Функционирование и структура белков (ферментов) в коллоидных системах, на поверхности раздела фаз и в микроэмульсиях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

КУДРЯШОВА ЕЛЕНА ВАДИМОВНА

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ И СТРУКТУРА БЕЛКОВ (ФЕРМЕНТОВ) В КОЛЛОИДНЫХ СИСТЕМАХ, НА ПОВЕРХНОСТИ РАЗДЕЛА ФАЗ И В МИКРОЭМУЛЬСИЯХ

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

1 5 ОКТ ?009

МОСКВА-2009

003479670

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор химических наук, профессор АБ. Левашов

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, чл.-корр. РАНА.Г. Габибов доктор химических наук, профессор И.А. Ямсков доктор химических наук А.А. Ярославов

диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан сентября 2009 года.

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится

декабря 2009 г. в 1600 часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Структурно-функциональное состояние белков на границах раздела фаз в значительной степени определяет протекание многих жизненно важных процессов в клетках. Именно на границах раздела фаз локализованы и функционируют многие биомолекулы, отвечающие за процессы транспорта, метаболизма и сигнальной трансдукции. Таким образом, разработка новых подходов к исследованию структурно-функциональных особенностей белков и ферментов в модельных коллоидных системах представляет очевидный интерес с фундаментальной точки зрения. Кроме того, исследование на молекулярном уровне механизмов образования и стабилизации искуственных коллоидных систем имеет огромное чняченис дня разработки новых лекарственных форм, а также новых технологий для пищевой и косметической промышленности.

В настоящее время, в арсенале исследователей практически отсутствуют прямые методы, позволяющие па молекулярном уровне изучать структурные и динамические свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз. Информация, встречающаяся в литературе, носит скорее качественный характер.

Таким образом, разработка новых высокочувствительных методов, позволяющих получать информацию о структурных и динамических свойствах белков в коллоидных системах, открывает широкие перспективы, как для фундаментальных исследований, так и для создания новых технологий для пищевой промышленности, биотехнологии и медицины.

Целью работы является разработка новых подходов для исследования структурно-функциональных свойств ферментов и белков в коллоидных системах, на поверхности раздела фаз и в микроэмульсиях. Для проведения данного исследования были применены модельные системы:

1. Белки и их комплексы адсорбированные на поверхности раздела фаз вода-воздух;

2. Ферменты в системе обращенных мицелл ПАВ;

3. Ферменты в составе фермент-полиэлектролитных комплексов и ковалентных конъюгатов с полиалкиленоксидами (ПЭГ и плюрониками) в неводных средах.

Использование выбранных модельных систем позволяет в широких пределах варьировать условия функционирования и характер взаимодействия компонентов в белок-содержащих супрамолекулярных структурах. В работе были поставлены следующие основные задачи:

о На основе высокочувствительных микроспектроскопических методов, применяемых для исследования свойств белков в растворах (флуоресцентных методов, ТИРА, РСБ, а также ИК-спекгроскопии), разработать методы исследования структурно-функциональных свойств белков в коллоидных системах, на поверхности раздела фаз.

о С применением разработанных спектроскопических методов изучить основные закономерности функционирования и структурные свойства ферментов и белков в коллоидных системах (включая мультикомпонентные системы).

В качестве объектов исследования выбраны белки, широко применяемые для стабилизации пищевых коллоидных систем, овальбумин куриного яйца и молочный р-лактоглобулин, а также ряд ферментов различных классов. При исследовании свойств белков и ферментов в мультикомпонентных

-1-

коллоидных системах использовали надмолекулярные белковые комшгексы (ассоциаты) и конъюгаты

с соединениями различной природы:

комплексы ферментов с синтетическими полиэлектролитами различной структуры; комплексы ферментов с природными олигоэлектролигами (олигоаминами); олнгомерные ферменты;

природные белковые ассоциаты, тела включения; искуственно агрегированные белки;

комплексы белков с полианионными и поликатионными полисахаридами; препараты ферментов, модифицированные соединениями различной природы; конъюгаты ферментов с полиалкиленоксидамн (ПЭГ, плюрониками).

о На основе найденных закономерностей разработать подходы для регуляции структурно-

функциональных свойств белков и ферментов в коллоидных системах.

Научная новизна работы. В настоящее время, практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков адсорбированных на поверхностях раздела фаз. Данных по структуре белков и белок-содержащих надмолекулярных ансамблей на поверхностях раздела фаз в литературе практически не встречается. В представленной работе впервые разработаны принципиально новые подходы, позволяющие исследовать структурные свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз на основе высокочувствительных микроспектроскопических методов, применяемых для изучения структурных свойств белков в гомогенных системах. Суть разработанных подходов состоит в применении методов разрешенно-временной флуоресцентной спектроскопии и ИК спектроскопии в режиме внешнего отражения (соответственно, ER-TRFA и IRRAS) и разработка соответствующих методов спектральной симуляции для получения количественной информации о свойствах белков (концентрации, конформации, степени агрегации, молекулярной подвижности) адсорбированных на поверхности вода-воздух. Кроме того, для получения информации о диффузионных свойствах белков на поверхности раздела фаз впервые адаптирован и применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Впервые показано, что данные методы (ER-TRFA и IRRAS и FCS) чувствительны к изменениям пространственной структуры, общей и внутренней молекулярной динамики белков, а также состояния агрегации белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. Продемонстрировано, что разработанные методы, ER-TRFA, FCS и IRRAS применимы как в случае моно-, так и мультикомпонентных коллоидных систем различного состава. С применением комбинации данных методов впервые получена детальная количественная информация о распределении белка в поверхностном слое, кинетике адсорбции, а также о структурно-динамических свойствах белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. Показано, что применение комбинации методов ER-TRFA, FCS и IRRAS открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции биополимеров и их комплексов на поверхностях раздела фаз.

С применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ, позволяющей целенаправленно регулировать олигомерный состав ферментов, был разработан принципиально новый метод для проведения рефолдинга рекомбинантных ферментов, образующихся в виде тел включения.

Эффективность и универсальность предложенного метода была продемонстрирована на пример; ферментов: галактозооксидаз (Рш£а1ох и Sagalox) и альдонолактоноксидазы (ТсОАЦ.

Предложены новые подходы для исследования механизмов регуляции функционирования олигомерных и мембранотропяых ферментов с применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ. Изучена роль межсубъединичных взаимодействий в функционировании олигомерных ферментов на примере п-гидроксибснзоат гидроксилазы (РНВН) и галактозооксидазы (р1^а1ох). Были впервые получены полностью активные олигомерные формы данных ферментов, не реализующиеся в водных растворах, мономерная - в случае РНВН и димерная и тетрамерная - в случае р1ода1ох. Найдено, что каталитическая эффективность полученных олигомерных форм выше по сравнению с таковыми в водном растворе, как в случае РНВН, так и FusgaIox. Установлено, что в случае РНВН механизм изменения каталитических параметров при образовании мономера, связан с конформационными перестройками в молекуле фермента при диссоциации димера, приводящими с одной стороны к увеличению каталитической активности, а с другой стороны — к инактивации и агрегации мономерной формы в водном растворе. Показано, что образование димера играет ключевую роль в поддержании нативной конформации фермента в случае РНВН.

Предложен новый подход для исследования влияния липидного состава матрицы на функционирование мембранотропных ферментов, основанный на применении системы обращенных мицелл. Показано, что данный подход является исключительно информативным для проведения такого исследования: позволяет варьировать липидный состав мицеллярной матрицы путем получения смешанных мицелл; учитывать влияние химической природы липидов на каждую из олигомерных форм фермента, а также исследовать влияние структуры липида на мембранотропные свойства фермента. На примере периферического мембранного фермента, кислой фосфатазы (КФ), показано, что липидный состав матрицы играет ключевую роль в функционировании мембранотропных ферментов. Показано, что влияние липидного состава системы на каталитические свойства КФ могут быть вызваны как влиянием липидного состава системы на структуру и свойства мицелл, так и являться следствием белок-липидных взаимодействий.

