшем использовали именно этот режим ионизации с регистрацией отрицательных ионов (напряжение коронного разряда ЗкВ, скорость подачи газа 2,5 л/мин, температура источника 275°С).

Параметры масс спектрометрического детектирования приведены в табл. 16. Градуировочные зависимости для <3ю и Ою'Ь линейны в диапазоне концентраций 100 -25000 мкг/л, для 0<) и СМЬ 100 -20000 мкг/л соответственно.

Таблица 16. Характеристики масс спектрометрического детектирования коэнзимов

Соединение т/2 Предел обнаружения, мкг/л

0,1 ь 795 15

Оо 795 7

ОюН, 864 30

Ою 864 10

Важным этапом при проведении анализа является процедура пробоподготовки. Наиболее сложным объектом в данном случае являются биологические ткани. При пробоподготовке необходимо сохранить соотношение окисленной и восстановленной форм коэнзимов. В ходе исследований опробовали несколько вариантов пробоподготовки для биологических тканей и для плазмы крови. В конце концов остановились на следующих вариантах. Для тканей: к навеске замороженного образца прибавляли г ВНТ, смесь гомогенизировали с охлажденным изопропиловым спиртом и помещали на 5 минут на ультразвуковую баню. При этом следили, чтобы температура бани не превышала 40°С. Далее образец центрифугировали, отбирали надосадочную, жидкость и вводили в прибор. Для плазмы крови пробоподготовка сводилась к осаждению белков охлажденным изопропиловым спиртом (1:4) и центрифугированию образца. Предложенные варианты обеспечивают стабильность извлечения коэнзимов и сохранность соотношения окисленной и восстановленной форм.

Разработанные схемы пробоподготовки и хроматографического определения использованы при анализе реальных образцов. Результаты приведены в табл. 17 и 18.

Таблица 17. Содержание <2ю и (^юНг в плазме крови до и после курса приема препарата, содержащего коэнзим (женщина, 24 года) (п = 3,Р = 0,95)

До приема препарата Через две недели регулярного употребления

Содержание От, мг/л 0,12±0,01 0,28±0,02

Содержание О,0Н2, мг/л 1,6±0,1 3,6±0,3

Суммарное содержание коэнзимов, мг/л 1,7±0,1 3,9±0,3

Соотношение с0юн2/сою 13,3±0,9 12,8±0,9

Таблица 18. Влияние стресса на соотношение форм коэнзимов в организме крыс (и = 3, Р = 0,95)

о,н2/<г, О,<№/<},„

Контрольная группа 127±25 1,4±0,3

Животные, подвергшиеся стрессу 0,19±0,05 0,8±0,2

На основании полученных данных можно сделать предположение, что соотношение восстановленной и окисленной формы коэнзимов может являться маркером стресса либо показателем общего состояния организма. Однако, для окончательных выводов требуется проведение дополнительных исследований.

Выводы

1. Разработаны способы одновременного определения водорастворимых витаминов в объектах со сложной матрицей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим (13 витаминов) и масс-селективным (14 витаминов) детектированием в режиме электрораспылительной ионизации с регистрацией положительных ионов. Полные времена анализа составляют 35 и 14 мин соответственно. Пределы обнаружения: спектрофотометрическое детектирование: 0,006-0,2 мг/л, масс спектрометрическое детектирование: аскорбиновая кислота 250 мкг/л, остальные витамины 3-50 мкг/л. Для извлечения водорастворимые витамины с последующим хромато-масс-спектрометрическим определением предложено использовать 0,5% фосфорную кислоту. Разработан вариант пробоподготовки, позволяющий определять водорастворимые витамины в алкогольсодержащих пробах. Пробоподготовка включает в себя подкисление пробы и отгонку этанола под вакуумом.

2. Установлено, что наличие дополнительных полярных взаимодействий с сорбентом влияет на селективность разделения и порядок удерживания водорастворимых витаминов. При рН подвижной фазы 1.7 (фосфорная кислота) порядок элюирования: аскорбиновая кислота, никотиновая кислота на неподвижных фазах с дополнительными полярными взаимодействиями, а на неподвижных фазах, полярные взаимодействия с которыми минимизированы - никотиновая кислота, аскорбиновая кислота. При этом полное разделение пары никотиновая-аскорбиновая кислоты при низких значениях рН достигается только на фазах без полярных взаимодействий. Температура практически не оказывает влияния на разделение витаминов.

3. Впервые для разделения водорастворимых витаминов использована гибридная неподвижная фаза (Gemini С18). Использование гибридной фазы Gemini приводит к улучшению асимметрии пиков и увеличению эффективности разделения. Порядок элюирования витаминов и времена удерживания аналогичны порядку и временам удерживания на С18 колонках с минимизированными полярными взаимодействиями.

4. Предложен способ определения жирорастворимых витаминов методом ОФ-ВЭЖХ с различными вариантами пробоподготовки в изократическом и градиентном вариантах элюирования. Полностью разделено шесть витаминов и витамерных форм при времени анализа 20 мин, пределы обнаружения при различных вариантах детектирования 0,0003-0,3 мг/л.

5. Установлено, что наличие полярного эндкэппинга улучшает разделение эргокальциферола и холькапьциферола. В качестве подвижной фазы предложено использовать водно-этанольные и водно-этанольно-ацетонитрильные смеси. Использование этанола позволяет снизить себестоимость анализа. При увеличении доли этанола в трехкомпонентном ацетонитрильно-этанольно-водном элюенте падает разрешение витаминов D2 и D3, а при увеличении доли ацетонитрила - разрешение витаминов D3 и Е.

6. Разработано несколько вариантов пробоподготовки молочных продуктов, для определения жирорастворимых витаминов, как включающих в себя стадию сапонификации, так и без нее. Установлено, что для витаминизированных объектов во многих случаях можно пренебречь стадиями реэкстракции, очистки экстракта и

отгонки растворителя, а в ряде случаев и стадией сапонификации. Время пробоподготовки, по сравнению с методикой ГОСТ снижено с 60 до 30 мин., количество стадий уменьшено с 4 до 2-х.

7. Предложен вариант экстракционной пробоподготовки для определения жирорастворимых витаминов в фармпрепаратах, БАДах сухих кормах, премиксах, сухих пищевых продуктах Показана неэффективность неполярных растворителей (н-гексана, эфира, хлористого метилена и бутанола) для извлечения жирорастворимых витаминов из объектов, содержащих большое количество неорганической матрицы, например, каолина, мела и др. (степени извлечения для отдельных витаминов не превышали 5-80%). Наиболее эффективным экстрагентом для объектов с полярными матрицами является метанол (степени извлечения 85-95%). Введение на начальной стадии небольшого (5-10%) количества воды увеличивает степени извлечения и сокращает время пробоподготовки, а введение антиоксиданта (бутилгидрокситолуола) минимизирует потери определяемых соединений.

8. Разработан способ одновременного определения окисленной и восстановленной форм коэнзимов и Ою в биологических объектах методом ОФ-ВЭЖХ с масс-селективным детектированием в режиме электрораспылительной ионизации с регистрацией положительных ионов и химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов. Разделение всех компонентов достигается за 15 мин. в изократическом режиме элюирования. Достигнуты пределы обнаружения коэнзимов О.ДЬ, О?, О,0Н2 и Ою составили 27, 4, 30 и 5 мкг/л, соответственно. Продемонстрированы преимущества использования источника химической ионизации при атмосферном давлении при определении коэнзимов.

9. Предложена схема экспрессной пробоподготовки для количественного извлечения коэнзимов из объектов со сложной матрицей. Применение данного варианта позволяет за короткое время (процедура пробоподготовки занимает 10 мин) получить пробу, в которой сохраняется исходное соотношение окисленной и восстановленной форм коэнзимов. Изучено распределение форм коэнзимов Од и Ою в организме крыс и показано влияние стресса на соотношение форм.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ в виде статей и тезисов докладов.

Статьи:

1. Бендрышев А.А. Определение жирорастворимых витаминов в зерновых блендах, таблетированных биологически активных добавках и медпрепаратах методом ВЭЖХ./ А.В. Пирогов, А.А. Бендрышев, Е.П. Свидрицкий, О.А. Шпигун // Заводск. Лаборатория. Диагностика материалов - 2008. - Т. 74, № 8. - С. 3-9.

2. Бендрышев А.А. Определение водорастворимых витаминов в витаминных премиксах, биологически активных добавках и фармацевтических препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с градиентным элюированием/ А.А. Бендрышев, А.В. Пирогов, Е.Б. Пашкова, О.А. Шпигун // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. - 2010. - Т. 51, № 4. - С. 315-324.

3. Бендрышев А.А. Определение водорастворимых витаминов в пищевых продуктах методом ВЭЖХ с масс-селективным детектированием./ А.В. Пирогов, А.А. Бендрышев, В.А. Колесов, Е.Б. Пашкова, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун//Заводск. Лаборатория. Диагностика материалов - 2010. - Т. 76, №8. -С. 15-20.

Тезисы докладов:

1. Bendryshev A., Pirogov A., Bebina A., Kurilova S., Shpigun О. Determination of ascorbic acid in dairy products by HPLC. / Book of abstracts International conference on Instrumental methods of analysis. Modern trends and application. October 2-6, 2005, Iraclion, Crete, Greece, P.485

2. Bendryshev A., Pirogov A., Svidritskiy E., Shpigun O. Determination of fat soluble vitamins in polyvitamin pills, premixes, fodders and dairy products by HPLC. / Book of abstracts International conference on Instrumental methods of analysis. Modern trends and application. October 2-6, 2005, Iraclion, Crete, Greece, P.486.

3. Pirogov A., Bendryshev A., Svidritskiy E., Shpigun O. Determination of fat soluble vitamins in polyvitamin pills, premixes, fodders and dairy products by HPLC. / Book of abstracts International congress on analytical science. June 25-30, 2006, Moscow, Russia, P.207.

Заказ № 81-П/09/2012 Подписано в печать 24.09.2012 Тираж 150 экз. Усл. п.л.1,25

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.rii; e-mail:info@cfr.ru

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ.

1.1 крагкая характеристика водорастворимых вш аминов.

111 Витамин В,

1 1 2 Витамин В

113 Витамин В}

114 Витамин В

115 Витамин В

116 Витамин Вя

117 Витамин В

118 Витамин В а

119 Витамине II

1.2 mci оды оприделепияводорастворимых витаминов

12 1 Капиллярный эчсктрофорез и лектрокинетическая хроматография

12 2 Тонкосчойная и бумажная хроматография

123 Газовая хроматография 14 12 4 Высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофото метрическим, фчуоресцентным и электрохимическим детектированием

12 5 Определение водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ-МС

1.3 особенности пробопод1 отовкипри определении водорастворимых ви i аминов.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ.

