Флуоресцентная корреляционная спектроскопия в исследовании динамики химических систем тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ :. . . . . . . . ..

1. МЕТОД ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ:.:.:.:.:.:.:.

1.:1. Концентрационный корреляционный анализ::.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

1.1.1. Корреляции флуктуа-ций числа молекул

1.1.:2. Измерение флуктуаций числа молекул :.:.:.:.:. .:.:.:.:.

1.2. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия и химическая кинетика :.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

1.2.1. Форма сигнала и ее связь с кинетическими параметрами . . . . . . . . . . . . .:.

1.2.2. Отношение сигнала к шуму в флуоресцентной корреляционной спектроскопии

1.:3. Экспериментальные установки флуоресцентной корреляционной спектроскопии :.:.:.:.:.:.

2. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ СПЕКТРОМЕТР С БОЛЬШИМ

ОТНОШЕНИЕМ СИГНАЛА К ШУМУ:

2.1. Регистрация флуоресцентной эмиссии :.:.:.:.:.:,.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

2.2. Применение привязки в флуоресцентной корреляционной спектроскопии . .:.

2.2.1. Операция привязки

2.:2.:2. Влияние привязки и конечности интервала выборки на оценку автокорреляционной функции флуоресценции :.:.:.:.:.

2. 2 .:3. Влияние привязки на отношение сигнал-шум эксперимента по корреляции флуоресценции

2. 3. Коррелятор с одноканальной привязкой входного сигнала :.

2.4. Оптическая часть спектрометра :.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

2.4.1. Возбуждение флуоресцентного излучения .:.

2.4.2. Сбор флуоресцентной эмиссии:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

3. РОЛЬ ФОТОФИЗИЧЕСКИХ И ФОТОХИМИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ В

ЭКСПЕРИМЕНТЕ ПО КОРРЕЛЯЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

3.1. Необратимое выцветание красителей:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

3.2. Обратимое выцветание красителей,:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.'.:.:.:.:.:.:.

3. 3. Изучение поступательной диффузии молекул красителей

3.:4. Изучение поступательной диффузии макромолекул, меченных красителем :.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ КРАСИТЕЛЕЙ С

МАКРОМОЛЕКУЛАМИ . . . :.:.

4.1. Форма сигнала

4.2. Нековалентное связывание красителей с полинуклеиновыми кислотами :.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.

Решение множества проблем биофизики связано с исследованием кинетических процессов, протекающих в системах макромолекул как в растворах, так и в клетках и мембранах. За последние двадцать лет широкое распространение получили импульсные и релаксационные методы исследования, позволяющие изучать быстрые химические реакции в растворах [1]. В течение последнего десятилетия для исследования динамических свойств макромолекул развертывалось применение корреляционных оптических методов', таких как спектроскопия корреляции фотонов и спектроскопия оптического смешения [2]. В начале 1970-х годов появились новые методы, позволяющие исследовать кинетические свойства молекул в разбавленных растворах - методы концентрационной корреляционной спектроскопии [3 ]. С их помощью измеряют величину и временное поведение флуктуаций числа наблюдаемых молекул в малом объеме образца. Согласно флуктуационно-дисси-пационной теореме [4], релаксация этих флуктуаций подчиняется тем же законам, что и релаксация системы после макроскопического возмущения [5-7:]. Кинетические параметры разных динамических процессов (диффузия, химические реакции, конформационные изменения и :т.д.) связаны с амплитудой и скоростью флуктуаций.

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС) является одной из разновидностей концентрационной корреляционной спектроскопии, в которой для наблюдения флуктуаций числа молекул используют флуоресцентную эмиссию. Хотя появление ФКС, связанное с работами Эльсона, Мэджа и Уебба [8], относится к началу 70-х годов, в последующее за первыми экспериментами десятилетие этот метод не нашел такого широкого применения, как предшествующие ему оптические методы измерения флуктуаций интенсивности света. Это объясняется главным образом экспериментальными трудностями флуоресцентной корреляционной спектроскопии. ФКС довольно широко и эффективно используется для изучения поступательной диффузии в биохимических системах - в растворах [9,10], мембранах [11] и клетках [12]. Большой интерес представляют возможности ФКС в изучении химических реакций [10] и вращательной диффузии [13,14], однако эти области исследования еще находятся в начальной, методологической стадии. Более того, до сих пор во всех экспериментах, опубликованных другими авторами, корреляционные функции даже в миллисекундной области времен заметно искажены шумом. Более интересный с точки зрения физики, но в смысле шумов и более трудный для экспериментатора диапазон меньших характерных времен ранее не был исследован. Относительно мало внимания обращено и на выбор красителей, применимых в ФКС с высоким отношением сигнала к шуму. Фотофизические и фотохимические процессы в молекуле красителя -зонда ограничивают возможности повышения интенсивности возбуждения и являются важными лимитирующими факторами, резко ограничивающими применимость ФКС. Большинство красителей, используемых до сих пор в ФКС, не позволяют достигать высокого отношения сигнала к шуму и тем самым ограничивают возможности расширения временного диапазона эксперимента.