Детально изучен молекулярный механизм влияния комплексообразования с полиэлектролитами на структурно-функциональные свойства ферментов и белков. Найдено, что взаимодействие белков с ПЭ приводит к образованию квази-регулярной компактной структуры комплекса двух уровней: внутренняя - доменная и общая - глобуло-подобная структура. Обнаружено, что в водно-органических системах, а также при адсорбции на гидрофобных поверхностях эффективность взаимодействия белков с ПЭ усиливается, что приводит к снижению константы диссоциации комплексов и образованию более конденсированной структуры комплекса. Найдено, что образование таких структур приводит к ограничению как общей, так и внутренней подвижности фермента (увеличивает жесткость активного центра). Впервые показано, что образование компактной и упорядоченной структуры фермент-ПЭ комплексов является основной причиной активационного и стабилизационного эффектов, наблюдаемых в водно-органических системах.

Практическая значимость работы. Способность белков адсорбироваться на поверхностях раздела фаз вода-воздух и вода-масло является молекулярной основой образования и стабилизации белок-содержащих коллоидных систем, пен и эмульсий. Многие пищевые продукты представляют собой коллоидную систему, в которой белки и их комплексы играют роль стабилизаторов. Адсорбционные свойства белков здесь определяют условия получения, текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов. На основе детального изучения механизмов адсорбции белков найдены корреляции между поверхностными свойствами белков и их способностью стабилизировать коллоидные системы. Предложены возможные пути регуляции поверхностно-активных свойств белков и реологических свойств белковых пленок. Показано, что эффективными методами контроля процесса образования, текстуры и стабильности белок-содержащих коллоидных систем являются: влияние на агрегационные процессы; образование комплексов белков с полиэлектролитами, а также варьирование физико-химических свойств среды. Найденные закономерности и предложенные подходы могут служить физико-химической основой при разработке новых продуктов в пищевой и косметической промышленности, при поиске новых лекарственных форм.

Разработан новый эффективный метод проведения рефолдинга рекомбинантных ферментов на основе мицеллярного подхода. Данный подход был успешно применен для ренатурации тел включения ферментов: галактонолактоноксидазы из Trypanosoma cruzi (TcGAL) и галактозооксидазы из Fusarium (Fusgalox). Преимуществом предлагаемого в данной работе подхода является возможность оптимизировать условия сворчивания фермента путем подбора оптимального размера мицелл, а также, возможность изолировать молекулу фермента в отдельной мицелле. Это, с одной стороны, повышает эффективность процесса сворачивания, а с другой стороны, защищает фермент от агрегации, включая образование межмолекулярных S-S-связей в процессе рефолдинга. Результаты исследований предназначены для получения рекомбинангным методом труднодоступных ферментов для их последующего использования в промышленной биотехнологии, в производстве косметических и лекарственных средств.

Разработан новый подход для повышения эффективности функционирования ферментов класса гидролаз, щелочной протеазы и целлюлазы, в составе синтетических моющих средств (CMC), основанный на комплексообразовании ферментов с природным полисахаридом, хитозаном. Продемонстрировано, что образование комплексов с хитозаном стабилизирует оба фермента. Общий эффект повышения каталитической активности ферментов, учитывая как увеличение уровня начальной активности фермента, так и стабилизационный эффект, составляет порядка 50-60%. Использование хитозана в качестве стабилизирующей добавки могло бы позволить снизить количество используемых в CMC ферментных преператов щелочной протеазы и целлюлазы в 2 раза, что важно с точки зрения экологической безопасности использования фермент-содержащих моющих средств.

Предложены методы регуляции функциональных свойств ферментов (растворимости, каталитической активности и стабильности) в водно-органических смесях, основанные на образовании комплексов ферментов с ПЭ и коньюгатов с полиспиртами и низкомолекулярными полярными

-4-

соединениями. Полученные результаты перспективны в плане расширения круга практическсл о использования ферментов для аналитических целей и в тонком органическом синтезе. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих международных конференциях и симпозиумах: «Полиэлектролиты» (Коимбра, 2008); «Высокоорганизованные каталитические системы» (Москва, 2004); «Инженерия и функционирование белков» (Москва, 2003); «ПАВ в растворах» (518-2002) (Барселона, 2002); «Биокатализ» (Москва, 2002); «Фолдинг» (Москва, 2000); «Биокатализ» (Москва, 2000); «Коллоидные системы на основе липидов и ПАВ» (Москва, 1999); «Высокое давление и Биотехнология» (Лиссабон, 1998); «Биокатализ» (Пущино, 1998); «Структура, Стабильность и Фолдинг белков» (Москва, 1998); «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997); «2 Съезд биохимического общества РАН» (Москва, 1997); «Растительные пероксидазы» (Вена, 1996); «16 Международный конгресс по биохимии и молекулярной биологии» (Нью-Дели, 1994); «Молекулярная подвижность и порядок в полимерных системах» (Санкт-Петербург, 1994); «Протеолитические ферменты» (Москва, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 статьи и 21 тезисы докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, постановки задачи, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 430 ссылок. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Функционирование и структурные свойства белков и ферментов в коллоидных системах изучали на примере трех модельных систем: белки и их комплексы адсорбированные на поверхности вода-воздух; ферменты в системе обращенных мицелл ПАВ; ферменты в составе фермент-ПЭ комплексов и ковалентных конъюгатов с ПЭГ и плюрониками в неводных средах.

Белки и белок-содержащие комплексы на поверхности вода-воздух. Поверхность вода-воздух является классической системой при изучении адсорбционных свойств белков. Адсорбцию белков на поверхности вода-воздух изучали на примере двух модельных белков, овальбумина куриного яйца (ОВА) и молочного р-лактоглобулина ф-^), которые широко используются для стабилизации пищевых коллоидных систем, пен и эмульсий. Для изучения свойств белков на поверхности вода-воздух применяли Ленгмюровскую установку, которая позволяет измерять и модулировать поверхностное давление. Для исследования структурных и динамических свойств белков в процессе адсорбции на поверхности вода-воздух в режиме реального времени были применены методы ИК-спектроскопии и разрешенно-временной флуоресцентной спектроскопии, реализованные в режиме внешнего отражения (рис. 1), а также метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (РСБ), позволяющий проводить фокусирование на поверхности раздела фаз. Данные подходы, позволяющие следить за структурой белков на поверхности раздела фаз, были разработаны впервые на основе микроспектроскопических методов, применяемых в настоящее время для изучения структурных свойств белков в гомогенных системах.

•IRRAS sS

•TRFA

•FCS

Реологические

Структурные свойства (Концентрация, конформация,

на пленку и расширение поверхности)

Рис. 1. Применение микроспектроскопических методов ER-TRFA, IRRAS для проведения экспериментов на поверхности раздела фаз при исследовании адсорбционных и структурных свойств белков и их комплексов в процессе адсорбции на поверхности вода-воздух в режиме реального времени.

Метод ИК-спектроскопии в режиме отражения, IRRAS. ИК спектры отражения (IRRAS) белков определяются оптическими свойствами поверхности, которые в свою очередь, зависят от распределения концентрации белка на поверхности раздела фаз, а также от структуры адсорбированного белка, что лежит в основе применения IRRAS для анализа свойств белков адсорбированных на поверхности. Однако, влияние оптических эфффектов существенно усложняет анализ IRRAS спектров. В связи со сложностью количественной интерпретации спектров отражения до настоящего времени метод IRRAS использовался крайне редко и лишь для получения качественной информации о свойствах адсорбированных белков. В данной работе был разработан метод количественного анализа IRRAS спектров, позволяющий получать детальную количественную информацию о свойствах белков адсорбированных на поверхности вода/воздух. Для анализа IRRAS спектров использовали модель, в которой рассматривали систему, как состоящую из определенного числа (N) гомогенных слоев, толщиной (d¡) и концентрацией белка с, расположенных над объемной фазой с концентрацией с0 (рис. 2). Моделирование экспериментальных спектров отражения IRRAS проводится следующим образом: измеряется ИК спектр поглощения исследуемого белка. На основе полученного ИК спектра поглощения с использованием системы уравнений Крамерс-Крониг, позволяющих установить взаимосвязь комплексного показателя преломления белок-содержащего слоя и спектра отражения R(v), создается теоретический рефлекционный спектр белка для требуемой оптической модели. Определяемые параметры: число слоев, толщина каждого из слоев и концентрации белка в них. Для изученных в работе белков: ОВА и ¡З-lg (включая модифицированные формы) адсорбированных из водных растворов с объемной концентрацией 0.05-Í00 мг/мл, система адекватно описывается двухслойной моделью: поверхностный слой, обогащенный белком, толщиной d и концентрацией С; и субфаза с концентрацией Cj, расположенные над объемной фазой с концентрацией белка с„, которая практически не изменяется даже при глубоких степенях адсорбции.