2 1 Краткая характеристика жирорас гворимых витаминов и их биологичьского д[ иствия.

211 Витамин А и ретиноиды

2 12 Витамин Е и его производные 47 2 13 Витамины D¡ и D

2.2 Методы определения жирорастворимых ви i аминов.

22 1 Спектрофотометрические методы

2 2 2 Другие нехроматографические методы определения жирорастворимых витаминов

22 2 Хроматографические методы

2 2 3 Хроматографические методы определения индивидуальных жирорастворимых витаминов и их форм

2 2 4 Мучьтивитаминный анализ

2.3 особншости процедур пробоподготовки, используемых при oiipi-делгнии жирорас гворимых вш аминов.

2 3 1 Пробоподготовка с использованием сапонификации

2 3 2 Экстракция

ГЛАВА 3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЭНЗИМОВ Q.

3.1 Краткая характеристикаубихинонов и их своисiba

3.2 Mi юды определения коэнзимов Q.

3 2 1 Электрохимические методы . 84 3 2 2 Спектрофотометрические методы 84 3 2 3 Хроматографические методы со спектрофотометрическим и электрохимическим детектированием

3 2 4 Определение убихинонов методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

3.3 Способы проьоподготовки биолсм ичьских объектов при определении коэизимов Q.

ГЛАВА 4. ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, АППАРАТУРА, МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТА.

4 1 исх0дны1 рг активы и рас i воры.

4.2 Аппаратура сорбенгы и ш подвижные фазы

4.3 Пробоподготовка образцов.

4 3 1 Водорастворимые витамины 106 4 3 2 Жирорастворимые витамины 108 4 3 3 Коэнзимы Qg и Q10.

4.4 Методика xpomatoi рафичгского эксперимг-нта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ.

5.1 выьор условии хромаioi рафическогоразделгния витаминов.

5 11 Раздечение витаминов с испочьзованием фосфатных буферных растворов в качестве элюента

5.2 Определение водорасiворимых витаминов с масс-селективным детектированием. . 137 52 1 Выбор неподвижной фазы 137 5 2 2 Выбор подвижной фазы и профиля градиентного элюироватш 143 52 3 Выбор усчоыш масс—спектрометрического детектирования витаминов

5 2 4 Метрочогические характеристики хромато-масс-спектро метрического определения витаминов 155 52 5 Оптимизация градиентного режима эчюирования

5.3 Применение предложенного подхода к анализу реальных ог.-ы ктов

ГЛАВА 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ.

6.1 Выбор условий хроматографическо1 о разделения.

611 Раздечение жирорастворимых витаминов в изократическом режиме

6 12 Раздечение жирорастворимых витаминов в градиентном режиме

6.2 Оптимизация способов пробоподго i овки.

62 1 Зерновые витаминные бченды, корма

6 2 2 Определение витаминов A, D, и Г в биологически активной добавке «А чфавит», витаминных бчендах и фармацевтических препаратах

62 3 Опреде ¡ение витаминов в молочных смесях и йогуртах « Агуиш»

6 2 4 Сравнение предчоженных способов пробоподготовки

6.3 дру1 иь варианты детектирования жирорастворимых витаминов.

6 3 1 Флуориметрическое детектирование жирорастворимых витаминов

6 3 2 Эчектрохимическое детектирование жирорастворимых витаминов

6 3 3 \(асс-спектрометрическое детектирование жирорастворимых витаминов

ГЛАВА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЭНЗИМОВ Q, И Q10.

7.1 Получение BocciAHOBjihHHOH формы коэнзимов.

7.2 опгимизация условии хроматографического разделения.

7.3 Выбор условий масс-спектрометрического детектирования

7.4 Оптимизация процедуры проьопод! оговки реальных obfktob.

7.5 Применение предложенного подхода при анализе реальных объектов.

ВЫВОДЫ.

Актуальность темы. В современном химическом анализе существует задача определения витаминов и коэнзимов в объектах различной природы, прежде всего в различных фармпрепаратах, продуктах питания, кормах, плазме крови и биологических тканях. Особую сложность представляет собой определение этих соединений в объектах, имеющих сложный состав, например, в продуктах питания. Существует большое число методик, ориентированных на определение витаминов и коэнзимов в различных матрицах. Однако подобные методики обладают рядом недостатков. Как правило, они позволяют одновременно определять только небольшое число соединений. При этом круг объектов, на который они ориентированы, в большинстве случаев ограничен одним или несколькими типами (например, плазма крови). При переходе от одного типа объектов к другому такие методики зачастую перестают работать и дают ошибочные результаты, например, методики, позволяющие определять водорастворимые витамины в фармацевтических препаратах, перестают работать при переходе к анализу продуктов питания. Пробоподготовка, которая используется во многих методиках, довольно сложна и не всегда обеспечивает необходимые степени извлечения и воспроизводимость, а используемые варианты детектирования не позволяют добиться требуемой селективности. Особенно остро необходимость в селективных и экспрессных методиках чувствуется при анализе продуктов питания (в том числе витаминизированных). Приведенные на сегодняшний момент в литературе способы определения витаминов и коэнзимов противоречивы и неоднозначны.

Задачу определения соединений в объектах со сложной матрицей можно решать различными путями. Для улучшения чувствительности и селективности можно либо использовать селективную пробоподготовку, либо обеспечить селективное разделение определяемых и мешающих соединений, либо вариант детектирования, позволяющий проводить селективное определение соединений без полного разделения. Для каждой из групп определяемых соединений существуют различные возможности использования того или иного пути или их комбинаций.

Таким образом, задача разработки новых подходов для определения витаминов и коэнзимов обеспечивающих определение широкого круга соединений в различных объектах со сложной матрицей с высокой селективностью и чувствительностью является актуальной. При этом используемые процедуры пробоподготовки должны быть максимально экспрессными и воспроизводимыми. Наилучшим методом для одновременного селективного определения соединений выбранных групп является жидкостная хроматография.

Цель работы состояла в разработке способов определения водо- и жирорастворимых витаминов, а также коэнзимов 0 в объектах со сложной матрицей (пищевых продуктах, кормах, БАДах, премиксах, биологических объектах) методом ВЭЖХ. Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

• Оптимизация пробоподготовки и выбор условий пробоподготовки, обеспечивающих количественное извлечение и определение наибольшего числа водорастворимых витаминов

• Исследование возможности использования упрощенных и ускоренных процедур пробоподготовки для определения жирорастворимых витаминов. Оценка возможности использования различных растворителей в качестве экстрагентов. Разработка экспрессных способов пробоподготовки

• Исследование стабильности окисленных и восстановленных форм коэнзимов в биологических матрицах. Оптимизация способа пробоподготовки с целью обеспечения сохранения исходного соотношения окисленных и восстановленных форм

• Исследование стабильности окисленных и восстановленных форм коэнзимов и СЫ в биологических матрицах. Разработка способа пробоподготовки, обеспечивающего сохранность исходного соотношения окисленных и восстановленных форм коэнзимов

• Исследование влияния различных параметров на селективность хроматографического разделения определяемых соединений. Выбор условий хроматографического разделения определяемых соединений для различных вариантов детектирования.

• Оценка возможностей различных вариантов детектирования. Выбор варианта детектирования, обеспечивающего селективное определение соответствующей группы соединений в объектах с матрицами различной сложности. Выбор параметров детектирования

• Разработка способов определения водорастворимых витаминов, жирорастворимых витаминов и коэнзимов С>9 и (^о, в объектах со сложной матрицей, включающих в себя пробоподготовку, хроматографическое разделение и детектирование определяемых соединений разными вариантами детекторов

Научная новизна.

Установлено влияние состава неподвижных и подвижных фаз и температуры па хроматографическое разделение водорастворимых витаминов, влияние полярных взаимодействий с сорбентом на порядок элюирования, селективность и асимметрию.

Влияние температуры на хроматографическое поведение водорастворимых витаминов незначительно.

Предложено использовать для разделения витаминов гибридную неподвижную фазу Gemini С18, которая обеспечивает преимущество в эффективности и снижение асимметрии пиков разделяемых соединений по сравнению с колонками на основе гидрофобизованного силикагеля.

Предложены водно-этанольные смеси в качестве подвижной фазы для определения жирорастворимых витаминов. Использование этанола в качестве основного компонента подвижной фазы позволяет снизить стоимость анализа по сравнению с традиционными метанольными и ацетонитрильными фазами.

Показана неэффективность использования для экстракции жирорастворимых витаминов из образцов с полярной матрицей (каолин, мел) неполярных и слабополярных растворителей.

Показано, что добавка воды (5-10%) при экстракции жирорастворимых витаминов метанолом из твердых объектов ускоряет процесс экстракции и улучшает воспроизводимость без снижения степени извлечения за счет растворения агломератов, нерастворимых в метаноле.

Показана возможность использования градиентного элюирования для снижения мешающего влияния матрицы и роста чувствительности определения ретинола и ретинола ацетата.

Продемонстрирована возможность одновременного определения окисленных и восстановленных форм коэнзимов Q? и Qio методом ВЭЖХ-МС. Показано, что использование источника химической ионизации при атмосферном давлении позволяет получать одинаковые масс-спектры при использовании различного оборудования, что делает предложенный подход более универсальным.

Практическая значимость.

Предложены способы определения водорастворимых витаминов с различными вариантами детектирования. Способ позволяет проводить одновременное определение 14 водорастворимых витаминов за 14 мин. в случае использования масс-селективного детектирования или 12 водорастворимых витаминов за 35 мин. в случае использования спектрофотометрического детектирования. При этом используемые процедуры пробоподготовки обеспечивают количественное извлечение витаминов из различных матриц.

Продемонстрировано, что определение водорастворимых витаминов при помощи квадрупольного МС анализатора дает значимый выигрыш в стоимости, по сравнению с тандсмным МС, при достаточной чувствительности определения, и существенный рост селективности, по сравнению с СФ.

Показана возможность использования в качестве экстрагента во время пробоподготовки твердых образцов 0,5% фосфорную кислоту при проведении ВЭЖХ-МС определения водорастворимых витаминов.

Расширен круг объектов, в которых возможно определение водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ-МС (витаминные препараты и добавки, витаминизированные минеральные воды, соки, спиртосодержащие напитки, витаминизированные корма, премиксы, молочные продукты, сухие пищевые продукты).

Предложен новый осадитель (смесь фосфорной и трихлоруксусной кислот) для коагуляции молочных продуктов во время пробоподготовки для определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ, позволяющий более эффективно осуществлять коагуляцию белков и обеспечивающий сохранность аскорбиновой кислоты.