Настоящая работа поставлена с целью изучения возможностей применения флуоресцентной корреляционной спектроскопии для исследования динамики химических систем. Основными задачами являлись следующие:

- Разработка флуоресцентного корреляционного спектрометра для экспериментов с большим отношением сигнала к шуму.

- Расширение диапазона измеряемых времен корреляции в микросекундную область.

- Изучение фотовыцветания красителей и выбор конкретных красителей, удовлетворяющих требованиям фотостабильности и одновременно способностью связывания с полинуклеотидами.

Актуальность работы прежде всего определяется возможностью применения метода ФКС для исследования очень малого числа молекул - малых концентраций веществ, заключенных в малых объемах -и особенно процессов, протекающих in vivo в клетках. При этом, имеющаяся в ФКС возможность одновременного наблюдения динамики химической реакции и поступательной диффузии молекул, принимающих участие в реакции, открывает путь к исследованию образования таких комплексов, для которых при этом изменяется только коэффициент диффузии красителя, а не его спектр поглощения.

Отношение сигнала к шуму можно повысить, оптимизируя разные составные части экспериментальной установки. Так как отношение сигнал-шум в ФКС пропорционально интегральной эффективности детектирования фотонов [15], то оптическая система собирания флуоресцентной эмиссии должна быть как можно более эффективной. Другими словами, апертура собирающей оптической системы должна быть по возможности большой. В первых экспериментах по корреляции флуоресценции, а также и в некоторых последующих исследованиях использовали зеркальную оптику, собирающую эмиссию от пространственного угла, равного почти 4тт стерадиана. Однако, при такой оптической системе фоновая флуоресценция накладывает строгие требования на качество материала окон ячейки и его полировки [16.}. Поэтому целесообразно пользоваться оптикой микроскопа, позволяющей осуществлять эффективное диафрагмирование в фокальной плоскости объектива.

Расширение диапазона измеряемых времен корреляции в микросекундную область заставляет применять метод счета фотонов и требует разработки коррелятора - специального вычислительного устройства для измерения автокорреляционных функций последовательности импульсов [17:]. При этом использование операции привязки позволяет значительно упростить коррелятор и исследовать более быстрые процессы. В настоящей работе показано, что одноканальная привязка не искажает автокорреляционную функцию и уменьшает отношение сиг

1 /2 нала к шуму.только в (тг/2) ' раз [18:]. Поэтому обосновано применение коррелятора с одноканальной привязкой, специально разработанного для эксперимента по корреляции флуоресценции.

При ширинах каналов коррелятора (интервалов выборки), меньших 25 микросекунд, обосновывается применение двух ФЭУ с последовательным вычислением кросс-корреляционной функции между двумя последовательностями импульсов, исходящих из обоих ФЭУ [19]. Это позволяет избавиться от искажений, вызванных собственными шумами ФЭУ, в частности, явлением послеимпульсов.

В работе изучены характеристики, однофотонного фотовыцветания множества красителей разных структур и выделены красители, удовлетворяющие требованию фотостабильности [19]. Показано, что для достижения отношения сигнала к шуму больше ста при интервале выборки

10 мкс и длительности измерения 1000 с, практически применимы

-5 красители с квантовым выходом фотовыцветания <10 [20]. При больших интенсивностях возбуждения в растворах разных красителей обнаружен и описан эффект появления быстрых зависящих от интенсивности возбуждающего света членов в автокорреляционной функции флуоресценции [20]. Поэтому следует применять такие интенсивности возбуждения, при которых этот эффект не искажает форму корреляционной функции.

