Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae

Зибарева, Лариса Николаевна

Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Зибарева, Лариса Николаевна АВТОР

доктора химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Томск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2003 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae»

Автореферат диссертации на тему "Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae"

На правах рукописи

ЗИБАРЕВА ЛАРИСА НИКОЛАЕВНА

ФИТОЭКДИСТЕРОИДЫ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА С А Л УОРНУЬЬА СЕАЕ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Новосибирск - 2003

[

Работа выполнена в лаборатории фитохимии Сибирского ботанического сада Томского государственного университета, г.Томск

Официальные оппоненты:

профессор, д.х.н., Ткачев Алексей Васильевич профессор, д.х.н., Юсубов Мехман Сулейманович д.б.н., Высочина Галина Ивановна

Ведущая организация: Институт химии СО РАН, г. Иркутск

Защита состоится (<Л^/у> 2003 г. в ■/Р ^асов на засе-

дании диссертационного совета Д 00^.045.01 при Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г. Ново-сибирск-90, пр. акад. Лаврентьева 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

Автореферат разослан « /Ш'/^ЖООЗ г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук ^¡РФедорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Экдистероиды представляют собой полигид-роксилированные стерины с характерными особенностями структуры: цис- сочленив А/В циклов, наличие 14а-гидрокси-А7-6-кетонной группировки и гидроксильных групп как в стероидной части, так и боковой цепи молекулы. Являясь структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоза насекомых, эти соединения широко распространены в растительном мире. К настоящему времени выделено более 250 экдисте-роидов, в том числе 150 растительного происхождения. Наряду со свободными экдистероидами с 19С, 21С, 27С, 28С и 29С из растений выделены и производные, включая гликозиды и сложные эфиры с высшими жирными кислотами.

Исследования последних лет свидетельствуют о существовании двух главных гипотез в отношении значения экдистероидов в онтогенезе растений: защитной и гормональной. Наиболее убедительные доказательства приводятся в пользу детеррентной функции при взаимодействии с неадаптированными беспозвоночными фитофагами, однако получены данные, указывающие на выполнение ими и физиологической роли в онтогенезе растительного организма.

Способность растений синтезировать соединения, нарушающие жизнедеятельность насекомых-фитофагов и нетоксичные для млекопитающих, открывает возможности для разработки новых биологических методов борьбы с вредителями и получения более устойчивых сортов растений. Фитоэкдистероиды являются основой препаратов (экдистен, Cytodyne, Ecdybol, Power Health, Macamor, Z-mass и др.) анаболического, адаптогенного, тонизирующего действий. Растительные объекты по содержанию и разнообразию качественного состава экдистероидов являются предпочтительными источниками для получения чистых соединений, а также различных субстанций, их содержащих.

Известно, что Caryophyllaceae является одним из богатых экдистеро-идсодержащих семейств мировой флоры и характеризуется большим разнообразием химических структур фитоэкдистероидов. Вероятность нахождения новых источников и новых стероидных соединений в нем весьма велика.

Цель работы - поиск доступных и перспективных в химическом отношении экдистероидсодержащих растений семейства Caryophyllaceae, способных служить основой для создания препаратов анаболического, радиопротекторного, противоопухолевого, антифунгального и геморео-логического действия.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

Задачи исследования: - разработать быстрый способ обнаружения и количественного определения фитоэкдистероидов в растительных объектах;

- изучить их распространение в семействе Caryophyllaceae;

- выявить наиболее перспективную по содержанию и составу экди-стероидов группу растений;

- исследовать химический состав экдистероидов в перспективных видах Caryophyllaceae-,

- выявить закономерности распределения экдистероидов в процессе развития, влияния интродукции и систематического положения видов родов Silene, Lychnis-,

- определить биологическую активность экстрактов экдистероид-содержащих растений, выделенных фракций и индивидуальных фитоэкдистероидов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная стратегия скрининга позволяет прогнозировать присутствие/отсутствие фитоэкдистероидов в растениях на основе предварительного хроматографического анализа экстрактов семян.

2. Род Silene L. - богатейший экдистероидсодержащий род мировой флоры.

3. Физиологически активные вещества Lychnis chalcedonica L. - основа для создания эффективных препаратов антифунгального, радиопротекторного, противоопухолевого и гемореологического действия.

Научная новизна. Разработана стратегия скрининга флоры на присутствие экдистероидов на основании предварительного хроматографического анализа экстрактов семян, позволяющая сделать заключение о способности растений их синтезировать и провести крупномасштабное изучение распространения экдистероидов в мировой флоре. Проанализировано более 400 видов порядка Caryophyllales, включая 266 видов семейства Caryophyllaceae, принадлежащих 28 родам. Достоверность результатов по выявлению экдистероидсодержащих видов подтверждена радиоиммунным анализом (РИА), биотестированием на культурах клеток Drosophila melanogaster и высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Обнаружено 95 новых экдистероидсодержащих видов сем. Caryophyllaceae, включая 8 видов рода Lychnis L. и 75 видов Silene L. Впервые роды Melandrium Roehl, Petrocoptis A.Braun предложены в качестве источников экдистероидов.

Определен химический состав экдистероидов 14 видов семейства Caryophyllaceae: 12 видов рода Silene и 2 видов Lychnis L. Выделено и

идентифицировано 19 известных и 3 новых фитоэкдистероида: 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон, 2-дезоксиэкдизон 22р-о-гликозид и 2-дезоксиполиподин В Зр-э-гликозид, химическое строение которых предложено на основании спектральных (ИК-, УФ-, масс-, ЯМР 'Н и 13С) и ВЭЖХ данных.

Выявлены основные закономерности распространения экдистероидов в роде Silene и проведено хемотаксономическое изучение секций этого рода.

г Впервые выявлены противогрибковая, радиопротекторная, геморео-

логическая, противоопухолевая активность экстрактов и изолированных из них фракций Lychnis chalcedonica и других растений. Установлено, » что экдистерон проявляет гемореологическое и радиопротекторное, а

полиподин В - антифунгальное действие.

Практическая значимость. Разработан способ обнаружения фито-экдистероидов, способствующий быстрому скринингу мировой флоры и надежному прогнозированию наличия их в растениях. Среди 95 новых растительных источников экдистероидов обнаружено 26 видов с высоким содержанием экдистероидов.

Изучено распределение 20-гидроксиэкдизона в процессе развития 19 видов, выявлены органы с наибольшим содержанием и вкладом в общее количество экдистероидов, установлены сроки сбора растительного сырья (фенофазы, возраст растений). Показано, что введение экдистеро-идсодержащих растений в культуру приводит к увеличению уровня экдистероидов в семенах и растениях.

Разработан способ получения эффективного средства противогрибкового действия на основе Lychnis chalcedonica, защищенный патентом РФ. Проведен подбор оптимального растворителя и условий экстракции. Выявлены биологически активные вещества, включая и экдистероиды, проявляющие фунгистатическое действие в отношении поверхностных дерматофитов. Показано, что спиртовый экстракт лихниса халцедонско-го и выделенный из него индивидуальный 20-гидроксиэкдизок обладают противолучевой активностью, заметно увеличивая среднюю продолжительность жизни облученных крыс.

Установлено, что экдистероидсодержащие растения могут являться эффективными корректорами синдрома повышенной вязкости крови на моделях сердечно-сосудистых заболеваний. Этанольный экстракт Lychnis chalcedonica, а также выделенные из него бутанольная, этилаце-татная фракции, 20-гидроксиэкдизон проявляют гемореологическое действие. Разработаны гемореологические средства и способ их получе-! ния, защищенные патентами РФ.

Выявлена неизвестная ранее противоопухолевая активность Lychnis chalcedonica и S.viridiflora.

В результате проведенных химических и фармакологических исследований открывается возможность создания оригинального комплексного лечебного препарата анаболического, радиопротекторного, противоопухолевого, антифунгального и гемореологического действия на основе Lychnis chalcedonica.

Работа выполнена в фитохимической лаборатории Сибирского ботанического сада Томского государственного университета (Сиб БС ТГУ) в период с 1986 по 2002 год. Экспериментальная часть по выделению и идентификации экдистероидов проведена в лабораториях фитохимии Сиб БС ТГУ и химии гликозидов Института химии растительных веществ АН Узбекистана (г. Ташкент).

Научные консультации по идентификации и исследованию закономерностей содержания экдистероидов рода Lychnis осуществлялись член-корреспондентом АН Узбекистана, д.х.н. Абубакировым Н.К., за что автор ему очень признателен.

Радиоиммунный анализ, биотесты на агонистическую и антагонистическую активности, проведены совместно с доктором Лоуренсом Дайне-ном (Эксетерский университет, Великобритания). Установление новых структур экдистероидов, а также ВЭЖХ разделение экстрактов растений рода Silene осуществлено совместно с профессором Рене Лафоном (Университет Пьера и Мари Кюри, Париж, Франция).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Сибирского ботанического сада Томского госуниверситета и комплексными исследованиями по теме гранта РФФИ (1998-2000 гг.), международного проекта INTAS (1998-2000 гг.). Результаты исследований, являясь частью комплексной темы, отмечены премией Правительства РФ за 2000 г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 23 конференциях и симпозиумах: 2-х всесоюзных, 10 российских и 11 международных, в том числе на Всесоюзной конференции "Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока" (Томск, 1986, 1989), 8* Danube Symposium on chromatography (Warsaw, 1991), Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды" (Томск, 1995), 10th International Symposium "Advances and applications of Chromatography in Industry" (Bratislava, 1996), 5-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998), Всероссийском симпозиуме по теории хроматографии и электрофореза, посвященного 95-летию открытия хрома-

тографии М.С.Цветом (Москва, 1998), 23rd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC, 99 (Granada-Spain, 1999), международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств..." (Томск, 2000), ХШ - XV International Ecdysone Workshops (Jena, Germany - 1998; Rap-perswil, Switzerland - 2000; Kolymbari, Greece - 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 статьи, 17 тезисов докладов, получено 4 патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и 5 приложений. Работа изложена на 247 страницах, иллюстрирована 35 рисунками и 35 таблицами. Список цитируемой литературы включает 225 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I содержит литературный обзор о разнообразии химических структур и распространении фитоэкдистероидов в растениях мировой флоры, семейства Caryophyllaceae, значении их для растений. Данные по распространению экдистероидов в порядке Caryophyllales сведены в таблицу, включающую известные и собственные экспериментальные данные. Обосновано положение о наибольшей встречаемости экдистероидов в роде Silene. В главах II, III, IV, V представлены результаты наших исследований.

Поиск новых экдистероидсодержащих видов семейства Caryophyllaceae

Тесная связь многих фундаментальных проблем с выявлением все новых экдистероидсодержащих видов, а также то, что фитоэвдистерои-ды обладают широким спектром биологической активности, который постоянно пополняется, побуждает исследователей активизировать их поиск.

С целью ускорения поиска продуцентов экдистероидов нами разработан способ быстрого обнаружения этих соединений, защищенный патентом РФ. Новизна его заключается в том, что в качестве объектов анализа используются семена, что обусловлено рядом причин: 1) высокое содержание экдистероидов, вследствие чего возможно использование малых навесок семян; 2) высокая чистота нативного экстракта семян, исключающая необходимость его очистки от сопутствующих ве-

ществ; 3) делектусный обмен семенами между ботаническими садами мира позволяет привлечь семенной материал мировой флоры, что ускоряет и расширяет возможности скрининга; 4) анализ экстрактов семян предваряет и определяет необходимость выращивания из них растений в качестве источников фитоэкдистероидов; 5) предварительный анализ семян способствует сохранению популяций растений в природе; 6) для анализа экстрактов семян применяются экспрессные методы - различные виды хроматографии (ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ). Использование предлагаемого способа позволяет существенно ускорить проведение всех стадий анализа экстрактов и заметно снизить расход экстрагента и раст-ворите-лей.

В процессе многолетнего эксперимента было установлено, что наблюдается четкая корреляция между присутствием или отсутствием фитоэкдистероидов в семенах и выращенных из них растениях как семейства Caryophyllaceae - родов Lychnis L., Silene L., Petrocoptis A.Braun., Sagina L., Saponaria L., Melandrium Roehl., так и Chenopodia-ceae (Chenopodium L.), Asteraceae (Serratula L., Rhaponticum Ludw.) и других. Этот вывод был сделан как на примере однолетних, двулетних, так и многолетних видов растений. Было показано, что по низкому уровню экдистероидов в семенах однолетних видов можно прогнозировать невысокое содержание их в надземной части, тогда как в многолетних видах семена с низким содержанием обусловливают возрастающие концентрации в растениях с возрастом. Применение нового подхода к поиску продуцентов фитоэкдистероидов дает возможность прогнозировать синтез искомых соединений в растениях и сделать заключение о целесообразности введения в культуру их в качестве объектов для выделения стероидных соединений на основании предварительного обнаружения в экстрактах семян. Дальнейшие исследования биотестированием и радиоиммунным методом 58 видов (80 образцов), выращенных из семян, присутствие экдистероидов в которых было предварительно обнаружено хроматоспектрофотометрическим методом, подтвердили правильность предложенной стратегии (табл. 1).

Использование разработанного нами способа позволило проанализировать семена более 400 видов растений, в том числе 152 видов рода Silene. Благодаря экспрессности способа удалось выявить 115 экдистеро-идсодержащих видов семейства Caryophyllaceae в том числе 95 новых: Silene - 91, из них впервые в 75, Lychnis - 12 и 8 (соответственно), Petrocoptis и Saponaria по 2 новых, Sagina - 4 новых и впервые два рода, виды которых способны также синтезировать экдистероиды - Melandrium, Petrocoptis. В процессе скрининга установлена наибольшая встре-

Таблица 1

Результаты анализа растений семейства Caryophyllaceae на содержание экдистероидов

Вид растений Фено- Часть ХСФ РИА Биотест на

фаза растений анализ DBL-1 агонисты

Lychnis haageana бут н.часть 0.2 1080 +++-

Lychnis kiusiana ЦВ н.часть 0.1 686.8 +++-

Petrocoptis pyrenaica ЦВ н.часть 0.2 198.9 С+-

P. glaucifolia вег листья 0.1 140.8 ++-

Silene bellidifolia цв цветки 0.5 2621 С++-

Silene burchellii цв цветки 1.4 8830 + + + +

Silene chlorantha цв цветки 1.9 19402 С + + + -

Sagina ciliata ЦВ н.часть 0.2 1016 +++--

Silene damboldtiana цв цветки 0.7 5176 + + + + -

Silene echinata цв цветки 0.4 5972 + + + -

Silene frivaldszkyana цв цветки 6.2 27592 + + + + -

Silene fruticosa вег листья 0.5 6810 С + + -

Silene gigantea пл н.часть 0.8 13279 + + + -

Silene italica ЦВ цветки 1.3 12205 + + + + -

Silene linicola ЦВ н.часть 0.5 2000 ++ + -

Silene mellifera ЦВ н.часть 0.9 5227 + + + + -

Silene paradoxa KB листья 0.4 2369 +++(+)

Silene portensis цв цветки 1.4 15312 С + + + -

Silene pseudotites кв листья 0.6 27188 + + + -

Silene radicosa цв цветки 1.3 11393 + + + + -

Silene roemeri ЦВ цветки 1.3 20962 + + + + -

Silene scabriflora цв цветки 0.6 2713 С + + -

Silene sendtneri цв цветки 1.8 17455 + + + + -

Silene squamigera цв цветки 1.5 9140 + + + +

пл н.часть 0.4 1424.3 + + + + -

пл семена 0.6 1608

Примечание. Вег - начало вегетации, бут - бутонизация, цв - цветение, пл - плодоношение, кв - конец вегетации, н.часть - надземная часть. ХСФ - хроматоспектрофото-метрический метод, в % на сухое сырье. РИА - радиоиммунный анализ, мкг экдизон эквивалент/г. С - цитотоксичный, - = не активен, + = активен-неразбавленный экстракт, (+) = слабо активен, ++, +++, Mil = активен при 10-, 100-, 1000-кратном разбавлении.