Примеры экспериментальных и теоретически полученных Ш^АБ спектров белка в зависимости от концентрации белка представлены па рис. 3.

4100 3600 3100 2600 2100 1600 1100

Длина волны (см1)

Рис. 3. Экспериментальные и теоретические ЖЯАБ спектры ОБА адсорбированного на поверхности вода-воздух в зависимости от объемной концентрации белка. Условия эксперимента: 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.0; время адсорбции 60 мин, 22°С.

Параметры системы, полученные в результате анализа ШЛАБ спектров, суммированы в таблице 1. При увеличении исходной объемной концентрации (со), концентрация в поверхностном слое (с;) возрастает, а соотношение концентраций и толщина слоя (с1) уменьшается. Таким образом, скорость адсорбции, а также параметры системы (с;, сг, Л), можно целенаправленно варьировать путем изменения объемной концентрации белка.

Таблица 1. Параметры полученные на основе общего анализа ЖЯАЗ спектров ОВА, измеренных при различных объемных концентрациях белка (Сц): концентрация белка в поверхностном слое (С|), концентрация белка в суб-фазе (С2), толщина поверхностного слоя ((1).

Од (мг/мл) 0.1 (мг/мл) 10 (мг/мл) 50 (мг/мл)

Сх (мг/мл) 17 111 236

С2 (мг/мл) -0.1 16 86

<1 (нм) 350 90 85

За кинетикой адсорбции белков на поверхности вода-воздух следили по изменению параметров системы: а?, с; и с;/е2. При исследовании адсорбции ОВА и было найдено, что в первые несколько минут адсорбции происходит образование монослоя белка (толщина слоя 7-10 нм) и субфазы, обедненной белком. Затем происходит накопление белка в поверхностном слое толщиной 300-400 нм. В процессе адсорбции толщина поверхностного слоя, с/, уменьшается, а концентрация в нем, с¡, увеличивается (рис. 4). Скорость установления стационарных параметров системы (г/, с; и с|/сг),

1х 1Я гоо 25о

отражающая скорость адсорбции белка, увеличивается пропорционально концентрации белка в объемной фазе, с„.

Качественно информацию о механизмах адсорбции белка

на поверхности вода-воздух можно извлечь из анализа

зависимости концентраций с; и с;От времени (рис. 5). Так

в случае ОВА при низких с0, концентрация белка в

субфазе, с2, долгое время остается существенно более

низкой, чем в поверхностном слое. Т.е. адсорбция из

субфазы происходит быстрее, чем диффузия из объема

раствора в субфазу и скорость-лимитирующей стадией

является диффузия. При средних концентрациях, 5-10

мг/мл, концентрация белка в субфазе, начиная с

определенного момента, практически не меняется со

временем (рис. 5Б). Из чего следует, что скорость

диффузии сопоставима со скоростью адсорбции. При

высоких исходных концентрациях белка (50-100 мг/мл)

белок накапливается в субфазе со временем (рис. 5В). Это

означает, что механизм адсорбции кинетически

контролируемый.

Величину кинетического барьера определяли,

сопоставляя кажущийся коэффициент диффузии, О*,

полученный из экспериментальных адсорбционных

кривых, с коэффициентом диффузии, Б, полученным

Рис. 4. Зависимости толщины независимым методом, согласно уравнениям: поверхностного слоя ((1), концентрации

белка в нем (с,) и соотношения г(')=Со>/0*1/я: и 0*=Эе" , где Г - количество белка

концентрации белка в поверхностном адсорбированного на поверхности; С0 - объемная слое и в субфазе (С1/С2) от времени

адсорбции. концентрация белка; в случае ОВА 13=0.8*10 м /с, к -

константа Больцмана; Т- абсолютная температура. Из анализа начальных участков кинетическтих кривых было найдено, что в случае ОВА, уже при низких степенях заполнения поверхности (Г<1 мг/м2), механизм адсорбции смешанный, диффузионно-кинетически контролируемый; процесс адсорбции ОВА характеризуется наличием активационного барьера порядка 10±2 кДж/моль. В случае Р-лактоглобулина, анализ кинетических кривых показал, что механизм адсорбции при низких степенях заполнения поверхности (Г<1 мг/м2) - диффузионно-контролируемый, (Б* ~ О = 1.0* Ю"10 м2/с), активационный барьер адсорбции равен нулю.

а «А»

бОнг/нл

100 1» 200 250 ЭЮ 350

Время, (мик)

Поверхностный слой

Субфаза

Объемная фаза 1 мг/мл

Время

Б ОВА 10 мг/мл Поверхностный СЛОИ

о с; Субфаза

и q о I-- Объемная фаза 10 мг/мл

Время

В ОВА 50 мг/мл Поверхностный

слои

К " о 5 Субфаза

X S ц о h- - Объемная фаза 50 мг/мл

Время

Рис. 5. Профиль распределения белка при адсорбции ОВА на поверхности вода-воздух.

Вторичная структура белка на поверхности вода-воздух. Для получения информации о вторичной структуре белков на поверхности вода-воздух проводили анализ амид 1-2 области IRRAS спектров. На рис. 6. приведены примеры экспериментальных и теоретических IRRAS спектров ОВА адсорбированного на поверхности вода-воздух при различных объемных концентрациях белка. Из рисунка видно, что при концентрациях белка 0.1 и 10 мг/мл соотношение интенсивностей пиков, относящихся к a-спиралям и Р-структурам в экспериментальном спектре, не соответствует таковым в теоретически полученном спектре, что свидетельствует о наличии конформациокных изменений в белке при адсорбции. Количественный анализ спектра показал, что на поверхности вода-воздух ОВА принимает конформацию, в которой содержание (З-структуры на 10% меньше по сравнению с белком в объеме раствора. Обнаружено, что такая конформация образуется при адсорбции ОВА из исходных объемных концентраций 0.1-10 мг/мл (рис. 6). При адсорбции из высоких концентрациях белка (50100 мг/мл) ОВА сохраняет нативную конформацию в поверхностном слое, что объясняется отсутствием необходимого пространства в поверхностном слое белка. По-видимому, уже на

-9-

начальной стадии адсорбции конформация белка фиксирована в поверхностном слое. Аналогичная тенденция наблюдается при адсорбции

O.t mg/ml

10 mg/ml

SO mg/ml

v. <

a ß

a

E*P Sim

-10% ßs ^r

• i

Sm

-10% 0s

Екр

Sim

-10% (й

Sim

та »w

täöö «Ii

Длина волны

I5IC HKS ß« IJT9

Рис. 6. Определение вторичной структуры ОБА на поверхности вода-воздух на основе анализа АМИД I области IRRAS спектров. Ехр - экспериментально полученные IRRAS спектры; Sim -теоретические кривые без учета конформационных изменений; Sim-10% (к - теоретические IRRAS спектры, в которых содержание (5-структуры снижено на 10%.

Молекулярная подвижность белков. на поверхности вода-воздух. При исследовании свойств белков адсорбированных на поверхности одним из наиболее значимых параметров является молекулярная подвижность белков, она характеризует структуру поверхностного слоя и определяет состояние белка в нем. Подвижность белков - параметр, наибольшим образом изменяющийся при адсорбции. В данной работе впервые были определены количественно параметры, характеризующие молекулярную подвижность белков на поверхности вода-воздух. Для изучения молекулярной подвижности белков в процессе адсорбции были впервые применены флуоресцентные методы: разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии в режиме отражения (ER-TRFA) и флуоресцентной корреляционной анизотропии (FCS).

TRFA - один из видов релаксационных флуоресцентных методов. Метод основан на том, что после возбуждения флуорофоров поляризованным светом (в импульсном режиме) измеряют кривые деполяризации, r(t), флуоресцентных молекул, как функцию от времени в наносекундной временной шкале: r(t) = XPjexp(-t/((ij), где ф] - индивидуальные корреляционные времена вращения, отражающие скорость вращательного движения флуорофора, a Pj - вклады соответствующих компонентов в деполяризацию. В белках различают несколько причин деполяризации: внутреннее движение флуоресцентной метки, движение сегментов белка, вращение всей молекулы белка, подвижность белковых агрегатов. Молекулярные массы вращающихся фрагментов определяют согласно уравнению Стокса-Ейнштейна: Фбелка" T|V/RT = riM(v+h) /RT. Для глобулярных белков корреляционное время вращения (фбш«а> нс) также связано с молекулярной массой белка (М) эмпирическим уравнением: 36 * 10"5 * М.

