Физические основы лазерных методов в онкологии

Иванов, Андрей Валентинович

Физические основы лазерных методов в онкологии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

Иванов, Андрей Валентинович АВТОР

доктора физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2003 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.01 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Физические основы лазерных методов в онкологии»

Автореферат диссертации на тему "Физические основы лазерных методов в онкологии"

На правах рукописи

УДК 535.21:535.33:535.339.047: 53.082.9:535.36:621.373.826: 577.33/34:615.849.19:616-006-7

Иванов Андрей Валентинович

ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЛАЗЕРНЫХ МЕТОДОВ В ОНКОЛОГИИ

Специальность 01.04.01 - приборы и методы экспериментальной физики

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Государственном учреждении Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина и в Московском государственном институте электроники и математики (Технический университет)

Официальные оппоненты:

доктор физ.- мат. наук В.А. Миляев

доктор физ.- мат. наук, профессор В.В. Григорьянц

доктор физ.- мат. наук, профессор,

Лауреат Государственной премии СССР В.Г. Дмитриев

Ведущая организация: Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова, Физический факультет

Защита диссертации состоится «/^7» июня 2003 г. в « 14» часов на заседании диссертационного Совета Д 002.135.01 при НТЦ Уникального приборостроения РАН по адресу: 117342, г. Москва, ул. Бутлерова, д. 15

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НТЦ Уникального приборостроения РАН по указанному адресу.

Автореферат разослан « » 2003г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Д 002.135.01, к.ф. - м.н.

Е. А. Отливанчик

И5®\

Общая характеристика работы.

Актуальность.

Важность проблемы "Злокачественные новообразования" определяет постоянный поиск новых и совершенствование имеющихся средств и методов диагностики и лечения опухолей. Исследования в области применения лазерного излучения (ЛИ) в онкологии ведутся уже около 40 лет и направлены в основном на поиск путей разрушения опухолей. Определенные успехи в разработке лазерных методов лечения опухолей и промышленный выпуск специализированных лазерных медицинских установок создали условия для использования лазерного излучения в практической онкологии. При этом в каждом конкретном случае в зависимости от вида, локализации и распространенности опухолевого заболевания встает вопрос о выборе источника излучения и оптимального режима воздействия на опухоль для достижения большего лечебного эффекта. Однако набор применяемых в онкологических клиниках лазерных методов повреждения опухолей и самих лазеров весьма ограничен, хотя современная промышленная технология предоставляет широкие аппаратурные и методические возможности деструктивно-термической обработки очагов патологии.

Многие приемы лазерной обработки материалов еще не нашли применения в отечественной медицине, хотя области их применения очевидны. Несомненно, что привлечение в медицину, и в онкологию в частности, отработанных и апробированных в промышленности приемов лазерной технологии в ближайшем же времени даст значительный положительный эффект. В связи с этим экспериментальное и теоретическое обоснование привлечения для целей практической онкологии новых источников излучения и новых режимов обработки злокачественных новообразований, разработка на этой основе новых методов и средств лечения опухолей представляются важными и актуальными.

В последние два десятилетия в онкологии повышенный интерес проявляется к новому направлению лечения опухолей - фотодинамической терапии (ФДТ), являющейся результатом совместной работы ученых разных областей науки: медиков, биологов, химиков, физиков. Это активно развивающееся направление в России еще не вышло за стены крупных онкологических институтов и клиник. Тем не менее, накопленный клинический опыт уже заставляет ставить вопрос о поиске путей повышения эффективности ФДТ опухолей.

С созданием лазеров начался также новый этап в развитии светолечения, приведший к разработке методов низкоэнергетической лазерной терапии (НЛТ). Экспериментальные исследования л—данные

клиники показывают, что низкоэнергетическое лазерное!

и.":

лазерное^йЯМеШ ШЛИ)

обладает отчетливо выраженной биологической активностью, оказывает болеутоляющее, сосудорасширяющее и противовоспалительное действие. Однако для широкого применения методов НЛТ в практической онкологии необходимо проведение углубленного исследования, направленного на отработку оптимальных условий лазерной терапии, выяснение механизмов биостимулирующего действия ИЛИ и специфики его действия на опухолевый процесс.

При всем многообразии биологических эффектов ЛИ, обнаруживаемых на различных уровнях биологической организации и закономерно связанных между собой временной последовательностью проявления, до сих пор крайне недостаточно исследованы начальные фотофизические стадии преобразования кванта света в реакцию биологической системы. Остается нерешенным принципиальный вопрос о первичном фотоакцепторе (ПФА), который в результате первичного фотофизического акта запускает цепь последовательных биохимических, структурных и физиологических изменений, проявляющихся на организменном уровне в виде эффектов биостимуляции. Идентификация ПФА составляет основное звено научного обоснования практических методик лазерной терапии.

Рост заболеваемости злокачественными новообразованиями во всем мире выдвигает проблему их ранней диагностики в ряд первоочередных. Имеющиеся в распоряжении онкологов методы скринингового обследования с целью формирования групп повышенного онкологического риска, последующее клиническое обследование которых позволяет выявить заболевание на ранней стадии, далеки от совершенства. Необходимо развитие объективных аппаратурных методов и создание соответствующих методик и приборов для диагностики рака, простых и доступных для оперативного применения в повседневной практике.

Совершенно очевидно, что конечный клинический результат применения лазерных методов лечения и диагностики определяется пониманием физических явлений, лежащих в их основе и обеспечивающих их адекватное использование.

Цель и задачи.

Целью работы является исследование биологических эффектов и изучение механизмов биологического действия ЛИ, экспериментально-теоретическое обоснование и разработка на их основе новых методов и средств диагностики и лечения опухолевых заболеваний с использованием свойств лазерного излучения.

новые эффективные способы деструкции опухолей ЛИ; изучить возможность технической реализации этих способов;

2) оценить возможности ФДТ опухолей с использованием фотосенсибилизаторов отечественного производства; дать рекомендации по повышению эффективности ФДТ опухолей;

3) выявить основные звенья механизма биостимулирующего действия НЛИ; изучить влияние ЛИ различных длин волн на клетки крови, определить оптимальные условия лазерного воздействия для разработки методик клинического использования методов НЛТ онкологических больных;

4) провести исследования по идентификации первичного фотоакцептора биостимулирующего действия ЛИ;

5) исследовать спектрально-оптические характеристики нормальных и опухолевых тканей и изучить возможность разработки на их основе спектральных методик диагностики опухолей; провести поиск путей усиления спектральных различий нормальных и опухолевых тканей.

Научная новизна.

Научная новизна проведенных исследований определяется следующими положениями, выдвинутыми на защиту.

1. Практически весь спектр технологических возможностей лазеров может быть использован в медицинских целях • при корректной медико-технической постановке задачи.

Сформулирована математическая модель нестационарного тепловыделения в биологической ткани при действии ЛИ ближнего ИК диапазона, обладающая прогностической ценностью, подтвержденной исследованиями в клинике экспериментальных животных. Теоретически предсказаны (рассчитаны) и экспериментально реализованы режимы работы лазера, позволяющие производить рассечение любых биологических тканей, включая костные, на заданную глубину. Для целей хирургии, в частности, онкохирургии предпочтительным является импульсно-периодический режим работы лазера, который может быть рекомендован для разработки специализированных лазерных хирургических установок.

Предложен и аппаратурно реализован метод контактной лазерной хирургии с использованием импульсно-периодического YAG : Nd+3 - лазера. Разработаны и реализованы методика лазерной внутритканевой термодеструкции метастазов в печени и методика лазерной декомпрессии межпозвонковых дисков.

биотехнологических подходов в сочетании с искусственной регуляцией метаболической активности тканей и современной лазерной и оптоэлектронной техникой. Активные оптические системы с лазерными усилителями яркости, а также пространственно-временными модуляторами света (ПВМС) являются эффективным средством для повышения избирательности воздействия ЛИ на патологически измененные ткани.

Предложен аппаратурный метод повышения селективности лазерной фото- и фотодинамической терапии опухолей на основе активных • оптических систем с усилителями яркости; исследованы различные схемы повышения контраста изображения. Впервые осуществлено избирательное воздействие ЛИ на опухоль путем формирования действующего пучка по . форме очага патологии на основе спектрально-оптических характеристик ткани с использованием ПВМС и управлением параметрами потока ЛИ от персональной ЭВМ.

3. Впервые проведено комплексное исследование, раскрывающее один из механизмов биологического действия оптического излучения от первичного фотофизического акта (поглощения фотона) до тканевых реакций и реакций отдельных систем организма. Начальным звеном биостимуляции, вызываемой ЛИ, является обратимая модификация плазматических мембран клеток, в частности, мембран форменных элементов крови и структурная перестройка водной матрицы. Низкоэнергетическое лазерное излучение является биологически активным модификатором иммунитета и может быть использовано на различных этапах лечения больных.

4. Одним из основных ПФА, ответственных за биологические эффекты низкоэнергетического излучения оптического диапазона, является молекулярный кислород, в значительном количестве содержащийся во всех живых биологических объектах. Впервые получены детальные спектры биологического действия оптического излучения в диапазоне 570-600 нм, 615-650 нм, 740-830 нм и 1240-1290 нм, выявившие полное совпадение их с полосами поглощения молекулярного кислорода.

Этими экспериментами впервые был надежно идентифицирован один из первичных фотоакцепторов, ответственных за биологические эффекты НЛИ видимого и ближнего ИК диапазона: молекулярный кислород -универсальный фотоакцептор для всех живых биологических систем.

Предложен принципиально новый метод беспрепаратной фототерапии опухолей, основанный на действии излучением в полосах основного эндогенного фотоакцептора - молекулярного кислорода, по первичному фотопродукту аналогичный ФДТ. Открыт светокислородный эффект (СКЭ). лежащий в основе новой медицинской технологии - светокислородной « терапии (СКТ).

Проведено изучение спектрально-оптических характеристик нормальных и патологически измененных тканей человека in vitro и in vivo; обнаружены спектральные отличия между нормальными, воспаленными, доброкачественно и злокачественно измененными тканями. Усиление спектральных различий нормальных и опухолевых тканей может быть достигнуто применением туморотропных контрастирующих соединений как за счет их люминесцентных, так и абсорбционных свойств. На основе проведенных исследований предложено несколько способов и устройств для диагностики опухолей, доступных для визуального и эндоскопического обследования.

Разработан способ морфометрии тканевых структур в гисто- и цитологических исследованиях с использованием акустооптического микроспектрофлуориметра; создан макет устройства для реализации этого способа, и проведены его испытания.

На основе изучения методом лазерной корреляционной спектроскопии подвижности белковых молекул в растворе разработана методика массового онкологического скрининга с целью формирования групп повышенного онкологического риска.

Научная новизна проведенных исследований подтверждена 19 авторскими свидетельствами и патентами на изобретения, полученными в процессе выполнения работы.

Научно-практическая значимость.

Получены новые данные в области фундаментальных проблем фотобиологии животной клетки, позволяющие выйти на физический структурно-функциональный уровень понимания фотобиологических реакций клеток, а в ряде случаев и первичных механизмов патогенеза. Выявленные закономерности действия ЛИ видимого и ближнего ИК-диапазона на опухолевый процесс значительно углубляют существующие представления о характере и механизмах действия ЛИ на биологические системы.

Создана научная основа для разработки новых биомедицинских технологий, в том числе методов фототерапии широкого круга заболеваний, включая онкологические. Разработаны и внедрены в практику ряда лечебных учреждений метод адоптивной лазерной фотоиммунотерапии для ранней профилактики рецидивов и метастазирования у онкологических больных и метод НЛТ постлучевых, послеоперационных и воспалительных осложнений.

Проведенные экспериментальные исследования по идентификации ПФА определяют направления технической реализации наиболее оптимальной лечебно-диагностической аппаратуры, в основе которой могут

лежать не только лазеры, но и достаточно широкополосные - источники излучения.

Созданы теоретические основы и проведено экспериментальное обоснование новой медицинской технологии - контактной лазерной хирургии и ее сочетание с тепловой деструкцией опухолей. Разработаны медико-технические требования на лазерную медицинскую установку для деструкции опухолей, на основе которых создана современная лазерная медицинская установка для контактной хирургии опухолей "ЛАСКА", разрешенная к серийному производству и нашедшая уже применение в клинической практике.

Проведенное комплексное исследование физико-химических и биологических свойств ряда фотосенсибилизаторов является основой для создания научных критериев отбора и оценки фотодинамической эффективности при скрининге потенциальных фотосенсибилизаторов. Предложены и представлены к клиническим испытаниям новые фотосенсибилизаторы на основе хлорина ее - «Фотодитазин» и «Радахлорин».

Реализованный в работе метод повышения селективности фототерапии опухолей на основе активных оптических систем с усилителями яркости и пространственно-временными модуляторами света может быть использован не только в онкологии, но и для воздействия на любые очаги патологии, имеющие спектральные отличия от окружающей нормальной ткани, локализованные как на поверхности организма, так и во внутренних органах при использовании эндоскопической техники с регулярными световолоконными жгутами, передающими изображения. Разработанный и созданный для этих целей диагностико-терапевтический комплекс «ФОТОС» удостоен медали «Лауреат ВВЦ».

Установленные спектральные различия нормальных и патологически измененных тканей человека явились базой для разработки ряда диагностических методик и аппаратуры; созданная по разработанным медико-техническим требованиям спектрометрическая приставка к эндоскопу «Кварц 3102-В-ГЭ» прошла клинические испытания и рекомендована к применению и серийному производству.

Принципы диагностического обследования, положенные в основу представленной в работе методики массового онкологического скрининга с целью формирования групп повышенного онкологического риска и онкологического мониторинга получивших лечение пациентов, могут быть использованы в диспансерном наблюдении пациентов и с другими заболеваниями, например, сердечно-сосудистыми или при патологии печени на уже разработанной аппаратурной базе; созданный для этих целей лазерный компьютерный анализатор находится на сертификации в Комитете по новой медицинской технике МЗ РФ.

Некоторые результаты работы внедрены в практику лечебных учреждений Москвы и ряда регионов России. Часть результатов диссертации использована в лекционном курсе для студентов МГИЭМ.

Апробация работы

Результаты работы были представлены более чем на шестидесяти всесоюзных, всероссийских и международных конгрессах, съездах, конференциях и симпозиумах. В частности, на III, IV, V. Всероссийских съездах онкологов - Ростов- на -Дону (1986, 1995), Казань (2000); I и II Съездах онкологов стран СНГ- Москва (1996), Киев (2000); Всесоюзных конференциях по применению лазеров в медицине - Москва(1987, 1989, 1993, 1994), Самарканд (1988), Тарту (1989, 1990), Одесса (1992), Санкт -Петербург (1993), Казань (1995), Киев (1995); V - XII Международных конференциях "Лазеры в науке, технике, медицине" - Суздаль (1994, 1995), Сергиев Посад (1996), Пушкинские Горы (1997), Геленджик (1998), Сочи (1999, 2000, 2001, 2002); I, II Всероссийских съездах фотобиологов - Пущино (1996, 1998); Международных конференциях "Магнитный резонанс в биологии и медицине" - Черноголовка (1989), Звенигород (2001), Суздаль (1998); I Съезде иммунологов России - Новосибирск (1992); XIII Международной конференции по нелинейной оптике - Минск (1988); VII Международной конференции "Химия порфиринов и их аналогов" - Санкт -Петербург (1995); V Международной конференции "Лазерные технологии" -Шатура (1995); Международном симпозиуме "Конверсионные разработки медицинской техники" - Подольск (1996); Международных конференциях "Физика и промышленность" - Голицино (1996); Международных конференциях по медицинской физике - Москва (1995, 1997, 2001), Нанс (1997); "Лазеры в биомедицине" - Гродно (2002); международных конференциях "Лазеры в науках о жизни" - LALS - 90, Москва (1990), LALS - 94, Минск (1994), LALS - 96, Йена (1996), LALS - 98, Братислава (1998); XXIII Генеральной ассамблее Международного радиосоюза - Прага (1990); по биомедицинской оптике BIOS, Барселона (1995), Сан-Ремо (1997), Лилль (1994), Сан-Хосе (2000); по фотодинамической терапии - София (1989), Пекин (1991); по лазерам на парах металлов и их применениям - Лос-Анжелес (1989), Ростов - на -Дону (1998), Томск (2001).

Отдельные разделы работы докладывались на семинарах Физического института им. П.Н. Лебедева РАН, Института общей физики РАН, Лазерной ассоциации, заседаниях Московского онкологического общества и Ученого совета РОНЦ им. H.H. Блохина.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, состоящих из нескольких разделов, заключения, списка цитируемой литературы из 324 наименований и содержит 243 страниц текста, 92 рисунка, 15 таблиц. В конце работы, в заключении сформулированы основные результаты и выводы.

Содержание работы

Глава I диссертации посвящена исследованию термических механизмов действия ЛИ на биологические объекты. Как и в большинстве промышленных лазерных технологий термические (тепловые) механизмы воздействия по распространенности практического использования е медицине являются преобладающими. В учебно-справочной литературе эти механизмы описаны достаточно подробно. Однако практическое их использование требует четкой конкретизации медицинской задачи.

В разделе I главы I приведены результаты сравнительного гистоморфологического исследования особенностей повреждающего действия на животные ткани излучения различных лазерных источников импульсных рубинового (694.3 нм, 1.5х10'3 с, <100 Дж; 25х10'9 с, <3.5 Дж 1.4 х108 Вт), неодимового (1060 нм, 2.5х10"3 с, < 1000 Дж; 4х10"8 с,< 12 Дж 3x108 Вт), углекислотного (с поперечным разрядом, 10600 нм, 10"6 с,<3 Дж f= 1/60 Гц) и эрбиевого YAG: Ег+3: (2940 нм, 2x10"* с,<2 Дж, f<5 Гц; на 3 Yi - 0.4 Дж, на 5 Гц - 0.1 Дж) и непрерывного С02 лазеров (60 Вт, 10600 нм).

В этой серии экспериментов использованы белые беспородные крысы-самцы (84 особи), мыши гибриды Fl (СВАхС57 В1) -' 40 особей к изолированные органы и ткани человека (32 биоптата). Экспериментальнс при использовании мощных импульсных лазеров в режиме свободное генерации во всем диапазоне энергетических нагрузок до 4200 Дж/см2 не удалось получить поражения тканей глубже 0.6 см. Переход к режим> модулированной добротности, естественно, значительно уменьшал размерь повреждения, выявляемые гистологическим исследованием. Полученные результаты свидетельствуют о существовании оптимального соотношенш параметров импульса излучения, при которых достигается максимальна; глубина поражения тканей. По нашим данным для рубинового \ неодимового лазеров с длительностью импульса ~10'3с максимальна? глубина поражения достигается при плотности энергии 700 - 1000 Дж/см2 \ составляет 0.5 - 0.6 см. Ограничение глубины поражения связано с тем, чтс глубина прогрева ткани до температуры денатурации белков (достижение этой температуры можно принять за порог биологического повреждения выявляемого гистоморфологически) определяется критической плотностьк мощности излучения, при которой еще не происходит интенсивногс испарения воды в поверхностных слоях ткани. Увеличение глубинь

поражения возможно при уменьшении плотности мощности и увеличении времени воздействия. В предельном случае это переход к режиму непрерывной генерации, реализуемому в известных "лазерных скальпелях".

Использование излучения непрерывного СОг - лазера при его фокусировке (плотность мощности ~ 3x107 Вт/м2) обеспечивало достаточно быстрое бесконтактное и бескровное рассечение мягких тканей, по глубине ограниченное каустикой лазерного пучка, а при плотности мощности 104 -106 Вт/м2 была возможна коагуляционная обработка тканей на различную глубину: от поражения только верхних слоев кожи до некроза всей ее толщи и подлежащих мышц в зависимости от времени воздействия, т.е. дозы. Особенностью повреждения является отсутствие демаркационного воспаления.

Использование импульсного излучения С02 - лазера производит выраженное деструктивное воздействие в тонких слоях 200 - 300 мкм. Это связано с сильным поглощением излучения 10.6 мкм водой и кратковременностью воздействия - Ю^с, при которой распространение тепла от места тепловыделения за счет теплопроводности не происходит и практически вся энергия лазерного импульса идет на испарение тонкого поверхностного слоя, а не на нагрев объема окружающей ткани. Особенно четко эти эффекты выражены при воздействии на животные ткани импульсным излучением эрбиевого лазера 2,94 мкм, резонансно поглощаемым водой. Даже при работе в импульсно - периодическом режиме с частотой 5 Гц (в технологии - режим скрайбирования) при испарении значительных по глубине (2-5 мм) участков ткани толщина пограничного коагулированного слоя в области образованного дефекта не превышала 2-3-х клеточных слоев 20 мкм. Такой режим облучения бесперспективен в клинической онкологии, однако может быть полезен при лечении различных дерматозов, в том числе инфекционной и паразитарной природы с локализацией поражения в пределах эпидермиса, при некоторых заболеваниях слизистой в оптически доступных областях организма, а также для осуществления ювелирных оперативных вмешательств на органах, важных в жизненном и функциональном отношении.

Изучение методами оптической микроскопии и кислотного гемолиза характера повреждений при действии излучения неодимового, рубинового и Не-Ые лазеров на изолированные клетки крови позволило разделить различные этапы возникновения повреждений. Анализ полученных результатов показывает, что ЛИ вызывает повреждение мембран эритроцитов по нескольким различным механизмам: фотохимическому (фотодинамическому), тепловому (денатурационному, модифицирующему фотохимическое повреждение) и ударно-механическому (рис. 1). В зависимости от параметров действующего излучения эти механизмы проявляются либо в отдельности, либо последовательно сменяя друг друга, либо одновременно. Нам удалось наблюдать последовательную смену

доминирующих механизмов повреждения. При наличии резонансного поглощения и относительно низкой интенсивности облучения 104 Вт/м2 при непродолжительном воздействии преобладает фотохимическое повреждение,

б 7 1Л II "У

сменяемое при 10 Вт/м тепловым, а при 10 - 10 Вт/м - ударно-механическим.

0,4

0,2

^10% [мин]

• /»-"Г 694,3 нм

3-Ю'8 с

694,3 нм КГ3 с

632,8 нм непрерывный

Е [ДяфЮ"4

Рис.1 Зависимость повреждающего действия излучения Не-Ие- и рубинового лазеров на окрашенную метиленовым голубым суспензию эритроцитов (рассчитано на один эритроцит с учетом спектра поглощения красителя и концентрации клеток в образце).

Наличие энергетических порогов для появления повреждений в клетках (рис. 1) объясняется необходимостью достижения определенного энерговклада при высоких интенсивностях облучения, достаточного для возникновения фотоакустических и кавитационных эффектов, и необходимостью "выключения " системы антиоксидантной защиты клеток при низких и средних интенсивностях облучения.

Присутствие в тканях и в клетках резонансно поглощающих центров (неоднородностей) и специфичность места "посадки" их на мембране сказывается на степени и характере повреждений биологических мембран ЛИ, так что различия в последних могут быть использованы для селективного поражения как отдельных структурных элементов клетки, так и определенных звеньев цепи биохимических реакций в процессе метаболизма.

В разделе II главы I проведено экспериментально - теоретическое обоснование режимов лазерного воздействия при лечении опухолей высокоинтенсивным ЛИ методами лазерной хирургии и термодеструкции.