Эксперименты по изучению диффузии красителей и тРНК, меченной изотиацианитом тетраметилродамина, а также по исследованию химического связывания красителей с полинуклеотидами, продемонстрировали возможности как разработанной установки, так и метода ФКС в целом. Впервые измерены автокорреляционные функции флуоресценции в широком диапазоне времен корреляции - от 1 мкс до 0,1 с -как в растворах красителей [17] и меченных тРНК [21], так и в химических системах краситель-полинуклеотид: пиронин Ж-ДНК, пиро-нин Ж-тРНК, крезиловый фиолетовый-ДНК, нильский голубой-ДНК, пиронин Ж-полиадениловая кислота [19,20,22].

Основными защищаемыми положениями диссертации являются следующие:

- При достижении высокого отношения сигнала к шуму флуоресцентная корреляционная спектроскопия является перспективным методом изучения кинетики химических реакций в многокомпонентных растворах красителей и макромолекул, а также фотофизических процессов обратимого выцветания молекул.

- Для достижения высокого отношения сигнала к шуму эксперимента по корреляции флуоресценции необходимо применять красители

-5 с низким квантовым выходом выцветания (меньшим 10 при обычных условиях эксперимента). Применимы оксазины, родамины и пиронины.

- Применение метода привязки в флуоресцентной корреляционной спектроскопии является обоснованным., Это позволяет разработать флуоресцентный корреляционный спектрометр, с помощью которого можно измерять автокорреляционные функции флуоресценции в широком диапазоне времен корреляции от 0,5 мкс до 10 с с отношением сигнала к шуму больше ст,а.

Диссертация состоит из введения, четырех основных разделов и заключения.

Основные результаты работы сводятся к следующему:

1. Обсуждено влияние привязки и конечности интервала выборки на оценку автокорреляционной функции флуоресценции. Показано, что метод привязки в одном входном канале вызывает только линейные искажения автокорреляционной функции и уменьшает отношение сигнала 1/2 к шуму в (тт/2) ' рй 1,25 раз, но зато сильно упрощает конструкцию и увеличивает надежность аппаратуры.

2. Разработан и построен коррелятор с одноканальной привязкой и с 32-канальным накоплением для измерения корреляционных функций последовательности импульсов в режиме реального времени, позволяющий считать импульсы с максимальной скоростью счета, равной 50 МГц, и с шириной канала от 100 не до 0,84 с.

3. При малых ширинах каналов (Дт < 24 мкс) для предотвращения искажающих влияний шумов ФЭУ, эффективным является применение двух ФЭУ и вычисление кросс-корреляционной функции между двумя последовательностями фотоимпульсов.

4. Изучалось множество красителей в отношении их необратимого выцветания. Для достижения отношения сигнал-шум больше ста при интервале выборки Дт = 10 мкс и длительности эксперимента 1000 с при обычных условиях ФКС необходимо, чтобы квантовый выход выцветания

-5 красителя удовлетворял требованию ф < 10 : . Этому требованию отБ вечают оксазины, родамины и пиронины.

5. В водных растворах разных красителей обнаружен эффект появления быстрых членов в автокорреляционных функциях флуоресценции с характерными временами около 1 мкс и 10 мкс. Амплитуды этих членов прямо пропорциональны интенсивности возбуждения, в то время как характерные времена от интенсивности не зависят. Эти члены обусловлены внутренней интерконверсией в метастабильное-триплетное состояние и пребыванием молекулы в этом состоянии в течение нескольких микросекунд.

6. Разработан и построен флуоресцентный корреляционный спектрометр, позволяющий измерять автокорреляционные функции флуоресценции как чисто диффузионных, так и диффузионно-химических систем с большим отношением сигнал-шум в широком диапазоне характерных времен (от 0,5 мкс до 10 с:).

7. Измерены автокорреляционные функции флуоресценции для поступательной диффузии красителей и тРНК, меченной изотиоционатом тетраметилродамина, а также для химического связывания красителей с полинуклеотидами с отношением сигнал-шум около 500 (при суммарном времени измерения 100 с и ширине канала 0,5 мс) ив широком диапазоне характерных времен (от 1 мкс до 0,1 с) .

Примечание Изложенные в диссертации результаты отражают личный вклад автора в работы, выполненные в соавторства.

Работа выполнена в секторе физики Института биологической и химической физики АН ЭССР, творческая и доброжелательная атмосфера которого во многом способствовала постановке и решению изложенных в диссертации проблем.

Академику АН ЭССР :Э.:Т.Липпмаа принадлежит постановка проблемы исследования и осуществлено руководство работой.

Кандидат физ.-мат. наук П.А.Каск участвовал в разработке коррелятора [16], спектрометра [18] и в ряде измерений [17,19,20], а также давал методологические советы и участвовал в обсуждении результатов.