чаемость экдистероидов в родах Lychnis и Silene (67 и 59 % от произвольно выбранных для анализа видов).

Установление химического состава экдистероидов перспективных видов

Выбор объектов для настоящего исследования обусловлен как богатым качественным составом и количественным содержанием экдистероидов, так и достаточной сырьевой базой интродуцируемых нами растений.

Фитоэкдистероиды рода Silene. Изучен химический состав экдистероидов 12 видов рода Silene: S.antirrhina, S.chlorifolia, S.cretica, S.disticha, S.echinata, S.italica, S.linicola, S.portensis, S.pseudotites, S.radicosa, S.regia, S.viridiflora. Экдистероиды в этих видах обнаружены впервые. Растения выращены из семян, полученных из зарубежных ботанических садов, интродуцированны в Сиб БС ТГУ (исследовали семена S.regia). Предварительный анализ хроматоспектрофотометрическим методом, а также ферментативный гидролиз порций каждого метаноль-ного экстракта смесью гидролазы из Helix pomatia с последующим радиоиммунным анализом показал, что большинство исследуемых видов богаты свободными экдистероидами и содержат лишь низкие уровни экдистероидных коньюгатов. Экдистероиды в видах S antirrhina, S.chlorifolia, S.cretica, S.disticha, S.echinata, S.italica, S.portensis идентифицировали с помощью ВЭЖХ. Очищенные водно-метанольные экстракты разделены на аналитической колонке с С18, индивидуальные соединения сконцентрированы на полупрепаративной С18 и разделены на колонках с Сб и Apex П. Пики экдистероидов на хроматограммах (рис.1) идентифицированы по УФ - спектрам, а также совместным введением эталонов экдистероидов. Мажорными компонентами в каждом виде Silene является 20-гидроксиэкдизон (20Е) и полиподин В (Пв) (табл. 2), содержание 20Е колеблется в пределах 0,12-1,2 % на сухой вес. Кроме того, в большинстве видов встречаются 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон и экдизон (Е), концентрации которых варьируются. Наибольшее содержание экдистероидов определено в Silene pseudotites, более 2 %, причем, уровни 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона и 2-дезокси-экдизона были такими высокими, что общая сумма их приблизилась к таковой 20-гидроксиэкдизона. Разделение близких по химической структуре и хроматографическому поведению 20Е, Е и Пв достигнуто в системах 2,4 и 5 (табл. 3).

200

160-

100

100 н 300

80 260-

% Э

м К

Е Д 200

60 Т и

А 3 150

Н о

40 О н

Л 100

20 к в 60

б 10 15 20 25 30 35 40

Номер фракции

1-20

6 Ю 16 20 25 30 36 40

Номер фракции

100

% м

во Е

40 Н

16 80 26 30 36 40

Номер фракции

6 10 16 20 26 30 36 40

Номер фракции

Рис. 1. ВЭЖХ-РИА экстрактов Silene echinata (A), S.itálico (В), S.pseudotites (С), S. regia (D). 1 - 20Е, 2 - полиподин В, 3 - инокостерон, 4 - экдизон, 5-2-дезоксиэкдизон, 6 - 2-дезокси-20Е, 14 - 2-дезокси-21-гидроксиэкдизон.

Таблица 2

Фитоэкдистероиды, выделенные из родов Silene L. и Lychnis L.

Экдистероид Формула Выход, Вид расте-

% ний

20-Гидроксиэкдизон (1) С27Н44О7 0.071# S.pseudotites

0.367 S.linicola

0.042 S.radicosa

0.302 S. regia

0.350 S.viridiflora

0.045 L.chalcedonica

0.097 L.wilfordii

Полиподин В(2) С27Н4408 0.006" S.pseudotites

0.073 S.linicola

0.007 S. radicosa

0.021 S. regia

0.250 S.viridiflora

0.006 L.chalcedonica

0.010 L.wilfordii

258-Инокостерон (3) С27Н4407 сл. S.pseudotites

0.012 S. regia

Экдизон (4) С27Н4406 0.002 S.pseudotites

0.001 S.linicola

0.001 L.chalcedonica

2-Дезоксиэкдизон (5) С27Н4405 0.165 S.pseudotites

2-Дезокси-20-гидроксиэкдизон (6) С27Н4406 0.106 S.pseudotites

0.017 S.linicola

0.200 S.viridiflora

2-Дезокси-20,26-дигидрокси- С27Н4407 0.003 S.pseudotites

экдизон (7)*

Понастерон А (8) С27Н4406 сл. **

Сидистерон (9) С24Н3206 0.001 S.pseudotites

2-Дезоксиэкдизон 22Р-0-гликозид C33H54O10 0.003 S.pseudotites

(10)*

2-Дезоксиполиподин В 3ß-D- C33H54012 0.003 S.pseudotites

гликозид (11)*

2-Дезоксиинтегристерон А (12) С27Н4407 0.001 S.pseudotites

(5а-2Н) -2-Дезоксиинтегристерон С27Н4407 0.001 S.pseudotites

А (13)

2-Дезокси-21 -гидроксиэкдизон С27Н4406 0.013 S.pseudotites

Экдистероид Формула Выход, Вид расте-

% ний

(14)

Стахистерон Д (15) С27Н42О6 0.001 1.ска1сес1отса

Витикостерон Е (16) С29Н46О8 0.001 5, Нтсо1а

0.0001 Ь.сксЛсейопка

24(28)-Дегидромакистерон А (17) С28Н44О7 0.0003 Ь.скакейотса

Гуркестерон (18) С27Н44О8 0.001 Ч.Итсо1а

Интегристерон А (19) С27Н44О8 0.002 5. Нтсо1а

0.200 ^МпйЩога

0.0002 Ь.ска1се<1отса

Силенеозид А (20) С33Н54О12 0.080 ЧМпсИАога

Силенеозид Б (21) СззН540|2 0.100 Ч.тпйфога

26-гидроксиполиподин В (22) С27Н44О9 0.035 ЗМпйфога

Примечание: * - данные по 60 % фракции, * - впервые выделенные экдистероиды, **- обнаружен в большинстве видов, сл. - следовые количества.

Таблица 3

Времена удерживания экдистероидов (ВЭЖХ), выделенных из видов БИепе (мин)

Экдистероид Система

1 2 3 4 5

20-Гидроксиэкдизон (1) 10.3 18.0 9.4 18.5

Полиподин В (2) 10.3 15.4 7.0 13.5

(2511)-Инокостерон (3) 10.3 20.7 10.8 18.0

(258)-Инокостерон (3) 10.3 22.0 11.3 18.0

Экдизон (4) 13.3 13.4 7.9 13.5

2-Дезоксиэкдизон (5) 17.5 8.3

2-Дезокси-20-гидроксиэкдизон (6) 14.6 14.5 10.5

2-Дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон (7) 23.7

Лонастерон А (8) 16.8 16.8 4.2 5.5

Сидистерон (9) 8.0

2-Дезоксиэкдизон 22р-Б-гликозид (10) 23.5

2-Дезокси-полиподин В 3 Р-Б-гликозид 38.0

(П)

2-Дезоксиинтегристерон А (12) 14.0

(5а-2 Н)-2-Дезоксиинтегристерон А (13) 22.5

2-Дезокси-21-гидроксиэкдизон (14) 12.5

Примечание: Система 1 - аналитическая колонка Си с Spherisorb, линейный градиент от 30 до 100 % СНзОН, система 2 - аналитическая колонка с Spherisorb С6, 28 % СН3ОН/Н2О; система 3 - аналитическая колонка с Spherisorb Сб, 45 % СН3ОН/Н2О; система 4 - аналитическая колонка с APEX II (диол), линейный градиент от 4 до 20 % CHjOH в CH2CI2; система 5 - полупрепаративная колонка с Zorbax-Sil, дихлорме-тан/изопропанол/вода в соотношении 125 40.3.

Идентификация экдистероидов, выделенных из Silenepseudotites, S.radicosa и S.regia

Выделение и разделение экдистероидов из видов Silene pseudotites, S.radicosa и S.regia осуществлено по схеме, представленной на рис. 2. Наибольший выход при выделении экдистероидов из S.pseudotites, получен для 2-дезоксиэкдизона, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона и 20-гидроксиэкдизона (табл. 2). Из надземной части S.radicosa удалось выделить мажорные компоненты - 20Е и Пв, а из семян S.regia 20Е, Пв и следовые количества 258-инокостерона.

Из надземной части S.pseudotites было изолировано 12 стероидных соединений, а выявлено 14, два из которых в следовых количествах -258-инокостерон и понастерон А. Структуры изображены на рис. 3. Идентификация мажорных экдистероидов: 20-гидроксиэкдизон (1), полиподин В (2), экдизон (4), 2-дезоксиэкдизон (5), 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон (6) проведена на основе УФ-, масс-, ЯМР *Н спектров. Физико-химические и спектральные характеристики исследуемых экдистероидов совпадают с соответствующими литературными данными.

2-Дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон (7). В масс-спектре (ХИ, NH3) проявились следующие пики: с m/z 498, отвечающий иону [M+H+NH3]+, 481 [М+Н]+, а также с m/z 480, соответствующий молекулярному иону [М]+, 463 [М+Н-Н20]+ и 445 [М+Н- 2Н20]+. В ЯМР 'Н спектре (D20) присутствуют типичные особенности как 2-дезокси-, так и 20,26-дигидрокси- экдистероидов. На основании химических сдвигов сигналов ангулярных 18- и 19-метильных групп, а также метильных групп боковой цепи сделан вывод о структуре циклической части стероида с двумя ОН-группами. Сигнал 5 0.863 м.д. отвечает СН3-18 группе, а 5 0.976 м.д. соответствует СН3-19 и свидетельствует о том, что структура стероидного ядра подобна таковым 2-дезокси-20Е, 2-дезоксиэкдизона. При сравнении ЯМР *Н спектров 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизона (7) и 20,26-дигидроксиэкдизона наблюдается хорошее совпадение положения большинства протонов, однако в соединении 7 отсутствует сигнал Н-2 при 3.99 м.д. (табл. 4), и наблюдается уширение сигнала Н-3 (wi/2= 20

экстракция СН3ОН

_^концентрирование

концентрированный экстракт]

_Ц+ н2о

70% СН30Н/Н20 экстракт

_(^очистка СбН14

конц. водная фракция]

Црастворение 10% СН30Н/Н20 и твердофазная экстракция, элюирование СН30Н/Н20

Фракции

Л и У и и

10% 25%, 20Е 60%, 20Е, Е. Пв 80% 100%

Ивэжх, С,8. сн3он/н2о

Ф р а к ц ии

1] И и и и и Л

Р1 Р2 РЗ Р6 Ш

Л ивэжх и

Рис. 2. Схема выделения экдистероидов из видов рода БИепе

Гц), что является следствием отсутствия гидроксильной группы при С-2. Появление -СН2-ОН сигнала в виде синглета при S = 3,45 м.д., характерного для 26-гидроксиэкдистероидов, подтвердило предположение о структуре соединения 7.

Таким образом, для соединения 7 предложена структура 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизона, выделенного впервые.

Сидистерон (9). В ИК-спектре проявились полосы vlrax (cm1): 1749 (у-лактон), 1643 (Д7-6-кетогруппировка). УФ (к^а (loge): 240 нм (4,12). Совместное хроматографирование исследуемого образца с эталоном методом ВЭЖХ косвенно указывает на их идентичность.

В масс спектрах (ХИ, NH3) проявились пики с m/z 434, соответствующие фрагменту [M+H+NH3]+, 417 [М+Н]+, молекулярному иону 416 [М]+ и дегидратационному иону 399 [М+Н-Н20]+.

Сравнение ЯМР 'Н и 13С спектров исследуемого соединения 9 и 20Е показало, что химические сдвиги СН3-19 (5 0.98 м.д.), Н-2, Н-3 и Н-7 хорошо совпадают. Однако сдвиг сигналов СН3-18 (5 0.74 м.д.) в сильное поле, протонов при Н-12, Н-17 (5 2.19 и 2.70 м.д. соответственно) и СН3-21 (1.57 м.д.) в слабое поле и отсутствие сигналов СН3-26/27 групп свидетельствуют об идентичности стероидных частей молекул и укороченной боковой цепи соединения 9. Совокупность спектральных данных, а также совместное хроматографирование с предполагаемым эталоном позволили идентифицировать соединение 9 как сидистерон, выделенный ранее из растений Silene dioica, S.otites (Catyophyïïaceaé), Briza maxima (Gramineae).

2-Дезоксиэкдизон 22р-о-гликозид (10). Весьма характерным для рода Silene является частая встречаемость гликозидов. Наличие в растениях гликозидных соединений экдистероидов является свидетельством их активной роли в метаболических процессах.

В масс-спектре соединения 10 проявляются пики с m/z 628 [M+H+NH3]+, 611 [М+Н]+, пик молекулярного иона 610 [М]+, 593 при отщеплении одной молекулы воды [М+Н-Н20]+. В ЯМР 'Н спектре (D20) (табл. 4) представлены характерные особенности для производных 2-дезоксиэкдизона: отсутствие сигнала карбинильного протона при С-2, сдвиг в слабое поле, уширение сигнала протона при С-3 (w1/2 »23 Гц) и сдвиг сигнала Н-9 в сильное поле относительно экдизона или 20-гидроксиэкдизона. Идентичность сахара ß-D-глюкопиранозе была установлена на основе характеристичного сигнала для аномерного протона в виде дублета при 5 4,53 м.д. с большой константой (1=8 Гц) и 'Н-'Н расщепления, аналогично как и в ЯМР 'Н спектре экдизон 22ß-D- глико-

Таблица 4

Химические сдвиги протонов новых и редких экдистероидов, выделенных из растений БПепе ряеийоШев (6, м.д., глицерин)

С о е д и н е н и е (растворитель)

Протон 7 9 10 И 12 13 14

ф20) (С030Б) (020) ФгО) (020) (В20) (В2<Э)

2-Н - 3.82 - - - - -

3-Н 4.10 3.94 4.10 4.31 3.70 3.74 4.10

5-Н 2.39 2.38 2.41 - 2.76 2.54 2.40

7-Н 5.96 5.78 5.97 5.99 5.94 5.99 5.97

9-Н 3.15 3.14 3.14 3.24 3.23 2.95 3.14

17-Н 2.33 2.77 2.32 2.36 2.31 2.07

22-Н 3.44 7.76 3.73 3.44 3.43 3.43 3,78

18-Ме 0.86 0.76 0.74 0.88 0.85 0.86 0.77

19-Ме 0.98 0.95 0.99 0.91 1.10 0.84 0.98

21-Ме 1.24 1.52 0.96 1.23 1.22 1.22 3.90 3.76

26-Ме 3.45 СН2ОН - 1.24 1.22 1.23 1.22 1.24

27-Ме 1.16 - 1.24 1.23 1.24 1.23 1.24

1-Н 4.53, 1=8Гц 4.56, 1=8Гц

2-Н 3.29 3.30

з'-н 3.48 3.51

4-Н 3.38 3.39

5-Н 3.45 3.45

б'-Н 3.70 3.71

6-Н 3.89 3.90

зида. Место присоединения сахара определено на основании химического сдвига С-1 в ЯМР 13С спектре и дальних констант 'Н-13С между ано-мерным протоном ('1-Н) и С-22 в 2В НМВС эксперименте. Такое присоединение подтверждено наблюдаемым эффектом Оверхаузера между (Г-Н)<=>22-Н. Сравнение ЯМР спектров соединений 2-дезоксиэкдизона и 2-дезоксиэкдизон-22|3-о-гликозида (10) показало, что отличие наблюдается лишь в химических сдвигах протонов при С-22 и СН3-21: в соединении 10 они сдвинуты в слабое поле, что также свидетельствует в пользу присоединения сахарного остатка при С-22. Таким образом, для соединения 10 предложена структура 2-дезоксиэкдизон 22(3-п -гликозид.

