Метод вольтамперометрии в определении антиоксидантных свойств некоторых биологически активных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На ппавах т'КОПИСи

003450789 Вторушина Анна Николаевна

Метод вольтамперометрии в определении антиоксидантных свойств некоторых биологически активных соединений

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 0 о'[7 2000

Томск 2008

003450789

Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат химических наук, доцент Короткова Елена Ивановна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор химических наук,

профессор Гунцов Александр Владимирович

кандидат химических наук, доцент

Мамонтова Инесса Петровна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

НИИ безопасности жизнедеятельности Республики Башкортостан, (г. Уфа)

Защита диссертации состоится 19 ноября 2008 г. в 14.30 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при Томском политехническом университете по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Томского политехнического университета по адресу: г.Томск, ул. Белинского, 53

Автореферат разослан: « № » октября 2008 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, канд. хим. наук, доцент

Гиндуллина Т.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Использование антиоксидантов (АО), веществ, прерывающих радикально-цепные процессы окисления в объектах органического и неорганического происхождения, получило широкое распространение в последнее время в различных областях химии, биологии и медицины. На основе индивидуальных АО и биологически активных веществ (БАВ) создаются новые фармацевтические препараты и биологически активные добавки (БАД), предназначенные для лечения и профилактики ряда заболеваний, нормализации обмена веществ и т.д.

Лавинообразный рост вновь синтезированных БАД, появляющихся на рынке, предъявляет все более серьезные требования к исследованию их свойств. В настоящее время не существует единой меры антиоксидантной активности (АОА) подобных препаратов, нет единой регламентированной процедуры оценки АОА БАД, а результаты, полученные методами с различными модельными системами, зачастую не сопоставимы. Необходимость введения новых показателей, методик и приборов, обеспечивающих надежные результаты по исследованию свойств и активности подобных препаратов, становится актуальной задачей, от решения которой зависит эффективность и безопасность предлагаемых на рынке БАД, продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности.

В систематизированном виде информация о свойствах антиоксидантов представлена очень ограниченно. Практически полностью отсутствуют сведения об электрохимических свойствах антиоксидантов природного и растительного происхождения, их влиянии на многостадийные электродные процессы.

В данной работе в качестве метода исследования предлагается использовать простой в аппаратурном оформлении, экспрессный и высокочувствительный метод вольтамперометрии, имеющий большие потенциальные возможности в области электроаналитической химии, исследования свойств БАВ, разработки методов аналитического контроля сложных объектов. Использование в качестве модельной реакции процесса ЭВ 02, идущего по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в клетках организма человека и животного, тканях растений, и являющегося основным окислительным процессом во всех объектах искусственного и природного происхождения, делает данный метод еще более привлекательным.

Цель работы: Разработать методику определения суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности на основе процесса ЭВ 02.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:

¡.Рассмотреть закономерности процесса ЭВ От в условиях линейной полубесконечной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с АО.

2. Определить оптимальные концентрации и время активного действия АО на примере флавоноидов, построить математические модели процесса в области оптимума функции.

3. Исследовать АО А по отношению к процессу ЭВ О2 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима <3ю, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, иопол, фенол), витамина С, аскорбатов Со, Ре, Са, 1л и их смесей, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей) для определения оптимальных условий их применения.

4. Исследовать электрохимические свойства ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Ош, определить оптимальные условия получения аналитического сигнала для определения данных веществ методом циклической вольтамперометрии.

5. Выявить корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами и антиоксидантными свойствами исследуемых соединений фенольной природы.

6. Разработать методику выполнения измерений суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, фармацевтической промышленности. Провести сравнительные испытания АОА индивидуальных препаратов, используя различные методы определения. Рассчитать метрологические характеристики методики.

Научная новизна. Впервые рассмотрены закономерности процесса ЭВ 02 в присутствии антиоксидантов в условиях как стационарной, так и нестационарной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами по механизму ЕС. Численным методом конечных разностей решена граничная задача для данного процесса . Определены некоторые кинетические параметры процесса.

Впервые проведено определение АОА по отношению к процессу ЭВ О2 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Ою, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Бе, Са, 1л, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей) методом катодной вольтамперометрии.

Получены линейные и квадратичные математические модели определения активности антиоксидантов в зависимости от концентрации и времени их активного действия, используя методы планирования эксперимента.

Выявлены корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами и антиоксидантными свойствами на примере ряда флавоноидов, производных кумаринов и жирорастворимых витаминов А и Е.

Практическая значимость.

Разработана новая методика определения суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности с помощью метода катодной вольтамперометрии и процесса

' Результаты поставленной задачи, получены при непосредственном участии доценга каф. общей физики Томского юсударственною педагогического университета, к ф -м и Катаева Сер1ея Григорьевича

4

ЭВ СЬ, отличающаяся чувствительностью, простотой в исполнении, экспрессностью, универсальностью.

На основе методики разработан новый анализатор «АОА». Прибор прошел государственные испытания с целью утверждения типа средства измерения (СИ), по результатам которых ему присвоен тип СИ - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.A № 28715) и внесен в Единый государственный реестр СИ под номером 35466-07.

Определены потенциалы окисления - восстановления ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Qio методом циклической вольтамперометрии, которые могут быть использованы в качестве аналитического сигнала для разработки методик их определения в различных объектах.

По результатам определения АОА ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qio, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Са, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей) выявлены наиболее активные антиоксиданты, их композиции, способ фракционирования экстрактов растений и даны рекомендации для их дальнейшего использования в фитотерапии.

На защиту выносятся:

1. Новые методика и разработанный на ее основе анализатор для определения суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, природных объектах.

2. Результаты определения АОА по отношению к процессу ЭВ 02 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qio, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Са, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей).

3. Результаты определения электроаналитических свойств ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Q|0, которые могут быть использованы в качестве аналитического сигнала для определения данных веществ в БАД.

4. Результаты сравнительных определений антиоксидантной активности некоторых БАВ, используя метод катодной вольтамперометрии и независимые аналитические методы анализа.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены устными и стендовыми докладами на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), European conference on analytical chemistry «Euroanalysis XIII» (Salamanca, Испания, 2004), III Всерос. научн. конф. «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2004), Всерос. научн. конф. с международным участием «Электроаналитика» (Екатеринбург, 2005), International Conference «Instrumental Methods of Analysis Modern Trends and

5

Applications» (Iraklion, Греция, 2005), International Conference «International Congress on Analytical Sciences» (Moscow, 2006), The 13-th World Congress «Food in life» (Nantes, Франция, 2006), II Всерос. конф. по аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2007» (Краснодар, 2007), 4lh Black sea basin conference on analytical chemistry (Sunny Beach, Болгария, 2007), VII Всерос. конф. по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008» (Уфа, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 12 тезисов докладов.

Диссертация выполнена при поддержке гранта ТПУ «на проведение молодыми учеными научных исследований в ведущих научно-педагогических коллективах» 2008г., проекта № 5.428 С.2007 Томской области в областном конкурсе научных разработок молодых ученых в 2007 году по теме «Разработка анализатора для определения антиоксидантов в различных объектах» и проекта № 5.426 С.2007 «Разработка анализатора для определения антиоксидантов в биологических объектах» в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы из 191 наименования и приложения. Содержит 200 страниц, 34 таблицы, 40 рисунков.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведен литературный обзор, посвященный описанию антиоксидантной защитной системы организма и роли фенольных соединений в ее составе, их распространению в природе и жизни человека; современное состояние теории и практики определения антиоксидантных и электрохимических свойств соединений фенольной природы.

Во второй главе рассмотрены теоретические закономерности процесса ЭВ 02 в условиях стационарной и нестационарной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами по механизму ЕС.

В третьей главе описаны условия эксперимента, способы приготовления растворов и электродов, представлены данные об используемом оборудовании и объектах исследования.

В четвертой главе рассмотрена АОА по отношению к процессу ЭВ 02 некоторых биологически активных соединений фенольной природы, определены их электрохимические параметры, а также показана корреляция между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами исследуемых соединений.

В пятой главе описаны метрологические аспекты методики определения суммарного количества антиоксидантов в различных объектах, рассчитаны

метрологические показатели для представленной методики. Показаны результаты сравнительных испытаний вольтамперометрического и спектрофотометричсского методов определения АОА.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования проводили на полярографе ПУ-1 с двухкоординатным самописцем ЛКД -4 и компьютеризированном вольтамперометрическом анализаторе ТА-2 («Томьаналит», г.Томск). В работе использовали метод катодной вольтамперометрии, в качестве модельной реакции рассматривали процесс ЭВ 02. Для оценки влияния исследуемых веществ рассматривали зависимости предельного тока первой волны ЭВ СЬ от концентрации их в объеме раствора и от времени протекания процесса ЭВ 02 в их присутствии.

Вольтамперограммы исследуемых растворов регистрировали на стационарных электродах с линейной разверткой потенциала со скоростью 40 мВ/с. Для измерений использовали индикаторный ртутнопленочный электрод (РПЭ). В качестве электрода сравнения применяли хлоридсеребряный электрод. Вспомогательным электродом служил стеклоуглеродный электрод.

Концентрацию кислорода в растворах электролитов контролировали при помощи потенциометрического кислородного датчика № 5972 «МЕРА-ЭЛЬВРО». рН растворов измеряли при помощи лабораторного рН-метра-150М с электродом ЭСКЛ-08М и автоматическим термокомпенсатором ТКА-8М.

Объектами лекарственного растительного сырья служили сухие экстракты различных растений флоры Сибири. Индивидуальными объектами исследований были выбраны ряд флавоноидов, впервые синтезированные производные кумаринов, витамины А и Е, а также коэнзим <3ю и др.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Окисление кислородом и его активными радикалами является одним из основных процессов, протекающих в организме. Поэтому представляется достаточно интересным рассмотрение влияния антиоксидантов на процесс ЭВ 02, протекающего по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в клетках и тканях организма. В работе рассматривается первая волна катодного ЭВ 02> реализующаяся на РПЭ.

В различных литературных источниках активно обсуждается вопрос влияния последующей химической реакции на электродный процесс. В настоящей работе была предложена схема процесса ЭВ 02 осложненного последующими химическими реакциями в условиях стационарной и нестационарной диффузии

Процесс ЭВ 0?, осложненный наличием последующей химической реакции в условиях стационарной и нестационарной диффузии

Общая схема электродного процесса с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами будет выглядеть следующим образом:

к

т.

К

т. К

т.

е" -Н*

к2;*КЦСН

к,;*ЯЦСН

Для описания электродного процесса ЭВ Ог в присутствии антиоксидантов были приняты следующие допущения:

- использовались условия стационарной диффузии, что может быть допустимо при малых скоростях развертки потенциала на стационарном РПЭ;

- среди продуктов реакции по схеме в раствор диффундирует только форма ЬЬСЬ как конечный продукт;

- коэффициенты диффузии окисленной и восстановленной форм кислорода принимались равными друг другу;

- в качестве лимитирующей стадии выступала стадия образования супероксид анион-радикала. Остальные стадии электродного процесса являются обратимыми и протекают с достаточно большой скоростью;

- АО реагируют с активными кислородными радикалами на поверхности электрода преимущественно в прямом направлении. Реакция взаимодействия АО с молекулярным кислородом, как на поверхности электрода, так и в глубине раствора не учитывалась;

- концентрация АО была достаточно большой, поэтому ее изменениями в ходе электродного процесса можно пренебречь.