Для рассечения биотканей при проведении операций рассмотрен фототермический эффект в кварцевом световоде, контактирующем с биотканью. Показано, что кварцевая жила световода, по которому распространяется импульсное ЛИ, в зоне контакта с биотканью разогревается до высокой температуры из-за нелинейности коэффициента поглощения

биотканей. Нелинейность коэффициента поглощения связана с присутствием в тканях микронеоднородностей, каковыми являются эритроциты крови, кровеносные капилляры, потовые железы, волосяные сумки с пигментом и т.п., размером 10-100 мкм, коэффициент поглощения которых существенно больше, чем в окружающей их среде. Эффективность разогрева микронеоднородностей зависит от длительности лазерных импульсов т и определяется размером включений R и температуропроводностью среды аг согласно условию т < R2/as. Поскольку для большинства биотканей ае = (2,22,6) 10~3 см2/с, то при т = 10"3-10"2 с (режим свободной генерации) будет проявляться нелинейный характер поглощения ЛИ в биотканях. Это приводит к более интенсивному локальному разогреву в области контакта световода с биосредой, ее испарению и покрытию кварцевой жилы световода продуктами распада биоткани, что ведет к увеличению поглощения лазерного излучения в открытой конечной части световода и соответственно ее ускоренному разогреву. Реализуется режим "саморазогрева", при котором все возрастающая часть поглощенной энергии идет на разогрев волокна до предельной температуры, определяемой мощностью ЛИ и диаметром световедущей жилы. Показано, что излучение импульсно-периодического YAG:Nd+3 лазера, работающего в режиме свободной генерации, способно разогревать кварцевую жилу световода до температуры, которая достаточна для рассечения любых биотканей.

Экспериментально исследовано рассечение биотканей при помощи фототермического эффекта, возникающего в кварцевом световоде при контакте с биообъектом. Для этого были использованы лазер на парах меди (511 нм +578 нм, 15- Ю"9 с, 10 кГц, 15 Вт), YAG: Nd+3 непрерывной генерации (1,060 нм, 40 Вт), мощный технологический импульсно - периодический YAG: Nd+3 лазер "Фотон - 500" производства НПО "ЗВИ" (1060 нм, 2 КГ1 с, 150 Гц, 300 Вт) и импульсно - периодический YAG: Nd+3 лазер в режиме свободной генерации 10"3 с с регулируемой частотой следования импульсов до 50 Гц и энергией в импульсе 0,1-1 Дж.

Измерены диаграммы направленности лазерного излучения на выходе световода, покрытого продуктами распада биотканей. Определены оптимальные параметры лазерного излучения, разогревающего световод до температуры, при которой происходит рассечение биотканей. Проведены опыты на экспериментальных животных (мышах, крысах, кроликах, собаках) по рассечению различных биотканей (брюшины, фатерососка, мышц, кишки, желудка, печени, костной ткани, раковых опухолей) при помощи кварцевых световодов диаметром 0,6 -1 мм и длиной 3 - 15 м, в которые вводилось ЛИ. В экспериментах температура кварцевой жилы волокна изменялась от 100° до 1000°С при средней мощности лазерного излучения 5150 Вт, что позволило рассекать различные по структуре биоткани и выполнять различные по сложности операции (делать разрезы, удалять части органов или целые органы и т.п.). В результате проведенных экспериментов

и расчетным путем были определены предельные параметры лазерного воздействия для надежного рассечения любых биотканей излучением YAG: Nd+3 лазера: импульсно - периодическое воздействие с частотой от 10 Гц до 100 Гц в режиме свободной генерации 10'3 с со средней выходной мощностью от 5 Вт до 100 Вт. На основе предложенного способа контактной деструкции биотканей (АС N1607149) был разработан ряд новых методов лечения, в частности, корешкового синдрома при остеохондрозе позвоночника, операции на желудочно-кишечном тракте и пр., а также ряд устройств для их реализации.

Особую проблему в этом ряду представляет лечение опухолей паренхиматозных органов и, в первую очередь, опухолей и метастазов в печени, поскольку наличие метастазов в печени является одной из основных причин в отказе больному от радикального хирургического лечения. Разработка методов инактивации (деструкции) метастазов в печени открывает этим больным пути проведения полноценного курса противоопухолевого лечения, включая радикальную операцию. При решении этой задачи были использованы теоретические методы математического моделирования тепловых процессов в биотканях с проведением машинных расчетов, составившие основу для проведения более емкого исследования по разработке лазерных методов лечения опухолей паренхиматозных органов.

Для описания процесса передачи тепла была выбрана модель капиллярно - пористого тела, где кровеносные сосуды рассматриваются как капилляры, а кровь как теплоноситель. При нагреве крови и тканей выше 60°С предполагалась их быстрая коагуляция. При определении области коагуляции учитывалась возможность парообразования. Задача сводится к нахождению изотермических поверхностей для температур коагуляции и парообразования и характера их распространения в ткани.

Модель капиллярно - пористого тела включает в себя два нестационарных нелинейных уравнения: для температуры каркаса (тканей печени, насыщенных кровью) и для температуры теплоносителя (крови).

(l-P)Cvpfl = (l-P)AÄ + ^4I) + Qchcm -a„(T-Tb) (1)

8t error

РСУЬр4^ + РСуЬрЛТь-Т).^ = РЯ4(^ + ^Ь-)-«,(Ть-Т) (2) dt X д г г д г

при граничных и начальных условиях t=0

дГ _(l-P)q0 T(R) =37 С Т=37С'

^mm^ surf

rs < г < R

ВТ Pq0

Я— = Д О T„(R) =37 С Ть=37 С

г=гя tum surf

где Т - температура тканей; Ть - температура крови; г5 - радиус световода; Р -коэффициент пористости; р, рь - плотность крови и ткани соответственно; Су, Суь ~ теплоемкость ткани и крови; X, ^шт > Хъ- коэффициенты теплопроводности нормальной ткани, опухоли и крови; qo - мощность источника нагрева, 35игг - площадь поверхности источника нагрева, (ЗсИет -энергия, выделяемая метаболическими процессами (как правило не

учитывается, в силу ее малости) а, = 0.0035 рьСл — - объемный

коэффициент теплоотдачи, описывающий обмен между каркасом и теплоносителем (между тканями и кровью); (1 - диаметр сосуда; и - скорость кровотока (течение в кровеносных сосудах); / - длина сосуда. При этом

параметр и по литературным данным лежит в пределах (1-^5) 10 сек, а т—±-

величина 1 ~~ и, входящая в уравнение (2), и. характеризующая время пребывания крови в рассматриваемом объеме с учетом сосудов всех диаметров, кроме аорт и полых вен, меняется в пределах 1-2 сек.

Для решения этой системы уравнений использована конечно-разностная явно-неявная трехточечная схема, которая решалась методом векторной прогонки на ЭВМ. В результате математического моделирования и машинных расчетов при различных параметрах лазерного воздействия установлено:

- в развитии процессов термического повреждения ткани характерен выход на стационарный уровень (рис. 2). Размер поражения как испаряемой области, так и коагулированной не зависит от продолжительности воздействия после выхода на стационарный уровень и определяется мощностью излучения и эффективностью теплообмена. В чисто практическом плане это дает уверенность врачам в проведении лечебной процедуру, так как передозировка не ведет к увеличению деструктивного дефекта ткани и каким-либо отрицательным последствиям. Главное при этом превысить время выхода на стационарный уровень. Для онкологии это имеет особый смысл, поскольку выгодно отличает лазерные методики деструкции опухолей от широко распространенных методов химио- и лучевой терапии, где передозировка ведет подчас к катастрофическим последствиям.

- сравнение различных режимов воздействия - непрерывного и импульсно-периодического при одинаковой средней мощности - показывает что при использовании импульсно-периодического режима работы лазера достигается больший объем деструктивных изменений ткани.

при импульсно-периодическом режиме значительно лучше развивается зона парообразования за счет большей выраженности переходных процессов с высокими градиентами температур в ближней зоне световода. Это особенно важно для рассечения тканей.

Г„сп [СМ] 1.6 1.2 0.8 0.4

..i......

15 Вт) непр

10 Bt¡ непр

5"ВГ,"<1ИГПТ 5 ВТ, l)eil|).~

10 20

40 50

t,c

10 20 30 40

t, с

Рис.2. Радиусы коагуляции (а) и испарения (б) при лазерном облучения с разными уровнями мощности.

Именно импульсно-периодический режим работы лазеров может быть рекомендован для разработки частных методик контактной лазерной хирургии.

В условиях in vivo при операции на печени у собак была получена зона некроза грушевидной формы с максимальным диаметром более 3 см при мощности 15 Вт (1.06 мкм, 100 Гц, 4x1o-4 с) за время 3 мин, что вполне удовлетворительно коррелирует с результатами проведенных расчетов с учетом различий в принятой модели и эксперименте. Размеры коагулированной области 3 см соответствуют типичной клинической ситуации с наличием солитарных метастазов в печени. Таким образом, предложенная математическая модель внутритканевой лазерной термодеструкции метастазов в паренхиматозные органы обладает прогностической ценностью, поскольку позволяет предсказать объем деструктивных изменений при известных параметрах лазерного воздействия и решить обратную задачу: при точно установленной локализации и определенных размерах патологического очага рекомендовать параметры лазерного воздействия для его надежной инактивации.

На основе проведенных экспериментально-клинических исследований разработаны медико-технические требования (МТТ) к лазерной медицинской хирургической установке для онкологии на основе импульсно-периодического YAG:Nd+3 лазера. По разработанным МТТ организациями физико-технического профиля создана лазерная хирургическая установка (ЛХУ) «ЛАСКА» с выходной мощностью до 120 Вт, прошедшая технические и клинические испытания и получившая разрешение Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ на применение и серийное производство и уже нашедшая применение в практической медицине. В частности, эта ЛХУ была использована при разработке совместно с ММА им. И.М. Сеченова (профессор Х.А. Мусалатов, профессор А.Г. Аганесов) методики хирургического лечения корешкового синдрома при остеохондрозе поясничного отдела позвоночника.

Глава II посвящена фотохимическому компоненту повреждающего действия ЛИ, основанному на нем новому активно развивающемуся

направлению в лечении опухолей - фотодинамической терапии и исследованию путей повышения ее эффективности.

В разделе I главы II представлены общие сведения по ФДТ опухолей и приводятся результаты комплексных исследований по созданию, изучению свойств и испытаниям новых фотосенсибилизаторов (ФС).

Одной из актуальных задач в проблеме ФДТ является поиск оптимального соединения - ФС, способного наиболее успешно обеспечить эффективное практическое использование этого метода. В работе сформулированы основные требования к оптимальному ФС, включающие биологические (токсические и фармакокинетические), фотофизические и химико-технологические критерии. В настоящее время проводится направленный поиск таких ФС среди производных хлоринов, бензопорфиринов, бактериохлорофиллов, нафтало- и фталоцианинов. При этом особый интерес представляют ФС, обладающие способностью быстро аккумулироваться в опухоли и высокой скоростью катаболизма.

В результате систематических исследований фотофизических свойств и фотодинамической активности металлокомплексов ряда порфина установлена зависимость фотоцитотоксичности от амфифильности ФС и положения боковых заместителей в ряду гомологов (изучено 9 соединений). Для обеспечения этих исследований был реализован комплекс лабораторных методик для изучения фотофизических, фармакокинетических и фотоцитотоксических характеристик ФС и их количественного определения в органах и тканях.

На основе направленного структурно-функционального поиска разработаны ФС второго поколения на основе хлорина е6 -«Фотодитазин» и «Радахлорин». Оба ФС являются модификациями высокоэффективной лекарственной субстанции - «Фотохлорин», с близкими спектральными, токсическими и фармакокинетическими свойствами. Исходным сырьем для него является биомасса микроводоросли Spirulina Platensis, искусственно культивируемая в фотореакторах в жестко контролируемых условиях.

Он обладает спектральными и энергетическими характеристиками, выгодно отличающими его от препаратов, разрешенных к применению (производное гематопорфирина "Фотофрин II" FDA USA, отечественный аналог "Фотофрина" - "Фотогем" и алюминиевый комплекс фталоцианина "Фотосенс"). По сравнению с "Фотогемом" он обладает мощной полосой поглощения в длинноволновой красной области спектра Х1гах=662 нм, 6=4.8x104 NT'cm"1, где биоткани обладают большим пропусканием. Полученное путем химической модификации производное хлорина е6 -"Фотодитазин" - прекрасно растворяется в воде не образуя димеров и более агрегированных форм, что характерно для производных гематопорфирина. Это производное хлорина е6 обладает значительно меньшей темновой токсичностью, чем "Фотогем" (предельно переносимая доза LDi0 составляет 230 мг/кг веса против 180 мг/кг веса соответственно). Способность

t \

"Фотодитазина" связываться с клеточными мембранами обуславливает его высокую фотодинамическую активность, к тому же он обладает лучшими фармакокинетическими свойствами. При введении его в организм мышей-опухоленосителей максимум накопления его в опухоли наступает через 4-6 часов при индексе контрастности по отношению к окружающей нормальной ткани более 10 и практически полном выведении из организма в течении суток-полутора. Для "Фотогема" максимальный индекс контрастности составляет 5-6, достигается через 24-30 часов, причем препарат сохраняется в тканях более 4х недель.

Обладая столь же сильной полосой поглощения в длинноволновой красной области (674 нм) синтетический металлокомплекс фталоцианина "Фотосенс" при практически одинаковой темновой цитотоксичности проявляет на порядок меньшую фотоцитотоксичность, чем "Фотодитазин". Общие токсические свойства при введении синтетического "Фотосенса" в организм оказываются значительно хуже, чем у "Фотодитазина", а скорости выведения препаратов из организма несравнимы: "Фотосенс" сохраняется в организме до трех месяцев против 1.5 суток у "Фотодитазина".

«Радахлорин» является сильнодействующим высокоселективным ФС для ФДТ. Он способен быстро (0,5-5 ч) накапливаться в злокачественных новообразованиях, причем индекс контрастности варьирует от 3 до 40 и зависит от нозологии опухоли. Его действие проявляется только при возбуждении светом с длиной волны 662±5 нм и заключается в эффективной генерации в раковой опухоли высоко цитотоксичного синглетного кислорода, квантовый выход которого составляет 75-96% в зависимости от физико-химических показателей среды.

«Радахлорин» является высоко фотоцитотоксичным препаратом для разных типов опухолевых клеток. Его половинная эффективная концентрация в тестах in vitro на различных культурах раковых клеток составляет от 1,8 до 3,9 микромоль/л. Максимум накопления его в опухоли у мышей с привитой эмбриокарциномой 0,70 микромоль/л достигается через 5 часов после внутрибрюшинного введения в дозе 40 мг/кг и длительно сохраняется (18-24 часа). Опухолевая концентрация субстанции через 18ч после введения препарата составляет 0,48 микромоль/л, что всего в 1,5 раза меньше, чем в абсолютном максимуме накопления, при высокой селективности накопления. Отношение опухоль/мышечная ткань составляет через 18 часов - 32, а опухоль/кожа - 44. Препарат выводится из организма через сутки на 98% (период полувыведения -12 часов). Чрезвычайно низкая темновая цитотоксичность этого препарата и быстрое выведение из кожи и слизистых оболочек делает его применение при ФДТ особенно целесообразным, так как исключает повреждение нормальных органов и тканей и гиперчувствительность кожных покровов к дневному свету. Высокая степень фототоксичности обоих препаратов связана с высоким квантовым выходом интерконверсии, что коррелирует с высоким

квантовым выходом сннглетного кислорода - одного из основных токсических агентов, возникающих под действием света при ФДТ. Сохраняющаяся при этом способность препаратов флуоресцировать оставляет возможность для флуоресцентной диагностики очагов неопластического изменения тканей. Для этого препараты возбуждают в любую из полос - 406, 506, 536, 608 или 662 нм и регистрируют интенсивную флуоресценцию при 668 нм.

концентрация препаратов 25 мкМ в 0,01 М боратном буфере, рН 9,18 > К

450 500 550 600 650 • 700 х,

Рис. 3. Спектры поглощения ФД-препаратов «Фотохлорин», «Фотогем» и «Фотосенс»

Характерные свойства предложенных ФД-препаратов на основе хлорина ее - низкая темновая цитотоксичность и высокая фотоцитотоксичность, низкая общая токсичность, быстрая и высокая туморотропность в сочетании с чрезвычайно быстрым выводом их из нормальных тканей и организма в целом - позволяют в корне изменить принятую технологию проведения ФДТ, исключив длительный период темновой подготовки пациентов к активному лазерному этапу ФДТ, связанный с пребыванием в стационаре, заменив его амбулаторным приемом или стационаром одного дня. В настоящее время ведутся клинические испытания препаратов «Радахлорин» и «Фотодитазин», которые уже подтвердили их высокую терапевтическую эффективность при лечении опухолей поверхностной и эндоскопически доступной локализации.

В заключительной части раздела I рассматриваются пути повышения эффективности ФДТ:

- направленный поиск, в том числе методами химического синтеза новых ФС с близкими к оптимальному свойствами;

- повышение селективности накопления ФС в опухолевых тканях, как путем создания конъюгатов ФС с моноклональными антителами или векторными молекулами - фотоиммунотоксинов, так и за счет регулируемого изменения свойств межклеточной среды;

- сочетание ФДТ с гипертермией повышением интенсивности действующего на опухоль излучения;

-разработка способов защиты нормальных клеток от фотосенсибилизированных реакций и общефизиологических систем организма от действия образующихся в процессе ФДТ продуктов.

Приводятся результаты собственных экспериментальных исследований, подтверждающие реальность и перспективность углубленной разработки каждого из этих направлений.

При ФДТ опухолей используется принцип двойной селективности: туморотропность ФС + техника избирательного облучения. Раздел II главы II и посвящен физическим основам и техническим приемам повышения эффективности ФДТ.

Проведено исследование возможных способов активного избирательного воздействия, основанных на различиях спектрально-оптических характеристик нормальных и патологически измененных тканей. Непосредственными измерениями спектрально-оптических свойств различных тканей экспериментальных животных и человека показано, что наличие патологического процесса в биоткани во всех случаях приводит к изменению спектров отраженного патологическим участком излучения, что в свою очередь проявляется в возникновении первичного контраста в изображении этого участка на фоне окружающей нормальной ткани, причем величина этого контраста определяется как

КЩ--

К,%

/„(Л)+ /,(*)

•100%,

450

500

550 600 650 X, нм

где ¡ы(^), - интенсивности

излучения с длиной волны X, отраженного нормальным и патологическим участком ткани соответственно. На некоторых длинах волн она может достигать 80% (рис. 4).

Рис. 4. Спектральная зависимость контраста первичного изображения патологического

участка на фоне нормальной биоткани.

Используя методы усиления яркости изображения, развитые применительно к лазерным проекционным системам для формирования мощных лазерных пучков необходимой формы, можно существенно повысить избирательность воздействия лазерного излучения на биоткань. Задавать необходимое распределение интенсивности на облучаемом участке при этом может оптическое изображение самого облучаемого участка, содержащего 4 патологическое образование. Наиболее подходящими источниками

излучения для этих целей оказываются лазерные среды на парах меди и золота с высоким проходным коэффициентом усиления, поскольку 0 наивысший контраст спектрального коэффициента отражения достигается

вблизи линий их генерации.

Рассмотрены различные варианты оптической схемы формирования профилированного лазерного пучка, размеры которого определяются параметрами используемой оптической схемы, а форма задается самим объектом. Такая система облучения обладает рядом очевидных достоинств. При условии контрастного выделения объекта на окружающем фоне она позволяет реализовать режим как бы "самооблучения", в котором сам объект задает и регулирует форму действующего лазерного пучка. При этом в процессе облучения автоматически отслеживаются перемещения патологического участка в поле зрения оптической системы, связанные с жизнедеятельностью органа или всего организма, а также изменения формы самого очага патологии в процессе действия излучения.

Были предложены, исследованы и оптимизированы схемы образования негативных изображений, основанные на создании соответствующего пространственного распределения усиления активной среды. В некоторых случаях весьма эффективным средством увеличения контраста представляется использование сред с нелинейным поглощением на длине волны генерации лазерной среды.

Подобная задача может быть также решена путем использования в качестве промежуточных элементов формирования таких пучков пространственно-временных модуляторов света (ГГОМС), например, в виде многослойных структур металл - диэлектрик - полупроводник - жидкий кристалл (МДП-ЖК). При этом удается одновременно решить задачу перестройки диапазона длин волн излучения, несущего первичное изображение. В этом случае использование туморотропных ФС представляется идеальным для контрастирования патологических образований. Использование ФС с высоким контрастом накопления в « опухоли, каковыми являются «Фотодитазин» и «Радахлорин», позволяет

создать в ПВМС достаточно точный пространственный образ опухоли, который формирует профилированный пучок лазерного излучения на любой длине волны, в том числе в максимуме поглощения ФС, обеспечивая четко локализованное ФД воздействие.

Рассмотренные системы оказываются также и наиболее выгодными с точки зрения энергетики, поскольку позволяют собрать энергию всего объема активной среды в пучок оптимальной формы и доставить ее точно к патологическому очагу, не оказывая прямого действия на окружающую нормальную ткань или минимизируя его.

Проведены эксперименты по фотодинамическому и фототермическому воздействию на опухоль пучком излучения, сформированным по форме опухоли. В качестве активной среды использовали лазерную среду на парах меди (511 и 578 нм, средней мощностью 18 Вт) и на парах золота (628 нм, 0.2 Вт). Повышение избирательности воздействия не только за счет контраста накопления сенсибилизатора, но и за счет контраста облучения, позволило сократить время облучения при фотодинамическом воздействии до 5 сек. Сохранение терапевтического эффекта при этом обеспечивается значительным повышением интенсивности пучков, падающих на патологические участки. Подобный подход может быть использован не только при воздействии на опухоли, но и на другие патологические очаги, локализованные как на поверхности, так и во внутренних органах, с применением обычных для эндоскопической техники регулярных световолоконных жгутов, передающих изображения.

На предложенных принципах совместно с НТВЦ ЦНИИ «Комета» был создан диагностико-терапевтический комплекс, представляющий собой автоматизированное рабочее место (АРМ) врача для спектрально-оптической диагностики и терапии новообразований фото- и фотодинамическим методом. С помощью АРМ и ФС второго поколения «Фотодитазин», «Радахлорин» и «Фотосенс» на фоне здоровой ткани осуществляется обнаружение и распознавание опухоли с последующим воздействием на нее ЛИ. Перераспределение интенсивности в потоке ЛИ в соответствии с люминесцентной картиной исследуемой области выполняется оптически управляемым ПВМС на основе структуры МДП-ЖК. На этапе спектрально-оптического выявления опухоли люминесценция

ФС фиксируется в красной (Х>660 нм) области спектра с помощью видеокамеры на основе ПЗС-матрицы (рис. 5).

Рис. 5. Функциональная схема комплекса: —» - электрический

сигнал,----> - оптический сигнал; Р

- отсекающий светофильтр, М -зеркало; Т - телескоп; ТЛ - 1

терапевтический лазер; ДЛ -диагностический лазер.

Полученная таким образом люминесцентная картина записывается в ЭВМ. Программное обеспечение комплекса обеспечивает анализ распределения интенсивности люминесценции по уровням яркости в произвольном направлении, определение линейных размеров и площадей участков люминесцентной картины с различными уровнями интенсивности люминесценции, выполняет пороговую фильтрацию видеоизображения.

