Естественное фракционирование изотопов углерода в процессе микробиологической ферментации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

МАТЮШЕНКО Ирина Николаевна

л

ЕСТЕСТВЕННОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ИЗОТОПОВ УГЛЕРОДА В ПРОЦЕССЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ

Специальность 02.00.10. Биоорганическая химия. Химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 1990

Работа выполнена на кафедре неорганической и аналити ческой химии Московской ордена Ленина и ордена Трудовой Красного Знамени сельскохозяйственной академии имен1 К. А. Тимирязева. о

Научные руководители: доктор химических наук, профес сор Д. А. Князев и доктор биологических наук, ведущий науч ный сотрудник ВНИГНИ А. А. Ивлев.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, про фессор М. Н. Монаков и доктор химических наук, тфофессо) В. В. Рачинский.

Ведущая организация — Институт молекулярной генетик] АН СССР.

Защита диссертации состоится «"/т^» . .

1990 г. в « часов на заседанги специализированного со вега 'К-120.35.04 в Московской сельскохозяйственной акадс мии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, Тимирязевская улица, 49 корп. 6. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « . . 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета — доцент

лй'Пл/^/^ П. Апполонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность теш

Развитие промышленного микроблалъного синтеза в СССР с целью производства кормовых добавок и биологически активных веществ требует углубления существующих: представлений о биохимических особенностях бактерий, о регуляции плеточных процессов и о влиянии внесших факторов на биохгадгю и биофизику мет-га. 3 первую очередь эта информация необходима для селекции мутантных штаммов - продуцентов биологически полезных веществ. Получение такой информации - чрезвычайно слонная и трудоемкая задача. Например, изучение метаболических путей требует пркке-нения изотопномеченых соединений, экстракции и очистки ферментов, использования аналогов метаболитов в качестве ингибиторов ферментативных реакций и т.д. Изучение клеточкой регуляции еще более слоЕная задача, решение которой все более основывается на построении и численном анализе шогсмерных нелинейных математических моделей и косвенных экспериментальных данных. Анализ метаболических изотопных эффектов с помощью теоретических моделей, связывающих изотопные характеристики организма с особенностями его метаболизма, позволяет получить новую, принципиально важную информацию о временной организации работы клетки, открывает новый и относительно простой путь изучения механизмов регуляции.. Кроме того, характер внутримолекулярных изотопных распределений метаболитов может быть использован для уточнения отдельных участков метаболических цепей, а изучение изменений изотопного состава СОд дыхания - для контроля функциональных состояний организмов. Эти и другие возможности яс-пользовашш метаболических изотопных эффектов для решения важной практической задачи повышения эффективности микробпального синтеза свидетельствуют об актуальности нашай работы.

Цель тработн заключалась в том, чтобы, экспериментально проворив центральный постулат выбранной теоретической модели (Ивлев, 1985) об определяющей рож изотопных: эффектов дскарбо-кешшрованкя яирувата в распределении изотопов утлерода в клетке, использовать ее для выяснения особенностей синтеза лизина и глутамжновой кислоты у ауксотрофных мутантов Корине-'бактерий, продуцирующих эти аминокислоты, и установить связь между путями синтеза аминокислот, и природой потребляемого субстрата, попытаться выявить биофизические механизмы функционирования клетки.

Для достижения этих целей было необходимо решить следующие методические и научные задачи:

1. Создать и отладить следушдую единую методическую последовательность частей: а) культивирование бактерий, б) выделение аминокислот из хультуралъной жидкости и очистка их от примесей,

в) декарбоксилирование аминокислот с выделением отщепляемой СО2,

г) подготовка образцов к прецизионному изотопному анализу утлерода аминокислоты, ее карбоксильной группы, углерода субстрата и биомассы бактерий, утлерода С02> респирируемого бактериями в процессе культивирования, д) масс-спектрометрическкй изотопный анализ к оценка точности определений. Все методики разрабатывались с учетом требования полноты очистки и химического превращения форм, вытекающего из условия прецизионности.

2. Выявить наличие внутримолекулярных изотопных различий .в аминокислотах, продуцируемых ауксотрофныш мутантами коринебак-терий,

3. Провести эксперименты по выявлению влияния кинетического изотопного эффекта декарбоксилированкя пирувата на внутримолекулярное распределение изотопов утлерода в аминокислотах.

4. Установить связь мевду внутримолекулярными изотопными распределениями аминокислот и путями их биосинтеза, а такке тех

и других с природой потребляемого субстрата.

5. Анатазируя совокупность изотопных данных, в том числе: изотопный состав углерода биомассы, субстрата, аминокислоты и ее карбоксильного углерода, исследовать временную организацию биосинтетических превращений в клеточном цикле коринебактерий.

6. Исследовать динамшсу изменений изотопного состава СС^, выделяемого коринебактерияш в процессе культивирования, и-ее связь с организацией клеточного цикла.

Научная говизна

Впервые экспериментально доказано in. vivo существенное влияние кинетического изотопного эффекта декарбоксшшрованпя шрувата на внутримолекулярное распределение изотопов углерода в аминокислотах.