При конструировании коррелятора [16] полезные советы давали :А. Сирк , :Ю. Пуск ар и :П. Пикс арв .

Требуемая при измерениях некоторых систем краситель-поли-нуклеотид препаративная работа, а также введение метки в тРНК были выполнены М.Поога [20,21].

В оформлении диссертации мне помогали :А.0ливсон и :К.Энгелъ-брехт, кому я весьма благодарен.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

После создания метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) в 1972 году, большой интерес вызвало применение ФКС для исследования химических реакций. Несмотря на это, таких экспериментов до сих пор мало. Последнее объясняется недостаточным вниманием к анализу возможностей и выявлению конкретных путей повышения отношения сигнала к шуму эксперимента по корреляции флуоресценции, а также к проблемам, связанным с процессами фотофизического и фотохимического выцветания красителей.

В настоящей работе создан ФК спектрометр и установлены критерии выбора красителей, впервые позволившие измерять автокорреляционные функции флуоресценции в широких пределах времен корреляции и с высоким отношением сигнала к шуму.

Практическая ценность результатов настоящей работы заключается, в первую очередь, в увеличении отношения сигнала к шуму, что позволяет не только повышать точность результатов по динамике исследуемых процессов, но и сокращать реальное время проведения эксперимента .

Внедрение операции привязки в ФКС позволяет применять более простую и надежную аппаратуру для измерения корреляционных функций и уменьшать при этом как мертвое время эксперимента, так и минимальный интервал выборки, :т.:е. увеличить диапазон измеряемых характерных времен. Это, в свою очередь, позволяет исследовать более быстрые динамические процессы, что особенно важно при изучении химической динамики биохимических систем.

Измерение кросс-корреляции между двумя ФЭУ позволяет избавиться от искажений сигнала, обусловленных статистическими шумами ФЭУ, в основном, послеимпульсами при меньших интервалах выборки (ширинах каналов) (Дт < 25 мкс)., и избегать тем самым трудоемкой и дорогой процедуры выбора индивидуального ФЭУ из множества ФЭУ конкретного типа по признаку минимального числа послеимпульсов.

1. Хеммис Г., ред. Методы исследования быстрых реакций. - М.:,

2. Мир, 197:7. 716 с. :2. Камминс :Г., Пайк Э., ред. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. - :М.: Мир, 197:8 . - 584 :с.

3. Magde D. Concentration correlation analysis and chemical kinetics. In: Pecht I., Rigler R., ed. Chemical Relaxation in Molecular Biology. - Berlin etc.: Springer, 1977, pp. 43-83.

4. Callen H.B., Welton T.A. Irreversibility and generalized noise. Phys. Rev., 1951, v. 83, No. 1, pp. 34-40.

5. Greene R.F., Callen H.B. On the formalism of thermodynamic fluctuation theory. Phys. Rev., 1951, v. 83, No. 6, pp. 12311 235.

6. Callen H.B., Greene R.F. On a theorem of irreversible thermodynamics. Phys. Rev., 1952, v. 86, No. 5, pp. 702-714.

7. Greene R.F., Callen H.B. On a theorem of irreversible thermodynamics. Phys. Rev., 1952, v. 88, No. 6, pp. 1387-1391.

8. Magde D., Elson E., Webb W.W. Thermodynamic fluctuations in a reacting system measurement by fluorescence correlation spectroscopy. - Phys. Rev. Lett., 1972, v. 29, No. 11,pp. 705-708.

9. Elson E.L., Magde D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers, 1974, v. 13,

10. No. 1, pp. 1-27. 10. Magde D., Elson E.L., Webb W.W. Fluorescence correlationspectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers, 1974, v. 13, No. 1, pp. 29-61.

11. Fahey P.F., Koppel D.E., Barak L.S., Wolf D.E., Elson E.L., Webb W.W. Lateral diffusion in planar liquid bilayers. -Science, 1977, v. 195, No. 4275, pp. 305-306.

12. Sorscher S.M., Bartholomew J.C., Klein M.P. The use of fluorescence correlation spectroscopy to probe chromatin in the cell nucleus. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v.610, No. 1, pp. 28-46.

13. Ehrenberg M., Rigler R. Rotational Brownian motion and fluorescence intensity fluctuations. Chem. Phys., 1974, v. 4, No. 3, pp. 390-401.

14. Агадбп S.R., Pecora R. Fluorescence correlation spectroscopy and Brownian rotational diffusion. Biopolymers, 1975,v. 14, No. 1, pp. 119-138.

