Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при патологии методом вольтамперометрии

Плотников, Евгений Владимирович

Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при патологии методом вольтамперометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Плотников, Евгений Владимирович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Томск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при патологии методом вольтамперометрии»

Автореферат диссертации на тему "Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при патологии методом вольтамперометрии"

На правах рукописи

Плотников Евгений Владимирович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

02.00.02 — аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Томск —2012

11 о кі тг

005053055

Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, доцент Короткова Елена Ивановна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Будников Герман Константинович доктор химических наук, профессор, член-корр. РАЕН,

Казанский государственный университет, профессор кафедры аналитической химии

Мамонтова Инесса Петровна, кандидат химических наук, доцент, Сибирский государственный медицинский университет (г. Томск), доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет, (г. Краснодар)

Защита диссертации состоится «26»' сентября 2012 г. в 16.30 на заседании диссертационного совета Д 212.269.04 при Национальном исследовательском Томском политехническом университете по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Национального исследовательского Томского политехнического университета по адресу:г.Томск, ул.Белинского, 53

Автореферат разослан: »

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. хим. наук, доцент

августа 2012 г.

• Гиндуллина Т.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Исследование состава и свойств биообъектов является приоритетной задачей аналитической химии. Одним из важных показателей гомеостаза живого организма является антиоксидантная активность биообъектов, препятствующая развитию свободно-радикальных процессов в организме. В свою очередь, избыточное содержание активных форм кислорода вызывает радикально-цепные процессы окисления в клетках организма, вызывая значительные нарушения в их нормальном метаболизме. Дисфункции в регуляции свободно-радикальных процессов являются важным звеном развития многих патологий. В частности, при психических заболеваниях активируются патологические механизмы свободно-радикального окисления и формирование синдрома эндогенной интоксикации. Поэтому очень важной становится проблема контроля состояния антиоксидантной системы организма человека при патологиях различного типа, с целью дальнейшей терапевтической коррекции.

Трудности в создании новых эффективных методов диагностики антиоксидантного статуса организма связаны с недостаточным пониманием механизмов кислородного метаболизма в организме человека.В настоящее время методы определения антиоксидантной активности биологических объектов основаны на различных принципах и модельных реакциях, часто используются искусственные радикалы и антиоксиданты не существующие в живых организмах, нет единой размерности показателя антиоксидантной активности биообъектов, результаты измерений часто несопоставимы друг с другом, что затрудняет их интерпретацию. Поэтому поиск новых подходов к определению активности антиоксидантов в биологических объектах является весьма актуальной задачей.

Цель работы: Разработка вольтамперометрического способа определения суммарной активности антаоксидантов в сыворотке крови человека на основе модельной системы электровосстановления кислорода для изучения антиоксидантного статуса организма и препаратов для его коррекции. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние антаоксидантов сыворотки крови человека на процесс электровосстановления кислорода. Оптимизировать способ пробоподготовки сыворотки крови с учетом особенностей вольтамперометрического метода в анализе биообъектов.

2. Провести оценку суммарной активности антиоксидангов в сыворотке крови человека вольтамперометрическим методом в норме и при психических патологиях.

3. Провести определение гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях методом флуориметрии.

4. Исследовать влияние солей лития на процесс электровосстановления кислорода, для выявления соединений, имеющих большой потенциал практического применения в психиатрии.

5. Разработать вольтамперометрическую методику определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека. Провести сравнительные исследования суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови с другими аналитическими методами определения активности антиоксидантов. Научная новизна.

• Впервые исследованы закономерности суммарного влияния антиоксидантов сыворотки крови человека на процесс электровосстановления кислорода. Выявлено, что взаимодействие антиоксидантов сыворотки крови с продуктами восстановления кислорода проходит преимущественно по ЕС механизму.

• Впервые предложен вольтамперометрический подход для оценки суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в пересчете на глутатион. Оптимизированы этапы пробоподготовки сыворотки крови человека Выявлена низкая суммарная активность антиоксидантов в сыворотке крови при патологии и ее положительная динамика в ходе медикаментозной терапии.

• Разработан новый подход к оценке количества гидроксильных радикалов в сыворотке крови методом флуориметрии, используя терефталиевую кислоту в качестве «ловушки» радикалов. Установлена обратная зависимость между концентрацией гидроксильных радикалов и суммарной активностью антиоксидантов в сыворотке крови.

• Впервые определена антиоксидантная активность психотропных соединений лития методом вольтамперометрии по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

• Показана взаимосвязь результатов определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека между вольтамперометрическим, спектрофотометрическим и иммуноферментным методами анализа.

Практическая значимость.

• Разработана методика определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека методом вольтамперометрии на основе процесса электровосстановления кислорода в пересчете на глутатион для оценки и мониторинга антиоксидантного статуса организма в норме и при патологии.

• На основе полученных экспериментальных данных предложено использовать показатель суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови как критерий эффективности лечения психических заболеваний.

• Выявлены наиболее активные соединения на основе солей лития, а так же композиции на их основе для корректировки антиоксидантного статуса организма. Установлено, что наибольшую антиоксидантную активность проявляет аскорбат лития. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов предложена наиболее эффективная композиция из

аскорбата лития и дигидрокверцетина в соотношении 5:1. Даны рекомендации для их дальнейшего использования в психиатрии в качестве психостабилизаторов с антиоксидантными свойствами.

• На основе аскорбата лития разработан и зарегистрирован лечебно-профилактический комплекс «Нормотим» для коррекции аддиктивных состояний.

• На основе разработанной методики создан модифицированный прибор «Антиоксидант» со встроенным программным обеспечением дня анализа антиоксидантной активности.

На защиту выносятся:

1. Результаты определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека по отношению к процессу электровосстановления кислорода в норме и при психических патологиях.

2. Результаты определения гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях методом флуориметрии.

3. Результаты определения антиоксидантной активности соединений лития и композиций на их основе, имеющие фармацевтическое значение, по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

4. Методика определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека по отношению к процессу электровосстановления кислорода.

5. Результаты сравнительных определений суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека с использованием метода вольтамперометрии и независимых аналитических методов анализа (спектроскопический и имунноферментный).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены в докладах на Второй Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008); Научно-практической конференции с международным участием «Охрана психического здоровья в демографической политике страны» (Томск, 2008); XI всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2010); симпозиуме «Теория и практика электроаналитической химии» (Томск, 2010); Научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора Ю.А. Карбаинова «Электрохимические методы анализа. Теория и практика» (Томск, 2010); 7th Aegean Analytical Chemistry Days (Lesvos, Greece, 2010); Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); VIH всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА 2012» (Уфа-Абзаково, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах ВАК и 13 тезисов в сборниках конференций, получено 5 патентов РФ на изобретение.

Диссертация выполнена при поддержке гранта РФФИ № 10-08-00306-а «Исследование антиоксидантаой активности сыворотки крови человека в норме и патологии методом вольтамперометрии» и программы ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы ПС №14.740.11.1440 «Разработка психотропных соединений, обладающих антиоксидантаой и иммуностимулирующей активностью».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы из 142 наименований и приложения. Содержит 140 страниц, 29 таблиц, 27 рисунков.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведен литературный обзор. Рассмотрены общие вопросы процесса восстановления кислорода в биологических мембранах. Дано обоснование разработки новых психотропных соединений с ангиоксидантной активностью для лечения аддиктивных состояний. Во второй главе описаны условия эксперимента, представлены данные об используемом оборудовании и объектах исследования. В третьей главе рассмотрены особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии сыворотки крови человека. Представлены результаты определения концентрации гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека в норме и при психических заболеваниях методом флуориметрии. В четвертой главе представлены результаты определения антиоксидантных свойств по отношению к процессу электровосстановления кислорода некоторых соединений лития. В пятой главе описаны метрологические аспекты методики определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека. Показаны результаты сравнительных испытаний вольтамперометрического,

спектрофотометрического и иммуноферментного методов определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ

Исследования проводили на вольтамперометрическом анализаторе ТА-2 (ООО «НПП Томьаналит», г.Томск) и вольтамперометрическом анализаторе антиоксидантной активности «Анализатор АОА» (ООО «НПП Полиант» г. Томск, Россия) в комплекте с ПК.

В работе использовали метод катодной вольтамперометршш, в частности процесс элеюровосстановления кислорода (ЭВ 02), который повторяет четырехэлектронный механизм восстановления молекулы 02 до воды в клетках живого организма, и таким образом является оптимальной модельной системой для анализа биобъекгов. Для оценки влияния исследуемых объектов рассматривали зависимости предельного тока ЭВ 02 от концентрации их в объеме раствора и от времени протекания процесса ЭВ 02 в их присутствии.

Вольтамперограммы исследуемых растворов регистрировали на стационарных электродах с линейной разверткой потенциала. Для измерений

использовали индикаторные электроды ртутно-пленочный (РПЭ) и стеклоуглеродный (СУЭ). В качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода использовали хлорид-серебряные электроды (ХСЭ). Оптические измерения проводили на спектрофотометре СФ-46 в кювете с длиной 1 см. Флуориметрические измерения проводили на флуориметре БресЬ-оАиогррЫЛоп^ег КР-5301рс.

В качестве объектов исследований использовали индивидуальные вещества: аскорбиновая кислота, соли лития (аскорбат, сукцинат, аспартат, никотинат, бензоат), дигидрокверцетин разной степени очистки 90%, 92% и 94% («Флавит», Пущино), а так же образцы сыворотки крови человека в норме и при психических патологиях.

