Физико-химическое исследование реакций синтеза и гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов, катализируемых пенициллинацилазой тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова Химический факультет

'ЬА П^АЬАХ флоппи*

ДЩЩЯПЕТРИС Ремигиюс йоно

Физико-химическое исследование реакций синтеза и гидролиза к-фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов, катализируемых пенициллинацилазои

о г. «о.15-Химическая кинетика и катализ

Дьтор^с-^т

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВа - 19 91:

Работа выполнена на кафедре химической Химического факультета и отделе оиокинетики

физико-химической Сиологии им А. Н. Белозерского

государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук Б.К. Швядас

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

В.М. Степанов

доктор химических наук. Л.Д. Румш

Ведущая организация.: Институт химии пищевых Еетеств РАН

Защита состоится ^ марта ¡-»у^ г. в час. на

заседании специализированного сонета Л oij.oi.76 в Московском государственном университете им. М. 3. Ломоносова по адресу: и узу9, ГСП, Москва, МГУ, Ленинские горы, Химическим Факультет, кафедра химическои энзимологии, ауд.

С диссертациеи можно ознакомиться в Сиолиотеке Химического факультета МГУ.

энзимологии Института Московского

Автореферат разослан февраля г.

Ученый секретарь

специализированного совета, л * / 1 яэндидат химических каук //У/ ^ '' 0. А. Кост

:;?р?к терисшка работы лктуэ юность проолемы. Использование ферментов в органическом синтезе является одним из О'.тко развивающихся направлении инженерной энзимологии. Достоино~ээ ферментов как катализаторов многих органических реакции весьма очевидны: высокая хемоспзцифичность. региоспецишичность. энантиоселективность. Биокатализаторы, кроне того, способны раоотать в "мягких" .условиях, многие реакции возможно провести в водной среде, чтс привлекает особое внимание в связи с возрастающими экологическими требованиями к современной техн^лолш. Однако 'до последнего времени использование ферментов в органическом синтезе явно не соответствовало их возможностям. В значительной степени это оыло связано с недостаточным уровнем исследования масгнх ферментативных реакции и недоступностью рядя ферментов. О развитием технической микробиологии, генетической инженерии и химической энзимологии были со здань; предпосылки более аирокого использования ферментов в органическом'синтезе. Одним из наиболее разработанных вопросов в этой области является ферментативный синтез пептидов, однако ферменты применялись здесь главным образом как катализаторы непосредственного образования пептидной связи. Существенным для развития биокаталитических методов синтеза пептидов представляется изучение возможностей синтеза пептидов с применением ферментов не только на стадии образования пептидной связи, но также и к? стадиях введения защитных групп с последующим ферментативном снятием этих защитных групп в целевых пептидах.

Цель работы, Целью настоящей работы явилось исслеяозэкг.г кинетики реакции гидролиза и синтеза \-фенилацегиламкнокислот. их сложных эовиров и пептидов, катализируемых пенпцилликацилазои. и демонстрация возможностей использования этих реакции з биокаталитическом синтезе пептидов. Для этого требовалось:

а! разработать методы ферментативного фенилацетилированкя аминокислот, их эфиров и пептидов,

б) выяснить пригодность полученных фенилацетильных производных в синтезе пептидов, катализируемом протеазами.

с) изучить возможности снятия ¡ренилацетильнои защиты аминогрупп в производных пептидов при помоои пенициллинацилазк. д) изучить специфичность пенициллинаиилазы в синтетических и

з

гидролитических реакциях с целью демонстрации общности данного-метода.

Практическое значение. Работа выполнена в рамках задания • государственной приоритетной научной программы "Новейшие метода биоинженерии", раздел "Инженерная энзимология", проект 4-зот "Биокаталитическое введение и снятие защиты аминогрупп в пептидном синтезе".