2-Дезоксиполиподин В ЗР-О-гликозид (11). В масс-спектре (де-сорбция/ХИ, NH3) проявился ряд фрагментов: с m/z 480, отвечающий молекулярному иону при отщеплении сахарного остатка [М - сахар]+, дегидратационные ионы при последовательном отщеплении 4-х молекул воды 463 [М + Н - сахар - Н20]+ и 445 [М + Н - сахар - 2Н20]+, 427 [М + Н - сахар - ЗН20]+, 409 [М + Н - сахар - 4Н20]+ и 180, соответствующий сахарному остатку. Данные ЯМР *Н спектра свидетельствуют о присутствии типичных особенностей 2-дезокси- и 5,20-дигидроксиэкдистерои-дов. Из сравнения химических сдвигов протонов в спектрах экдистерои-да 11 и полиподина В следует, что наиболее отличаются величины сигналов протонов при С-3, С-7 и СН3-19. Смещение сигнала протона С-3 в слабое поле (5,4.31 м.д.), сигнала СН3-19 в сильное поле по сравнению с полиподином В позволяет предположить, что сахарный остаток присоединен к оксигруппе при С-3. Исчезновение характерного сигнала протонов при С-2 указывает на отсутствие оксигруппы в положении 2. Сигнал аномерного протона соединения 11 (д, 8 4.56 м.д.) и большая константа (J=8 Гц), указывает на присутствие ß-D-глюкопиранозы, как и в случае известного экдистероида - полиподин В Sß-D-гликозида, а заключение о месте присоединения сделано на основании ядерного эффекта Оверхау-зера и наблюдаемой корреляции в НМВС эксперименте между Г-Н сахара и С-3.

Таким образом, для соединения 11 предложена структура 2-дезоксиполиподин В Зр-о-гликозида, выделенного впервые.

(5а-2Н) -2-Дезоксиинтегристерон А (13). В ЯМР 'Н спектре представлены типичные особенности 2-дезокси-1р,20-дигидрокси-5а-экдистероидов. 5а-Конфигурация подтверждена проявляемым эффектом Оверхаузера между 9-Н и 5-Н. Присутствие преимущественно (91 %) дейтерия при С-5 было продемонстрировано понижением насыщения 5-Н сигнала в ЯМР 'Н спектре. Возможно, что (5ос-2Н)-2 -дезоксиинтегри-стерон А является артефактом, зафиксированным в процессе получения ЯМР спектра в дейтерированном растворителе, так как известно, что (5ß-H) 2-дезоксиэкдистероиды быстро подвергаются эпимеризации при С-5 в 5а-эпимер.

2-Дезокси-21-гидроксиэкдизон (14). Молекулярная масса определена из масс-спектра высокого разрешения и равна 464. В масс-спектре выявлены пики с m/z: 482, соответствующий фрагменту [M+H+NH3]+, 465 [М+Н]+, 452, 447 [М+Н-Н20]+ - основной пик, 435, 429 [М+Н-2Н20]+, 417, 411 [М+Н-ЗН20]+, 399, 393 [М+Н-4Н20]+, 366, 349, 331, 313, 116.

Анализ ЯМР !Н спектра показал, что это соединение принадлежит к

2-дезокси 5Р-экдистероидам, т.к. в области >СНОН (3.7 - 4.0 м.д.) отсутствует сигнал карбинильного протона при С-2 и наблюдается уширение

3-Н сигнала. В насыщенной области присутствует только четыре метальных сигнала: СН3-18 (0.77 м.д.), СН3-19 (0.98 м.д.), СН3-26 (1.236 м.д). и СНз-27 (1.243 м.д.). Сигналы при 3.90 и 3.76 м.д. соответствуют диастереомерным протонам при гидроксилированном С-21. В ЯМР |3С спектре 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона сигнал атома углерода С-21 проявляется при 20.6 (СН3), в то время как в исследуемом соединении при 62.2 м.д.

Хорошее совпадение экспериментальных данных УФ-, ЯМР 'Н и 13С спектров с литературными, а также совместное хроматографирование ВЭЖХ с предполагаемым образцом позволило идентифицировать соединение 14 как 2-дезокси-21-гидроксиэкдизон, впервые выделенный из близкородственного вида Silene otites.

Фитоэкдистероиды Silene linicola. Из надземной части S.linicola выделено 7 экдистероидов. Структуры приведены на рис. 4. Экдистеро-идный профиль Silene linicola представлен в основном часто встречаемыми экдистероидами (табл. 2).

Туркестерон (18) не обнаружен ранее в растениях этого рода. Из масс- спектра экдистероида 18 следует, что стероидная часть молекулы содержит 4 ОН-группы: m/z: 460 (M1" - 2Н20), 442,424,406, а фрагменты боковой цепи идентичны 20Е (m/z 143, 126, 125, 99, 81, 69). Положение дополнительной оксигруппы при С-II установлено на основании смещения в слабое поле СН3-18 и СН3-19 групп по сравнению с 20Е. Полученные данные позволили идентифицировать экдистероид 18 с туркестероном, ранее выделенным из растений Ajuga turkestanica.

Сравнение ЯМР |3С спектров соединения 18 и 20-гидроксиэкдизона показало, что наблюдается значительные различия значений химических

он

-----" "=Н; R2=R3=R6=OH

R2=R3=R,=R6=OH

R2=R3= ОН

KV-II; R3= R<~ OH

R2=R3 = R6=OH;R7=Ac 3; R2=R3=R5=R<rOH 19. R,= Rs= R,= H R,= R2= R3= R6 =OH;

Рис. 4. Структуры эдистероидов, вьщеленных из Silene linicola

сдвигов углеродных атомов в 9, 10, 11, 12 положениях. В туркестероне сигналы этих атомов смещены в слабое поле: С-9 5 42.82 и 34.67 м.д., С-10 5 39.57 и 38.80, С-11 6 68.44 и 21.29, С-12 5 44.21 и 32.19 м.д. соответственно. Наряду с полученными экспериментальными данными это свидетельствует о наличии дополнительной оксигруппы при С-11 по сравнению с 20-гидроксиэкдизоном и подтверждает факт обнаружения туркестерона в роде Silene. Наблюдалось хорошее совпадение спектральных, физико-химических характеристик выделенных соединений с литературными данными.

Фитоэкдистероиды Silene viridiflora. Выделение экдистероидов из S.viridiflora осуществлялось по схеме, изображенной на рис. 2. Постепенное увеличение полярности системы растворителей позволило последовательно выделить экдистероиды разного строения: 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон (6); полиподин В (2) и 20-гидроксиэкдизон (1); 26-гидроксиполиподин В (22), интегристерон А (19) и силенеозиды D (21) и А (20). Физико-химические константы (t пл, [a]D), а также спектральные данные позволили отождествить их с предполагаемыми достоверными образцами. Экдистероиды 1, 2, б, 19, 20 и 21 были выделены ранее из одноименного вида, собранного в ботаническом саду (г. Ташкент). В растениях же, интродуцированных в Западную Сибирь, синтезируется наряду с перечисленными дополнительно 26-гидроксиполиподин В.

26-Гидроксиполиподнн В (22). В ИК-спектре наблюдается широкая полоса поглощения при 3443-3368 см"1, соответствующая валентным колебаниям ОН-групп. Полоса при 1687 см"1 обусловлена поглощением ке-тогруппы, сопряженной с двойной связью при наличии дополнительной оксигруппы в 5-положении. В масс-спектре имеется пик молекулярного иона с m/z 512. Сопоставление масс молекулярных ионов экдистероида 22 (N1*512) и полиподина В (2) (М+ 496) свидетельствует о различии их в 16 единиц, что предполагает наличие в соединении 22 дополнительной гидроксильной группы. Из сравнения спектров ЯМР 1Н экдистероида 22 и полиподина В следует, что в соединении 22 отсутствует шестипротонный сигнал СН3-26 и СН3-27 при 1.36 м.д., а вместо него появились два сигнала: трехпротонный при 1.21 м.д., обусловленный СНз-группой при С-27, и двухпротонный при 3.35 м.д., который, вероятно принадлежит СН2-группе, связанной с гидроксилом. При отсутствии в ЯМР *Н спектре сигнала СН3-26 можно предположить, что дополнительная оксигруппа локализуется у С-26. Кроме того, на это

указывает сдвиг сигнала С-27 метальной группы экдистероида 22 в сильное поле по сравнению с таковым полиподина В.

Совокупность приведенных данных позволяет идентифицировать эк-дистероид 22 как 26-гидроксиполиподин В или 5,20,26-тригидроксиэк-дизон, ранее выделенный из Silene nutans L..

Таким образом, во всех исследуемых видах Silene идентифицированы 20-Е, полиподин В. Кроме того, установлено присутствие экдизона S.disticha, S.echinata, S.italica, S.linicola, S.portensis, S.cretica, S.pseudo-tites, S.radicosa. Во всех видах, за исключением S.echinata, S.radicosa и S.regia обнаружен 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон.

Фитоэкдистероиды рода Lychnis. Из Lychnis chalcedonica выделено 7 экдистероидов (табл. 2), структуры которых идентифицированы на основе данных ИК-, УФ-, ЯМР-, масс-спектров, а также в сравнении с эталонами.

Стахистерон Д (15). Анализ масс-спектра показал, что боковая цепь имеет два атома кислорода, при этом пики с m/z 99 и 81 указывают на

цикличность боковой цепи, что подтверждается наличием оксониевого иона с m/z 405, при разрыве С23-С24 связи, характерного для стахистерона Д и выделенного ранее из Stachyurus praecox. Цикличность боковой цепи следует и из ЯМР 1Н спектра. Наблюдается смещение метанового протона при С-22 в слабое поле (3.92 м.д.), а сигнала близко расположенной СН3-21 в сильное поле (1.28 м.д.) по сравнению с 20-гидроксиэкдистероидами. Совокупность полученных экспериментальных данных позволяет отождествить соединение 15 с редким соединением стахистероном Д, имеющим оригинальную структуру - его боковая цепь содержит тетрагидрофурановый цикл.

Таким образом, из надземной части Lychnis chalcedonica изолированы соединения, принадлежащие к 27С, 28С и 29С- экдистероидам.

Из L.wilfordii выделены 20Е, Пв и идентифицированы сравнением с эталонами 24(28)-дегидромакистерон А, интегристерон А и экдизон.

Хемотаксономическое значение экдистероидов рода Silene

Род Silene является удобной моделью для изучения хемотаксономи-ческого значения экдистероидов вследствие многочисленности (700 видов), большой встречаемости видов, синтезирующих эти соединения,

сложной и, по всей вероятности, еще не сформировавшейся системы рода. Информация о наличии или отсутствии экдистероидов может способствовать уточнению систематического статуса вида.

На примере 105 изученных видов установлено, что более половины секций рода Silene включают только экдистероидсодержащие виды растений: Siphonomorpha, Otites, Brachypodae, Fruticulosae, Silene, Dipterosperma, Holopetalae, Graminifoliae, Lasiocalycinae, либо только экдистероид-отрицательные: Odontopetalae, Inflatae, Auriculatae, Heliospermae, Elisanthe, Conomorpha и др. В этих секциях со значительной степенью вероятности можно прогнозировать присутствие/отсутствие экдистероидов в еще не исследованных видах. Другие секции содержат как экдистероид-положительные, так и отрицательные виды.

Соотнесение полученных нами данных о присутствии/отсутствии экдистероидов в родах Silene, Lychnis, Petrocoptis с положением видов в филогенетическом дереве, основанном на анализе ДНК-последовательностей (Oxelman, Liden, 1995) позволило сделать весьма интересные наблюдения и подтвердить правильность наших результатов исследований: спорные виды S.armería, S.coeli-rosa, S.zawadskii, в которых нами не обнаружены экдистероиды отнесены также к отрицательным кладам. В данном случае геносистематика дополняет и объясняет некоторые моменты хемотаксономии.

Сравнение результатов наших исследований с литературными данными свидетельствует о наличии общих закономерностей в составе экдистероидов видов Silene: присутствие в больших количествах 20Е, которое сопровождается в большинстве видов наличием 2-дезокси-20Е, 2-дезоксиэкдизона и полиподина В. Замечено, что наборы характерных экдистероидов для видов секций Siphonomorpha, Silene и Otites различны: для первой - 20-гидроксиэкдизон и полиподин В, для второй - 20-гидроксиэкдизон, полиподин В, интегристерон А, экдизон и 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, для третьей - 20-гидроксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, экдизон, 2-дезоксиэкдизон, 2-дезоксиинтегристерон А, 2-дезокси-21 -гидроксиэкдизон, сидистерон.

Богатый набор и разнообразие экдистероидов, присутствующих в многочисленных видах Silene (более чем в 100 видах) дают возможность предположить, что экдистероиды в этом роде имеют хемотаксономиче-ское значение. Однако это требует дальнейшего подтверждения, возможно, оно более отчетливо проявится при изучении химического состава экдистероидов, включая минорные компоненты у еще большего количества видов этого обширного рода.

Распределение экдистероидов в процессе развития видов Caryophyllaceae

Изучена динамика содержания экдистероидов следующих однолетних видов: Silene bellidifolia, S.cretica, S.disticha, S.linicola, S.portensis, S.squamigera, S.thessalonica и многолетних: S.altaica, S.catholica, S.ciliata, S.damboldtiana, S.frivaldszkyana, S.italica, S.paradoxa, S.pseudotites, S.sendtneri, S.tatarica, S.viridiflora, Lychnis chalcedonica. Замечено, что наибольшее содержание для надземной части всех видов наблюдается в периоды интенсивного роста и развития растений: для многолетних видов в следующие фазы - начало вегетации, бутонизации и цветения, тогда как для однолетних - только в фазы бутонизации и цветения. В фазе максимального накопления экдистероидов в надземной части наблюдается наибольшее содержание и во всех ее компонентах.