Впервые в экспериментах in vivo получено подтверздение существования в гликолитической цепи клеток бактерий реципрок-шх колебаний.

Получены новые доказательства связи изотопных распределений метаболитов (аминокислот) с путями их биосинтеза. Обнаружено, что синтез лизина у B.-ftevuirt, E-53I п происходит диашнопнмелиновшл путем с участием глиоксилатного цикла. Получены доказательства интенсивного липпдно-углеводного обмена и функционирования фосфоглюконатного цикла у C.cj¿aia^~'~ ¿сон 3144.

Впервые обнаружено, что у разных бактерий включение экзогенного субстрата в метаболизм может происходить на разных этапах клеточного цикла. У ВE-53I и 3144 включение экзогенного ацетата происходит преимущественно в фазу Гликолиза, у C.gíniaiv^cu^L. E-95-I0 - преимущественно в фазу глюконеогене за.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на конференции научных сотрудников и преподавателей ТСХА (г.Москва, 1988 г.), XII Всесоюзном симпозиуме по стабильным изотопам в геохимии (г.Москва, 1989 г.), И Всесоюзном'совещании по проблеме "Физиологически активные соединения, меченые радиоактивными и стабильными изотопами" (г.Звенигород, 1988 г.), У Всемирном симпозиуме "Изотопы в природе" (г.Лейпциг, 1989 г.)

Публикации по теме диссертации

По результатам работы имеется 8 публикаций.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 456 листах машинописного текста, содержит Л$ таблиц и Л/ рисунков. Состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы из 103кш~ менований.

Содержание работы

Во введении приведено обоснование выбора темы диссертационной работы, ее. актуальность, сформулирована цель и основные положения диссертации.

В литературном обзоре отражено состояние изученности вопроса о фракционировании изотопов углерода в клетках: живых организмов. В первой части обзора рассмотрены результаты экспериментальных исследований. В работе Монсона и Хейеса (Шизы, 1982) установлено чередование изотопнолегких и изотопнотяжелых атомов вдоль углеродного скелета жирных кислот, выделенных из липидной фракции бактерии Е.Ссс< . Авторы связали это распределение изотопов с путями клеточного синтеза жирных кислот, Блейр

п о , ■ ^

и др. ( гл а,,-, _ 1985), изучая распределение изотопов

в клетках Е. <. сИ , выращенных на глюкозе известного изотопного состава, обнаружили аномальное обогащение уксусной кислоты, об-

то

разующеися при сбралсивании глюкозы изотопом С. При этом ее метилькый углерод оказался близким по. изотопному составу к уг-

то

лероду глюкозы, а наблюдаемая обогащенность С оказалась связанной с карбоксильным углеродом кислоты. Авторы объяснили эти различия свойства!®! ферментов, из которых образуется в клетке ацетат. Рассмотрены и друтие работы (^гйслз е1 1984; Захарченко и др., 1989 и т.д.), в которых отмечена связь межкомпонентных и внутримолекулярных распределений изотопов углерода в клетках биомассы с путями биосинтеза метаболитов.

Во второй части обзора проанализировали различные попытки объяснить появление в клетке изотопной гетерогенности С^12 М ^о, ёрз+*;>г , 1977; Галкмов, 1981; ТНспВса., НауЗ , 1982; Ивлев, 1985). Из анализа сделан вывод, что для целей настоящей работы наиболее приемлимой представляется теоретическая модель изотопного фракционирования в клетке, предложенная Ивлевым (1985). Однако необходимо проверить ряд принятых в ней допущений, з том" числе: I) об определяющей роли в механизме распределения изотопов углерода в клетке реакции декарбоксилирования пирувата, 2) о фракционировании изотопов в этой реакции в клетке в условиях исчерпывания фонда субстрата, 3)о связи распределений изотопов в метаболитах с путями их образования и распределением изотопов в продуктах реакции декарбохсллироэания пирувата - ацетил-КЬА ^-фрагментах), остаточном пирувате (Сд--фрагментах) и образующейся при декарбоксилировагаш СС^.

Для решения этих и других задач диссертации необходимы экспериментальные исследования, требующие проведения предварительных методических работ, излагаемых в следующей главе.

Во второй главе (методической) приводятся описание устано-

бок и условий эксперимента, составляющих единую методическую схему, изображенную блок-схемой на рис Д.

Рис* I. Блок-схема экспериментов по изучению изотопной неоднородности углерода различных компонентов микробиальлой системы.

В экспериментах использовали чистые культуры, выделенные вс ВШИ генетики.

Условия культивирования различались в зависимости от задач, которые ставились в эксперименте и выбранных для исследования микроорганизмов.

Б предварительных экспериментах, целью которых было выяснить, проявляется ли фракционирование изотопов углерода в метках гетеротрофных коринебактерий и, если проявляется, то как; культивирование проводили в идентичных условиях на одних и тех

же средах.

Эксперименты по изучению вдагашя природы субстрата па фракционирование изотопов углерода в клетках коринебактерий проводили на срсдах с разлянговля субстратами, используемыми в качестве основных источников потребляемого клеткой углерода.