Разработаны способы пробоподготовки молочных продуктов, позволяющие сократить требуемое время пробоподготовки для определения жирорастворимых витаминов в два и более раза.

Разработан способ экстракции жирорастворимых витаминов из объектов, матрица которых содержит большое количество полярных соединений.

Предложен способ хроматографического определения жирорастворимых витаминов с различными вариантами детектирования. Способ позволяет проводить определение б витаминов и витамерных форм за 20 мин.

Предложен способ пробоподготовки биологических тканей и плазмы крови, обеспечивающих неизменное соотношение окисленных и восстановленных форм коэнзимов в процессе пробоподготовки и хранения образцов.

Разработан способ одновременного хроматографического определения окисленной и восстановленной форм коэнзимов СЬ и <3ю с масс-спектрометрическим детектированием.

На защиту выносятся следующие положения:

Условия пробоподготовки при определении водорастворимых витаминов в фармпрепаратах, БАДах, кормах, пищевых продуктах, напитках и молочных продуктах.

Зависимости параметров хроматографического разделения водорастворимых витаминов от природы неподвижной фазы, природы и рН подвижной фазы, температуры и профиля градиента.

Условия хроматографического разделения и детектирования 14 водорастворимых витаминов со спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием. Результаты определения водорастворимых витаминов в реальных объектах.

Условия пробоподготовки при определении жирорастворимых витаминов в фармпрепаратах, БАДах, премиксах и молочных продуктах.

Зависимость степеней извлечения жирорастворимых витаминов из объектов с полярной матрицей от природы экстрагирующего растворителя.

Условия хроматографического разделения и детектирования шести жирорастворимых витаминов и витамерных форм со спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием. Результаты определения жирорастворимых витаминов в реальных объектах.

Условия пробоподготовки образцов плазмы крови и биологических тканей, позволяющие сохранять исходные соотношения окисленной и восстановленной форм коэнзимов Q9 и Qio

Условия одновременного хроматографического разделения и детектирования окисленных и восстановленных форм коэнзимов Q9 и Qio с масс-спектрометрическим детектированием. Результаты определения коэнзимов Q9 и Qio в реальных объектах.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 6 публикациях. Результаты исследований докладывались на International conference on Instrumental methods of analysis. Modern trends and application. (Ираклион, Греция, 2005); International congress on analytical science «ICAS-2006» (Москва, 2006). Предложенные схемы пробоподготовки и способы определения витаминов в продуктах питания. БАДах, премиксах, кормах, фармпрепаратах и напитках используются при проведении анализа в Аналитическом центре Химического факультета МГУ им. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезиса.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Выводы

1. Разработаны способы одновременного определения водорастворимых витаминов в объектах со сложной матрицей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим (13 витаминов) и масс-селективным (14 витаминов) детектированием в режиме электрораспылительной ионизации с регистрацией положительных ионов. Полные времена анализа составляют 35 и 14 мин соответственно. Пределы обнаружения: спектрофотометрическое детектирование: 0,006-0,2 мг/ji, масс спектрометрическое детектирование: аскорбиновая кислота 250 мкг/л, остальные витамины 3-50 мкг/л. Для извлечения водорастворимые витамины с последующим хромато-масс-спектрометрическим определением предложено использовать 0,5% фосфорную кислоту. Разработан вариант пробоподготовки, позволяющий определять водорастворимые витамины в алкогольсодержащих пробах. Пробоподготовка включает в себя подкисление пробы и отгонку этанола под вакуумом.

2. Установлено, что наличие дополнительных полярных взаимодействий с сорбентом влияет на селективность разделения и порядок удерживания водорастворимых витаминов. При рН подвижной фазы 1.7 (фосфорная кислота) порядок элюирования: аскорбиновая кислота, никотиновая кислота на неподвижных фазах с дополнительными полярными взаимодействиями, а на неподвижных фазах, полярные взаимодействия с которыми минимизированы - никотиновая кислота, аскорбиновая кислота. При этом полное разделение пары никотиновая-аскорбиновая кислоты при низких значениях рН достигается только на фазах без полярных взаимодействий. Температура практически не оказывает влияния на разделение витаминов.

3. Впервые для разделения водорастворимых витаминов использована гибридная неподвижная фаза (Gemini С18). Использование гибридной фазы Gemini приводит к улучшению асимметрии пиков и увеличению эффективности разделения. Порядок элюирования витаминов и времена удерживания аналогичны порядку и временам удерживания на С18 колонках с минимизированными полярными взаимодействиями.

4. Предложен способ определения жирорастворимых витаминов методом ОФ-ВЭЖХ с различными вариантами пробоподготовки в изократическом и градиентном вариантах элюирования. Полностью разделено шесть витаминов и витамерных форм при времени анализа 20 мин, пределы обнаружения при различных вариантах детектирования 0,0003-0,3 мг/л.

5. Установлено, что наличие полярного эндкэппинга улучшает разделение зргокальциферола и холькальциферола. В качестве подвижной фазы предложено использовать водно-этанольные и водно—этанольно-ацетонитрильные смеси.

Использование этанола позволяет снизить себестоимость анализа. При увеличении доли этанола в трехкомпонентном ацетонитрильно-этанольно-водном элюенте падает разрешение витаминов От и Эз, а при увеличении доли ацетонитрила - разрешение витаминов 03 и Е.

6. Разработано несколько вариантов пробоподготовки молочных продуктов, для определения жирорастворимых витаминов, как включающих в себя стадию сапонификации, так и без нее. Установлено, что для витаминизированных объектов во многих случаях можно пренебречь стадиями реэкстракции, очистки экстракта и отгонки растворителя, а в ряде случаев и стадией сапонификации. Время пробоподготовки, по сравнению с методикой ГОСТ снижено с 60 до 30 мин., количество стадий уменьшено с 4 до 2-х.

7. Предложен вариант экстракционной пробоподготовки для определения жирорастворимых витаминов в фармпрепаратах, БАДах сухих кормах, премиксах, сухих пищевых продуктах Показана неэффективность неполярных растворителей (»-гексана, эфира, хлористого метилена и бутанола) для извлечения жирорастворимых витаминов из объектов, содержащих большое количество неорганической матрицы, например, каолина, мела и др. (степени извлечения для отдельных витаминов не превышали 5-80%). Наиболее эффективным экстрагентом для объектов с полярными матрицами является метанол (степени извлечения 85-95%). Введение на начальной стадии небольшого (5-10%) количества воды увеличивает степени извлечения и сокращает время пробоподготовки, а введение ангиоксиданта (бутилгидрокситолуола) минимизирует потери определяемых соединений.

8. Разработан способ одновременного определения окисленной и восстановленной форм коэнзимов (^9 и <3ю в биологических объектах методом ОФ-ВЭЖХ с масс-селективным детектированием в режиме электрораспылительной ионизации с регистрацией положительных ионов и химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов. Разделение всех компонентов достигается за 15 мин. в изократическом режиме элюирования. Достигнуты пределы обнаружения коэнзимов СЬН?, (^9, СЬоНг и (^ю составили 27, 4, 30 и 5 мкг/л, соответственно. Продемонстрированы преимущества использования источника химической ионизации при атмосферном давлении при определении коэнзимов.

9. Предложена схема экспрессной пробоподготовки для количественного извлечения коэнзимов из объектов со сложной матрицей. Применение данного варианта позволяет за короткое время (процедура пробоподготовки занимает 10 мин) получить пробу, в которой сохраняется исходное соотношение окисленной и восстановленной форм коэнзимов. Изучено распределение форм коэнзимов СЬ и СЬ0 в организме крыс и показано влияние стресса на соотношение форм.

1. Vitamins in Foods: Analysis, Bioavailability and Stability. / Ball G. F. M. Boca Raton: CRC Press, 2006. 785 p.

2. Vitamin Analysis for the Health And Food Sciences. / Eitenmiller R. R., Ye L., Landen W. O. Boca Raton: CRC Press, 2008. 637 p.

3. Bui L. Т. Т., Small D. M. The stability of pyridoxine hydrochloride used as a fortificant in Asian wheat flour noodles // Food Chem. 2012. - V. 130, N. 4. - P. 841 -846.

4. Modern Chromatographic Analysis of Vitamins, Revised and Expanded. / de Leenheer A. P., Lambert W. E., Van Bocxlaer J. F. New York: Marcel Dekker, 2000. 632 p.

5. Handbook of Vitamins. / Zempleni J., Rucker R.B., Suttie J.W., McCormick D.B. Boca Raton: CRC Press, 2007. 593 p.

6. Earl Mindell's Vitamin Bible for the 21st Century. / Mindell E. New York: Warner Books, 1999. 441 p.

7. Okamoto H., Nakajima Т., Ito Y. Simultaneous determination of ingredients in a vitamin-enriched drink by micellar electrokinetic chromatography // J. Pharm. Biomed. Anal. -2002.-V. 30, N. 3.-P. 815-822.

8. Aurora-Prado M. S., Silva C. A., Tavares M. F. M., Altria K. D. Determination of folic acid in tablets by microemulsion electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. -2004. V. 1051, N. 1-2. - P. 291-296.

9. Yin C., Cao Y., Ding S., Wang Y. Rapid determination of water- and fat-soluble vitamins with microemulsion electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2008. - V. 1193, N. 1-2.-P. 172-177.

10. Cimpoiu C., Hosu A., Puscas A. Thin-layer chromatography with stationary phase gradient as a method for separation of water-soluble vitamins // J. Chromatogr. A. -2012. — V. 1223.-P. 142-146.

11. Echols R. E., Miller R. I I., Foster W. Analysis of Thiamine in Milk by Gas Chromatographyand the Nitrogen-Phosphorus Detector // J. Dairy Sci. 1986. - V. 69, N. 5. - P. 12461249.

12. Echols R. E., Miller R. I I., Winzer W., Carmen D. J., Ireland Y. R. Gas chromatographicdetermination of thiamine in meats, vegetables and cereals with a nitrogen-phosphorus detector // J. Chromatogr. A. 1983. - V. 262. - P. 257-263.

13. Tanaka A., Iijima M., Kikuchi Y., Hoshino J., Nose N. Gas chromatographic determinationof nicotinamide in meats and meat products as 3-cyanopyridine // J. Chromatogr. A. -1989.-V. 466. -P. 307-317.

14. Abdel-Kader Z. M. Comparison of AOAC and high-performance liquid chromatographicmethods for thiamin determination in foods // Food Chem. 1992. - V. 43, N. 5. - P. 393-397.