Установлена зависимость характера динамики содержания 20-гидроксиэкдизона в надземной части многолетних видов Silene в генеративный период от направленности изменения в листьях розеток в первый год. Увеличение к концу вегетации в первый год жизни приводит к максимуму в начале вегетации генеративного периода, в другом случае максимум наблюдался в фазу бутонизации или цветения. Таким образом, определив направленность изменений в листьях в первый вегетационный период, можно прогнозировать динамику содержания экдистероидов в генеративный период развития и фазу максимального накопления, что важно в случае использования растений в качестве сырьевого источника фитоэкдистероидов.

С целью оценки вклада каждого органа в биомассу растений и суммарное количество 20Е исследованы однолетние виды S.bellidifolia, S.squamigera и многолетний S.viridiflora (рис. 5, 6). Изучение распределения экдистероидов в органах в процессе развития показало, что максимальное содержание их характерно для репродуктивных органов независимо от биоморфы видов, наименьшее в стеблях. Однако несмотря на самую высокую концентрацию (%) в бутонах и цветках, количество (мг/1 растение) аккумулируемого ими 20Е меньше, чем в плодах. Это является следствием значительного увеличения массы репродуктивных органов в процессе развития растений. Многолетний вид S.viridiflora в отличие от однолетних накапливает к концу каждого вегетационного периода максимальное количество в зимующих листьях и практически равные доли в запасающих органах (плодах и корнях). Максимальный вклад (более 50 %) в биомассу изучаемых однолетних растений вносят стебли с низким содержанием 20Е, однако доля их в

Рис5. Вклад (%) органов в биомассу (а) и общее количество 20Е (б) однолетних растений Silene bellidifolia. А-бутонизация, В-цветение, С-

плодоношение.

ABC

а)

б)

Репродуктивные Листья Стебель Корень

органы

Рис. 6. Вклад органов в биомассу (а) и общее количество 20Е (б) многолетних растений Бйепе тпйЛога

суммарном количестве 20Е в фазах цветения и плодоношения выше, чем в листьях, в то время как, доля плодов в суммарном количестве 20Е была превалирующей. В соответствии с биологией однолетних видов весовая доля корней, а также их вклад в общее количество 20Е (мг на 1 растение в сухом виде) наименьшие.

Физиологический смысл такой динамики лежит, видимо, в области функций, выполняемых соединениями: высокие концентрации экдисте-роидов защищают нежные репродуктивные органы от поедания насекомыми с целью сохранения органов размножения (семян), а возможно, значительные количества в последних необходимы для передачи информации новому поколению растений.

С учетом представленного распределения экдистероидов в видах Silene, в том числе и по метамерам, а также биологии развития можно предположить, что листья являются органами, синтезирующими эти соединения, а плоды накопителями. Однако вопрос о физиологической роли экдистероидов в растениях пока остается открытым, равно как и вопрос - для чего растения аккумулируют значительные количества экдистероидов в семенах.

Биологическая активность суммарных комплексов некоторых видов Caryophyllaceae и индивидуальных экдистероидов

Установлено, что комплекс биологически активных соединений Lychnis chalcedonica, в число которых входит и 20-гидроксиэкдизон проявляет радиозащитные свойства: при пероральном введении в организм экстракта и изолированного из него 20Е средняя продолжительность жизни белых крыс, тотально облученных на рентгеновской установке дозой 8 Гр (ЛД 100/30), увеличивается на 6-9 суток (Акт об испытаниях - приложение 1).

Показано, что экстракты лихниса халцедонского и его биологически активные вещества: флавоноиды, полисахариды и экдистероид - полиподин В, обладают противогрибковой активностью. Следует отметить, что фунгистатическая активность водного экстракта лихниса халцедонского значительно выше эталонов: гризеофульвина, нистатина, нитрофунгина и других лекарственных препаратов растительного происхождения (Акт об испытаниях - приложение 2). Разработанный способ получения средства, обладающего противогрибковым действием защищен патентом РФ.

Установлено, что экдистероидсодержащие растения L.ckalcedonica, S.dioica, S.tatarica могут являться эффективными корректорами синдрома повышенной вязкости крови на моделях сердечно-сосудистых заболеваний, благодаря воздействию как на клеточные, так и на плазменные гемореологические факторы. Они эффективно в сравнении с пентокси-филлином снижают вязкость крови и агрегацию эритроцитов. Кроме того, впервые установлено, что 20Е, выделенный из лихниса халцедон-ского, оказывает существенное влияние на реологические свойства крови, выражающееся в снижении остроты проявления синдрома повышенной вязкости крови при ишемии мозга у крыс вплоть до полной нормализации основных гемореологических параметров. Исходя из наших данных об отчетливых реологических свойствах 20Е, можно предположить, что гемореологическая активность исследованных экстрактов обусловлена наличием в их составе экдистероидов. Получено два новых гемореологических средства на основе индивидуального 20Е и L.chalcedonica, защищенные патентами РФ. По сравнению с эталоном пентоксифиллином 20Е применяется в значительно меньшей концентрации (105 и 10'7 г/мл соответственно). При этом 20Е уменьшал вязкость крови на 9.4 % по отношению к контрольным значениям, в то время как пентоксифиллин на 7.3 %. Полупериод агрегации эритроцитов у 20Е был на 20.7 % больше, чем в контроле, а у эталона сравнения на 17.9 %.

Таким образом, 20-гидроксиэкдизон проявляет выраженный гемо-реологический эффект, ограничивая повышение вязкости крови и спонтанной агрегации эритроцитов. Экстракты Lychnis chalcedonica, Silene tatarica и S. dioica могут быть основой для создания группы новых гемореологических средств. (Акт об испытаниях - приложение 3).

Экстракты Silene viridiflora и Lychnis chalcedonica проявили противоопухолевое действие. Первый достоверно повышал в 1.9 раза количество лейкоцитов в периферической крови у мышей, получавших комбинированное лечение и усиливал антиметастическое действие циклофосфана -количество метастазов на одну мышь снизилось в 2.4 раза. Экстракт лихниса халцедонского проявил свойство снижать токсическое действие циклофосфана и увеличивать его антиметастатическую активность.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения препаратов из растений семейства Гвоздичных в качестве средств, позволяющих улучшить традиционное хи-миотерапевтическое лечение злокачественных новообразований.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработан способ быстрого обнаружения фитоэкдистероидов, основанный на предварительном хроматографическом анализе экстрактов семян.

2. Методами радиоиммунного анализа, биотестирования и хромато-спектрофотометрии осуществлен скрининг семян 400 видов растений различных семейств, включая 266 видов, принадлежащих 28 родам Caryophyllaceae, в том числе 152 вида рода Silene L.

Впервые обнаружены экдистероиды в 95 видах: 75 - p.Silene, 8 -Lychnis, 2 - Petrocoptis, 4 - Sagina, 2 - Saponaria, 3 - Melandrium, 1 -Dianthus. Установлена наибольшая встречаемость экдистероидов в родах Lychnis и Silene. Выявлено 2 новых экдистероидсодержащих рода: Melandrium Roehl, Petrocoptis A.Braun (Caryophyllaceae).

3. Выделено 22 экдистероида, в том числе новые неизвестные ранее экдистероиды: 2-дезоксиэкдизон 22р-0-гликозид, 2-дезоксиполиподин В зр-Б-гликозид и 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон.

Установлен состав экдистероидов 12 видов Silene. Наиболее богатыми источниками в качественном и количественном отношении оказались Silene pseudotites, S.linicola, S.viridiflora, из которых изолировано 14, 7 и 7 экдистероидов соответственно.

4. Выделено и идентифицировано 7 индивидуальных экдистероидов из Lychnis chalcedonica и L.wilfordii: 20-гидроксиэкдизон, экдизон, полиподин В, 24(28) - дегидромакистерон А, интегристерон А, стахистерон Д и витикостерон Е.

Показано, что для представителей родов Silene и Lychnis свойственен биосинтез характерных соединений: 20-гидроксиэкдизон, полиподин В, экдизон, понастерон А, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, а также таких редких экдистероидов, как сидистерон, стахистерон Д, туркестерон, 24(28)-дегидромакистерон А и витикостерон Е.

Строение выделенных соединений установлено на основе совокупности физико-химических констант и спектральных данных.

5. В результате проведенного хемотаксономического анализа распространения экдистероидов в роде Silene (на примере 105 видов) показано, что более половины секций включают либо только положительные, либо только отрицательные виды. В этих секциях можно с определенной вероятностью прогнозировать присутствие (отсутствие) экдистероидов. Наличие экдистероидов является дополнительным и необходимым кри-

терием для систематики рода Silene и поиска их продуцентов среди родственных видов.

6. Показано, что фазами максимального накопления экдистероидов для надземной части однолетних видов является период развития генеративных органов - бутонизация, цветение. В многолетних видах максимальное содержание наблюдается в следующих фенофазах - начало вегетации, бутонизация и цветение. В отдельных органах однолетних и многолетних видов отмечается разный характер динамики: максимальные значения как содержания (%), так и количества (мг/1 растение) экдистероидов в однолетних отмечается в репродуктивных органах, тогда как в органах многолетних видов наибольшая концентрация - в репродуктивных органах, а количество в листьях. По видимому, общей стратегией как в однолетних, так и многолетних видах Caryophyllaceae является синтез экдистероидов в листьях, а аккумулирование - в плодах.

Установлено, что наибольшее накопление экдистероидов происходит на 2-4 годах жизни растений.

7. Выявлена гемореологическая активность экстрактов Lychnis chalcedonica, Silene tatarica, Silene dioica, Silene linicola, Silene crética, Silene viridiflora. Наиболее эффективно в сравнении с пентоксифилином снижают вязкость крови и агрегацию эритроцитов Lychnis chalcedonica, Silene tatarica, Silene dioica и не уступают танакану. 20-Гидроксиэкдизон, выделенный из Lychnis chalcedonica, оказывает существенное влияние на реологические свойства крови при ишемии мозга и инфаркте миокарда.

8. Установлено, что экстракты Lychnis chalcedonica и Silene viridiflora проявили противоопухолевое и антиметастатическое действие.

9. Биологически активные вещества и экдистероиды Lychnis chalcedonica являются основой для комплексного препарата анаболического, противогрибкового, радиопротекторного, гемореологического и противоопухолевого действий.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зибарева JI.H., Балтаев У.А., Свиридова Т.П., Саатов 3., Абубаки-ров Н.К. Виды рода Lychnis L. - перспективные источники экдистероидов // Раст. ресурсы. - 1995. - Т. 31, вып. 4. - С. 1 - 9.

2. Зибарева JI.H., Еремина В.И. Динамика содержания экдистерона в Silene linicola, S. crética И Природокомплекс Томской области. Биологические и водные ресурсы. - 1995. - Т. II. - С. 75 - 79.

3. Зибарева Л.Н., Еремина В.И. Динамика содержания экдистероидов в видах Silene И Раст. ресурсы. - 1996. - Т. 32, вып. 1 - 2. - С. 106 - 110.

4. Зибарева Л.Н. Прогнозирование наличия экдистероидов в видах Silene L. и Chenopodium L. по их содержанию в семенах // Раст. ресурсы. - 1997. - Т. 33, вып. 1. - С. 89 - 92.

5. Зибарева Л.Н., Еремина В.И., Иванова Н.А. Новые экдистероидо-носные виды рода Silene L. и динамика содержания в них экдистерона // Раст. ресурсы. - 1997. - Т. 33, вып. 3. - С. 73 - 76.

6. Плотников М.Б., Зибарева Л.Н., Колтунов А.А., Алиев О.И., Якимова Т.В., Маслов М.Ю. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих экдистероиды // Раст. ресурсы. - 1998. -Т. 34, вып. 1.-С. 91 -97.

7. Зибарева Л.Н. Распространение экдистероидов в роде Silene L. и динамика их содержания // Раст. ресурсы. - 1999. - Т. 35, вып. 1. - С. 79 -87.

8. Плотников М.Б., Алиев О.И., Васильев А.С., Маслов М.Ю., Чер-нышова Г.А., Краснов Е.А., Зибарева Л.Н. Гемореологическая активность экстрактов из надземной части Lychnis chalcedonica L. и Rhapo-nticum carthamoides (Willd.) Iljin при экспериментальном инфаркте миокарда // Раст. ресурсы. - 1999. - Т. 35, вып. 1. - С. 103 -107.

9. Плотников М.Б., Алиев О.И., Васильев А.С., Маслов М.Ю., Зибарева Л.Н., Дмитрук С.Е., Калинкина Г.И. Гемореологические эффекты экстрактов Lychnis chalcedonica L. И Экспер. и клин, фармакол. - 2000. -Т. 63.-№2.-С. 54-56.

10. Zibareva L. Distribution and levels of phytoecdysteroids in plants of genus Silene during development // Archives of insect biochemistry and physiology. - 2000. - V. 43. - P. 1 - 8.

11. Плотников М.Б., Зибарева Л.Н., Васильев A.C., Алиев О.И., Маслов М.Ю., Дмитрук С.Е. Гемореологическая активность экдистерона и различных фракций экстракта из надземной части Lychnis chalcedonica L. in vitro II Раст. ресурсы. - 2000. - Т. 36, вып. 3. - С. 91 - 94.

12. Meng J., Whiting P., Zibareva L., Bertho G., Girault J.-P., Lafont R., Dinan L. Identification and quantitative analysis of the phytoecdysteroids in Silene species (Caryophyllaceae) by high performance liquid chromatography. Novel ecdysteroids from Silene pseudotites // J. Chromatography. - 2001. -V. 935.-P. 309-319.

13. Зибарева JI.H., Еремина В.И. Распределение 20-гидроксиэкдизона в различных частях Silene bellidifolia Juss. ex Jacq. и S.squamigera Boiss., выращиваемых в Сибирском ботаническом саду (Томск) // Раст. ресурсы. - 2002. - Т. 38, вып. 2. - С. 81 - 85.

14. Мамадалиева Н.З., Зибарева JI.H., Саатов 3. Фитоэкдистероиды растений Silene linicola II Химия природ, соедин. - 2002. - № 3. - С. 225 -227.

15. Мамадалиева Н.З., Зибарева JI.H., Lafont R., Саатов 3. Исследование фитоэкдистероидов Silene viridiflora II Химия природ, соедин. - 2003. - № 2,- С. 150- 153.

16. Зибарева JI.H., Еремина В.И., Иванова H.A., Лазьков Г.А. // Распределение фитоэкдистероидов в трибе Sileneae Dumort. (Caryophyl-laceae Juss.) II Раст. ресурсы. - 2003. - Т. 39, вып. 3. - С. 45 - 53.

17. Zibareva L., Volodin V., Saatov Z., Savchenko Т., Whiting P., Lafont R., Dinan L. Distribution of phytoecdysteroids in the Caryophyllaceae II http//www.elsevier.com/inca/publications/store/2/7/3/index.htt (Phytochemis-try. - 2004. - V. 64. - N. 2 - P. 499 - 517.)

18. Пат. 1755440, МКИ A 61 К 35/78. Способ получения средства, обладающего противогрибковым действием / Л.Н. Зибарева, С.Е. Дмитрук, E.H. Сальникова. - №. 4838137/14; Заявлено 07.05.90; Опубл. 1.03.93, Бюл. № 35. Приоритет 07.05.90.