Составы основных сред и подпиток подробно описаны в работе. Они несколько различались для предварительных и основных экспериментов с учетом вида бактерий. Поддержание рН в процессах и включение подпиток осуществлялось автоматически по сигналу рН-датчика.

Культивирование корпн ебактерий в предварительных экспериментах выполняли в периодическом режиме ка качалочной установке при рН=7,8-8,0; температуре 30+1°С в течение 72 часов.

В опытах с лизшештезирувдаии бактериями культивирование вели в режиме непрерывного хемостатного культивирования па установке "Автоферм-Г'(СССР) во ВНИИ биотехнологии. Процедуру осуществляли при следующих параметрах: скорость аэрации 2,5 л/г/лн; тешература в ферментере 30+1 °С; рН=7,6-7,8.

Культивирование глутаматпродуцирующей бактерии проводили па установке "(СЕЛ) во ВНИИ генетики в периодическом режше

при следующих заданных параметрах: температура 30+1°С, скорость аэращш воздухом 400-420 мл/мин, скорость оборотов мешатиси -900 об/мпн, рН=7,7.

Колбы, ферментеры, все подпитки и среды и т.п. стерилизовали, В ходе всех ферментации контролировали стерильность, концентрацию Сахаров, ацетат-ионов, азота к аминокислот в i-ультуралыюй жидкости (KS) по стандартным методикам. Процесс остмзмвлли после накопления необходимого объема слота KS, соответствующей стационарной фазе роста популяции. Культурачьную жидкость центрифугировали (10000 об/млн) 20-30 мин. Отделяли биомассу, которую несколько раз промывали и шеутшкиш.

Из центркфутата КН выделяли лизин и глутаминовую кислоту колоночной ионообменной хроматографией с использованием катиони-та КУ-2-8 в Н+- и^Н4+-форме и анионита ЭДЗ-ЮП в ^СОСТ-форме, алкировали 2н раствором аммиака. Дополнительную очистку выделенного препарата осуществляли активированным углем в статических условиях, кристаллизацией и перекристаллизацией. Все образцы выделенных аминокислот были хроматографически чистыми, содержали менее 1% примесей гексоз или пентоз (мольный % по углероду), что отвечает требованиям чистоты образца для проведения изотопного анализа углерода.

Декарбоксилирование аминокислот осуществляли на специально созданной установке, состоящей из реактора для- декарбоксилирова-ния, помещаемого в электрическую печь, осушителя влаги, реактора для изотопного уравновешивания и ловушки с жидким азотом. Реактор имеет два штуцера для ввода и вывода газа-носителя, поступающего из баллона, и для ввода воды - растворителя нингидрина,помещаемого в ампулу реактора в качестве реагента.

Процедура декарбоксилироЕания состояла в следующем. В стеклянную ампулу реактора помещали шшгццрин, аминокислоту (^12/1 ' моль/моль), хлористый натрий (для создания высаливающего эффекта в растворе). Подавали газ-носитель гелий со скоростью 10-1.5 мл/ мин, освобсвдали систему от воздуха. Через штуцер в ампулу вводили раствор НИ (^р!1=6,0). На ампулу надвигали печь (¿-Ю0°С) и осуществляли процесс декарбоксилирования в течение 20 мин,при

этом продукт реакции - С0? - вымораживался в ловушке с жидким

: ^В ней,

азотом, которую присоединяли к вакуумной устшювке^углекислий

газ перемораживали в вакууме в ампулу для последующего масс-

спектрометрического анализа углерода.

Твердофазное окисление углерода субстрата, аминокислот и

биомассы выполняли с целью перевода углерода органического ве-

гцества в форму СО2, используемого при изшреикдас на масс-спектрометре. Твердофазное окисление осуществляли в реакторе. Реактор состоит из помещенной в электрическую печь кварцевой трубки, внутри которой находится медная трубка, 'частично заполненная СиД. 3 рабочей зоне реактора *i=700°C; вблизи выхода из реактора, где t^550-G00°C, пошцеиа грляулпроегшиаяг чистпя медь (дая удаалп-вшшя кислорода, частично образующегося при разложения Си0 при высоких температурах, а тачке для разложения закиси азота) и серебряная сетка, которая служит дал улавливания галогенов л серы. Реактор соединялся.с осушителем влаги я ловушкой с яядхям азотом, которую после шкоранивания С0<> лрвсоедашш к вакуумной установке.

Окисление осуществляли следущкм образом. ¥еактор, осуии-телъ и ловупку продувала гелием со скоростью 10-15 ил/кян, освобождая их от воздуха. 3 рабочую зону реактора помещали лодочку со смесью органического вещества и порошковой СмО (1:100 по весу) и вели процесс окпелепгл 15 мин, Затем вшорошшнй углекислый газ освобождали от газа-ноептелл и перекоражшши в вакууме для изотопного анализа углерода.