Для оценки активности антиоксидантов (АО) исследованных объектов использовали кинетический критерий, отражающий количество активных кислородных радикалов, прореагировавших с антиоксидантом (или суммарным содержанием антиоксидантов) за минуту времени:

где /о- ток ЭВ Ог в отсутствии АО в растворе, мкА; I-ток (2 I ЭВ О2 в присутствии АО в растворе, мкА; Со - исходная

К =—-(1--) концентрация 02 в растворе, мкмоль/л; f - время

t /0 протекания реакции взаимодействия АО с активными

кислородными радикалами, мин.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Определение оптимальных условий пробоподготовки сыворотки крови человека для оценки суммарной активности антиоксидантов в сыворотке Известно, что при изменении скорости и времени центрифугирования меняется состав сыворотки крови. При уменьшении скорости и времени центрифугирования раствор становился неоднородным, что может оказывать влияние на воспроизводимость результатов. При увеличении скорости и времени центрифугирования крови можно потерять ценные компоненты антиоксидантной природы, оказывающие влияние на общий антиоксидантный статус организма. Поэтому первоначально использовали методы планирования эксперимента для оптимизации этапов пробоподготовки сыворотки крови человека путем выбора режимов центрифугирования.

Для получения математической модели процесса использовался полный факторный эксперимент. Варьируемыми факторами служили скорость и время центрифугирования крови. В качестве функции отклика использовали критерий суммарной активности антиоксидантов сыворотки крови.

Получено, что модель адекватно описывает процесс, эффект взаимодействия факторов не значим, все коэффициенты линейной модели значимы и имеют знак плюс, что означает увеличение критериев оптимизации с увеличением значений обоих факторов. Следует отметить, что наибольшее влияние оказывает фактор - время центрифугирования сыворотки крови.

Для нахождения точки оптимума реализован метод крутого восхождения и получена двухфакторная поверхность отклика. На основании полученных

результатов определены оптимальные условия пробоподготовки для определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови: «=2000 об/мин, /=10 мин. Полученные оптимальные условия эксперимента согласуются с общепринятой методикой приготовления сыворотки крови.

Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии сыворотки крови человека Известно, что ЭВ 02 является квазиобратимым процессом и протекает в условиях смешанной кинетики, когда скорость диффузии кислорода в растворе сопоставима со скоростью протекания электрохимической стадии его восстановления. Сыворотка крови является сложным многокомпонентным объектом, с высоким содержанием антиоксидантов различной природы и в разных концентрациях. Поэтому проведено исследование суммарного влияния антиоксидантов сыворотки крови человека на процесс ЭВ Ог.

При добавлении исследуемых образцов в фоновый раствор при скорости развертки потенциала 20 мВ/с на вольтамперограммах наблюдалось уменьшение величины тока ЭВ 02 и смещение потенциала (предельного тока) волны в положительную область (рис. 1).

Рис. 1 Вольтамперофамма тока ЭВ Ог на СУЭ в фосфатном буфере с рН=6.86 (0.025М КН2Р04, 0.025М №2НР04), *Г=20 мВ/с в отсутствие (1) и в присутствии 0.1 мл сыворотки крови человека без видимых патологий при Ь 5 мин (2) и 10 мин (3). (4) - остаточный ток фонового электролита в отсутствии Ог и вещества в растворе.

I, шкА

-0.2

-0.4

-0.6

Такие изменения связаны с влиянием антиоксидантов сыворотки крови на процесс ЭВ Ог- Общая схема электродного процесса с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов сыворотки крови с активными кислородными радикалами может быть представлена следующим образом:

т.

<ж.

(Цк ==№ == № (Н>си+ (ГСМЭз

-Н* -Н;-в"

*РЩОН

+1ЩОН

Показано что для процесса ЭВ Ог в присутствии сыворотки крови соблюдаются следующие условия:

- зависимость потенциала полуволны тока ЭВ 02 в присутствии сыворотки крови от ^ <УД) носит линейный характер (рис. 2), в то время как в отсутствии АО для данного процесса зависимость не линейна.

- при изменении скорости развертки потенциала в 10 раз, потенциал пика смещается на 2.3ЯТ/2пГ и составляет 30 мВ при и=1 (количество электронов, участвующих в лимитирующей стадии электродного процесса).

Ет, в

07 у=0,159х+0,408 Рис. 2 Зависимость потенциала полуволны ЭВ Ог

от скорости развертки потенциала на СУЭ в фосфатном буфере с рН=6.86 (0.025М КН2РО4, 0.025М ЫагНРСЬ) в присутствии сыворотки крови человека (0.1 мл).

Таким образом, сопоставление полученных и литературных данных позволяет говорить о том, что процесс ЭВ Ог в присутствии антиоксидантов сыворотки крови осложняется последующими химическими реакциями.

Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке

крови человека в норме и при психических заболеваниях В качестве объекта исследования использовали сыворотку крови пациентов с диагнозом синдрома алкогольной зависимости 2 степени и пациентов с диагнозом параноидная шизофрения, проходивших стационарное лечение в Томской областной психиатрической больнице. Для оценки суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях сняты вольтамперограммы тока ЭВ Ог в отсутствии и в присутствии исследуемых объектов. На основании полученных данных строились зависимости относительного уменьшения тока ЭВ 02 от времени протекания процесса в присутствии исследуемых образцов сыворотки (рис. 3) и рассчитывались значения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови по кинетическому критерию.

В таблице 1 представлены результаты определения суммарной активности антиоксидантов сыворотки крови человека в норме и у пациентов с диагнозом алкоголизм 2 стадии (выборка по 10-ти пациентам, п=50). Как видно из таблицы 1, показатель активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме составляет около 1.00 мкмоль/л*мин.

1-1,/!«

Рис. 3. Зависимость относительного изменения тока ЭВ Ог от времени протекания процесса в фоновом электролите в присутствии 0.1 мл сыворотки крови: здорового донора (4) и пациента с диагнозом алкоголизм до (1) и после лечения (3), пациента с диагнозом шизофрения (2).

Таблица 1

Значения суммарной активности антаоксидантов в сыворотке крови пациентов с диагнозом алкоголизм по отношению к процессу ЭВ С>2(р=0.95, п=5)

№ Здоровые доноры К, мкмоль/л-мин

До лечения После лечеиия

1 0.85±0,06 0.11 ±0.04 0.82± 0.03

2 1.01 ±0.07 0 71 4-0 03 0.81 4-0 04

3 0.97±0,04 0.02 4- 0.01 0.15 4-0.04

4 0.91±0,05 0 41+ 0.03 0.72 4-0.04

5 1.00±0.09 0.75 4-0.05 0.634- 0.03

б 0.85±0,06 0 37.4-0.02 0.544-0.06

7 0.98±0.07 0 09 4-0.01 0.44 + 0 04

8 0.97±0,04 0 37.4- 0.05 0.65 4- 0.05

9 0.91±0.05 0 71 4-0 04 0.754-0 04

10 1.03±0.04 0.04 4-0 07 0.354-0 03

На рис. 4 представлены результаты средних значений показателя суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови пациентов в динамике лечения. Низкий уровень суммарной активности антаоксидантов в сыворотке крови пациентов при поступлении в стационар (/£=0,18 ± 0,04 мкмоль/лмин), по-видимому, объясняется депрессивным состоянием организма после периода длительного употребления алкоголя. Токсические эффекты этанола истощают протекторные системы крови. На завершающем этапе лечения (10 день пребывания в стационаре) наблюдалось значительное повышение данного показателя. Однако, даже на заключительном этапе терапии средний уровень активности антиоксидантов в сыворотке (#=0,62+0,04 мкмоль/л мин) оставался значимо ниже аналогичного показателя здоровых доноров (ЛГ=0,97±0,04 мкмоль/л-мин).

К ,мкмопь1л*мнн

0,97

0,62

0,18

Рис. 4. Средние значения показателя суммарной активности антиоксидантов сыворотки крови пациентов с диагнозом алкоголизм в динамике лечения

Без паголенки

До/№ЧЕНИЯ После лечеиия

Кроме того отмечена взаимосвязь между суммарной активностью антиоксидантов в сыворотке крови пациентов с диагнозом алкоголизм и активностью ферментов аспарагинаминотрансфераза (ACT) и аланинаминотрансфераза (AJIT), которые имеет большую диагностическую ценность в первую очередь при заболеваниях печени (рис. 5).

-ДСГ(Е/л)

(к, мкмоль/л'мин)

82 62

Т*"*4—«. 50

18 •

Начало лечения После лечения

Рис. 5. Взаимосвязь значения показателя суммарной

активности антиоксидантов

сыворотки крови пациентов с диагнозом алкоголизм в динамике лечения и уровнем активности ферментов ACT и АЛТ

Пониженный уровень средней суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови соответствовал увеличеному значению активности ACT и АЛТ. Установлено, что повышение среднего уровня суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови по завершению курса лечения соответствовало снижению ACT и АЛТ до верхних пределов нормы.

В таблице 2 представлены результаты определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке кровипациентов с диагнозом параноидная шизофрения (выборка по 5-ти пациентам, п=50).