Научная новизна. Впервые разработаны метода высокоэффективного ферментативного синтеза фенилацетильных производных аимнокислот, их эфиров и пептидов. Получены принципиально новые результаты по специфичности пенициллинацилазы как в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов, так и в реакциях синтеза этих соединений.' С использованием разработанных методов введения фенилацетильной защиты мн2-групп в эфирах аминокислот при помощи пенициллинацилазы, образования пептидной связи с использованием папаина и химотрипсина, и последующего снятия фенилацетильной защиты кн2-групп при помощи пенициллинацилазы, впервые был проведен синтез трет-бутилового эфира ьеи-энкефалина полностью ферментативныым путем.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на б Всесоюзном симпозиуме "Методы синтеза и анализа биохимических реагентов". Рига, 1987 г., 4 Всесоюзном симпозиуме "Аминокислоты в сельском хозяйстве, медицине и в науке", Ереван, 1988 г., 5 Всесоюзном симпозиуме по пептидному синтезу, Рига, 1990 г., т Всесоюзном симпозиуме по "Инженерной энзимологии". Москва, 1991 г., 1 Международном рабочем совещании "Ферменты в пептидном •синтезе", Богензес, ФРГ, 1991 г., Всесоюзной школе-конференции "Ассиметрический синтез. Биокатализ в органическом синтезе".

АЛуШТа, 1991 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Обьем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы,, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы < из названии). Работа изложена ца ¡?0 страницах машинописного текста и включает таблиц

И 18 РИСУНКОВ.

- ~ ; *

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Ферментативный синтез фенилацзтильных производных эфироз

аминокислот методом прямой конденсат;', срэнилуксуснои кислоты__и

.эфиров аинокислот, Показана возможность ' высокоэффективного серментативного синтеза фенилацетильных производных сложных эфиров аминокислот в водных растворах и в водно-органических смесях методом прямой конденсации фенилуксуснои кислоты и эфиров аминокислот, катализируемои пенициллинашлазои:

_ 0 о 0 0

---' 1 —— \

а ч

Основной. проблемой д»~н:-х гпктс-зоз является то, что ооразовэние амиднои связи е- глзн:« среде является термодинамически невыгодным. Изучены два сгос-Х'* сдвига равновесия : а> проведение синтеза в водно-оутандиолькых смесях с высоким содержанием органического сорг-створителя с тол». О! синтез в водных средах с высокими н=-:эльк.:ми концентрациями реагентов (>о.зч>. где сдвиг равновесия в сторону синтеза наблюдался за счет образования малорастворимых в рлдв продуктов. Хссошш: зыхсд наблюдали в обоих методой. одн^к'» синтез в золе является ло.-с-е лерспектквнын с прчки:ческо;: т.'тки зрения .простата проведения синтеза. легкость ЬйЛеягния I1 достижение бысэкои чист*, ты иеле?;сгс продукте, стабильность сермента •. Используя дан-'.;;: мот: д. с вихсдсм презышакднк *ылн -хвнилацегилкрс-вяны -гртплы ряда слсжкк;-.

ЗфИрОБ ЭМИНОКНСЛОТ (.,|\-> ••!.-. . - !- •••• , ¡.-¡м- -М .

!- . . Кривые накопления продуктов престэзлекы н?

рис. 1.

Высок»»: выход сшгео? наблюдали тольк: при использовании ' Гг- " • ,• ■/ ^Г^НТОВ. Г"/'!'""'-' ГЛТ^ОКИО СТеН?НИ

::: ^ь.'-иечпя д.-■ в зквн'.г ллрных р'^тв:рах сусс гратов. 3 спу-по синтеза , , ■ ■ это проиллюстрировано на рис.

¿Что '"ме-пп, что с помощью пекшллингцилэзк удается «сди4-.!и:с'св?:ъ • -группы не только низксмолекуляркых вепестн. но ~ льмв - пне1'ттэ у. алгОтмин0.