19. Пат. 2082168, МКИ 6 G 01 N 33/50, 30/02, 30/90. Способ обнаружения и количественного определения экдистероидов в растительных объектах. / Л.Н.Зибарева., В.И.Еремина П.В.Зибарев (Россия).

№ 94002629/13; Заявлено 26.01.1994; Опубл. 20.06.97, Бюл. №. 17. Приоритет от 26.01.1994.

20. Пат. 2138284, МКИ А 61 К 35/78. Гемореологическое средство и способ его получения / М.Б.Плотников, О.И.Алиев, А.С.Васильев, М.Ю.Маслов, Л.Н.Зибарева. - №. 98114435/14; Заявлено 14.07.98; Опубл. 27.09.99, Бюл. №. 27. Приоритет 14.07.98.

21. Пат. 2160592, МКИ А 61 К 31/575, А 61 Р 7/00, 7/02. Гемореологическое средство / Л.Н.Зибарева, О.И.Алиев, А.А.Колтунов, М.Б.Плотников - №. 96118150/14; Заявлено 11.09.1996; Опубл. 20.12.2000, Бюл. №. 35. Приоритет 11.09.1996.

Отпечатано на участке оперативной полиграфии Редакционно-издательского отдела ТГУ Лицензия ПД № 00208 от 20 декабря 1999 г.

Заказ №-//0 "20 " ОХ_2003 г. Тираж 100 экз.

2oaJzA 1 4 8 3 2

Содержание диссертации автор исследовательской работы: доктора химических наук, Зибарева, Лариса Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

I. ФИТОЭКДИСТЕРОИДЫ

1.1. Химическая природа фитоэкдистероидов

1.2. Распространение экдистероидов в мире растений

1.3. Фитоэкдистероиды видов семейства Caryophyllaceae

1.4. Распределение экдистероидов в растениях

1.5. Предполагаемые роли фитоэкдистероидов 58 II. ПОИСК НОВЫХ ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИХ

ВИДОВ СЕМЕЙСТВА CARYOPHYLLACEAE И УСТАНОВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА

ЭКДИСТЕРОИДОВ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВИДОВ

2.1. Скрининг видов семейства Caryophyllaceae на присутствие экдистероидов

2.1.1. Скрининг экстрактов семян растений хроматоспектрофотометрическим методом

2.1.2. Радиоиммунный анализ экстрактов растений

2.2. Изучение химического состава экдистероидов некоторых видов семейства Caryophyllaceae

2.2.1. Выделение и идентификация экдистероидов видов рода

Lychnis L.

2.2.2. Выделение и идентификация экдистероидов

Silene linicola и Silene viridiflora

2.2.3. Идентификация экдистероидов некоторых видов рода Silene методом ВЭЖХ

2.2.4. Выделение и разделение экдистероидов Silene radicosa,

Silene regia и Silenepseudotites

2.2.5. Идентификация экдистероидов, изолированных из

Silenepseudotites, S.radicosa и S.regia

III. ФИТОХИМИЧЕСКИЕ И ХЕМОТАКСОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ РОДОВ

LYCHNIS И SILENE (CARYOPHYLLACEAE)

3.1. Хемотаксономическое значение фитоэкдистероидов при изучении рода Silene

3.2. Распределение экдистероидов в процессе развития видов Caryophyllaceae

3.2.1. Динамика содержания экдистероидов в однолетних видах

Silene

3.2.2. Динамика содержания экдистероидов в многолетних видах Silene, Lychnis в процессе развития

3.2.3. Изменение содержания экдистероидов в зависимости от возраста растений семейства Caryophyllaceae

IV. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ CARYOPHYLLACEAE

4.1. Радиопротекторная активность экстракта Lychnis chalcedonica и изолированного из его надземной части экдистерона

4.2. Фунгистатическое действие Lychnis chalcedonica

4.2.1. Влияние экстрагента на фунгистатическую активность экстрактов Lychnis chalcedonica

4.2.2. Выявление группы биологически активных веществ и индивидуальных соединений, обладающих фунгистатическим действием

4.3. Гемореологическая активность некоторых видов

Silene и Lychnis

4.4. Оценка противоопухолевых свойств некоторых видов семейства Caryophyllaceae

V. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5.1. Методы качественного и количественного определения экдистероидов

5.1.1. Хроматографические методы

5.1.2. Метод радиоиммунного анализа

5.1.3. Биотест на присутствие агонистов и антагонистов экдистероидов

5.2. Выделение и разделение экдистероидов из видов Silene и Lychnis

5.2.1. Выделение и разделение экдистероидов из видов Lychnis

5.2.2. Выделение и разделение экдистероидов из видов Silene

Введение диссертация по химии, на тему "Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae"

Актуальность темы. Среди разнообразных низкомолекулярных физиологически активных веществ, синтезируемых растениями, заметное место занимают экдистероиды. Являясь структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоза насекомых, эти соединения широко распространены в растительном мире. Исследования последних лет свидетельствуют о существовании двух главных гипотез в отношении значения экдистероидов в онтогенезе растений: защитной и гормональной. Наиболее убедительные доказательства приводятся в пользу детеррентной функции при взаимодействии с неадаптированными беспозвоночными фитофагами, однако получены данные, указывающие на выполнение ими физиологической роли в онтогенезе растительного организма.

К настоящему времени выделено более 250 экдистероидов из объектов растительного и животного мира. По своему химическому строению экдистероиды представляют собой полигидроксилированные стерины с характерными особенностями структуры: цис- сочление А/В циклов, наличие 14а-гидрокси-Д7-6-кетонной группировки и нескольких гидроксильных групп как в стероидной части, так и боковой цепи молекулы.

Фитоэкдистероиды в практическом плане являются основой мощных препаратов анаболического, адаптогенного, тонизирующего и других действий (экдистен, Cytodyne, Ecdybol, Power Health, Macamor, Z-mass и др.). Растительные объекты по содержанию и разнообразию химических структур экдистероидов являются предпочтительными источниками для получения чистых соединений, а также различных субстанций, их содержащих.

К настоящему времени стало известно, что Caryophyllaceae является одним из богатых экдистероидсодержащих семейств и характеризуется большим разнообразием химических структур экдистероидов. Вероятность нахождения новых источников и новых стероидных соединений в нем весьма велика.

Актуальной задачей современной биоорганической химии является изучение распространения фитоэкдистероидов в мировой флоре, поиск их новых и доступных источников, исследование химического состава.

Цель работы. Поиск доступных и перспективных в химическом отношении экдистероидсодержащих растений семейства Caryophyllaceae, способных служить основой для создания препаратов анаболического, радиопротекторного, противоопухолевого, антифунгального и гемореологического действия. Задачи исследования:

- разработать быстрый способ обнаружения и количественного определения фитоэкдистероидов в растительных объектах;

- изучить их распространение в семействе Caryophyllaceae;

- выявить наиболее перспективную по содержанию и составу экдистероидов группу растений;

- исследовать химический состав экдистероидов в перспективных видах Caryophyllaceae;

- выявить закономерности распределения экдистероидов в процессе развития, влияния интродукции и систематического положения видов родов Silene, Lychnis; определить биологическую активность экстрактов экдистероидсодержащих растений, выделенных фракций и индивидуальных фитоэкдистероидов. Положения, выносимые на защиту:

2. Род Silene - богатейший экдистероидсодержащий род мировой флоры.

3. Физиологически активные вещества Lychnis chalcedonica - основа для создания эффективных препаратов антифунгального, радиопротекторного, противоопухолевого и гемореологического действия.

Научная новизна. Разработана стратегия скрининга флоры на присутствие экдистероидов на основании предварительного хроматографического анализа семян, позволяющая сделать заключение о способности растений их синтезировать. Это способствует крупномасштабному изучению распространения экдистероидов в мировой флоре. Проанализировано более 400 видов порядка Caryophyllales, включая 266 видов семейства Caryophyllaceae, принадлежащих 28 родам. Достоверность результатов по выявлению экдистероидсодержащих видов подтверждена радиоиммунным анализом (РИА), биотестированием на культурах клеток Drosophila melanogaster, а также высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Обнаружено 95 новых экдистероидсодержащих видов сем. Caryophyllaceae, включая 8 видов рода Lychnis L. и 75 видов Silene L., 4 вида Sagina L., 2 вида Saponaria L., 2 вида Petrocoptis A.Braun, 1 вид Dianthus L. и 3 вида Melandrium Roehl. Впервые роды Melandrium, Petrocoptis предложены в качестве источников экдистероидов.

Впервые определен химический состав экдистероидов 14 видов семейства Caryophyllaceae: Lychnis chalcedonica L., L.wilfordii (Kegel.) Maxim., Silene antirrhina L., S.chlorifolia Sm., S.cretica L., S.disticha Willd., S.echinata Otth in DC, S.italica (L) Pers, S.linicola C.C.Gmelin, S.portensis L., S.pseudotites Besser ex Reichenb., S.radicosa Boiss. & Heldr. in Boiss, S.regia Sims, S.viridiflora L. Выделено и идентифицировано 19 известных и 3 новых фитоэкдистероида: 2-дезоксиэкдизон 22(3-0-гликозид, 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон и 2-дезоксиполиподин В 3P-D-гликозид, химическое строение которых установлено на основании спектральных (ИК-, УФ-, масс-, ЯМР 'Н и 13С) и ВЭЖХ данных.

Выявлены некоторые закономерности распространения экдистероидов в роде Silene и проведено хемотаксономическое изучение секций этого рода. Изучено распределение экдистероидов в процессе развития 19 видов и оценен вклад органов растений в суммарное количество 20-гидроксиэкдизона.

Впервые выявлены противогрибковая активность экстрактов лихниса халцедонского и изолированных из них фракций флавоноидов, полисахаридов, радиопротекторное действие его этанольного экстракта, а также гемореологическая активность Lychnis chalcedonica, Silene tatarica, S.dioica, S.linicola, S.viridijlora, S.cretica. Установлено, что экдистерон обладает гемореологической и радиопротекторной, а полиподин В антифунгальной активностью. Выявлена противоопухолевая активность экстрактов S.viridijlora, L.chalcedonica.

Практическая значимость. Разработан способ обнаружения фитоэкдистероидов, способствующий быстрому скринингу мировой флоры и надежному прогнозированию наличия их в растениях. Обнаружено 95 новых растительных источников экдистероидов, в том числе 26 видов с высоким содержанием экдистероидов.

Изучено распределение 20-гидроксиэкдизона в процессе развития 19 видов, выявлены органы с наибольшим содержанием (количеством и вкладом в общее количество) экдистероидов и установлены сроки сбора растительного сырья (фазы развития и возраст растений). Показано, что введение экдистероидсодержащих растений в культуру приводит к увеличению уровня экдистероидов в семенах и растениях.

Разработан способ получения средства противогрибкового действия на основе Lychnis chalcedonica. Показано, что спиртовый и водный экстракты, а также индивидуальный полиподин В и фракции, содержащие экдистероиды, флавоноиды и полисахариды, проявляют фунгистатическую активность в отношении поверхностных дерматофитов. Специфическая активность водного экстракта значительно выше эталонных препаратов синтетического и растительного происхождения.

Показано, что спиртовый экстракт лихниса халцедонского и выделенный из него индивидуальный 20-гидроксиэкдизон обладают противолучевой активностью, заметно увеличивая среднюю продолжительность жизни облученных крыс.

Установлено, что этанольный экстракт Lychnis chalcedonica, а также выделенные из него бутанольная, этилацетатная фракции, флавоноиды и 20-гидроксиэкдизон проявляют гемореологическое действие. Разработаны гемореологические средства и способ их получения, защищенные патентами РФ.

Работа выполнена в фитохимической лаборатории Сибирского ботанического сада (Сиб БС) Томского государственного университета в период с 1986 по 2002 год. Экспериментальная часть по выделению и идентификации экдистероидов проведена в лабораториях фитохимии Сиб БС и химии гликозидов Института химии растительных веществ АН Узбекистана (г.Ташкент) при участии Балтаева У.А. и Саатова 3.

Радиоиммунный анализ, биотесты на агонистическую и антагонистическую активности, проведены совместно с доктором Лоуренсом Дайненом (Эксетерский университет, Великобритания). Установление новых структур экдистероидов, а также ВЭЖХ разделение экстрактов растений рода Silene осуществлено совместно с профессором Рене Лафоном (Университет Пьера и Марии Кюри, Париж, Франция).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Сибирского ботанического сада Томского госуниверситета и комплексными исследованиями по теме гранта РФФИ р98сибирь № 98-04-03080 (1998-2000 гг.) и международного проекта INTAS № 96-1291 (1997-2000 гг.). Результаты исследований, являяясь частью комплексной темы, отмечены премией Правительства РФ за 2000 г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 23 конференциях и симпозиумах: всесоюзных (2), российских (10) и международных (И), в том числе на Всесоюзной конференции «Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока (Томск, 1986, 1989), 8th Danube Symposium on chromatography (Warsaw, 1991), Юбилейной конференции "Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов" (Томск, 1994), Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды" (Томск, 1995), 10th International Symposium "Advances and applications of Chromatography in Industry" (Bratislava, 1996), 5-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998), Всероссийском симпозиуме по теории хроматографии и электрофореза, посвященного 95-летию открытия хроматографии М.С.Цветом (Москва, 1998), 23rd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC, 99 (Granada-Spain, 1999), международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств." (Томск, 2000), XIII-XV International Ecdysone Workshop (Jena, Germany - 1998; Rapperswil, Switzerland - 2000; Kolymbari, Greece - 2002).

Благодарности. Автор считает приятным долгом выразить глубокую признательность коллегам и соавторам за неоценимую помощь в осуществлении этой работы: В.И.Ереминой, Н.А.Ивановой, Т.П.Свиридовой, J1.A. Малаховой, П.В.Зибареву, З.Саатову, М.Б.Плотникову, С.Е.Дмитруку, Р.Лафону и Л.Дайнену.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработан способ быстрого обнаружения фитоэкдистероидов, основанный на предварительном хроматографическом анализе семян.

2. Методами радиоиммунного анализа, биотестирования и хроматоспектрофотометрии осуществлен скрининг семян 400 видов растений различных семейств, включая 266 видов, принадлежащих 28 родам Catyophyllaceae, в том числе 152 вида рода Silene L.

Впервые обнаружены экдистероиды в 95 видах: 75 - р.Silene, 8 -p.Lychnis, 2 - Petrocoptis, 4 - Sagina, 2 — Saponaria, 3 - Melandrium, 1 -Dianthus. Установлена наибольшая встречаемость экдистероидов в родах Lychnis и Silene. Выявлено 2 новых экдистероидсодержащих рода: Melandrium Roehl., Petrocoptis A.Braun (Caryophyllaceae).

3. Выделено 22 экдистероида, в том числе новые неизвестные ранее экдистероиды: 2-дезоксиэкдизон 22р-0-гликозид, 2-дезоксиполиподин В 30-D-гликозид и 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон.

4. Выделено и идентифицировано 7 индивидуальных экдистероидов из Lychnis chalcedonica, L.wilfordii: 20-гидроксиэкдизон, экдизон, полиподин В, 24(28)-дегидромакистерон А, интегристерон А, стахистерон Д и витикостерон Е.