При изучении изотопного состава СОр дашпга микроорганизмов, образующегося в ходе ферментации, углекислый газ улевклгл-лл, пропуская воздух, выходящий из ферментера через барбатери, заполненные наевднпкм раствором гддроксяда бария. Через кач-дые 12 часов удаляли из барбатера накопившийся осадок карбоната бария и заливали спедий раствор гпдрокецца бария. Лалучатие осад-ici BaCOg сушки, а затек- разлагали в вакууме обезвопгнпей ерто-фосфорной кислотой. Образовавшихся С0? очпк'ляи и собирали в ампул:: для г.лсс-сиг:с?роштрпчес;-:огс> изотопного олтлиза.

Прс;и:зпо;;:иь: алат.? чзотопного состава углерода тгалнлли ;г-з :.;ас':-спо:-:т;;ог.:стре -То С- îTh; т :î-î "1 -J.IAT", Разрешение

прибора 200, точность измерений при определении изотопного состава углерода - 0,15« Прибор оборудован системой регистрации, позволяющей записывать масс-спектр анализируемого газа и определить разницу в величию изотопного отношения мезду образцом и стандартом.

Изотопный состав углерода выражали в $"-единицах, представляющих нормированную разность отношений изотопных концентраций элемента в изучаемом объекте и стандарте

?0 g[flI3/CI2Jo6 -feI3/CI2.]cT х jq3 [c^/C^Jct

В качестве стандарта использовали международный ставдарт л (Cxckâ.^ H., 1957). Точность однократного анализа углерода органических веществ при использовании методики твердофазного окисления составляла 0,3^о при Э5% доверительной вероятности, точность .определения изотопного состава углерода карбоксильных групп аминокислоты при использовании методики декарбоксилировашш - I,2{S» Точность определения изотопного состава С02 дыхания микроорганизмов - 0,4$о.

В третьей главе приведены результаты исследований внутримолекулярной изотопной неоднородности углерода аминокислот, проду-цировашшх коринебактериями, а также изотопного состава углерода биомассы, СОг, дыхания и субстратов.

Вначале изложены результаты проверки теоретического вывода динамической модели изотопного фракционировшпш в клетке (Ивлев A.A., 1985) о наличии в клетках гетеротрофных организмов, в частности, в клетках гетеротрофных бактерий механизма разделения изотопов углерода и связанных с этим механизмом внутримолекулярных изотопных различий в аминокислотах. Исследовались продуценты аш-нокислот - ауксотрофнне мутанты корилебактерпй (табл.1).

Таблица I

Результаты изучения внутримолекулярных изотопных различий в лизине, продуцированном М.Т-3, Б, ^¿йуиътл. Е-531, С, Умг?.^'Е-95-10, к-22, выращенных на сахарозе,

Вид мутантов-продуцентов "З^С субстр = !о С лизина 1 I отч ; о Ссоон ! лизина ¡¿3С=??3Ссоон 1 -с^Собщ

Е-531 а* -19,1 -27,6 -8,5

б -19,1 -26,7 -7,6

//-22 -19,1 -25,5 -0,4

СоГ-95 -17,1 -24,3 -7,2

Т-3 а -20,8 -28,7 -7,9

б -20,8 -28,7 -7,9

а и б - результаты параллельных опытов. В таблице представлены значения среднего арифметического пяти измерений.

Было обнаружено, что в клетках всех изученных муталтных

штаммов коринебактерий происходит фракционирование изотопов уг-

. лерода, выражающееся в изотопной гетерогенности метаболитов, в

частности, лизина (табл.1). Карбоксильная группа последнего сутр

ществешю (до 8,5#о) обогащена изотопом С относительно общего

углерода аминокислоты. При этом общий углерод лизина оказался

таким не по изотопному составу, зсак и углерод питающего субстрату

та. Близость значений С свидетельствует о сходести путей биосинтеза лизина у данных коринебактерий.

Лалее изложены результаты.изучения фракционировать! иоото-

з,

пов углерода лизинсинтезирующими бактерияка Б,р1«1ч Е-531 п С. Б-95-10 при культивировании их на средах с мелас-

сой н ацетатом. При использовании в качестве основного углеродного субстрата мелассы общий углерод обоих бактерий по изотопному составу оказался близким к изотопному составу псу.ояного субстрата (табл.2), а углерод карбоксильной группы оуггетпгач-» обо-12

гащен изотопом С.

Таблица 2

Изменения внутримолекулярных изотопных распределений в аминокислотах, продуцированных коринебактериями при частичной или

полной замене в питающем субстрате мелассы на ацетат -г

; Субстрат Бактерия! £13с I

Амино-ки слота

Общий ¡Карбок-; то .-то углерод, {сильный) Л С=Ь Скарб

Меласса ( а13С=-23,6) -24.8 -31,1 -6,3

Ъ^&хшт Меласса Е-531 (о13С^-23,6) Ацетат (^13С=-31,5) Лизин -29,7 -31,2 -2,7

Меласса ( ^13С=-23,6) -24.4 -32,7 -8,2

Меласса т^сяи/и. ( £13С=-23,6) Е-95-10 Ацетат ( С=-31,5) Лизин -30,0 -37,8 -7,8

Ацетат (^ С=~31.5) -32.4 -37,9 -5,5

Меласса Глута-шко-вая кислота -28,0 -20,6 +7,4

Ацетат 3144 (1Р3С=-32,2) -26,7 -29,4 -2,7

^Цифровые значения есть среднее трех параллельных измерений.