Исходя из схемы (1) и принятых допущений, получено выражение для тока кислорода на электрод в присутствии (2) и отсутствии (3) АО в растворе:

ь=1<,-р{к [огин+№ <2>

1, = 2 Р^[Н202]5

к; =10-4^/7,; к[ =10~3А':5//2; к'а

где - кинетический ток в присутствии АО в растворе, I^

(3)

* <4>

диффузионный ток в

отсутствии антиоксидантов в растворе, Р - постоянная Фарадся, кх и к2 -

константы

скорости последующих химических реакций взаимодействия антиоксиданта с активными кислородными радикалами, Аг^ - константа диффузионного тока, ц - толщина диффузионного слоя, см. По литературным данным ц = 0.25 мм.

С учетом констант равновесия (К2, К3) при определении относительного изменения тока в присутствии АО, получим следующее выражение для тока на электрод:

'к _

= 1-

(к; +к'2 к2)

"АО

(5)

V 2 к',К2К3[Н>] В данном случае полученное уравнение не дает возможности рассчитать кинетические параметры процесса, но объясняет наличие линейной зависимости изменения тока ЭВ 02 от концентрации АО в растворе. При этом понижение предельного тока ЭВ 02 в присутствии АО будет наблюдаться при соотношении: (*,' + к'2К2)Сл0<2к'с1К2Къ[Н+] (6)

Если выражения будут равны друг другу, мы не будем наблюдать изменения сигнала ЭВ 02 в присутствии АО: 1к=0:(Аг,' +к'2К2)СА0 = К2Кг[Н+ ] (7)

Если {к; +к'2К2)САО>1к^К2Кг[Н+] (8)

мы будем наблюдать повышение тока ЭВ 02 в присутствии АО.

Для определения границ применимости данной модели и расчета некоторых кинетических параметров процесса была поставлена граничная задача квазиобратимого электродного процесса ЭВ 02 в присутствии АО в условиях нестационарной диффузии. За основу была взята следующая схема электродного процесса:

Ох + пе —

•Же^ + С 1 >А

(9)

Принимая ряд допущений, сформулирована граничная задача для представленного процесса и поставлены граничные условия. Данная задача была решена, используя численный метод конечных разностей.

В результате решения были получены теоретические вольтамперограммы процесса ЭВ 02 в присутствии аскорбиновой кислоты для разных значений скоростей развертки потенциала: 0.02 В/с, 0.08 В/с и 0.29 В/с. Полученные теоретические вольтамперограммы сравнивались с экспериментальными, расхождение между результатами незначительны, особенно в области малых скоростей развертки потенциала (рис. 1).

Корреляцию между экспериментальными и теоретическими вольтамперограммами оценивали при помощи коэффициента детерминации формуле:

рассчитываемого

по

£> = 1-

ХХлхр-у«.

1=1_

гУ

У/еог

г>2

Рис. 1. Экспериментальная и

теоретическая вольтамперограммы тока ЭВ 02 в присутствии аскорбиновой к-ты (02.7- 10"3моль/л) на РПЭ в фосфатном буфере (рН 6.86), \V-20 мВ/с

где усхр - значение функции отклика в М-й точке на экспериментальной кривой, у1ео1. - значение функции отклика в N -й точке на теоретически полученной кривой, N - количество точек на рассматриваемых кривых.

Также были рассчитаны значения среднеквадратического отклонения (СКО)

между теоретическими и экспериментальными значениями тока на вольтамперных кривых для разных скоростей развертки потенциала (табл. 2).

В ходе решения были определены некоторые кинетические параметры процесса, представленные в таблице 2. Исходные параметры, взятые за основу в расчете, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Исходные параметры процесса ЭВ 02 в присутствии аскорбиновой _кислоты (С=2.7-10~3 моль/л^ на РПЭ

Бох, см7с

1.48-10"'

рге<ь см /с

4.56-10"'

С„х, моль/л

2.56- 1(Г

Сс, моль/л

2.7-10"

5, см

0.275

Таблица 2.

Значения некоторых кинетических параметров процесса ЭВ 02 в

мВ/с 20 80 290

а 0.5 0.55 0.5

к5, см/с Ю"2 ю-2 10"

, лмоль"1 с"1 10+4 10+4 10+4

ско 1.854 4.494 9.170

Б 0.964 0.921 0.917

Полученные теоретические вольтамперограммы при сопоставлении с экспериментальными позволили подтвердить механизм наличия последующей химической реакции и рассчитать константу скорости последующей химической реакции взаимодействия АО с активными кислородными радикалами, значение которой хорошо согласуется с литературными данными. Показано, что при малых скоростях развертки потенциала полученная математическая модель адекватно описывает процесс. Определены оптимальные условия получения аналитического сигнала.

Оценка оптимальной концентрации и времени активного действия АО

фенольной природы

Для оценки оптимальной концентрации и времени активного действия АО в данной работе использовали методы планирования эксперимента. Все исследования проводились на примере ряда флавоноидов.

Для получения математической модели процесса ЭВ 02 в присутствии АО фенольной природы использовали полный факторный эксперимент.

Варьируемыми факторами служили концентрация АО и время его взаимодействия с активными кислородными радикалами. В качестве функции отклика использовали относительное изменение тока ЭВ 02 (1/1о) в присутствии АО. Для всех исследуемых веществ получены адекватные математические модели процесса: Рутин у=0.0083+0.0023л;,+0.0038^2

Кверцетин у=0.0479+0.003 8л:; - 0.01 Ох, - 0.0645* ^

Дигидрокверцетин у=0.0140+0.0045х7+0.0099х2

Катехин у=0.0330+0.0021х,+0.0036х2

Для оптимизации условий осуществили поиск точки оптимума движением по градиенту функции отклика согласно уравнению регрессии, используя метод крутого восхождения. Полученные оптимальные условия были взяты за основу при описании области оптимума планами второго порядка методом центрального ортогонального композиционного планирования (ЦОКП). Для исследуемых флавоноидов получены следующие математические модели второго порядка:

Рутин: у=0.0699+0.0212х;-0.0112х_,+0.0078х/

Кверцетин: у=0.1504-0.0373хг-0.0112х;х>-0.0731х/+0.0250х/

Дигидрокверцетин: у=0.0859-0.029х,-0.0134x^0.0116х,х2+0.125х/ Катехин: у=0.0275+0.0083х/+0.0090х,+О.ООЗОх/х2-0.0104х/*-0.0144х/

Показано, что относительное изменение предельного тока кислорода в присутствии АО зависит как от концентрации АО фенолыюй природы, так и от времени его взаимодействия с активными кислородными формами (АФК). Следует заметить, что основным значимым фактором в полученных математических моделях являлось время взаимодействия АО с АФК для всех исследуемых веществ. На основании полученных результатов, согласно методике определения АОА вольтамперометрическим методом, было предложено два эмпирических критерия оценки АОА: концентрационный и кинетический критерии.

1. Концентрационный критерий - отражает степень изменения концентрации кислорода и его активных радикалов в зависимости от

концентрации АО в растворе. Размерность: мл/г.

1

¿.с,. =7" "7— (Ю)

1 о АО

где /, - ток ЭВ От в присутствии АО в растворе, мкА, /„ - ток ЭВ 02 в отсутствии АО в растворе, мкА; Сдо - концентрация АО, г/мл.

2. Кинетический критерий - отражает количество активных кислородных форм, прореагировавших с АО (или суммарным содержанием АО) за минуту времени. Размерность: мкмоль/л-мин.

/ Со

*.„„., =0-7-)—7- (11)

о

где I, - ток ЭВ Оз в присутствии АО в растворе, мкА, /„ - ток ЭВ 02 в отсутствии АО в растворе, мкА; С° - исходная концентрация кислорода в растворе, мкмоль/л, 7 - время реакции взаимодействия антиоксиданта с активными кислородными формами, мин.

Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии

индивидуальных антиоксидантов фенольной природы Для оценки влияния на процесс ЭВ 02 индивидуальных АО фенолыюй природы были рассмотрены зависимости предельного тока ЭВ 02 от времени активного действия и концентрации некоторых флавоноидов в объеме раствора. При добавлении исследуемых образцов наблюдалось уменьшение величины катодного тока и смещение потенциала волны ЭВ 02 в положительную область (рис. 2.).

По результатам полученных вольтамперограмм строились зависимости относительного уменьшения тока ЭВ Ог от времени протекания процесса в присутствии исследуемых флавоноидов (рис. 3).

Е. V

-0 4 -0 5

Рис. 2. Вольтамперограммы тока ЭВ СЬ на РПЭ в Рис. 3. Линейная часть зависимости

фосфатном буфере (рН 6.86) в отсутствие (1) и в относительного изменения предельного

присутствии 0.27-10"3 моль/л дигидрокверцетина тока ЭВ О2 от времени протекания

в зависимости от времени протекания процесса: процесса в присутствии 0.27-10° моль/л:

кверцетина (1), катехина в дигидрокверцетина (3), рутина (4)

(2),

?=10 мин (2), 20 мин (3), 30 мин (4), (5) остаточный ток фонового электролита отсутствии Ог и вещества в растворе. Скорость развертки потенциала 40 мВ/с

Антиоксидантная активность объектов определялась по относительному уменьшению тока ЭВ О2, используя кинетический критерий (11).

Используя методы планирования эксперимента, были построены двухфакторные поверхности отклика для рассматриваемых флавоноидов, из которых определены оптимальные интервалы концентраций и время активного действия (табл. 3).

Таблица 3.

Антиоксидантная активность образцов по отношению к процессу ЭВ 02 при

Флавоноид Си|, 106, моль/л Тф, мин к, мкмоль/(л-мин)

Рутин 0.82 + 0.04 40 0.12 + 0.09

Катехин 1.40 ±0.06 20 0.23 ±0.05

Кверцетин 1.55±0.04 45 0.27 ±0.03

Дигидрокверцетин 3.20 ±0.03 30 0.14±0.06

Аналогичным образом были рассмотрены антиоксидантные свойства некоторых впервые синтезированных производных кумаринов.

Таблица 4.