, ! * ■■: 11,' ■ ■ ','! Г. Г' '' ' * С

а (Ну -ОНе • Рке-ОНе

■ Туг-ОМе ▼ 1еи-ОМе

Рис. 1 Ферментативный синтез малорастворимых в воде фенилацетильных производных эфиров аминокислот в эквимолярном (0.5 м) растворе сложного эфира аминокислоты и фенилуксусной кислоты. Концентрация пенициллинацилазы 2.1*ю"6м.

Концентрата ремвнтоь (Н)

Рис. 2 Зависимость выхода синтеза фенилацетильного производного ь-рье-оме от концентращш реагентов при их эквимолярном соотношении -

б

\

методом химического фенилацетилирования го^-групп являются возможность использования в качестве ацилирупцего агента свободных кислот,энантиоселективность реакции (скорость ферментативного

фенилацетилирования ь-туг-оме, например, в зо раз превышает скорость фенилацетилирования в-туг-оме), мягкие условия синтеза.

2. Ферментативное фенилацетилирование аминогрупп в аминокислотах, их эфирах и пептидах. Фенилацетильные производные ряда соединений, синтезировать которые не удается методом прямого ферментативного синтеза, могут быть получены методом ферментативного переноса ацильной группы из какого-либо активированного производного фенилуксусной кислоты, например, сложного эфира. Кривые накопления целевых продуктов в этих реакциях представлены на рис. з. '

Рис.з. Синтез фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов методом ферментативного переноса фенилацетильной группы.

Условия реакции указаны в подписи к табл. 1

20 ео

Время (мин.)

я БЕу-1-1еи ж 11-РЬе

9 1.-РЬе ♦ Ь-Ггр о 1_-11е

▼

Выход целевых продуктов при таком методе синтеза является кинетически котролируемым, так как образующиеся продукты в дальнейшем гидролизуютея пенициллинацилазой. В связи с этим большой интерес представляло изучение кинетики этого процесса, что позволило определить численные значения кинетических параметров, определящих величину выхода целевого продукта и характеризирувдих специфичность фермента в зтих реакциях.

Простейшей схемой, описывавдей реакции ацильного переноса, катализируемого пенициллинацилазой, является схема i:

E + S^ES - ЕА - Е + Р2 +

N

Mt

ks

EAN — EP -> E + P

■ - пенициллинаиилаза, р., - фенилуксусная кислота, - комлекс о"с донором эцильнои группы э, ер - комплекс фермента с ск!\-£-.:г»занным продуктом р, ел - ацилфермент, елх - тройной к^-сек'- яцилфермента и нуклеофила х

Схема . Кинетическая схема реакции ацильного переноса, катализируемой пенициллинацилазои

Легальный кинетический анализ реакции ферментативного ацильного переноса, проведенный ранее в нашей лаборатории, показал, что при заданных концентрациям донора ацильнои группы и нуклеофила максимальный выход целевого продукта не зависит от величин индивидуальны/ констант скоростей и концентрации возможных сорм фермента, и определяется двумя ключевыми параметрами и р. Параметр ;; характеризует нуклесфильность аминокислот и их производных в реакциях. катализируемых пенициллинацилазои.

Р = к4/к3к^ а параметр « характеризует специфичность фермента к

СИНТеЗИруеМОМУ ПРОДУКТУ а = (кц/К )/<к.,/К5).

Экспериментально определив а и р можно предсказать

максимальный выход продуктов при любых начальных концентрациях

исходных веществ. При > выход можно рассчитать по формуле:

« + 1

2э

ч>

макс.

, где й) = б +п

о о

а

>1<32-4э п' + <3 о о

зо и по - начальные концентрации ацилирующего агента и нуклеофила.

Значения параметров « и р в реакциях ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой, представлены в таблице 1.

Таблица 1 Основные кинетические характеристики реакций переноса ацильной группы, катализируемых пенициллинацилазой..