5. В результате проведенного хемотаксономического анализа распространения экдистероидов в роде Silene (на примере 105 видов) показано, что более половины секций включают либо только положительные либо только отрицательные виды. В этих секциях можно с определенной вероятностью прогнозировать присутствие (отсутствие) экдистероидов. Наличие экдистероидов является дополнительным и необходимым критерием для систематики рода Silene и поиска их продуцентов среди родственных видов.

6. Показано, что фазами максимального накопления экдистероидов для надземной части однолетних видов является период развития генеративных органов - бутонизация, цветение. В многолетних видах максимальное содержание наблюдается в следующих фенофазах - начало вегетации, бутонизация и цветение. В органах однолетних и многолетних видов отмечается разный характер динамики: максимальные значения как содержания (%), так и количества (мг/1 растение) экдистероидов в однолетних отмечается в репродуктивных органах, тогда как в органах многолетних видов наибольшая концентрация - в репродуктивных органах, а количество - в листьях. По-видимому, общей стратегией как в однолетних, так и многолетних видах Caryophyllaceae является синтез экдистероидов в листьях, а аккумулирование - в плодах.

Установлено, что наибольшее накопление экдистероидов происходит на 2-4 годах жизни растений.

7. Выявлена гемореологическая активность экстрактов Lychnis chalcedonica, Silene tatarica, Silene dioica, Silene linicola, Silene cretica, Silene viridiflora. Наиболее эффективно в сравнении с пентоксифилином снижают вязкость крови и агрегацию эритроцитов Lychnis chalcedonica, Silene tatarica и Silene dioica и не уступают танакану. 20-Гидроксиэкдизон, выделенный из

Lychnis chalcedonica оказывает существенное влияние на реологические свойства крови при ишемии мозга, инфаркте миокарда.

Список источников диссертации и автореферата по химии, доктора химических наук, Зибарева, Лариса Николаевна, Томск

1. Butenandt A., Karlson P. Crystallization of insect Moulting Hormone // Naturforsch. - 1954. - Bd 9B. - P. 389 - 391.

2. Koolman J. Review metabolism of ecdysone // Insect Biochem. 1982. - V. 12. -N3.-P. 225 -250.

3. Insect hormones. The structure of ponasterone A, an insect-moulting hormone from the leaves of Podocarpus nakaii Hay. / K.Nakanishi, M.Koreeda, S.Sasaki et. al. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1966. - V. 24. - P. 915 - 917.

4. Носов A.B. Главная тема номера фитоэкдистероиды // Физиология растений. - 1998. - Т. 45. - № 3. - С. 325.

5. Лафон Р. Фитоэкдистероиды и мировая флора: разнообразие, распределение, биосинтез и эволюция // Физиология растений. 1998. - Т. 45. - № 3. - С. 326 - 346.

6. Henrich G., Hoffmeister Н. Ecdysone als Belgleitsubstanz des Ecdysterones in Polypodium vulgare L. // Experiantia. 1967. - V. 23. - P. 915 - 917.

7. Яцюк Я.К., Сегаль Г.М. О выделении экдистерона // Химия природ, соедин. 1970. - № 2. - С. 281.

8. Зибарева Л.Н.^ Еремина В.И., Иванова Н.А. Новые экдистероидоносные виды рода Silene L. и динамика содержания в них экдистерона // Раст. ресурсы. 1997. - Т. 33, вып. 3. - С. 73 - 76.

9. Дайнен Л. Стратегия оценки роли фитоэкдистероидов как детеррентов по отношению к беспозвоночным-фитофагам // Физиология растений. 1998. -Т. 45. - № 3. - С. 347-359.

10. Screening Results of Plants for Phytoecdysones / S.Imai, T.Toyosato, M.Sakai et. al. // Chem.Pharm. Bull. 1969. - V. 17. - P. 335 - 339.

11. Screening of Formosan Ferns for Phytoecdysones /К.-Y.Yen, L.-L.Yang, T.Okuyama et. al. // Chem. Pharm. Bull. 1974. - V. 22. - P. 805 - 808.

12. Screening of Japanese Ferns for Phytoecdysones / H.Hikino, T.Okuyama, H.Jin, T.Takemoto // Chem. Pharm. Bull. 1973. - V. 21. - P. 2292 - 2302.

13. Зибарева J1.H. Фитоэкдистероиды и другие химические компоненты растений рода Lychnis: Автореф. дис. канд. хим. наук. Новосибирск, 1991. - 19с.

14. Stebbins G.L. Flowering plants. Evolution above the species level. -Cambridge; The belknap press of Harvard Univ. Press. 1974.

15. Zibareva L. Distribution and levels of phytoecdysteroids in plants of genus Silene during development // Archives of insect biochemistry and physiology. -2000.-V. 43.-P. 1-8.

16. Devarenne T.P., Sen-Michael В., Adler J.H. Biosynthesis of ecdysteroids in Zea mays // Phytochemistry. 1990. - V. 40. - P. 1125 - 1131.

17. Абубакиров H.K. Экдистероиды цветковых растений (Angiospermae) // Химия природ, соедин. 1981. - № 6. - С. 685 - 702.

18. Bergamasco R., Horn D.H.S. Distribution and role of insects hormones in plants // Endocrynology of insects. New York, 1983. - P. 270 - 293.

19. Lafont R., Horn D.H.S. Phytoecdysteroids: structures and occurence // Ecdysone from chemistry to mode of action. New York, 1989. - P. 39 - 64.

20. Ecdysteroids from Gomphrena haageana {Amaranthaceae) / S.D.Sarker, J.-P.Girault, R.Lafont, L.N.Dinan // Biochemical Systematic Ecology. 1996. - V. 24.-P. 177- 178.

21. Distribution and identity of phytoecdysteroids in Gomphrena spp. (Amaranthaceae) / T.Savchenko, P.Whiting, S.D.Sarker, L.Dinan // Biochemical Systematics and Ecology. 1998. - V. 26. - P. 337 - 346.

22. Саатов 3. Экдистероиды растений сем. Caryophyllaceae, Labiatae, Compositae: Автореф. дис.докт. хим. наук Ташкент, 1993. - 36 с.

23. Isolation and identification of new ecdysteroids from the Caryophyllaceae / J.-P.Girault, M.Bathori, E.Varga, K.Szendrei, R.Lafont // J. of Natural Products. -1990.-V. 53.-P. 279-293.

24. Виды рода Lychnis L. перспективные источники экдистероидов / Л.Н.Зибарева, У.А.Балтаев, Т.П.Свиридова, З.Саатов, Н.К.Абубакиров // Раст. ресурсы. - 1995. - Т. 31, вып. 4. - С. 1 - 9.

25. Occurence of phytoecdysteroids in Silene species / M.Bathori, R.Lafont, J.-P.Girault, I.Mathe // J. Toxocology Toxin Reviews. 1995. - V. 14. - N 2. - P. 223.

26. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. ХУП. Томентостерон А из Silene tomentella / Н.Ш.Рамазанов, У.С.Максимов, З.Саатов, Н.Д.Абдуллаев // Химия природ, соедин. 1995. - № 6. - С. 714 - 719.

27. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XVIII. Томентостерон В из Silene tomentella / Н.Ш.Рамазанов, У.С.Максимов, З.Саатов, Н.Д.Абдуллаев // Химия природ, соедин. 1996. - № 1. - С. 59 - 61.

28. Зибарева J1.H. Прогнозирование наличия экдистероидов в видах Silene L. и Chenopodium L. по их содержанию в семенах // Раст. ресурсы. 1997. - Т. 33, вып. 1.-С. 89-92.

29. Зибарева Л.Н. Распространение экдистероидов в роде Silene L. и динамика их содержания // Раст. ресурсы. 1999. - Т. 35, вып. 1. - С. 79 - 87.

30. Grebenok R.J., Adler J.H. Ecdysteroid distribution during development of Spinach II Phytochemistry. 1991. - V. 30. - N 9. - P. 2905 - 2910.

31. Grebenok R.J., Adler J.H. Ecdysteroids biothynthesis during the ontogeny of Spinach leaves I I Phytochemistry. 1993. - N 2. - P.341 - 347.

32. Dinan L. Phytoecdysteroids and insect-plant relationships in the Chenopodiaceae // Proc. 8th Int.Symp. Insect-Plant Relationships, Dordrecht: Kluver Acad. Publ. 1992. - P. 86 - 88.

33. Dinan L The analysis of phytoecdysteroid in single (pre-flowering stage) specimens of fat hen, Chenopodium album I I Phytochemical analysis. 1992. - V. 3.-P. 132- 138.

34. Distribution and identities of phytoecdysteroids in the genus Briza (Graminae) / T.Savchenko, P.Whiting, V.Sik, E.Underwood, S.D.Sarker, L.Dinan // Biochemical Systematics and Ecology. 1998. - V. 26. - P. 781 - 791.

35. Analysis of species of the Ranunculaceae for ecdysteroid agonists and antagonists II: ecdysteroids in the genus Anemone / T.Savchenko, P.Whiting, S.D.Sarker, L.Dinan// Biochemical Systematics and Ecology. - 1998. - V. 26. - P. 131 - 134.

36. Ecdysteroid agonist and antagonist activities in species of the Solanaceae / T.Savchenko, P.Whiting, A.Germade, L.Dinan // Biochemical Systematics and Ecology. 2000. - V. 28. - P. 403 - 419.

37. Ecdysteroid xyloside from Limnanthes douglasii / S.D.Sarker, J.-P.Girault, R.Lafont, L.Dinan // Phytochemistry. 1997. -N 3. - P. 513 - 521.

38. The genus Ourisia (Scrophulariaceae): A potential source of phytoecdysteroids / S.D.Sarker, T.Savchenko, P.Whiting, R.Lafont, L.Dinan // Biochemical Systematics and Ecology. 1996. - V. 24. - N 7/8. - P. 803 - 804.

39. Dinan L. A strategy for the identification of ecdysteroids receptor agonists and antagonists from plant// Eur. J. Entomol. 1995. - V. 92. - P. 271 - 283.

40. Балтаев У. Фитоэкдизоны растений рода Rhaponticum. Автореф. дис. . канд. хим. наук. Ташкент, 1978. - 27с.

41. Балтаев У.А., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды Rhaponticum carthamoides И Химия природ, соедин. 1987. - № 5. - С. 681-684.

42. Новосельская И.Л. Фитоэкдизоны растений рода Serratula: Автореф. дис. .канд. хим. наук. Ташкент, 1977. - 23с.

43. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Magnoliaceae Limoniaceae. Л.: Наука, 1985. -460с.

44. Cronquist A. An integrated system of classification of flowering plants. -Columbia University Press, New York. 1981.

45. Тахтаджян A.A. Систематика магнолиофитов. 1987. - 439c.

46. Adler J.H., Grebenok R.J. Biosynthesis and distribution of insect-molting hormones in plants A review. // Lipids. - 1995. - V. 30. - N 3. - P. 257 - 262.

47. Саатов 3., Усманов Б.З., Абубакиров H.K. Фитоэкдизоны Silene praemixta

48. Силеностерон // Химия природ, соедин. 1979. - № 6. - С. 793 - 797.

49. Саатов 3., Усманов Б.З., Абубакиров Н.К. Фитоэкдизоны Silene praemixta1.. Премиксистерон // Химия природ, соедин. 1979. - № 6. - С. 797 - 799.

50. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. III. Силенеозид А новый гликозидный экдистероид Silene brachuica / З.Саатов, М.Б.Горовиц, Н.Д.Абдуллаев, Б.З.Усманов, Н.К.Абубакиров//Химия природ, соедин. 1981. - № 6. - С. 738-744.

51. Фитоэкдистероиды растений рода Silene V. Силенеозид В дигалактозид экдистерона из Silene brahuica / З.Саатов, М.Б.Горовиц, Н.Д.Абдуллаев, Б.З.Усманов, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. - 1982. - № 5. - С. 611 -615.

52. Фитоэкдистероиды растений рода Silene IV. Силенеозид С галактозид интегристерона А из Silene brahuica / З.Саатов, М.Б.Горовиц, Н.Д.Абдуллаев, Б.З.Усманов, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. - 1982. - № 2. - С. 211 -214.

53. Саатов 3., Абдуллаев Н.Д., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene VII. Силенеозид D З-О-а-галактопиранозид экдистерона из Silene brahuica II Химия природ, соедин. -1984.-№6.-С. 741 -744.

54. Фитоэкдистероиды растений рода Silene X. Силенеозид Е 2-дезокси-а-экдизон-З-О-Р-глюкопиранозид из Silene brahuica / З.Саатов, Н.Д.Абдуллаев, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. - 1986. - № 3. - С. 323 - 326.

55. Фитоэкдистероиды растений рода Silene VI. 22-сульфат-а-экдизон -новый экдистероид из Silene brahuica / З.Саатов, Н.Д.Абдуллаев, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. 1984. - № 4. - С. 467 - 470.

56. Фитоэкдистероиды растений рода Silene XVIII. 2-Дезоксиэкдистерон-20,22-моноацетонид из Silene brahuica / М.Х Джухарова, З.Саатов, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров П Химия природ, соедин. 1991. - № 2. - С. 241 - 244.

57. Садиков З.Т., Саатов 3. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XX. Интегристерон А-25-ацетат // Химия природ, соедин. 1999. - № 4. - С. 492 -493.

58. Высокоэффективная жидкостная хроматография фитоэкдистероидов Melandrium nutans / У.Балтаев, Ю.П.Белов, М.Н.Чумаченко, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. 1984. - № 3. - С. 322 - 324.

59. Фитоэкдистероиды Silene nutans. 22-дезоксиэкдистерон и особенности его масс-спектра / У.А.Балтаев, Я.В.Рашкес, В.Н.Дармограй, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. 1985. - № 1. - С. 62 - 66.

60. Балтаев У.А., Рашкес Я.В., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды Silene nutans. III. Нусилстерон // Химия природ, соедин. 1985. - № 4. - С. 522 - 525.

61. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. VIII. 2-Дезоксиэкдистерон-З-ацетат из Silene praemixta // Химия природ, соедин. 1985. - № 1. - С. 60 - 62.

62. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. IX. Экдистерон-22-О-бензоат из Silene scabrifolia / З.Саатов, М.Б.Горовиц, С.Мелибаев, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. 1986. - № 1. - С. 77 - 80.

63. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XI. 2-Дезокси-а-экдизон-З-ацетат из Silene scabrifolia Н Химия природ, соедин. 1986. - № 4. - С. 439 - 441.

64. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XII. 5а-Экдистерон-22-0-бензоат из Silene scabrifolia / З.Саатов, М.Б.Горовиц, Н.Д Абдуллаев, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. 1987. - № 5. - С. 678 - 681.

65. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XIII. Экдистерон-20,22-моноацетонид из Silene scabrifolia И Химия природ, соедин. 1987. - № 5. - С. 767 - 768.

66. Балтаев У.А., Дармограй В.Н., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XIV. Экдистерон-20-0-бензоат из Silene tatarica II Химия природ, соедин. 1987. - № 6. - С. 850 - 852.

67. Балтаев У.А. Экдистерозид новый экдистероид из Silene tatarica (L.) // Workshop on phytoecdysteroids. Abstr. - Syktyvkar. - 1996. - P. 78.

68. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XV. 2-Дезокси-а-экдизон-22-0-бензоат из Silene wallichiana II Химия природ, соедин. 1987. - № 6. - С. 852 - 855.

69. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XVI. Витикостерон Е-22-О-бензоат из Silene wallichiana // Химия природ, соедин. 1988. - № 4. - С. 546 - 549.

70. Фитоэкдистероиды растений рода Лихнис / Л.Н.Зибарева, У.А.Балтаев, Т.А.Ревина, Н.К. Абубакиров // Химия природ, соедин. 1991. - №. 4. - С. 584-585.

71. Зибарева Л.Н., Саатов 3., Абубакиров Н.К. Стахистерон D, витикостерон Е и а-экдизон из Lychnis chalcedonica II Химия природ, соедин. 1991. - №. 4. -С. 585-586.

72. Isolation of Ecdysterone from Indian Plants / A.Banerji, G.J.Chintalwar, N.K.Joshi, M.S.Chadna//Phytochemistry. 1971. - N 10. - P. 2225 - 2226.

73. Ravishankar G.A., Menta A.R. Control of Ecdysterone Biogenesis in Tissue Cultures of Trianthema portulacastrum II J. Nat. Prod. 1979. - V. 42. - N 2. - P. 152 - 158.

74. Boerhaavia diffusa, a New Source of Phytoecdysones / O.P.Suri, R.Kant, R.S.Jamwal, K.A Suri, C.K.Atal // Planta medica. 1982. - V. 44. - P. 180 - 181.

75. Activity of Crude Drugs and Plants (1) / T.Takemoto, S.Ogawa, N.Nishimoto et. al. // Yakugaku Zasshi. 1967. - V. 87. - P. 1414 - 1418.

76. Ecdysterone: an Insect Moulting Hormone from Achyranthes aspera (Amaranthaceae) / R.Ikan, U.Ravid, D.Trosset, E.Shulman // Experientia. 1971. -V. 27.-P. 504-505.

77. Studies on Constituents of Achyranthes radix. VIII. Insect-moulting Substances in Achyranthes genus / S.Ogawa, N.Nishimoto, N.Okamoto, T.Takemoto 11 Yakugaku Zasshi. -1971. V. 91 - P. 916 - 919.

78. Takemoto Т., Ogawa S., Nishimoto N. Isolation of the Moulting Hormones of Insects from Achyranthes radix // Yakugaku Zasshi. 1967. - V. 87. - P. 325 - 327.

79. Studies on the Constituents of Achyranthes Radix. VII. The Insect-moulting Substences of Achyranthes and Cyathula Genera / T.Takemoto, S.Ogawa, N.Nishimoto, H.Hirayama 11 Yakugaku Zasshi. 1968. - V. 88. - P. 1293 - 1297.

80. Studies of the Constituents of Achyranthes Radix. IV. Isolation of the Insect Moulting Hormones from Formosan Achyranthes spp. / T.Takemoto, S.Ogawa, N.Nishimoto, S.Taniguchi // Yakugaku Zasshi. 1967. - V. 87. - P. 1478 - 1480.

81. The Isolation of Ecdysterone from the Radix of Achyranthes obtusifolia / T.Takemoto, S.Ogawa, N.Nishimoto et. al. // Yakugaku Zasshi. 1967. - V.87. -P. 1521 - 1523.

82. Structure of rubrosterone, a novel С19 metabolite of insect-moulting substances from Achyranthes rubrofusca / T.Takemoto, Y.Hikino, H.Hikino et. al. // Tetrahedron Lett. 1968. - P. 3053 - 3056.

83. Hardman R., Mahar S.M.A. Isolation, Identification and Quantification of Ecdysones from Aerva tomentosa and Pandiaka involucra 11 Planta medica. 1978. -V. 33.-P. 278 -279.

84. Steroide Mit Hautungshormon-Aktivitat aus Tieren und Pflanzen / T.Takemoto, S.Ogawa, N.Nishimoto, H.Hoffmeister // Z. Naturforsch. B. 1967. -V. 22.-P. 681 -682.

85. Structure of cyasterone, a novel C29 insect-moulting substance from Cyathula capitata / T.Takemoto, Y.Hikino, K.Nomoto, H.Hikino // Tetrahedron Lett. 1967. - P. 3191 - 3194.

86. Takemoto Т., Nomoto K., Hikino H. Structure of amarasterone A and B, novel C29 insect metamorphosing substances from Cyathula capitata. II Tetrahedron Lett. 1968.-P. 4953 -4956.

87. Structure of capitasterone, a nivel C29 insect moulting hormone from Cyathula capitata /T.Takemoto, K.Nomoto, Y.Hikino, H.Hikino // Tetrahedron Lett. 1968. -P. 4929-4932.

88. Hikino H., Nomoto K., Takemoto T. Structure of sengosterone, a novel C29 insect-moulting substance from Cyathula capitata II Tetrahedron Lett. 1969. - P. 1417- 1420.

89. Hikino H., Nomoto K., Takemoto T. Sengosterone, an insect metamorphosing substance from Cyathula capitata: Structure // Tetrahedron. 1970. - V. 26. - N 3. -P. 887-898.

90. Structure of precyasterone, a novel C29 insect-moulting substance from Cyatula capitata . / H.Hikino, K.Nomoto, R.Ino, T.Takemoto // Chem. Pharm. Bull. 1970. - V. 8. - P. 1078 - 1080.

91. Hikino H., Nomoto K., Takemoto T. Poststerone, a metabolite of insect metamorphosis substances from Cyathula capitata II Steroids. 1970. - V. 16. - P. 393 - 400.

92. Hikino H., Nomoto K., Takemoto T. Structure of isocyasterone and epicyasterone, novel C-29 insect-moulting substances from Cyathula capitata И Chem. Pharm. Bull. 1971. - V. 19. - P. 433 - 435.

93. Shah V.C., De Soura N.J. Ecdysterone from Cyathula prostrata // Phytochemistry. -1971. N 10. - P. 1398- 1399.

94. Ecdysteroids from Pffafia iresinoides and Reassignement of Some 13C NMR Chemical shifts / N.Nishimoto, Y.Shiobara, M.Fujino et. al. // Phytochemistry. -1987.-N26.-P. 2505-2507.

95. Three ecdysteroid glycosides from Pffafia iresinoides / N.Nishimoto, J.Shiobara, S.S.Inoue et. al. // Phytochemistry. 1988. - N 27. - P. 1665 - 1668.

96. Dinan L., Whiting P., Scott A.J. Taxonomic distribution of phytoecdysteroids in seeds of members of the Chenopodiaceae II Biochemical systematics and ecology. 1998. - V. 26. - P. 553 - 576.

97. Determination and isolation of ecdysteroids in native goosefoot species /M.Bathory, I.Toth, K.Szendrei et. al. // Herba Hungarica. 1984. - V. 23. - P. 131 -145.

98. Phytoecdysteroids in the Chenopodiaceae (Goosefoots) / L.Dinan, S.Riseborough, M.Brading et. al. // In: Hrdy I. (Ed.), Insect Chemical Ecology.1991. Academia, Prague. - P. 215 -220.

99. Keckeis K., Sarker S.D., Dinan L.N. Phytoecdysteroids from Atriplex nummularia II Fitoterapia. 2000. - V. 71. - P. 456-458.

100. Identification and Physilogical test of phytoecdysones from Chinese flora with silkworm Bombyx mori L. I L.Z.Wong, H.Y.Li, Y.Y.Chang et. al. // Acta Entomol. Sinica. 1979. - V. 22. - P. 396 - 403.

101. Ecdysteroids in Chenopodiaceae. Chenopodium album / I.Toth, M.Bathory, K.Szendrei et. al. // Fitoterapia. 1981. - V. LII. - N.2. - P. 77 - 80.

102. Dinan L. The association of phytoecdysteroids with flowering in fat hen, Chenopodium album, and other members of the Chenopodiaceae II Experientia.1992.-V. 48.-P. 305 -308.

103. Ecdysteroids in Spinacea oleracea and Chenopodium bonus-henricus / M.Bathory, I.Toth, K.Szendrei, J.Reisch // Phytochemistry. 1982. - V. 21. - P. 236 - 238.

104. Rastrelli L., Tommasi N., Ramos I. Ecdysteroids in Chenopodium pallidicaule seeds // Biochemical Systematics and Ecoljgy. 1996. - V. 24. - P. 353.

105. Clement C.Y., Dinan L. Development of an assay for ecdysteroid-like and antiecdysteroid activities in plants //In: Hrdy I. (Ed.), Insect Chemical Ecology. -1991. Academia. Prague. - P. 221 - 226.

106. Dinan L. Phytoecdysteroids in Kochia scoparia (burning bush) // J. of Chromatography. 1994. - V. 658. - P. 69 - 76.

107. Чадин И.Ф. Экдистероидсодержащие растения Европейского Северо-востока России: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Сыктывкар, 2001. 25с.

108. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероды растений Dianthus hoeltzeri Winkl. II Химия природ, соедин. 1991. - № 6. - С. 837.

109. Isolation of cyasterone and ecdysterone from plant materials / S.Imai, T.Toysato, M.Sakai et al. // Chem. Pharm. Bull. 1969. - V. 17. - P. 340 - 342.

110. Балтаев У.А., Горовой П.Г., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды Lychnis fulgens II Химия природ, соедин. 1986. - № 6. - С. 794 - 795.

111. Kozuka М., Takasaki М., Konoshima Т. New ecdysteroids from Lychnis miqueliana //16th Intern. Symp. on the Chemistry of Natural Products (IUPAC). -Kyoto (Japan). 1988. - P. 143.

112. Зибарева JI.H., Ревина Т.А. Фитохимическое изучение некоторых представителей рода Melandrium семейства Гвоздичных // Тез. докл. пятой регион, научно-практ. конф. Томск, 1986. - С. 14.

113. Ревина Т.А., Ревушкин А.С., Ракитин А.В. Экдистероидсодержащие виды во флоре Горного Алтая // Раст. ресурсы. 1988, вып. 4. - С. 565 - 570.

114. Фитоэкдистероиды рода Melandrium. II. Меландриозид А галактозид витикостерона Е / З.Саатов, Р.У.Умарова, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соедин. - 1991. - № 4. - С. 517 - 520.

115. Зибарева Л.Н. Изучение закономерностей накопления экдистероидов в растениях рода Silene // Тез. междунар. конф. "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окруж. среды". — Томск, 1995. С. 38 - 39.

116. Зибарева Л.Н., Эбель А. Л., Гашкова Л.П. Новые источники фитоэкдистероидов // Мат. междунар. совещ. "Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений", посвящ. памяти В.Г.Минаевой. -Новосибирск, 1998. С. 28.

117. Ecdysteroids from Silene claviformis / Z.Sadikov, Z.Saatov, M Garcia, J.-P.Girault, R.Lafont // Химия природ, соедин. 2001. - № 3. - С. 223 - 225.

118. Зибарева Л.Н., Еремина В.И. Динамика содержания экдистероидов в видах Silene II Раст. ресурсы. 1996. - Т. 32, вып. 1 - 2. - С. 106 - 110.

119. Zibareva L.N. The chromatographic detection of ecdysteroids in plants // 10th International Symposium "Advances and applications of chromatography in Industry". Bratislava, 1996. - P. 34.

120. Мамадалиева H.3., Зибарева Л.Н., Саатов 3 Фитоэкдистероиды Silene linicola // Химия природ, соедин. 2002. - С. 225 - 227.

121. Фитоэкдистероиды рода Silene и динамика их содержания / Н.Ш.Рамазанов, С.А.Султанов, З.Саатов, А.М.Нигматуллаев // Химия природ, соедин. 1997. - № 6. - С. 718 - 723.

122. Bathori М., Szendrei К., Herke J. The ecdysteroids of Silene otites L.Wib. II Herba Hungarica. 1986. - V. 25. - N. 2. - P. 105 - 107.

123. Complex phytoecdysteroid coctail of Silene otites (Caryophyllaceae) /M.Bathori, J.-P.Girault, H.Kalasz, I.Mathe, L.N.Dinan, R.Lafont // Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 1999. - V. 41. - P. 1 - 8.

124. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды в растениях рода Silene И Химия природ, соедин. 1993. - № 5. - С. 627 - 635.

125. Greuter W. Silene {Caryophyllaceae) in Greece: a subgeneric and sectional classification // Taxon. 1995. - V. 44. - P. 543 - 581.

126. Лазьков Г.А. Обзор рода Silene флоры Кавказа // Бот. журн. 1996. - Т. 81. - № 8. - С. 99-112.

127. Лазьков Г.А. Критические заметки о роде Silene {Caryophyllaceae) в Сибири//Бот. журн. 1997.-Т. 82.-№ 1. - С. 108 - 112.

128. Дармограй В.Н. Фармакогностическое изучение некоторых видов семейства Гвоздичных и перспективы использования их в медицинской практике. Диссертация в виде доклада .докт. фарм. наук. Рязань, 1996. 92с.

129. Вересковский В.В., Чекалинская И.И., Пашина Г.В. Динамика содержания экдистерона у видов Rhaponticum Ludw. II Раст. ресурсы. 1983. -Т. 19, вып.1.-С. 60-65.

130. Якубова М.Р., Сахарова Н.А. Динамика содержания экдистерона в подземных органах Rhaponticum carthamoides II Раст. ресурсы. 1980. - Т. 16, вып. 1. - С. 98 - 100.

131. Свиридова Т.П., Ревина Т.А., Яковлева И.А. Биологические и химические особенности видов р.Rhaponticum Ludw., выращиваемых на юге Томской области II Раст. ресурсы. 1993. - Т. 29, вып.З. - С. 50 - 57.

132. Новосельская И.Л., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Витикостерон Е, экдистерон, а-экдизон. Фитоэкдистероиды Serratula coronata // Химия природ, соедин. 1981. - №. 5. - С. 668 - 669.

133. Futher ecdysteroids from Serratula coronata L. (Asteraceae). / V.V.Volodin, L.I. Alexeeva, N.A.Kolegova, S.D.Sarker, V.Sik, R.Lafont, L.Dinan // Biochemical systematics and ecology. 1998. - V. 26. - P. 459 - 461.

134. Фитоэкдистероиды растений рода Serratula и Chenopodium. Выделение и трансформации. / У.А. Балтаев, И.В. Галяутдинов, Е.Б.Боровикова, В.Н.Одиноков. // Тез. докл. III Всероссийское совещание "Лесохимия и органический синтез". Сыктывкар, 1998. - С. 28.

135. Володин В.В. Экдистероиды в интактных растениях и клеточных культурах: Автореф. дис.докт. биол. наук. М., 1999. - 49 с.

136. Состав и содержание экдистероидов в растениях и культуре ткани Serratula coronata / Э.Н.Ануфриева, В.В.Володин, А.М.Носов, М.Гарсиа, Р.Лафон // Физиология растений. 1998. - Т. 45. - № 3. - С. 382 - 389.

137. Sabri N.N., Asaad A., Khabady S.M. Isolation of four ecdysones from Ajuga iva roots and rapid semiquantitative method for ecdysone determination // Planta medica. 1981. - V. 42. - N 3. - P. 293 - 295.