Добавление к мелассе ацетата привело в случае к резкому обогащению общего углерода лизина легким изотопом ( 5,1Я по отношению к мелассйо-ацетатному субстрату и значите;! ному уменьшению внутримолекулярных изотопных различий углерод лизина с -€,3 до В случае С.^^ич^и-п Е-95-10 доба

ка ацетата привела приблизительно к такому -т.е обогзщсштю общ(

то

углерода лизина изотопом С, но внутримолекулярные изотопные различия в лизине уменьшились незначительно.

Штамм С.з^ли-исииа Е-95-10 мо:;;ет расти на ацетатной 'среде. 'При использовании его в качество основного источника углерода дабладалп уменьыенле влутр:гмолекуляршге изотопных различий в лпз!ше с -7,8 до -5,5^о при одновременном обогащении общего углерода лизина легким изотопом (табл.2).

Результаты изучения фракционировагаш изотопов углерода глу-таматпродуцкруищпм штаммом С.^^и/иГсхи-и. 3144 при культивировании его на мелассной и ацетатной средах показали следующее. При использовании в качестве основного углеродного субстрата мелассы наблюдаюсь обогащение карбоксильной группы глутаминовой зсис-13-

лоты изотопом С по отношению к общему углероду аминокислоты ( на 1,А%о), который п свою очередь оказался существенно обогащенным легки.! изотопом по отношению к углероду субстрата (табл.2).

При переходе к среде с ацетатом в качестве основного углеродного субстрата имело место радикальное изменение распределения изотопов углерода в глутаминовой кислоте. Карбоксильный углерод кислоты из изотопнотякелого становился изотопнолегкпм, а углерод аминокислоты обогатился.тяжелым изотопом по отношение к углероду субстрата - ацетата.

Тагсгм образом, полученные нами результаты показывают, что смена источника С2-фраплентоз (продуктов реакции декарбоксили-ровачия ппрувата на экзогенный ацетат) вызывает измените изотопного состава и распределения изотопов углерода з аминокислотах (лизине и глутаминовой кислоте), которое, как мы увидим далее, предсказывает теория.

При культивировании С.<|Сь?и"ч*с.....3144 изучали также динамику изменения изотопного состава углерода выдыхаемой С02 в разные фа31! песта . Отметили, что динамика изменений разная при культлпкропанпп оакгер::!; на мелассе и ацетате. Общее в том что

на протяжении всех фаз роста выдыхаемый углекислый газ оставал-

12

ся значительно обогащенным С по сравнению с углеродом биомассы (¡?3С=-21,5^о в мелассном процессе и -2&,3%о - в ацетатном) и субстратов мелассы=-21,5/йО, 1?3Сацетата=-32,2), колеблясь

от -30,05»о до -42,3%о в мелассном процессе и от -41,75?о до -50,3 %о - в ацетатном.

В четвертой главе обсуздаются результаты исследований фракционирования изотопов углерода коркнебактериягш и приводятся соответствующие выводы.

В начале кратко изложена теоретическая модель, в соответствии с которой изотопное фракционирование углерода в клетке в основном происходит в реакции декарбоксилировашм пирувата на фоне постоянно происходящих в гликолитической цепи клетки реципрокных колебаний, состоящих из фазы гликолиза и фазы клюконеогенеза. Фракционирование изотопов углерода возншсает в фазу гликолиза в решает декарбокешшрованкя пирувата, которой завершается глико-литическая цепь, Кинетический изотопный эффект определяет изотопное распределение и состав продуктов реакции - С2~фрагментов и С02, а такке остаточного пирувата (Сд-фрагментов), которые в этот, смысле можно такие рассматривать как продукт реакции В силу спе-цкфики природы юпштического изотопного эффекта в ходе реакции сдвиг в изотопном составе испытывают только те атомы, которые находятся на концах рвущейся углеродной связи. Это углерод С02, карбонильный атом С2-фрагментов, а также карбоксильный и смежный с ним атом углерода Сд-йрагментов. Остальные атомы углерода в продуктах реакции сохраняют свой первоначальный изотопный состав. В нестационарных условиях с исчерпыванием фонда пирувата изотопный состав продуктов меняется, прогрессивно обогащаясь тянелым изотопом, но оставаясь друг по отиопошвз к другу в постоянных соотноаенилх, опродедае'.кх рагугтгеяяп покатак? скоростей рсак-

дни изотопных форм молекул пирувата. При этом утлерод СОо и карбонильный атом С2-фрап.?ента при малых степенях превращения (Г*^ 0,5) будет всегда обогащен легким изотопом по сравнению с ме-тильным (при равенстве исходного изотопного состава этих атомов). Вел5тчина обогащения с ростом степени превращения будет уменьшаться до 0 и при степенях превращения, больших 0,5, знак различия изменится, а карбонильный атом углерода начнет экспоненциально обогащаться тяжелим изотопом по отношению к метальному. Изотопный состав отщепляемой С02 меняется также, как и 1сарбонилышй атом С2-фрагментов. В Сдфрагментах, начиная с малых степеней

превращения, карбоксильный и смежный с ним карбонильный атом

13

всегда обогащены изотопом С относительно метильного атома.Различия между ними будут непрерывно возрастать с ростом степени превращения фонда пирувата. Таим образом, даже построенные из одинаковых фрагментов метаболиты могут различаться по изотопному составу углерода, если фрагменты синтезированы при разных степенях превращения пируватного фонда.