На этапе обработки люминесцентного образа можно сформировать картину фотовоздействия, помечая область здоровых участков ткани (фона) черным цветом, а область опухоли - белым или градациями серого цвета. Таким образом в электронном виде формируется маска, в соответствии с которой будет в дальнейшем производиться преобразование цилиндрического пучка терапевтического излучения.

В процессе фотовоздействия сформированная маска поступает в ПВМС. На выходе ПВМС терапевтическое излучение с длиной волны 670 нм повторяет в уровнях интенсивности маску, сформированную ранее. При этом оператору достаточно один раз настроить комплекс в части параметров преобразования принимаемого видеоизображения, в дальнейшем вся поступающая в ЭВМ видеоинформация (с частотой до 5 кадров в секунду) обрабатывается автоматически. Оператору предоставляется возможность облучать границы новообразований либо точно в соответствии с люминесцентной картиной, либо с определенным захватом прилегающих здоровых участков ткани. Для этого предусмотрена процедура оконтуривания фрагментов изображения в градациях серого цвета.

Такое техническое решение позволяет в реальном времени выполнять формирование картины фотовоздействия таким образом, что терапевтический пучок излучения подается только на участки тканей, накопивших ФС, а на прилегающие здоровые участки тканей подается нулевая или неразрушающая доза. Комплекс позволяет также проводить облучение с инверсией (в негативе). При этом на экране видеомонитора отображается позитивное изображение, соответствующее реальности, а инверсия выполняется аппаратно с помощью ПВМС.

Описанная технология облучения позволяет:

• повысить избирательность фотохимического повреждения тканей и таким образом компенсировать низкий контраст накопления ФС опухолью Ка избирательным облучением, которое, в свою очередь, характеризуется контрастностью картины фотовоздействия Кр1. Контраст фотоповреждений К характеризует травматизм окружающих опухоль здоровых тканей: чем выше значение контраста, тем меньше травматизм здоровых тканей (К ~ Кр, х Ка);

• работать в следящем режиме, т.е. облучать расположенные в поле обзора опухоли, положение которых изменяется вследствие дыхания, перистальтики или непроизвольных движениях пациента, автоматически в

реальном времени вносить изменения в картину фотовоздействия, вызванные изменением формы или движением границ новообразования;

• рассчитывать и задавать дозу фотовоздействия с учетом оптических и геометрических характеристик очага патологии.

В главе III рассмотрены механизмы действия НЛИ на биологические системы от первичного фотофизического акта поглощения фотона эндогенным фотоакцептором до проявления биологического эффекта в стимуляции регенераторных процессов в ранах и обоснована возможность ■

использования НЛИ в лечении онкологических больных.

Раздел I Главы III посвящен феноменологическим механизмам биостимулирующего действия НЛИ и прежде всего его онкологическим ^ аспектам с целью экспериментального обоснования возможности применения его в онкологии. С учетом разноречивости литературных данных о параметрах ЛИ при использовании его для стимуляции репаративных и регенераторных процессов на первом этапе работы была проведена отработка оптимальных параметров и режимов облучения для получения устойчивого эффекта стимуляции заживления ран у здоровых животных.

В опытах на 156 крысах со стандартно нанесёнными операционными ранами был перекрыт диапазон интенсивности облучения на 633 нм от 20 до 3000 Вт/м2 при экспозиционной дозе 1-6 Дж на животное. В результате серии экспериментов установлено, что под влиянием ЛИ 633 нм интенсивностью 1500-2500 Вт/м2 в режиме сканирования патологического очага с захватом неповрежденной ткани по его границе при экспозиционной дозе 1-2 Дж/см2 у 50% животных на 1/3 сокращались сроки закрытия раневых дефектов.

Гистологически наблюдалось качественное изменение течения раневого процесса, приводившее к лучшему восстановлению органоспецифичности регенерированной ткани. Последнее имеет особое значение при заживлении ран после удаления опухоли и сказывается на частоте рецидивирования в послеоперационных рубцах. В серии опытов на крысах с подкожно привитой, а затем удаленной саркомой 45, выявлено заметное уменьшение частоты рецидивирования (с 27% до 11%) при облучении ран при явном терапевтическом эффекте ускорения заживления по срокам на 30% примерно в 50% случаев как у нормальных животных, так и у животных после удаления опухоли.

Для решения вопроса о возможности стимуляции ЛИ как регенерации, так и процесса диссеминации было проведено изучение влияния ЛИ на характер метастазирования в режимах, отработанных для стимуляции регенераторных процессов. Изучение различных параметров метастазирования в условиях лазерного облучения было проведено на высокометастазирующих штаммах КСМЛ (карциносаркома, метастазирующая в легкие) и BMP (высокометастазирующий рак с широким

спектром органного метастазирования). В таблице 1 приведены результаты одного из опытов на 130 животных. Проведение 4-х недельного курса облучения сразу после прививки приводит к резкому замедлению интенсивности метастазирования и сроков "закладки" метастазов. Эффективность подавления роста и метастазирования опухоли ЛИ увеличивается при более раннем начале воздействия после прививки. Установлено, что облучение резко тормозит начальные этапы развития опухолевого процесса: в течение 4 месяцев после прививки в облучавшейся группе животных лишь 13% пали от метастазов в легкие против 42% в контрольной группе.

Таблица 1.

Влияние излучения 633 нм на интенсивность

Группа I II Контроль

Дни облучения С 1 по 29 после прививки С 15 по 29 после прививки 0

Количество животных -44 43 43

Параметры метастазирования % п % п % п

30 дней после прививки 20 3,2 47 4 62 6

48 дней после прививки 53 3,3 77 3,1 75 3,2

Столбцы «%» - количество животных с метастазами в легких в % от общего числа животных в группе; столбцы «п» - среднее количество метастазов у животных с метастазами в легких; различия между опытными и контрольной группами достоверны по критерию х2 (р=0,05).

В опытах со штаммом BMP исследовали влияние ЛИ на интенсивность и спектр метастазирования. Было проведено сравнение влияния облучения места инокуляции и отдаленного от опухоли участка кожи бока на продолжительность жизни животных, привитых минимальной прививочной дозой, и распределение метастазов по органам у павших мышей. Облучение проводили на протяжении 4 недель, наблюдение за животными вели 6 месяцев. Спустя 170 суток после прививки все мыши контрольной группы пали так же, как и мыши с облученной кожей бока. В группе мышей, облученных в области инокулята, к этому сроку выжило 50% животных, а за период дальнейшего наблюдения случаев гибели мышей от опухолей в этой группе не отмечено (рис. 6). Полученное в этих опытах полное подавление опухолевого роста лазерным излучением было неоднократно подтверждено. В различных вариантах постановки опыта на выживание при минимальных прививочных дозах на штаммах BMP и ВМР-МГ группа животных с

полностью подавленным опухолевым процессом составляла от 20% до 80% общего числа мышей в опыте. На вскрытии у таких "излеченных" животных

никаких признаков опухолевого роста обнаружено не было.

Рис. 6. Влияние излучения 633 нм на продолжительность жизни мышей с опухолью BMP. По оси ] ординат - количество выживших мышей; по оси абсцисс - декады после прививок, 1- облучение места инокуляции опухоли, 2 - облучение ¡1 кожи бока, 3 - необлучснная контрольная группа.

В результате проведенного исследования влияния ЛИ 633 нм на процесс метастазирования установлено, что облучение в выбранном режиме не способствует развитию опухолевого процесса, а в ряде случаев даже ведет к его подавлению. Эффективность подавления роста и метастазирования опухоли увеличивается при минимальных прививочных дозах, при более продолжительном курсе облучения и при возможно более раннем начале облучения после прививки, когда опухолевый узел еще не сформировался. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о существовании выраженной местной тканевой реакции, а также о развитии общефизиологического компонента в ответе организма на облучение. Предположение о важной роли иммунологических механизмов в наблюдаемых эффектах лазерного воздействия на опухолевый процесс было проверено в цикле исследований по влиянию НЛИ на иммунокомпетентные клетки - лимфоциты крови человека.

При снятии дозовой зависимости эффекта активации лимфоцитов излучением наблюдался вполне естественный для систем с конечным числом активных центров эффект насыщения. Эти эффекты были получены при различных интенсивностях облучения, в том числе и в режиме сканирования препарата в чашке Петри лучом Не-Ые-лазера интенсивностью 2000 Вт/м2. Установлено, что под действием излучения 633 нм происходит увеличение иммунологических показателей как у доноров, так и у больных с различными нозологическими формами опухолей (рак молочной железы, почки, саркома Юинга, лимфогранулематоз, бластома легкого, меланома). Эффект стимуляции был более заметным в тех случаях, когда реактивность больных была сниженной. f

Экспериментально обнаружено, что повышение иммунологических показателей лимфоцитов под воздействием ЛИ сопровождается не только количественными, но и качественными изменениями: увеличивается скопление числа эритроцитов вокруг отдельных лимфоцитов в реакции

10«

80 60 40 20

% живых мышей

RLL

3-i-

дпи после '-■1 прививки

100 150

розеткообразования и повышается процент светящихся детерминант, наблюдаемых иммунофлуоресцентным методом. Подобные изменения свидетельствуют об активации поверхностных рецепторов клеток.

Сравнение микрорельефа облученных и интактных лимфоцитов, проведенное методом растровой электронной микроскопии, показало, что лазерное облучение, не приводя к резкому изменению поверхностной морфологии клеток, несколько активирует клеточную оболочку, способствуя появлению булавообразных микроструктур, связанных с выпячиванием и втягиванием плазмолеммы (рис. 7).

Рис.7. Изменение ультраструктуры поверхности лимфоцитов в результате облучения (633 нм, 200 мВт/см2, 4 Дж/см , увеличение 20000).

Проведенный цикл экспериментальных исследований послужил основой для разработки метода лазерной адоптивной иммунотерапии онкологических больных с целью ранней профилактики метастазирования в послеоперационном периоде. В клинике опухолей молочной железы РОНЦ им. H.H. Блохина этот метод позволил устойчиво нормализовать показатели иммунитета до 3,5 лет и значительно увеличить безрецидивный период наблюдения пациенток.

Для выявления причин изменения иммунных свойств лимфоцитов были проведены исследования, дающие подход к пониманию механизмов, лежащих в основе изменения их функциональной активности. В частности, методом магнитофоретической подвижности в высокоградиентном магнитном поле V(#-Я) = 10'ч-10'° Э2/см изучали изменение магнитных свойств лимфоцитов под воздействием ЛИ. Обнаружено, что лимфоциты крови человека первоначально являются диамагнитными относительно водного буферного раствора. На гистограмме по величине магнитной восприимчивости % они распределены с дисперсией 30% относительно максимума % - -0,41 10"8 ед.СГС. Подвергнутые лазерному облучению на 633 нм лимфоциты имели тот же максимум распределения по магнитной восприимчивости, но с гораздо большей дисперсией 75%. В то же время часть лимфоцитов в результате облучения становилась парамагнитной в

различной степени с магнитной восприимчивостью % >0, достигавшей 2 10'7 | ед.СГС. Появление парамагнетизма в клетках может быть связано с возрастанием уровня парамагнитных радикалов, появляющихся в результате первичных фотохимических процессов, инициируемых ЛИ. На функциональном уровне это находит отражение в изменении иммунных свойств клеток, связанных с состоянием клеточной поверхности.

Таким образом установлено, что начальным звеном эффектов биостимуляции является недеструктивная модификация клеточных и ^ плазматических мембран, вызываемая появлением свободнорадикальных продуктов первичных фотохимических реакций, запускаемых поглощением фотона первичным фотоакцептором (ПФА). i

В разделе II главы III приводятся результаты исследований по идентификации ПФА. Дан краткий обзор современных представлений о механизмах биологического действия НЛИ и его первичных этапах. Все предложенные гипотезы о ПФА сводятся к одному: действие света осуществляется через реакции внутриклеточных ферментов. Но ни одна из этих гипотез не может объяснить многообразия наблюдаемых эффектов и ни одна из них никогда не была подвергнута прямой экспериментальной проверке.

Анализ немногочисленных спектров действия в диапазоне 0.4-1 мкм на ряде клеточных культур выявил сходство их со спектром поглощения j

молекулярного кислорода 3Ог, что позволило выдвинуть гипотезу (Р.В. Амбарцумян, 1987) о молекулярном кислороде как ПФА. Полное доказательство этой гипотезы в наших совместных с С.Д. Захаровым работах заняло более 10 лет. Для этой цели как базовый использован метод лазерной цитодифрактометрии, дополнявшийся на различных этапах биофизическими и физическими методами исследования: измерением оксидо-редуктазной активности, оксиметрией, центрифугированием, оптической (

спектрофотометрией, гипоосмотической «отмывки» эритроцитов (ЭЦ), оптической микроскопией, нефелометрией. Большой цикл исследований спектров действия выполнен методом оптической рефрактометрии.

Изучались фотоиндуцированные процессы в наиболее доступных для исследования, простых и хорошо изученных клетках - ЭЦ крови человека. В качестве методологического приема, позволяющего идентифицировать ПФА, использовалась регистрация детальных спектров действия с помощью лазеров с плавной перестройкой частоты. Был перекрыт спектральный * диапазон 570-830 нм и 1220-1290 нм перестраиваемыми лазерами на красителях с накачкой от лазера на парах меди, титан-сапфировым и александритовым лазерами, полупроводниковым с температурной *

перестройкой и непрерывными гелий-неоновым и YAG:Nd+3 лазерами (Табл.2). Энергетические и спектральные характеристики ЛИ контролировались паспортизованными калориметрами ИМО-2М, ИМО-4С и дифракционными спектрометрами.

Лазерный цитодифрактометр (ЛЦЦ) представляет собой гидродинамическую петлю с циркулирующей суспензией эритроцитов (рис.8). В петлю встроена оптическая кювета с узким зазором (плоский капилляр). Ламинарное течение в кювете отрегулировано таким образом,

Таблица 2. Запрещенные по спину переходы молекулярного кислорода в диапазоне 550-1300 нм [Matheson I.B.C. (1970), Long С. (1973)] и параметры лазеров, использованных для идентификации первичного фотоакцептора.

Номер полосы Переход Длина волны в максимуме ПОЛОСЫ, X max, HM (02 газ/Ог:фреон) Ширина полосы, Av, см"1 Тип лазеров Диапазон перестройки, ДХ, нм Ширина линии излучения ДХ, нм Р, мВт Режим работы лазера

I 'Д8(г>=0) ЗД=0) 1265/ 1269 200/ 100 InGaAsP/InP 12201290 0,5 6,0 Непр.

II 'Д8(и=1) %-(v=0) 1065/ 1068 210/ 190 Nd:YAG 1064 0,1 1200 Непр.

III lIg+(u=0) JSg"(u=0) 760,4; 763,3/ 763,5 35; 55/ 120 TiJ+:Al203 Сг3+:ВеА1204 700900 720790 1,0 1,2 200 100 10Гц, ЮОмкс 10Гц, 200мкс

IV ' Ag(\)=0)+' Ag (\з=0) <- 630/ 631 350/ 380 He-Ne (ЛГ-38) He-Ne (AJIOK-l) «Яхрома 1» (Cu R101) «Малахит» (Cu R101) 632,8 632,8 626646 627660 <10" 2 <10" 2 0,7 1,5 50 2 500 200 Непр. Непр. ЮкГц, 30нс 15 кГц, 15нс

V 1 Ag(u= 1)+' Дв(и=0) <— 3Zg-(u=0)+3Sg-(u=0) 577/ 578 350/ 350 «Яхрома 1» (Cu R6B) «Малахит» (Cu R6B) 577595 577592 0,1 1,4 500 200 ЮкГц, 30нс 15 кГц, 15нс

* чтобы ориентировать эритроцитарные диски параллельно стенкам кюветы и

одновременно сгруппировать клетки в два симметрично расположенных движущихся монослоя. В этом случае на них действует одно и тоже значение . сдвигового напряжения, в результате чего все они растягиваются

одинаковым образом. Степень растяжения, являющаяся мерой способности эритроцитов к обратимым деформациям, регистрируется оптическим методом. Кювета просвечивается коллимированным лазерным лучом малой мощности, а рассеянное клетками излучение собирается линзой. В фокальной плоскости линзы наблюдается дифракционная картина Фраунгофера в форме овала. Чем выше степень деформируемости, тем сильнее вытянут овал. Картина устойчива и повторяет форму среднестатического эритроцита, развернутого на 90° относительно направления потока. В первом дифракционном минимуме измеряются длины большой (А) и малой (В) осей овала. С их помощью определяется безразмерная величина е=(А-В)/(А+В), называемая коэффициентом деформируемости эритроцитов. Под влиянием облучения в изменяется и динамическая реакция клеток фиксируется в форме кривой £(1).

Облучение производится в открытом расширенном участке петли

Рис 8. Принципиальная схема лазерного цитодифрактометра

Рис. 9. Изменение деформируемости эритроцитов по мере облучения суспензии (Х=1264 нм, 0,85 мВт, 8=3 см2)(а) и связь обратного времени проявления максимального эффекта с интенсивностью облучения А.=1264 нм для двух образцов крови от двух доноров (б). Объёмная доля клеток 0,3%

На рис.9 представлен типичный временной ход коэффициента деформируемости эритроцитов £(1) при облучении суспензии в полосах поглощения кислорода. Облучение включалось в момент 1=0 и продолжалось в течение всего времени регистрации. Положение максимума

1га на временной оси определяется длиной волны и интенсивностью облучения, в то время как амплитуда фотоотклика = -е0 не зависит от

этих параметров. В случае применения ФС кривая 8(0 имеет аналогичную форму.

Рис. 10. Спектры действия in vitro в полосах I, III, IV, V.

Физически и биологически значимой характеристикой процесса является скорость проявления максимума tm"'=Q, называемая фотореактивностью. Связь Q=tm"' с интенсивностью облучения q линейна в достаточно широком интервале q (рис.9). Измеренные спектры действия in vitro в окрестности различных абсорбционных полос Ог показаны на рис.10. Из сравнения полученных спектров со спектром поглощения О2 [Long С., Kearns D.R., 1973] следует, что наблюдаемые эффекты обусловлены прямой фотогенерацией синглетного кислорода, причем наиболее эффективным является излучение в полосе 1.

В экспериментально-клинических исследованиях in vivo (86 волонтеров с диагнозом ХИБС II и III степени, получавшие процедуру BJIOK) временная зависимость s(t) у большинства пациентов (более 90%) имела ту же колоколообразную форму, как и in vitro. На рис.11 показаны спектры действия in vivo в окрестности полос IV и V.

Рис. И. Спектры действия ¡n vivo в полосах IV и V. На врезках - линейные характеристики фотостимуляции

Таблица 3. Спектральные и энергетические параметры фотостимуляции in vitro и in vivo в полосах поглощения кислорода: ___

Номер Длина Интенсивность Время Оптимальная Примечания

полосы Поглощения волны, нм облучения, мВт/см2 проявления максимума доза, Дж

о2* стимуляции, мин

I 1264 0,33 3,17 ±0,30 0,10 ±0,01 in vitro: суспензия эритроцитов, 0,3% об., 8 мл, облучаемая

площадь= 3 см2

II 1064 100 0,5 ± 0,1 9,0 ±1,0

III 762 3,3 3,17 ±0,45 1,0 ±0,15

IV 633 16,7 6,0 ± 1,0 18,0 ±3,0 He-Ne лазер

638 16,7 2,5 ± 0,8 7,5 ± 2,4 «Яхрома 1»

633 1,0" 20,0 ± 2,0 1,2 ±0,12 ВЛОК, He-Ne

633 1,0" 20,0 ±2,0 1,2 ±0,12 лазер

639 1,0" 5,0 ± 0,5 0,3 ± 0,03 ВЛОК, имп. Режим ВЛОК

V 587 100 1,5 ±0,1 27,0 ± 1,8 in vitro

587 1,0" 6,0 ±2,0 0,36 ±0,12 ВЛОК

ФДВ- 633 1,3 2,0 ± 0,2 0,48 ± 0,05 Ди ацетат гематопор-фирина, 40 мкМ

яшечания: - см. табл.2; - мощность на выходе световода внутри вены;

" - фотодинамическое воздействие in vitro.

Из сопоставления рис.11 и спектров поглощения Ог следует, что полученные спектры во всех основных чертах соответствуют спектру поглощения растворенного молекулярного кислорода.

Фотоиндуцированное повышение деформируемости отражает стимуляцию ЭЦ, поскольку повышенная деформируемость позволяет ЭЦ лучше проникать в мельчайшие капилляры и с большей эффективностью выполнять свое основное функциональное назначение. Пик фотоотклика £га при 1т соответствует переходу ЭЦ в состояние наибольшей эластичности и, следовательно, максимальной физиологической активности. Последнее согласуется с наблюдаемой при НЛТ активацией микроциркуляции и биоэнергетических процессов, связанных с потреблением кислорода. Данные о параметрах облучения, вызывающего биоэффекты, опосредованные прямой фотогенерацией синглетного кислорода, приведены в Табл. 3.

Акцептором фотонов, запускающим стимуляционные эффекты НЛТ во всех исследованных спектральных участках видимого и ближнего ИК диапазона является молекула кислорода. Присутствуя во всех живых биосистемах кислород является универсальным неспецифическим ПФА, чем можно объяснить удивительную широту терапевтических эффектов НЛИ. Явление, которое предложено называть светокислородным эффектом (СКЭ), представляет собой первый и пока единственный однозначно установленный пусковой механизм НЛТ.

Очевидная аналогия в протекании ФДЭ и СКЭ - в обоих эффектах первичным биологически активным агентом является синглетный кислород 'Ог - предполагает зависимость этих эффектов от концентрации Ог в среде. Для ФДЭ зависимость 0(р02) была изучена в модифицированном контуре циркуляции ЛЦД, соединенном последовательно с оптическим оксигемометром и миниатюрным оксигенатором. Зависимость фотореактивности ЭЦ от концентрации кислорода показана на рис.12. В случае с СКЭ эта зависимость представлена тремя точками (табл.4).

Для обоих эффектов продувка суспензии ЭЦ инертным газом приводила к исчезновению эффекта стимуляции клеток, а барботирование кислородом - к резкому возрастанию фотореактивности. Это лишний раз свидетельствует о решающей роли Ог в реализации этих эффектов.

рос. НАЦИОНАЛЬНАЯ | ..•г пилтРКА 1

Табл.4. Время проявления пика стимуляции при непрерывном облучении ЭЦ-суспензии Не-№-лазером (18 мВт/см2) при разных давлениях кислорода.

50 80 110 130 р(02) (мм рт.ст)

р02 (мм рт.ст) Способ поддержания р02 &п=П-1, с

8=10 Деоксигенация >1.2-103

150 В равновесии с атмосферой 330±30

700±50 Продувка кислородом при атмосферном давлении 22±5

Рис.12.3ависимосгь фотореактивности клеток при ФДЭ от парциального давления молекулярного кислорода в клеточной суспензии (ЮТЗА, 4х10"5 моль/л, 632.8 им, 0.18 мВт/см2).

1««%

гибель

10" 10' мин.

Рис. 13. Схема последовательной (снизу вверх) смены фаз в реакции клеток по мере развития ФДЭ: переход от активирования к деструкции

В изменениях деформируемости ЭЦ, наблюдаемых на ЛЦЦ по мере облучения в полосах поглощения 02, выде-ляется несколько стадий. На начальных этапах облучения деформируемость растет, а затем, после достижения максимума ет падает до малых значений. При дальнейшей экспозиции клеток наблюдается их набухание и последующий гемолиз, что свидетельствует о накоплении повреждений и переходе к нере-парируемым деструктивным пов-деформнру- реждениям мембран клеток.