15. Petteys B. J., Frank E. L. Rapid determination of vitamin B2 (riboflavin) in plasma by HPLC

16. Clinica Chimica Acta. 2011. - V. 412, N. 1-2. - P. 38-43.

17. Lahely S., Ndaw S., Arella F., Hasselmann C. Determination of biotin in foods by highperformance liquid chromatography with post-column derivatization and fluonmetric detection // Food Chem. 1999. - V. 65, N. 2. - P. 253-258.

18. Guggisberg D., Risse M. C., l ladorn R. Determination of Vitamin B12 in meat products by

19. RP-HPLC after enrichment and purification on an immunoaffinity column // Meat Sci. -2012. V. 90, N. 2. - P. 279-283.

20. Vails F., Checa M. A., Fernandez-Muino M. A., Sancho M. T. Determination of thiamin incooked sausages // J. Agri. Food Chem. 1999. - V. 47, N. 1. - P. 170-173.

21. Vidalvalverde C., Reche A. AN Improved high-performance liquid-chromatographic methodfor thiamin analysis in foods// Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung Und-Forschung. 1990. - V. 191, N. 4-5. - P. 313-318.

22. Bohrer D., do Nascimento P. C., Ramirez A. G., Mendonca J. K. A., de Carvalho L. M.,

23. Pomblum S. C. G. Determination of thiamine in blood serum and urine by highperformance liquid chromatography with direct injection and post-column derivatization // Microchemical J. 2004. - V. 78, N. 1. - P. 71 -76.

24. Gratacos-Cubarsi M., Sarraga C., Clariana M„ Regueiro J. A. G., Castellan M. Analysis ofvitamin B1 in dry-cured sausages by hydrophilic interaction liquid chromatography (I11LIC) and diode array detection // Meat Sci. 2011. - V. 87, N. 3. - P. 234-238.

25. Woodcock E. A., Warthesen J. J., Labuza T. P. Riboflavin photochemical degradation inpasta measured by high-performance liquid-chromatography // J. Food Sci. 1982. - V.47, N. 2. P. 545-549.

26. Rokitzki L., Berg A., Keul J. Concentrations of water and fat-soluble vitamins in sera ofathletes and other healthy persons// Zeitschrift fuer die Gesamte Ilygiene und ¡lire Grenzgebiete. 1989. - V. 35, N. 1. - P. 16-21.

27. Zempleni J., Galloway J. R., McConnick D. B. Pharmacokinetics of orally and intravenouslyadministered riboflavin in healthy humans // Amer. J. Clin. Nutr. 1996. - V. 63, N. 1. -P. 54-66.

28. Lahely S., Bergaentzle M., Hasselmann C. Fluorimetric determination of niacin in foods byhigh-performance liquid chromatography with post-column derivatization // Food Chem. 1999. - V. 65, N. l.-P. 129-133.

29. Devries J. X., Gunthert W., Ding R. Determination of nicotinamide in human plasma andurine by ion-pair reversed-phase high-performance liquid-chromatography// J. Chromatogr. 1980,-V. 221, N. 1. - P. 161-165.

30. Vails F., Sancho M. T., Fernandez-Muino M. A., Checa M. A. Simultaneous determinationof nicotinic acid and nicotinamide in cooked sausages // J. Agri. Food Chem. 2000. - V.48,N. 8.-P. 3392-3395.

31. Pakin C., Bergaentzle M., Hubscher V., Aoude-Werner D., Flasselmann C. Fluorimetricdetermination of pantothenic acid in foods by liquid chromatography with post-column derivatization // J. Chromatogr. A. 2004. - V. 1035, N. 1. - P. 87-95.

32. Romera J. M., Ramirez M., Gil A. Determination of pantothenic acid in infant milk formulasby high performance liquid chromatography // J. Dairy Sci. 1996. - V. 79, N. 4. - P. 523-526.

33. Bognar A., Ollilainen V. Influence of extraction on the determination of vitamin B-6 in foodby HPLC // Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung Und-Forschung a-Food Research and Technology. 1997. - V. 204, N. 5. - P. 327-335.

34. Edwards P., Liu P. K. S., Rose G. A. A simple liquid-chromatographic method for measuringvitamin-B6 compounds in plasma // Clin. Chem 1989. - V. 35, N. 2. - P. 241 -245.

35. Kamata K., Hagiwara T., Takahashi M., Uehara S., Nakayama K., Akiyama K.

36. Determination of biotin in multivitamin pharmaceutical preparations by highperformance liquid-chromatography with electrochemical detection // J. Chromatogr. -1986. V. 356, N. 2. - P. 326-330.

37. Yoshida T., Uetake A., Nakai C., Nimura N., Kinoshita T. Liquid-chromatographicdetermination of biotin by using 1-pyrenyldiazomethane as a pre-column fluorescent labeling reagent // J. Chromatogr. 1988. - V. 456, N. 2. - P. 421 -426.

38. Thompson L. B., Schmitz D. J., Pan S. J. Determination of biotin by high-performance liquidchromatography in infant formula, medical nutritional products, and vitamin premixes // J. AOAC Int. 2006. - V. 89,N. 6.-P. 1515-1518.

39. Jacoby B. T., Henry F. T. Liquid-chromatographic determination of folic acid in infantformula and adult medical nutritionals // J. AOAC Int. 1992. - V. 75, N. 5. - P. 891898.

40. Iwase II. Determination of folic acid in an elemental diet by high-performance liquidchromatography with U V detection // J. Chromatogr. 1992. - V. 609. N. 1 -2. - P. 399401.

41. Kohashi M., Inoue K., Sotobayashi II., Iwai K. Microdetermination of folatemonoglutamates in serum by liquid-chromatography with electrochemical detection // J. Chromatogr. 1986. - V. 382. - P. 303-307.

42. Heudi O., Kilinc T., Fontannaz P., Marley E. Determination of vitamin B-12 in food productsand in premixes by reversed-phase high performance liquid chromatography and immunoaffinity extraction // J. Chromatogr. A. 2006. - V. 1101, N. 1 -2. - P. 63-68.

43. Pakin C., Bergaentzle M., Aoude-Werner D., Hasselmann C. alpha-Ribazole, a fluorescentmarker for the liquid chromatographic determination of vitamin B-12 in foodstuffs // J. Chromatogr. A. 2005. - V. 1081, N. 2. - P. 182-189.

44. Vinas P., Campillo N., LopezGarcia I., I IernandezCordoba M. Identification of vitamin B-12analogues by liquid chromatography with electrothermal atomic absorption detection // Chromatographia. 1996. - V. 42, N. 9-10,- P. 566-570.

45. Kim II. J. Determination of total vitamin C by ion exclusion chromatography withelectrochemical detection // J. AOAC Int. 1989. - V. 72, N. 4. - P. 681-686.

46. Burini G. Development of a quantitative method for the analysis of total L-ascorbic acid infoods by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2007. - V. 1154,N. 1-2.-P. 97-102.

47. Irachc J. M., Ezpeleta I., Vega F. A. IIPLC determination of antioxidant synergists andascorbic acid in some fatty pharmaceuticals cosmetics and food // Chromatographia. -1993. V. 35, N. 3-4. - P. 232-236.

48. Chebrolu K. K., Jayaprakasha G. K., Yoo K. S., Jifon J. L., Patil B. S. An improved samplepreparation method for quantification of ascorbic acid and dehydroascorbic acid by H PLC // Food Sci. Technol. 2012. - V. 47, N. 2. - P. 443-449.

49. Li H. B., Chen F. Simultaneous determination of twelve water- and fat-soluble vitamins byhigh-performance liquid chromatography with diode array detection // Chromatographia. 2001. - V. 54, N. 3-4. - P. 270-273.

50. Amin M., Reusch J. High-performance liquid-chromatography of water-soluble vitamins .3.

51. San José Rodriguez R., Fernández-Ruiz V., Cámara M., Sánchez-Mata M. C. Simultaneousdetermination of vitamin B1 and B2 in complex cereal foods, by reverse phase isocratic HPLC-UV // J. Cereal Sci. 2012. - V. 55, N. 3. - P. 293-299.

52. Li Y., Brown P. R. On-line detection for the HPLC analysis of water-soluble vitamins inmultivitamin tablets // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2003. - V. 26. N. 11. - P. 1769-1786.

53. Li H. B., Chen F. Simultaneous determination of nine water-soluble vitamins inpharmaceutical preparations by highperfonnance liquid chromatography with diode array detection // J. Sep. Sci. 2001. - V. 24, N. 4. - P. 271 -274.

54. Buszewski B., Zbanyszek W. Determination of different solubility vitamins inpharmaceutical preparations. I. F1PLC column switching // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2002. - V. 25, N. 8. - P. 1229-1241.

55. Moreno P., Salvado V. Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multivitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2000. - V. 870, N. 1 -2. - P. 207-215.

56. Klejdus B., Petrlova J., Potesil D., Adam V., Mikelova R„ Vacek J., Kizek R„ Kuban V.

57. Simultaneous determination of water- and fat-soluble vitamins in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection // Anal. Chim. Acta. 2004. - V. 520, N. 1 -2. - P. 57-67.

58. Gatti R., Gioia M. G. Liquid chromatographic determination with fluorescence detection of

59. B-6 vitamers and riboflavin in milk and pharmaceuticals // Anal. Chim. Acta. 2005. -V. 538, N. 1-2. - P. 135-141.

60. Woollard D. C., Indyk I I. E. Rapid determination of thiamine, riboflavin, pyridoxine, andniacinamide in infant formulas by liquid chromatography // J. AOAC Int. 2002. - V. 85, N. 4.-P. 945-951.

61. AlbalaHurtado S., VecianaNogues M. T., IzquierdoPulido M., MarineFont A. Determinationof water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography// J. Chromatogr. A. 1997. - V. 778, N. 1 -2. - P. 247-253.

62. Vinas P., Lopez-Erroz C., Balsalobre N. Hernandez-Cordoba M. Reversed-phase liquidchromatography on an amide stationary phase for the determination of the B group vitamins in baby foods // J. Chromatogr. A. 2003. - V. 1007, N. 1 -2. - P. 77-84.

63. Maeda Y., Yamamoto M., Owada K., Sato S., Masui T., Nakazawa H. Simultaneous Liquidchromatographic determination of water-soluble vitamins, caffeine and preservative in oral liquid tonics // J. AOAC Int. 1989. - V. 72, N. 2. - P. 244-247.

64. Mendiola J. A., Marin F. R., Senorans F. J., Reglero G., Martin P. J., Cifuentes A., Ibanez E.

65. Profiling of different bioactive compounds in functional drinks by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2008. - V. 1188, N. 2. - P. 234-241.