За динамикой ОВА следили как по флуоресцентной метке (акридон 14), так и по собственной флуоресценции белка. Было обнаружено, что в объеме раствора ОВА проявляет свободное вращение: его корреляционное время вращения, <f><*„a=21 нс, соответствует геометрическим размерам молекулы.

Адсорбция на поверхности приводит к ограничению вращательной подвижности белка. При высоких концентрациях белка наблюдается уменьшение времени вращения в 1.5 раза (фй«л«а= 16 не), что в случае белков с эллипсоидной геометрией, каковым является ОВА (4.5x7x5 нм), может быть связано с ограничением вращательной подвижности белка относительно более длинной оси симметрии. Данные подтверждающие это предположение - наличие ненулевой остаточной анизотропии (гю =0.16-0.22 в зависимости от времени адсорбции) (деполяризационные кривые не доходят до нуля), что свидетельствует об ограничении вращательной подвижности в направлении перпендикулярном поверхности раздела фаз. Это предполагает преимущественно вертикальную пространственную ориентацию молекул белка на поверхности. Из анализа значений остаточной анизотропии согласно уравнению: г^/гц = ¡(Зсо$2в-1)/2}2 следует, что максимально возможный угол реориентации белка относительно плоскости поверхности равен 11-18° в зависимости от времени адсорбции.

При низких концентрациях белка, в условиях наличия достаточного пространства для конформационных перестроек, наблюдается денатурация адсорбированных молекул, как было обнаружено методом ИШАЭ. При этом вращательная подвижность, соответствующая всей молекуле белка не наблюдается, а наблюдается вращение небольшого фрагмента белка (ф=5.1 не, что соответствует ММ =10-12 кДа), как было найдено методом ЕЯ-Т11РЛ.

Таким образом, впервые продемонстрировано, что метод ЕЯ-ТИРА чувствителен к изменениям во вращательной подвижности белков на поверхности вода-воздух, и позволяет получать информацию о структуре и пространственной ориентации белка на поверхности. Не менее важной характеристикой адсорбированных белков является общая молекулярная подвижность или диффузионные свойства, которые напрямую характеризуют структуру поверхностного слоя, агрегатное состояние адсорбированных молекул белка. Для получения информации об общей молекулярной подвижности белков на поверхности вода-воздух был впервые применен метод ИСБ, который позволяет измерять напрямую скорость диффузии белков. Метод основан на том, что диффузия флуоресцентных молекул вызывает флуктуации в интенсивности флуоресценции регистрируемой в объеме детекции 0.1-1 флитр, с применением конфокального микроскопа. Статистический анализ флуктуаций флуоресценции позволяет определять время трансляционной диффузии, Та, которое характеризует время пребывания молекулы в рассматриваемом элементе объема и которое обратно пропорционально коэффициенту диффузии, Б. Для проведения РСв-экспериментов на поверхности вода воздух измеряли профиль распределения белка путем сканирования интенсивности флуоресценции как функции расстояния от дна ячейки до поверхности раздела фаз. На рис. 7 приведен пример профиля распределения концентрации для ОВА (рис. 7А) и калибровочная кривая зависимости наблюдаемой интенсивности флуоресценции в поверхностном слое от исходной объемной концентрации белка (рис. 7Б). Концентрация белка в поверхностном слое, найденная методом ГСБ, и ее соотношение с объемной концентрацией (рис. 7В) согласуется с данными, полученными методом Ш^АБ. Это доказывает применимость используемых методов РСЭ и 1Ю1А8 для определения концентрации белка вблизи и на поверхности вода-воздух в сравнении с объемом раствора.

д объем раствора воздух

Л__ А _

X я.8 5.9

Рис. 7. (А): Профиль распределения концентрации ОВА, меченного акридоном, вблизи и на поверхности вода-воздух полученный методом флуоресцентной микроспектроскопии. Из анализа нескольких профилей концентрации (А) измеренных при разных объемных концентрациях белка (С0) были получены калибровочная кривая (Б) и зависимость концентрации белка на поверхности вода-воздух (в точке 2) от концентрации белка в объеме раствора (В).

С использованием полученного профиля распределения белка, измеряли скорость диффузии белка на поверхности вода-воздух в сравнении с объемной фазой. Из анализа корреляционных кривых (рис. 8А), было найдено, что времена трансляционной диффузии, Та, в объеме раствора и на поверхности вода-воздух равны соответственно 0.3*10"3 и 9*10"3 с, что соответствует уменьшению коэффициента диффузии от 0.8*Ю'10 (м2/с) до 0.03*10"'° м2/с. Оказалось, что диффузия ОВА на поверхности вода-воздух в 30 раз более медленная, чем в объеме раствора.

Рис. 8. Автокорреляционные кривые (экспериментальные и симуляционные) полученные методом ГСБ для ОВА (А) и Т-ОВА (Б) в объеме раствора (1) и на поверхности вода-воздух (2,3).

Сопоставляя данные, полученные методом ГСБ и ЕЯ-ТЯГА, мы можем сделать вывод, что подвижность ОВА на поверхности вода-воздух существенно ограничена. Ограничена как общая динамика белка (снижение коэффициента диффузии), так и вращательная подвижность.

Влияние агрегации на адсорбцию белка на поверхности вода-воздух. Следует отметить, что найденные параметры, характеризующие молекулярную подвижность, относятся к поверхностному слою белка, в котором белок находится в неагрегированном состоянии, как было показано методом тЯАБ. Как будет изменяться структурно-динамические свойства белка при усилении белок-белковых взаимодействий и в пределе, при образованиии агрегированного белкового слоя на поверхности вода-воздух? Этот аспект является важным, поскольку, как обсуждалось выше, при адсорбции на поверхности вода-воздух образуются высоко-концентрированные белковые слои с локальной концентрацией вплоть до 400 мг/мл. В таких системах белок-белковые взаимодействия и агрегация является одним из ключевых факторов, влияющих на структуру поверхностного слоя и его реологические свойства.

Применение разработанных нами подходов для исследования структурных свойств белков открывает новые возможности для выяснения молекулярных деталей влияния агрегации на адсорбционные свойства белков. Для этого были рассмотрены три препарата ОВА, характеризующиеся различной способностью образовывать агрегаты: нативный ОВА, термоденатурированный полностью агрегированный ОВА (Т-ОВА), и ОВА, модифицированный янтарным ангидридом (янт-ОВА), который не имеет склонности к агрегации из-за высокой плотности отрицательного заряда на поверхности.

Структурные характеристики препаратов ОВА в объемной фазе. Вторичная структура препаратов ОВА была изучена методом АТЯ-ИК-спектроскопии. АТК-ИК спектры ОВА, Т-ОВА приведены на рис. 9. Анализ «амид 1» области АТИ. спектра показал, что вторичная структура ОВА содержит 47% Р-структурных и 35% а-спиральных областей. Модификация ОВА янтарным ангидридом не приводила к изменениям во вторичной структуре и агрегационном состоянии белка. В препарате Т-ОВА содержание Р-структуры на 10-15% меньше по сравнению с ОВА.

Рис. 9. Амид-1 область АТК-ИК спектров ОВА и Т-ОВА. Пунктирными линиями обозначены длины волн ИК спектра, соответствующие элементам

вторичной структуры белка: а=а-спирали; р= р-слои; г.с.= статистический клубок; апьр= антипарапельные Р-слои.