Таблица 2

Значения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке кровипациентов с диагнозом параноидная шизофрения по отношению к процессу ЭВ 0г(р=0.95, п=5)

К, мкмоль/л-мин

№ до лечения после лечения

1 0.17 ±0.04 0.25 ± 0.06

2 0.25 ± 0.06 0.23 ± 0.05

3 0.38 ± 0.05 0.35 ±0.04

4 0.30 ±0.04 0.39 ± 0.06

5 0.68 ± 0.07 0.74 ± 0.07

Среднее значение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови при поступлении в стационар (/С=0,35±0,13) ниже, чем у здоровых доноров. После 10 дней лечения данный показатель (А=0,39±0Д4) составляет менее 40 % от аналогичного показателя здоровых доноров.

Таким образом, показано, что при психических патологиях протекторные антиоксидантные системы организма истощаются, а по изменению показателя суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови пациентов можно оценить степень эффективности проведенных лечебных мероприятий.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что введенный показатель суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови является важным лабораторным аналитическим критерием.

Метрологические аспекты методики определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека На данный момент нет единой регламентированной процедуры оценивания как антиоксидантной активности, так и суммарного количества антиоксидантов в различных объектах: нет государственных стандартных образцов антиоксидантов, нет единой размерности и нормированного показателя антиоксидантной активности, в том числе и биообъектов.

Для выхода из сложившейся ситуации предложено оценивать показатель суммарного количества антиоксидантов в сыворотке крови человека в пересчете на концентрацию глутатиона по градуировочному графику относительного изменения тока ЭВ Ог от его концентрации в растворе (рис. 6). Выбор глутатиона обусловлен стабильностью его структуры, антиоксидантными свойствами, а также значительным присутствием в сыворотке крови человека (до 4,5 ммоль/л).

Рис. 6. Зависимость относительного изменения тока ЭВ О2 от концентрации глутатиона на СУЭ в фосфатном буфере с рН=6.86 (0.025М КН2РО4, 0.025М Ыа2НР04)

На основании полученных данных выведено уравнение регрессии зависимости относительного изменения тока ЭВ Ог от молярной концентрации глутатиона в растворе фонового электролита в диапазоне от 1-Ю"4 до 10-Ю"4 моль/дм3:1-1До = 0.0038 х С

Проведена проверка гипотезы линейности данного градуировочного графика. Оценена адекватность математической модели по критерию Фишера. В представленном диапазоне концентраций модель адекватна.

Для подготовки методики к метрологической аттестации определены метрологические характеристики методики, представленные в таблице 3. Все

процедуры расчетов проводились в соответствии с ГОСТ РИСО 5725-2002, действующего на территории РФ.

Таблица 3

Метрологические характеристики методики определения показателя

суммарного количества антиоксидантов в сыворотке крови человека по отношению к процессу ЭВ Ог в пересчете на концентрацию глутатиона (р = 0.95, п=3,1=10)

Молярная концентрац ия глутатиона, моль/дмЗ Показатели прецизионности (относительные значения) Показатель точности (границы относительной погрешности при Р= 0,95), ±5, %

Стандартное отклонение повторяемости, от, % Стандартное отклонение внутрилабораторнойпрецизи онности, <4%

0,000196 7 и 25

0,00038 6 10 24

0,00074 5 8 20

0,0091 5 8 21

0,0011 4 8 20

По полученным метрологическим показателям для рассматриваемых поддиапазонов концентрации глутатиона принято решение приписать наибольшую погрешность (25%) для всей области рассматриваемых концентраций градуировочной характеристики.

Введенный показатель суммарного количества антиоксидантов в сыворотке крови в пересчете на концентрацию глутатиона решает проблемы метрологической аттестации методики. Однако на практике более удобно использовать ранее введенный кинетический критерий, выраженный в мкмоль/(л- мин). Это взаимозаменяемые параметры.

Сравнительные определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови с использованием разных методов

Несмотря на многообразие методов оценки активности антиоксидантов в сыворотке крови, зачастую сравнивать данные, полученные разными методами, не представляется возможным, поскольку методы основаны на разных модельных системах, имеют разную размерность показателя антиоксидантной активности. Поэтому иногда сравнивать численные значения нецелесообразно, но можно провести корреляцию между результатами, полученными разными методами.

В первом случае в качестве метода сравнения выбран спектрофотометрический метод с неферментативной системой генерации кислородных радикалов. Спектрофотометрическая методика определения суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови основывалась на способности антиоксидантов конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксид-анион радикалы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД»Н) и феназинметасульфата (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием формазана (синего цвета). В присутствии антиоксидантов процент восстановления НСТ уменьшается.

Результаты сравнительных испытаний определения показателя суммарной антиоксиданшой активности сыворотки крови человека (выборка по 5-ти здоровым донорам, п=50), представлены в таблице 4 и рис. 7.

. Таблица4

Значения суммарной активности антиоксвдантов в сыворотке крови здоровых доноров, измеренные СФМ и ВА методами (р=0.95, п=5)

К мкмоль/л-мин

№ спектрофотометрический метод вольтамперометрический метод

1 0.83 ± 0.04 0.85 ± 0.06

2 0.95 ± 0.05 1.01 ± 0.07

3 0.93 ± 0.06 0.97 ±0.04

4 0.87 ±0.06 0.91 ±0.05

5 0.92 ± 0.06 1.00 ± 0.09

Рис. 7. Зависимость показателей суммарной активности ашяоксидантов в сыворотке крови здоровых доноров, полученных спектрофотометрическим и

вольтамперометрическим методами

Во втором случае в качестве метода сравнения выбран иммуноферментный метод анализа с использованием тест-системы «Оху81аЬ>. В качестве объекта исследования использована сыворотка крови пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), перенесших аорто-коронарное шунтирование в условиях искусственного кровообращения на базе кардиохирургического отделения НИИ кардиологии СО РАМН г.Томска.

Сравнительное исследование антиоксидантного статуса проводилось на разных этапах: до начала оперативного вмешательства (А), остановки кровообращения (В1), через 6 часов после искусственного кровообращения (В2) и через сутки после операции (С).Результаты сравнительных испытаний определения показателя суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови пациентов (выборка по 3-м пациентам, п=8), представлены в таблице 5 и

Рис. 8. Зависимость показателей суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови пациента с ИБС на разных этапах операции аорто-коронарного шунтирования,

полученных иммуноферментным анализом и вольтамперометрическим методом

К.нпюль/лчшн

Таблица 5

Значения суммарной активности ацтиоксидантов в сыворотке крови пациентов с ИБС, измеренные ИФА и ВА методом (р=0.95, п=5)

№ Код образца ВА метод К, мкмоль/л*мин ИФА OxyStat, мкмоль/л

1 А 0.78 ± 0.03 609±8

В1 0.13 ±0.06 134±3

В2 0.17 ±0.02 176±3

С 0.53 ±0.02 497±5

2 А 0.12 ±0.06 390±4

В1 0.038 ±0.004 5±1

В2 0.042 ±0.005 84±5

С 0.31 ±0.04 480±4

3 А 0.076 ± 0.002 464±8

В1 0.015 ±0.005 81±1

В2 0.045 ± 0.007 118+7

С 0.082 ±0.003 518±5

Из данных таблиц 4 и 5 видно, что численного совпадения результатов нет, что и было ожидаемо, поскольку модельные реакции методов различны. Однако можно говорить о корреляции методов (рис. 7 и 8).

Определение гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека флуориметрическим методом ОН* радикал является наиболее агрессивным продуктом восстановления кислорода как повреждающий агент в отношении клеток организма. Прямое определение гидроксильных радикалов в разных объектах, включая сыворотку крови человека, практически невозможно, т.к. время жизни ОН'радикалов вводной среде около 10"9 с.

Предложена флуориметрическая методика оценки количества гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека, используя терефталевую кислоту в качестве ловушки гидроксильных радикалов.

Образование ОН* в модельных растворах идет по реакции Фенгона: Fe2++H202->Fe3++20H*.

Реакция терефталевой кислоты с гидроксильным радикалом приводит только к одному гидроксилатному продукту, который устойчив и дает хороший сигнал в спектре флуоресценции при длине волны Х=425 нм (рис.9). Анион терефталиевой кислоты не дает подобного сигнала.

сосг

Рис. 9. Схема реакции терефталевой J кислоты с гидроксильным радикалом

^f ПРИ протекании реакции Фентона в

СОСГ растворе

СОО

СОО'

Для количественного определения ОН* радикалов в сыворотке крови человека получен пик флуоресценции ТА-ОН в идентичной области спектра с длиной волны Х=425 им. Полученный сигнал рос с увеличением объема сыворотки крови в растворе (рис.10).

Е. Г.'« ГІІ

лао

Рис. 10. Спектр флуоресценции ТА-ОН в сыворотке крови пациента с диагнозом алкоголизм при >„=425нм: ОД мл (1), 0,2 мл (2), 0,3 мл (3).

воа

Таким образом, природные компоненты сыворотки крови человека генерируют ОН* радикалы, концентрацию которых можно определить, используя данную флуориметрическую методику.

В таблице 6 представлены результаты определения количества ОН* радикалов в сыворотке крови здоровых доноров и пациентов с диагнозом алкоголизм 2 степени до и после лечения методом флуориметрии (выборка по 8-ти пациентам, п=50).