Нуклеофил Ч> *-макс (ар/си) о <с1Р,ЛН) 2 О а а

X мин М/с, 106 М/с, 106 м"1

Ь-РЬе 88 40 19.2 3.7 1 6 520

Ь-Тгр 86 30 13.9 4.1 1 5 340

Ь-РЪ? 85 50 6.7 1.2 0 560

в1у 93 60 13.8 1.5 1 6 920

Ь-А1а 58 30 СО 4.4 1 6 110

83 150 5 . 1 5 . 4 0 2 100

Ь-11е 76 60 о . 7 9 . 5 0 1 6 0

Ь-Шэ 80 15 6 . У - -

Ь-А^ 51 20 12 20 1 1 6 0

Ь-Азп 43 20 9. 7 2" 1 3 35

Ь -Аэр 28 35 3 . 6 37 0 1 1 0

Х.-С1и 55 20 12 50 0 1

73 15 г 7 20 0 9 135

Gl.y-I.-Leu 62 15 14 12,5 1 4 1К'

Ь-РЬе-ОМе 38 100 3 . 4 10. 7 0 4 30

Ь-Туг-ОЕ 4« 3 0 6. В 12.5 '.1 1

О-РЬе 3 150 0.23 31 0.73

0 - - - -

Условия реакции-, концентрации пенициллинацилазы - 5.1 *ю~' лового эфира фенилуксусной кислоты - 4.2*иГ'-\ч, нуклеофила

, эти--2

10

Из полученных данных видно, что параметры а и р, а также выход целевого продукта существенно зависят от структуры нуклеофила. Параметр р имеет наиболее высокие значения в случае глицина и аминокислот с неразветвленным гидрофобным боковым радикалом, а наиболее низкие величины наблюдаются для аминокислот с зарядом в боковой цепи. Следует отметить, что хорошими нуклеофилами ЯВЛЯЮТСЯ дипептида Gly-Gly И Gly-L-Leu, причем время достижения максимума в этом случае наиболее короткое (рис. з). Значение р увеличивается при переходе от эфира аминокислоты к самой аминокислоте, что указывает на взаимодействие карбоксильной группы с ферментом при связывании нуклеофила. Существенной является энантиоселективность данных реакций: величина р для ь-рье,например, в too раз превышает величину р для d-Phe. Переноса фенилацетильной группы на o-vai вообще не было обнаружено.

Была изучена реакция ферментативного переноса фенилацетильной группы на аминогруппы L-Lys. Обнаружено, что в качестве нуклеофильного агента могут выступать как так и с аминогруппы. На это указывает тот факт, что эффективными нуклеофилами оказались как e-Boc-L-Lys ТЭК И a-Boc-L-Lys.

Таким образом реакции ферментативного переноса ацильной группы, катализируемые пенициллинацилазой, представляют метод, позволяющий расширить круг ш2-группы содержащих веществ, которые могут быть фенилацетилированы ферментативно. Причем таким способом можно проводить синтез с высоким выходом даже таких веществ, которые гидролизувтся пенициллинацилазой более эффективно, чем исходный донор ацильной части, т.е. величина а превышает i. Такой вывод, сделанный ранее при анализе кинетической модели, был потвержден в данной работе экспериментально (см. данные в табл. i

ДЛЯ Gly, L-Phe, L-Tyr).

з. Исследование ферментативного гидролиза N-фенилацетиламино-кислот их эфиров и пептидов. Детальное изучение кинетики

гидролиза к-фенилацетиламинокислот,__их эфиров и пептидов

позволяет понять границы применения данного метода в ферментативном синтезе пептидов.

Схематический гидролиз — N-фенилацетильных производных аминокислот и пептидов представлен на схеме г-.

ю

0 0 о

р« к

Схема 2. Схема гидролиза к-фенилацетильных производных аминокислот и пептидов

Рассмотрим некоторые вывода по изучению специфичности пеницилладацилазы к положению р1 и р2, полученные из анализа литературных данных, а также проведенного нами исследования • гидролиза м-фенилацетилпептидов (см. таблицу г). При проведении корреляции использовали стерические параметры-. - параметр

Киера, ев -стерический параметр Тафта, - эпсилон стерический параметр, ь, ва, в1 йтеигмоь параметры, и - нормализированный Ван-дер-Вальсовский обьем, а также я - параметр гидрофоСности Ганша, « - параметр поляризуемости, а - параметр, характеризующий индуктивный эффект.