66. Ekinci R., Kadakal C. Determination of seven water-soluble vitamins in tarhana, a traditional

67. Turkish cereal food, by high-performance liquid chromatography // Acta Chromatogr. -2005.-V. 15.-P. 289-297.

68. Karatapanis A. E., Flamegos Y. C., Stalikas C. D. 11IL1C separation and quantitation ofwater-soluble vitamins using diol column // J. Sep. Sci. 2009. - V. 32, N. 7. - P. 909917.

69. Amidzic R., Brboric J., Cudina O., Vladimirov S. RP-HPLC Determination of vitamins B-l,

70. B-3, B-6, folic acid and B-12 in multivitamin tablets // Journal of the Serbian Chemical Society. 2005.-V. 70, N. 10.-P. 1229-1235.

71. Vidovic S., Stojanovic B., Veljkovic J., Prazic-Arsic L., Roglic G., Manojlovic D.

72. Simultaneous determination of some water-soluble vitamins and preservatives in multivitamin syrup by validated stability-indicating high-performance liquid chromatography method // J. Chromatogr. A. 2008. - V. 1202, N. 2. - P. 155-162.

73. Ghorbani A. R., Momenbeik F., Khorasani J. I I., Amini M. K. Simultaneous micellar liquidchromatographic analysis of seven water-soluble vitamins: optimization using super-modified simplex // Anal. Bioanal. Chem. 2004. - V. 379, N. 3. - P. 439-444.

74. TangX., Cronin D. A., Brunton N. P. A simplified approach to the determination of thiamineand riboflavin in meats using reverse phase HPLC // J. Food Comp. Anal. 2006. - V. 19, N. 8.-P. 831-837.

75. Furlani R. P. Z., Godoy H. T. Vitamins B-l and B-2 contents in cultivated mushrooms //

76. Food Chem. 2008. - V. 106. - P. 816-819.

77. Dawson K. R., UnklesbayN. F., Hedrick I I. B. HPLC determinatin of riboflavin, niacin andthiamin in beef, pork and lamb after alternate heat-processing methods // J. Agri. Food Chem. 1988. - V. 36, N. 6. - P. 1176-1179.

78. Wehling R. L., Wetzel D. L. Simultaneous determination of pyridoxine, riboflavin, andthiamin in fortified cereal products by high-performance liquid-chromatography // J. Agri. Food Chem. 1984. - V. 32, N. 6. - P. 1326-1331.

79. Zafra-Gomez A., Garballo A., Morales J. C., Garcia-Ayuso L. E. Simultaneousdetermination of eight water-soluble vitamins in supplemented foods by liquid chromatography // J. Agri. Food Chem. 2006. - V. 54, N. 13. - P. 4531 -4536.

80. Presoto A. E. F., Rios M. D. G., de Almeida-Muradian L. B. Simultaneous high performanceliquid chromatographic analysis of vitamins B-l, B-2 and B-6 in royal jelly // J. Braz. Chem. Soc.-2004.-V. 15,N. l.-P. 136-139.

81. Guo J. Y., Lu Y., Dong H. HPLC-MS analysis of the riboflavin crude product ofsemisynthesis // J. Chromatogr. Sci. 2006. - V. 44, N. 9. - P. 552-556.

82. Pfuhl P., Karcher U., Ilaring N., Baumeislcr A., Tawab M. A., Schubert-Zsilavecz M.

83. Simultaneous determination of niacin, niacinamide and nicotinuric acid in human plasma //J. Pharm. Biomed. Anal. -2005. V. 36, N. 5. - P. 1045-1052.

84. Catz P., Shinn W., Kapetanovic 1. M., Kim H., Kim M., Jacobson E. L., Jacobson M. K.,

85. Perrone D., Donangelo C. M., Farah A. Fast simultaneous analysis of caffeine, trigonelline,nicotinic acid and sucrose in coffee by liquid chromatography-mass spectrometry // Food Chem.-2008.-V. 110,N.4.-P. 1030-1035.

86. Peoples M. C., Halquist M. S., Ismaiel O., El-Mammli M. Y., Shalaby A., Karnes H. T.

87. Assessment of matrix effects and determination of niacin in human plasma using liquidliquid extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Biomed. Chromatogr.-2008.-V. 22, N. 11.-P. 1272-1278.

88. Rychlik M. Pantothenic acid quantification by a stable isotope dilution assay based on liquidchromatography-tandem mass spectrometry // Analyst. 2003. - V. 128, N. 7. — P. 832837.

89. Azoulay M., Desbene P. L., Frappier F. Use of liquid-chromatography mass-spectrometry forthe quantitation of dethiobiotin and biotin in biological samples // J. Chromatogr. 1984. -V. 303,N. l.-P. 272-276.

90. Holler U., Wachter F., Wehrli C., Fizet C. Quantification of biotin in feed, food, tablets, andpremixes using HPLC-MS/MS // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 2006. - V. 831, N. 1 -2.-P. 8-16.

91. Rychlik M. Revised folate content of foods determined by stable isotope dilution assays // J.

92. Food Comp. Anal. 2004. - V. 17, N. 3-4. - P. 475-483.

93. Makarov A., Szpunar J. Species-selective determination of cobalamin analogues byreversed-phase HPLC with ICP-MS detection // J. Anal. At. Spcctrom. 1999. - V. 14, N. 9.-P. 1323-1327.

94. Yanes E. G., Miller-lhli N. J. Cobalamin speciation using reversed-phase micro-highperformance liquid chromatography interfaced to inductively coupled plasma mass spectrometry // Spectrochim. Acta B. 2004. - V. 59, N. 6. - P. 891 -899.

95. Szterk A., Roszko M., Malek K., Czerwonka M., Waszkiewicz-Robak B. Application of the

96. SPE reversed phase HPLC/MS technique to determine vitamin B12 bio-active forms in beef// Meat Sci. 2012. - V. 91, N. 4. - P. 408-413.

97. Chassaigne H., Lobinski R. Direct species-selective determination of cobalamins byionspray mass spectrometry and ionspray tandem mass spectrometry // Analyst. 1998. -V. 123,N. l.-P. 131-137.

98. Luo X. B„ Chen B., Ding L„ Tang F., Yao S. Z. HPLC-ESI-MS analysis of Vitamin B-l 2in food products and in multivitamins-multimineral tablets // Anal. Chim. Acta. 2006. -V. 562, N. 2. - P. 185-189.

99. Stokes P., Webb K. Analysis of some folate monoglutamates by high-performance liquidchromatography-mass spectrometry. I // J. Chromatogr. A. 1999. - V. 864, N. 1, - P. 59-67.

100. Pawlosky R. J., Hertrampf E., Flanagan V. P., Thomas P. M. Mass spectral determinationsof the folic acid content of fortified breads from Chile // J. Food Comp. Anal. 2003. -V. 16,N.3.-P. 281-286.

101. Thomas P. M., Flanagan V. P., Pawlosky R. J. Determination of 5-methyltetrahydrofolicacid and folic acid in citrus juices using stable isotope dilution-mass spectrometry // J. Agri. Food Chem. 2003. - V. 51, N. 5. - P. 1293-1296.

102. Pawlosky R. J., Flanagan V. P., Doherty R. F. A mass spectrometric validated highperformance liquid chromatography procedure for the determination of folates in foods // J. Agri. Food Chem. 2003. - V. 51, N. 13. - P. 3726-3730.

103. Kali M. A., Norgaard P., Pedersen S. J., Leth T. Optimised extraction of folic acid frommultivitamin-mineral preparations for liquid chromatographic analysis // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. - V. 23, N. 2-3. - P. 437-445.

104. Garbis S. D., Melse-Boonstra A., West C. E., van Breemen R. B. Determination of folatesin human plasma using hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry//Anal. Chem.-200l.-V. 73,N. 22.-P. 5358-5364.

105. Nelson B. C., Pfeiffer C. M., Margolis S. A., Nelson C. P. Solid-phase extractionelectrospray ionization mass spectrometry for the quantification of folate in human plasma or serum // Anal. Biochem. 2004. - V. 325, N. 1. - P. 41 -51.

106. Kok R. M., Smith D. E. C., Dainty J. R., van den Akker J. T., Finglas P. M., Smulders Y.

107. M., Jakobs C., de Meer K. 5-methyltetrahydrofolic acid and folic acid measured in plasma with liquid chromatography tandem mass spectrometry: applications to folate absorption and metabolism // Anal. Biochem. 2004. - V. 326, N. 2. - P. 129-138.

108. Nelson B. C„ Satterfield M. B., Sniegoski L. T., Welch M. J. Simultaneous quantificationof homocysteine and folate in human serum or plasma using liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Anal. Chem. 2005. - V. 77, N. 11.- P. 3586-3593.

109. Owens J. E., Holstege D. M., Clifford A. J. Quantitation of total folate in whole blood using1.-MS/MS // J. Agri. Food Chem. 2005. - V. 53, N. 19. - P. 7390-7394.

110. Garratt L. C„ Ortori C. A., Tucker G. A., Sablitzky F., Bennett M. J., Barrett D. A.

111. Nelson B. C., Sharpless K. E., Sander L. C. Quantitative determination of folic acid inmultivitamin/multielement tablets using liquid chromatography/tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2006. - V. 1135, N. 2. - P. 203-211.

112. De Brouwer V., Storozhenko S., Van de Steene J. C„ Wille S. M. R., Stove C. P., Van der

113. Straeten D., Lambert W. E. Optimisation and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for folates in rice // J. Chromatogr. A. 2008. - V. 1215,N. 1-2. — P. 125-132.

114. Patring J., Wandel M., Jiigerstad M., Frolich W. Folate content of Norwegian and Swedishflours and bread analysed by use of liquid chromatography-mass spectrometry // J. Food Comp. Anal. 2009. - V. 22, N. 7-8. - P. 649-656.

115. Fenoll J., Martinez A., Hellin P., Flores P. Simultaneous determination of ascorbic anddehydroascorbic acids in vegetables and fruits by liquid chromatography with tandemmass spectrometry // Food Chem. 2011. - V. 127, N. 1. - P. 340-344.

116. Rychlik M. Simultaneous analysis of folic acid and pantothenic acid in foods enriched withvitamins by stable isotope dilution assays // Anal. Chim. Acta. 2003. - V. 495, N. 1 -2. -P. 133-141.

117. Cheong W. J., Kang G. W., Lee W. I., Yoo Y. S. Rapid determination of water-soluble Bgroup vitamins in urine by gradient LC/MS with a disposable home-made microcolumn // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol.-2002. V. 25, N. 9.-P. 1367-1378.

118. Grant D. C., Helleur R. J. Simultaneous analysis of vitamins and caffeine in energy drinksby surfactant-mediated matrix-assisted laser desorption/ionization // Anal. Bioanal. Chem. 2008. - V. 391, N. 8. - P. 2811 -2818.