Привлечение методов контроля трансембранного электронного транспорта (ТЭТ) осмотического набухания клеток с использованием многократного светорассеяния и прямого счета живых

няя активность

«чисть

клеток в сенсибилизированной (НРБА 4x10" мсшь/л) суспензии ЭЦ при непрерывном облучении 633 нм позволило выделить три фазы фотоотклика, предшествующие гибели клеток (рис.13). На первой стадии развивается фотостимуляция, наблюдаемая помощью ЛЦЦ и проявляющаяся в синхронном увеличении мембранной лабильности при £т. Это новый вид

возбуждения клеток, представляющий собой раннюю стадию ФДЭ и проявляющийся как увеличение «эластичности» их мембраны. Продолжающееся облучение приводит к нарастанию в клетке окисления и нарушениям ТЭТ - вторая стадия. Начало возмущения электрон-протонного транспорта, согласно прямым измерениям сопряженными методами, приходится на пик ет. Чем больше фотодинамическая нагрузка, тем быстрее проявляется этот пик и, соответственно, раньше наступает третья стадия -повреждение системы ионного (в первую очередь №7К+) транспорта и осмотическое набухание клеток. При продолжении облучения осмотическое давление в клетке нарастает, мембрана не выдерживает и наступает лизис, клетка гибнет. Приближенное соотношение между продолжительностью структурной, электрон-протонной и ионной стадий при условии непрерывного облучения с постоянной интенсивностью составляет 1:10:100.

Установлена идентичность этапов проявления ФДЭ и СКЭ, что делает реальной постановку исследований по разработке методик беспрепаратной фототерапии опухолей - светокислородной терапии (СКТ) и является основой для разработки МТТ на новые образцы лазерной медицинской аппаратуры.

Особое место в наблюдаемых явлениях занимает первая стадия, на которой проявляется феномен детальной обратимости хода деформируемости ЭЦ г при выключении облучения, что предполагает преимущественно физический (структурный), а не химический путь дезактивации синглетного кислорода '02.

1,3348

I46

I «

6 46 §

Й 44

ё46 1,3344

762 нм

О, мин"

760 нм Ь

2 4 б 8 10

в р емя, мин

755 760 765 770 775 780 x, нм

Рис. 14. Фотоотклик межклеточного показателя преломления при облучении суспензии эритроцитов Сг:А12Ве40 лазером на различных длинах волн при одинаковой интенсивности 40 мВт/см2.

Рис. 15. «Спектр действия» в одной из главных полос поглощения молекулярного кислорода '2Д+ <- 32я+, измеренный с помощью контроля межклеточного показателя преломления (экспериментальные точки о) и коэффициента деформируемости эритроцитов - сплошная кривая.

Привлечение метода рефрактометрии и его седиментационного варианта позволило измерить спектры действия излучения в полосе III поглощения Ог по показателю преломления п раствора - внеклеточной среды суспензии ЭЦ (рис. 14, 15).

Были получены зависимости п(0 и С1(Х) аналогичные изменениям деформируемости ЭЦ е(0- Полученные результаты свидетельствуют о перестройке структуры водной матрицы в результате прямой фотогенерации синглетного кислорода. Идентичность хода обеих зависимостей свидетельствует о единстве механизмов, запускающих фотоиндуцированные эффекты в клетках и внеклеточной среде, и ведущей роли синглетного кислорода.

Таким образом, первичный механизм биостимуляции ЛИ сводится к фотогенерации синглетного кислорода, дезактивация которого вызывает модификацию мембран клеток и окружающей их водной матрицы. При этом в структурной перестройке водной матрицы очень важная роль принадлежит физическому пути дезактивации синглетного кислорода, когда освобождающаяся при 8 - Т переходе энергия 0.98 еУ преобразуется в изменения сети водородных связей внеклеточной воды.

Индуцируемый НЛИ лизис может быть использован для беспрепаратной деструкции патологически измененных клеток. В экспериментах с суспензиями опухолевых клеток (эпидермоидная карцинома легкого Льюис и асцитный вариант эмбриокарциномы Т36) в термостабилизированных условиях получен лизис клеток при облучении их на длинах волн 633 нм, 762 нм и 1264нм, т.е. внутри полос поглощения Ог-При облучении суспензии клеток Не-Ие лазером была получена дозозависимая гибель опухолевых клеток и проведено сравнение ее с облучением в присутствии ФС диацетата гематопорфирина (рис.16).

100

* з

СП

Рис.16. Зависимость выживаемости опухолевых клеток в суспензии от времени при ФДЭ и СКЭ в присутствии НРЭА (40 мкмоль/л) (1) и без ФС (2); темные точки - прямой счет клеток; светлые - контроль ТЭТ.

Эксперимент показал, что при воздействии излучения Не-Ые лазера гибель /(мин) клеток может происходить как в присутствии, так и в

отсутствии ФС, причем экспозиционные дозы 50%-ой гибели клеток оказываются сравнимыми. Аналогичные результаты были получены при

облучении суспензии опухолевых клеток излучением 1264 нм от полупроводниковых лазеров общей мощностью 8.5 мВт. Сравнение доз 50%-ой гибели клеток ЬБ30 (табл. 5) показывает, что ИК излучение в полосе поглощения кислорода » в 20 раз эффективнее, чем в красной полосе, что согласуется со спектром поглощения кислорода. При микроскопическом исследовании клеток во всех случаях разрушение выглядело одинаково и состояло в разрыве плазматической мембраны на несколько фрагментов, что согласуется с механизмом осмотического набухания.

Табл.5. Сравнение светокислородного и фотодинамического эффектов.

X (нм) 1264 632.8 632.8+HPDA 4x10"5 М

LDso (Дж/см2) 10.2 194 27

Таким образом, установлен единый механизм биостимулирующего и фотодеструктивного действия НИЛИ. Обнаружен СКЭ, заключающийся в активировании или необратимом повреждении клеток, в зависимости от световой дозы, оптическим излучением внутри полос поглощения молекулярного кислорода, опосредуемый генерацией синглетного кислорода. Комплексом проведенных исследований создана фундаментальная научная основа методов фототерапии, позволившая предложить для клинического применения НЛИ с определенными параметрами для лечения и профилактики осложнений лекарственной и лучевой терапии. Результаты исследований внедрены в клиническую практику.

Рис. 17. Отношение спектральных коэффициентов отражения Ri(X) участков ткани толстой кишки больного (дифференцированная аденокарцинома) и коэффициента отражения Ro(>.) здорового участка толстой кишки того же больного: а - другой здоровый участок, б -патологически измененная ткань.

В главе IV рассматриваются физические основы спектрально -оптических методов диагностики

злокачественных новообразований. Проведено исследование спектрально - оптических характеристик нормальных и патологически измененных тканей человека in vitro и in vivo. С помощью автоматизированного акустооптического спектрофотометра (разработка ВНИИ ФТРИ) исследо-

Ri(A.)/RO(A.)

X, нм

ваны спектры пропускания и отражения биотканей различных типов в широком спектральном диапазоне 450-750 нм, а также на отдельных длинах волн при использовании различных лазерных источников. Обнаружены спектральные отличия между нормальными, воспаленными, доброкачественно и злокачественно измененными тканями. На основе проведенных исследований предложено несколько способов и устройств для диагностики опухолей, визуально и эндоскопически доступных локализаций. Суть метода состоит в измерении спектра отраженного и рассеянного тканью i широкополосного излучения и сопоставления спектров здоровой и видоизмененной ткани одного и того же органа (рис. 17). По полученным результатам были разработаны МТТ и создана спектрометрическая приставка к эндоскопу "КВАРЦ-3102-В-ЭГ", получившая рекомендацию Минздрава для клинического применения.

Спектральный анализ - как абсорбционный, так и эмиссионный - в традиционном его виде используется в основном для определения составляющих компонент в состоящих из них неоднородных смесях. Однако существует множество задач типа анализа изображений, где компоненты, количество которых необходимо определить, оказываются пространственно разделенными. В онкологии это морфометрия гисто- и цитологических препаратов.

В работе описывается способ создания пространственно однородного спектра, в котором весовые соотношения спектральных компонент отражают количественные отношения между элементами изображения. В качестве интегратора спектра изображения используется оптическое моноволокно, выступающее одновременно в качестве тракта связи между отдельными элементами спектроанализатора. Предложенный метод и установка решают задачу спектрального анализа - как на пропускание, так и на отражение -объектов с пространственным разделением компонент, в частности, плоских изображений. При соответствующей технике проведения измерений можно довести количество отдельных определяемых элементов до нескольких десятков при использовании как уже существующих методов их контрастирования, так и при создании новых красителей, ориентированных на предложенный метод. При этом значительно снижается время измерений, повышается точность в сравнении с традиционными способами получения той же информации и возможна почти полная автоматизация рутинных гистологических исследований, по крайней мере, в части "разбраковки" г анализируемого массива препаратов с выделением подмассива для визуального исследования высококвалифицированным патоморфологом.

Развитие патологических процессов в организме сопровождается • изменениями ряда молекулярных параметров в клетках и тканях, а также в плазме крови. Исследование оптических свойств растворов биополимеров, включая белки плазмы крови, показало диагностическую эффективность метода релеевского рассеяния света.

ЛЙ8»1|Н|ь

Особенности рассеяния света растворами белков определяются физическими параметрами растворенных молекул и физико-химическими процессами, происходящими в среде. Белковые молекулы несут на своей поверхности электрический заряд, величина и знак которого определяет характер межмолекулярного взаимодействия макромолекул, отражающегося на их

подвижности. Одним из прямых способов изучения трансляционного движения макромолекул в растворах является метод динамического рассеяния света ( метод корреляции фотонов = метод оптического смешения). В этом методе исследуется корреляционная функция С(0, описывающая молекулярное движение с коэффициентом трансляционной диффузии

Health donor " Здоровый донор

Leukemia Острый лейкоз

Lyphogranulomalosis

1ь_ лгм

Buikitfs turnor

(lyniphosalcoma)

Лимфосарком.1

Lung cancel second stage Рак Jiei кого U ci.

Renal carcmoma Рак почки

Рис. 18. Спектральные образы плотности флуктуаций интенсивности рассеянного света, полученные на лазерном компьютерном анализаторе при исследовании плазмы крови здорового и онкологических больных.

движения S(ra) и C(t):

С(0 = С0ехр(-О,к20,

где к~(4япЛо)зт(0/2) -вектор рассеяния, зависящий от показателя преломления п растворителя, длины волны зондирующего излучения Хо и угла рассеяния 0. Через Фурье-преобразование устанавливается связь между функцией спектральной плотности молекулярного

S(co)=l/2jf C(t)e"°'dt

Функция 8(а>) определяется методом оптического смешения света.

!> Метод реализован в специально созданном лазерном компьютерном

анализаторе с помощью алгоритма сверхбыстрого преобразования Фурье (проф. С. Г. Алексеев). С помощью этого прибора разработана методика многопараметрической диагностики онкологических заболеваний на основе

рассеяния света в слабых водных растворах нативных биологических жидкостей (плазма, сыворотка крови, лимфа) in vitro и проведена ее

клиническая оценка в ряде ведущих онкологических клиник. Для количественной оценки спектров (рис.18) предложен интегральный показатель krG, представляющий собой ковариационное произведение основных характеристических параметров выделяемого спектрального ядра динамического светорассеяния исследуемых образцов: интенсивности и частоты в максимуме спектра рассеяния (биений), полуширины спектра. Результаты одного из клинических испытаний представлены на рис. 19. В серии проведенных клинических испытаний основные диагностические характеристики (чувствительность, специфичность, точность) ложатся в интервал 86% - 93%.

Предложенные метод и аппаратно - программный комплекс могут быть использованы прежде всего при скрининговом обследовании населения с целью формирования групп повышенного онкологического риска, для контроля эффективности последующего диспансерного онко-

Рис.19. Результат диагностического обследования 153 пациентов: 1 - группа практически здоровых добровольцев (30 чел.); 2 - группа больных с основным неонкологическим диагнозом (93 чел.); 3 - группа онкологических больных (30 чел.)

проводимого лечения, а также для логического мониторинга.

В заключении диссертации подводится общий итог проведенных экспериментальных исследований. Основные результаты работы могут быть сформулированы следующим образом.

1. При действии лазерного излучения на биологические системы с многокомпонентным составом и сложной структурной и функциональной

организацией очень важно наличие в них хромофорсодержащих компонентов и структурно выделенных путей утилизации поглощенной энергии. Специфика действия излучения связана с распределением и локализацией резонансно поглощающих включений. Характер выявляемых различными методами пострадиационных изменений исследованных биосистем, вызываемых резонансным поглощением ЛИ, совершенно определенно указывает на протекание при облучении термических и ударно-механических явлений, сопровождающихся обычно сенсибилизированными фотохимическими реакциями в условиях светового насыщения. При наличии резонансного поглощения определяющую роль играет скорость поступления энергии на поглощающие центры, что и определяет возникновение высоких 1 пространственно-временных градиентов температуры, лежащих в основе

ударно-механических деструктивных изменений структуры. Для фотохимического повреждения биомембраны специфическим является предварительное насыщение (блокирование) защитных стабилизирующих систем, в первую очередь, эндогенных антиоксидантов.

2. На основании рассмотрения нестационарного тепловыделения в пористой среде, пронизываемой жидкостью, построена математическая модель внутритканевой лазерной термодеструкции для тканей печени и солитарных метастазов в ней.

Установлено, что в развитии процессов термического повреждения ткани характерен выход на стационар. Размер поражения - как испаренной области, так и коагулированной - не зависит от продолжительности воздействия после выхода на стационарный уровень и определяется мощностью излучения и эффективностью теплообмена. Для онкологии это имеет особый смысл, поскольку выгодно отличает лазерные методики деструкции опухолей от широко распространенных химио- и лучевых методов терапии, где передозировка ведет подчас к катастрофическим последствиям.

Сравнение различных режимов контактного воздействия непрерывного и импульсно-периодического при одинаковой средней мощности - показывает, что при использовании импульсно-периодического режима работы лазера быстрее достигается больший объем деструктивных изменений ткани. Именно импульсно-периодический режим работы лазеров является оптимальным для рассечения биоткани и может быть рекомендован для разработки методов контактной лазерной хирургии и соответствующей лазерной медицинской аппаратуры.

3. Проведенное изучение свойств новых хлориновых фотосенсибилизаторов «Фотодитазин» и «Радахлорин», созданных в рамках структурно-функциональной концепции синтеза ФС с заданными физико-химическими свойствами, показало их перспективность использования в клинике.

Систематизированы представления о путях повышения эффективности ФДТ, включающие помимо традиционных химических и биотехнологических направлений пути регуляции метаболической активности - как локальной, так и общей - и физико-технические возможности современной оптоэлектронной аппаратуры.

4. Предложен аппаратурный метод повышения селективности лазерной фото- и фотодинамической терапии опухолей на основе активных оптических систем с усилителями яркости; показана возможность управления контрастом усиливаемого изображения в системах с многопроходным усилением. Предложены и реализованы системы, в которых для формирования распределения энергии в обрабатывающем пучке используется как изображение объекта, полученное непосредственно в резонаторе системы, так и его «копия», образованная с помощью пространственно-временного модулятора света. Впервые осуществлено избирательное воздействие ЛИ на опухоль путем формирования действующего пучка по форме очага патологии на основе спектрально-оптических характеристик ткани с использованием ГТВМС и управлением параметрами ЛИ от персональной ЭВМ.

Реализованный в работе метод повышения селективности фототерапии опухолей на основе активных оптических систем с усилителями яркости может быть использован для воздействия на любые очаги патологии, имеющие спектральные отличия от окружающей нормальной ткани, локализованные как на поверхности организма, так и во внутренних органах, при использовании эндоскопической техники с регулярными световолоконными жгутами, передающими изображение.

5. Впервые проведено комплексное исследование, раскрывающее один из механизмов биологического действия оптического излучения от первичного фотофизического акта (поглощения фотона) до тканевых реакций и реакций отдельных систем организма. Установлено, что начальным звеном эффектов биостимуляции, является недеструктивная модификация клеточных и плазматических мембран, вызываемая появлением свободно-радикальных продуктов первичных фотохимических реакций, запускаемых поглощением фотона первичным фотоакцептором, и структурной перестройкой водной матрицы.

Низкоэнергетическое лазерное излучение является биологически активным модификатором иммунитета и может быть использовано на различных этапах лечения больных. Разработан и внедрен в практику ряда лечебных учреждений метод адоптивной лазерной фотоиммунотерапии для ранней профилактики рецидивов и метастазов у онкологических больных.

ближнего ИК диапазона является молекула кислорода. Присутствуя во всех живых биосистемах кислород является универсальным неспецифическим ПФА, чем можно объяснить удивительную широту терапевтических эффектов НЛИ.

Показано, что помимо химического канала дезактивации синглетного кислорода 'Ог в биологическом действии НЛИ значительную роль играет физический канал тушения '02, по которому энергия возбуждения 0.98 эВ при возращении молекулы кислорода в основное состояние (S-T-переход) «сбрасывается» в окружающую водную среду, вызывая в ней структурные перестройки водородных связей. Явление, которое предложено называть светокислородным эффектом (СКЭ), представляет собой первый и пока единственный однозначно установленный пусковой механизм НЛТ.

7. В результате комплексных экспериментальных исследований установлен единый механизм биостимулирующего и фотодеструктивного действия НЛИ. Обнаружен новый вид возбуждения клеток, проявляющийся как увеличение эластичности их мембраны и представляющий собой раннюю стадию фотодинамического эффекта (ФДЭ). Установлена идентичность этапов проявления ФДЭ и СКЭ.

Предложен новый метод беспрепаратной фототерапии опухолей, основанный на действии излучением в полосах основного эндогенного фотоакцептора - молекулярного кислорода - по первичному фотопродукту аналогичный ФДТ. Создана научная основа для разработки методов фототерапии широкого круга заболеваний, включая некоторые онкологические.

8. Разработана методика спектрофотометр ии и сравнения спектральных характеристик отраженного от биоткани излучения, созданы устройства для ее использования, позволяющие проводить скоростные измерения широкополосного излучения. Проведенные исследования спектрально-оптических характеристик нормальных и патологически измененных тканей человека in vitro и in vivo выявило спектральные отличия между ними. Обнаруженные спектральные различия могут быть усилены использованием контрастирующих туморотропных соединений.

На основе проведенных исследований предложено несколько способов и устройств для диагностики опухолей, доступных для визуального и эндоскопического обследования. Разработан способ морфометрии тканевых структур в гисто- и цитологических исследованиях с использованием акустооптического микроспектрофлуориметра, создан макет устройства для реализации этого способа.

9. На основе выдвинутых и обоснованных в диссертацииноложений сформулированы медико-технические требования к ряду созданных в дальнейшем лазерных медицинских аппаратов: лазерной хирургической установке «ЛАСКА» на основе импульсно-периодического YAG:Nd+3 лазера, диагностико-терапевтического комплекса для фото- и фотодинамической терапии «ФОТОС», спектрометрической приставки к эндоскопу «КВАРЦ 3102-В-ГЭ», лазерного компьютерного анализатора «ЛКА 1» для диагностики онкологических заболеваний.

10. Проведенные экспериментальные исследования по идентификации первичного фотоакцептора определяют направления технической реализации наиболее оптимальных терапевтических приборов, в основе которых могут лежать не только лазеры, но и достаточно широкополосные источники излучения, уточняют спектральные диапазоны для создания новых, близких к оптимальным фотосенсибилизаторов и открывают перспективы для развития новых биомедицинских технологий, где уже получены первые результаты.

Выявленные закономерности действия лазерного излучения видимого диапазона на опухолевый процесс значительно углубляют существующие представления о характере и механизмах действия лазерного излучения на биологические системы.

По результатам диссертации имеется более 100 публикаций, основные из которых следующие:

1. Kupin V.l., Bykov B.S., Ivanov A.V., Larichev V.Yu. Potentaiting Effects of Laser Radiation on Some Immunological Traits.// Neoplasma, 1982, vol. 29, № 4, pp. 403-404.

2. Сенин B.M., Иванов A.B., Афанасьева A.B., Бунцевич A.M. Новые органотропно метастазирующие перевиваемые опухоли мышей и их использование для изучения влияния лазерного излучения на процесс диссеминации. // Вестник АМН СССР, 1984, №5, с. 85-91.

3. Трапезников H.H., Купин В.И., Иванов A.B., Машковцев Ю.В., Бескова Т.К., Полевая Е.Б., Кадагидзе З.Г. Действие излучения He-Ne лазера на лимфоциты человека. // Вестник АМН СССР, 1984, № 5, с. 40-43.

4. Заплавнова Л.Д., Иванов A.B., Малышев Б.Н. Лазеры в лечении предопухолевых заболеваний шейки матки и вульвы. // Электронная техника, Серия II: Лазерная техника и оптоэлектроника, 1984, т. 4(30), с. 73-77.

5. Иванов A.B., Мороз JI.B. Задачи лазерной терапии в онкологии. // Вопросы онкологии, 1985, т. 31, № 6, с. 114-115.

6. Поддубный Б.К., Иванов A.B., Чвыков В.В., Шабаров В.Л., Фаенов А.Я., Жогун В.Н., Латышев В.М., Скобелев И.Ю., Пустовойт В.И., Газаров Х.В., Шеховцов В.Н. Рассеяние оптического излучения биологическими тканями. // Журнал прикладной спектроскопии, 1987, т. 47, № 5, с.825-829.

7. Kupin V.l., Sorokin A.M., Ivanov A.V., Lapteva R.M., Polevaia B.M. The Effect of Nondamaging Intensity Laser Irradiation on the Immune System. // Neoplasma, 1987, vol. 34, №3, pp. 325-331.

8.' Земсков К.И., Иванов A.B., Казарян М.А., Лаптев В.П., Петраш Г.Г., Чвыков В.В., Шабаров В.Л. Возможность использования контраста спектральных коэффициентов отражения биотканей при фотодинамической терапии с лазерами на парах металлов.// Спектральные методы и средства измерения параметров плазмы многозарядных ионов, Москва, 1988, с. 118-123.

9. Жаров В.П., Иванов A.B., Лаптев В.П., Литвинов Ю.О., Панферова Н.Г., Чвыков В.В., Шабаров В.Л., Шашков Е.В. Использование фототермического световолоконного скальпеля в онкологическом эксперименте. // Спектральные методы и средства измерения параметров плазмы многозарядных ионов, Москва, 1988, с. 128-134.

10. Иванов A.B., Петраш Г.Г., Казарян М.А., Земсков К.И., Фаенов А.Я., Чвыков В.В., Шабаров В.Л. Избирательность действия лазерного излучения на биоткани. // Доклады Академии Наук СССР, 1989, т.305, № 3, с. 736-739.

11. Думаревский Ю.Д., Земсков К.И., Иванов A.B., Казарян М.А., Медведева Л.В., Петраш Г.Г., Чвыков В.В. Активные оптические системы для формирования заданного распределения энергии в обрабатывающем лазерно-биологическом пучке. // Методы исследования оптических свойств высокотемпературной плазмы. Москва, 1989, с. 97107.