Таблица 6

Количество ОН* радикалов в сыворотке крови

в норме и при патологии методом флуориметрии(] ?=0.95, п=5)

Шифр пациента Концентрация ОН* в сыворотке крови здоровых добровольцев ммоль/л Концентрация ОН* радикалов в сыворотке крови пациентов до лечения, ммоль/л Концентрация ОН* радикалов в сыворотке крови пациентов после лечения, ммоль/л

1 0.30 ±0.02 0.62 ± 0.04 0.31 ± 0.03

2 0.45 ± 0.03 0.65 ± 0.03 0.44 ± 0.02

3 0.39 ±0.02 0.70 ± 0.02 0.42 ± 0.03

4 0.31 ±0.03 0.65 ± 0.03 0.38 ± 0.04

5 0.41 ± 0.02 0.68 ± 0.02 0.36 ± 0.02

6 0.29 ± 0.04 0.66 ± 0.03 0.40 ± 0.04

7 0.34 ±0.04 0.72 ± 0.06 0.37 ± 0.04

8 0.27 ± 0.04 0.73 ± 0.05 0.35 ± 0.03

9 0.50 ± 0.03 0.69 ± 0.04 0.36 ± 0.04

10 0.32 ± 0.04 0.70 ± 0.04 0.41 ± 0.03

Показано, что уровень содержанияОН* радикалов в сыворотке крови при поступлении пациента в стационар больше чем тот же показатель после проведенного курса лечения. Сопоставление результатов исследования выявило обратную зависимость между концентрацией концентрация ОН- радикалов и суммарной активностью антиоксидантов в сыворотке крови человека (рис. 11). Максимальное расхождение этих показателей наблюдается после длительного периода злоупотребления алкоголем. На фоне минимальной активности антиоксидантных систем крови наблюдается увеличение количества

ОН* радикалов в крови. Отмечено, что проведенные лечебные мероприятия уменьшили количество ОН* радикалов, при этом наблюдается увеличение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови.

1,2 п

Я Концентрация ОН" радикалов в

сыворотке крови (ммодь/л) □ АО А сыворотки крови (мкмодь/л-кин)

0,97

0.8

0,68

Рис. 11. Зависимость между концентрацией ОН» радикалов и

суммарной

активностью

антиоксидантов в сыворотке крови человека

Без патологии Алкоголизм (до Алкоголизм лечения) (после

лечения)

Таким образом, было выявлено, что уровень ОН* радикалов в сыворотке крови здоровых доноров меньше, чем у пациентов с диагнозом алкоголизм. По-видимому, повышение продукции нативных радикалов наблюдается на фоне истощения антиоксидантных систем крови. Поэтому необходимо применение антиоксидантов на ранних стадиях лечения, что будет способствовать направленной коррекции оксидантного стресса.

Таким образом, полученные данные позволяют рекомендовать разработанный подход по определению гидроксильных радикалов в сыворотке крови методом флуориметрии, используя терефталиевую кислоту в качестве основного реагента, для оперативного контроля за содержанием активных кислородных радикалов в сыворотке крови пациента

Определение аптиоксидантной активности соединений лития

В химиотерапии психических патологий широко используются препараты лития. В настоящее время основным психостабилизатором является карбонат лития, не обладающий антиоксидантной активностью, при этом риск развития побочных эффектов существенно ограничивает возможность его использования. Исходя из предыдущих исследований, разработана новая концепция - «психотропные антиоксиданты» - соединения, которые должны обладать психостабилизирующим действием и выраженной антиоксидантной активностью.

В работе проведены исследования антиоксидантной активности соединений лития, где в качестве исходных субстанций для анионного компонента выбран ряд органических кислот с изученной биоактивностью (рис. 12). Для оценки совместного эффекта компонентов проведено изучение антиоксидантной активности композиций с добавлением известного природного антиоксиданта дигидрокверцетина(ДГК) в диапазоне соотношений

(1:20)-(1:5).

он ин? 2

6 с4™

Рис. 12 Структурные формулы соединений лития:

аскорбат лития (1), аспартат лития (2), бензоат лития (3), никотинат лития (4), сукцинат лития (5).

В таблице 7 представлены результаты определения антиоксидантной активности соединений лития и композиций на их основе по отношению к процессу ЭВ О2, рассчитанные по кинетическому критерию.

Таблица 7. Значения антиоксидантной активности

Исследуемое вещество К, мкмоль/л-мин. я-

Аскорбат лития 1.25 0.07

Сукцинат лития 0.51 0.03

Бензоат лития 0,53 0,039

Аспартат лития 0.46 0.03

Никотинат лития 0.23 0.03

Аскорбат лития/ДГК (20:1) 1.24 0.11

Аскорбат лития/ДГК (5:1) 1.31 0.12

Сукцинат лития/ДГК (20:1) 0.59 0.13

Сукцинат лития/ДГК (5:1) 0.63 0.13

Аспартат лития/ДГК (20:1) 0.68 0.09

Аспартат лития/ДГК (5:1) 0.71 0.10

Никотинат лития/ДГК (20:1) 0.44 0.12

Никотинат лития/ДГК (5:1) 0.69 0.15

Повышение антиоксидантной активности наблюдается в ряду: никотинат-аспартат-сукцинат-бензоат-аскорбат лития. Наибольшая относительная антиоксидантная активность выявлена для комбинации дигидрокверцетина с аскорбатом лития (1:5). Кроме того прослежена взаимосвязь между антиоксидантной активностью аскорбата лития по отношению к процессу ЭВ О2 и его иммуномодулирующими свойствами птйо, по влиянию на иммунокомпетентные клетки крови человека. Установлено отсутствие побочного токсического влияния на лимфоциты и наличие стимулирующего действия на фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов крови человека. Эти данные подтверждаются низкой острой токсичностью аскорбата лития (11)50 составляет 4840 мг/кг), при этом токсическое действие широко применяемого в медицинской практике карбоната лития более чем в 6 раз выше.

Таким образом, аскорбат лития совмещает положительные свойства антиоксиданта и иммуномодулятора, что делает его весьма перспективным для создания новых эффективных лекарственных препаратов.

выводы

1. Исследованы закономерности влияния антиоксиданте в сыворотки крови человека на процесс электровосстановления кислорода. Обосновано предположение о ЕС-механизме взаимодействия антиоксидантов сыворотки крови с активными формами кислорода.

2. Найдены оптимальные параметры пробоподготовки сыворотки крови методами планирования эксперимента для оценки показателя суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови методом вольтамперометрии путем выбора оптимальных режимов центрифугирования.

3. Проведена оценка суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях по отношению к процессу электровосстановления кислорода. Выявлено значительное снижение суммарной активности антиоксидантов при психических патологиях.

4. Разработана методика выполнения измерений показателя суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в пересчете на концентрацию глутатиона. В соответствии с регламентируемой процедурой аттестации методики выполнения измерений рассчитаны основные метрологические характеристики анализа.

5. Проведены сравнительные определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови вольтамперометрическим методом и стандартными методами определения антиоксидантной активности. Установлена взаимосвязь между результатами вольтамперометрического, спектрофотометрического и иммуноферменгного метода.

6. Разработан способ оценки концентрации гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека методом флуориметрии, используя терефталиевую кислоту в качестве «ловушки» радикалов. Установлено повышение концентрации гидроксильных радикалов в сыворотке крови при алкоголизме. Выявлена обратная зависимость между концентрацией гидроксильных радикалов и суммарной активностью антиоксидантов в сыворотке крови.

7. Проведено определение антиоксидантной активности соединений лития и композиций на их основе методом вольтамперометрии по отношению к процессу электровосстановления кислорода. Выявлено, что среди изученных соединений наибольшую антиоксидантную активность проявляет аскорбат лития. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов (соединений лития с дигидрокверцетином) предложена наиболее эффективная композиция на основе аскорбата лития и дигидрокверцетина в соотношении 5:1 соответственно.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Avramchik O.A.,.Korotkova E.I, Plotnikov E.V., Lukina A.N., Karbainov Y.A. Antioxidant and electrochemical properties of calcium and lithium ascorbates // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 37(2005), p.l 149-1154.

2. Кузнецова E.O., Липских О.И., Короткова Е.И., Балашов П.П., Плотников Е.В., Н.С.Захария Исследование антиоксидантной активности сыворотки крови больных алкоголизмом методом вольтамперометрии // Охрана психического здоровья в демографической политике страны: тезисы докладов научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию ОГУЗ Томской клинической психиатрической больницы под ред. В .Я. Семке, Т.П. Ветлугиной.-Томск: Изд-во «Иван Федоров», 2008,-с. 181-182.

3. Балашов П.П., Аникина Е.Ю., Плотников Е.В., Потапов A.B., Чучалин B.C. Сравнительное изучение нейротоксического действия солей лития // Сибирский весгаик психиатрии и наркологии —2008.-№4 (51).-с. 84.

4. Плотников В.М., Ветлугина Т.П., Балашов П.П., Плотников Е.В. Изучение гсмо протекторного эффекта аскорбата лития при токсическом воздействии этанола // Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии : тезисы докладов Второй Всероссийской конференции с международным участием под ред. В.Я. Семке, Т.П. Ветлугиной.-Томск: Изд-во «Иван Федоров», 2008.- с. 184-185.

5. Липских О.И., Аврамчик O.A., Кузнецова Е.О., Балашов П.П., Плотников Е.В. Антиоксидантная активность психотропных препаратов на основе солей лития // Охрана психического здоровья в демографической политике страны: тезисы докладов научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию ОГУЗ Томской клинической психиатрической больницы под ред. В.Я. Семке, Т.П. Ветлугиной.-Томск: Изд-во «Иван Федоров», 2008.- с. 205-206

6. Плотников Е.В., Короткова Е.И., Дорожко Е.В., Букель М.В., Линерт В. Исследование суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови человека в норме и патологии алкоголизма методом вольтамперометрии // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. №12,2009, Том 75, с. 14-17.