119. Chen P., Wolf W. R. LC/UV/MS-MRM for the simultaneous determination of watersoluble vitamins in multi-vitamin dietary supplements // Anal. Bioanal. Chem. 2007. -V.387,N. 7.-P. 2441-2448.

120. Gentili A., Caretti F., D'Ascenzo G., Marchese S., Perret D., Di Corcia D., Rocca L. M.

121. Simultaneous determination of water-soluble vitamins in selected food matrices by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008. - V. 22, N. 13. - P. 2029-2043.

122. Rizzolo A., Polesello S. Chromatographic determination of vitamins in foods // J.

123. Chromatogr. A.-1992,-V. 624, N. 1-2.-P. 103-152.

124. Mandal S. M., Mandal M., Ghosh A. K., Dey S. Rapid determination of vitamin B2 and

125. B12 in human urine by isocratic liquid chromatography // Anal. Chim. Acta. 2009. - V. 640, N. 1-2.-P. 110-113.

126. Water-Soluble Vitamin Assays in Human Nutrition. / Ball G. F. M. London: Chapman &1. Hall, 1994. 416 p.

127. Novelli G. D., Kaplan N. O., Lipmann F. The liberation of panthothenic acid fromcoenzime-A // J. Biol. Chem. 1949. - V. 177, N. 1. - P. 97-107.

128. Vanderslice J. T., Maire C. E., Doherty R. F., Beechcr G. R. Sulfosalicylic acid as anextraction agent for vitamin B6 in food // J. Agri. Food Chem. 1980. - V. 28, N. 6. - P. 1145-1149.

129. Ryley J., Kajda P. Vitamins in thermal processing // Food Chem. 1994. - V. 49, N. 2. - P.119.129.

130. Thiex N., Smallidge R., Beine R. Sources of error in vitamin A analysis // J. AOAC Int.1996.-V. 79, N. 6.-P. 1269-1275.

131. Cho I. K., Rima J., Ling Chang C., Li Q. X. Spectrofluorometric and high-performanceliquid chromatographic determination of all-rac-a-tocopheryl acetate in virgin olive oil // J. Food Comp. Anal. 2007. - V. 20, N. 1. - P. 57-62.

132. Wyss R. Chromatographic and electrophoretic analysis of biomedically important retinoids

133. J. Chromatogr. B: Biomed. Sci.- 1995.-V. 671,N. 1-2.-P. 381-425.

134. Maraschiello C., Garcia Regueiro J. A. Procedure for the determination of retinol and atocopherol in poultry tissues using capillary gas chromatography with solvent venting injection//J. Chromatogr. A.- 1998,-V. 818,N. l.-P. 109-121.

135. Pérès V. F., Saffi J., Melecchi M. I. S., Abad F. C., de Assis Jacques R., Martinez M. M.,

136. Oliveira E. C., Caramào E. B. Comparison of soxhlel, ultrasound-assisted and pressurized liquid extraction of terpenes, fatty acids and Vitamin E from Piper gaudichaudianum Kunth // J. Chromatogr. A.-2006.-V. 1105,N. 1-2.-P. 115-118.

137. Liebler D. C., Burr J. A., Philips L., I lam A. J. L. Gas chromatography mass spectrometryanalysis of vitamin E and its oxidation products // Anal. Biochem. 1996. - V. 236, N. 1. - P. 27-34.

138. Pyka A., Sliwoik J. Chromatographic separation of tocopherols // J. Chromatogr. A. 2001.-V. 935, N. 1-2.-P. 71-76.

139. Sliwiok J., Kocjan B., Labe B., Kozera A., Zalejska J. Chromatographic studies oftocopherols // J. Planar Chromatogr.-Mod. TLC. 1993. - V. 6, N. 6. - P. 492-494.

140. Chang L.-C., Chang H.-T., Sun S.-W. Cyclodextrin-modified microemulsion electrokineticchromatography for separation of a-, y-, 5-tocopherol and a-tocopherol acetate // J. Chromatogr. A. 2006. - V. 1110, N. 1-2. - P. 227-234.

141. Delgado-Zamarreño M. M., González-Maza I., Sánchez-Pérez A., Carabias-Martinez R.

142. Separation and simultaneous determination of water-soluble and fat-soluble vitamins by electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. A. 2002. - V. 953, N. 1-2. -P. 257-262.

143. Bustamante-Rangel M., Delgado-Zamarreño M. M., Sánchez-Pérez A., Carabias-Martinez

144. R. Microemulsion electrokinetic chromatography for the separation of retinol, cholecalciferol, 5-tocopherol and a-tocopherol // J. Chromatogr. A. 2006. - V. 1125, N. 2.-P. 270-273.

145. Sánchez J. M., Salvado V. Comparison of micellar and microemulsion electrokineticchromatography for the analysis of water- and fat-soluble vitamins // J. Chromatogr. A. -2002.-V. 950, N. 1-2.-P. 241-247.

146. Favaro R. M. D., Iha M. H., Bianchi M. Liquid chromatographic determination ofgeometrical retinol isomers and carotene in enteral feeding formulas // J. Chromatogr. A. -2003.-V. 1021,N. 1-2. P. 125-132.

147. Deruyter M. G. M., Deleenheer A. P. Simultaneous determination of retinol and retinylesters in serum or plasma by reversed-phase high-performance liquid chromatography // Clin. Chem. 1978. - V. 24, N. 11. - P. 1920-1923.

148. Tanner J. T., Barnett S. A., Mountford M. K. Analysis of milk-based infant formula. Phase

149. V. Vitamins A and E, folic acid, and pantothenic acid: Food and Drug Administration-Infant Formula Council: collaborative study // J. AOAC Int. 1993. - V. 76, N. 2. - P. 399-413.

150. Jensen S. K. Retinol determination in milk by IIPLC and fluorescence detection // J. Dairy

151. Res. 1994.-V. 61, N. 2.-P. 233-240.

152. Lim Y. O., Kim B., Ahn S., Kim J. Improvement of accuracy for the determination ofvitamin A in infant formula by isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry//Food Chem. 2011.-V. 126, N. 3.-P. 1393-1398.

153. Brinkmann E., Dehne L., Oei II. B., Tiebach R., Baltes W. Separation of geometrical retinolisomers in food samples by using narrow-bore high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 1995. - V. 693, N. 2. - P. 271-279.

154. Barua A. B., Olson J. A. Retinoyl beta-glucuronide: an endogenous compound of humanblood // Am. J. Clin. Nutr. 1986. - V. 43, N. 4. - P. 481 -485.

155. Kraft J. C., Shepard T., Juchau M. R. Tissue levels of retinoids in human embryos/fetuses //

156. Reprod. Toxicol.- 1993.-V. 7,N. l.-P. 11-15.

157. Meyer E., Lambert W. E., De Leenheer A. P. Simultaneous determination of endogenousretinoic acid isomers and retinol in human plasma by isocratic normal-phase IIPLC with ultraviolet detection // Clin. Chem. 1994. - V. 40, N. 1. - P. 48-57.

158. Got L., Gousson T., Delacoux E. Simultaneous determination of retinyl esters and retinol inhuman livers by reversed-phase high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 1995. - V. 668, N. 2. - P. 233-239.

159. Hagen J. J., Washco K. A., Monnig C. A. Determination of retinoids by reversed-phasecapillary liquid chromatography with amperometric electrochemical detection // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 1996. - V. 677, N. 2. - P. 225-231.

160. Arnhold T., Tzimas G., Wittfoht W., Plonait S., Nau H. Identification of 9-cis-retinoic acid,9,13-di-cis-retinoic acid, and 14-hydroxy-4,14-retro-retinol in human plasma after liver consumption//Life Sci. 1996,-V. 59, N. 12.-P. PL169-177.

161. Eckhoff C., Nau H. Identification and quantitation of all-trans- and 13-cis-retinoic acid and13.cis-4-oxoretinoic acid in human plasma // J. Lipid Res. 1990. - V. 31, N. 8. - P. 1445-1454.

162. Tzimas G., Collins M. D., Nau II. Identification of 14-hydroxy-4,14-retro-retinol as an invivo metabolite of vitamin A // Biochim. Biophys. Acta. 1996.-V. 1301, N. 1-2.-P. 1-6.

163. Sass J. O., Nau H. Single-run analysis of isomers of retinoyl-P-D-glucuronide and retinoicacid by reversed-phase high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. -1994.-V. 685, N. l.-P. 182-188.

164. Tan B., Brzuskiewicz L. Separation of tocopherol and tocotrienol isomers using normalphase and reverse-phase liquid chromatography // Anal. Biochem. 1989. - V. 180, N. 2. -P. 368-373.

165. Ueda T., Igarashi O. Effect of coexisting fat on the extraction of tocopherols from tissuesafter saponification as a pretreatment for HPLC determination // J. Micronutr. Anal. -1987. — V. 3,N. l.-P. 15-25.

166. Thompson J. N., Maxwell W. B., L'Abbe M. High pressure liquid chromatographicdetermination of vitamin D in fortified milk // J. AOAC Int. 1977. - V. 60, N. 5. - P. 998-1002.

167. Cohen H., Wakeford B. High pressure liquid chromatographic determination of vitamin D3in instant nonfat dried milk // J. AOAC Int. 1980. - V. 63, N. 5. - P. 1163-1167.

168. Thompson J. N„ Hatina G., Maxwell W. B., Duval S. High performance liquidchromatographic determination of vitamin D in fortified milks, margarine, and infant formulas // J. AOAC Int. 1982. - V. 65, N. 3. - P. 624-631.

169. Hymoller L., Jensen S. K. Vitamin D analysis in plasma by high performance liquidchromatography (HPLC) with C30 reversed phase column and UV detection Easy and acetonitrile-free// J. Chromatogr. A.-2011.-V. 1218,N. 14.-P. 1835-1841.

170. Landen W. O., Jr. Liquid chromatographic determination of vitamins D2 and D3 in fortifiedmilk and infant formulas // J. AOAC Int. 1985. - V. 68, N. 2. - P. 183-187.

171. Sertl D. C., Molitor B. E. Liquid chromatographic determination of vitamin D in milk andinfant formula//J. AOAC Int. 1985.-V. 68,N.2.-P. 177-182.

172. Johnsson II., Ilessel H. High performance liquid chromatographic determination ofcholecalciferol (vitamin D3) in food—a comparison with a bioassay method // Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1987. - V. 57, N. 4. - P. 357-365.

173. Trenerry V. C., Plozza T., Caridi D., Murphy S. The determination of vitamin D3 in bovinemilk by liquid chromatography mass spectrometry // Food Chem. 2011. - V. 125, N. 4. -P. 1314-1319.