15. Koppel D.E. Statistical accuracy in fluorescence correlation spectroscopy. Phys. Rev., 1974, v. A.10, No. 6, pp. 1928-1944.

16. Каск П., Кяндлер Т. Привязка в флуоресцентной корреляционной спектроскопии.: Изв. АН Эст.ССР. Физ. мат., 1978,т. 27, № 1, с. 73-7:8.

17. Кяндлер Т., Каск П., Пиксарв П., Сирк А., Липпмаа Э. Исследование химической кинетики с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии.: Изв. АН Эст.ССР. Физ. мат., 1982, т. 31, № 3, с. 314-31:9.

18. Kask P., Kandler Т., Piksarv P., Pooga M.f Lippmaa E. Fluorescence correlation spectroscopy in solutions. In: Schultz-DuBois E.D., ed., Photon correlation techniques in fluid mechanics. - Berlin, Heidelberg, NY: Springer, 1983, pp. 393-398.

19. Kandler Т., Pooga M., Kask P., Piksarv P., Lippmaa E. Fluorescence correlation spectroscopy applied to dynamics of polynucleic acids. 16th European Congress on Molecular Spectroscopy, Abstracts, 1983, Sofia, Th P43.

20. Kask P., Kandler Т., Piksarv P., Pooga M., Lippmaa E. Fluorescence correlation spectroscopy in solutions.5th International Conference on Photon Correlation Techniques in Fluid Mechanics, Kiel, 1982, p. 38.

21. Зубарев Д.Н. Неравновесная статистическая термодинамика. -М.: Наука, 197:1. 415 :с.2:4. Magde D. , Webb W.W. , Elson E.L. Fluorescence correlation spectroscopy. III. Uniform translation and laminar flow. -Biopolymers, 1978, v. 17, No. 2, pp. 361-376.

22. Czerlinski G.H. Chemical Relaxation. NY: Marcel Dekker, 1966. - 314 p.

23. Schwarz G. Kinetic analysis by chemical relaxation methods. -Rev. Mod. Phys., 1968, v. 40, No. 1, pp. 206-218.

24. Bloomfield V.A., Benbasat J.A. Inelastic light-scattering study of macromolecular reaction kinetics. I. The reactions A^B and 2A^tA2. Macromolecules, 1971, v. 4, No. 5, pp. 60961 3.

25. Keizer J. Master equations, Langevin equations and the effect of diffusion on concentration fluctuations. J. Chem. Phys., 1977, v. 67, No. 4, pp. 1473-1476.

26. Keizer J. Dissipation and fluctuations in nonequilibrium thermodynamics. J. Chem. Phys., 1976, v. 64, No. 4, pp. 1 679-1 687.

27. Elson E.L., Webb W.W. Concentration correlation spectroscopy: a new biophysical probe based on occupation number fluctuations. Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1975, v. 4, pp. 311-334.

28. Magde D. Chemical kinetics and fluorescence correlation spectroscopy. Quart. Rev. Biophys., 1976, v. 9, No. 1, pp. 35-47.

29. Webb W.W. Applications of fluorescence correlation spectroscopy. Quart. Rev. Biophys., 1 976, v. 9, No.' 1, pp. 49-68.

30. Yeh Y., Keeler R.N. Experimental study of reaction kinetics by light scattering. I. The polarized Rayleigh component. -J. Chem. Phys., 1969, v. 51, No. 3, pp. 1120-1127.

31. Yeh Y. Experimental study of reaction kinetics by light scattering. II. Helix-coil transition of the copolymer deoxyadenylate-deoxythymidylate (dAT). J. Chem. Phys., 1970, v. 52, No. 12, pp. 6218-6224.

32. Berne B.J., Pecora R. Laser light scattering from liquids. -Ann. Rev. Phys. Chem., 1974, v. 25, pp. 233-253.

33. Schaefer D.W., Berne B.J. Light scattering from non-Gaussian concentration fluctuations. Phys. Rev. Lett., 1972, v. 28, No. 8, pp. 475-478.

34. Carlson F.D. The application of intensity fluctuation spectroscopy to molecular biology. Ann. Rёv. Biophys. Bioeng., 1975, v. 4, pp. 243-264.

35. De Maeyer L., Gnadig K., Hendrix J., Saleh. B. Photon correlation spectroscopy of molecular processes in solution. Quart. Rev. Biophys., 1976, v. 9, No. 1, pp. 83-107.