Антиоксидантная активность образцов по отношению к процессу ЭВ 02

(р=0.95, п=5)

№ X У я к, мкмоль/(л-мин) к, мл/г

1 с=о Р(0)(0Е1)2 н 0.113 ±0.002 0.201 ±0.005

2 Р(О)(ОЕ0 С(0)0Е1 н 0.099 ± 0.008 0.194 ±0.003

3 С=0 Р(0)(0Е1)(0Н) н 0.087 ± 0.007 0.135 ±0.006

4 С=0 Р(0)(0Е1)2 6-Вг 0.128 ±0.004 0.208 ± 0.002

5 С=0 Р(0)(0Е1)2 6-С1 0.169 ±0.006 0.264 ± 0.004

6 с=о Р(0)(0Е1)2 7-И(Е1)2 0.532 ± 0.005 0.363 ± 0.004

где X, У, II - заместители в структуре исследуемых кумаринов

Из таблицы 4 можно видеть корреляцию между значениями концентрационного и кинетического критериев, что говорит об активном влиянии на процесс ЭВ 02 обоих факторов времени и концентрации исследуемых производных кумаринов в растворе. Показано, что вновь синтезированные производные кумаринов обладают неплохой АОА по отношению к процессу ЭВ 02, не уступающей по своим показателям природным аналогам, извлечение которых из растительного сырья достаточно трудоемкий и долговременный процесс.

Исследованы антиоксидантные свойства ряда аскорбатов металлов. Большинство комплексов металлов и аскорбиновой кислоты проявили большую активность (табл.5), чем сама аскорбиновая кислота, считающаяся несомненным антиоксидантом и синергетиком в процессах прерывания цепных радикальных реакций.

Таблица 5.

Антиоксидантная активность образцов (с = 10"4 г/мл) по отношению к процессу

ЭВ 02 (р=0.95, и=5)

Название k, мкмоль/(л-мин) Название к, мкмоль/(л-мин)

Ase Mg 2.125 ±0.053 Ase Fe -

Ase Li 1.714 ±0.024 Аскорбиновая к-та 1.165 ±0.053

Ase Ca 1.550 ±0.042 Глюкоза 0.169 ±0.037

Ase Со 0.879 ± 0.027 Дигидрокверцетин 0.140 + 0.060

Рассмотрено влияние смеси компонентов на процесс ЭВ СЬ на примере смесей известных антиоксидантов и рассматриваемых аскорбатов. Установлено, что в смесях с Ase Mg и количеством компонентов не более 3-х наблюдается эффект синергизма. На основании полученных данных можно рекомендовать создание фармакологических препаратов на основе Ase Mg в смесях с небольшим количеством компонентов для более активного воздействия на организм.

Исследование суммарной антиоксидантной активности

растительного сырья

Для изучения антиоксидантных свойств растительного сырья было проведено исследование активности экстрактов некоторых растений из флоры западной и восточной Сибири. В частности была определена суммарная АОА экстрактов лабазника по относительному уменьшению тока ЭВ 02, используя выражение (11) (таблица 6).

Таблица 6.

Суммарная АОА экстрактов надземной части лабазника вязолистного и лабазника обыкновенного по отношению к процессу ЭВ СЬ (/7=0.95, п~5)

Образец Кинетический критерий антиоксидантной активности к, мкмоль/(л-мин)

Лабазник вязолистный Лабазник обыкновенный

Водный экстракт 0.607 ±0.036 0.325 ± 0.042

Экстракт на 40% этаноле 0.783 ± 0.043 0.365 ± 0.044

Экстракт на 70% этаноле 0.953 ± 0.045 0.429 ± 0.050

Экстракт на 95% этаноле 1.170 ±0.051 0.928 ±0.034

Установлено, что наибольшей активностью обладают экстракты на 70 % и 95 % этаноле, что свидетельствует о наиболее полном извлечении БАВ при экстрагировании более концентрированными водно-спиртовыми растворами.

Аналогичным образом была определена суммарная АОА экстрактов альфредии поникшей (таблица 7).

Таблица 7.

Суммарная антиоксидантная активность экстрактов надземной части А1/гесИа

Экстракт (выход, %) к, мкмоль/(л мин)

Водный экстракт (24.4) 0.28 ±0.06

Экстракт на 40% этаноле (24.6) 0.35 ± 0.03

Экстракт на 70% этаноле (24.5) 0.50 ± 0.05

Экстракт на 95% этаноле (14.7) 0.38 ±0.05

С целью изучения компонентного состава экстракта альфредии поникшей, полученного обработкой 70% этанолом, проводили его фракционирование рядом растворителей с увеличивающейся полярностью.

Для установления природы веществ, ответственных за проявление антиоксидантных свойств, изучали активность фракций экстракта альфредии поникшей (табл. 8.). Показано, что липофильные фракции экстракта в наибольшей степени проявляют антиоксидантные свойства. Наиболее выраженную активность показала этилацетатная фракция, содержащая более полный комплекс фенольных компонентов, что согласуется с результатами исследований других растений.

Таблица 8.

АОА фракций экстракта надземной части А1/гес1ш сегпиа, полученного обработкой 70% этанолом, по отношению к процессу ЭВ О? (р=0.95, п=5)

Фракция Выход, % Кинетический критерий АОА (к), мкмоль/(л-мин)

Хлороформная 5.2 0.57 ± 0.03

Этилацетатная 5.8 0.65 ± 0.04

Бутанольная 12 0.56 ± 0.06

Водный остаток 62 0.16 ±0.05

Аналогичным образом были рассмотрены АО свойства экстрактов и фракций на их основе черники обыкновенной.

Рассмотрев ряд растительных объектов, можно говорить, о возможности применения метода катодной вольтамперометрии для определения суммарной АОА растительного сырья, выявления и выделения наиболее перспективных источников БАВ. А также возможность выявления экстрагентов, наиболее полно извлекающих БАВ из растительного сырья, с целью их концентрирования и создания фармакологических препаратов на их основе.

Корреляция между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами исследуемых соединений фенольной природы Наличие корреляционной связи между АОА и электрохимическими параметрами веществ было оценено на примере ряда флавоноидов (катехин, рутин, кверцетин и дигидрокверцетин). АОА исследуемых флавоноидов определялась, используя метод катодной вольтамперометрии (процесс ЭВ От).

Электрохимические свойства флавоноидов были изучены с помощью метода циклической вольтамперометрии. Исследование проводилось в условиях дифференциального режима постоянно-токовой вольтамперометрии на СУЭ. В таблице 9 приведены значения потенциалов окисления и восстановления веществ.

Таблица 9.

Потенциалы пиков окисления - восстановления исследуемых флавоноидов и значение кинетического критерия их АОА по отношению к

Флавоноид Еа,В ЕК,В к, мкмоль/(л-мин)

Рутин 0.48 ±0.02 0.31 ±0.03 0.12± 0.09

Дигидрокверцетин 0.44 ±0.04 0.24 ±0.02 0.14±0.06

Катехин 0.41 ±0.04 0.20±0.03 0.23 ±0.05

Кверцетин 0.37 ±0.03 0.14±0.02 0.27 ±0.03

На рис. 4. представлена корреляционная зависимость между потенциалами окисления исследованных флавоноидов и значениями их АОА.

К, тктоШ"пмп 0 24(—

Уравнение корреляционной зависимости:

#=0.82- 1.48 Еа

Данное уравнение позволяет

прогнозировать значения

потенциалов окисления

флавоноидов по известным

в данным их АОА и

„ , „ " 04 044 наоборот.

Рис. 4. Корреляционная зависимость между потенциалами '

окисления флавоноидов и значениями АОА,

рассчитанными по кинетическому критерию (г = 0.96)

Аналогичным образом рассмотрена корреляционная зависимость между электрохимическими параметрами (потенциалами окисления - восстановления) и антиоксидантными свойствами синтезированных производных кумаринов.

Наличие корреляционной зависимости рассматривалось также на примере жирорастворимых витаминов А и Е (табл. 10).

Таблица 10.

Значения кинетического критерия АОА (р=0.95, п= 5)

Название витамина к, мкмоль-л"'мин~1 Еа,В

С=0.599 мг/мл С= 1.195 мг/мл

Витамин А 10.01 ±0.07 12.91 ±0.03 +1.1 ±0.05

Витамин Е 9.26 ± 0.04 11.29 ±0.08 + 1.8 ±0.04

Наблюдался аналогичный эффект как и в случае с водорастворимыми АО.

Рассмотрев несколько групп сходных по структуре соединений, можно с уверенностью говорить, что наблюдается корреляционная зависимость между потенциалами окисления веществ и их АОА по отношению к процессу ЭВ 02. Чем легче окисляется вещество, т.е. чем меньше его потенциал окисления, тем больше его АОА по отношению к процессу ЭВ 02.

Метрологические аспекты методики определения суммарного количества антиоксидантов в объектах

На данный момент существует ряд методик определения как АОА так и суммарного количества антиоксидантов в различных объектах. Однако ни один из существующих методов не аттестован. Этот факт связан с множеством проблем:

• нет стандартных образцов антиоксидантов;

• методы основаны на различных принципах и модельных реакциях, поэтому результаты измерений, полученные разными методами, имеют разную размерность и практически несопоставимы друг с другом;

• нет единой размерности и нормированного показателя АОА.

Для выхода из сложившейся ситуации было предложено оценивать суммарное количество антиоксидантов в БАД по отношению к процессу ЭВ 02 в пересчете на концентрацию аскорбиновой кислоты.

Для определения суммарного количества антиоксидантов в исследуемом объекте строится градуировочная зависимость относительного изменения тока ЭВ 02 от концентрации аскорбиновой кислоты в растворе. Далее из данной зависимости по величине относительного изменения тока ЭВ 02 в присутствии исследуемого объекта определяется суммарное количество антиоксидантов в пересчете на концентрацию аскорбиновой кислоты (рис. 5).

Используя данный прием, были решены отмеченные выше проблемы, возникающие при аттестации методики определения АОА различных объектов.

Разработку методики проводили на примере ряда соков с содержанием аскорбиновой кислоты не менее 0.2 мг/мл.

По результатам зарегистрированных вольтамперограмм тока ЭВ О? в присутствии аскорбиновой кислоты строился градуировочный график.

На основании полученных данных выведено уравнение регрессии зависимости относительного

изменения тока ЭВ 02 от концентрации аскорбиновой кислоты в растворе фонового электролита в диапазоне концентраций С = 0-1 мг/мл:

10/1 = 0.910+ 0.427С

Проведена проверка гипотезы линейности данного градуировочного графика. Оценена адекватность математической модели по критерию

Рис. 5. Зависимость относительного

изменения тока ЭВ СЬ от концентрации аскорбиновой кислоты на РПЭ в фоновом фишера. В представленном диапазоне

концентраций модель адекватна.

фосфатном буфере

электролите 0.025 М (рН = 6.86)

Для подготовки методики к метрологической аттестации были определены метрологические характеристики методики, представленные в таблице 11.

Таблица 11.

Метрологические характеристики методики определения суммарного количества антиоксидантов по отношению к процессу ЭВ 02 в пересчете на

: 0.95, п=3, /=10

Измеряемая концентрация, С, (мг/мл) 0.1 0.5 0.999

Показатель повторяемости •Яш, (мг/мл) 0.00446 0.04756 0.07186

Показатель внутрилабораторной прецизионности, 8Кт, (мг/мл) 0.011889 0.05495 0.08525

Показатель точности, А 0.02325 0.10779 0.16697

е, % 22.9% 21.5% 16.7%

По полученным метрологическим показателям для рассматриваемых поддиапазонов концентрации аскорбиновой кислоты принято решение приписать наибольшую погрешность (23%) для всей области концентраций линейного участка градуировочной характеристики.