174. Sliva M. G., Sanders J. K. Vitamin D in infant formula and enteral products by liquidchromatography: collaborative study // J. AOAC Int. 1996. - V. 79, N. 1. - P. 73-80.

175. Byrdwell W. C„ Exler J., Gebhardt S. E., Harnly J. M., Ilolden J. M., Horst R. L„ Patterson

176. K. Y., Phillips K. M., Wolf W. R. Liquid chromatography with ultraviolet and dual parallel mass spectrometric detection for analysis of vitamin D in retail fortified orange juice // J. Food Comp. Anal. 2011. - V. 24, N. 3. - P. 299-306.

177. Hagar A. F., Madsen L., Wales L., Jr., Bradford H. B., Jr. Reversed-phase liquidchromatographic determination of vitamin D in milk // J. AOAC Int. 1994. - V. 77, N. 4.-P. 1047-1051.

178. Bartolucci G., Giocaliere E., Boscaro F., Vannacci A., Gallo E., Pieraccini G., Moneti G.

179. Vitamin D3 quantification in a cod liver oil-based supplement// J. Pharm. Biomed. Anal. -2011.-V. 55,N. l.-P. 64-70.

180. Bilodeau L., Dufresne G., Dccks J., Clement G., Bertrand J., Turcotte S., Robichaud A.,

181. Beraldin F., Fouquet A. Determination of vitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 in foodstuffs by HPLC UV-DAD and LC-MS/MS // J. Food Comp. Anal. 2011. - V. 24, N.3.-P. 441-448.

182. Xie W., Chavez-Eng C. M., Fang W., Constanzer M. L., Matuszewski B. K., Mullett W.

183. Hasegawa H. Vitamin D determination using high-performance liquid chromatography withinternal standard—redox mode electrochemical detection and its application to medical nutritional products // J. Chromatogr. A. 1992. -V. 605, N. 2. - P. 215-220.

184. Chou P. P., Jaynes P. K., Bailey J. L. Determination of vitamin E in microsamples of serumby liquid chromatography with electrochemical detection // Clin. Chem. 1985. - V. 31, N. 6. - P. 880-882.

185. Pascoe G. A., Duda C. T., Reed D. J. Determination of a-tocopherol and atocopherylquinone in small biological samples by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 1987. -V.414.-P. 440-448.

186. Pinheiro-Sant'Ana H. M., Guinazi M., Oliveira D. d. S., Delia Lucia C. M., Reis B. d. L.,

187. Brandao S. C. C. Method for simultaneous analysis of eight vitamin E isomers in various foods by high performance liquid chromatography and fluorescence detection // J. Chromatogr. A. 2011. - V. 1218, N. 47. - P. 8496-8502.

188. Darnet S., Serra J. L., da Cruz Rodrigues A. M., Meller da Silva L. 11. A high-performanceliquid chromatography method to measure tocopherols in assai pulp (Euterpe oleracea) // Food Res. Int. 2011. - V. 44, N. 7. - P. 2107-2 111.

189. Vilasoa-Martinez M., Calaza-Ramos C., Lopez-Hernandez J., Lage-Yusty M. A., Losada P.

190. P., Rodriguez-Bernaldo de Quiros A. Determination of vitamin E and carotenoid pigments by high performance liquid chromatography in shell of Chionoecetes opilio // Anal. Chim. Acta. 2008. - V. 617, N. 1-2. - P. 225-229.

191. Molto-Puigmarti C., Castellote A. I., Lopez-Sabater M. C. Ultra-High-Pressure Liquid

192. Chromatographic method for the analysis of tocopherols in human colostrum and milk // J. Chromatogr. A. 2009. - V. 1216, N. 20. - P. 4388-4394.

193. Czauderna M., Kowalczyk J. Alkaline saponification results in decomposition oftocopherols in milk and ovine blood plasma // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 2007. -V. 858, N. 1-2.-P. 8-12.

194. Delgado-Zamarreño M. M., Bustamante-Rangel M., Sánchez-Pérez A., Carabias-Martinez

195. R. Pressurized liquid extraction prior to liquid chromatography with electrochemical detection for the analysis of vitamin E isomers in seeds and nuts // J. Chromatogr. A. -2004.-V. 1056, N. 1-2.-P. 249-252.

196. Sarzanini C., Mentasti E., Vincenti ML, Nerva M., Gaido F. Determination of plasmatocopherols by high-performance liquid chromatography with coulometric detection // J. Chromatogr. 1993. - V. 620, N. 2. - P. 268-272.

197. Gonzalez-Corbel la M. J., Lloberas-Blanch N., Castellote-Bargallo A. I., Lopez-Sabater M.

198. C., Rivero-Urgell M. Determination of a-tocopherol in plasma and erythrocytes by highperformance liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 1994. - V. 660, N. 2.-P. 395-400.

199. Cooper J. D. H., Thadwal R., Cooper M. J. Determination of vitamin E in human plasma byhigh-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 1997. - V. 690, N. 1-2.-P. 355-358.

200. Thompson J. N., Maxwell W. B. Reverse phase high-pressure liquid chromatography ofvitamin A in margarine, infant formula and fortified milk // J. AOAC Int. 1977. -V. 60, N.4.-P. 766-771.

201. Henderson S. K., Wickroski A. F. Reverse phase high-pressure liquid chromatographicdetermination of vitamin D in fortified milk // J. AOAC Int. 1978. - V. 61, N. 5. - P. 1130-1134.

202. Chappell J. E., Francis T., Clandinin M. T. Simultaneous high-performance liquidchromatography analysis of retinol ester and tocopherol isomers in human milk // Nut. Res. 1986. - V. 6, N. 7. - P. 849-852.

203. Barnett S. A., Frick L. W., Baine H. M. Simultaneous determination of vitamin A, vitamin

204. D2 or vitamin D3, vitamin E and vitamin K1 in infant formulas and dairy products by reversed-phase liquid chromatography // Anal. Chem. 1980. - V. 52, N. 4. - P. 610614.

205. Albalallurtado S., NovellaRodriguez S., VecianaNogues M. T., MarineFont A.

206. Determination of vitamins A and E in infant milk formulae by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. -V. 778, N. 1-2. - P. 243-246.

207. Delgado-Zamarreño M. M., Sanchez-Perez A., Gomez-Perez M. C., Hernandez-Mendez J.

208. Directly coupled sample treatment—high-performance liquid chromatography for on-line automatic determination of liposoluble vitamins in milk // J. Chromatogr. A. 1995. - V. 694, N. 2.-P. 399-406.

209. Delgado Zamarreno M. M., Sanchez Perez A., Sanchez Rodriguez M., Gomez Perez M. C.,

210. Hernandez Mendez J. Determination of fat-soluble vitamins in yogurt by HPLC with electrochemical detection // Talanta. 1996. - V. 43, N. 9. - P. 1555-1563.

211. Thompson J. N., Hatina G., Maxwell W. B. High-performance liquid chromatographicdetermination of vitamin A in margarine, milk, partially skimmed milk and skimmed milk // J. AOAC Int. 1980. - V. 63, N. 4. - P. 894-898.

212. Paixao J. A., Stamford T. L. M. Lacteal matrices. A single guide for extraction andquantification of fat-soluble vitamins // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2002. - V. 25,N. 2.-P. 217-239.

213. Vails F., Fernandez-Muino M. A., Checa M. A., Ortiz M. T. S. Determination of vitamins Aand E in cooked sausages // Eur. Food Res. Technol. 2007. - V. 226. - P. 181 -185.

214. Plozza T., Craigc Trenerry V., Caridi D. The simultaneous determination of vitamins A, Eand p-carotene in bovine milk by high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry (I lPLC-MSn) // Food Chem. 2012. - V. 134, N. 1. - P. 559-563.

215. Gleize B., Steib M., André M., Reboul E. Simple and fast IIPLC method for simultaneousdetermination of retinol, tocopherols, coenzyme Q10 and carotenoids in complex samples // Food Chem. 2012. - V. 134, N. 4. - P. 2560-2564.

216. Momenbeik F., Roosta M., Nikoukar A. A. Simultaneous microemulsion liquidchromatographic analysis of fat-soluble vitamins in pharmaceutical formulations: Optimization using genetic algorithm // J. Chromatogr. A. 2010. - V. 1217, N. 24. - P. 3770-3773.

217. Xu H., Jia L. Capillary liquid chromatographic analysis of fat-soluble vitamins and (3carotene in combination with in-tube solid-phase microextraction // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci.-2009. V. 877,N. 1-2.-P. 13-16.

218. Tavcar-Kalcher G., Vengust A. Stability of vitamins in premixes // Anim. Feed Sci. Tech.2007.-V. 132, N. 1-2.-P. 148-154.

219. Heudi O., Trisconi M.-J., Blake C.-J. Simultaneous quantification of Vitamins A, D3 and Ein fortified infant formulae by liquid chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. A. -2004. V. 1022,N. 1-2.-P. 115-123.

220. Escriva A., Esteve M. J., Farre R., Frigola A. Determination of liposoluble vitamins incooked meals, milk and milk products by liquid chromatography // J. Chromatogr. A. -2002. V. 947, N. 2. - P. 313-318.

221. Quesada J. M., Mata-Granados J. M., Luque de Castro M. D. Automated method for thedetermination of fat-soluble vitamins in serum // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2004. -V. 89-90.-P. 473-477.

222. Azeredo V. B. d., Trugo N. M. F. Retinol, carotenoids, and tocopherols in the milk oflactating adolescents and relationships with plasma concentrations // Nutrition. — 2008. — V. 24, N. 2.-P. 133-139.

223. Kamao M., Tsugawa N., Suhara Y., Wada A., Mori T., Murata K., Nishino R., Ukita T.,

224. Uenishi K., Tanaka K., Okano T. Quantification of fat-soluble vitamins in human breastmilk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 2007. - V. 859, N. 2. - P. 192-200.

225. Momenbeik F., Momeni Z., Khorasani J. H. Separation and determination of Vitamins Eand A in multivitamin syrup using micellar liquid chromatography and simplex optimization // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. - V. 37, N. 2. - P. 383-387.

226. Siluk D., Oliveira R. V., Esther-Rodriguez-Rosas M., Ling S., Bos A., Ferrucci L., Wainer

227. W. A validated liquid chromatography method for the simultaneous determination of vitamins A and E in human plasma // J. Pharm. Biomed. Anal. 2007. - V. 44, N. 4. - P. 1001-1007.

228. Chavez-Servin J. L., Castellote A. I., Lopez-Sabater M. C. Simultaneous analysis of

229. Vitamins A and E in infant milk-based formulae by normal-phase high-performance liquid chromatography-diode array detection using a short narrow-bore column // J. Chromatogr. A. -2006. V. 1122,N. 1-2.-P. 138-143.