36. Hendrix J., Saleh В., Gnadig K., De Maeyer L. Measurement of the intramolecular fluctuations of random coil polymers by photon correlation spectroscopy. Polymer, 1977, v. 18, No. 1, pp. 10-14.

37. Feher G. Determination of kinetic parameters from the frequency spectrum of fluctuations. Biophys. Soc. J., 1970, v. 10, Abstr. 118.

38. Feher G., Weissman M. Fluctuation spectroscopy: determination of chemical reaction kinetics from the frequency spectrum of fluctuations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 973, v. 70, No. 3, pp. 870-875.

39. Schurr J.M. Relaxation of rotational and internal modes of macromolecule s determined by dynamic scattering'. — Quart. Rev. Biophys., 1976, v. 9, No. 1, pp. 109-134.

40. Ehrenberg M., Rigler R. Fluorescence correlation spectroscopy applied to rotational diffusion of macromolecules. Quart. Rev. Biophys., 1976, v. 9, No. 1, p. 69-81.

41. Агадбп S.R., Pecora R. Fluorescence correlation spectroscopy as a probe of molecular dynamics. J. Chem. Phys., 1976,v. 64, No. 4, pp. 1791-1803.

42. Rigler R., Graselli P. Time resolved fluorescence spectroscopy and diffusion of biological то1еси1ёз. NATO Adv. Study Inst. Ser., Ser. A, 1980, v. A34, pp. 151-164.

43. Yardley J.T., Specht L.T. Orientational relaxation by fluorescence correlation. Chem. Phys. Lett., 1976, v. 37, No. 3, pp. 543-546.

44. Chen F.C., Chu B. Dynamics of mouse-liver DNA by single-clipped photon correlation. J. Chem. Phys., 1977, v. 66, No. 5,pp. 2235-2237.

45. Chen Y., Hill T.L. Fluctuations and noise in kinetic systems. Application to K+ channels in squid axon. Biophys. J., 1973, v. 13, No. 12, pp. 1276-1295.

46. Conti F., FioravantL R., Malerba F., Wanke E. A comparative analysis of extrinsic fluorescence in nerve membranes and lipid bilayers. Biophys. Struct. Mechanism, 1974, v. 1, No. 1,pp. 27-45.

47. Koppel D.E., Axelrod D., Schlessinger J., Elson E.L., Webb W.W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility. Biophys. J., 1976, v. 16, No. 12, pp. 1315-1329.

48. Schlessinger J., Koppel D.E., Axelrod D., Jacobson K., Webb W.W., Elson E.L. Lateral transport on cell membranes: mobility of concavalin A receptors on myoblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, No. 7, pp. 2409-2413.

49. Schlessinger J., Axelrod D., Koppel D.E., Webb W.W., Elson E.L. Lateral transport of a lipid probe and labeled proteins on a cell membrane. Science, 1977, v. 195, No. 4275, pp. 307-309.

50. Rigler R., Ehrenberg M. Fluorescence relaxation spectroscopy in the analysis of macromolecular structure and motion. -Quart. Rev. Biophys., 1976, v. 9, No. 1, pp. 1-19.

51. Rigler R., Graselli P., Ehrenberg M. Fluorescence correlation spectroscopy and application to the study of Brownian motion of biopolymers. Physica Scripta, 1979, v. 19, No. 4,pp. 486-490.

52. Borejdo J., Putnam S., Morales M. Fluctuations in polarized fluorescence: Evidence that muscle cross bridges rotate repetitively during contraction. Proc. Natl. Sci. USA, 1979, v. 76, No. 12, pp. 6346-6350.

53. Watanabe A., Sato Y., Amako Y. Fluctuation spectroscopy: Thedetermination of chemical reaction rates based on the optical density fluctuation. Japanese J. Appl. Phys., 1978, v. 17, No. 1, pp. 109-115.

54. LePecq J.—B., Paoletti C. A fluorescent complex between Ethidium Bromide and nucleic acids. Physical-chemical characterization. J. Mol. Biol., 1967, v. 27, No. 1, pp. 87-106.

55. Jakeman E., Pike E.R., Swain S. Statistical accuracy in the digital autocorrelation of photon counting fluctuations. -J. Phys. A, 1971, v. 4, No. 4, pp. .51 7-534.

56. Weissman M., Schindler H., Feher G. Determination of molecular weights by fluctuation spectroscopy: Application to DNA. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, No. 8, pp. 2776-2780.

57. Sorscher S.M., Klein M.P. Profile of a focussed collimated laser beam near the focal minimum characterized by fluorescence correlation spectroscopy. Rev. Sci. Instrum., 1980, v. 51, No. 1, pp. 98-102.