138. Динамика содержания экдистероидов у Ajuga reptans на северной границе ареала (Республика Коми) / Л.И.Алексеева, Л.И.Тетерюк, В.В.Володин, Н.А.Колегова // Раст. ресурсы. 1998. - Т. 34, вып. 4. - С. 56 -61.

139. Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию. М., 1986. - 176с

140. Харборн Дж. Введение в экологическую биохимию. М., 1985. - 311с

141. Ковганко Н.В., Ахрем А.А. Стероиды. Экологические функции. Минск: Навука i тэхшка, 1990. - 224с.

142. Влияние экдизонов на вредителей хлопчатника / С.А.Журавлева, И.Г.Новосельская, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Защита растений. 1977.- № 6. С. 23.

143. Испытание экдизонподобных препаратов для борьбы с озимой совкой / С.А.Муратов, Х.З.Уринова, А.А.Рахимов, З.Саатов // Научные труды Ташк. сельскохоз. ин-т. 1983. - Вып. 106. - С. 91.

144. Уринова Х.З., Умаров А.А., Саатов 3. Фитоэкдистероиды в качестве инсектоакарицидов 11 Защита растений. 1988. - № 3. - С. 25 - 26.

145. Фитоэкдистероиды как детерренты насекомых-фитофагов / В.В.Володин, Т.И.Ширшова, А.П.Якимчук, К.Г.Уфимцев // Тез. докл. междунар. конф. "Физиология растений наука III тысячелетия". - М., 1999. -С. 548.

146. Ахрем А.А., Левина И.С., Титов Ю.А. Экдизоны стероидные гормоны насекомых. - Минск: Наука и техника, 1973. - 232с.

147. Головацкая И.Ф., Карначук Р.А., Епанчинцев А.А. Экдистероиды -возможные природные регуляторы роста // Тез. докл. междунар. конф. "Физиология растений наука III тысячелетия". - М., 1999. - С. 555.

148. Носов A.M. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro II Физиология растений. 1994. - Т. 41. - № 6. - С. 873-878.

149. Wilson I.D., Scalia S., Morgan E.D. Reversed-phase thin-layer chromatography for the separation and analysis of ecdysteroids // J. of Chromatography. 1981. - V. 212. - P. 211 - 219.

150. Thin-layer chromatography of ecdysteroids originated from Silene otites L. / M.Bathori, K.Szendrei, H.Kalasz et al. // Chromatographia. 1988. - V. 25. - N 7.- P. 627 630.

151. Gilgon M.W., Tarquharson Т.Е. Paper chromatographic separation of a-ecdysone, ecdysterone, inokosterone, makisterone A and ponasterone A II Steroids.- 1973. V. 22. - N 3. - P. 365 - 372.

152. Practical aspects of the preparation and chromatography of the trimethilsilyl ethers of ecdysteroids / N.R.Bielby, A.R.Gange, E.D.Morgan, I.D.Wilson // J. chromatography. 1980. - V. 194. - P. 43 - 53.

153. Bielby C.R., Morgan E.D., Wilson I.D. Gas chromatography of ecdysteroids as trimethilsilyl ethers // J. of Chromatography. 1986. - V. 351. - P. 57 - 64.

154. Morgan E.D., Pool C.F. The formation of trimethylsilyl ethers of ecdysones. A reapraisal. // J. of Chromatography. 1976. - V. 116. - P. 333 - 341.

155. Analysis of ecdysteroids by high-performance liquid chromatography and coupled gas-liquid chromatography mass-spectrometry / R.Lafont, G.Somme-Martin, B.Mauchamp et. al. // Progress in Ecdysone Research, Hoffmann, editor. 1980. -P.45-68

156. Lafont R. HPLC analysis of ecdysteroids in plants and animals // Chromatography' 87. Akademiai Kiado, Budapest, 1988. - P. 1 - 15.

157. HPLC screening of plant extracts for ecdysteroids / M.Bathori, K.Szendrei, H.Kalasz, R.Ohmacht // J. of high resolution chromatography & Chromatography communications. 1986. - P. 539 - 541.

158. Хроматоспектрофотометрический метод определения экдистерона в растительном сырье / М.Р.Якубова, Г.Л.Генкина, Т.Т.Шакиров, Н.К.Абубакиров // Химия природ, соединений. 1978. - № 6. - С. 737 - 740.

159. Головкин Б.Н., Китаева Л.А., Немченко Э.П. Декоративные растения СССР. М.: Мысль, 1986. - 320 с.

160. Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды. Химия и биологическая активность. Минск: Наука и техника, 1989. - 327с.

161. Galbraith M.N., Horn D.H.S. Insect moulting hormones: crustecdysone (20-hydroxyecdysone) from Podocarpus elatus И Aust. J. Chem. 1969. - V. 22. - P. 1045- 1057.

162. Jizba J., Herout V., Sorm F. Polypodin В a novel ecdysone-like substance from plant material // Tetrahydron Lett. - 1967. - P. 5139 - 5143.

163. Russell G.R., Fenemore P.G., Horn D.H.S. Insect moulting hormones: The phytoecdysones of Dacridium intermedium // Aust. J. Chem. 1972. - V. 25. - P. 1935 - 1941.

164. Новосельская И.JI., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Экдистерон и полиподин В из Paris quadrifolia II Химия природ, соедин. 1981. - № 3. - С. 402 - 403.

165. Rimpler Н. Pterosteron, polypodin В und neues ecdysonartigers steroid (viticosterone E) aus Vitex megapotamica (Verbenaceae) 11 Tetrahedron Lett. -1969.-P. 329-333.

166. Structures of stachysterone С and D / S.Imai, E.Murata, S.Fujioka et al. // Chem. Soc. Chem. Commun. 1970. - P. 352 - 353.

167. Structure of shidasterone, a novel insect-moulting substance from Blechnum nipponicum /T.Takemoto, J.Hikino, T.Okuyama et al. 11 Tetrahedron Lett. 1968. -P. 6095 - 6098.

168. Chou W.-S., Lu H.-S. Growth regulation and silk production in Bombyx mori L. from phytogenous ecdysteroids // In Hoffman J.A., Ed Progress in ecdysone research. Amsterdam: Elsevier /North-Holland, 1980. - P. 281 - 297.

169. Усманов Б.З., Горовиц М.Б., Абубакиров H.K. Фитоэкдизоны Auga turkestanica III. Строение туркестерона II Химия природ, соедин. 1975. - № 4.-466- 470.

170. Lafont R., Wilson I. (Eds). The ecdysone handbook, 2nd Edition, Chromatographic Society, Nottingham, 1996. P. 84, 100, 262, 336, 398.

171. Sidisterone, a C24 ecdysteroids from Silene dioica and Silene otites / J.-P. Girault, M.Bathori, H.Kalasz, I.Mathe, R.Lafont // J. Nat. Prod. 1996. - V. 59. -P. 522 - 524.

172. The Ecdysone Handbook (3rd Edition) 2002 / R.Lafont, J.Harmatha, F.Marion-Poll, I.D.Wilson http://ecdybase.org.

173. Horn D.H.S., Bergamasco R. // In: Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Pergamon, Oxford, 1985. V. 7. - P. 185.

174. Silene L. / A.O.Chater, S.M.Walters, J.R.Akeroyd, F.Wrigley // Flora Europea, ed. 2. Cambridge, 1993. V.l. - P.191 - 218.

175. Greuter W. Studies in Greek Caryophyllaceae: Agrostemma, Silene, and Vaccaria И Willdenowia. 1995. - V. 25. - P. 105 - 142.

176. Черепанов C.K. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). Русское издание. Спб.: Мир и семья, 1995. -992с.

177. Клоков М.В. Родина Гвоздичш Caryophyllaceae И Флора УРСР. - Кшв, 1952.-Т. 4.-С. 421 -646.

178. Высочина Г.И. Хемотаксономия: системный подход к ресурсоведческому и интродукционному поиску // Мат. междунар. совещ. "Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений", посвящ. памяти В.Г.Минаевой. Новосибирск, 1998. - С. 86-87.

179. Лазьков Г.А. Обзор секции Graminiformes рода Silene (Caryophyllaceae) во флоре России // Бот. журн. 1998. - Т. 83. - № 10. - С. 111 - 118.

180. Лазьков Г.А. Обзор секции Holopetala рода Silene (Caryophyllaceae) во флоре России // Бот. журн. 1998. - Т. 83. - № 5. - С. 89 - 95

181. Антонов А.С. О возможных причинах расхождения взглядов фено- и геносистематиков на филогению и систему высших растений // Бот. журн. -2000.-№. 1.- С. 3- 11.

182. Cronquist A. The evolution and classification of flowering plants. New York, 1988.-555p.

183. Chemataxonomic significance of phytoecdysteroids in the Caryophyllaceae /L.Zibareva, V.Volodin, Z.Saatov, R.Lafont, L.Dinan // 14th Ecdysone Workshop. Abstract Book. Rapperswil, Switzerland, 2000. - P. 62.

184. Oxelman В., Liden M. Generic boundaries in the tribe Sileneae (Caryophyllaceae) as inferred from nucler rDNA sequences // Taxon. 1995. - V. 44. - P. 525 - 542.

185. Chemothaxonomic value of phytoecdysteroid profiles in the genus Silene (Caryophyllaceae) / L.Zibareva, J.-P.Girault, R.Lafont, L.Dinan // XV International Ecdysone Workshop. Kolymbari (Greece), 2002. - P. 15.

186. Dinan L., Savchenko Т., Whiting P. On the distribution of phytoecdysteroids in plants //Cellular and Molecular Life Sciences. 2001. - V. 58. - P. 1121 -1132.

187. Зибарева Л.Н., Еремина В.И. Распределение 20-гидроксиэкдизона в различных частях Silene bellidifolia Juss. ex Jacq. и S.squamigera Boiss., выращиваемых в Сибирском ботаническом саду (Томск) // Раст. Ресурсы. -2002, вып. 2.-С. 81-85.

188. Зибарева Л.Н., Свиридова Т.П. Динамика содержания экдистерона Lychnis chalcedonica L., выращиваемом в Сибирском ботаническом саду (г.Томск) // Раст. ресурсы. 1989, вып. 4. - С. 561 - 564.

189. Zibareva L., Ivanova N., Yeriomina V. Ecdysteroid distribution during development of perennial species Silene frivaldszkyana // XV International Ecdysone Workshop. Kolymbari (Greece), 2002. - P. 16.

190. Верещагин В.И., Соболевская K.A, Якубова А.И. Полезные растения Западной Сибири. М.; Л: Наука, 1959. - 347с.

191. Варлаков М.Н. Избранные труды / Под ред. А.Д. Туровой. М., 1963. -С. 69 - 76.

192. Анели Н.А., Ментешашвили А.А., Лачашвили И.И. Лекарственные растения Цхинвальского и Джавского районов ГССР. В кн.: Биологически активные вещества флоры Грузии. - Тбилиси, 1967. - С. 309 - 318.

193. Hartwell J.L. Plants used against cancer // Lloydia. 1968. - V. 31. - №. 2. -P. 71 - 170.

194. Алексеев Г.А., Якимова З.П. Лекарственные растения на территории Чувашии. Чебоксары, 1975. - 229 с.

195. Оралбаев К.О. Изучение фармакодинамики препаратов из растений смолевок брагуйской и широколистной. // В кн.: Изучение лекарственного сырья Казахстана и синтетических препаратов. - Алма-Ата, 1957, вып. 1. - С. 63 - 79.

196. Блинова К.Ф., Куваев В.Б. Лекарственные растения тибетской медицины Забайкалья. // В кн.: Вопросы фармакогнозии, 1965, вып. 3. С. 163 - 178.

197. Шретер А.И. Лекарственная флора советского Дальнего Востока. М., 1975. - 327с.

198. Кормовые растения сенокосов и пастбищ СССР / И.В.Ларин, Ш.М.Агабабян, Т.А.Работнов и др. Л.; М., 1951. - Т. 2. - 948с.

199. Вичканова С.А., Рубинчик М.А. Методика изыскания антимикробных препаратов из высших растений // Фитонциды, их биологическая роль и значение для медицины и народного хозяйства. Киев, 1967. - С. 138 - 141.

200. Антигрибковые свойства экдистероидов лихниса халцедонского / С.Е.Дмитрук, Л.Н.Зибарева, Е.Н.Сальникова, И.Ф.Гусев // Тез. докл. конф. "Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации" Самара. 1996. С. 125.

201. Пат. 1755440, МКИ А 61 К 35/78. Способ получения средства, обладающего противогрибковым действием / Л.Н. Зибарева, С.Е. Дмитрук, Е.Н. Сальникова. № 4838137/14; Заявлено 07.05.90; Опубл. 1.03.93, Бюл. № 30. Приоритет 07.05.90.

202. Пат. 1510146, МКИ А 61 К 35/78. Способ получения средства, обладающего фунгицидной активностью / С.И.Дмитрук, С.Е.Дмитрук, Т.П.Прищеп, и др. Опубл. 23.09.89. Бюл. № 35.

203. Колтунов А.А. Фармакологическая коррекция синдрома повышенной вязкости крови при патологических состояниях сердечно-сосудистой системы: Автореф. дис. канд. мед. наук Томск, 1997. - 22 с.

204. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих флавоноиды / М.Б.Плотников, А.А.Колтунов, О.И.Алиев, и др. // Раст. ресурсы. 1998. - Т. 34, вып. 1. - С. 87 - 91.

205. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих экдистероиды / М.Б.Плотников, Л.Н.Зибарева, А.А.Колтунов и др. // Раст. ресурсы. 1998. - Т. 34, вып. 1. - С. 91 - 97.

206. Гемореологические эффекты экстрактов Lychnis chalcedonica L. / М.Б.Плотников, О.И.Алиев, А.С.Васильев, М.Ю.Маслов, Л.Н.Зибарева, С.Е.Дмитрук, Г.И.Калинкина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2000. - Т. 63. - № 2. - С. 54 - 56.

207. Пат. 2138284, МКИ А 61 К 35/78. Гемореологическое средство и способ его получения / М.Б.Плотников, О.И.Алиев, А.С.Васильев, М.Ю.Маслов, Л.Н.Зибарева. №. 98114435/14; Заявлено 14.07.98; Опубл. 27.09.99, Бюл. № 27. Приоритет 14.07.98.

208. Гемореологическая активность экдистерона и различных фракций экстракта Lychnis chalcedonica L. in vitro /М.Б.Плотников, Л.Н.Зибарева,

209. А.С.Васильев, О.И.Алиев, М.Ю.Маслов, С.Е.Дмитрук // Раст. ресурсы. -2000. Т. 36, вып. 3. - С. 91 - 94.

210. Пат. 2160592, МКИ А 61 К 31/575, А 61 Р 7/00, 7/02. Гемореологическое средство / Л.Н.Зибарева, О.И.Алиев, А.А.Колтунов, М.Б.Плотников № 96118150/14; Заявлено 11.09.1996; Опубл. 20.12.2000, Бюл. № 35. Приоритет 11.09.1996.

211. Сыров В.Н. Фитоэкдистероиды: биологические эффекты в организме высших животных и перспективы использования в медицине // Эксперим. и клинич. фармакология. 1994. - № 5. - С. 61 - 66.

212. Дмитрук С.Е. Антифунгальные свойства биологически активных веществ некоторых представителей флоры Сибири: Автореф. дис.док. фарм. наук. Харьков, 1991. 45с.