12. Zemskov K.I., Ivanov A.V., Kazaryan М.А., Faenov A.Ya., Chvykov V.V. Application of Metal Vapour Lasers for Selective Effect to Pathological Tissues. // "Metal Vapor, Deep Blue, and Ultraviolet Lasers", Jin J. Kim, Randy Kimball, P. Jeffrey Wosoff, Eds., Proc. SPIE 1989, vol. 2041, pp. 86-90.

13. Иванов A.B., Захаров С.Д., Перов C.H., Панасенко H.A. Гибель опухолевых клеток при их облучении гелий-неоновым лазером. // Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине, Тарту, 1990, с.52-54.

14. Белоусов A.B., Жогун В.Н., Иванов A.B., Пустовойт В.И., Чвыков В.В. Исследование оптических характеристик биотканей с помощью акустооптического спектрофотометра. // Методы исследования спектральных и релаксационных характеристик атомов и ионов, Москва, 1990, с. 107-112.

15. Данилов В.П., Захаров С.Д., Иванов A.B., Мурина Т.М., Еремеев Б.В., Машалов A.A., Новиков Е.Г., Панасенко H.A., Перов С.Н., Прохоров A.M. Фотодинамическое повреждение клеток в красной и ИК полосах поглощения эндогенного кислорода. // Доклады АН СССР, 1990, т. 311, № 5, с. 1255-1258.

16. Данилов В.П., Захаров С.Д., Иванов A.B., Мурина Т.М., Еремеев Б.В., Машалов A.A., Новиков Е.Г., Панасенко H.A., Перов С.Н., Прохоров A.M., Лаптев В.П. Спектральноселективный фотодинамический эффект без экзогенных фотосенсиблизаторов и его возможные применения для фототерапии рака и биостимуляции // Известия АН СССР, Серия Физика, 1990, № 8, с. 1610-1620.

17. Жогун В.Н., Каримова Л.Н., Петровичев H.H., Иванов A.B., Пустовойт В.И., Фаенов А.Я., Чвыков В.В., Шабаров В.Л., Шеховцов В.Н. Спектроанализатор изображений и его использование для морфометрии биологических микропрепаратов. // Приборы и техника эксперимента, 1990, № 2, с. 205-207.

18. Васильев Ю.Н., Земсков К.И., Иванов A.B., Казарян М.А., Петраш Г.Г., Чвыков В.В. Применение активных оптических систем для биологии и медицины. // Труды ФИАН СССР, Москва: "Наука", 1991, т. 206, с. 136-148.

19. Жогун В.Н., Иванов A.B., Латышев-В.М., Пустовойт В.И., Скобелев И.Ю., Фаенов А.Я., Шабаров В.Л., Шеховцов В.Н. Исследование микроциркуляции биотканей и параметров газосодержания крови спектральными методами. // Журнал прикладной спектроскопии, 1991, т. 55, №2, с. 261-265.

20. Богуславская Л.М., Иванов А.В., Корепин А.Г., Чвыков В.В. Алгоритмы выбора характеристических длин волн в прикладных задачах спектрофотометрии. // Методы исследования радиационно-столкновительных процессов в лазерной плазме, Москва, 1991, с. 140-145.

21. Букин Г.В., Вольф Е.Б., Данилов В.И., Захаров С.Д., Иванов А.В., Мурина Т.М., Новиков Е.Г., Панасенко Н.А., Перов С.Н., Прохоров A.M., Скопинов С.А., Тимошечкин М.И. Структурные изменения межклеточного раствора, индуцированные прямой фотогенерацией синглетного кислорода в суспензии эритроцитов. // Краткие сообщения по физике, 1991, №1, с. 18-24.

22. Кац В.А., Литвин Г.Д., Назиров Ш.Б., Иванов А.В., Ряжский Г.Г., Странадко Е.Ф., Ягубов А.С., Градюшко А.Т. Фотодинамическая терапия (обзор).// Вопросы онкологии, 1992, № 9, с. 1403-1413.

23. Armichev A.V., Ivanov A.V., Panasenko N.A., Perov S.N., Zakharov S.D. Spectral ( Dependence of Erytrocyte Response of Low-Intensity Irradiation at 570-690 nm.// Journal of Russian Laser Research, 1995, vol.16, pp.186-188.

24. Иванов A.B., Ефимов O.H., Цыганкин В.И., Балакирев С.А., Полевая Е.Б., Карташова Е.О. Неповреждающая лазерная терапия в комплексном лечении опухолей. // Вопросы онкологии, 1995, т.41, № 2, с.141-143.

25. Ivanov А.V., Molodykh E.I., Romanovsky Yu.M., Schetinkina T.A., Borisov D.V. Physical and mathematical models of heat action of laser radiation on biotissue. // Proc. SPIE, "Laser Applications in Life Sciences", 1994, vol. 2370, pp.509-514.

26. Laser Use in Onkology: CIS Selected Papers, Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Editors, Proc. SPIE 1996, vol. 2728, 252 p.

27. Tsigankin V.I., Balakirev S.A., Atroschenko V.I., Belousov N.N., Ivanov A.V. Laser Therapy and Phototherapy in Complex Treatment of Childrens Oncological Diseases. / In: "Laser Use in Oncology: CIS Selected Papers", Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Eds. //Proc. SPIE, 1996, vol. 2728,pp.97-99.

28. Ivanov A.V., Kazaryan M.A., Molodykh E.I.,Schetinkina T.A. Evalution of Laser Radiation regimes at Thermal Tissue destruction. / In: "Laser Use in Oncology: CIS Selected Papers", Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Eds. // Proc. SPIE, 1996, vol. 2728, pp. 134-136.

29. Armichev A.V., Ivanov A.V., Kazaryan M.A. Physico-Technical Background of Metal Vapor Laser Systems and Their Application in Oncology. / In: "Laser Use in Oncology: CIS Selected Papers", Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Eds. // Proc. SPIE, 1996, vol. 2728, pp. 223-239.

30. Ivanov A.V. Laser Methods in Oncology. II Proc. Intern. Symp. "Development of Medical Equipment Technology Converted from Weapons Sciences", 19-23 February 1996, Podolsk, Moscow Region, pp. 28-31.

31. Иванов A.B. Фотодинамическая терапия опухолей: пути повышения эффективности. // Медицинская физика, 1996, №3, с.55-60.

32. Ivanov A.V., Kazaryan A.M.. Kazaryan M.A., Kuvshinov Yu.P., Poddubnyi V.K. Increasing The Effectiveness Of Photodynamic Tumor Therapy Using Active Metal Vapor Laser

Media. // Moscow Physics Societe Journal, 1997, no. 7, pp. 421-426. «

33. Решетников A.B., Жигальцев И.В., Коломейчук C.H., Каплун А.П., Швец В.И., Жукова О.С., Карменян А.В., Иванов А.В., Пономарев Г.В. Получение и некоторые свойства липосомальной формы 2,4-ди(1-метил-3-гидроксибутил)дейтеропорфирина-1Х. // «Биоорганическая химия», 1999, №10, с. 782-790. '

34. Захаров С.Д., Иванов А.В. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухолей. (Обзор). Квантовая электроника, т. 29, №3, 1999, с. 192-214.

35. Laser Use in Onkology II, Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Editors, Proc. SPIE 2000, Vol. 4059, 230 p.

36. Иванов A.B., Карменян A.B., Полутов А.Г. Диагностико-терапевтичнский комплекс для фотодинамической терапии и его возможности. // Лазерная медицина, 1999, т. 3, №3/4, с. 86-89.

37. A.V. Ivanov. Oncological aspects of the biological action of low-level laser radiation. I. Experimental foundation for LLLR use in oncology. / Laser Use in Oncology II, Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Eds. // Proc. SPIE, 2000, vol. 4059, pp. 90-100.

38. A.V. Ivanov, S.D. Zakharov. Oncological aspects of the biological action of low-level laser radiation. II. Investigation of primary mechanisms and clinical application. / Laser Use in Oncology II, Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Eds. // Proc. SPIE, 2000, vol. 4059, pp. 101-111.

39. A.V.Ivanov, A.V.Reshetnickov, G.V.Ponomarev. One more PDT application of chlorin c6. / Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy IX. - T.J.Dougherty, ed. // Proc. SPIE, 2000, Vol. 3909, 131-137.

40. Иванов A.B. Современные тенденции развития методов фотодинамической терапии опухолей. (Обзор). // Использование лазеров для диагностики и лечения заболеваний. М„ 2001, Вып. 3, стр. 28-33.

41. Ковтонюк Н.Ф., Иванов А.В., Полутов А.Г. Управление лазерным излучением в фотодинамической терапии опухолей. // Биомедицинская радиоэлектроника, 2000, № 10, с.

42. Ревазова Е., Брызгалов И., Сорокина Ю., Иванов А.В., Себастиан Дж., Келлер Г., Ватсон Дж. Низкосиловое лазерное облучение стимулирует рост человеческой опухоли.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, Том 132, № 8, с. 195-196

43. Ревазова Е., Брызгалов И., Сорокина Ю., Иванов А.В., Себастиан Дж., Келлер Г., Ватсон Дж. Использование низкосилового лазерного облучения для ускорения васкуляризации тканевых трансплантантов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, Том 132, № 9, с. 306 - 309

44. Uzdensky А.В., Dergacheva O.Yu., Zhanoronkova A.A., Ivanov A.V., Reshetnikov A.V., Ponomarev G.V. Photodynamic effect of deuteroporphyrin IX and hematoporphyrin derivatives on single neuron. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, vol. 281, 1194-1199.

45. Петрова Г. П., Петрусевич Ю. М., Алексеев С. Г., Иванов А. В. Метод релеевского рассеяния света в диагностике онкологических заболеваний. // "Медицинская физика". М„ физ. фак. МГУ, 2002, с. 156 -167.

46. Petrova G., Petrusevich Yu., Alexeev V., Ivanov A. Laser Light Scattering in Diagnosis of Widespread Diseases. / ALT-01, Intern. Confer, on Advanced Laser Technology, Roumania 2001 // Proc. SPIE, 2002, vol. 4762, pp. 356-365

47. С.Д. Захаров, A.B. Иванов, Е.Б. Вольф, В.П. Данилов, Т.М. Мурина, К.Т. Нгуен, Е.Г. Новиков, Н.А. Панасенко, С.Н. Перов, С.А. Скопинов, Ю.П. Тимофеев. Структурные перестройки в водной фазе клеточных суспензий и белковых растворов при светокислородном эффекте. // Квантовая электроника. 2003, Том 33, № 2, с. 149-162

В процессе выполнения работы были получены следующие авторские свидетельства и патенты:

48. Иванов A.B., Купин В.И., Буачидзе JI.H. Способ воздействия на иммунологический статус онкологических больных. Авторское свидетельство № 1341768,1.06.1987

49. Заплавнова Л.Д., Иванов A.B. Способ лечения предопухолевых заболеваний и начальных форм рака шейки матки. Авторское свидетельство № 1374499, 15.10.1987

50. Поддубный Б.К., ., Пустовойт В.И., Газаров Х.В., Жогун В.Н., Иванов A.B., Скобелев И.Ю., Фаенов А.Я, Чвыков В.В., Шабаров В.Л., Шеховцов В.Н. Способ колориметрического обнаружения опухолевой ткани. Авторское свидетельство № 1433192, 22.06.1988

51. Поддубный Б.К., Иванов A.B., Шабаров B.JI., Аверьянов К.П., Агранат М.Б., Таурин Н.Ф., Чалкин С.Ф. Спектрофлуориметрический эндоскоп. Авторское свидетельство № 1363549,01.09.1987

52. Поддубный Б.К., Пустовойт В.И., Визен Ф.Д., Иванов A.B., Газаров Х.В., Жогун В.Н., Фаенов А.Я., Шабаров B.JI. Способ диагностики опухолей, доступных для эндоскопического и визуального обследования. Авторское свидетельство № 1363995, 01.09.1987.

53. Петровичев H.H., Шабаров B.JI., Иванов A.B., Чвыков В.В., Фаенов А.Я., Пустовойт В.И., Шеховцов В.Н., Скобелев И.Ю. Способ определения количественного сос-тава тканевых структур в гисто-цитологических препаратах. Авторское свидетельство № 1507026, 08.05.1989

54. Поддубный Б.К., Пустовойт В.И., Визен Ф.А., Газаров Х.В., Жогун В.Н., Латышев Л.М., Иванов A.B., Фаенов А.Я., Чалкин С.Ф., Шабаров В.Л., Шеховцов В.Н. Спектрофотометрический эндоскоп. Авторское свидетельство № 1504835, 01.05.1989.

55. Петраш Г.Г., Казарян М.А., Иванов A.B., Шабаров В.Л., Фаенов А.Я., Чвыков В.В. Способ облучения патологических образований. Авторское свидетельство № 1543615, 15.10.1989

56. Иванов A.B., Чвыков В.В., Жаров В.П., Шашков Е.В., Кувшинов Ю.П., Литвинов Ю.О., Шабаров В.Л., Фаенов А.Я. Способ деструкции опухолей. Авторское свидетельство № 1607149, 15.07.1990

57. Колосов В.А., Пророков В.В., Иванов A.B., Ли И.А. Лазерное устройство для проведения промежностного этапа при операции на прямой кишке. Авторское свидетельство № 1660242, 01.03.1991

58. Петровичев H.H., Чвыков В.В., Иванов A.B., Фаенов А.Я., Шабаров В.Л., Пустовойт В.И., Шеховцов В.Н., Скобелев И.Ю. Способ определения количества тканевых структур на гистологическом препарате и устройство для его осуществления. Авторское свидетельство № 1698677, 15.08.1991

59. Белоусов A.B., Иванов A.B., Фаенов А.Я., Чвыков В.В., Шабаров В.Л. Способ контроля положения дистального конца гибкого эндоскопа и устройство для его осуществления. Авторское свидетельство № 1717099, 08.11.991

60. Мусалатов Х.А., Силин Л.Л., Аганесов А.Г., Бровкин C.B., Лысенков A.B., Козлов В.Л., Иванов A.B., Казарян М.А., Науров Ю.А., Булычев А.О. Способ хирургического лечения корешкового синдрома при остеохондрозе поясничного отдела позвоночника. Патент №2054956, 27.02.1996.

61. Мусалатов Х.А., Силин Л.Л., Аганесов А.Г., Бровкин C.B., Лысенков A.B., Козлов В.Л., Иванов A.B., Казарян М.А., Науров Ю.А., Булычев А.О. Устройство для хирургического лечения корешкового синдрома при остеохондрозе поясничного отдела позвоночника. Свидетельство №2334 на полезную модель, 16.07.1996.

62. Воробьев Н.С., Иванов A.B., Подгаецкий В.М., Терещенко С.А. Способ определения онкологических заболеваний. Патент № 2077342, 20.04.1997

63. Горбунова Ю.Г., Дюмаев K.M., Иванов A.B., Подгаецкий В.М., Томилова Л.Г. Состав для контрастирования внутренней структуры биологических объектов при лазерной томографии. Патент №2098092, 10.12.1997

64. Полутов А.Г., Карменян A.B., Иванов A.B., Хохлова Н.М., Кирюхин В.И. Способ и эндоскоп для избирательной фототерапии. Патент № 2116745,10.08.1998

65. Полутов А.Г., Карменян A.B., Иванов A.B. Устройство для спектральной диагностики и избирательной фототерапии. Патент №2138306,27.09.1999

66. Решетников А.' В., Залевский И. Д., Кемов Ю. В., Иванов А. В., Карменян А. В., Градюшко А.Т., Лаптев В. П., Неугодова Н. П., Абакумова О. Ю., Привалов В. А., Романов В. А. "Фотосенсибилизатор и способ его получения". Патент РФ № 2183956, 27.06.2002

Служба множительной техник» ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Заказ 125 Тираж 100 экз.

U5~of

P11 5 0 1

Содержание диссертации автор исследовательской работы: доктора физико-математических наук, Иванов, Андрей Валентинович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. Исследование термических механизмов действия лазерного излучения на биологические объекты.

РАЗДЕЛ I. Особенности повреждающего действия лазерного излучения на животные ткани.

1.1.1. Повреждающее действие лазерного излучения на животные ткани.

1.1.2. Повреждающее действие лазерного излучения на клетки крови.

Ф 1.1.3. Влияние параметров лазерного излучения на характер повреждения животных тканей.

РАЗДЕЛ II. Экспериментально-теоретическое обоснование методов деструкции опухолей высокоинтенсивным излучением.

1.11.1. Фототермический эффект в кварцевом световоде, контактирующем с биотканью.

1.И.2. Контактная лазерная хирургия.

1.11.3. Математическая модель нестационарного тепловыделения в биотканях при действии лазерного излучения ближнего ИК диапазона.

I.И.4. Экспериментальная проверка предложенных методов контактной деструкции биотканей.

1.11.5. Лазерная хирургическая установка «ЛАСКА».

ГЛАВА И. Фотохимические механизмы действия лазерного излучения на опухоли и пути повышения их эффективности.

РАЗДЕЛ I. Фотодинамическая терапия: механизмы и пути повышения эффективности.

II.1.1. Фотодинамический эффект, фото динамическая терапия.

П.1.2. Структурно-функциональный подход - основа направленного синтеза фотосенсибилизаторов.

Н.1.3. Оценка биологической активности ряда отечественных фЬтосенсибилизаторов.

П.1.4. Пути повышения эффективности фотодинамической терапии опухолей.

РАЗДЕЛ II. Физические основы и технические приемы повышения эффективности фото динамической терапии.

11.11.1. Оптические характеристики биотканей.

11.11.2. Активные оптические системы на парах металлов для избирательного воздействия.

11.11.3. Активные проекционные системы для биологических исследований.

11.11.4. Управление лазерным излучением в фото динамической терапии опухолей.

11.11.5. Диагностико-терапевтический комплекс для фотодинамической терапии опухолей «ФОТОС» и его возможности.

ГЛАВА III. Низкоэнергетическое лазерное излучение в онкологии.

РАЗДЕЛ I. Феноменологические механизмы биостимулирующего действия низкоэнергетического лазерного излучения.

111.1.1. Регенерация ран.

111.1.2. Влияние излучения He-Ne-лазера на метастазирование опухолевых штаммов мышей.

III.I.3. Изменение иммунологических показателей лимфоцитов человека под действием низкоэнергетического лазерного излучения.

III Л .4. Изменение поверхностной ультраструктуры лимфоцитов.

111.1.5. Изменение магнитных свойств лимфоцитов.

111.1.6. Лазерная адоптивная иммунокоррекция.

РАЗДЕЛ II. Идентификация первичного фотоакцептора при низкоэнергетической лазерной терапии.

III.IL1. Современные гипотезы о ПФА (обзор).

111.11.2. Аппаратурно-методическое обеспечение.

111.11.3. Лазерный цитодифрактометр.

111.11.4. Исследование ФДЭ методом лазерной цитодифрактометрии.

111.11.5. Спектры действия.

111.11.6. Роль воды.

111.11.7. Светокислородный эффект в экспериментальной онкологии.

ГЛАВА IV. Физические основы спектрально-оптических методов диагностики опухолей.

РАЗДЕЛ I. Спектрофотометрические методы диагностики опухолей.

1У.1.1. Спектрально-оптические характеристики тканей - основа для разработки диагностических методик.

1У.1.2. Использование акустооптического спектрофотометра для диагностики опухолей.

1У.1.3. Спектроанализатор изображений и его использование для морфометрии биологических микропрепаратов.

РАЗДЕЛ II. Релеевское рассеяние света в диагностике злокачественных новообразований.

IV.II. 1. Теоретические основы релеевского рассеяния света в жидкости.

IV.11.2. Биофизические основы диагностической методики.

1УЛ1.3. Метод динамического рассеяния света в диагностике злокачественных опухолей.

1У.И.4. Аппарат ЛКА-1 и его возможности.

Введение диссертация по физике, на тему "Физические основы лазерных методов в онкологии"

Важность проблемы "Злокачественные новообразования" определяет постоянный поиск новых и совершенствование имеющихся средств и методов диагностики и лечения опухолей. Исследования в области применения лазерного излучения (ЛИ) в онкологии ведутся уже около 40 лет и направлены в основном на поиск путей разрушения опухолей [1-10]. Определенные успехи в разработке лазерных методов лечения опухолей [1125] и промышленный выпуск специализированных лазерных медицинских установок [26-39] создали условия для использования лазерного излучения в практической онкологии. При этом в каждом конкретном случае в зависимости от вида, локализации и распространенности опухолевого заболевания встает вопрос о выборе источника излучения и оптимального режима воздействия на опухоль для достижения большего лечебного эффекта. Однако набор применяемых в онкологических клиниках лазерных методов повреждения опухолей и самих лазеров весьма ограничен, хотя современная промышленная технология предоставляет широкие аппаратурные и методические возможности деструктивно-термической обработки очагов патологии.

Многие приемы лазерной обработки материалов [40-48] еще не нашли , применения в отечественной медицине, хотя области их применения • очевидны. Несомненно, что привлечение в медицину, и в онкологию в частности, отработанных и апробированных в промышленности приемов лазерной технологии в ближайшем же времени даст значительный положительный эффект. В связи с этим экспериментальное и теоретическое обоснование привлечения для целей практической онкологии новых источников излучения и новых режимов обработки злокачественных новообразований, разработка на этой основе новых методов и средств лечения опухолей представляются важными и актуальными.

В последние два десятилетия в онкологии повышенный интерес проявляется к новому направлению лечения опухолей - фотодинамической терапии (ФДТ), являющейся результатом совместной работы ученых разных областей науки: медиков, биологов, химиков, физиков [49-55, 64]. Это активно развивающееся направление в России еще не вышло за стены крупных онкологических институтов и клиник [56-59]. Тем не менее, накопленный клинический опыт уже заставляет ставить вопрос о поиске путей повышения эффективности ФДТ опухолей [60, 61].

С созданием лазеров начался также новый этап в развитии светолечения [62, 63], приведший к разработке методов низкоэнергетической лазерной терапии (НЛТ) [65-69]. Экспериментальные исследования и данные клиники показывают, что низкоэнергетическое лазерное излучение (НЛИ) обладает отчетливо выраженной биологической активностью, оказывает болеутоляющее, сосудорасширяющее и противовоспалительное действие [70-74]. Однако для широкого применения методов НЛТ в практической онкологии необходимо проведение углубленного исследования, направленного на отработку оптимальных условий лазерной терапии, выяснение механизмов биостимулирующего действия НЛИ и специфики его действия на опухолевый процесс.

При всем многообразии биологических эффектов ЛИ, обнаруживаемых на различных уровнях биологической организации и закономерно связанных между собой временной последовательностью проявления, до сих пор крайне недостаточно исследованы начальные фотофизические стадии преобразования кванта света в реакцию биологической системы [75-82]. Остается нерешенным принципиальный вопрос о первичном фотоакцепторе (ПФА), который в результате первичного фотофизического акта запускает цепь последовательных биохимических, структурных и физиологических изменений, проявляющихся на организменном уровне в виде эффектов биостимуляции. Идентификация ПФА составляет основное звено научного обоснования практических методик лазерной терапии.

Рост заболеваемости злокачественными новообразованиями во всем мире выдвигает проблему их ранней диагностики в ряд первоочередных [8587]. Имеющиеся в распоряжении онкологов методы скринингового обследования с целью формирования групп повышенного онкологического риска, последующее клиническое обследование которых позволяет выявить заболевание на ранней стадии, далеки от совершенства [88-90]. Необходимо развитие объективных аппаратурных методов и создание соответствующих методик и приборов для диагностики рака, простых и доступных для оперативного применения в повседневной практике.