Далее- рассмотрены доказательства в пользу основного постулата динамической модели. Основной постулат изложенной модели -связь изотопных распределений метаболитов с изотопными эффекта-, ми в реакции декарбоксилирования пирувата - можно проверить,заблокировав реакцию декарбоксилирования пирувата путем замены основного углеродного субстрата углеводной природы - мелассы, метаболизкруемой через гликолптпческую цепь, на ацетат - продукт реакщш декарбоксилирования пирувата. Результаты проведенных наш экспериментов показывают, что добавление ацетата к мелассе приводит в случае лизинсинтезирующей бактерии Е-531 к розному, в случав Е-95-10 - незначитель-

ному изменению внутримолекулярных изотопных разлитой углерода в лизине. Однако переход к культивации последней на ацетате уже заметно уменшает изотопные различия но сравнению с культива-

дней на мелассе. В случае глртакатпродуцирувщего штаг.тта С.уЬ-Ж* »»«•• сгичз144 переход с мелассы на ацетат правел к изменению знака внутримолекулярных изотопных различий п глутаминовой кислоте.

Таким образом, результаты экспериментов совершенно ясно об-наругжвают связь внутримолекулярных изотопных различий в лизине и глут актовой кислоте, продуцируемых корипебактериями, с изотопным эффектом декарбокииглровапия гшрувата. С учетом того, что ранее была обнаружена связь с этик эффектом изотопных распределений в ааршх кислотах (1)кп$сп, //¿.^5 , 1982) и изотопного состава углерода липкдной фракции (л'е ¿-рзК-ч, 1977), биосинтез которых связывает с биосинтезом рассмотренных аминокислот только использование продуктов реакции декарбоксилкроваппя пиру-вата, коглю заключить, что изотопный аффект дисарбоксплярования ппрувата - основной узел изотопного фракционирования углерода в клетках изученных бактерий.

Получены косвенные аргументы в пользу колебательного характера метаболизма углерода в клетках бактерий. Било обнаружено, что добавка ацетата к мелассе в случае С.'<■<■•■». Б-95-10 не приводит к заметному изменению изотопных различи!; в лизине. В •рамках иакоаенной модели ого вполне объяснимо и указывает па предполагаемое существование • в клетке рсцяпрошшх колебаний (Сель-ков Е.Е., 1978). В самом деле, представив, что в клетке С.^.Ли»« сит Е-95-10 осноЕная часть ацетатного субстрата потребляется в фазу глюконеогенеза, легко понять, что в этом случае вкачало происходит ресинтез углеводов, которые затем в фазу гликолиза претерпевают последовательные превращения в гликолктической цепи, заканчивающиеся реакцией декарбоксилкроваппя пкрувата. Продукты этой реакции Сз-фрагглеоты, обогащенные легким изотопом 12С в силу юшетического изотопного эффекта, превращаются через гли-оксилатный цикл в оксалоацетат, который долее утилизируется дп-ашшопимелкновым путем с образованием лизина, углерод карбеж-

ильной группы которого оказывается, таким образом, существенно

егче по изотопному составу общего углерода щ.тппокпслоты. ПодоХ 3

верждение этому видно и'в том, что биомасса бактерии (8 С «= 6,3^о) и общий углерод лизгата (табл.2) обогащаются легким изо-опом почти до уровня ацетата, что свидетельствует об интенсивом потреблении бактерией ацетата в мелассно-ацетатном процессе.

При переходе С.^¿Лл^чи^ Е-95-10 на потребление только аце-ата в ацетатном процессе внутримолекулярные различия снижаются, то указывает на то, что заметная часть ацетата начинает потреб-яться бактерией в фазу гликолиза.

В случае В,|£и'а;-.,Е-531 резкое снижение внутримолекулярных азл1гчик в лизине при добавке ацетата к мелассе свидетельетву-т о том, чю этот штамм' потребляет ацетат главным образом в фа-у гликолиза.

Далее обсуждена связь изотопных распределений в амннокис-отах, продуцируемцх коршшбактериями, с путями их биосинтеза, а примере лизгасинтезирующих бактерий В,-/^*^. Е-531 и С.^¿^¿и«'-№ Е-95-10 рассмотрены возможные пути биосинтеза лизина у этих гаммов в соответствии с теоретическими представлениями динами-зской модели на основе полученных результатов изотопного аиа-яза углерода и с .учетом известных из литературы сведений о ме-аболизме данных коринебактерий.