В соответствии с регламентированной процедурой аттестации МВИ определения суммарного количества антиоксидантов в объектах в пересчете на аскорбиновую кислоту, отработаны оптимальные условия получения аналитического сигнала предельного тока ЭВ 02 в присутствии АО, используя метод вольтамперометрии; проверена гипотеза линейности градуировочной характеристики и оценена адекватность полученной математической модели. Рассчитаны основные метрологические характеристики анализа (показатель повторяемости, точности, внутрилабораторной прецезионности). Проведена оценка правильности методики определения суммарного количества антиоксидантов в пересчете на аскорбиновую кислоту методом «введено-

найдено» по критерию Стьюдента. Все процедуры расчетов проводились в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ.

Спектрофотометрический и вольтамперометрический методы определения АОА. Сравнительные определения На сегодняшний день спектр методов определения суммарной антиоксидантной активности веществ очень разнообразен. Однако зачастую сравнивать данные, полученные разными методами, не представляется возможным, поскольку методы основаны на различных принципах измерения, модельных системах, имеют разную размерность показателя АОА. Таким образом, сравнивать численные значения нецелесообразно, но можно провести корреляцию между результатами, полученными разными методами.

В качестве метода сравнения был выбран спектрофотометрический метод с неферментативной системой генерации кислородных радикалов. Сравнение результатов определения АОА разными методами было проведено на примере определения АОА ряда флавоноидов с использованием критерия Ю50, показывающего концентрацию антиоксиданта при ингибировании модельного сигнала на 50%.

Таблица 12.

Значения критерия 1С50, определенные спектрофотометрическим и вольтамперометрическим методами, для ряда флавоноидов (р=0.95, п=5)

Название вещества Спектрофотометрический метод, 1С*50 • Ю2 (М) Вольтамперометрический метод, 1С50 ■ Ю2 (М)

Рутин 0.13 ±0.02 0.82±0.04

Дигидрокверцетин 0.53 ±0.04 1.03 ±0.05

Бензойная кислота 0.55+0.03 4.1910.05

Аскорбиновая к-та 0.72 + 0.03 4.8710.03

Кверцетин 1.1710.02 5.8910.03

Катехин 3.92±0.04 8.2210.04

Из представленных данных видно, что численного совпадения результатов определения нет, что и было ожидаемо, поскольку модельные реакции методов различны. Однако можно говорить о корреляции результатов полученных СФ-им и вольтамперометрическим методами, что является косвенным доказательством правильности представленной в данной работе вольтамперометрической методики определения АОА различных объектов. Оба метода были поставлены в одной лаборатории на одних и тех же образцах.

Утверждение типа волътамперометрического анализатора по определению АОА билогически активных веществ Разработанная вольтамперометрическая методика определения суммарной антиоксидантной активности БАВ или суммарного количества антиоксидантов нашла широкое применение в исследовании антиоксидантных свойств различных веществ, продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. На основе данной методики совместно с ООО НПП «Томьаналит» был разработан вольтамперометрический анализатор

«Антиоксидант» для определения суммарной АОА и суммарного количества антиоксидантов в различных объектах.

Прибор прошел государственные испытания с целью утверждения типа СИ, по результатам которых ему присвоен тип СИ - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Разработанный анализатор может использоваться как в аккредитованных аналитических лабораториях по контролю качества, так и в научно-исследовательских лабораториях для оценки суммарного содержания антиоксидантов или суммарной антиоксидантной активности различных объектов.

ВЫВОДЫ

1. Рассмотрены закономерности процесса ЭВ 02 в условиях как стационарной, так и нестационарной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами по механизму ЕС. Определены некоторые кинетические параметры процесса.

2. Определены оптимальные концентрации и время активного действия флавоноидов, построены математические модели процесса в области оптимума функции, используя методы планирования эксперимента.

3. Исследована антиоксидантная активность по отношению к процессу ЭВ 02 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима С>ю, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Со, Бе, Са, и, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей).

4. Рассмотрено влияние смеси компонентов на основе аскорбатов металлов на процесс ЭВ 02 и определена суммарная антиоксидантная активность смесей по отношению к данному процессу. Проведена оценка взаимного влияния компонентов в смеси. Показано, что с увеличением числа компонентов в смеси ее суммарная активность уменьшается.

5. Исследованы электрохимические свойства ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима (Зю, найдены потенциалы окисления -восстановления данных веществ. Определены оптимальные условия получения аналитического сигнала данных веществ методом циклической вольтамперометрии.

6. Выявлены корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами (потенциалами окисления - восстановления веществ) и антиоксидантными свойствами на примере ряда флавоноидов и производных кумаринов.

7. Разработана методика определения суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности. Проведены сравнительные испытания АОА некоторых БАВ, используя различные методы определения. Оценены метрологические характеристики методики.

8. Разработан новый анализатор «Антиоксидант». Проведены государственные испытания с целью утверждения типа СИ, по результатам

которых присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.А № 28715) и внесен в Единый государственный реестр СИ под номером 35466-07.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1.Korotkova E.I., Lukina A.N. (Vtorushina), Karbainov Y.A. Voltammetric sensor for antioxidant activity determination // Book of abstr. European conference on analytical chemistry "Euroanalysis XIIl". Salamanca. 2004. P.32.

2. Короткова Е.И., Лукина A.H. (Вторушина), Гончаров Л.А., Мисин В.М. Вольтамперометрический способ определения суммарной антиоксидантной активности объектов // Материалы научно-практического семинара «Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения». Москва. 2004. С.182-194.

3. Короткова Е.И., Карбаинов Ю.А., Лукина А.Н. Исследование антиоксидантных свойств биологически активных веществ методом вольтамперометрии // Тез. докл. III Всерос. научн. конф. «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий». Томск. 2004. С.203.

4. Короткова Е.И., Лукина А.Н. Исследование электрохимических свойств дигидрокверцетина методом вольтамперометрии // Тез. докл. Всерос. науч. конф. с международным участием «Электроаналитика». Екатеринбург. 2005. С. 102, 252.

5. Lukina A.N., Avramchik О.А., Korotkova E.I., Karbainov Y.A. Investigation of electrochemical and antioxidant properties of some flavonoids by voltammetry // Book of abstr. Int. Conf. «Instrumental Methods of Analysis Modern Trends and Applications». Iraklion. 2005. P.496.

6. Короткова Е.И., Лукина A.H., Гончаров Л.А., Мисин В.М. Анализатор для определения суммарной антиоксидантной активности объектов // Материалы 8-го Междунар. семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2005». Пущино. 2005. С. 163-168.

7. Lukina A.N., Avramchik О.А., Korotkova E.I., Karbainov Y.A. Study of antioxidant properties derivatives of coumarin by voltammetry // Abstr. Int. Conf. International Congress on Analytical Sciences. Moscow. 2006. P.255.

8. А.Н. Лукина, Е.И. Короткова, Ю.А. Карбаинов Исследование антиоксидантных свойств некоторых аскорбатов и смесей на их основе // Материалы Международной научн. конф. «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий». Томск, 2006. С.91-93.

9. О. Lipskikh, A. Lukina, Е. Korotkova Investigation of antioxidant properties of some flavonoids by voltammetric and spectrophotometric methods // Book of abstracts V International Conference on Instrumental Methods of Analysis Modern Trends and Applications. Greece. 2007. P. 135.

10. Lukina A.N., Avramchik O.A., Korotkova E.I. A new analyzer for antioxidant activity determination of biological-active substances // Book of abstr. 4lh Black sea basin conference on analytical chemistry. Sunny Beach. 2007. P.65.

11. Короткова Е.И., Аврамчик O.A., Лукина А.Н., Витюк О.Ю. Анализатор по определению суммарной антиоксидантной активности биологически активных добавок // Материалы II Всерос. конф. по аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2007». Краснодар. 2007. С.439.

12. Короткова Е.И, Вторушина А.Н., Липских О.И. Исследование антиоксидантных свойств некоторых флавоноидов методом вольтамперометрии // Материалы VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008». Уфа. 2008. С.24.

13. Короткова Е.И., Аврамчик O.A., Каморзина И.Г., Карбаинов Ю.А., Лукина А.Н. Новый вольтамперометрический метод определения антиоксидантной активности косметической продукции // Заводская лаборатория. 2004. Т.70. №8. С. 13-17.

14. Avramchik O.A., Korotkova E.I., Plotnikov E.V., Lukina A.N., Karbainov Y.A. Investigation of antioxidant properties of some complex compounds of lithium// J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V.37. P.l 149-1154.

15.1. Schepetkin, A. Potapov, A. Khlebnikov, A. Lukina Decomposition of reactive oxygen species by copper(II) bis(l-pyrazolyl)methane complexes // J. Biol. Inorg. Chem. 2006. V.U. P.499-513.

16. Шилова И.В., Краснов Е.А., Короткова Е.И., Нагаев М.Г., Лукина А.Н. Антиоксидантная активность экстрактов надземной части лабазника вязолистного // Химико-фармацевтический журнал. 2006. Т.40. №12. С.22-24.

17. Короткова Е.И., Лукина А.Н., Драчсва Л.В. Исследование антиоксидантной активности биокомпозиций на основе пробиотиков // Пищевая промышленность. № 3. 2007. С.14-15.

18. Шилова И.В., Вторушина А.Н., Короткова Е.И. Черника обыкновенная - источник биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами // Сборник статей «Здоровое питание - основа жизнедеятельности человека». 2008. С.250-254.

19. Шилова И.В., Кувачева Н.В., Короткова Е.И., Краснов Е.А., Лукина А. Н. и др. Антиоксидантные свойства биологически активных веществ Alfredia Cernua и Alfredia Nivea // Растительные ресурсы. 2008. №1. С. 114-121.

Автор считает своим долгом выразить искреннюю признательность научному консультанту - к.х.н., доценту Коротковой Елене Ивановне за помощь при подготовке и написании диссертационной работы; а также к.ф.н., ст. преподавателю кафедры фармацевтической химии СибГМУ Шиловой Инессе Владимировне; сотруднику НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАН Плотникову Владимиру Михайловичу; Розите Николовой и Невене Петковой (Sofia, Bulgaria) за проявленный интерес к работе и плодотворное сотрудничество.

Подписано к печати 08.10.2008. Формат 60x84/16. Бумага «Снегурочка». Печать RISO. Усл. печ. л. 1,28. Уч.-изд. л. 1,16.

_Заказ 965. Тираж 120 экз._

Томский политехнический университет Система менеджмента качества Томского политехнического университета сертифицирована NATIONAL QUALITY ASSURANCE по стандарту ISO 9001:2000

ИЗШЕАЬСТВОУТПУ. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30.

ISO 9001

Условные обозначения и сокращения.

Введение.