Совершенно очевидно, что конечный клинический результат применения лазерных методов лечения и диагностики определяется пониманием физических явлений [92], лежащих в их основе и обеспечивающих их адекватное использование.

Цель и задачи.

Целью работы является исследование биологических эффектов и изучение механизмов биологического действия ЛИ, экспериментально-теоретическое обоснование и разработка на их основе новых методов и , средств диагностики и лечения опухолевых заболеваний с использованием свойств лазерного излучения.

В соответствии с этим задачами настоящей работы было: 1) исследовать физические эффекты, возникающие при воздействии мощного ЛИ на биологические ткани, и на их основе предложить новые эффективные способы деструкции опухолей ЛИ; изучить возможность технической реализации этих способов;

4) провести исследования по идентификации первичного фотоакцептора биостимулирующего действия ЛИ;

5) исследовать спектрально-оптические характеристики нормальных и . опухолевых тканей и изучить возможность разработки на их основе спектральных методик диагностики опухолей; провести поиск путей усиления спектральных различий нормальных и опухолевых тканей.

Научная новизна.

Научная новизна проведенных исследований определяется следующими положениями, выдвинутыми на защиту.

1. Практически весь спектр технологических возможностей лазеров может быть использован в медицинских целях при корректной медико- , технической постановке задачи.

Сформулирована математическая модель нестационарного тепловыделения в биологической ткани при действии ЛИ ближнего ИК диапазона, обладающая прогностической ценностью,, подтвержденной исследованиями в клинике экспериментальных животных [93, 94, 95]. Теоретически предсказаны (рассчитаны) и экспериментально реализованы режимы работы лазера, позволяющие производить рассечение любых биологических тканей, включая костные, на заданную глубину [96, 97, 98]. Для целей хирургии, в частности, онкохирургии предпочтительным является импульсно-периодический режим работы лазера, который может быть рекомендован для разработки специализированных лазерных хирургических установок [96, 99-101].

Предложен и аппаратурно реализован метод контактной лазерной хирургии с использованием импульсно-периодического YAG : Nd+3 - лазера [102]. Разработаны и реализованы методика лазерной внутритканевой термодеструкции метастазов в печени и методика лазерной декомпрессии межпозвонковых дисков [103, 104].

2. Наиболее эффективное использование возможностей ФДТ опухолей определяется разработкой наукоемких медицинских технологий, включающих комплексное использование направленного химического синтеза соединений с заданными фотофизическими характеристиками и биотехнологических подходов в сочетании с искусственной регуляцией метаболической активности тканей и современной лазерной и оптоэлектронной техникой [105-110]. Активные оптические системы с лазерными усилителями яркости, а также пространственно-временными модуляторами света (ПВМС) являются эффективным средством для повышения избирательности воздействия ЛИ на патологически измененные ткани [95, 97, 111-115].

Предложен аппаратурный метод повышения селективности лазерной фото- и фотодинамической терапии опухолей на основе активных оптических систем с усилителями яркости [116]; исследованы различные схемы повышения контраста изображения. Впервые осуществлено избирательное воздействие ЛИ на опухоль путем формирования действующего пучка по форме очага патологии на основе спектрально-оптических характеристик ткани с использованием ПВМС и управлением параметрами потока ЛИ от персональной ЭВМ [117-120].

3. Впервые проведено комплексное исследование, раскрывающее один из механизмов биологического действия оптического излучения от первичного фотофизического акта (поглощения фотона) до тканевых реакций и реакций отдельных систем организма [121-126]. Начальным звеном биостимуляции, вызываемой ЛИ, является обратимая модификация плазматических мембран клеток, в частности, мембран форменных элементов крови и структурная перестройка водной матрицы [125, 127]. Низкоэнергетическое лазерное излучение является биологически активным модификатором иммунитета и может быть использовано на различных этапах лечения больных [123, 128130].

4. Одним из основных ПФА, ответственных за биологические эффекты низкоэнергетического излучения оптического диапазона, является молекулярный кислород, в значительном количестве содержащийся во всех живых биологических объектах [131-133]. Впервые получены детальные спектры биологического действия оптического излучения в диапазоне 570600 нм, 615-650 нм, 740-830 нм и 1240-1290 нм, выявившие полное совпадение их с полосами поглощения молекулярного кислорода [134-137].

Предложен принципиально новый метод беспрепаратной фототерапии опухолей, основанный на действии излучением в полосах основного эндогенного фотоакцептора - молекулярного кислорода, по первичному фотопродукту аналогичный ФДТ [99, 132, 138]. Открыт светокислородный эффект (СКЭ), лежащий в основе новой медицинской технологии -светокислородной терапии (СКТ).

5. Даже незначительные различия спектрально-оптических характеристик нормальных и опухолевых тканей являются отличительным признаком для разработки объективных аппаратурных методов диагностики опухолей. Проведено изучение спектрально-оптических характеристик нормальных и патологически измененных тканей человека in vitro и in vivo; обнаружены спектральные отличия между нормальными, воспаленными, доброкачественно и злокачественно измененными тканями [139-142].

Усиление спектральных различий нормальных и опухолевых тканей может быть достигнуто применением туморотропных контрастирующих соединений как за счет их люминесцентных, так и абсорбционных свойств

143, 144]. На основе проведенных исследований предложено несколько способов и устройств для диагностики опухолей, доступных для визуального t и эндоскопического обследования [145-148].

Научная новизна проведенных исследований подтверждена 19 авторскими свидетельствами и патентами на изобретения, полученными в процессе выполнения работы [101-104, 116, 127, 131-137, 143-151, 159-163].

Научно-практическая значимость.

Получены новые данные в области фундаментальных проблем фотобиологии животной клетки, позволяющие выйти на физический структурно-функциональный уровень понимания фотобиологических реакций клеток, а в ряде случаев и первичных механизмов патогенеза [125, 127, 135, 136]. Выявленные закономерности действия ЛИ видимого и ближнего ИК-диапазона на опухолевый процесс значительно углубляют существующие представления о характере и механизмах действия ЛИ на " биологические системы.

Создана научная основа для разработки новых биомедицинских технологий, в том числе методов фототерапии широкого круга заболеваний, включая онкологические. Разработаны и внедрены в практику ряда лечебных учреждений метод адоптивной лазерной фотоиммунотерапии [159] для ранней профилактики рецидивов и метастазирования у онкологических больных и метод HJ1T постлучевых, послеоперационных и воспалительных осложнений [160, 164-173].

Проведенное комплексное исследование физико-химических и биологических свойств ряда фотосенсибилизаторов является основой для создания научных критериев отбора и оценки фотодинамической эффективности при скрининге потенциальных фотосенсибилизаторов [174177]. Предложены и представлены к клиническим испытаниям новые фотосенсибилизаторы на основе хлорина ев - «Фотодитазин» и «Радахлорин» [163].

Реализованный в работе метод повышения селективности фототерапии опухолей на основе активных оптических систем с усилителями яркости и пространственно-временными модуляторами света может быть использован не только в онкологии, но и для воздействия на любые очаги патологии, имеющие спектральные отличия от окружающей нормальной ткани, локализованные как на поверхности организма, так и во внутренних органах при использовании эндоскопической техники с регулярными световолоконными жгутами, передающими изображения [161-162]. Разработанный и созданный для этих целей диагностико-терапевтический комплекс «ФОТОС» удостоен медали «Лауреат ВВЦ» [118].

Установленные спектральные различия нормальных и патологически измененных тканей человека явились базой для разработки ряда диагностических методик и аппаратуры; созданная по разработанным медико-техническим требованиям спектрометрическая приставка к эндоскрпу «Кварц 3102-В-ГЭ» прошла клинические испытания и рекомендована к применению и серийному производству.

Заключение диссертации по теме "Приборы и методы экспериментальной физики"

Основные результаты работы могут быть сформулированы следующим образом.

1. При действии лазерного излучения на биологические системы с многокомпонентным составом и сложной структурной и функциональной организацией очень важно наличие в них хромофорсодержащих компонентов и структурно выделенных путей утилизации поглощенной энергии. Специфика действия излучения связана с распределением и локализацией резонансно поглощающих включений. Характер выявляемых различными методами пострадиационных изменений исследованных биосистем, вызываемых резонансным поглощением ЛИ, совершенно определенно указывает на протекание при облучении термических и ударно-механических явлений, сопровождающихся обычно сенсибилизированными фотохимическими реакциями в условиях светового насыщения. При наличии резонансного поглощения определяющую роль играет скорость поступления энергии на поглощающие центры, что и определяет возникновение высоких пространственно-временных градиентов температуры, лежащих в основе ударно-механических деструктивных изменений структуры. Для фотохимического повреждения биомембраны специфическим является предварительное насыщение (блокирование) защитных стабилизирующих систем, в первую очередь, эндогенных антиоксидантов.

Сравнение различных режимов контактного воздействия — непрерывного и импульсно-периодического при одинаковой средней мощности - показывает, что при использовании импульсно-периодического режима работы лазера быстрее достигается больший объем деструктивных изменений ткани. Именно импульсно-периодический режим работы лазеров является оптимальным для рассечения биоткани и может быть рекомендован для разработки методов контактной лазерной хирургии и соответствующей лазерной медицинской аппаратуры.

Систематизированы представления о путях повышения эффективности ФДТ, включающие помимо традиционных химических и биотехнологических направлений пути регуляции метаболической активности — как локальной, так и общей — и физико-технические возможности современной оптоэлектронной аппаратуры.

4. Предложен аппаратурный метод повышения селективности лазерной фото- и фотодинамической терапии опухолей на основе активных оптических систем с усилителями яркости; показана возможность управления контрастом усиливаемого изображения в системах с многопроходным усилением. Предложены и реализованы системы, в которых для формирования распределения энергии в обрабатывающем пучке используется как изображение объекта, полученное непосредственно в резонаторе системы, так и его «копия», образованная с помощью пространственно-временного модулятора света. Впервые осуществлено избирательное воздействие ЛИ на опухоль путем формирования действующего пучка по форме очага патологии на основе спектрально-оптических характеристик ткани с использованием ПВМС и управлением параметрами ЛИ от персональной ЭВМ.

5. Впервые проведено комплексное исследование, раскрывающее один из механизмов биологического действия оптического излучения от первичного фотофизического акта (поглощения фотона) до тканевых реакций и реакций отдельных систем организма. Установлено, что начальным звеном эффектов биостимуляции, является не деструктивная модификация клеточных и плазматических мембран, вызываемая появлением свободно-радикальных продуктов первичных фотохимических реакций, запускаемых поглощением фотона первичным фотоакцептором, и структурной перестройкой водной матрицы.

6. Впервые получены детальные спектры биологического действия оптического излучения в диапазоне 570-600 нм, 615-650 нм, 740-800 нм и 1240-1290 нм. Акцептором фотонов, запускающим стимуляционные эффекты НЛИ во всех исследованных спектральных участках видимого и ближнего ИК диапазона является молекула кислорода. Присутствуя во всех живых биосистемах кислород является универсальным неспецифическим ПФА, чем можно объяснить удивительную широту терапевтических эффектов НЛИ.

Показано, что помимо химического канала дезактивации синглетного кислорода !Ог в биологическом действии НЛИ значительную роль играет физический канал тушения 102, по которому энергия возбуждения 0.98 эВ при возращении молекулы кислорода в основное состояние (Б-Т-переход) «сбрасывается» в окружающую водную среду, вызывая в ней структурные перестройки водородных связей. Явление, которое предложено называть светокислородным эффектом (СКЭ), представляет собой первый и пока единственный однозначно установленный пусковой механизм НЛТ.

8. Разработана методика спектрофотометрии и сравнения спектральных характеристик отраженного от биоткани излучения, созданы устройства для ее использования, позволяющие проводить скоростные измерения широкополосного излучения. Проведенные исследования спектрально-оптических характеристик нормальных и патологически измененных тканей человека in vitro и in vivo выявили спектральные отличия между ними. Обнаруженные спектральные различия могут быть усилены использованием контрастирующих туморотропных соединений.

9. На основе выдвинутых и обоснованных в диссертации положений сформулированы медико-технические требования к ряду созданных в дальнейшем лазерных медицинских аппаратов: лазерной хирургической установке «JIACKA» на основе импульсно-периодического YAG:Nd+3 лазера, диагностико-терапевтического комплекса для фото- и фотодинамической терапии «ФОТОС», спектрометрической приставки к эндоскопу «КВАРЦ

3102-В-ГЭ», лазерного компьютерного анализатора «ЛКА 1» для диагностики онкологических заболеваний.

330

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Очевидно, что в основе всех медицинских применений лазеров лежат фундаментальные исследования механизмов взаимодействия ЛИ с биологическими структурами, проведение которых возможно лишь с привлечением высокоточных, чувствительных и специфичных приборов и методов экспериментальной физики. Именно этому - исследованию физических основ механизмов биологического действия ЛИ - и посвящена в основном настоящая работа. Казалось бы, с вопросами деструктивного действия ЛИ, лежащего в основе лазерной хирургии, все более-менее ясно, поскольку на тепловых и термомеханических механизмах работает промышленная лазерная технология, однако специфика биологических объектов вносит определенные коррективы. Основная особенность биообъектов — их иерархическая функционально-структурная организация с наличием высокочувствительных регуляторных и защитных систем.

Для рассматриваемой в данной работе проблемы можно отметить два важных момента. Во-первых, очень ограниченный диапазон физиологических температур 34-43°С, выход за которые приводит к повреждению определенных структурных компонентов, а следовательно, и к изменению функциональной активности объекта в целом. И второе - наличие выделенных путей диссипации поглощенной энергии, определяющих локализацию возможных повреждений структуры объекта. В наших ранних работах [321, 322] была показана возможность селективного повреждения ЛИ отдельных звеньев фотосинтетического аппарата высших растений. В животном мире столь развитых и организованных пигментных систем (кроме зрительных) нет. Однако имеется целый класс цитохромов, имеющих четко выраженные спектральные свойства и, во многих случаях, осуществляющих определенные регуляторные функции в процессе жизнедеятельности. Воздействие в полосах поглощения выбранных цитохромов может приводить к селективным изменениям функциональной активности биообъекта.

При деструктивных термических или термомеханических воздействиях необходимо четко соразмерять силу воздействия с объемом необходимых и допустимых повреждений биосистемы. В практическом плане это означает четкую конкретизацию медицинской задачи: какие структуры, в каком объеме должны быть повреждены, качество повреждения и размеры неизбежных пограничных изменений. При наличии этих данных знание механизмов деструктивного действия ЛИ позволяет наиболее оптимальным образом решить поставленную медицинскую задачу выбором параметров излучения и режимов воздействия. При таком подходе с помощью одной лазерной установки с регулируемыми энергетическими параметрами можно решать целый спектр задач. В данной работе на примере только одного УАС:Кс1-лазера показано, как можно, меняя характеристики ЛИ, решать различные задачи клинической медицины.

1. Рассечение любых тканей организма (хирургия).

2. Коагуляция солитарных метастазов в паренхиматозных органах.

3. Лазерная декомпрессия межпозвонковых дисков.

4. Термотерапия (43° - 50°).

5. Разрушение почечных и желчных камней за счет фотогидроакустического эффекта (лазерное дробление камней).

Созданная по нашим МТТ ЛХУ «ЛАСКА» вошла в клиническую практику и уже решает все перечисленные задачи. На очереди - методы ФДТ, что сдерживается пока что отсутствием нетоксичных туморотропных ФС с поглощением на 1,06 мкм. Создание такого ФС позволит резко поднять эффективность ФДТ и расширит диапазон ее клинического применения.

При всей казалось бы ясности и подробно описанной очевидности тепловых механизмов действия ЛИ реально остается неосвоенным огромный пласт технологических возможностей использования этих механизмов для решения конкретных задач практической медицины. Во многом это определяется еще недостаточной подготовленностью врачей к восприятию новых неожиданных технологий и их традиционной - и надо признать, оправданной — консервативностью.

Прогресс в разработке достаточно мощных полупроводниковых и волоконных лазеров в диапазоне 0,8 — 1,5 мкм с их лучшими эргономическими, весо-габаритными и эксплоатационными характеристиками несомненно приведет к их предпочтительному применению для деструктивных воздействий в клинике и замещению ими существующих ЛХУ. Как показано в настоящей работе, для подавляющего большинства хирургических применений достаточно иметь среднюю выходящую мощность ЛИ до 50 Вт. Однако при этом остается неизменной рекомендация, установленная в этой работе, о предпочтительности для рассечения тканей импульсно-периодического режима работы с тимп 10" си /сл Ю Гц.

Одним из важнейших результатов работы является четкое доказательство существования светокислородного эффекта, лежащего в основе многочисленных терапевтических применений ЛИ -светокислородной терапии (СКТ).

СКЭ имеет много общего с известным ФДЭ и при" больших дозах облучения перспективен для применения в терапии опухолей, а при меньших дозах - для светокислородной стимуляции клеток в различных медико-биологических- приложениях. Вследствие универсальности кислорода как ПФА СКЭ имеет место во всех живых биологических системах. Причем механизм СКЭ не накладывает ограничений на конкретный тип биосистем. Это открывает путь к разнообразным практическим применениям эффекта, в частности, при работе с культурами клеток, при культивировании микроорганизмов - продуцентов, дрожжей в бродильных производствах, и пр. Первые результаты применения СКЭ в биотехнологии нами уже получены [323, 324]. На наш взгляд, именно биомедицинские технологии являются основной сферой применения СКЭ.

При действии излучением в полосах поглощения молекулярного кислорода появляется возможность в зависимости от дозировки вызывать все виды модификаций биологических мембран от стимуляции до деструкции, что, собственно, и продемонстрировано в данной работе. С целью биостимуляции целесообразно использовать излучение дальнего красного и ближнего ИК диапазона, лежащего в полосе наибольшего пропускания БТ. Однако передозировка и этих видов излучения приводит к развитию нежелательных явлений: усугублению течения некротических процессов, обострению воспалительных заболеваний, замедленной регенерации ран, что предполагает разработку оптимальных режимов облучения.

Проведенные в нашей лаборатории исследования по оптимизации параметров лазерного воздействия при СКТ позволили предложить для клинического применения методику лечения и профилактики лучевых реакций и поражений слизистых и кожных покровов при лучевой и химиотерапии и постлучевых осложнений глубокой органной локализации у онкологических больных. Исследования, проведенные в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по комплексному использованию СКТ, лучевой и химиотерапии, показали, что сроки полного излечения указанных осложнений сокращаются в 2 раза. Лечение осложнений с помощью СКТ позволяет точно соблюдать режим лекарственного и лучевого лечения, в большом числе случаев избегать симптоматического назначения противовоспалительных препаратов и анальгетиков, улучшает качество жизни пациентов в процессе лечения [171-173].

Несомненный интерес представляет возможность использования РЖ ЛИ в качестве радиосенсибилизатора при лучевой терапии опухолей для повышения ее эффективности. Имеющиеся к настоящему времени предварительные клинические результаты дают основание для постановки серьезного исследования в этом направлении.

Одно из перспективных направлений - использование СКТ с целью стимуляции кроветворения, лечения токсических поражений печени токсических гепатитов) в процессе химиотерапии, коррекция иммунитета методом чрескожного лазерного облучения крови. Внутрисосудистое лазерное облучение крови уже показало высокую эффективность в лечении панкриатитов, перитонитов, генерализованных инфекционных процессов. Имеющиеся данные дают надежду на то, что со временем этот метод займет прочное место в профилактике одного из самых тяжелых осложнений химиотерапии - угнетения костномозгового кроветворения.

Справедливости ради, необходимо отметить, что СКТ не является альтернативным способом лечения в онкологии. Несмотря на большое разнообразие клинических эффектов и отсутствие абсолютных противопоказаний СКТ не рассматривается как метод, заменяющий другие лечебные мероприятия. Задача онкологов состоит в том, чтобы на основании современных технических разработок и достижений медицинской науки снизить до минимума побочные эффекты лекарственной и лучевой терапии, облегчить пациенту борьбу с тяжелым заболеванием. И одним из лучших вариантов решения этой задачи является использование СКТ.

Среди общепризнанных физических методов лечения злокачественных новообразований заметное место занимают лучевая терапия, гипертермия и ФДТ. Однако применение каждого из них в отдельности не всегда позволяет достичь надежной инактивации всей опухолевой массы не вызывая при этом неблагоприятных • побочных эффектов как локального, так и общефизиологического характера. При комплексном использовании нескольких из этих методов .появляется возможность оптимизировать параметры и режимы воздействия с точки зрения получения максимального лечебного эффекта.

Известно, что гипертермия является наиболее мощным средством повышения эффективности основных способов лечения рака - лучевой и химиотерапии. Гипертермия, создаваемая с помощью ЛИ, является новым и специфическим способом воздействия на опухоли. Резко повышая локальность воздействия, такая гипертермия может сочетать в себе как тепловую компоненту, так и специфические эффекты, присущие лазерной ФДТ, при воздействии в соответствующих полосах спектра. При действии излучением в полосах поглощения молекулярного кислорода - прежде всего, 1264 нм - появляется возможность беспрепаратной фототерапии опухолей, в основных своих чертах аналогичной ФДТ.

При использовании излучения ближнего ИК диапазона, где проницаемость БТ максимальна, за счет большого энергетического диапазона ЛИ появляется возможность создавать тепловые эффекты различной степени выраженности, от чисто деструктивных до незначительного локального нагрева. При этом различные эффекты лазерного воздействия будут реализовываться в зависимости от распределения излучения в БТ (рис. 5.1). Зоны выраженной термодеструкции (испарение, коагуляция) будут сменяться зоной гипертермических повреждений, переходящих через слой (зону) паранекротических фотохимических изменений ткани в зону выраженной стимуляции репаративных и биосинтетических процессов с положительными сдвигами параметров местного иммунитета.

При наличии эффективных средств канализации и доставки энергии ЛИ такой мощности к опухолевой ткани возможна реализация режима лазерной гипертермии с параллельно протекающими фотохимическими процессами, т.е. речь идет о комплексной беспрепаратной фототерапии опухолей [95, 99]. По нашим оценкам, для этого необходим лазер на 1264 ± 5 нм со средней выходной мощностью —10 Вт. Сочетание этих процессов с локальным лучевым воздействием должно резко повысить эффективность ингибирования опухолевого процесса и деструкции опухолевой ткани. При этом по периферии зоны воздействия за счет рассеянного БТ лазерного излучения создаются условия, используемые обычно в большинстве лазерных терапевтических методик. Эти же условия, как известно, используются для лазерной фоторепарации первичных лучевых реакций и поражений ткани, а также фотопротекции нормальных тканей по периферии

Лазерное излучение

Внешнее воздействие

1- зона испарения

2 - обугливание (спекание)

3 - коагуляция Лазерное излучение

4 - гипертермия + фотохимия Волокно

5 - фотостимуляция

Внутритканевое воздействие

Рис. 5.1. Схема комплексной беспрепаратной фототерапии опухолей опухоли в ближней зоне воздействия. Указанные факторы в комплексе способствуют общему повышению эффективности противоопухолевой терапии и улучшению качества лечения. На наш взгляд, разработка методик комплексной беспрепаратной фототерапии опухолей является весьма перспективным направлением применения ЛИ в онкологии.