Специфичность пенициллинацилазы к фрагменту субстрата в положении р . Скорость гидролиза ь!-фенилацеталлептидов падает при увеличении стерического влияния боковой цепи аминокислотного остатка в положении р . Наилучшую корреляцию наблюдали при использовании стерического параметра к : 1п = -1.12з±о.о88' » + 4.25±о.зз, г2= 0.958 (V - начальная скорость гидролиза л-фенилацетилпептвдов относительно начальной скорости гидролиза бензилпенициллина >. Качественно аналогичная закономерность была обнаружена при снятии .ч-фенилацетильной заШиты в ходе синтеза ьеи-энкефалина. Все же следует отметить, что требуется солее детальное изучение специфичности фермента к положению р , так как полученные результаты не являются однозначными, поскольку наблюдается некоторая зависимость скорости гидролиза \'-фенилацетилпептидов от параметра поляризуемости г2= 0.91.

и

Таблица г. Специфичность пенициллинацилазы в реакциях гидролиза к-фенилацетильных производных аминокислот и пептидов.

к _ cat ч саЧ: М

Субстрат -1 с * 10° м »Ю^М^с"1

РЬАс-С1у-01у 92 2 4.6

РИАс-Иу-Ь-Ьеи 210 1.85 11.4

ГНАс-01у-0-Ьеи 20 1 .6

РЬАс-С1у-Ь-\'а1 165 1.05 15.7

РЬЛс-СХу-О-У'а! 11

РЬАс-О}у-Ь-РЬе 94 1 9.4

РЬАс-01у-0-РЬс 1.56

РЬАс-01у-Ь-А1а 47.5 0.7 6.8

РКАс-в1у-0-Азр 2.25

рьлс-с!у-а1у-с:у 45.6 4.6 1

РЬЛс-С1у-01у-й1у-01у 3 7.5 12.5 0.3

РЬАс-С1у-С1у-С1у-С1у-01у Кб 54 0.16

PhAc-L-Ala-L-.Ua 9 1 0.9

РЬАс-Ь-А1а-Ь-А1а 12 9.2 0.13

РЬАс-С-А1а-Б-А1а 0.8 30 0.002

PhAc-L-Ala-L-.-Ua-l.-Ai а 23 15.2 0. ¡5

РпАс-01у 150 0 . 78 19.2

РЬАс-Ь-РЬе 37 0.15 24.7

Ph.Ac-X.-Asp 124 7. 0 1'. 65

РЬАс-С1у-ОМе 320 10 3.2

РПАс-Ь-А1а-ОМе , 260 9.2 2.83

РЬАс~Ь-А1а~ОМе 0.01

Бензилпенициллин 42 0.4 10.5

Условия реакции : 0.1м кн2ро , рн 7.5, 25 с

Результаты, касающиеся ферментативного гидролиза к-фенилацетиламинокислот, представлены в таблице 2. Из полученных нами данных можно предположить взаимодействие карбоксильной группы с ферментом, так как к /к гидролиза падает при переходе от фенилацетильных производных аминокислот к их эфирам.

Надо отметить, что пенициллинацилаза характеризуется высокой энантиоселективностью действия к фрагменту субстрата в положении

р . Это наблюдается как, при гидролизе .v-фенилацетиламинокислот, так и при гидролизе N-фенилацетилпептидов (например kcat/KM падает 65 раз при переходе ОТ PhAc-L-Ala-D-Ala К. PhAc-D-Ala-D-Aia) , однако при модификации карбоксильной группы аминокислотного остатка в положении р^ энантиоселективность умекьшаеться.