Обогащенность легким изотопом карбоксильного углерода ли-дга, продуцируемого Е-531 и С.^ОиЫшсип,Е-95-10 в ме~

ассном процессе (табл.2), дает основание полагать, что этот уг-зрод унаследован от карбоксильного углерода С^-фрагментов, ко-эрые поступают в глиоксклатний цикл (ферменты этого цикла об-аружены у изучаемых бактерий (Рубан Е.Л. и др., 1968)). Продукт

то

шт - оксалоацетат с карбоксильными группами, обогащенными С, этаболпзируется по диаминопимелкновому пути, ферменты которого данных бактерпй обнаружены ранее (МчС'а^^в- К 1976), предло-

гезпгый путь долкен привести к наблюдаемому распределению изотопов углерода в лизине.

Полученные в мслассно-ацетатном процсссс результаты ето трактовать следующим образом. Ацетат при активации образует аце-ткя-КоЛ, который входит в глпокенлатннй цикл. Продуктом цикла является сугасшат, который, превращаясь в оксалоацетат, далее утилизируется диагамопшелинови« путем. Описанная последовательность превращений соответствует фазе гликолиза. В то ке время сохранение небольших изотопных различий в лизине в том де процессе (табл.2),по-вздкмому, указывает на то, что другая часть лизина синтезируется В,^■!<.<>•.! Е-531 из Сз-фрагконтов, юлеицпх "легкую" карбоксильную группу, т.с.образующихся при декарбокси-лировашж пирувата. Исходным субстратом для них служит меласса, метаболизируемая через глиоксилатную цепь.

У С.^^^-^^Е-Эб-Ю сохранение значительных изотопных различий в лиз1ше в мелассно-ацетатном процессе означает, что экзогенный ацетат, презде чем включиться в биосинтез лизина,расходуется на синтез углеводов (фаза глюконеогенеза), которые ме-табсушзирутгся' в гликолиткческок цепи, где после ряда превраще-

,1шй происходит декарбоксилировшше пирувата и появляются Сд-фраг-Т2

менты, обогащенные С по карбонильному атому. Весь дальнейший синтез лизина аналогичен толу, который рассмотрен для мелассно-го процесса, включая синтез оксалоацетата через глиоксплатный цикл.

Факт сохранения значительных внутримолекулярных различий в лкзкнв, продуцированном С,^Лам«'е«!»<Е-95-10 на ацетатной средо, свидетельствует о том, что часть экзогенного ацетата утилизируется в фазе глюконеогенеза, как и в рассмотренном выше мелассно-ацетатном процессе. В то ?/.с время снижение, величины внутримолекулярных изотопных раалпчтгй в лизине в ацетатном процессе показывает, что другая часть экзогенного ацетата в фазу гликолиза

через глпоксллатний цикл иояет быть непосредственно использовала та огаггоэ лпззиа, как ото опасаю вше для В.т^'^^В-бЗ! в ислас-зно-ацетатноп процессе.

На примере глутэлатпродуцирувдей бшетерш! С.¡^</""-^■«>'"3144 1ан анализ возмояшх щггей биосинтеза глуташновой кислоты. Каб-ендаемая обогащешгостъ карбоксильного углерода глутагшюпой кис-тати, продуцированной С.ьЛ.ьцЗШ в мелассном процессе, от-юентельно ее общего углерода с учетом известных путей биосинтеза допускает три возмояпости возникновешш подобного распределе-шя. Их анализ показшзает, что в клетках С.^йинЯ-«»., 3144, по-зкдшому, происходит синтез глутам:шовой кислоты с использованием з качестве исходных субстратов пирувата, образующегося при гллко-пгзе, п продуктов ого декарбоксилироЕания через цикл Кребса.При-шм синтез глуташтовой кислоты протекает при высоких степенях феврацения пируватного фонда.

Анализ результатов по изотопному составу СОд дыхания С.^^л-<п1>ч 3144 также свидетельствует в пользу рассмотренного дута син-■еза.

Изменение знака внутршолекулярных изотопных различий в глу-'аыпновой кислоте при замене мелассного субстрата н а ацетатный и :арактер ее изотопного распределения свидетельствует о смене пу-•и синтеза глутшжновой кислота. Вероятный путь синтеза кислоты ; ацетатном процессе состоит в использовании экзогенного ацетата утей непосредственного включения С2-фрагментоз в синтез агяшо-ислотп через глкоксклатннй цикл в фазу гл1иолиза с образованием «трата, а затем о>кето-'тлутарата, из которого синтезируется глу-а'.тнковал кислота, На зто указывает и характер изменения изотоп-ого состава общего углерода аминокислоты относительно углерода убстрата.

Липли:; данных изотопного состава углерода СО2 дыхания при-

водит к выводу, что очень большое (свыше 20%о) обогащение вццы хаемой СОд легким изотопом относительно субстрата (в обеих фер ментадкях) вполне может быть объяснено фракционированием изото пов в реакции декарбоксилированпя при малых степенях превращен фонда субстрата. Резкое изменение изотопного состава углерода СО2 дыхания С.13144, наблюдаемое в ходе ферментации при использовании смеси субстратов, показывает, что изотопный состав вцдыхаемой СО2 макет служить простым и надежным средств! контроля за динамикой потребления различных субстратов из сложных питательных сред.