Глава I. литературный обзор.

1.1. Основные свойства, классификация и распространение соединений фенольной природы.

1.2. АО' защитная система организма. Биологическая активность соединений фенольного типа.

1.2.1. Антиоксидантная защитная система организма.

1.2.2. Антиоксидантная активность соединений фенольной природы

1.2.3. Антиоксидантная и биологическая активность витамина Е.

1.2.4. Биологическая роль коэнзима.

1.2.5. Антиоксидантные свойства флавоноидов.

1.2.6. Антиоксидантные свойства каротиноидов.

1.2.7. Антиоксидантая активность витамина С.

1.3. Методы исследования АО свойств фенольных соединений.

1.3.1. Хемилюминесцентный метод в определении антиоксидантов и их активности.

1.3.2. Кинетические методы исследования антиоксидантных свойств различных объектов.

1.3.3. Физико-химические методы исследования антиоксидантной активности объектов.

1.3.4. Электрохимические методы исследования свойств антиоксидантов.

1.4. Электрохимические методы в определении некоторых -фенольных соединений.

1.4.1. Электрохимические методы в анализе токоферолов.

1.4.2. Методы электрохимии в определении флавоноидов.

1.5. Метрологическая оценка результатов анализа.

Глава II. Теоретическая часть.

Физико-химические закономерности процесса ЭВ Ог в присутствии антиоксидантов: Механизм ЕС в условиях линейной полубесконечной диффузии с последующей химической реакцией псевдопервого порядка на примере процесса ЭВ О2 в присутствии антиоксидантов.

2.1. Процесс ЭВ 02, осложненный наличием последующей химической реакции в условиях стационарной диффузии.

2.2. Процесс ЭВ О2, осложненный наличием последующей химической реакции взаимодействия с АО в условиях нестационарной диффузии.

глава III.Аппаратура и методика эксперимента.

3.1. Приборы, ячейки, электроды, растворы и реактивы.

3.3. Методика эксперимента.

3.3.1. Исследование электрохимических свойств веществ.

3.3.2. Методика определение антиоксидантной активности образцов

глава Iv. Исследование Физико-химических свойств некоторых АО фенольной природы.

4.1. Применение методов планирования эксперимента в оценке оптимальных условий анализа АО фенольной природы.

4.2. Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии индивидуальных антиоксидантов фенольной природы.

4.2.1. Исследование антиоксидантных свойств некоторых флавоноидов по отношению к процессу ЭВ О2.

4.2.2. Антиоксидантные свойства производных кумаринов.

4.2.3. Влияние аскорбатов металлов на процесс ЭВ О2.

4.2.4. Исследование суммарной антиоксидантной активности растительного сырья.

4.2.5. Исследование антиоксидантной активности некоторых фенол-производных веществ в апротонных средах.

4.3. Электрохимические свойства исследуемых фенольных соединений

4.3.1. Электрохимические свойства флавоноидов.

4.3.2. Электрохимические свойства производных кумаринов.

4.3.3. Электрохимические свойства коэнзима Q10.

4.4. Корреляция между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами исследуемых соединений фенольной природы.

глава v. Метрологические аспекты методики определения суммарного количества антиоксидантов в объектах.

5.1. Разработка и подготовка В А методики определения суммарного количества антиоксидантов в БАД к аттестации.

5.2. Спектрофотометрический и вольтамперометрический методы определения АОА. Сравнительные определения.

5.3. Утверждение типа вольтамперометрического анализатора по определению АОА билогически активных веществ.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Актуальность темы. Использование антиоксидантов, веществ, прерывающих радикально-цепные процессы окисления в объектах органического и неорганического происхождения, получило широкое распространение в последнее время в различных областях химии, биологии и медицины. На основе индивидуальных антиоксидантов и БАВ создаются новые фармацевтические препараты и БАД, предназначенные для лечения и профилактики ряда заболеваний, нормализации обмена веществ.

Лавинообразный рост вновь синтезированных БАД, появляющихся на рынке и не всегда качественных, предъявляет все более серьезные требования к исследованию их свойств. В настоящее время не существует единой меры антиоксидантной активности подобных препаратов, нет единой регламентированной процедуры оценки антиоксидантной активности БАД, а результаты, полученные методами с различными модельными системами, зачастую не совпадают. Для проверки качества при сертификации БАД используются длительные, трудоемкие исследования, опирающиеся иногда на негостированные методики. Необходимость введения новых показателей, методик и приборов, обеспечивающих надежные результаты по исследованию свойств и активности подобных препаратов, становится актуальной задачей, от решения которой зависит эффективность и безопасность предлагаемых на рынке БАД, продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности.

Антиоксиданты являются в настоящее время объектом весьма интенсивного применения и изучения. Об этом свидетельствует большое количество публикаций в научной отечественной и зарубежной периодической литературе. Однако, в систематизированном виде информация о свойствах антиоксидантов представлена очень ограниченно. Практически полностью отсутствуют сведения об электрохимических свойствах антиоксидантов природного и растительного происхождения, их влиянии.на многостадийные электродные процессы и электровосстановление кислорода в частности.

В- данной работе в качестве метода исследования предлагается, использовать простой в: аппаратурном оформлении, экспрессный и; высокочувствительный метод вольтамперометрии, имеющий большие-потенциальные возможности в областй электроаналитической химии, исследования^ свойств БАВ, разработки методов аналитического контроля сложных объектов., Использование в качестве модельной реакции процесса электровосстановления кислорода, идущего по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в клетках организма человека и животного, тканях растений, и являющегося основным окислительным процессом во всех объектах искусственного'и природного происхождения, делает данный метод еще более привлекательным.

Цель работы: Разработка методики определения суммарного количества^ антиоксидантов в БАД, продукции, пищевой, косметической, фармацевтической промышленности на основе процесса электровосстановлениякислорода.

Задачи:

1. Рассмотреть закономерности, процесса ЭВ О2 в условиях линейной полубесконечной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций, взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами.:

2. Определить оптимальные концентрации^ и. время активного действия антиоксидантов на примере флавоноидов, построить математические модели процесса в области оптимума функции.

3. Исследовать антиоксидантную активность по- отношению к процессу ЭВ О2 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qio, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Qo, Fe, Са,- Li и их смесей, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей) для определения оптимальных условий их применения.

4. Исследовать электрохимические свойства ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Qi0, определить оптимальные условия получения аналитического сигнала для определения данных веществ методом циклической вольтамперометрии.

5. Выявить корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами и антиоксидантными свойствами исследуемых соединений фенольной природы.

6. Разработать методику выполнения измерений суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, фармацевтической промышленности. Провести сравнительные испытания антиоксидантной активности индивидуальных препаратов, используя различные методы определения. Провести оценку метрологических характеристик методики.

Научная новизна. Впервые рассмотрены закономерности процесса ЭВ О2 в присутствии антиоксидантов в условиях как стационарной, так и нестационарной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами по механизму ЕС. Численным методом конечных разностей решена граничная задача для данного процесса. Определены некоторые кинетические параметры процесса.

Впервые проведено определение антиоксидантной активности по отношению к процессу ЭВ О2 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Q]0, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, л

Fe, Са, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей) методом катодной вольтамперометрии.

Получены математические модели первого и второго порядков для определения активности антиоксидантов в зависимости от концентрации и времени их активного действия, используя методы планирования эксперимента.

Выявлены корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами и антиоксидантными свойствами на примере ряда флавоноидов, производных кумаринов и жирорастворимых витаминов А и Е.

Практическая значимость. Разработана новая методика определения суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности с помощью метода катодной вольтамперометрии и процесса ЭВ Ог, отличающаяся чувствительностью, простотой в исполнении, экспрессностью, универсальностью.

На основе методики разработан новый анализатор «АОА». Прибор прошел государственные испытания с целью утверждения типа СИ, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством,по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.А № 28715) и внесен в единый Гос. реестр СИ под номером 35466-07.

Определены потенциалы окисления — восстановления ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Qio методом циклической вольтамперометрии, которые могут быть использованы в качестве аналитического сигнала для определения данных веществ.

Проведена оценка антиоксидантной активности по отношению к процессу ЭВ О2 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qio, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Са, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей). Полученные результаты позволили выявить наиболее активные антиоксиданты, их композиции, способ фракционирования экстрактов растений и дать рекомендации для их дальнейшего использования в фитотерапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты определения антиоксидантной активности по отношению к процессу ЭВ Ог ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qi0, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Са, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей).

2. Результаты определения электроаналитических свойств ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Qio, которые могут быть использованы в качестве аналитического сигнала для определения данных веществ в БАД.

3. Новые методика и анализатор определения суммарного количество антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, природных объектах.

4. Результаты сравнительных определений антиоксидантной активности некоторых БАВ, используя метод вольтамперометрии и независимые аналитические методы анализа.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены устными и стендовыми докладами на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), European conference on analytical chemistry «Euroanalysis XIII» (Salamanca, Испания, 2004), III Всероссийской научной конференции «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика» (Екатеринбург, 2005), International Conference «Instrumental Methods of Analysis Modern Trends and Applications» (Iraklion, Греция, 2005), International Conference «International Congress on Analytical Sciences» (Moscow, 2006), The 13-th World Congress «Food in life» (Nantes, Франция, 2006), II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2007» th

Краснодар, 2007), 4 Black sea basin conference on analytical chemistry (Sunny Beach, Болгария, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008» (Уфа, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 12 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 200 страницах, содержит 34 таблицы, 40 рисунков и библиографию из 191 наименования. Работа состоит из введения, пяти глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения.

ВЫВОДЫ

1. Рассмотрены закономерности процесса ЭВ 02 в условиях как стационарной, так и нестационарной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами по механизму ЕС. Определены некоторые кинетические параметры процесса.

2. Определены оптимальные концентрации и время активного действия флавоноидов, построены математические модели процесса в области оптимума функции, используя методы планирования эксперимента.

3. Исследована антиоксидантная активность по отношению к процессу ЭВ 02 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qi0, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Са, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей).

4. Рассмотрено влияние смеси компонентов на основе аскорбатов металлов на процесс ЭВ 02 и определена суммарная антиоксидантная активность смесей по отношению к данному процессу. Проведена оценка взаимного влияния компонентов в смеси. Показано, что с увеличением числа компонентов в смеси ее суммарная активность уменьшается.

5. Исследованы электрохимические свойства ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Qio, найдены потенциалы окисления -восстановления данных веществ. Определены оптимальные условия получения аналитического сигнала данных веществ методом циклической вольтамперометрии.

6. Выявлены корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами (потенциалами окисления -восстановления веществ) и антиоксидантными свойствами (кинетический критерий АОА) на примере ряда флавоноидов и производных кумаринов.

7. Разработана методика определения суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности. Проведены сравнительные испытания антиоксидантной активности некоторых БАВ, используя различные методы определения. Оценены метрологические характеристики методики.