58. Geerts H. Experimental realization and optimalization of a fluorescence correlation spectroscopy apparatus. J. Biochem. Biophys. Methods, 1983, v. 7, pp. 255-261.

59. Icenogle R.D., Elson E.L. Fluorescence correlation spectroscopy and photobleaching recovery of multiple binding reactions. I. Theory and FCS measurements. Biopolymers, 1983, v. 22, No. 8, pp. 191 9-1948.

60. Джейкман E. Корреляция фотонов. В: Камминс :Г., Пайк Э., ред. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. -М.:- Мир, 1978, стр. 71-14:5.

61. Оливер С.Д. Методы корреляционной спектроскопии. В: Камминс :Г., Пайк :Э., ред. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. - М.: Мир, 1978, стр. 146-22:0.

62. Каш Z., Shore H.B., Feher G. Simple schemes for measuring autocorrelation functions. Rev. Sci. Instrum., 1975, v. 46, No. 3, pp. 269-277.

63. Gunter W.D., Grant G.R., Shaw S.A. Optical devices to increase photocathode quantum efficiency. Appl. Opt., 1970, v. 9,1. No. 2, pp. 251-257.

64. Morton G.A., Smith H.M., Wasserman R. Afterpulses in photo-multipliers. IEEE Trans. Nucl. Sci., 1967, v. NS-14, No. 1, pp. 443-448.

65. Arecchi F.T., Corti M., Degiorgio V., Donati S. Measurements of light intensity correlations in the subnanosecond region by photomultipliers. Opt. Comm., 1971, v. 3, No. 4, pp. 284-288.

66. Burstyn H.C., Chang R.F., Sengers J.V. Nonexponential decay of critical concentration fluctuations in a binary liquid. -Phys. Rev. Lett., 1980, v. 44, No. 6, pp. 410-413.

67. Hiller G., Simonsohn G. Measuring thermal diffusivities using two photomultipliers in cross-correlation. In: Schultz-DuBois, ed. Photon correlation techniques in fluid mechanics. -Berlin, Heidelberg, NY: Springer, 1983, pp. 377-383.

68. Jakeman E., Pike E.R. Spectrum of clipped photon-counting fluctuations of Gaussian light. J. Phys. A, 1969,. v. 2, No. 3, pp. 411-412.

69. Degiorgio V., Lastovka J.B. Intensity-correlation spectroscopy. Phys. Rev. A, 19.71, v. 4, No. 5, pp. 2033-2050.

70. Saleh B.E.A., Hendrix J. Clipped correlation of integrated intensity fluctuations of thermal light with an arbitrary spectrum. J. Phys. A, 1975, v. 8, No. 7, pp. 1134-1139.

71. Crooker P.P., Hoover J.A. Measurement of optical autocorrelation functions using a signal averager. Rev. Sci. Inctrum., 1976, v. 47, No. 5, pp. 574-580.

72. Mole A., Geissler E. A digital correlator for clipped photon counting. J. Phys. E: Sci. Instrum., 1975, v. 8, No. 5, pp. 41 7-420.

73. Chen S., Veldkamp W.B., Lai C.C. Simple digital clipped correlator for photon correlation spectroscopy. Rev. Sci. Instrum., 1975, v. 46, No. 10, pp. 1356-1367.

74. Fraser A. A digital pulse correlator and an advantage of double clipping. Rev. Sci. Instrum., 1971, v. 42, No. 10, pp. 1 539-1 540.

75. Higbie J. An improved numerical method for determining composite decay constants. Nucl. Instrum. Meth., 1972, v. 105, No. 2, pp. 279-282.

76. Innes D.J., Bloom A.L. Design of optical systems for use with laser beams. Spectra-Physics Laser Technical Bulletin, 1966, No. 5 -10 p.

77. Drexhage K.H. Fluorescence efficiency of laser dyes. Journal of Research of the National Bureau of Standards, 1976, v. 80A, No. 3, pp. 421-428.

78. Gurr E. The rational use of dyes in biology and general staining methods. London: Leonard Hill, 1965. - 422 p.

79. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 198:0. - 320 стр.8:3. Kapoor М. The application of fluorescence and fluorescent probes in biological systems. Biol. Rev., 1976, vol. 47, pp. 27-51.

80. Birks J.B. Photophysics of aromatic molecules. NY: Wiley-Inter science, 1970. - 704 p.

81. Теренин A.H. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. Ленинград: Наука, 196:7. - 616 стр.