Представленный в диссертации метод лазерной корреляционной спектроскопии плазмы крови позволяет дополнить существующие скрининговые системы ранней диагностики рака простым и объективным тестом. Минимальный объем исследуемого материала, простая процедура подготовки образцов к анализу, быстрое получение качественной и количественной информации, регистрация и обработка которой полностью объективизированы, позволяет использовать данный метод для формирования групп повышенного риска в отношении наиболее вероятных отдаленных последствий действия канцерогенных факторов на население. Последующее обследование людей, имеющих повышенный риск развития онкологических заболеваний, позволит обеспечить эффективное медицинское наблюдение, профилактику и лечение.

Преимущества этого метода перед другими общепринятыми методами, используемыми в клинической практике: широкий динамический диапазон исследуемых субфракций и возможность изучения нативных биологических жидкостей. Ни один из альтернативных методов клинического исследования не позволяет анализировать одновременно частицы размером от мономерных альбулярных, глобулярных белков, гликолипопротеиновых комплексов и до высокополимерных иммунных комплексов. Кроме того, все альтернативные методы исследования обязательно предполагают предварительные стадии препаративного выделения отдельных субфракций. Это приводит к усложнению процедуры анализа, что немаловажно при мониторинговых исследованиях. Более того, выделение отдельных субфракций не позволяет, учитывать эффекты межмолекулярных взаимодействий, свойственные молекулярным структурам в нативной биологической жидкости. Характер межмолекулярных взаимодействий является функциональной характеристикой анализируемых ингредиентов. Таким образом, ЛКС-метод в отличие от структурных методов дает уникальную возможность структурно-функционального анализа молекулярных ингредиентов биологических жидкостей. В перспективе ЛКС плазмы крови может приобрести особое значение не только как метод широкомасштабного скрининга населения с целью формирования групп повышенного риска и проведения ранней доклинической диагностики злокачественных новообразований, а также как метод, позволяющий отслеживать динамику патологического процесса, оценивать и прогнозировать эффективность лечебных мероприятий.

Список источников диссертации и автореферата по физике, доктора физико-математических наук, Иванов, Андрей Валентинович, Москва

1. Shawlow A.L. 1.frared and Optical Masers. - Bell Lab. Report, 1960, 38, II, p. 403407.

2. Fine S., Klein E., Scott R.E. Laser i г radiation of biological systems. JEEE Spectrum, 1964, 1, H, p. 81-86.

3. Goldman L., Igelman J., Richfield D., Impact of laser on nevi and melanoma. Arch. Derm., 1964, 90, p. 71-75.4. . Klein E., Fine S., Laor J., Sympson L., Ambrus J., Richter W., Smith G.K., Aranson

4. C. Interaction of laser radiation wich biological systems. II. Experimental tumours. Fed Proc., 1965,24, 1, III: Supplement, 14, p. 143-149.

5. Ketchman A.S., Minton J.P. Laser radiation as a clinical tool in cancer therapy. Fed. Proc., 1965,24,1, p. 159-163.

6. Fine S., Klein E. Biological effects of laser radiation. In: Advances in Biomedical and Medical Physics, 10, N.-Y., Academic Press, 1965, p. 149-226.

7. Hoye R.C., Wliss G.H., Further Evidence of Enchanced Tumour Destruction with combined Laser Energy and Chemotherapy. Natura, 1966, 210, 5034, p. 432-433.

8. Кавецкий P.E., Сидорик Е.П., Когут T.C. «Применение излучения оптических квантовых генераторов (лазеров) в онкологии» Вестник АМН СССР, 1968, 12, с. 62-68.

9. Kozlov А.Р., Moskalik K.G., Pulsed laser radiation therapy of skin tumors. Cancer, 1980, v. 46, № 10, p. 2172-2178.

10. Кавецкий P.E., Чудаков В. Г., Сидорик Е.П., Гамалея Н.Ф., Когут Т.С. Лазеры в биологии и медицине. «Здорой е», Киев, 1969, с. 257.

11. Гамалея Л.Ф. «Лазеры в эксперименте и клинике». М., Медицина, 1972, с. 232.

12. Плетнев С.Д., Девятков Н.Д., Абдуразанов М.Ш. «Газовые лазеры в экспериментальной и клинической онкологии» К., Медицина, 1978, с. 184.

13. Лазарев И.Р., «Лазеры в онкологии», Киев, «Здоровье», 1977, 134.

14. Вишневский А.А. (мл), «Возможности использования оптических квантовых генераторов в хирургии (клинико-морфологическое исследование)», Дисс. Д.м.н., Москва, 1973, ЗЬ2.

15. Пономарев И.В., «Применение лазеров на парах металлов в медицине», ФИАН, препринт №16, Москва, 1997, 57 с.

16. Грудинин А.Б., Дианов Е.М., Прохоров A.M., Серкин В.Н., «Волоконная оптика: фундаментальные и прикладные аспекты, перспективы развития», Изв. АН СССР, Сер. Физическая, 1987, том 51, №8, с. 1419-1424.

17. Артюшенко В.Г., Блинов Л.М., Володько В.В. и др., «Кварцевые волоконные световоды для передачи мощного лазерного излучения», Изв. АН СССР, Сер. Физическая, 1990, том 54, №8, с. 1570-1573.

18. Артюшенко В.Г., Дианов Е.М., Калайджан К.И. и др., «Световоды с линзами на торцах для медицинских применений», Москва, 1988, №35, Препринт ИОФАН СССР.

19. Антипенко Б.М., Березин Ю.Д., Дубровин А.Н. и др., «Волоконные световоды для эндоскопических ИК лазерных хирургических установок», Изв. АН СССР, Сер. Физическая, 1990, том 54, №10, с. 1886-1887.

20. Katzir A., "Lasers and Optocal Fibers in Medicine", San Diego et aL, Academic Press, Inc., 1993.

21. Tuchin V.V., "Lasers and Fiber Optics in Biomedicine", Laser Physics, 1993, vol. 3, no. 3,4, pp. 767-820; 925-950.

22. Sliney D.H., Trockel S.L., "Medical Lasers and Their Safe Use", N.Y. et al., Academic Press, Inc., 1993.

23. Ванюков М.Ц., Гаврилов H.M., Серебряков B.A. и др., «Оптический квантовый генератор для онкологических целей «Пульсар-1000»», ОМП, 1975, №12, с. 3133.

24. Беляев В.П., Лагузов В.П., Плетнев С.Д., «Лазерная медицинская установка ЛГМ-2», Электронная промышленность, 19766 №4, с. 52.

25. Ларюшин А.И., «Лазерная техника», Казань, ФЭН, 1995, 121 с.

26. Bondarenko A.L., Kochiev D.G., Minaev V.P., "High-power Laser Surgical Systems for Oncology in Russia", In: "Laser Use in Oncology: CIS Selected Papers", Andrey V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Editors, Proc. SPIE vol. 2728, pp. 110-118 (1996).

27. Анисимов С.И., Имас JI.C., Романов Г.С., Ходыко Ю.В., «Действие излучения большой мощности на металлы», Москва, Наука, 1970, 272.

28. Миркин Л.И., «Физические основы обработки материалов лучами лазеров», Москва, Изд. МГУ, 1976, 383.

29. Реди Дж., «Действие мощного лазерного излучения», Москва, Мир, 1974; «Промышленное применение лазеров», Москва, Мир, 1981.

30. Алейников B.C., Масычев В.И., «Лазеры на окиси углерода», Москва, Радио и Связь, 1990,312 с.

31. Дианов Е.М., Кашин В.В., Масычев В.И. и др., «Управление процессом изготовления световодов с помощью лазерного нагревателя», Инженерно-физический журнал, 1988, т. 54, №2, с. 242-248.

32. Алейников B.C., Демидов И.С., Масычев В.И. и др., «Лазерная сварка узлов стеклооболочек ЭЛП», Электронная промышленность, 1988, №12, с. 55.

33. Abakumov А.О., Aleinikov V.S., Masychev V.I. et al., "Coagulation and Destruction of Biological Tissue by CO Laser in Radiation Using Fibre Optic Cable", Optics and Laser Technology, 1986, vol. 8, pp. 190-192.

34. Бужинский О.И., «Эволюция исследований Cu-лазера и возможности его практического применения», обзор, Институт атомной энергии им. И.В. Курчатова, 1983.

35. Батенин В.М., Бучанов В.В., Казарян М.А. и др., «Лазеры на самоограниченных переходах атомов металлов», Москва, Научная книга, 1998, 544 с.

36. Dougherty Т., Boyle D., Weishaupt et al., "Phototherapy of Human Tumors", In: "Research in Photobiology", New York, 1977, pp. 435-446.50. "Photodynamic Therapy: Mechanisms", Thomas J. Dougherty, Editor, Proc. SPIE, 1990, vol. 1203, 303 p.

37. McCaughan J.S. Jr., "Photodynamic Therapy of Malignancies: A Clinical Manual", R.J. Landes Company, Austin, Georgetown, 1992, p. 248.

38. Pass H.J., "Photodynamic Therapy in Oncology: Mechanismsm and Clinical Use", J. Nat. Cancer Inst., 1993, vol. 85, no. 6, pp. 443-456.

39. Миронов А.Ф., «Фотодинамическая терапия рака», В: «Успехи химии порфиринов», том 1, Санкт-Петербург, НИИ химии СПбГУ, 1997, с. 357-373.

40. Иванов А.В., «Современные тенденции развития методов фотодинамической терапии опухолей», В: «Использование лазеров для диагностики и лечениязаболеваний», Научно-информационный сборник, вып. 3, Москва, 2001, с. 2833.

41. Соколов В.В., Странадко Е.Ф., Жаркова Н.Н и др., «Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами Фотогем и Фотосенс (результаты трехлетних наблюдений)», Вопросы онкологии, 1995, т. 41, №2, с. 134-138.

42. Levy J.G., "Photodynamic Therapy", Trends in Biotechnology, 1995, vol. 13, no. 1(132), pp. 14-18.

43. Камалов В.Ф., Степанова H.B., Черняева Е.Б., Чикишев А.Ю., «Избирательное воздействие лазерного излучения на раковые клетки и лазерная спектроскопия клетки», Квант. Электроника, 1985, том 12, №10, с. 1997-2023.

44. Hausmann W., Volk R., «Руководство по светолечению», перевод с немецкого д-ра Э.Б. Соловейчика под редакцией проф. С.А. Бруштейна, Гос. Мед. Изд., Москва, 1929, 387 с.

45. Илларионов В.Е., «Основы лазерной терапии», Москва, Респект, 1992, 122 с.

46. Козлов В.И., «Современные направления в лазерной медицине», Лазерная медицина, 1997, №1, с. 6-12.

47. Утц С.Р., Волнухин В.А., «Низкоинтенсивная лазеротерапия в дерматологии», Саратов, Изд. Саратовского Ун-та, 1998, 92 с.

48. Козлов В.И., Буйлин В.Л., «Лазеротерапия», Москва, Центр «Астр», 1993, 275 с.

49. Т. Oshiro, R.G. Calderhead, "Low Level Laser Therapy: A Practical Introduction", John Wiley and Sons, Chichester, New York, 1988.71. «Лазер в лечении ран», под редакцией проф. Кошелева В.Н., Изд. СГУ, 1980, 125 с.

50. Ernst Е., Fialka V., "Low-dose Laser Therapy: Critical Analysis of Clinical Effects", Schweiz-Med-Wochenschr., 1993, 123:949-954.

51. Крюк A.C., Мостовников B.A., Хохлов И.В., Сердюченко И.С., «Терапевтическая эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения», Минск, Наука и техника, 1986, 231 с.

52. Козлов В.И., Буйлин В.А., Самойлов Н.Г., Марков И.И., «Основы лазерной физио- и рефлексотерапии», Самара-Киев, 1993,216 с.

53. Владимиров Ю.А., «Три гипотезы о механизме действия лазерного облучения на клетки и организм человека», в сборнике «Эфферентная медицина», Москва, ИБМХ РАМН, 1994, с. 51-67.

54. Девятков Н.Д., Зубкова С.М., Лапрун И.Б., Макеева Н.С., «Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения», Успехи совр. Биол., 1987, т. 103, с. 31-43.

55. Lubart R., Malik Z., Rochkind S., Fisher Т., "A possible mechanism of low-level laser-living cellmteraction", Laser Theor., 1990, vol.2, no. 1, pp. 65-68.

56. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Башкуева Т.Ю., Модестова Т.М., Стеклова Л.С., Владимиров Ю.А., «Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональный потенциал лейкоцитов», Бюлл. Эксп. Биол. мед., 1997, Т. 123, №4, С. 395-398.

57. G.I. Klebanov, Yu.O. Teselkin, I.V. Babenkova, T.Yu. Bashkueva, T.V. Chichuk, and Yu.A. Vladimirov, "Low Power Laser Irradiation Induces Leukocyte Priming", Gen. Physiol Biophys., 1998, vol. 17, № 4, pp. 365-376.

58. Tiina Karu, "Primary and secondary mechanisms of action of visible and near infra red radiation on cells", J. Photochem. Photobiol., 1999, vol. 49, no. 1, pp. 1-17.

59. Горбатенкова E.A., Владимиров Ю.А., Парамонов H.B., Азизова О.А., «Красный свет гелий-неонового лазера реактивирует супероксидцисмутазу», Бюлл. эксп. биол. мед. 1989, 57:302-305.

60. Брилль Г.Е., Брилль А.Г., «Гуанилатциклаза и NO-синтаза возможные первичные акцепторы энергии низкоинтенсивного лазерного излучения», Лазерная медицина 1997; 1: 39-42.

61. Гамалея Н.Ф., Шишка Е.В., Яниш А.П., «Новые данные о фотосенсибилизации животных клеток и механизмах лазерной биостимуляции», ДАН СССР, том 273, с. 224-227, 1983.

62. Т. Karu, "Mollecular Mechanism of Therapeutic Effects of Low Intensity Laser Radiation", Laser Life Sci., vol. 2, pp. 53-74, 1988.

63. H.H. Трапезников, E.M. Аксель, «Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1998 году», Москва, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2000, 270 с.

64. С.П. Дарьялова, В.И. Чиссов, «Диагностика и лечение злокачественных опухолей», Москва, Медицина, 1993, 256 с.

65. Давыдов М.И., Демидов Л.В., Поляков Б.И., «Основы современной онкологии», Москва, 2002,240 с.

66. Власов В.В., «Эффективность диагностических исследований», Москва, Медицина, 1988, 56 с.89. «Ранняя комплексная диагностика и лечение злокачественных новообразований», под ред. Н.Е. Ехонтовой, Горький, 1981, с. 110.

67. Казначеев В.П., Баевский P.M., Барсенева А.П., «Донозологическая диагностика в практике массовых обследований населения», Л., Медицина, 1980, 207 с.

68. Кошелев В.Н., Серебряник М.Н., «Лазерокоагуляция опухолей кожи», Изд. Саратовского Ун-та, 1983,104 с.

69. Делоне Н.Б., «Взаимодействие лазерного излучения с веществом: курс лекций», Москва, Наука, Гл. ред. Физ.-мат. Лит., 1989, 280 с.

70. Ivanov A.V., Molodykh E.I., Romanovsky Yu.M., Schetinkina T.A., Borisov D.V. Physical and mathematical models of heat action of laser radiation on biotissue. Proceeding SPIE, "Laser Applications in Life Sciences", 1994, vol. 2370, pp. 509514.

71. Ivanov A.V., "Laser Methods in Oncology", Proc. of International Symposium "Development of Medical Equipment Technology Converted from Weapons Sciences", 19-23 February 1996, Podolsk, Moscow Region, pp. 28-31.

72. Иванов A.B., Зубов Б.В., Мурина T.M., Роттенберг В.И. Перспективы применения эрбиевого лазера в онкологии. Лазеры в онкологии, Ташкент, 1987, с. 11-14.

73. Иванов А.В. Комплексная фототерапия опухолей перспективное направление лазерной медицины. "Медицинская физика. Техника, биология, клиника", № 2, 1995, с. 99-100.

74. Козлов А.А., Жаров В.П., Иванов А.В., Литвинов Ю.О., Шашков Е.В. Многофункциональная лазерная медицинская установка на основе импульсно-периодического лазера. Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине, Тарту, 1990, с. 220-229.

75. Колосов В.А., Пророков В.В., Иванов A.B., Ли И.А. Лазерное устройство для проведения промежностного этапа при операции на прямой кишке. Авторское свидетельство № 1660242, 01.03.1991

76. Иванов A.B., Чвыков В.В., Жаров В.П., Шашков Е.В., Кувшинов Ю.П., Литвинов Ю.О., Шабаров В.Л., Фаенов АЛ. Способ деструкции опухолей. Авторское свидетельство № 1607149, 15.07.1990

77. Иванов A.B. Фотодинамическая терапия опухолей: пути повышения эффективности. Медицинская физика, 1996, №3, с.55-60.

78. Ivanov А.V., Kazaryan A.M., Kazaryan M.A., Kuvshinov Yu.P., Poddubnyi V.K. Increasing The Effectiveness Of Photodynamic Tumor Therapy Using Active Metal Vapor Laser Media. Moscow Physics Société Journal, no. 7, 1997, pp. 421-426.

79. Bier J., J. Electrophoresys, N.Y., 1968

80. Иванов A.B., Петраш Г.Г., Казарян M.A., Земсков К.И., Фаенов А .Я., Чвыков В.В., Шабаров B.J1. Избирательность действия лазерного излучения на биоткани. Доклады Академии Наук СССР, 1989, т.305, № 3, с. 736-739.

81. Васильев Ю.Н., Земсков К.И., Иванов A.B., Казарян М.А., Петраш Г.Г., Чвыков В.В. Применение активных оптических систем для биологии и медицины. Труды ФИАН СССР, Москва: "Наука", 1991, т. 206, с. 136-148.

82. Петраш Г.Г., Казарян М.А., Иванов A.B., Шабаров В.Л., Фаенов А.Я., Чвыков В.В. Способ облучения патологических образований. Авторское свидетельство № 1543615, 15.10.1989

83. Иванов A.B., Карменян A.B., Полутов А.Г. Управление параметрами лазерного излучения для воздействия на злокачественные новообразования. «Медицинская физика», №5, 1998, с. 61-65.

84. Иванов A.B., Карменян A.B., Полутов А.Г. Диагностико-терапевтичнский комплекс для фотодинамической терапии и его возможности. Лазерная медицина, т. 3, №3/4, 1999, с. 86-89.

85. Ковтонюк Н.Ф., Иванов А.В., Полутов А.Г. Управление лазерным излучением в фотодинамической терапии опухолей. Биомедицинская радиоэлектроника, № 10 (2000), с. 14-20.

86. Kovtonyuk N.F., Ivanov A.V., Polutov A.G., "Laser Radiation control in photodynamic therapy of tumors", Crit. Rev. Biomed. Eng., 2001, vol. 29, no. 3, pp. 493-501.

87. Kupin V.I., Bykov B.S., Ivanov A.V., Larichev V.Yu. Potentaiting Effects of Laser Radiation on Some Immunological Traits. Neoplasma, vol. 29, № 4,1982, pp. 403404.

88. Сенин B.M., Иванов A.B., Афанасьева A.B., Бунцевич A.M. Новые органотропные метастазирующие переваренные опухоли мышей и . их использование для изучения влияния лазерного излучения на процесс диссеминации. Вестник АМН СССР, 1984, № 5, с. 85-91.

89. Трапезников Н.Н., Купин В.И., Иванов А.В., Машковцев Ю.В., Бескова Т.К., Полевая Е.Б., Кадагидзе З.Г. Действие излучения He-Ne лазера на лимфоциты человека. Вестник АМН СССР, 1984, № 5, с. 40-43,

90. Иванов А.В., Мороз JI.B. Задачи лазерной терапии в онкологии. Вопросы онкологии, 1985, т. 31, № 6, с. 114-115.

91. A.V. Ivanov. Oncological aspects of the biological action of low-level laser radiation. I. Experimental foundation for LLLR use in oncology. Laser Use in Oncology II, Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Eds., Proc. SPIE, vol. 4059, pp. 90-100.

92. Ревазова E., Брызгалов И., Сорокина Ю., Иванов А.В., Себастиан Дж., Келлер Г., Ватсон Дж. Низкосиловое лазерное облучение стимулирует рост человеческой опухоли. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, Том 132, № 8, с. 195-196

93. Kupin V.I., Sorokin A.M., Ivanov A.V., Lapteva R.M., Polevaia B.M. The Effect of Nondamaging Intensity Laser Irradiation on the Immune System. Neoplasma, 1987, vol. 34, №3, pp. 325-331.

94. Купин В.И., Сорокин A.M., Иванов А.В., Лаптева P.M., Полевая Е.Б. Влияние лазерного излучения неповреждающей интенсивности на систему иммунитета. Советская медицина, 1985, № 7, с. 8-12.

95. Антонив В.Ф., Дмитриев А.А., Дайхес Н.А., Иванов А.В., Давудов Х.Ш., Перекосова Ю.В., Лаптев В. П. Адоптивная лазерная иммунотерапия и фотодинамическая терапия в ЛОР-онкологии. Вестник оториноларингологии, 1990, №5, с. 3-8.

96. Armichev A.V., Ivanov A.V., Panasenko N.A., Perov S.N., Zakharov S.D. Spectral Dependence of Erytrocyte Response of Low-Intensity Irradiation at 570-590 nra. Journal of Russian Laser Research, 1995, vol.16, pp. 186-188.

97. Захаров С.Д., Иванов A.B. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухолей. Квантовая электроника, т. 29, №3, -1999, с. 192-214.

98. Иванов A.B., Захаров С.Д., Перов С.Н., Панасенко H.A. Гибель опухолевых клеток при их облучении гелий-неоновым лазером. Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине, Тарту, 1990, с.52-54.

99. Эскин В.Е., «Рассеяние света растворами полимеров», Москва, 1973.

100. Воробьев Н.С., Иванов A.B., Подгаецкий В.М., Терещенко С.А. Способ определения онкологических заболеваний. Патент № 2077342, 20.04.1997

101. Горбунова Ю.Г., Дюмаев K.M., Иванов A.B., Подгаецкий В.М., Томилова Л.Г. Состав для контрастирования внутренней структуры биологических объектов при лазерной томографии. Патент № 2098092, 10.12.1997

102. Поддубный Б.К., ., Пустовойт В.И., Газаров Х.В., Жогун В.Н., Иванов A.B., Скобелев И.Ю., Фаенов А.Я, Чвыков В.В., Шабаров В.Л., Шеховцов В.Н. Способ колориметрического обнаружения опухолевой ткани. Авторское свидетельство № 1433192, 22.06.1988

103. Поддубный Б.К., Иванов A.B., Шабаров В.Л., Аверьянов К.П., Агранат М.Б., Таурин Н.Ф., Чалкин С.Ф. Спектрофлуориметрический эндоскоп. Авторское свидетельство № 1363549, 01.09.1987

104. Поддубный Б.К., Пустовойт В.И., Визен Ф.Д., Иванов A.B., Газаров Х.В., Жогун В.Н., Фаенов А.Я., Шабаров В.Л. Способ диагностики опухолей,доступных для эндоскопического и визуального обследования. Авторское свидетельство № 1363995, 01.09.1987.

105. Поддубный Б.К., Пустовойт В.И., Визен Ф.А., Газаров Х.В., Жогун В.Н., Латышев Л.М., Иванов A.B., Фаенов А.Я., Чалкин С.Ф., Шабаров В.Л., Шеховцов В.Н. Спектрофотометрический эндоскоп. Авторское свидетельство № 1504835,01.05.1989.