8. Разработан новый анализатор «Антиоксидант». Проведены государственные испытания с целью утверждения типа средств измерений (СИ), по результатам которых ему присвоен тип средства измерения -«Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.A № 28715) и внесен в единый Гос. реестр СИ под номером 35466-07.

177

1. Общая органическая химия: справочник: пер. с англ.: в 12т./ под ред. Д. Бартона и У. Д. Оллиса. - М.: Химия, 1981-1988.Т. 2: Кислородосодержащие соединения / под ред. Н. К. Кочеткова и А. И. Усова; пер. С. В. Яроцкого. - 1982. - 855 с.

2. Меньшикова Е.Б., Панкин В.З., Зенков Н.К., И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В. А. Труфакин Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. -М.: Фирма «Слово», 2006. — 556 с.

3. Рогинский В. А. Фенольные антиоксиданты. Реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988. - 247 с.

4. Эммануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. Торможение процессов окисления жиров. М.: Пищепромиздат, 1961. - 359 с.

5. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функция в растениях. М.: Наука, 1993. - 272 с.

6. Chung H.S., Chang L.C., Lee S.K. et al. Flavonoid constituents of Chorizanthe diffusa with potential cancer chemopreventive activity // J Agric. Food Chem. 1999.-Vol. 47.-36-41.

7. Бурлакова Е.Б., Алексеенко Е.Б., Молочкина E.M. и др. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М.: Наука, 1975.-211 с.

8. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252с.

9. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Д.: Наука, 1985

10. Балакова Р., Соколова Ц., Рибаров С., Каган В. Эффективность действия а -токоферола и его гомологов на люминолзависимую хемилюминесценцию // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1991. -№5.-с. 482-485.

11. Бурлакова Е.Б., Губарева А.Е., Архипова Г.В., Рогинский В.А. Модуляция перекисного окисления липидов биогенными аминами в модельных системах // Вопр. мед. химии. 1992. — №2. - с. 17-20.

12. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты // Успехи химии. — 1985. -Т.54. с. 15401558

13. Beyer R.E. The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation // Free Radic. Biol. Med. 1990. - Vol.8. - p. 545-565

14. Афанасьев Ю.И., Боронихина T.B. Витамин Е: значение и роль в организме // Успехи соврем, биологии. 1987 - Т. 104, вып. 3. - с. 400-411

15. Burton G.W., Traber M.G. Vitamin E antioxidant activity, boikinetics and bioavailability // Rev. Nutr. - 1990. - Vol. 10. - P. 357-382

16. Beyer R.E. The analysis of the role of coenzyme Q in free radical generation and as an antioxidant // Biochem. Cell Biol. 1992.- Vol.70 - P.390-403

17. Yamamoto K., Niki E. Interaction of a -tocopherol with iron: antioxidant and prooxidant effects of a -tocopherol in the oxidation of lipids in aqueous dispersion in the presence of iron // Biochim. Biophys. Acta.- 1988-Vol.958.-P. 19-23

18. Yoshida Y., Tsuchiya J., Niki E. Interaction of a -tocopherol with copper and its effect on lipid peroxidation // Biochim. Biophys. Acta- 1994 — Vol.200.-P. 85-92

19. Mariorino M., Zamburlini A., Roveri A.,Ursini F. Prooxidant role of vitamin E in copper induced lipid peroxidation // FEBS Lett. 1993- Vol. 330 - P. 174-176

20. Wood Z.A., Schroder E., Robin H.J., Poole L.B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins // Trends Boichem. Sci 2003 .-Vol.28.- P. 32-40

21. Tappel A.L. The inhibition of hematin-catalyzed oxidations by a-tocopherol // Arch. Biochem.- 1954.-Vol.50-P.473-485

22. Azzi A., Stacker A. Vitamin E: non-antioxidant roles // Progr. Lipid Res. 2000.- Vol.39. - P.231-255

23. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов — Черноголовка, 1992 56с.

24. Чудинова В.В., Алексеев С.М., Захарова Е.И, Евстигнеева Р.П. Перекисное окисление липидов и механизм антиоксидантного действия витамина Е // Биоорг. химия.- 1994.-№10 С.1029-1046

25. Betancor-Fernandez A., SiesH.,Stahl W., Polidori М.С. In vitro antioxidant activity of 2,5,7,8-tetramethyl-2-(2 -carboxyethyl)-6-hydroxychroman (alpha-CEFIC), a vitamin E metabolite // Free Radic. Res.- 2002.- Vol.36.- P.915-921.

26. Festenstein G.N., Heaton F.W., Lowe J.S., Morton R.A. A constituent of the unsaponifiable portion of animal tissue lipids // Biochem. J — 1955 Vol.59.-P. 558-566.

27. Негреску E.B., Лебедев A.B., Балденков Г.Н. и др. Антиоксиданты, перекисное окисление липидов и рецепторзависимое увеличение концентрации Сав тромбоцитах человека // Вопр. мед. химии — 1992 — №1— С.36-39.

28. Pobezhimova Т.Р., Voinikov V.K. Biochemical and physiological aspects of ubiquinone function // Membr.Cell Biol.- 2000,- Vol. 13 P. 595-602

29. Schopfer F., Riobo N., Carreras M.C. et al. Oxidation of ubiquinol by peroxynitrite: implications for protection of mitochondria against nitrosative damage // Biochem. J.- 2000.- Vol.349.- P.35-42

30. Guo Q., Packer L. ESR studies of ascorbic acid-dependent recycling of the vitamin E homologue Trolox by coenzyme Q0 in murine skin homogenates // Redox Rep.- 1999.- Vol. 4.- P. 105-111

31. Kagan V., Serbinova E., Packer L. Antioxidant effects of ubiquinones in microsomes and mitochondria are mediated by tocopherol recycling // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1990.-Vol. 169.-P. 851-857.

32. Tomasetti M., Littarru G.P., Stocker R., Alleva R. Coenzyme Q.0 enrichment decreases oxidative DNA damage in human lymphocytes // Free Radic. Biol. Med.- 1999.-Vol. 27.-P. 1027-1032.

33. Kaikkonen J., Tuomainen T.-P., Nyyssonen K., Salonen J.T. Coenzyme Qio: Absorption, antioxidative properties, determinants, and plasma levels // Free Radic. Res.-2002.-Vol. 36.-P. 389-397.

34. Stocker R., Bowry V.W., Frei B. Ubiquinol-10 protects human low density lipoprotein more efficiently against lipid peroxidation than does alpa-tocopherol//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.-Vol. 88.-P. 1646-1650.

35. Tribble D.L., van den Berg J.J.M., Motchnik P.A. et al. Oxidative susceptibility of low density lipoprotein subtractions is related to their ubiquinol-10 and a -tocopherol content // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.- Vol. 91- P. 11831187.

36. Lonnrot K., Metsa-Ketela Т., Molnar G. et al. The effect of ascorbate and ubiquinone supplementation on plasma and CSF total antioxidant capacity // Free Radic. Biol. Med.- 1996.-Vol. 21.-P.211-217.

37. Aejmelaeus R., Metsa-Ketela Т., Laippala P. et al. Ubiquinol-10 and total peroxyl radical trapping capacity of LDL lipoproteins during ageing the effects of QIO supplementation // Mol. Asp. Med.-1997.- Vol. 18.-P. 113-120.

38. Markham K.R., McGhie Т.К. The effect of pKa onthe electrophoretic mobility of mono- and dihydroxyflavones // Polyphenols Com 1996 - Vol. 96 - P. 13-14.

39. Mehta A.C., Seshadri T.R. Flavonoids as antioxidants / J. Sci. Ind. Res— 1958.-Vol. 18b.-P. 24-28.

40. Bors W., Michel C. Antioxidant capacity of flavanols and gallate esters: Pulse radiolysis studies // Free Radic. Biol. Med.- 1999.- Vol. 27.- P. 1413-1426.

41. Bors W., Heller W., Michel C., Saran M. Flavonoids as antioxidants: determination of radicalscavenging efficiencies // Methods Enzymol.- 1990 Vol. 186.-P. 343-355.

42. Costantino L., Rastelli G., Albasini A. Inhibitory activity of flavonols towards the xanthine oxidase enzyme // Int. J. Pharmaceutics — 1992 Vol. 86.- P. 17-23.

43. Chang W.S., Lee Y.J., Chiang H.C. Inhibitory effects of flavonoids on xanthine oxidase//Anticancer Res 1993- Vol. 13-P. 2165-2170.

44. Cos P., Ying L., Calomme M. et al. Structure-activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers // J. Nat. Prod 1998.- Vol. 61.- P. 71-76.

45. Cotelle N., Bernier J.L., Catteau J.P. et al. Antioxidant properties of hydroxyl-flavones // Free Radic. Biol. Med 1996.- Vol. 20.- P. 35-43.

46. Magnani L., Gaydou E.M., Hubaud J.C. Spectrophotometric measurement of antioxidant properties of flavones and flavonols against superoxide anion // Anal. Chim. Acta.- 2000.-Vol. 411.-P. 209-216.

47. Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M. Structure-activity relationships for antioxidant activity of a series of flavonoids in a liposomal system // Free Radic. Biol. Med.- 1998.-Vol. 24.-P. 1355-1363.

48. Kim D.O., Lee C.Y. Comprehensive study on vitamin С equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of various polyphenolics in scavenging a free radical and its structural relationship // Crit. Rev. Food Sci. Nutr- 2004 Vol. 44 - P. 253273.

49. Lien E.J., Ren S., Bui H.H., Wang R. Quantitative structure-activity relationship analysis of phenolic antioxidants // Free Radic. Biol. Med 1999 - Vol. 26.-P. 285-294.

50. Cao G., Sofic E., Prior R.L. Antioxidant and proantioxidant behavior of flavonoids: structure-activity relationships // Free Radic. Biol. Med.- 1997 Vol. 22.-P. 749-760.

51. Decker E.A. Phenolics: prooxidants or antioxidants? // Nutr. Rev-1997-Vol. 55-P. 396-407.

52. Olson J.A. Carotenoids and vitamin A An overview // Lipid-Soluble Antioxidants: Biochemistry and Clinical Applications — Basel: Birkhauser Verlag, 1992,-P. 178-192.

53. Palozza P., Krinsky N.I. Antioxidant effects of carotenoids in vivo and in vitro an overview // Methods Enzymol - 1992 - Vol. 213 - P. 403-420.

54. Kikugawa К., Hiramoto К., Tomiyama S., Asano Y. /3 -Carotene effectively scavenges toxic nitrogen oxides: nitrogen dioxide and peroxynitrous acid //FEBS Lett.- 1997.-Vol. 404.-P. 175-178.

55. Gutteridge J.M.C., Quinlan G.J. Antioxidant protection against organic and inorganic oxygen radicals by normal human plasma: The important primary role for iron-binding and iron-oxidising proteins // Biochim. Biophys. Acta 1992 - Vol. 1159.-P. 248-254.

56. Rousseau E.J., Davison A.J., Dunn B. Protection by f3 -carotene and related compounds against oxygen-mediated cytotoxicity and genotoxicity — Implications for carcinogenesis and anticarcinogenesis // Free Radic. Biol. Med — 1992.- Vol. 13.- P.407-433.