82. Longsworth L.G. Diffusion measurements at 1°, aqueous solutions of amino acids, peptides and sugars. J. Amer. Chem. Soc., 1952, v. 74, No. 16, pp. 4155-4159.

83. Zamecnick P.C., Stephenson M.C., Scott J.-F. Partial purification of soluble RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 1960,v. 46, No. 6, pp. 811-822.

84. Bauman J.G.J., Wiegant J., van Duijn P. Cytochemical hybridization with fluorochrome-labeled RNA. I. Development of a method using nucleic acids bound to agarose beads as a model. -J. Histochem. Cytochem., 1981 , v. 29, No. 2, pp. 227-237.

85. Hansske F., Cramer F. Modification of the 3' terminus of tRNA by periodate oxidation and subsequent reaction with hydrazides. Methods in Enzymology, 1979, v. 59, pp. 172-181.

86. Конарев :В.Г. О комплексообразования рибонуклеиновая кислота-пиронин. Цитология, 1959, т. I, № 4, стр. 4 08-41:4 .

87. Motonashi N. Interaction between 9-substituted benzoa.-phen-oxazine derivatives and DNA and relationships to their antibacterial activities. Yakugaku Zasshi, 1982, v. 102, No. 7, pp. 646-650.

88. Dutt M.K. Nile blue as an aqueous solution for the demonstration of DNA-aldehydes and DNA-phosphate groups. Sci. Cult., 1980, v. 46, No. 9, pp. 338-340.

89. Sharpies D., Brown J.R. Correlation of the base specificity of DNA-intercalating ligands with their physico-chemical properties. FEBS Letters,. 1976, v. 69, No. 1, pp. 37-40.

90. Weisblum В., de Haseth P.L. Quinacrine, a chromosome stain specific for deoxyadenylate-deoxythymidylate-rich regions in DNA. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1972, v. 69, No. 3, pp. 629-632.

91. Schreiber J.P., Daune M.P. Fluorescence of complexes of acridine dye with synthetic polydeoxyribonucleotides: a physical model of frameshift mutation. J. Mol. Biol., 1974, v. 83, No. 4, pp. 487-501.

92. Hammes G.G., Hubbard C.D. The interaction of acridine orange and proflavine with polyadenylic acid. J. Phys. Chem., 1966, v. 70, No. 9, pp. 2889-2895.

93. Miiller W. , Crothers D.M. Interactions of heteroatomic compounds with nucleic acids. 1. Eur. J. Biochem., 1975, v. 54, No. 1, pp. 267-277.

94. Schmechel D.E., Crothers D.M. Kinetic and hydrodynamic studies of the complex of proflavine with Poly A«Poly U. Bipol., 1971, v. 10, No. 3, pp. 465-480.

95. Круглова Е.Б., Малеев :В.Я. Спектральные проявления взаимодействия красителя пиронина G с полинуклеотидами. Мол. биология, 1982, :т. 16, вып. 4, стр. 865-869.

96. Ellerton N.F., Isenberg I. Fluorescence polarization study of DNA-proflavine complexes. Biopol., 1969, v. 8, No. 6, pp. 767-786.

97. Bustamante C., Stigter D. Intercalation of cationic dyes in the DNA double helix: introductory theory. Biopolymers, 1984, v. 23, No. 4, pp. 629-645.

98. Le Pecq J.-В., Paoletti С. A new fluorometric method for RNA and DNA determination. Analytical Biochem., 1966, v. 17, No. 1, pp. 100-107.

99. Fredricq E., Houssier C. Study of the interaction of DNA and acridine orange by various optical methods. Biopol., 1972, v. 11, No. 11, pp. 2281-2308.

100. Tritton T.R., Mohr S.C. Relaxation kinetics of the binding of ethidium bromide to unfractionated yeast tRNA at low dye/phosphate ratio. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, v. 45, No. 5, pp. 1240-1249.

101. Jovin T.M. Fluorimetric kinetic techniques: chemical relaxation and stopped-flow. In: Chen R.F., Edelhoch H., ed. Biochemical fluorescence: concepts, vol. 2. - NY, Basel: Marcel Dekker, 1976, pp. 305-374.

102. Icenogle R.D., Elson E.L. Fluorescence correlation spectroscopy and photobleaching recovery of multiple binding reactions. II. FPR and FCS measurements at low and high DNA concentrations. Biopolymers, 1983, v. 22, No. 8, pp. 19491 966.