Появление пика на 1624 см"' в спектре Т-ОВА (рис. 9) указывает на высокую степень агрегации в Т-ОВА. Подробно состояние агрегации в Т-ОВА анализировали методами гель-фильтрации, нативного

Длина волны, ап '

и SDS-электрофореза. Оказалось, что Т-ОВА состоит на 95-98% из нековалентно агрегированного белка. Молекулярная масса агрегатов составляет 600-700 кДа, что соответствует 12-16-меру. Влияние агрегации на кинетику адсорбции белка на поверхности вода-воздух было исследовано методом 1RRAS. Найдено, что скорость адсорбции Т-ОВА более медленная по сравнению с ОВА, что выражается в более медленном установлении равновесных значений поверхностной концентрации белка Ci (рис. 10А), толщины поверхностного слоя d, а также соотношения концентрации белка С1/С2 в поверхностном слое и субфазе. Это объясняется более низкой скоростью диффузии агрегатов Т-ОВА к поверхности по сравнению с молекулами мономера. Однако, скорость увеличения поверхностного давления выше в случае Т-ОВА (рис. 10Б). Это означает, что поверхностная активность Т-ОВА, увеличение поверхностного давления в пересчете на поверхностную концентрацию белка (ön/Sc), выше по сравнению с ОВА. Одной из причин более низкой поверхностной активности ОВА может являеться вертикальная пространственная ориентация ОВА, в результате которой уменьшается эффективная площадь поверхности, занимаемой молекулами ОВА на границе раздела фаз. На поверхностную активность белка может также влиять различие в структуре и подвижности белка на поверхности вода-воздух. Данные свойства препаратов ОВА были исследованы спектроскопическими методами IRRAS и ER-TRFA и FCS.

Концентрация ОВА на поверхности, нг/хл

0,12

ОВА

Т-ОВА

0 1200 2400 3600 4800 Время, сек

Поверхностное давление,idUM Б

70 ОВА

—

10 (Ï

У

1000 2000 3000 $емя,»к 4000 5000

Рис. 10. Зависимости поверхностной концентрации белка (А) и поверхностного давления (Б) от времени для ОВА и Т-ОВА при адсорбции на поверхности вода-воздух. Со= 0.1 мг/мл.

Конформационные свойства ОВА и Т-ОВА на поверхности вода-воздух. Из анализа ШЯАЗ спектров Т-ОВА и ОВА, следует, что по сравнению с частично денатурированной конформацией, найденной для адсорбированного ОВА (рис. ЗАБ), при адсорбции Т-ОВА дальнейшей денатурации белка не наблюдается. Оказалось, что при адсорбция Т-ОВА приводит к дез-агрегации. За диссоциацией агрегатов Т-ОВА на поверхности вода-воздух следили по уменьшению содержания антипаралельных р-слоев, которые в случае ОВА отражают степень агрегации (рис. 11). Так, после 4 часов адсорбции степень агрегации Т-ОВА снизилась от 100% до 25 %, где за 100% принимали полностью агрегированный Т-ОВА, а за 0% - ОВА (мономер). По-видимому, гидрофобные свойства поверхности

и энтропийный фактор - тенденция к равномерному распределению белка по всей поверхности являются основными причинами диссоциации агрегатов адсорбированного Т-ОВА.

Рис. 11. Дезагрегация Т-ОВА при адсорбции на поверхности вода-воздух. А: Амид 1 область IRRAS спектра Т-ОВА в зависимости от времени инкубации на поверхности. Б: Степень агрегации Т-ОВА определенная методом симуляционного анализа 1RRAS спектров. Начальная степень агрегации Т-ОВА (95-98%) была определена методом гель-фильтрации.

Диссоциация агрегатов Т-ОВА подтверждается также методом FCS. В то время как в объеме раствора была обнаружена одна фракция, коэффициент диффузии которой, D = 0.09*10"'° м2/с, соответствует агрегированным молекулам Т-ОВА с молекулярным весом 600-700 кДа, для Т-ОВА, адсорбированного на поверхности вода-воздух, было обнаружено две фракции, которым соответствуют времена диффузии, z¿, 9 и 25 мс (рис. 8Б). Величина времени диффузии первой фракции, Та =9 мс, совпадает с таковым определенным для нативного ОВА на поверхности и соответствует скорости диффузии мономерных молекул на поверхности. Время диффузии, относящееся ко второй фракции, соответствует диффузии крупных белковых агрегатов (кластеров), которые практически неподвижны на поверхности раздела фаз; скорость диффузии агрегатов на поверхности на 2 порядка ниже по сравнению со скоростью диффузии ОВА в объеме раствора. Вклад «долгого» времени диффузии при адсорбции на поверхности уменьшается во времени по сравнению с объемом раствора, что отражает дез-агрегацию Т-ОВА.

Молекулярные свойства овалъбумина в условиях сжатия пленки. Для исследования механизма влияния агрегации на адсорбцию белка и реологические свойства поверхностного слоя за молекулярным состоянием ОВА, Т-ОВА и янт-ОВА следили в условиях механического сжатия пленки. Профиль изотермы сжатия ОВА представлен на рис. 12. Изотерма сжатия содержит два основных участка, I и II, характеризующиеся различным наклоном, что соответствует различной сжимаемости, т.е. различным агрегатным состояниям белка на поверхности вода-воздух. Особенности молекулярных состояний ОВА на участках I и II изучали методами ER-TRFA и IRRAS в режиме реального времени. Было обнаружено, что на начальном этапе сжатия пленки (I) (от 230 до

130 см2) поверхностная концентрация ОБА и толщина поверхностного слоя белка практически не изменяются, что предполагает десорбцию белка с поверхности.

230 190 150 120 80

Площадь поверхности, см2

Рис. 12. Изотерма сжатия полученная для нативного ОВА при концентрации белка 0.1 мг/мл. Указаны корреляционные времена вращения в зависимости от площади доступной поверхности

определенные методом ЕЯ-ТЯГА в режиме реального времени при сжатии белковой пленки.

Основным процессом при сжатии пленки на начальном участке является агрегация белка.

Агрегация белка была показам по появлению характеристических пиков в амид I области ИШАБ спектров (на длинах волн 1694 и 1624 см"1, рис. 13), которые соответствуют анти-паралельным р-слоям, и являются индикаторами агрегации в ОВА. Количественный анализ ШЛАБ спектров показал, что содержание агрегированного белка при сжатии пленки от 230 до 130 см"1 увеличивается от 0 до 80%. Агрегация ОВА также проявляется в уменьшении корреляционного времени вращения белка Фбми от 21 до 7-10 не в ЕК-ТККА экспериментах (рис. 12). Найденная величина фбелт предполагает, что в условиях сжатии пленки белок вращается не как целая молекула, а только как неблюшой сегмент. Этот эффект является следствием образования белковых агрегатов, которые практически неподвижны и не вносят вклад во вращательное движение белка на поверхности в наносекундной временной шкале. При этом отдельные сегменты белка сохраняют свою подвижность. Размер таких сегментов уменьшается, что указывает на прогрессирующую агрегацию в процессе сжатии пленки.

парал р^трукт ^ »-„пар [няручт

теор -12% р +25 антир

Рис. 13. Вторичная структура ОВА на начальном участке изотермы сжатия. Со= 0.1 мг/мл.

Рис. 14. Изотермы сжатия препаратов ОВА: Т-ОВА (А) и янт-ОВА (Б), полученные после инкубации системы в течении 60 мин. Со= 0.1 мг/мл, ЮмМ фосфатный буфер, рН 7.0.

Только после того как основная масса белка перешла в агрегированное состояние (участок 11) наблюдается увеличение концентрации белка в поверхностном слое. Этот интервал сжатия пленки соответствует резкому скачку поверхностного натяжения (рис. 12), что указывает на переход белковой пленки в новое более конденсированное агрегатное состояние, наиболее вероятно, гелеобразное. В этих условиях молекулы белка образуют прочную сеть межмолекулярных взаимодействий, что препятствует десорбции белка с поверхности. В результате при дальнейшем сжатии происходит интенсивное увеличение поверхностной концентрации белка.

Интересно, что при подавлении агрегации белка путем введения на поверхность большого числа отрицательно заряженных групп (в препарате янт-ОВА), увеличения поверхностного давления (рис. 14Б) и поверхностной концентрации не наблюдается даже при 3-х кратном сжатии пленки, а происходит десорбция белка. Отсутствие агрегатов в янт-ОВА при сжатии пленки показано методами ЕЯ-ТЯРА и ШДАЗ. В случае, когда белок исходно агрегирован (Т-ОВА), он сразу является практически необратимо адсорбированным и поверхностное давление (рис. 14А), также как и поверхностная концентрация (рис. 15), увеличиваются

-17-

200 1 60 120 80 Площадь поверхности, см2

Рис. 15. Концентрация Т-ОВА в поверхностном слое, С[, (А) и толщина поверхностного слоя, Л, определенные из анализа 1Ю1А5 спектров Т-ОВА, в зависимости от площади доступной поверхности при измерении изотермы сжатия (рис. 13Б). С0= 0.1 мг/мл.