7. Плотников Е.В., Дорожко Е.В., Букель М.В. Сравнительная оценка антиоксидантной активности крови человека в норме и при алкоголизме методом вольтамперометрии // Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XI всероссийской конференции студентов и аспирантов. T.I; Национальный исследовательский Томский политехнический университет. -Томск: изд-во ТПУ, 2010. - с. 357

8. Короткова Е.И., Плотников Е.В., Дорожко Е.В., Букель М.В. Исследование суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови человека в норме и при патологии методом вольтамперометрии //Теория и практика электроаналитической химии: сборник трудов симпозиума; Томский политехнический университет. - Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2010,- с.112

9. Плотников Е.В., Короткова Е.И. Синергетический эффект антиоксидантных свойств дигидрокверцетина и лития аскорбата //Теория и практика электроаналитической химии: сборник трудов симпозиума; Томский политехнический университет. - Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2010,- с. 126

10. Короткова Е.И., Плотников Е.В., Букель М.В. Вольтамперометрический метод определения суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения // Электрохимические методы анализа. Теория и практика: материалы научно-практической конференции, посвященной 70-ю со дня рождения проф. Ю.А. Карбаинова- Томск, ТПУ, 3-4 сентября 2010. - Томск: Изд. ТПУ ДОЮ. - с. 78-89

11. Plotnikov E.V., Korotkova E.I. Antioxidant properties of dihydroquercetin and lithium ascorbates // 7th Aegean Analytical Chemistry Days: book of abstracts; Lesvos, Greece, 2010, p. 254

12. Elena I. Korotkova, Bashkim Misini, Elena V. Dorozhko, Manya V. Bukkel, Evgeniy V. Plotnikov and Wolfgang Lineit Study of OH« Radicals in Human Serum Blood of Healthy Individuals and Those with Pathological Schizophrenia // Int. J. Molecular. Science. 2011, 12,401409

13. Плотников E.B., Короткова Е.И., Плотников B.M., Дорожко Е.В., Букель М.В., Воронова O.A. Применение вольтамперометрии в предклиническом тестировании нового противоинфекционного препарата // Сборник трудов Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» г. Санкт-Петербург, Россия, 2011, с. 262-264

14. Плотников Е.В., Короткова Е.И., Плотников В.М., Дорожко Е.В., Букель М.В., Воронова O.A. Изучение антиоксидантной активности органических солей лития для создания психотропных аншоксидантов // Сборник трудов Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине».г. Санкт-Петербург, Россия, 2011, с. 168-170

15. Дорожко Е.В., O.A. Воронова, Короткова Е.И., Плотников Е.В., Петрова Е.В. Определение тиоловых соединений в сыворотке крови человека с доклинической стадией заболевания эпилепсией методом вольтамперометрии // Заводская лаборатория. Диагностика материалов, №12,2011.Том 77.

16. Короткова Е.И., Плотников Е.В., Воронова O.A., Дорожко Е.В. Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при патологии психотропных заболеваний // Материалы VIII Всероссийской конференции «Электрохимические методы анализа», Уфа-Абзаково, 3-9 июня 2012 г., с. 45.

17. Воронова O.A., Петрова Е.В., Дорожко Е.В., Короткова Е.И., Плотников Е.В. Тиоловые соединения и аптиоксидантный статус организма: сравнительная оценка при поведенческих расстройствах // Материалы VIII Всероссийской конференции «Электрохимические методы анализа», Уфа-Абзаково, 3-9 июня 2012 г., с. 78.

18. Плотников Е.В., Короткова Е.И., Воронова O.A., Дорожко Е.В., Вишенкова Д.А Психотропные антиоксиданты: сравнительное изучение // Материалы VIH Всероссийской конференции «Электрохимические методы анализа», Уфа-Абзаково, 3-9 июня 2012 г., с. 120.

Автор считает своим долгом выразить искреннюю признательность научному руководителю - д.х.н., проф. Коротковой Елене Ивановне за помощь при подготовке и написании диссертационной работы; а так же д.х.н. проф. Бакибаеву Абдигали Абдиманаповичу, д.х.н. проф. Колпаковой Нине Александровне, зав. кафедрой психиатрии, наркологии и психотерапии СибГМУ дм.н., проф. Балашову Петру Прокопьевичу; км.н. исполнительному директору ОАО «ФиБр-Мед» Плотникову Владимиру Михайловичу, к.х.н. Вороновой Олесе Александровне и к.х.н. Дорожко Елене Владимировне за проявленный интерес к работе и плодотворное сотрудничество.

Подписано к печати 08.08.12. Бумага офсетная. Печать RISO. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 38-0248 Центр ризографии и копирования. Ч/П Тисленко О.В. Св-во №14.263 от 21.01.2002 г., пр. Ленина, 41, оф. № 7.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Плотников, Евгений Владимирович

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНА ЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Активные формы кислорода и их биологическая роль.

1.2. Свободно-радикальные процессы в живом организме.

1.3. Система антиоксидантной защиты организма.

1.3.1. Состав крови.

1.3.2. Антиоксидантная система крови.

1.4. Роль оксидантного стресса в патогенезе различных заболеваний человека.

1.4.1. Оксидантный стресс в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний.

1.4.2. Оксидантный стресс при психических заболеваниях.

1.4.3. Антиоксидантные препараты для коррекции оксидантного стресса.

1.5. Методы определения антиоксидантной активности.

1.5.1. Хемилюминесцентные методы.

1.5.2. Кинетические методы.

1.5.3. Оптические методы.

1.5.4. Электрохимические методы.

1.5.5. Методы, основанные на взаимодействии антиоксидантов с кислородом и его активными радикалами.

1.5.6. Методы определения антиоксидантной активности сыворотки крови человека

1.6. Обоснование использования метода вольтамперометрии и процесса электровосстановления кислорода как модельного для оценки антиоксидантной активности сыворотки крови человека.

1.7. Обоснование разработки новых психотропных соединений с антиоксидантной активностью.

ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

2.1. Приборы, ячейки, электроды,реактивы ирастворы.

2.2. Объекты исследования.

2.3. Критерии оценки суммарной антиоксидантной активности.

2.4. Методика эксперимента.

2.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СУММАРНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ И КОЛИЧЕСТВА ОН РАДИКАЛОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ.

3.1. Определение суммарной активности антиоксидантов в сывороткие крови человека в норме вольтамперометрическим методом.

3.1.1. Закономерности влияния антиоксидантов сыворотки крови на процесс электровосстановления кислорода.

3.2. Оценка суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека при психических заболеваниях методом вольтамперометрии.

3.2.1. Оценка суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека при алкоголизме.

3.2.2. Оценка суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови больных шизофренией.

3.3. Определение активных ОН* радикалов в сыворотке крови человека флуориметрическим методом в норме и при психическом заболевании.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ПСИХОТРОПНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ МЕТОДОМ КАТОДНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ.

4.1. Исследование антиоксидантной активности некоторых стандартных антиоксидантов в смесях методом катодной вольтамперометрии.

4.2. Исследование антиоксидантной активности перспективных соединений лития, как основы для создания новых антиоксидантов для лечения психических заболеваний.

4.2.1. Исследование антиоксидантной активности органических соединений лития методом катодной вольтамперометрии.

4.2.2. Исследование суммарной антиоксидантной активности композиций органических соединений лития и дигидрокверцетина методом катодной вольтамперометрии.

4.3. Исследование иммуномодулирующих свойств перспективных соединений лития.

ГЛАВА 5. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.

5.1. Определение оптимальных условий для оценки антиоксидантной активности с использованием методов планирования эксперимента.

5.2. Разработка и подготовка вольтамперометрического способа определения суммарного количества антиоксидантов в биологических объектах к аттестации.

5.3. Вольтамперометрический, спектрофотометрический методы и имунноферментный анализ суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови. Сравнительные определения.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при патологии методом вольтамперометрии"

Актуальность темы. Исследование состава и свойств биообъектов является приоритетной задачей аналитической химии. Особенно актуальными являются вопросы кислородного метаболизма в организме человека, когда стало очевидно, что избыточное содержание активных радикалов кислорода вызывают радикально-цепные процессы окисления в клетках организма, приводя к значительным нарушениям. Дисфункции в регуляции свободнорадикальных процессов являются важным звеном при таких тяжелых патологиях как атеросклероз, диабет и ряд психических заболеваний. В последнее время особую актуальность приобрели аддиктивные заболевания (в первую очередь алкоголизм), создавая угрозу генофонду всей нации, не говоря уже о связанных с алкоголизмом негативных социальных последствиях. Малоизученными остаются вопросы, связанные с изучением нарушений антиоксидантной системы при алкоголизме и их корреляции с показателями крови, поэтому наши исследования были сосредоточены на изучении антиоксидантной активности крови при аддиктивных состояниях (алкоголизм) и наиболее распространенном психозе (шизофрения), а также поиске путей коррекции антиоксидантного статуса организма. Психические заболевания, как правило, предполагают длительную лекарственную терапию, часто пожизненную, при этом психотропные средства имеют серьезные побочные эффекты (например, злокачественный нейролептический синдром - летальное осложнение), поэтому очень важной задачей является поиск путей снижения токсической нагрузки на организм пациента. Создание психотропных антиоксидантов является одним из путей решения этой проблемы.