Специфичность пенициллинацилазы к фрагменту субстрата в положении р„. Эффективность катализа увеличивается с увеличением стерического влияния боковой цепи аминокислотного остатка L-изомеров субстрата в положении р^. Наблюдается зависимость с коэффициентом корреляции г2, превышающим о.9, только от стерических параметров, причем наилучшую корреляцию наблюдали при использовании параметра :

In (к ./К„)=15.3±0.1 + 0.31*0.05, г2= 0.930 1 РИС. 4). cat М

Пенициллинацилаза проявляет некоторую энантиоселективность к аминокислотному остатку в положении р2.Эффективность катализа в случае субстратов с о-аминокислотами в положении р2 ниже, чем с соответствующими ь-аминокислотами, причем kcat/KM уменьшается при увеличении стерического влияния боковой цепи аминокислот-.

In (к ./К„) = 15.340.1 - 0.38*0.03 =., г2= 0.982 (РйС 4).

cat м

Рис. 4 Специфичность пенициллинацилазы к фрагменту субстрата в положении р в реакциях гидролиза ¡^-фенилацетилпептидов

Специфичность пенициллинацилазы к длине пептидной цепи субстрата. Как видно из рис. 6, при удлинении пептидной цепи эффективность катализа падает. Причем наиболее существенно изменяется значение константы Михаелиса: при переходе от рьас-01у к рьас-<с1у)5 величина км возрастает почти 70 раз. Величина каталитической константы гидролиза претерпевает существенно меньшее изменение, а при переходе от тетра- к пентапептиду кса1 даже возрастает.

14

<г

п

• РЬМйзХ, л РМоМЦ,

е

Рис. 5 Зависимость эффективности гидролиза к-фнилацетилпептвдов от длины пептидной цепи

В заключение необходимо отметить также, что, несмотря на существенные различия в эффективности ферментативного гидролиза к-фенилацетилпептидов, все изученные субстраты имеют достаточно хорошие кинетические характеристики для практического использования пенициллинацилазы при снятии к-фенилацетильной защиты нн2-групп. Следует подчеркнуть, что во всех случаях реакции гидролиза можно провести до высоких степеней превращения.

4. Ферментативный синтез ьеи-энкефалина с использованием пенициллинацилазы на стадиях введения и снятия фенилацетильной защиты. Как обсуждалось выше-, пенициллинацилаза е. со 11 катализирует реакцию фенилацетилирования аминогрупп в аминокислотах, их сложных эфирах и пептидах. Также отмечалось, что фенилацетильную защиту можно избирательно удалить в мягких условиях при помощи того же фермента. Таким образом логично было показать пригодность использования фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов в качестве ацильных доноров б ферментативном синтезе пептидов. Это позволило бы проводить синтез пептидов с использованием ферментов на стадиях введения защитной группы, формирования пептиднои цепи и последующего снятия защитной группы в целевом пептиде. Подобная стратегия была реализована для синтеза модельного.пептида 1.он-энкесьалина ¡рис.б), а также ь-мег.-'

Туг

С1у

С1 у

РЬе

РА

\

РЬАс ОТ

\

РЬАс

РЬАс ■

РЬЛс • РА

л

■ ОМе

■ ОМе

•ОН Н ■

ст

н —

РА

\

РьЛс

■ОМе РЬАс ■ РА

■ ОМе Н

Р

Туг

РА

РЬАс •

-ОМе РЬАс■ РА

- ОМе

■ ОМе Р

• ОЧс Р

-ОВи

г - *

• гши

■ ОЬи

■ ОВи '

• ОЬи

■ ОВи

■ ОВи

Э1у

С1у

РЬе

Ьеи

Рис. а Принципиальная схема ферментативного синтеза ьеи-энкефалина р\ - пенициллинацилаза, ст - «-химотрипсин, р - папаин

Следуя логике нашей работы все стадии можно разделить на три основные группы: г) ферментативное введение фенилацетильной защиты '' аминогрупп в эфирах аминокислот, 2) ферментативное образование пептидной связи, з) деблокирование фенилацетильной защиты аминогрупп, катализируемое пеницилинацилазой. Рассмотрим полученные результаты при исследовании реакции каждой из этих групп.