57. Di Mascio P., Devasagayam T.P.A. Kaiser S., Sies H. Carotenoids, tocopherols, and thiols as biological singlet molecular oxygen quenchers // Biochem. Soc. Trans.- 1990.-Vol. 18.-P. 1054-1056.

58. Di Mascio P., Kaiser S., Sies H. Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher // Arch. Biochem. Biophys.- 1989— Vol. 274,-P. 532-538.

59. Kaiser S., Di Mascio P., Murphy M.E., Sies H. Quenching of singlet molecular oxygen by tocopherols // Antioxidants in therapy and Preventive Medicine.-N.Y.: Plenum Press, 1990.- P. 117-123.

60. Conn P.F., Schalch W., Truscott T.G. The singlet oxygen and carotenoid interaction // J.Photochem. Photobiol. В.- 1991.- Vol. 11.- P. 41-47.

61. Ланкин B.3., Тихазе A.K., Коновалова Г.Г., Козаченко А.И. Концентрационная инверсия антиоксидантного и прооксидантного действия J.3-каротина в тканях in vivo II Бюл. эксперим. биологии и медицины 1999Т. 128, вып. 9.-С. 314-316.

62. Lowe G.M., Vlismas К., Young A.J. Carotenoids as prooxidants? // Mol. Aspects Med.- 2003.- Vol. 24.- P. 363-369.

63. Palozza P., Galviello G., Bartoli G.M. Prooxidant activity of beta-carotene under 100% oxygen pressure in rat liver microsomes // Free Radic. Biol. Med.- 1995.-Vol. 19.-P. 887-892.

64. Cantrell A., McGarvey D.J., Truscott T.G. et al. Singlet oxygen quenching by dietary carotenoids in a model membrane environment // Arch. Biochem. Biophys.- 2003-Vol. 412.-P. 47-52.

65. Tamba M., O'Neil P. Redox reactions of thiol free radicals with the antioxidants ascorbate and chlorpromazine: Role in radioprotection // J. Chem. Soc. Perkins Trans. 2.- 1991.-Vol. 11.-P. 1681-1685.

66. Колотилова А.И., Глушанков Е.П. Витамины (химия, биохимия и физиологическая роль).- JL: Изд-во ЛГУ, 1976 248 с.

67. Niki Е. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals // Am. J. Klin. Nutr.-1991.- Vol. 54.- P. 1119-1124.

68. Биохемилюминесценция / Под ред. А.И. Журавлева. М.: Наука, 1983. - 345с.

69. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. / Сборник науч. статей М.: Наука, 1992. - 110 с.

70. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Кинетика жидкофазного окисления дифенилметана при умеренных температурах // Кинетика и катализ. 1996. - т.37, №4. - с.542-552.

71. Васильев Р.Ф., Вичутинский А. А., Черкасов А.С. Хемилюминесценция, активированная производными антрацена // Доклады АН СССР. 1963. -т.149, №1. - с.124-127.

72. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. О переносе энергии с химически возбуждаемых карбонильных соединений на производные антрацена и кислород // Известия АН СССР, серия физическая. 1973. - т.37, №4. - с.747-752.

73. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. Ингибирование сывороточными антиоксидантамиокисления люминола в присутствии гемоглобина и пероксида водорода // Вопросы медицинской химии. 1997. - т.43, №2. — с.87-92.

74. Навас М.Х., Хименец A.M., Асуэро А.Г. Определение восстановительной способности настоек семени канарского канареечника методом хемилюминесценции // Журнал аналитической химии. 2004. -т.59, №1. - с.84-86.

75. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Владимиров Ю.А. Антиоксидантная активность сыворотки крови. // Вестник РАМН. 1999. -№2.-с. 15-22.

76. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Кинетика окси-хемилюминесценции и ее использование для анализа антиоксидантов //Кинетика и катализ. 2004. - т.45, № 3. - с.355-362.

77. Большакова И.В., Лозовская Е.Л., Сапежинский И.И. Антиоксидантные свойства ряда экстрактов лекарственных растений // Биофизика. 1997. - т.42, №2. - с.480-483.

78. Наумов В.В., Храпова Н.Г. Определение активности слабых антиоксидантов хемилюминесцентным методом // Кинетика и катализ. -1984. т.25, №3. - с.563-570.

79. Шарипов Г.Л., Казаков В.П., Толстиков Г. А. Химия и хемилюминесценция 1,2-диоксикетанов. М.: Наука, 1990. - 288 с.

80. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Хемилюминесценция при окислении непредельных органических соединений в растворах // Известия АН СССР, серия химическая. 1983. -№12. - с.2709-2717.

81. Письменский А.В., Психа Б.Л., Харитонов В.В. Кинетическая модель окисляемости метиллинолеата // Нефтехимия. 2000. - т.40, №2. -с.123-129.

82. Письменский А.В., Психа Б.Л., Харитонов В.В. Механизм и эффективность ингибирующего действия 1,3-ди(4-фениламинофенокси)-2-пропанола и 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола при окислении метиллинолеата // Нефтехимия. 2001. - т.41, №5. - с.377-383.

83. Ермилова Е.В., Кадырова Т.В., Краснов Е.А., Писарева С.И., Пынченков В.И. Антиокислительная активность экстрактов водяники черной. // Химико-фармацевтический журнал. 2000. - т.34, №11. - с.28-30.

84. ХасановВ.В., ДычкоК.А., Рыжова Г.Л. Кинетический метод свободно-радикального окисления сульфит-иона для определения антиоксидантов в биообъектах // Химико-фармацевтический журнал. 2001. - т.35, №12. - с.36-37.

85. Наумов В.В., Васильев Р.Ф. Анти- и прооксидантное действие токоферола // Кинетика и катализ. 2003. - т.44, № 1.-е. 111-115.

86. Сизова Н.В., Веретникова О.Ю., Ефремов А.А. Оценка антиоксидантной активности эфирных масел методом микрокалориметрии // Химия растительного сырья. 2002. - № 3. - с.57-60.

87. Афанасьев В.А., Заиков Г.Е. Физические методы в химии. М.: Наука, 1984. 174 с

88. Починюк Т.В., тараховский М.Л., Портнягина В.А., Денисова М.Ф., Вонсяцкий В.А., Александрова А.Н., Мельничук В.А. Экспресс-метод определения антиокислительной активности лекарственных веществ // Химико-фармацевтический журнал. 1985. - №5. - с.565-569.

89. V. Fogliano, V. Verde, G. Randazzo, A. Ritieni Method for measuring antioxidant activity and its application to monitoring the antioxidant capacity of wines. // Journal Agricultural and Food Chemistry. 1999. - v.47, №3. - p. 10351040.

90. F. Tubaro, E. Micossi, F. Ursini The antioxidant capacity of complex mixtures by kinetic analysis of crocin bleaching inhibition. // Journal of the American Oil Chemists's Society. 1996. - v.73, №3. -p.173-176.

91. V.L. Singleton, J.A. Rossi Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. // American Journal of Enology and Viticulture. 1965. - v. 16, №3. - p. 144-158.

92. Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения. М.: изд-во РУДН, 2005. 221с.

93. Benzie I.F., Strain J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP)as a measure of bantioxidant powerQ: the FRAP assay // Analytical Biochemistry. -1996. v.239, №1. - p.70-76.

94. Moyer R.A., Hummer K.E., Finn C.E., Frei В., Wrolstad R.E. Anthocyanins, phenolics, and antioxidant capacity in diverse small fruits: vaccinium, rubus, and ribes // Journal Agricultural and Food Chemistry. 2002. -v.50,№3.-p.519-525.

95. Luximon-Ramma A., Bahorun Т., Soobrattee M.A., Aruoma O.I. Antioxidant activities of phenolic, proanthocyanidin, and flavonoid components in extracts of Cassia fistula // Journal Agricultural and Food Chemistry. 2002. -v.50, №18. - p.5042-5047.

96. Chevion S., Berry E.M., Kitrossky N., Kohen R. Evaluation of plasma low molecular weight antioxidant capacity by cyclic voltammetry // Free Radical Biology And Medicine 1997. - v.22, №6. - p.411-421.

97. Chevion S., Roberts M.A., Chevion M. The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant capacity // Free Radical Biology And Medicine. -2000. v.28, №6. - p.860-870

98. Kohen R., Vellaichamy E., Hrbac J., Gati I., Nirosh O., Quantification of the overall reactive oxygen species scavenging capacity of biological fluids and tissues // Free Radical Biology And Medicine 2000. - v.28, №6. - p.871-879.

99. Абдуллин И.Ф., Турова E.H., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Гайсина Г.Х. Электрогенерированный бром — реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов. // Заводская лаборатория. -2002. т.68, №9. - с.12-15.

100. Абдуллин И.Ф., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Интегральная антиоксидантная емкость крови по данными метода гальваностатическойкулонометрии // Вестник Татаского отделения Российской экологической академии. 2003. - № 3. - с.35-39.

101. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Новый прибор для определения антиоксидантной активности пищевых продуктов, биологическиактивных добавок, растительных лекарственных экстрактов и напитков // Приборы и автоматизация. 2004. - №11. - с.45-48.

102. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П., Экспрессный электрохимический метод определения антиоксидантной ативности пищевых продуктов // Пиво и напитки. — 2004. №6. - с.44-46.

103. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Вяселев М.Р. Основы современного электрохимического анализа —М.: Мир, 2003, 592с.

104. Осина М.А., Богдановская В.А., Тарасевич М.Р. Биоамперометрическое определение производных фенола с использованием композита лакказа-нафион // Электрохимия. 2003. - т.39, №4. - с.450-456.

105. Ge В., Lisdat F. Superoxide sensor based on cytochrome С immobilized on mixed-thiol SAM with a new calibration method // Analytica Chimica Acta. 2002. - v.454, №1. - p.53-64.

106. Ignatov S., Shishniashvili D., Ge В., Scheller F.W., Lisdat F. Amperometric biosensor based on a functionalized gold electrode for detection of antioxidants // Biosensors and Bioelectronics. 2002. - v.17, №1. - p.191-199.

107. Campanella L., Bonanni A., Favero G., Tomassetti M. Determination of antioxidant properties of aromatic herbs, olives and fresh fruit using an enzymatic sensor // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2003. - v. 375. № -p.1011-1016.

108. Бумбер А.А., Корниенко И.В., Профатилова И.А., Внуков В.В., Корниенко И.Е., Гарновский А.Д. Полярографический метод в изучении антиоксидантной активности аминокислот и белков. // Журнал общей химии. 2001. Т. 71. №8. С. 1387 1390.

109. Громовая В.Ф., Шаповал Г.С., Луйк А.И. Применение импульсной вольтамперометрии для изучения антиокислительнойактивности физиологическиактивных веществ // Химико-фармацевтический журнал. 1994. -№11.-с.11-14.