уже на начальном участке изотермы сжатия (при сохранении толщины поверхностного слоя, ё). При этом скачка на кривых поверхностного давления, соответствующего переходу в новое агрегатное состояние, не наблюдается (рис. 14А).

Возникает вопрос, сохраняются ли найденные закономерности при переходе от модельной системы, поверхность вода-воздух, к соответствующим колоидным системам, пенам? Какова взаимосвязь между агрегационными свойствами белка и его пенообразующей способности? В качестве количественного критерия пенообразующей способности используется минимальная концентрация белка, при которой образуется стабильная пена с стандартных условиях. Оказалось, что пенообразующая способность кореллирует качественно с поверхностной активностью белка. Так, Т-ОВА, обладающий более высокой поверхностной активностью, является также существенно более эффективным пенообразующим агентом по сравнению с ОВА. В случае ОВА для образования стабильной пены необходимо использовать концентрацию белка 10 мг/мл, в то время как в случае Т-ОВА минимальная концентрация составляет 1 мг/мл при тех же условиях пенообразования.

А

w&.mWÍ

Рис. 16. Пена, образованная в результате взбивания (30 сек) растворов, содержащих 1 мг/мл ОВА (А) или Т-ОВА (Б).

Таким образом, агрегация влияет практически на каждый из параметров: скорость диффузии, структуру, пространственную ориентацию белка в поверхностном слое и особенно - на обратимость адсорбции через образование геле-подобного поверхностного слоя белка. Найденные закономерности открывают возможные пути для целенаправленной регуляции адсорбционных свойств белков и их пенообразующей способности.

Влияние комплексообразования с полисахаридами на поверхностную активность белков. Другим методом регуляции адсорбционных свойств белков является переход от моно- к мультикомпонентным системам. Эффективным подходом для контроля адсорбции белков представляется метод комплексообразования с ПЭ: при комплексообразовании с ПЭ резко увеличивается поверхностный заряд, что непосредственно влияет на агрегационные свойства белка; увеличивается гидродинамический объем; происходит стабилизация структуры белка. Следует

ожидать, что комплексообразования с ПЭ будет существенным образом влиять на адсорбционные свойства белков и вместе с тем, на стабильность коллоидных систем.

В качестве ПЭ в работе использовали пектин из лимонной кожуры (ММ 120±10 кДа, см. Табл. 8), широко применяемый в пищевой промышленности в качестве загустителя. Влияние пектина на адсорбцию белка исследовали методом тензиометрии (АБТ). Обнаружено, что образование комплекса с пектином значительно снижает скорость адсорбции: лаг-фаза на кривой развития поверхностного давления при адсорбции ОВА (при объемной концентрации белка 0.05 мг/мл) увеличивается в 2.5 раза (рис. 17А). Найдено, что эффективность влияния комплексообразования на адсорбционные свойств?. ОВА определяется соотношением белс?1сТ1Э. МаксГи.^злшы?* эффект комплексообразования с пектином на скорость адсорбции ОВА пектина был обнаружен в условиях избытка белка, что по-видимому, связано с образованием специфической структуры комплеска в условиях насыщения молекулы ПЭ белком.

г

1 1»

I 1000 2000 3000 4000 5000 6000

£000 10000 13300 20000

Рис. 17. Кривые развития поверхностного давления, П, измеренные методом тензиометрии (АОТ) для ОВА (1) и ОВА в комплексе с пектином (2) в водном растворе (А) и в системе, содержащей 10 об. % этанола (Б). Концентрации белка 0.05 мг/мл.

Учитывая электростатический характер взаимодействия белков с ПЭ, прочность комплексов можно эффективно регулировать путем изменения физических параметров системы, диэлектрической проницаемости среды, ионной силы, рН. Так, влияние пектина на адсорбцию белков полностью

Рис. 18. Соотношение лаг-фазы при развитии поверхностного давления для ОВА в отсутствии пектина относительно ОВА в комплексе с пектином (при ОВА/пектин =10/1) как функция от концентрации этанола в системе.

подавляется в присутствии 0.2 М КаС1. И наоборот, при добавлении в систему небольших количеств этанола (до 15 об. %) наблюдается значительное усиление влияния ПЭ на адсорбцию белков (рис. 18).

Если при комплексообразовании с пектином в водном растворе лаг-фаза адсорбции ОВА увеличивается в 2.5 раза, в 10% растворе этанола лаг-фаза адсорбции ОВА увеличивается более чем в 10 раз в присутствии пектина (рис. 17Б). Наблюдаемые различия в адсорбционных свойствах комплексов при варьировании условий комплексообразования (соотношения белок/ПЭ и полярности среды), наиболее вероятно, обусловлены различием в пространственной структуре и стехиометрии комплексов.

Пространственная структура комплексов ОБА с пектином в растворе и на поверхности вода-воздух изучена методом TRFA. Обнаружено, что взаимодействие с пектином приводит к образованию характеристических пространственных структур комплекса в зависимости от соотношения белок/ПЭ. Из анализа корреляционных времен вращения, полученных методом TRFA следует, что в условиях избытка белка несколько молекул белка связывается с одной молекулой пектина. Наблюдается образование доменной структры комплекса, которая представляет собой цепочку идентичных независимо вращающихся фрагментов комплекса, характеризующихся независимым вращением (ММ порядка 55 кДа в предположении сферической формы вращающихся фрагментов), в каждом из которых белок окружен участком ПЭ. Предполагаемая пространственная структура комплекса ОВА-пектин в условиях избытка ОВА представлена на рис. 19А.

Иная ситуация наблюдается при избытке пектина: величина ф10те возрастает до ~102 не, что отражает подвижность всего комплекса ОВА-пектин стехиометрического состава 1:1 М/М и общей ММ 165 кДа, в котором молекула белка конденсирует вокруг себя полиэлектролит. Предполагаемая пространственная структура комплекса ОВА-пектин в условиях избытка ОВА представлена рис. 19Б.

Рис. 19. Предполагаемые пространственные структуры комплексов ОВА-пектин: (А) в условиях избытка ОВА; (Б) при избытке пектина.

Адсорбция комплекса ОВА-пектин приводит к ограничению подвижности белка по сравнению с объемом раствора. Интересно отметить, что несмотря на существенную разницу в структуре комплексов в объеме раствора в условиях избытка или недостатка белка (корреляционные времена вращения, найденные для комплексов ОВА-пектин при соотношениях ОВА/пектин 10/1 и 1/10 равны, 28.1 и 101.7 не, соответственно), при адсорбции на поверхности характеристики вращательной

подвижности комплексов идентичны (величина ф10„8 в обоих случаях равна 10.8 не). Из анализа данных следует, что на поверхности формируется одна и та же характеристическая структура комплекса, в которой максимальная часть зарядов на ПЭ скомпенсирована за счет взаимодействия с белком. Способность к десорбции образовавшегося слаборастворимого «стехиометрического» белок-ПЭ комплекса снижается. В такой системе белок можно рассматривать как прочно иммобилизованный на поверхности вода-воздух. Образование жесткой конденсировашюй структуры белок-ПЭ комплекса, в котором белок практически неподвижен, существенно замедляет процессы обмена и установления равновесия между адсорбционным слоем и субфазой, что, по-видимому, является основной причиной наблюдаемого резкого снижения скорости адсорбции в присутствии пектина (рис. 17А). Наиболее ярко данный эффект проявляется при включении с систему этанола (10 об. %). За счет усиления электростатических взаимодействий фермента с ПЭ в системе вода-этанол структура комплекса становится более сконденсированная и жесткая по сравнению с водным раствором, что приводит к драмматическому увеличению "лаг-фазы" адсорбции от 25 минут до 3 часов (рис. 17Б).

Помимо влияния на адсорбционные свойства белка комплексообразование в свою очередь влияет также на адсорбционные свойства ПЭ. Так, свободный пектин не обладает поверхностной активностью, а взаимодействие с белком привадит к компенсации зарядов на ПЭ и образованию компактной структуры, что позволяет получать ПЭ-содержащие поверхностные слои, которые обладают совершенно особенными реологическими свойствами по сравнению со свойствами белковых пленок.