Интерес к исследованию соединений, способных предотвращать процессы свободнорадикального окисления в клетках, возник уже много лет назад. В настоящее время препараты с ярко выраженными антиоксидантными свойствами широко используются в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Фармакологическая коррекция оксидантного стресса также осуществляется с помощью антиоксидантов (АО). Они прерывают быстрорастущие процессы окисления, образуя малоактивные радикалы, легко выводящиеся из организма. В целом можно резюмировать, что проблема продления активной человеческой жизни напрямую связаны с созданием новых высокоэффективных антиоксидантов.

Терапия с включением АО находит все большее применение при лечении различных заболеваний и коррекции антиоксидантного статуса организма. В связи с вышесказанным возникает проблема быстрого экспрессного определения суммарной антиоксидантной активности биологических объектов с целью ранней диагностики и контроля за эффективностью лечения. В настоящее время существуют методы для определения антиоксидантной активности, емкости биологических объектов. Однако, эти методы используют разные модельные системы, в которых зачастую используются искуственные радикалы и антиоксиданты несуществующие в живой природе. Полученные результаты имеют разные размерности и плохо сопоставимы. Достаточно мало сертифицированных приборов, способных быстро и на качественном уровне определить антиоксидантную активность биологических объектов. Поэтому поиск новых подходов к определению активности антиоксидантов в биологических объектах на данном этапе является весьма актуальной задачей. Поскольку окислительно-восстановительные реакции, определяющие антиоксидант/оксидантный баланс организма, имеют электрохимическую природу, естественно рассматривать именно эти методы для оценки указанного параметра. Среди электрохимических методов стоит особо отметить вольтамперометрические методы, обладающие низкой себестоимостью, высокой чувствительностью к кислороду и его активным радикалам, простотой в аппаратурном оформлении.

Цель работы: Разработка вольтамперометрического способа определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека на основе модельной системы электровосстановления кислорода для изучения антиоксидантного статуса организма и препаратов для его коррекции.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние антиоксидантов сыворотки крови человека на процесс электровосстановления кислорода. Оптимизировать способ пробоподготовки сыворотки крови с учетом особенностей вольтамперометрического метода в анализе биообъектов.

2. Провести оценку суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека вольтамперометрическим методом в норме и при психических патологиях.

4. Исследовать влияние солей лития на процесс электровосстановления кислорода, для выявления соединений имеющих большой потенциал практического применения в психиатрии.

5. Разработать вольтамперометрическую методику определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека. Провести сравнительные испытания суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови с другими аналитическими методами определения активности антиоксидантов.

Научная новизна.

Практическая значимость.

• Выявлены наиболее активные соединения на основе солей лития, композиции на их основе для корректировки антиоксидантного статуса организма. Установлено, что наибольшую антоксидантную активность проявляет аскорбат лития. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов предложена наиболее эффективная композиция из аскорбата лития и дигидрокверцетина в соотношении 5:1. Даны рекомендации для их дальнейшего использования в психиатрии в качестве психостабилизаторов с антиоксидантными свойствами.

• На основе разработанной методики создан модифицированный прибор «Антиоксидант» со встроенным программным обеспечением для анализа антиоксидантной активности.

На защиту выносятся:

Апробация работы. Основные результаты работы представлены в докладах на Второй Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008); Научно-практической конференции с международным участием «Охрана психического здоровья в демографической политике страны», (Томск, 2008); XI всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2010); Симпозиуме: «Теория и практика электроаналитической химии» (Томск, 2010); Научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора Ю.А. Карбаинова «Электрохимические методы анализа. Теория и практика» (Томск, 2010); 7th Aegean Analytical Chemistry Days (Lesvos, Greece, 2010); Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», (Санкт-Петербург, 2011), VIII всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА 2012» (Уфа-Абзаково, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах ВАК и 13 тезисов докладов, получено 5 патентов РФ на изобретение.

Диссертация выполнена при поддержке гранта РФФИ № 10-08-00306-а «Исследование антиоксидантной активности сыворотки крови человека в норме и патологии методом вольтамперометрии»,. программы «УМНИК» Фонда содействия развитию МП НТС «Разработка новых психотропных антиоксидантов как основа для создания лекарственных препаратов для профилактики и лечения алкоголизма» и программ ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 14.740.11.1440 «Разработка психотропных соединений, обладающих антиоксидантной и иммуностимулирующей активностью» и ГК 14.740.11.1369 «Разработка высокочувствительных методик определения и исследование биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами в объектах природного и искусственного происхождения с целью совершенствования профилактики и лечения социально-значимых заболеваний».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, содержит 29 таблиц, 27 рисунков и библиографию из 142 наименований. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и приложения.

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

ВЫВОДЫ

1. Исследованы закономерности влияния антиоксидантов сыворотки крови человека на процесс электровосстановления кислорода. Обосновано предположение о ЕС-механизме взаимодействия антиоксидантов сыворотки крови с активными формами кислорода.

2. Найдены оптимальные параметры пробоподготовки сыворотки крови методами планирования эксперимента для оценки показателя суммарной активности антиоксидантов в ней методом вольтамперометрии путем выбора оптимальных режимов центрифугирования.

3. Проведена оценка суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях по отношению к процессу ЭВ 02. Выявлено значительное снижение суммарной активности антиоксидантов при психических патологиях.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Плотников, Евгений Владимирович, Томск

1. Розанцев Э.Г., Шолле В Д. Органическая химия свободных радикалов. М., 1979.

2. Girotti A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effectors action in biological systems. J Lipid Res 1998; 39: 1529-1542.

3. Zhao Y., Wang Z.B., Xu J.X. Effect of cytochrome с on the generation and elimination of 02' and H202 in mitochondria. J Biol Chem 2003; 278: 23562360.

4. Droge W.Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 2002; 82: 47-95.

5. Hoidal J.R. Reactive oxygen species and cell signaling. Am J Respir Cell Mol Biol 2001; 25: 661-663.

6. Griendling K.K., Sorescu D, Ushio-Fukai M. NAD(P)H oxidase. Role in cardiovascular biology and disease. Circ Res 2000; 86: 494-501.

7. Sanders S.A., Eisenthal R., Harrison R. NADH oxidase activity of human xanthine oxidoreductase generation of superoxide anion. Eur J Biochem 1997; 245: 541-548.

8. Mc Hugh J., Cheek D.J. Nitric oxide and regulation of vascular tone: pharmacological and physiological considerations. Am J Critical Care 1998; 7: 131-140.

9. Pou S., Pou W.S., Bredt D.S. et al. Generation of superoxide by purified brain nitric oxide synthase. J Biol Chem 1992; 267: 24173-24176.

10. Kuhn H. Biosynthesis, metabolization and biological importance of the primary 15-lipoxygenase matabolites 15-hydro(pe-ro)xy-5Z,8Z,l 1Z,13E-eicosatetraenoic acid and 13-hydro(pero)xy-9Z,l lE-octadecadienoic acid. Prog Lipid Res 1997;35:203-206.

11. СаенкоЮ. В., ШутовА. М. Роль оксидативного стресса в патологии сердечно-сосудистой системы у больных с заболеваниями почек // Нефрология и диализ. Т. 6, 2004 г., №1

12. Beckman К.В., Ames B.N. Oxidative decay of DNA. J Biol Chem 1997; 272: 19633-19636.

13. Nielsen F., Mikkelsen B.B., Nielsen J.B. et al. Plasma malondialdehyde as biomarker for oxidative stress: reference interval and effects of life-style factors. Clin Chem 1997; 43: 1209-1214.

14. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники. Сер. биофизика / ВИНИТИ.- 1991. Т.29, №1. - С. 1-252.

15. Rice-Evance С.A., Diplock А.Т, Symons M.C.R. Thechniques in free radical research. Elsevier, Amsterdam, 1991

16. Halliwell B. Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning). Free Radic Res 1999; 1: 261-272.

17. Halliwell В., Gutteridge J.M. The antioxidants of human extracellular fluids. Arch Biochem Biophys 1990; 280: 1-8.

18. Зенков H.K. Окислительный стресс / H.K. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньшикова // М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. 343 с.

19. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. -Oxford.: Clarendon Press, 1989. 793 p.

20. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В.И. Кулинский // Соросов, образов, журн. 1999. - Т. 1, № 2. - С. 2-7.

21. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки / Ю.А. Владимиров // Соросов, образов, журн. 2000. - Т. 6, № 9. - С. 2-9.

22. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы (эволюционные, экологические и медико-биологические аспекты) / О.Ю. Янковский // СПб.: «Игра», 2000. 294 с.

23. Droge W.Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 2002; 82: 47-95.

24. Koshi J.K. (ed). Free radicals. NY, 1980

25. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

26. Thannickal V.J., Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2000; 279: L1005-L1028.

27. Панкин B.3., Тихазе A.K., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. Пособие для врачей. -М.: Медицина, 2001. 78 с.

28. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. JL: Наука, 1985. - 230 с.

29. Bourdon Е., Blache D. The importance of proteins in defense against oxidation. Antioxid Redox Signal 2001; 3: 293-311.

30. Журавлев А.И. Свободнорадикальная биология / А.И. Журавлев, В.Т. Пантюшенко // М.: «Московская ветеринарная академия», 1989. 60 с.

31. May M.J., Cobb С.Е., Mendiratta S. et al. Reduction of the Ascorbyl free radical to ascorbate by thioredoxin reductase. J Biol Chem 1998; 273: 2203923045.