Синтез фенилацетильных производных сложных эфиров аминокислот мы проводили конденсацией фенилуксусной кислоты и эфиров аминокислот, катализируемой пеницилинацилазой. Необходимо отметить, что при синтезе ьеи-энкефалина во всех случаях значения выхода фенилацетильных производных сложных эфиров аминокислот превышали 80% при эквимолярном соотношении исходных реагентов. Степень превращения при ферментативной конденсации фенилуксусной КИСЛОТЫ И Ь-РЬе-ОМе, а ТЭКЯСе Ь-Туг-ОМе была близка к количественной. Необходимо подчеркнуть, что как в этих, так и во всех остальных обсуждаемых реакциях, наблюдаемые значения выхода не являются олтимальными, так как специального внимания к оптимизации этих процессов в данной работе не уделялось.

Основной целью изучения ферментативного образования пептидной связи было показать пригодность фенилацетильных производных сложных эфиров аминокислот и пептидов в качестве ацильных доноров для синтеза пептидов, катализируемого протеазами. Синтез с папаином осуществлялся методом ацильного переноса, а синтез с использованием химотрипсина проводился методом прямой конденсации рьас-ь-туг-он и с1у-оме с образованием малорастворимого в воде продукта. Полученные результаты представлены в таблице з. Так как и в этих процессах наблюдалось образование осадка, хорошая степень конверсии достигалась при высоких концентрациях исходных реагентов.

На рисунке 7 представлены кинетические кривые ферментативного снятия фенилацетильной защиты аминогрупп в ходе ферментативного синтеза ьеи-энкефалина. Основной вывод этих исследований заключается в том, что степень конверсии на всех этапах снятия фенилацетильной. защиты аминогрупп превышает 90%. Наиболее Эффективно протекал гидролиз РЬАс-01у-Ь-РЬе-Ь-Ьеи-0-Ви^ ЭТО согласуется с • выводами по исследованию специфичности

пенициллинацилазы, где отмечалось, что в первом положении от расщепляемой связи в пептидной цепи наиболее подходящими являются аминокислоты с неразветленным боковым радикалом. При увеличении

оСьема боковой цепи аминокислотного остатка эффективность катализа падает.

Таблица з. Ферментативное образование пептидной связи, катализируемое протеазами

Реагенты Фермент Выход

(М> 1%)

РИА г -РЬе-ОМо + Н-Ьеи-ОВ^ папаин 85

0.5 0.5

РЬДс -СЛу-ОЧр + Н-РЬе-Ьеи-ОВи1 папаин 92

0 . 1 0 . 3

РЬАс -Туг-ОМ<? + Н-С1уОМе а-ХИМОТрИПСИН 68

0. 1 0.3

РИАс -Туг-01у-0Ме + Н-йХу-РЬе-Ьеи-ОВи1 папаин 45

0.05 0.05

Рис. т Ферментативное снятие фенилацетильной защиты ш2-групп в

пептидах в ходе синтеза ьеч-энкефалина

I 7

1аким образом, в настоящей работе получены экспериментальные данные, указывающие на расширение возможностей применения ферментов в пептидном синтезе. Применение пенициллинацилазы как катализатора при введении и снятии защиты аминогрупп в ходе пептидного синтеза, наряду с использованием протеаз на стадиях образования пептидных связей, позволяет весьма эффективно проводить синтез в водных растворах. Необходимо отметить, что оптимизация отдельных стадий может позволить достичь существенно больших значений выхода чем те, которые получены, в данной работе.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЫАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые показана возможность высокоэффективного ферментативного синтеза фенилацетильных производных сложных .эфиров аминокислот.При использовании эквимолярных исходных растворов реагентов выход целевых продуктов превышал эо%.

2. Изучена кинетика реакции синтеза фенилацетильных производных аминокислот, их сложных эфиров и пептидов (всего 20 соединений) методом ферментативного переноса ацильной группы, катализируемого ■ пенициллинацилазои, определены величины ключевых параметров, определяющих выход целевых продуктов в такой системе. Показано, что эффективная нуклеофильность соединений в катализе пенициллинацилазой весьма сильно зависит от структуры аминокислот и их производных и является наибольшей у ь-рье, ь-рьй, С1у, равной 520,560 и 920 м-1, соответственно.