Таким образом, разработаны новые методы исследования структурно-динамических свойств белков адсорбированных на поверхности вода-воздух (ЕЯ-ТНБЛ, {'С5 и Ш^АБ). Показано, что применение комбинации этих методов открывает широкие возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции белков на флюидных поверхностях. С применением разработанных методов были детально исследованы молекулярные закономерности адсорбции белков и их комплексов на поверхности вода-воздух. Предложены возможные пути к рефляции адсорбционных свойств белков и реологических свойств поверхностного слоя.

Второй рассматриваемой модельной системой является система обращенных мицелл ПАВ. Мицеллярный подход является в настоящее время классическим методом контроля олигомерного состава ферментов. Применение системы обращенных мицелл позволяет путем подбора размера мицеллярной матрицы формировать желаемую надмолекулярную форму белка, проводить как ассоциацию белковых молекул, так и диссоциацию белковых комплексов.

Возможность целенаправленной регуляции олигомерного состава и мягкого воздействия на структуру фермента при солюбилизации в системе обращенных мицелл была реализована в работе при разработке нового подхода для проведения рефолдинга рекомбинантных ферментов, образующихся в виде тел включения. Сворачивание ферментов, получаемых в виде тел включения, представляет особый интерес, поскольку именно в таком виде получаются многие редкие, но практически значимые рекомбинантные белки в процессах генной инженерии. В настоящее время не

существует эффективного и универсального метода сворачивания и проблема восстановления активности ферментов образующихся в виде тел включения остается не решенной для большинства случаев. В настоящей работе на основе мицеллярного подхода был разработан новый метод для проведения рефолдинга ферментов, образующихся в виде тел включения. На примере ряда ферментов, галактозооксидаз ю различных источников, Fusgalox и Sagalox; а также альдонолактоноксидазы из Trypanosoma cruzi (TcGAL), была впервые продемонстрирована эффективность и универсальность предложенного метода. Рефолдинг тел включения исследованных в работе ферментов включал следующие стадии. (1) Растворение тел включения в 6М GuHCl с последующим удалением денатурирующего реагента методом равновесного диализа. Эта процедура позволяет улучшить качество суспензии тел включения для последующей солюбилизации в мицеллах. (2) Солюбилизация ре-суспензированного фермента в системе обращенных мицелл содержащей 0.4М АОТ при различных степенях гидратации (для оптимизации выхода активного фермента). Высокая концентрация АОТ (0.4М) обеспечивает возможность растворения большего количества фермента в пересчете на объем системы. (3) Разрушение ненативных и восстановление нативных S-S связен в белке осуществляли с использованием смеси окисленного и восстановленного глутатионов (GSSG и GSH в соотношении 1:3). Данная стадия является особенно важной в случае белков с высоким содержанием дисульфидных связей в молекуле, каковым является фермент TcGAL, содержащий 16 цистеиновых остатков. (4) Добавление кофактора для активации фермента (ФАД - в случае TcGAL и ионов меди - в случае Fusgalox и Sagalox). (5) Извлечение целевого белка из мицеллярной системы осаждением холодным ацетоном или переходя от мицеллярной системы к макродвухфазной (добавляя избыточную воду или водный раствор с высокой ионной силой), в которой целевой белок переходит в водную фазу.

Сворачивание Fusgalox в системе обращенных мицелл АОТ. Галактозооксидаза (Fusgalox), образуется, в зависимости от условий экспрессии, либо в виде тел включения, либо в растворимой и каталитически активной форме. Данный факт позволяет количественно контролировать

re

Рис. 20. Зависимость каталитической активности растворимой формы Fusgalox, Умах, от степени гидратации мицелл (\Уо) в 0.2 М АОТ в изооктане. Каталитическая активность при каждой степени гидратации была измерена в насыщающих конентрациях субстрата.

[Fusgalox] =10"'М.

15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40.00 45.00

каталитические параметры и эффективность процесса ренатурации фермента в системе обращенных мицелл. Зависимость каталитической активности растворимой формы Fusgalox от степени гидратации

-22-

мицелл представлена на рис. 20. Оптимумы каталитической активности Fusgalox в системе обращенных мицелл АОТ наблюдаются при степенях гидратации, w0, 21, 31-33 и 38-40, которые соответствуют мономерной, димерной и тетрамерной формам фермента, согласно результатам седиментационного анализа. Наибольшая активность в системе обращенных мицелл наблюдается при степени гидратации, Wo = 38-40, что соответствует тетрамерной форме фермента.

Внесение тел включения Fusgalox в систему обращенных мицелл АОТ оказалось эффективным для солюбилизации фермента и восстановления его каталитической функции. Наибольшая эффективность ренатурации тел включения Fusgalox наблюдалась в системе обращенных мицелл при степени гидратации 38, что соответствует тетрамерной форме фермента. При данной степени гидратации выход ренатурированного фермента относительно растворимой и полностью активированной формы Fusgalox в той же системе составляет 20-25%. Сворачивание тел включения альдонолактоноксидазы (TcGAL).

Мицеллярный подход оказался эффективным также при сворачивании тел включения рекомбинантного ФАД-зависимого фермента,TcGAL из Trypanosoma cruzi. Trypanosoma - род простейших вызывающих сонную болезнь и лейшманиозы, заболевания, широко распространенные в южных странах, где различными формами страдает около 100 миллионов человек. Переносчиком трипаносом является насекомые (африканская муха цеце). В настоящее время не существует адекватного лечения данных заболеваний, существующие препараты неэффективны и вызывают множество побочных эффектов. TcGAL является медицински значимым ферментом. Он каталитизирует финальную стадию в биосинтезе витамина С, выполняющего, в частности, антиоксидантную функцию в трипанасомах. Трипанасомы не способны усваивать аскорбат извне, и эффективное ингибирование TcGAL могло бы служить основой при разработке лекарств.

Экспрессия TcGAL в Е. coli приводит к образованию тел включения. Попытки восстановить каталитическую функции фермента с использованием различных методов, традиционно используемых для рефолдинга тел включения ферментов, не привели к успеху. Солюбилизация в системе обращенных мицелл АОТ позволила впервые получить рекомбинантный TcGAL в растворимой и каталитически активной форме. С целью

-23-

W.

W.

Рис.21. Зависимость каталитической активности TcGAL (А) от степени гидратации мицеллярной системы в реакции окисления 0-арабиноно-1,4-лактона (в присутствии 1,4-бензохинона) сравнении с АЮАЫЭН (Б).

в 4

а Е

оптимизировать и количественно оценить выход активного фермента была изучена зависимость каталитической активности TcGAL от степени гидратации системы. В качестве контроля использовали гомологичный флавофермент растительного происхождения, рекомбинантную галактонолакгон дегидрогеназу из Arabidopsis thaliana (AtGALDH), которая экспрессируется в Е. coli полностью в растворимой форме.

Из анализа зависимостей каталитической активности

ферментов TcGAL и AtGALDH от степени гидратации

(рис. 21) следует, что активность ренатурированного

фермента TcGAL составляет порядка 25% по отношению к

контрольной системе - высокоочищенному, полностью

активному ферменту AtGALDH. Для контроля

сворачивания вторичная структура TcGAL,

ренатурированного в системе обращенных мицелл, была

исследована методом КД спектроскопии. В качестве

контроля использовали AtGALDH в мицеллярной системе

и в водном растворе. Спектры TcGAL и AtGALDH имеют

сходные профили (рис. 22). Количественный анализ

спектров КД показал, что различие во вторичной

структуре TcGAL и AtGALDH минимально (Табл. 2).

Структура обоих ферментов характеризуется высоким

содержанием а-спиралей, что согласуется со

структурными свойствами ферментов семейства

ванилилалкогольоксидаз, к которым относятся TcGAL и

AtGALDH. Из анализа спектров КД и кинетических

данных следует вывод о правильном сворачивании TcGAL

в системе обращенных мицелл АОТ.

С точки зрения практического применения

мицеллярного подхода для ренатурации промышленно

значимых рекомбинантных ферментов важным фактором

является возможность экстракции ферментов свернутых

в мицеллярной системе в водную фазу. В данной работе

на примере TcGAL впервые была продемонстрирована

принципиальная возможность выделения активного

фермента из мицелярной системы в водную фазу с

сохранением каталитических параметров.

Таким образом, разработан принципиально новый

универсальный и эффективный подход для проведения

рефолдинга белков образующихся в виде тел включения.