230. Thompson J. N. Problems of official methods and new techniques for analysis of foods andfeeds for vitamin A // J. AOAC Int. 1986. - V. 69, N. 5. - P. 727-738.

231. Thomas J. B. R„ Kline M. C., Schiller S. B., Ellerbe P. M., Sniegoski L. T„ Duewer D. L.,

232. Sharpless K. E. Certification of fat soluble vitamins, carotenoids, and cholesterol in human serum: Standard reference material 968b // Fresenius J. Anal. Chem. 1996. - V. 356, N. l.-P. 1-9.

233. Evers J. M., Wightman L. M., Crawford R. A., Contarini G., Coors U., Farrington D. S.,

234. Molkentin J., Nicolas M. A precise method to measure the total fat content of spreadable fats // Int. Dairy J. 2000. - V. 10, N. 12. - P. 815-827.

235. Xin Q., Ling I I. Z., Long T. J., Zhu Y. The rapid determination of fat and protein content infresh raw milk using the laser light scattering technology // Opt. Lasers Eng. 2006. - V. 44,N. 8.-P. 858-869.

236. Indyk H. E. Simplified saponification procedure for the routine determination of totalvitamin E in dairy products, foods and tissues by high-performance liquid chromatography // Analyst. 1988. - V. 113, N. 8. - P. 1217-1221.

237. Bioavailability and Analysis of Vitamins in Foods. / Ball G. F. M.: Chapman & Hall, 1998.

238. Bhat P. V., Sundaresan P. R. High-performance liquid chromatography of vitamin Acompounds // Crc Critical Reviews in Anal. Chem. 1988. - V. 20, N. 3. - P. 197-219.

239. Rodrigo N., Alegria A., Barbera R., Farre R. High-performance liquid chromatographicdetermination of tocopherols in infant formulas // J. Chromatogr. A. 2002. - V. 947, N. l.-P. 97-102.

240. Wang Q., Lee B. L., Ong C. N. Automated high-performance liquid chromatographicmethod with precolumn reduction for the determination of ubiquinol and ubiquinone in human plasma // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 1999. - V. 726, N. 1 -2. - P. 297-302.

241. Hansen G., Christensen P., Tuchsen E., Lund T. Sensitive and selective analysis ofcoenzyme Q(10) in human serum by negative APCI LC-MS // Analyst. 2004. - V. 129, N. l.-P. 45-50.

242. Aberg F., Appelkvist E. L., Dallner G., Ernster L. Distribution and redox state ofubiquinones in rat and human tissues // Arc. Biochem. Biophys. 1992. - V. 295, N. 2. -P.230-234.

243. Vadhanavikit S., Sakamoto N., Ashida N., Kishi T., Folkers K. Quantitative determinationof coenzyme Q10 in human blood for clinical studies // Anal. Biochem. 1984. - V. 142, N. l.-P. 155-158.

244. Artuch R., Moreno J., Quintana M., Puig R. M., Vilaseca M. A. Serum ubiquinone-10 in apediatric population // Clin. Chem. 1998. - V. 44, N. 11. - P. 2378-2379.

245. Miles M. V., Horn P. S., Tang P. H., Morrison J. A., Miles L., DeGrauw T., Pesce A. J.

246. Age-related changes in plasma coenzyme Q(10) concentrations and redox state in apparently healthy children and adults // Clin. Chim. Acta. 2004. - V. 347, N. 1-2. - P. 139-144.

247. Motchnik P. A., Frei B., Ames B. N. Measurement of antioxidants in human blood-plasma

248. Oxygen Radicals in Biological Systems, D. 1994. - V. 234. - P. 269-279.

249. Brasen J. 11., Koenig K., Bach H., Kontush A., Heinle 11., Witting P. K., Yla-Herttuala S.,

250. Stocker R., Beisiegel U. Comparison of the effects of alpha-tocopherol, ubiquinone-10 and probucol at therapeutic doses on atherosclerosis in WHHL rabbits // Atherosclerosis.- 2002. V. 163, N. 2. - P. 249-259.

251. Zhang Y. Y., Eriksson M., Dallner G., Appelkvist E. L. Analysis of ubiquinone andtocopherol levels in normal and hyperlipidemic human plasma // Lipids. 1998. - V. 33, N. 8. - P. 811-815.

252. Yang H. Y., Song J. F. High-sensitive determination of coenzyme Q(10) in lodinate-betacyclodextrin medium by inclusion reaction and catalytic polarography // Anal. Biochem.- 2006. V. 348, N. 1. - P. 69-74.

253. Farbu T., Lambertsen G. Ubiquinone analyses in fish tissues and in some marineinvertebrates // Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 1979. - V. 63, N. 3. -P. 395-397.

254. Hagennan R. A., Willis R. A., Hagerman A. E. Ubiquinone binding protein used fordetermination of coenzyme Q// Anal. Biochem. 2003. - V. 320. N. l.-P. 125-128.

255. Karpilska J., Frankowska R. Application of tocopherol acetate as internal standard in UV

256. Derivative spectrophotometry analysis of coenzyme Q(10) // Inst. Sci. Technol. 2004. -V. 32,N. 3.-P. 281-290.

257. Karpinska J., Mikoluc B., Piotrowska-Jastrzebska J. Application of derivative spectrophotometry for determination of coenzyme Q(10) in pharmaceuticals and plasma // J. Pharm. Biomed. Anal. 1998. - V. 17, N. 8. - P. 1345-1350.

258. Andersson S. Determination of coenzyme-Q by nonaqueous reversed-phase liquidchromatography // J. Chromatogr. 1992. - V. 606, N. 2. - P. 272-276.

259. Karpinska J., Mikoluc B., Motkowski R., Piotrowska-Jastrzebska J. HPLC method forsimultaneous determination of retinol, alpha-tocopherol and coenzyme Q(10) in human plasma // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. - V. 42, N. 2. - P. 232-236.

260. Duncan A. J., Heales S. J. R., Mills K., Eaton S., Land J. M., Hargreaves I. P.

261. Determination of coenzyme Q(10) status in blood mononuclear cells, skeletal muscle, and plasma by HPLC with Di-propoxy-coenzyme Q(10) as an internal standard // Clin. Chem. -2005. -V. 51,N. 12.-P. 2380-2382.

262. Piretti M. V., Pagliuca G., Tarozzi G. Simultaneous reversed-phase high-performance liquidchromatographic separation of non-polar isoprenoid lipids and their determination // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 1995. - V. 674, N. 2. - P. 177-185.

263. Okamoto T., Fukui K., Nakamoto M., Kishi T., Okishio T., Yamagami T., Kanamori N.,

264. Kishi H., Hiraoka E. High-performance liquid chromatography of coenzyme Q-related compounds and its application to biological materials // J. Chromatogr. 1985. - V. 342. N. 1,-P. 35-46.

265. Mosca F., Fattorini D., Bompadre S., Littarru G. P. Assay of coenzyme Q(10) in plasma bya single dilution step // Anal. Biochem. 2002. - V. 305, N. 1. - P. 49-54.

266. Tang P. H., Miles M. V., Steele P., Davidson B. S., Geraghty S. R., Morrow A. L.

267. Determination of coenzyme Q(10) in human breast milk high-performance liquid chromatography // Biomed. Chromatogr. 2006. - V. 20, N. 12. - P. 1336-1343.

268. Tang P. H., Miles M. V., Miles L., Quinlan J., Wong B., Wenisch A., Bove K.

269. Measurement of reduced and oxidized coenzyme Q(9) and coenzyme Q(10) levels in mouse tissues by IIPLC with coulometric detection // Clin. Chim. Acta. -2004. V. 341, N. 1-2.-P. 173-184.

270. Lass A., Sohal R. S. Comparisons of coenzyme Q bound to mitochondrial membraneproteins among different mammalian species // Free Radical Biol. Med. 1999. - V. 27, N. 1-2.-P. 220-226.

271. Kwong L. K., Kamzalov S., Rebrin 1., Bayne A. C. V., Jana C. K., Morris P., Forster M. J.,

272. Sohal R. S. Effects of coenzyme Q(10) administration on its tissue concentrations, mitochondrial oxidant generation, and oxidative stress in the rat // Free Radical Biol. Med. 2002. - V. 33, N. 5. - P. 627-638.

273. Tang P. I I. Determination of coenzyme Q(10) in over-the-counter dietary supplements byhigh-performance liquid chromatography with coulometric detection // J. AOAC Int. -2006.-V. 89, N. 1.-P. 35-39.

274. Grossi G., Bargossi A. M., Fiorella P. L., Piazzi S., Battino M., Bianchi G. P. Improvedhigh-performance liquid chromatographic method for the determination of coenzyme-Q10 in plasma // J. Chromatogr. 1992. - V. 593, N. 1-2.-P. 217-226.

275. Lang J. K., Packer L. Quantitative determination of vitamine E and oxidized and reducedcoenzyme-Q by high-performance liquid chromatography with in-line ultraviolet and electrochemical detection//J. Chromatogr. 1987,-V. 385.-P. 109-117.

276. Bentinger M., Dallner G., Chojnacki T., Swiezewska E. Distribution and breakdown oflabeled coenzyme Q(10) in rat // Free Radical Biol. Med. 2003. - V. 34, N. 5. - P. 563575.

277. Gao M. C., Liu H. J., Yang M., Hu J. Y., Shao B. Indirect identification of isoprenoidquinones in Escherichia coli by LC-MS with atmospheric pressure chemical ionization in negative mode // J. Basic Microbiol. 2004. - V. 44, N. 6. - P. 424-429.

278. Zu Y. G., Zhao C. J., Li C. Y., Zhang L. A rapid and sensitive LC-MS/MS method fordetermination of coenzyme Q(10) in tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves // J. Sep. Sci.- 2006. V. 29, N. 11. - P. 1607-1612.

279. Jiang P., Wu M., Zheng Y., Wang C., Li Y., Xin J., Xu G. Analysis of coenzyme Q10 inhuman plasma by column- switching liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. 2004. - V. 805, N. 2. - P. 297-301.

280. Hiroshima O., Ikenoya S., Naitoh T., Kusube K., Ohmae M., Kawabe K., Ishikawa S.,

281. Hoshida H., Kurahashi T. Electrochemical detector for high-performance liquid chromatography .6. Application of a twin electrochemical detector // Chem. Pharm. Bull.- 1983.-V. 31,N. 10.-P. 3571-3578.

282. Mattila P., Kumpulainen J. Coenzymes Q(9) and Q(10): Contents in foods and dietaryintake // J. Food Comp. Anal. 2001. - V. 14, N. 4. - P. 409-417.