3. Пенициллинацилаза обладает энантиоселективностью при ферментативном синтезе х-ацильных производных аминокислот и их сложных эфиров во всех изученных системах.

4. При помощи пенициллинацилазы можно ацилировать \н -группы не только низкомолекулярных веществ, но также полипептидов и белков.

5. Основным фактором, определяющим специфичность фермента в ' реакциях гидролиза х-фенилацетилпептидов, является стерический. Эффективность катализа уменьшаеться при увеличении обьема боковой цепи аминокислотного остатка в первом положении пептидной цепи от расщепляемой связи. Бо втором положении пептидной цепи с увеличением стерических параметров аминокислотного остатка эффективность катализа увеличивается для ^аминокислот и

в

уменьшается для о-аминокислот.

6. Пенициллинацилаза проявляет энантиоседектквность к аминокислотным остаткам как в первом, так и во втором положении. Эффективность ферментативного гидролиза падает при увеличении длины пептидной цепи, однако большинство ' из этих процессов протекает с эффективностью, пригодной для использования пенициллинацилазы в препаративном снятии фенилацетильной защиты ,чн2-групп.

7. Предложена стратегия ферментативного синтеза пептидов, включающая разработанные метода введения фенилацетильной защиты кн2-групп в аминокислотах и их производных, образования пептидной связи и последующего снятия фенилацетильной защиты кн.,-груш;. С использованием этого подхода проведен синтез трет-бутилового эфира ьеи-энкефалина полностью ферментативными путем.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Козлова Е.В., Дидасяпетрис Р.И., Гололобов М.Ю., Исаева С.А., Швядас В.К., Ферментативная защита аминогрупп в сложных эфирах аминокислот, Мат. 5 Всес. симп. "Методы синтеза и анализа бисхим. реагентов", Рига, 1987, с. зоз.

2. Дидасяпетрис Р.И., Исаева С.А., Козлова Е.В., Гололобоз М.Ю., Швядас В. К., Введение защиты аминогрупп аминокислот и их производных при помощи пенициллинацилазы, Мат. 4. Всес. симп. "Аминокислоты в сельском хоз., медицине и в науке", Ереван, 198«,

с. 90-91.

3. Швядас В.К., Дидасяпетрис Р.И., Драбниг Б., Гололобав М.Ю., Митин Ю.В., Синтез пептидов с использованием ферментов на стадиях введения и снятия защитной группы, а также образования пептидной связи, Мат. 5 Всес. симп. по пептидному синтезу, Рига, 1990, с.

123.

4. R. Didziapetгis, В. Drabnig, V. Schellenberger, H.-D. Jakubke, V. Svedas, Synthesis of Leu-enkephalin using enzymes for reversible amino group protection and peptide bond formation, Proc. 12 Amer. Peptide Symp., Cambridge, 1991.

s, Диджяпетрис Р.И., Шредер И., Пятраускас А.А., Шзядас В.К., Исследование специфичности пенициллинацилазы в реакциях гидролиза N-фенилацетилпептидов, Мат. т Всес. симп. "Инженерная энзимология", Москва, 1991, с. 70-71.

6. R. Didziapetпs, В. Drabnig, V. Schellenberger, H.-D. Jakiibr.e, V. bvedas, Penicillin acvlase catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in ensymat i с peptide synthesis, FEBS Letters, 1991, v. 287 , No. 1/2, p. .»!-'«;!.

7. R. T; i dz iapet ri s , V, ^'vedas , Penicillin асу I aso-cava : уг^п nry i group transfer reactions to amino acids, t гк- i г esvnrs peptides-. a Kinet Vc study, Bioinedica Biochj^i a \c r. , :!,V tiG ,

No II. p. иг-M