32. Brigelius-Flohe R., Traber M.G Vitamin E: function and metabolism. FASEB J 1999; 13: 1145-1155.

33. Будников Г.К. Антиоксиданты как объекты биоаналитической химии / Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // Журн. аналит. химии. 2005. - Т. 60, № 7. -С. 678-691.

34. Wolfler A., Abujia P.M., Schauenstein K., Liebmann P.M. N-acetylserotonin is a better extra- and intracellular antioxidant than melatonin. FEBS Letters 1999; 449: 206-210

35. Halliwell B. Antioxidant characterization. Methodology and mechanism. // Biochemical Pharmacology. 1995. - V.49, №10. - P. 1341-1348.

36. Reiter R.J. Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans / R.J. Reiter, D. Tan, J.C. Mayo, R.M. Sainz, J. Leon, Z. Czarnocki // Biol. Pharm. Bull. 2003. - V. 50, № 4. -P. 1129- 1146.

37. Воробьева E.H. Роль свободнорадикального окисления в патогенезе болезней системы кровообращения / Е.Н. Воробьева, Р.И. Воробьев // Бюлл. СО РАМН 2005. - Т. 118, № 4. - С. 24-30.

38. Тарасов Н.И., Тепляков А. Т., Малахович Е.В. и др. Состояние перекисного оксиления липидов, антиоксидантной защиты крови у больных инфарктом миокарда, отягощенным недостаточностью кровообращения // Тер. архив. 2002. № 12. С. 12-15.

39. Шмидт Е. В., Лунев Д. К., Верещагин Н. В. Сосудистые заболевания головного и спинного мозга. М.: Медицина, 1976. 283 с.

40. Курашвили Л.В., Косой Г.А., Захарова И.Р. Современное представление о перекисном окислении липидов и антиоксидантной системе при патологических состояниях // Методическое пособие. Пенза: Инс-т усоверш. врачей МЗ РФ, 2003. 32 с.

41. Окислительный стресс, апоптоз и повреждение мозга //Нейрохимия.-1996,- Т.13, Вып.1.-С.61-64.

42. Никушкин Е.В. Перекисное окисление липидов в ЦНС в норме и при патологии // Нейрохимия.-1989.-Т.8, N1.-С. 124-145.

43. Покровский A.A., Абраров A.A. К вопросу о перекисной резистентности эритроцитов // Вопр. питания. 1964- N6.- С.44-49.

44. Болдырев A.A., Куклей M.J1. Свободные радикалы в нормальном и ишемическом мозге. // Нейрохимия.- 1996. Т. 13. - С. 25 - 29.

45. Шакаришвили P.P. Свободнорадикальная патология у больных эпилепсией. Клиника и лечение эпилепсии: Сб. науч. тр.- Тбилиси, 1986.-С.131-145.

46. Collaborative Group of the Primary Prevention Project. Low-dose aspirin and vitamin E in people at cardiovascular risk: a randomized trial in general practice // Lancet.- 2001.- Vol.357.- P.89-95.

47. Goodman; Gilman's. The Pharmacological basis of therapeutics 9th ed. / Ed by J.G. Hardman et al. New York et al.: McGraw-Hill, 1996.- 1905 p.

48. Зарубина И.В. Принципы фармакотерапии гипоксических состояний антигипоксантами быстродействующими корректорами метаболизма // Обзоры по клин, фармакол. и лек. терапия. - 2002. - Т.1. - № I.e. 19-28.

49. Афанасьев В.В. Цитофлавин в интенсивной терапии: Пособие для врачей. СПб. - 2005.- 36 с. - с. 9-30.

50. Дунаев В.В., Тишкин B.C., Евдокимов Е.И. К механизму действия рибоксина. //Фармакология и токсикология. 1998. - С. 52, 56-58.

51. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., Афанасьева Г.А. Возможности эффектиного использования антиоксидантов и антигипоксантов в экспериментальной и клинической медицине // Успехи современного естествознания. 2006. - № 8 - С. 18-25

52. Аронов Д.М. Применение Коэнзима Q10 в кардиологической практике // РМЖ. -2004. 12(15). - с. 905-909.

53. Захарова И.Н., Обыночная Е.Г., Скоробогатова Е.В., Малашина О.А. Влияние антиоксиданта на основе убихинона Кудесана на активность перекисного окисления липидов и антиоксидантную защиту при пиелонефрите у детей // Педиатрия.-2005.-№4.

54. Ланкин В.З., Капелько В.И., Рууге Э.К., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Коэнзим Q: физиологическая функция и перспективы использования в комплексной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы / Пособие для врачей. М: Медпрактика - М, 2008. - с.22

55. Капелько В.И., Рууге Э.К. Исследования действия Кудесана при повреждении сердечной мышцы, вызванной стрессом. Применение антиоксидантного препарата кудесан (коэнзим Q10 с витамином Е) в кардиологии. М. 2002. - с. 15-22.

56. Биохемилюминесценция / Под ред. А.И. Журавлева. М.: Наука, 1983. -345 с.

57. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo / Сборник науч. статей М.: Наука, 1992. - 110 с.

58. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Кинетика жидкофазного окисления дифенилметана при умеренных температурах // Кинетика и катализ. 1996. - Т.37, №4. - С. 542-552.

59. Шарипов Г.Л., Казаков В.П., Толстиков Г. А. Химия и хемилюминесценция 1,2-диоксикетанов. -М.: Наука, 1990. 288 с.

60. Письменский А.В., Психа Б.Л., Харитонов В.В. Кинетическая модель окисляемости метиллинолеата // Нефтехимия. 2000. - Т.40, №2. - С. 123129.

61. Письменский А.В., Психа Б. Л., Харитонов В.В. Механизм и эффективность ингибирующего действия 1,3-ди(4-фениламинофенокси)-2-пропанола и 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола при окислении метиллинолеата // Нефтехимия. 2001. - Т.41, №5. - С. 377-383.

62. Хасанов В.В., Дычко К.А., Рыжова Г.Л. Кинетический метод свободно-радикального окисления сульфит-иона для определения антиоксидантов в биообъектах // Химико-фармацевтический журнал. 2001. - Т.35, №12. -С. 36-37.

63. Афанасьев В.А., Заиков Г.Е. Физические методы в химии. М.: Наука, 1984,- 174 с

64. Сизова Н.В., Веретникова О.Ю., Ефремов А.А. Оценка антиоксидантной активности эфирных масел методом микрокалориметрии // Химия растительного сырья. 2002. - №3. - С. 57-60.

65. Fogliano V., Verde V., Randazzo G., Ritieni A. Method for measuring antioxidant activity and its application to monitoring the antioxidant capacity of wines // Journal Agricultural and Food Chemistry. 1999. - V.47, №3. -P. 1035-1040.

66. Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения / Сборник докладов. -М.: Изд-во РУДН, 2005. 221 с.

67. Benzie I.F., Strain J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP)as a measure of bantioxidant powerQ: the FRAP assay // Analytical Biochemistry. -1996. V.239, №1. - P. 70-76.

68. Moyer R.A., Hummer K.E., Finn C.E., Frei В., Wrolstad R.E. Anthocyanins, phenolics, and antioxidant capacity in diverse small fruits: vaccinium, rubus, and ribes // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002. - V.50, №3. -P. 519-525.

69. Абдуллин И.Ф., Турова E.H., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., ГайсинаГ.Х. Электрогенерированный бром реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов // Заводская лаборатория. - 2002. - Т.68, №9. - С. 12-15.

70. Абдуллин И.Ф., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Интегральная антиоксидантная емкость крови по данными метода гальваностатической кулонометрии // Вестник Татаского отделения Российской экологической академии. 2003. - №3. - С. 35-39.

71. Ziyatdinova G.K., Budnikov Н.С., Pogorel'tzev V.I. Electrochemical determination of the total antioxidant capacity of human plasma // Analytical and Bioanalytical Chemistry. -2005. -V.381, №8. P. 1546-1551.

72. Зиятдинова Г.К. Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов. Дисс. канд. хим. наук. - Казань, 2005. - 187с.

73. Reiter R.J. Melatonin: Lowering the High Price of Free Radicals. News Physiol Sci 2000; 15: 246-250.

74. Шарафутдинова E.H. Потенциометрия в исследовании антиоксидантной активности объектов растительного происхождения. Автореф. дис. канд. хим. наук. Екатеринбург, 2007. - 24с.

75. Chevion S., Berry Е.М., Kitrossky N., Kohen R. Evaluation of plasma low molecular weight antioxidant capacity by cyclic voltammetry // Free Radical Biology And Medicine 1997.- V.22, №6. -P. 411-421.

76. Chevion S., Roberts M.A., Chevion M. The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant capacity // Free Radical Biology And Medicine. -2000. V.28, №6. - P. 860-870

77. Kohen R., Vellaichamy E., Hrbac J., Gati I., Nirosh O., Quantification of the overall reactive oxygen species scavenging capacity of biological fluids and tissues // Free Radical Biology And Medicine 2000. - V.28, №6. - P. 871879.

78. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Новый прибор для определения антиоксидантной активности пищевых продуктов, биологическиактивных добавок, растительных лекарственных экстрактов и напитков // Приборы и автоматизация. 2004. - №11. - С. 45-48.

79. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П., Экспрессный электрохимический метод определения антиоксидантной ативности пищевых продуктов // Пиво и напитки. 2004. - №6. - С. 44-46.

80. Ge В., Lisdat F. Superoxide sensor based on cytochrome С immobilized on mixed-thiol SAM with a new calibration method // Analytica Chimica Acta. -2002. V.454, № 1. - P. 53-64.