110. Громовая В.Ф., Шаповал Г.С., Мионюк И.Е., Луйк А.И. Электрохимическое исследование антиоксидантной активности крови // Журнал обшей химии. 1997. -т.67, № 3. -с.510-513.

111. Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Реакции супероксид анион-радикала с антиоксидантами и их применение в вольтамперометрии // Журнал аналитической химии. 2005. - т.60. № 5. — с.56-59.

112. Ziyatdinova G.K., Budnikov Н.С., Pogorel'tzev V.I. Electrochemical determination of the total antioxidant capacity of human plasma // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2005. - v. 381, №8. - p. 1546-1551.

113. А.П. Томилов, С.Г. Майрановский, М.Я. Фиошин, B.A. Смирнов Электрохимия органических соединений. — Л.: Химия, 1968. 591 с.

114. Манн Ч., Барнес К. Электрохимические реакции в неводных системах. М.: Химия, 1974. - 480 с.

115. Ион-радикалы в электродных процессах. / под ред. Е.И. Хрущевой, сб. статей. М.: Наука, 1983. - 336 с.

116. Электродные процессы в растворах органических соединений: Учеб. пособие / под ред. Б.Б. Дамаскина. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985. -312 с.

117. Науч. рук. Г. Б. Слепченко. Защищена 18.05.2005 г. - Томск: Изд-во ТПУ, 2005.- 152 л.

118. Будников Г.К., Улахович Н.А., Медянцева Н.П. Основы электроаналитической химии. Изд-во Казанского ун-та. - 1986. - 288с.

119. Smith I, Kolhoff. //J. Amer. Chem. Soc. 1942. - V.64, №447. - P.646.

120. Karrer P, Keller H. //Helv. chim. Acta. 1938. - V.21. - P. 1161.

121. Мискиджьян С.П., Кравченюк JI.П. Полярография лекарственных соединений. Киев: Вища школа. - 1976. - 232с.

122. Uchyama S., Kurokawa Y., Hasebe Y., Suzuki S. Rapid coulonomelry of tocopherols in enhanol and chloroform using ferricyanide ion mediator. //Elektroanalysis. 1994. - V.6, № 2. - P.63-66.

123. Zvonimir J.Suturovic, Nikola J. Marjanovic //Elektroanalysis. 1999. -V.ll,№3.-P. 207-209.

124. Девятнин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов. М.: Медицина. 1964. - 360 с.

125. Zhang Tian-Yi, Zhu Shi-Min. On-line electrochemistry liquid chromatography with UV absorbance detection for elucidating the electrochemical oxidation mechanism of a-tocopherol in methanol. //Anal. chim. acta. -1995.-V.309, № 1-3.-P. 111-115.

126. Надиров К.С. и др. Электрохимическое исследование а-токоферола. //Каз.хим.-технол.ин-т. Чимкент. - 1986. - 9 с.

127. Michalkiewicz Slawomir, Titaj Monika, Kaczor Maria, Malyszko Jan. Electrochemical behavior of tocopherols on microelectrodes in acetic medium. //Electroanalysis. 2002. - 14, №4. - P. 297-302.

128. Yamauchi R., Noro H., Shimoyamada M., Kato K. Analysis of vitamin E and its oxidation products by HPLC with electrochemical detection // Lipids.- 2002.-V. 37, №5.-P. 515-522.

129. Ting Wu, Yueqing Guan, Jiannong Ye // Food Chemistry 100 (2007) p1573-1579

130. Xueqin Xu, Lishuang Yu, Guonan Chen // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41 (2006) 493-499

131. Shan Zhang, Shuqing Dong, Langzhu Chi, Pingang He, Qingjiang Wang, Yuzhi Fang // Talanta в печати

132. R. Aguilar-Sanchez, F. Ahuatl-Garcia, M.M. Davila-Jimenez, M.P. Elizalde-Gonzalez, M.R.G. Guevara-Villa // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 38 (2005) 239-249

133. Yamamoto Y., Yamashita S. Plasma ratio of ubiquinol and ubiquinone as a marker of oxidative stress.- 1997.- V. 18, №S1.- P. 79-84.

134. Gamache P.H., Acworth I.N. Simultaneous analysis of fat soluble carotenoids, retinoids, tocopherols, vitamin К and coenzyme Q 10 in plasma // Northeast Regional Chromatography Discussion Group.- 1998 Book of Abstr. -P. 6.

135. ГОСТ P 8.563-96 ГСИ. Методики выполнения измерений

136. ГОСТ P ИСО 5725-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений

137. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа. Полярография, хроновольтамперометрия, хронопотенциометрия, метод вращающегося диска, пер. с польск. М.: Мир, 1974. — 552 с.

138. Шольц Ф. Электроаналитические методы: теория и практика: пер. с англ.; под ред. В.Н. Майстренко. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006. —326 с.

139. Nicholson R.S., Shain I. Anal. Chem., 36, 706 (1964)

140. Turyan Y.I., Gorenbein P., Kohen R. J. Electroanalytical Chem., №571,2004, 183-188

141. Turyan Ya.I., Chemical Reactions in Polarography, Khimiya, Moscow, 1980, p.22

142. Короткова Е.И. Закономерности процесса электровосстановления кислорода, осложненного адсорбцией ПАОВ, и их использование в аналитической практике: Диссертация к-та хим. наук. — Томск, 1995. 242с.

143. Heyrovsky М., Vavricka S. Heterogeneous electron transfer to molecular oxygen in aqueous solutions // Journal of Electroanalytical Chemistry. -1992.-v.332, № 1-2.-p. 309-313.

144. Richard G. Compton, Craig E. Banks Understanding voltammetry -World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., 2007, 371 p.

145. Г.И. Красовский, Г.Ф. Филаретов Планирование эксперимента. Минск: Изд-во Белорусского ГУ, 1982. - 302 с Г.И.

146. A.N. Lukina, E.I. Korotkova, Y.A. Karbainov. // Abstr. Int. Conf. Instrumental Methods of Analysis Modern Trends and Applications, Greece, 2-6 October, 2005, p. 496

147. Anka Bojilova, R. Nikolova, Christo Ivanov Tetrahedron, Vol. 52 №38, 1996, 12597-12612

148. Rositca Nikolova, Anka Bojilova Tetrahedron, Vol. 54, 1998, 14407-14420

149. A.N. Lukina, E.I. Korotkova, Y.A. Karbainov. // Abstr. Int. Conf. International Congress on Analytical Sciences, Moscow, Russia, 25 30 June, 2006, p. 255

150. М.Д. Машковский Лекарственные средства:. 14-ое изд. в 2 томах. Tl. М.: Медицина, 2000, 540 с.

151. L. Rasmussen, S.E. Husted, S.P. Johnsen, Acta Anaesthesiologica Scandinavica, 47 (2003), 1038-1040.

152. F. Angelucci, L. Aloe, P.J. Vasquez, A.A. Mather, The International Journal ofNeuropsychopharmacology, 6, (2003), 225-231.

153. Чекман И.С., Горчакова Н.А., Николай C.JI. Магний в медицине. Кишинев, 1992.- 101 с.

154. Ebel Н., Gunther Т. Magnesium metabolism: a review // J. Clin. Chem. & Clin. Biochem. 1998. - v. 18. - P. 257-270.

155. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов I-IV групп: справ. Изд. /Под. ред. В.А. Филова и др. JI.: Химия, 1988,512 с

156. А.Н. Лукина, Е.И. Короткова, Ю.А. Карбаинов. // Материалы Международной научной конф. Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий, Томск, 11-16 сентября, 2006, с. 91-93

157. П.Швец, Словакофарма ревю, VI(4), 75 77 (1996).

158. Ю.А.Владимиров, Вестник РАМН, №7, 43-50 (1998).

159. Э.П.Кемертелидзе, В.Г.Цицишвили, М.Д.Алания и др., Хим. природ, соед., №1, 42 46 (2000).

160. Е.И. Шкарина, Т.В. Максимова, И.Н. Никулина и др., Хим. -фарм. журн., 35(6), 40 47 (2001).

161. Y.F.Chu, J.Sun, X.Wu et al., J. Agric. Food Chem., 50(23), 6910 -6916 (2002).

162. Е.И.Короткова, О.А.Аврамчик, M.C. Юсубов и др., Хим. -фарм. журн., 37(9), 55-56 (2003).

163. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование, Т.З, Наука, Ленинград (1987).

164. В.Г. Беспалов, А.Ю. Лимаренко, А.С. Петров и др., Раст. ресурсы, 3(1), 9-18(1993).

165. Крылов Г.В. Травы жизни и их искатели. Томск: Красное знамя, 1992, 390

166. Н.П. Максютина, Н.Ф. Комиссаренко, А.П. Прокопенко, Растительные лекарственные средства, Здоровье, Киев (1985).

167. Е.А.Краснов, Т.П.Березовская, Н.В.Алексеюк и др., Выделение и анализ природных биологически активных веществ, Изд-во Томского ун-та, Томск (1987).

168. И.В. Шилова, Е.А. Краснов, Е.И. Короткова, М.Г. Нагаев, А.Н. Лукина. Антиоксидантная активность экстрактов надземной части лабазника вязолистного. // Химико-фармацевтический журнал, 2006, Т.40, №12, с. 2224

169. Флора СССР / Под ред. В. Л. Комарова. М., 1963. Т. XXVIII.

170. Никифоров Ю. В. Зеленая аптека Горного Алтая. Горно — Алтайск, 1990.

171. Крылов Г. В., Казакова Н. Ф., Степанов Э. В. Зеленая аптека. Кемерово, 1993.

172. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейство Asteraceae (Compositae). СПб., 1993.

173. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронич. М., 1983.

174. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Е. Сироткиной. Томск, 1987.

175. И.В. Шилова, Н.В. Кувачева, Е.И. Короткова, Е.А. Краснов, А.Н. Лукина и др. Антиоксидантные свойства биологически активных веществ Alfredia Cernua и Alfredia Nivea. // Растительные ресурсы, 2008, №1, с. 114-121

176. Лекарственные растения (Растения-целители). Изд. 2-ое под ред. А.Ф. Гаммерман, Г.Н. Кадаев и др. Высшая школа, 1975 - 400 с.

177. И.В. Шилова, А.Н. Вторушина, Е.И. Короткова. Черника обыкновенная — источник биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами. // Сборник статей «Здоровое питание -основа жизнедеятельности человека», 2008, с. 250-254

178. Квантово-химические расчеты в органической химии и молекулярной спектроскопии / К.Я. Бурштейн, П.П. Шорыгин. М.: Наука, 1989.- 104 с.

179. О. Lipskikh, A. Lukina, Е. Korotkova. // Book of abstracts V International Conference on Instrumental Methods of Analysis Modern Trends and Applications, Greece, 30 September 4 October, 2007, p. 135

180. I. Schepetkin, A. Potapov, A. Khlebnikov, A. Lukina Decomposition of reactive oxygen species by copper(II) bis(l-pyrazolyl)methane complexes // J. Biol. Inorg. Chem., 2006, V. 11, p. 499-513