106. Белоусов A.B., Иванов A.B., Фаенов А.Я., Чвыков В.В., Шабаров В.Л. Способ контроля положения дистального конца гибкого эндоскопа и устройство для его осуществления. Авторское свидетельство № 1717099, 08.11.991

107. Белоусов A.B., Беляев М.В., Горбенко A.B., Иванов A.B., Чвыков В.В. Лазерный проекционный микроскоп в биологических исследованиях. Методы исследования оптических свойств высокотемпературной плазмы. Сборник научных трудов, Москва, 1989, с. 92-96.

108. Петрова Г. П., Петрусевич Ю. М., Алексеев С. Г., Иванов А. В. Метод рэлеевского рассеяния света в диагностике онкологических заболеваний. "Медицинская физика". Сборник научных трудов.- М., физ. фак. МГУ, 2002, с. 156-167.

109. Petrova G., Petrusevich Yu., Alexeev V., Ivanov A. Laser Light Scattering in Diagnosis of Widespread Diseases. Proc. SPIE v. 4762 pp 356-365 (2002) ALT-01, Intern. Confer, on Advanced Laser Technology, Roumania 2001

110. Иванов A.B., Купин В.И., Буачидзе Л.H. Способ воздействия на иммунологический статус онкологических больных. Авторское свидетельство № 1341768, 1.06.1987

111. Заплавнова Л.Д., Иванов A.B. Способ лечения предопухолевых заболеваний и начальных форм рака шейки матки. Авторское свидетельство № 1374499, 15.10.1987

112. Полутов А.Г., Карменян A.B., Иванов A.B., Хохлова Н.М., Кирюхин В.И. Способ и эндоскоп для избирательной фототерапии. Патент № 2116745, 10.08.1998

113. Полутов А.Г., Карменян A.B., Иванов A.B. Устройство для спектральной диагностики и избирательной фототерапии. Патент №2138306, 27.09.1999

114. Решетников А. В., Залевский И. Д., Кемов Ю. В., Иванов А. В., Карменян А. В., Градюшко А.Т., Лаптев В. П., Неугодова Н. П., Абакумова О. Ю., Привалов В. А., Романов В. А. "Фотосенсибилизатор и способ его получения". Патент РФ №2183956,27.06.2002

115. Подцубный Б.К., Кувшинов В.П., Ефимов О.Н., Иванов A.B., Серебряков С.Н. Лечение язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки лазерным излучениемнеповреждающей интенсивности. Медицинская радиология, 1983, № 10, с. 7576.

116. Заплавнова Л.Д., Иванов A.B., Малышев Б.Н. Лазеры в лечении предопухолевых заболеваний шейки матки и вульвы. Электронная техника, Серия II: Лазерная техника и оптоэлектроника, 1984, т. 4(30), с. 73-77.

117. Заплавнова Л.Д., Козаченко В.П., Иванов A.B. Применение лазерного излучения в лечении предопухолевых и опухолевых заболеваний шейки матки и вульвы. Вестник АМН СССР, № 12, 1984.

118. Кныш В.И., Ананьев B.C., Барсуков Ю.А., Иванов A.B., Спицина Т.А., Мухаммедаминов Ш.К. Ведение промежностной раны в послеоперационном лечении больных раком прямой кишки. Вестник хирургии им. Грекова, 1985, т. 134, № 1, с. 65-68.

119. Цветков В.Н. и др., «Структура макромолекул в растворах», Москва, 1964.

120. Балакирев С.А., Цыганкин В.И., Иванов A.B., Атрощенко В.И., Яновский А.Н., Сарфундин М. Методика применения лазерной и фототерапии в комплексном лечении злокачественных опухолей и гемобластозов у детей. «Вопросы онкологии», том 43, №4, с. 445-447.

121. Иванов A.B., Ефимов О.Н., Цыганкин В.И., Балакирев С.А., Полевая Е.Б., Карташова Е.О. Неповреждающая лазерная терапия в комплексном лечении опухолей. Вопросы онкологии, 1995, т.41, № 2, с.141-143.

122. A.V.Ivanov, A.V.Reshetnickov, G.V.Ponomarev. One more PDT application of chlorin еб. Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy IX. T.J.Dougherty, ed., Proc. SPIE, Vol. 3909, 131-137 (2000).

123. Тучин В.В., «Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях», Саратов, Изд. Саратовского ун-та, 1998, 384 с.184185186187,188,189,190,191.192.193.194,195.196,197.

124. Граменицкий Е.М., «Прижизненная окраска клеток и тканей»,Л-д, Медгиз. 1963.

125. Лордкипанидзе А.Т., Рощупкин Д.И., «Механизм перекисного фотоокисления липидов в мембранах эритроцитов», в кн.: «Фотобиология животной клетки», Л-д, Наука, 1979, с. 56-60.

126. Черницкий Е.А., Воробей A.B., «Структура и функции эритроцитарных мембран», Минск, Наука и техника, 1981.

127. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте», Москва, Наука, 1975.

128. Конев C.B., Волотовский И.Д., «Фотобиология», Минск, Наука и техника, 1975, 392.

129. Фельдман H.JL, «О причинах подавления гранулообраэования красителей при повреждении клеток», ДАН СССР, 1953, 39, 2, 345-346.

130. Васильева H.H., Иванов A.B., Поляков Б.И., Малышев Б.Н. Изучение повреждающего действия на кожу и подлежащие ткани излучения различных лазерных источников. Вестник дерматологии и венерологии, 1978, № 3, с. 13-16.

131. Рубин Л.Б., Ахобадзе В.В., Иванов A.B., Масиновский З.Б. О механизме действия несфокусированного лазерного излучения на фотосенсибилизиованную суспензию эритроцитов. Научные доклады высшей школы. Биологические науки, 1973, № 11, с. 50-54.

132. Иванов A.B., Ганаго А.О. Селективное действие излучения рубинового лазера на пигментный аппарат фотосинтеза. Биофизика, 1983, т. 18, № 1, с. 45-49.

133. Рубин Л.Б., Кренделева Т.Е., Низовская Н.В., Иванов A.B. Действие излучения ОКГ на рубине на первичные биохимические реакции фотосинтеза. Биохимия, 1972, т. 37, № 1, с. 158-162.

134. Зверев Г.М., Толяев Ю.Д., «Лазеры на алюмоиттриевом гранате с неодимом», Москва, Радиосвязь, 1985, 144 с.

135. Дьюлик У., «Лазерная технология и анализ материалов», Москва, Мир, 1986, 504 с.

136. Тихонов А.И., Самарский A.A., «Уравнения математической физики», Москва, Наука, 1977, 736 с.

137. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х., «Реология крови», Москва, Медицина, 1982, 272 с.

138. Guy A.W., "Physical Aspects of Electromagnetic heating of Issue Volumes", Proc. Int. Symp. Cancer Therapy by Hyperthermia and Radiation, Washington, D.C., August 1975, pp. 105-108.

139. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., «Физико-химические основы фотобиологических процессов», Москва, Высшая школа, 1989.

140. Шинкаренко Н.В., Алесковский В.Б., «Химические свойства синглетного молекулярного кислорода и значение его в биологических системах», Успехи химии, 1982, т. LI, №5, с. 713-735.

141. Шинкаренко Н.В., Алесковский В.Б., «Синглетный кислород, методы получения и обнаружения», Успехи химии, 1981, т. L, №3, с. 406-408.220221222223224225226227228229230,231232,

142. Красновский A.A. мл., «Фосфоресцентный анализ синглетного молекулярного кислорода в фотобиохимических системах», Биологические мембраны, т. 15, №5, 1998, с. 530-548. •

143. Reshetnickov A.V., Yashunsky D.V., Shvets V.l., Moser J.G., Ponomarev G.V., II

144. Abstracts of XVI Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry (Sectionof Life Chemistry), Russia, SPb, 25-29 May 1998, pp. 99-100.

145. Yarmush M.L, Thorpe W.P., Strong L., Rakestraw S., Toner M., Tompkins R., II

146. Crit. Rev. Therap. Drug Carr. Syst., 1993, vol. 10, pp. 197-252.

147. Dagari A., Gatt S., Cerbu-Karabat S., Mazier J.-K., Maziere C., Santus R.,

148. Engelhardt E.L., Yeh K.A., Stobbe C.C., Fanning M.C., Chapman J.D, Int. J. Cancer,1995, vol. 63, pp. 831-839.

149. Bergstrom, Vucenic I., Hagen L.K., Chemomorsky S.A., Poretz R.D., J. Photochem. Photobiol. B- Biol., 1994, vol. 24, pp. 17-23.

150. Akhlynina T.V., Jans D.A., Rozenkranz A.A., Statsyuk N.V, Balashova I.Y., Toth G., Pavo I., Rubin A.B., Sobolev A.S., J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, pp. 2032820331.

151. Jiang X., Pandey R.K., Smith K.M., J. Chem. Soc. Perkin Trans., vol. 1, 1996, pp. 1607-1615.

152. Pandey R.K., Sumin A.B., Constantine S., Auodia M., Potter W.R., Smith K.M., Dougherty T.J., Photochem. Photobiol., 1996, vol. 64, no.l, pp. 194-204. Kessel D., "Biochemistry", 1977, vol. 16, pp. 3443-3449.

153. Решетников A.B., Швец В.И., Пономарев Г.В., «Водорастворимые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака», обзор РАВ в: «Успехи химии порфиринов», том 2, 1999.233234235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,

154. Миронов А.Ф., Нокель А.Ю., Скобелкин O.K., Чиссов В.И., Соколов В.В., Странадко Е.Ф., Патент РФ №2063971, Б.И., 1996, №20.

155. Harrigan P.R., Wang K.F., Redelmayer Т.Е., Wheeler I.I., Cullis P.R., Biochem. Biophys Acta, 1993, vol. 1149, pp. 329-338.

156. New R.R.C., Ed. "Liposomes: A Practical Approach", Oxford, JRL Press at Oxford Universyty Press, 1993, 186 p.

157. Moan J., Berg K., "Photochemotherapy of Cancer: experimental research", Photochem. Photobiol., 1992, vol. 55, pp. 931-948.

158. Sakata I., Nakajima S. et al., "Pheophorbide Derivatives and Alkaline Salts Thereof',

159. C.A., 1985, vol. 103, no. 15, 123271s; Pat. 4709022 (11/1987) USA.

160. Bonnett, R., "Photosensitizers of the Porphyrin and Phtolocyanine Series for

161. Photodynamic Therapy", Chem. Soc. Reviews, 1995, no. 24, pp. 19-33,

162. Moan, J., "Proporties for Optimal PDT Sensitizers", Photochem. Photobiol., B:

163. Biology, 1990, no. 5, pp. 521-524.

164. Rosenthal, I., "Phthalocyanine as Photodynamic Sensitizers", Photochem. Photobiol., 1991, vol. 53, pp. 859-870.

165. Golubeva, N.A., Demcheva, M.V., Chernyaeva, E.B., et. al., "Bioconjugates of Photosensitizers Relevant for PDT", in Laser Use in Oncology: CIS Selected Papers, Andrei V. Ivanov, Mishik A. Kazaryan, Editors, Proc. SPIE 2728, 1996, pp. 165-180.

166. Klyashnhitsky, B.A., Mitina, V.Kh., Frantsuzova N.A., et. al., "Use of Biospecific Interactions of Collagen, Fibronectin and Their Fragments in Affimily Chromatography", J. Chromatogr., 1992, vol. 577, pp. 267-273.

167. Oseroff, A.R., Ära, G., Ohnoha, D., et. al., "Strategies for Selective Cancer Photochemo-therapy: Antibody-targeted and Selective Carcinoma Cell Photolysis", Photochem. Photobiol., 1987, vol. 46, pp. 83-96.

168. Yarmush, L.M., Thorpe, W.P., Strong, L., et. al., "Antibody Targeted Photolysis", Crit. Rev. Therap. Drug Carr. Syst., 1993, vol. 10., no. 3, pp. 197-252.

169. Pottier, R. and Kennedy, J.C., "The Possible Role of Ionic Species in Selective Biodistribution of Photochemotherapeutic Agents Toward Neoplastic Tissue", J. Photochem.Photobiol, B: Biology, 1990, no. 8, pp. 1-16.

170. Болодон B.H., Воробей A.B., Черницкий Е.А., "Влияние анестетиков на сенсибилизируемое порфиринами фотоповреждение клеток", Биофизика, 1986, т. 31, №6, с. 990-992.

171. Bachowsky, G.J., Morehouse, К.М, and Girotti A.W., "Porphyrin-sensitized Photoreactions in the Presence of Ascorbate: Oxidation of Cell Membrane Lipids and Hydroxyl Radical Traps", Photochem. Photobiol., 1988, vol. 47, no. 5, pp. 635-645.

172. Böhmer, R.M. and Morstin, G., "Uptake of Hematoporphyrine Derivative by Normal and Malignant Cells: Effect of Serum, pH, Temperature and Cell Size", Cancer Research, 1985, no. 45, pp. 5328-5334.

173. Iinuma, S., Farshi, S.S., Ortel, В., and Husan, Т., "A Mechanistic Study of Cellular Photo-destruction Which 8-Aminolaevulinic Acid-Induced Porphyrin", Br. J. Cancer, 1994, vol. 70, no. l,pp. 21-28.

174. Панферова Н.Г., Иванов A.B., Дейчман A.M., Лаптев В.П., "Фотодинамические реакции у мышей с опухолями в условиях умеренного гипометаболизма",

175. Актуальные вопросы лазерной медицины и операционной эндоскопии, Материалы 3 Международной конференции, 30 мая 1июня 1994 г., Москва — Видное, 1994, с. 454.

176. Земсков К.И., Казарян M.A., Петраш Г.Г., Скрипниченко А.С., Чвыков В.В., «Внутрирезонаторная обработка объектов в активной оптической системе», Крат, со-общ. по физике ФИАН, 1988, № 5, с. 30-32.

177. Казарян М. А., Матвеев В. М., Петраш Г. Г., «Проекционная система с усилителем яркости и автономным источником света», Изв. АН СССР, Сер. физ., 1982, том 46, № 10, с. 1898-1904.

178. Земское К. И., Казарян М. А., Матвеев В. М., Петраш Г. Г., «Исследование характеристик негативного изображения в оптической системе с усилителем яркости на парах меди», Квантовая электроника, 1983, том 10, № 11, с. 2278-2282.

179. Алейников B.C., Бункин Ф.В., Дианов Е.М., Земское К.И., Казарян М.А., Петраш Г.Г., Прохоров A.M., Савранский В.В., «Волоконный жгут в оптической системе с усилителями яркости», ДАН СССР, 1984, том 274, № 6, с. 1373-1375.

180. Белоусов А.В., Беляев М.В., Горбешко Т.П., Иванов А.В., Чвыков В.В., «Лазерный проекционный микроскоп в биологических исследованиях»,

181. Методы исследования оптических свойств высокотемпературной плазмы, Сб. науч. тр. ВНИИФТРИ, Москва, 1989, с. 131-134.

182. Теренин А.Н., «Фотоника молекул красителей и родственных органический соединений», Ленинград, Наука, 1967, 726 с.

183. Думаревский Ю.Д., Ковтонюк Н.Ф., Савин А.И., «Преобразование изображений в структурах полупроводник-диэлектрик», Москва, Наука, 1987, 176 с.

184. Иванов A.B. Влияние неионизирующего излучения на гематогенную диссеминацию высокометастазирующих опухолей мышей. Метастазирование злокачественных опухолей: новые подходы, I Всесоюзный симпозиум, Тезисы докладов, Киев, 1987, с.53-54.

185. Саркисян А.П., «Воздействие низкоинтенсивного гелий-неонового лазера на систему кроветворения кроликов в условиях интоксикации бензолом», в сб.: «Применение лазеров и средств лазерной техники в биологии и медицине», Киев, Наукова думка, 1981.

186. Ровенский Ю.А., «Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток», Москва, Медицина, 1979, 151 с.

187. Иванов A.B., Шалыгин A.M. Изменение магнитных свойств лимфоцитов под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения 633 нм. Магнитобиология и магнитотерапия в медицине, Тезисы докладов, Всесоюзный симпозиум, Куйбышев, 1991, с.32-33.

188. Кондорский Е.И., Норина С.Б., Шалыгин А.Н., «Действие неоднородного магнитного поля на эритроциты человека», Биофизика, 1980, том 25, №1-2, с. 353-355.

189. Kupin V.l., Polevaya Е.В., Ivanov A.V. Laser Adoptive Photoimmunotherapy in Breast Cancer Patients. Inernational Conference of Photodynamic Therapy and Laser Medicine, Oktober 15-17, 1991, Beiying, China, Abstracts, p. 93 L91.

190. Владимиров Ю.А., «Лазерная терапия: настоящее и будущее», Соровский образовательный журнал, 1999, №12, с. 2-8.

191. Зубкова С.М., «О механизме биологического действия излучения гелий неонового лазера», Биол. науки, 1978, №7, с. 30-37.

192. Кару Т.И., «Клеточные механизмы низкоинтенсивной лазерной терапии», Успехи совр. Биологии, 2001, том 121, №1, с. 110-120.

193. Мостовников В.А., Мостовникова Г.Р., Плавский Ю.В., Третьяков С.А., «О молекулярном механизме терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения видимого спектрального диапазона», Изв. АН СССР, Сер. физ., 1990, том 54, № 8, с. 1636-1642.

194. Karu T.I., "The science of Low Power Laser Therapy", London: Gordon and Breach Sei. Publ, 1998, p. 320.

195. Мостовников B.A., Мостовникова Г.Р., Плавский В.Ю., Третьяков С.А., «О молекулярных механизмах терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения», В сб.: «Современная оптика и лазерная физика», Минск, 1993, с. 254-312.

196. Захаров С.Д., Скопинов С.А., Чудновский В.М. и др., «Первичные механизмы неспецифического воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на эритроциты с участием молекулярного кислорода», Изв. АН СССР, Сер. Физ., 1990, том 54, №8, с. 1629-1635.

197. Чудновский В.М., Леонова Г.Н., Скопинов С.А., Дроздов А.Л., Юсунов В.И., «Биологические модели и физические механизмы лазерной терапии», Владивосток, Дальнаука, 2002, 157 с.

198. Минаев В.П., «О возможном механизме влияния когерентности лазерного излучения на взаимодействие с биотканью при низкоинтенсивной лазернойтерапии», в: «Использование лазеров для диагностики и лечения заболеваний», Москва, ЛАС, 1996, с. 5-7.

199. Семенов А.Н., Хохлов А.Р, «Статистическая физика жидкокристаллических полимеров», УФН, 1988, том 156, №3, с. 427-472.

200. Зельдович Б.Я., Табирян Н.В., «Ориентационная оптическая нелинейность жидких кристаллов», УФН, 1985, том 147, №4, с. 633-674.

201. Иванов A.B., «Экспериментальное обоснование режимов применения лазерного излучения в онкологии», дисс. канд. биол. наук, Москва, 1985, 169 с.

202. КлебановГ.И., Владимиров. Ю.А., «Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов», Успехи совр. Биол., 1999, том 119, №5, с. 462-475.

203. Снайдер C.X., Бредт Д.С., «Биологическая роль азота», В мире науки, 1992, №7, с. 16-26

204. Ambartsumyan R.V., "Lasers in cardiology", Proc. SPIE EKOOSA'86, Florence, Monduzzi, 1987, pp. 341-342.

205. Long S., Keaurus D.R., J. Chem. Phys., 1973, vol. 59, p. 5729.

206. Амбарцумян P.B., Елисеев П.Г., Еремеев Б.В., Захаров С.Д., «Биологическое действие лазерного излучения на эритроциты в инфракрасной полосепоглощения молекулярного кислорода», Кратк.сообщ. по физике, ФИАН, 1987, №10, с. 35-37.

207. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д., «Биология», том 2, Москва, Мир, 1990; Сетлоу Р., Поллард Э., «Молекулярная биофизика», Москва, Мир, 1964.

208. Matheson I.B.C., Lee J., Chem. Phys. Letts., 7, 475, (1970).

209. Еремеев Б.В., «Селективное действие низкоинтенсивного ИК-лазерного излучения на эритроциты», дисс. Канд. Физ.-мат. наук, ФИАН, Москва, 1989.

210. Zakharov S.D., Ргос. SP1E 1884, 181 (1993).

211. Захаров С.Д., Перов С.Н., Панасенко H.A., «Краткие сообщения по физике», 1989, №1, с. 26.

212. Чудновский Ю.Р., Бондарев И.Р., Оратовская C.B., «Люминесценция эндогенного порфирина крови», Биофизика, 1996, том 41, Вып. 5, с. 1121-1124.

213. Zakharov S.D., Soldatov A.N., Korochkin I.M., Eremeev B.V., Sukhanov V.B., Shumeyko A.S., Babenko E.V., Kapustina G.M. Journal of Russian Laser Research, 1995, vol.16, pp.179-185.

214. Всеволодов H.H., «Биопигменты-фоторегистраторы», Москва, наука, 1988.

215. Приезжев A.B., Тучин B.B., Шубочкин Л.П., «Лазерная диагностика в диагностике и медицине», Москва, Наука, 1989.

216. Yong. A.R., "Chomosphores in human skin", Phys. Med. Biol., 1997, vol. 42, pp. 779-802.

217. Фабелинский И.Л., «Молекулярное рассеяние света», Москва, Наука, 1965, 511 с.

218. Ленинджер А., «Биохимия», Москва, 1974.316. «Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов», под ред. Камминс Г., Пайк Э., Москва, Мир, 1978, 583 с.

219. Лебедев А.Д., Левчук Ю.Н., Ломакин А.В., Носкин В А., «Лазерная коррреляционая спектроскопия в биологии», Киев, Наукова думка, 1987, 526 с.

220. Edsall J.T. et al., "Lighr scattering in solutions of serum albumin: effects of charge and ionic strength", J. Am. Chem. Soc., 1950, vol. 72, p. 1641.

221. Петрусевич Ю.Н., «Взаимодействие биополимеров в растворе», дисс. док. физ.-мат. наук, Москва, 1992.

222. Петрова Г.П., «Молекулярная подвижность и молекулярные взаимодействия в оптически анизотропных жидких системах», дисс. док. физ.-мат. наук, Москва, 1999.

223. Krendeleva Т.Е., Nizovskaya N.V., Rubin L.B. On Selected Damage of Photosystem I of Isolated Pea Chloroplast After Treatment with Ruby Laser Radiation. Nature, New Biology, vol. 240, 13 December 1972, pp. 223-224.

224. Иванов A.B., Рубин Л.Б., Ганаго A.O. О механизме селективного повреждающего действия излучения рубинового лазера на фотосистему I в хлоропластах гороха. Биофизика, 1973, т.18, № 6, с. 1117-1119.

225. Ревазова Е., Брызгалов И., Сорокина Ю., Иванов А., Себастиан Дж., Келлер Г., Ватсон Дж., «Использование низкосилового лазерного облучения для ускорения васкуляризации тканевых трансплантатов», Бюлл. Эксп. Биол. мед., 2001, том 132, №9, с. 306-309.

226. Захаров С.Д., Исмаилов М.Ш., Аминова Э.М., Стародуб А.Н., Иванов А.В., Данилов В.П., Рыков С.В., «Способ повышения продуктивности микроорганизмов», Патент РФ №2202049, 10.07.2003.