81. Бумбер А.А., Корниенко И.В., Профатилова И.А., Внуков В.В., Корниенко И.Е., Гарновский А.Д. Полярографический метод в изучении антиоксидантной активности аминокислот и белков. // Журнал общей химии. 2001. - Т.71, №8. - С. 1387-1390.

82. Громовая В.Ф., Шаповал Г.С., Мионюк И.Е., Луйк А.И. Электрохимическое исследование антиоксидантной активности крови // Журнал обшей химии. 1997. - т.67, № 3. - С. 510-513.

83. Stocks J., Gutteridje J.H., Sharp R., Dormandy T. Assay using brain homogenate for measuring the antioxidant activity of biological fluids// Clin. Sci. Mol. Med. 1974. V.47, (3) .P. 215-222.

84. Г.И. Клебанов, И.В. Бабенкова, Ю.О. Теселкин,/ Оценка антиокислительных свойств плазмы крови с применением желточных липопротеидов// Лабораторное дело.- 1988 №3 - С. 59-62.

85. Blasco A.J. Direct electrochemical sensing and detection of natural antioxidant capacity in vitro systems / A.J. Blasco, A.G. Crevillen, M.C. Gonzalez, A. Escarpa // Electroanalysis 2007. - V. 19, № 2. - P. 2275-2286.

86. Ziyatdinova G.K. The application of coulometry for total antioxidant capacity determination of human blood / G.K. Ziyatdinova, H.C. Budnikov, V.I. Pogorel'tzev, T.S. Ganeev // Talanta 2006. - V. 68, № 3. - P. 800-805.

87. Queiroz Ferreira R. Electrochemical determination of the antioxidant capacity: The Ceric Reducing/Antioxidant Capacity (CRAC) Assay / R. Queiroz Ferreira, L.A. Avaca // Electroanalysis 20078. - V. 20, № 12. - P. 1323-1329.

88. Антропов Л.И. Теоретическая электрохимия. М.: Высшая шлола, 1969.-510 с.

89. Дамьянович А.А. Современные проблемы электрохимии. М.: Мир, 1971.-450 с.

90. Lai М.Е., Bergel A. Electrochemical reduction of oxygen on glassy carbon: catalysis by catalase // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2000. - V.494, № 1. - P. 30-40.

91. Дамаскин Б.Б., Петрий О.А., Цирлина Г.А. Электрохимия. М.: Химия, 2006. - 670с.

92. Короткова Е.И. Закономерности процесса электровосстановления кислорода, осложненного адсорбцией ПАОВ, и их использование в аналитической практике.: Дисс.к-та хим. наук. Томск, 1995. - 242 с.

93. Kuta J., Koryta J. Reduction of oxygen at the mercury electrode // Collect, of Czechoslovak Communications. 1965. - V.30, №12. -P. 4095 - 4110.

94. Тарасевич M.P., Хрущева С.И., Филиновский В.Ю. Вращающийся дисковый электрод с кольцом. М.: Наука, 1987. - 247 с.

95. Замощина Т.А 35 лет изучения фармакологии солей лития // Бюллетень сибирской медицины, Томск (2006). Приложение 2

96. Tamba М., O'Neil P. Redox reactions of thiol free radicals with the antioxidants ascorbate and chlorpromazine: Role in radioprotection // J. Chem. Soc. Perkins Trans. 2.- 1991.-Vol. 11.-P. 1681-1685.

97. Niki E. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals // Am. J. Klin. Nutr.-1991.- Vol. 54.- P. 1119-1124.

98. Методы и средства определения антиоксидантной активности препаратов. Материалы I семинара. / Под ред. Е.Б. Бурлаковой. Москва: ИБХФ, 2005. - 250с.

99. Аврамчик О.А. Закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов и их применение в аналитической практике. Дисс. канд. хим. наук. Томск, 2006. - 176 с.

100. Вторушина A.H. Метод вольтамперометрии в определении антиоксидантных свойств некоторых биологически активных соединений. Дисс. канд. хим. наук. Томск, 2008. - 200 с.

101. Bartoli G.M., Bartoli S., Galeotti Т., Bertoli E. Spectrophotometric study of oxygen radical species generation // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - Vol. G20. - P.205 -211.

102. Turyan Y.I., Gorenbein P., Kohen R. Theory of the oxygen voltammetric electroreduction process in the presence of an antioxidant for estimation of antioxidant activity // J. Electroanalytical Chem. 2004. - Vol. 571, №571. - P. 183-188

103. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа, пер. с польск. М.: Мир, 1974. - 552 с.

104. Шольц Ф. Электроаналитические методы: теория и практика: пер. с англ.; под ред. В.Н. Майстренко. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006. —326 с.

105. Тарасевич М.Р. Обобщенное кинетическое уравнение электровосстановления молекулярного кислорода // Электрохимия. 1981. - Т.17, №8. - С. 1208-1212.

106. Тарасевич М.Р., Бурштейн Р.Х., Радюшкина К.А. Исследование параллельно-последовательных стадий реакций кислорода и перекиси водорода. Восстановление кислорода на платиновом электроде // Электрохимия. 1970. - Т.6, №3. - С. 372-375.

107. Зиятдинова Г.К., Гильметдинова Д.М., Будников Г.К. Реакции супероксиданион-радикала с антиоксидантами и их применение в вольтамерометрии / Журнал аналитической химии, 2005, том 60, №1, с.56-59

108. Эммануэль Н.М. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе. М, 1965.

109. Fridovich I. Superoxide anion radical (02-), superoxide dis-mutases, and related matters. J Biol Chem 1997; 272: 18515-18517.

110. Wolin M.S. Interactions of oxidants with vascular signaling systems. Arterioscler Thromb Vase Biol 2000; 20: 1430-1442.

111. Yang Y., Cheng J.Z., Singhal S.S. et al. Role of glutathione S-trans-ferases in protection against lipid peroxidation. J Biol Chem 2001; 276: 19220-19230.

112. Zhao Y., Wang Z.B., Xu J.X. Effect of cytochrome с on the generation and elimination of 02' and H202 in mitochondria. J Biol Chem 2003; 278: 23562360.

113. Меныцикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибирование радикальных окислительных процессов // Успехи совр. Биологии. 1993. Т. 113. Вып. 4. С 442-455

114. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 томах. Tl. М.: Медицина, 1986, 624 с.

115. О.A. Avramchik, E.I. Korotkova, E.V. Plotnikov, A.N. Lukina, Y.A. Karbainov. Antioxidant and electrochemical properties of calcium and lithium ascorbates.// J. Pharmaceutical and biomedical analysis, v.37, 2005, p. 11491154.

116. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов I-IV групп: справ. Изд. /Под. ред. В.А. Филова и др. JL: Химия, 1988, 512 с.

117. Новиков Д.К., Новикова В.А. Оценка иммунного статуса // Д.К. Новиков, В.А. Новикова, Москва, 1992.

118. Ghiselli A. A fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability / A. Ghiselli, M. Serafmi, G. Maiani, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi // Free Radic. Biol. Med. 1987. - V. 18, № 1. - P. 29-36.

119. Antolovich M., Prenzler P.D., Patsalides E., McDonald S., Robards K. Methods for testing antioxidant activity // Analyst. 2002. - V.127, №. - P. 183-198.

120. M. Б. Фиалко, В. H. Кумок Лекции по планированию эксперимента. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1977.- 131с.

121. С. Н. Саутин Планирование эксперимента в химии и химической технологии.- Л.: Наука, 1975. 48с.

122. Е.И. Короткова. Практикум по планированию и организации эксперимента. Томск: Изд-во ТПУ, 1984.- 97с.

123. Красовский Г.И., Филаретов Г.Ф. Планирование эксперимента. Минск: Изд-во Белорусского ГУ, 1982. - 302 с

124. Bockris J.O'M., Abdu R. A theoretical study of the electrochemical reduction of oxygen // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1998. - V.448, №2-P. 189-204.

125. Мельников В.И. Влияние поверхносто-активных веществ на кинетику катодного восстановления кислорода и коррозию железа в 1н. растворе серной кислоты.: Дисс. .к-та хим. наук. Киев. 1970. - 210с.

126. Schafer F.Q., Buettner R.G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathion disulfide/glutathione couple. Free Radic Biol Med 2001; 30: 1191-1212.

127. Багоцкий B.C., Яблокова И.Е. Механизм электрохимического восстановления перекиси водорода и кислорода на ртутном электроде // Журнал физической химии. 1953. - Т.27, №12. - С. 1663-1667.

128. Радюшкина К.А., Зонина Е.О., Тарасевич М.Р. Электровосстановление кислорода на пирографите в ацетонитрильных растворах // Электрохимия.- 1984. Т.20, №7. - С. 977-980.

129. Cofre P., Sawyer D.T. Electrochemical reduction of dioxigen to perhidroxil (HO 2) in aprotonic solvents that contain Bronsted acids // Analytical Chemistry.- 1986. V.58, №6. - P. 1057-1062.

130. Артемова B.M., Деркулова B.C., Макарова Jl.E. О влиянии некоторых добавок на электровосстановление кислорода в среде ДМФА на твердых электродах // Вопросы химии и химической технологии. 1984. - Т.74, №1. - С. 13-17.

131. Gootsby A.D., Sawyer D.T. Electrochemical reduction of superoxide ion and oxidation of hydroxide ion in dimethyl sulfoxide// Analytical Chemistry. 1968.- V.40, №1. P. 83-86.