ВЫВОДЫ

1. Получено экспериментальное доказательство того, что в кле1 как аэробных: гетеротрофных коринебактерий, как и в большинстве ранее изученных микроорганизмов, кинетические изотопные эффекты декарбоксилированпя пирувата играют определяющую роль в распред( лешш изотопов утлерода.

2. Совместный анализ изотопных распределений метаболитов,изотопных различий углерода биомассы, С02 дыхания, субстратов свидетельствуют в пользу теоретического постулата о существовании ■в гликолитической .цепи клетки коринебактерий рецгшрокных колеба-1шй, выражающихся в изменении направления потока углеродных субстратов в фазу гликолиза и глюконеогенеза.

3. Обнаружено, что смена субстратов вызывает адаптацию бактерий в виде изменения метаболических путей утилизации углерода и биосинтеза метаболитов.

4. У исследованных коринебактерий установлены следующие метаболические особенности.

Синтез лизина в клетках Е-531 и

происходит диамиюпикелшювым путем с участием глноксилатного цикла, посредством которого синтезируется ключевой интермеднат

диамгаюпимелинового пути - оксалоацетат.

Источником С^-фрагментов, питащик глиоксклатный цикл, являются: I) мсласса, метаболизирутощаяся через гликолитическую цепь, оканчивающейся синтезом Cg-cJparMemoB в реакции декарбокснлиро-вания пирувата, и 2) экзогенный ацетат, который включается в метаболизм через глиокоилапшй цикл преимущеетвешю в фазу гликолиза В случае В. ^м'ит E-53I и преимущественно в фазу глюконео-гепеза в случае С.^iufa^cu^ E-95-I0.

Сжтез глутаминовой кислоты в клетках про-

исходит: I) через цикл Кребса, который питается шруватом и продуктами его декарбоксилирования, и 2) через глиоксилатний цикл, который питается Сз-фрагментш. Первый путь реализуется при утилизации субстратов углеводной природы (мелассы), второй - при утилизации экзогенного ацетата в фазу гликолиза.

Б клетках C,g.Ä.ciatw'w-ini.3I44 происходит интенсивный липид-но-углеводный обмен, а глюкоза ресиитеза, которая образуется в глюконеогенезе, подвергается частичному окислешш в фосфоглюко-натном цикле.

5. Изотопный состав углерода СС>2 дыхания С.^"^ли-м'«о-и3144

существенно отлетается от изотопного состава углерода утилизяру-

12

емого субстрата в сторону обогащения С и зависит от его природы. Утилизация углерода из смеси субстратов происходит селективно. Зри этом смена одного субстрата другим, с отличающимся изотопным составом утлерода, вызывает соответствующее изменение в изотопном составе углерода выдыхаемой COg.

; Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Валуев D.H., Есиков А.Д., Ивлев A.A., Князев Д.А., Матнаен-

ТО ТО

iO И.Н. Распределение изотопов углерода С/в лизине лизинсин-гег1фуидас бактерий // Биотехнология. Т.5. 4. С.434.

2. Валуев В.П., Мвлев A.A., Есиков Д.А., Князев Д.А., Маиошен-

ijo И.H. Исследование процесса биосинтеза лизина с помощью метода метаболических изотопных эффектов углерода // Сборник научных трудов ВНИИбиотехнология. 1990. 712. С,

3. Ивлев A.A., Есиков А.Д., Князев Д.А., Матюшенко И.Н. Фракционирование изотопов, углерода в процессе микробиальной ферментации. Деп.во.ВНШЖТИ JS 0289.0011753 (5.01.1989).

4. Ивлев A.A., Есиков А.Д., Князев Д.А., Матюшенко И.Н. Связь между распределением изотопов утлерода в лизине и путями его синтеза в 3ibvïi?acietiuw -fôxi/uiA,, и Coryvcéacterium

// Микробиология. 1990. Т. 'ТУ. С. 373 - 3SZ,

5. Ивлев A.A., Князев Д.А., Есиков А.Д., Матюшенко И.Н. Использование метаболических изотопных эффектов в исследованиях биологических систем // П Всесоюзное совещание по проблеме "Физиологически активные соединения, меченые радиоактивными и стабильными изотопами". Тезисы докл. - Звенигород, 1988.

6. Ивлев A.A., Князев Д.А., Есиков А.Д., Матюшенко И.Н. Использование метаболических изотопных эффектов утлерода в исследованиях биологических систем // Всесоюзная конференция по стабильным изотопам в геохимии. Тезисы докл. M. 1989.

7. Ивлев A.A..Князев Д.А., Матюшенко И.Н., Есиков А.Д., Ба~ лкцкая P.M., Кузнецова H.H. Связь мезду распределением изотопов углерода в глутаминовой кислоте и путями ее биосинтеза Coryneéaciety-uw ßu^ocpa^ci^ia, i39<P. T. 3£Г.

Q.Mev <4.A, K^aïev Yeiïfav Л.%, ТПа+уихМо J. M

Fr<xctiona4t'on. of- catoon i?o-jopes In wUctpêiaC processes J/ Proc. <Ц -the Worlin « JUee-bng ISOTOPES MATVR.E. -leipXia f 1982,