Важным преимуществом мицеллярного подхода при ренатурации тел включения, является

-24-

% \ Б

\ ч

1 J ; J

т

220

240

260

220 248 260 Длина волны, нм

Рис. 22. Спектры КД TcGAL и А1САШН. (А) TcGAL в системе обращенных мицелл АОТ (0.04М); (Б) AtGALDH в системе обращенных мицелл АОТ (0.04М); (В) AtGALDH в водном растворе. Концентрация белка: 0.05-0.1 цМ.

возможности подбирать оптимальные условия сворачивания при варьировании степени гидратации системы, а также, изолировать молекулу фермента в отдельной мицелле. Это, с одной стороны, усиливает эффективность процесса сворачивания, а с другой стороны, защищает фермент от межмолекулярного взаимодействия, образования межмолекулярных Б-Б-связей и агрегации белка в процессе рефолдинга.

Таблица 2. Параметры вторичной структуры определенные из анализа КД спектров тел включения ТсвЛЬ солюбилизированных в системе обращенных мицелл АОТ в сравнении с контрольными системами: АЮАЫ)Н в водном буферном растворе и в системе обращенных мицелл (в присутствии и отсутствии ФАД). Условия эксперимента (см. подпись к рис. 22).

Элементы вторичной структуры ТсСА1. в мицеллах, % А(СА1Л)Н в буфере, % ЛЮАЬШ! в мицеллах, % АЮАЫШ + ФАД в мицеллах, %

а-спирали 33.1 (32.9- 35.6) 32.4 (30.9-32.5) 29.1 (28.2-30.3) 32.0(30.6-32.8)

Р-слои (антипар.) 8.6 (7.3-8.9) 8.1 (8.0-10.5) 12.8(11.8-12.9) 9.7 (8.1-9.7)

Р-слои (параллел.) 8.9(8.1-8.9) 9.1(8.6-9.1) 9.2 (9.2-9.4) 9.3 (9.2-9.4)

Р-повороты 16.6(16.2-16.8) ¡6.8(16.8-18.0) 17.9 (17.4-17.9) 16.9(16.9-17.8)

Петли 34.0(31.9-34.2) 35.4(31.4-35.6) 31.7(31.6-33.8) 31.8 (32.8-35.0)

Изучение роли межсубъединичного взаимодействия в функционировании олигомерных ферментов. «Мицеллярный подход» с его уникальной возможностью получать желаемую олигомерную форму ферментов был применен для изучения роли межсубъединичного взаимодействия в функционировании олигомерных ферментов, галактозооксидазы (р!еда1ох) и пара-гидроксибензоат гидроксилазы (РНВН). Впервые были получены олигомерные формы данных ферментов, не реализующиеся в водных растворах, и изучены их каталитические характеристики. РНВН - модельный флавофермент, катализирующий одну из стадий биодеградации лигнина. РНВН димер, состоящий из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит одну молекулу ФАД. В литературе общепринятой является гипотеза, что образование димера принципиально для проявления каталитических свойств РНВН. Однако, выделить мономерную форму фермента и изучить ее каталитические свойства до сих пор не удавалось из-за низкой константы диссоциации димера и быстрой инактивации мономера в водных растворах. В данной работе с применением системы обращенных мицелл ПАВ впервые удалось в мягких неденатурирующих условиях получить изолированную, полностью активную мономерную форму РНВН и охарактеризовать ее каталитические и структурные свойства. Зависимость каталитической активности от степени гидратации ПАВ в системе обращенных мицелл характеризуется двумя оптимумами при степенях гидратации 13 и 18 (рис. 23), которые соответствуют функционированию мономерной и димерной формы фермента согласно данным седиментационного анализа. Кинетические параметры (^са* и ^м для КАБРН и РОНВ), полученные в системе обращенных мицелл АОТ для димерной формы фермента соответствовали таковым, найденным для водного раствора (Табл. 4). При образовании мономерной формы РНВН в системе обращенных мицелл наблюдается 1.5-кратное уменьшение км и

-25-

30-кратное уменьшение значения Км для субстрата (РОНВ), что соответствует увеличению каталитической эффективности фермента (к^/Км) в 20 раз. Оказалось, что при образовании мономера каталитическая эффективность фермента не снижается, а увеличивается более чем на порядок за счет снижения Км. Аналогичная тенденция, снижение ксЛ и существенное уменьшение Км, была обнаружена при диссоциации димера РНВН в системе вода-ДМСО (Табл. 3), что указывает на то, что обнаруженные кинетические эффекты не связаны со специфическим влиянием мицеллярной матрицы на фермент.

706050-

¡

40

30-1

10 12

—г-14

-1-1—

16 18

wo

20 22

—I 24

Рис. 23. Зависимость каталитической активности РНВН от степени гидратации в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане. Условия эксперимента: 0.2М АОТ, 100 мМ Трис, рН 8.0, концентрации субстратов РОНВ и НАДФ варьировали от 20 до 400 мкМ для определения кинетических констант кш и Км.

Таблица 3. Кинетические параметры РНВН, определенные в водном растворе и в системе обращенных мицелл АОТ при степенях гидратации 13 и 18, соответствующих функционированию мономерной и димерной форм фермента, и в системе вода-ДМСО, содержащей 20 об. % v/v.

Система jr„NADPH АмРОНВ kcnt Олнгомерная

рМ ЦМ S1 форма

Водный раствор 37±5 18±3 61±3

(литературные данные) (23) (И) (57) димер

АОТ, Wo=13 52±10 0.6±0.1 45±2.5 мономер

АОТ, w0=18 25±4 25±4 63±4 димер

ДМСО, 20 об. % 60±10 10i2 30±2 мономер/димер

Для «визуализации» процесса образования мономера в системе вода-ДМСО вращательная динамика фермента была изучена методом TRFA. В данном методе основным определяемым параметром является корреляционное время вращения, которое прямо пропорционально молекулярной массе белка. Согласно этому, при диссоциации димера РНВН ожидается двухкратное уменьшение корреляционного времени вращения фермента. За флуоресценцией фермента следили по флуоресцентной метке (Alexa-488), а также по ФАД активного центра РНВН. Результаты анализа деполяризационных кривых ФАД-РНВН и Alexa-PHBH представлены в Таблице 5. Из таблицы следует, что при увеличении концентрации ДМСО в системе наблюдается постепенное снижение корреляционного времени вращения (как для ФАД-РНВН, так и в случае Alexa-PHBH), что свидетельствует об увеличении доли мономера в системе. Двухкратное снижение корреляционного времени вращения белка при концентрации ДМСО 30 и 40 об. % указывает на то, что фермент

присутствует в системе, как мономер. Комплементарная информация о диссоциации димера РНВН в системе вода-ДМСО была получена методом флуктуационной флуоресцентной спектроскопии (ФФС), который позволяет получать статистические кривые распределения флуорофоров в системе по их молекулярной интенсивности флуоресценции, Т|. Так как каждая из субъединиц фермента содержит по одной молекуле ФАД, при образовании мономера РНВН ожидается снижение параметра т] в два раза. В водном растворе фермент характеризуется молекулярной интенсивностью флуоресценции, т), равной 37.5 кГц/мол, что соответствует димерной форме РНВН. При переходе в систему, содержащую 30 и 40 об. % ДМСО, наблюдается снижение величины Т) до 22.7 кГц/мол, отражающее образование мономера. Общий статистический анализ полученных спектроскопических данных показал, что точка перегиба равновесия димер-мономер соответствует концентрации ДМСО -23 об. %. При данной концентрации ДМСО как мономерная, так и димерная форма проявляет каталитическую активность, что приводит к усредненному значению Км Для РОНВ, равному 10 )1М. При концентрации ДМСО 30 об. % и выше РНВН находится в форме мономера.

Таблица 4. Корреляционные времена вращения полученные методом ТЯРА и нормированные на относительную вязкость раствора ($,м//7) Для препаратов А1еха488-РНВН и ФАД-РНВН в системе вода-ДМСО. В скобках указан доверительный интервал значений {фрп>/т]).

ДМСО Относит. А1еха488- РНВН ФАД-РНВН

(об. %) вязкость, 1) фргс,1г}( не) /г) (не)

0 1 19.3 (16.2-22.3) 31.8 (30.1-33.6)

10 1.25 14.0 (11.4-18.4) 29.2 (27.5-31.0)

20 1.57 12.3 (9.8-16.7) 27.5 (26.0-29.1)

30 2.01 10.4 (7.8-13.3) 20.9 (19.9-22.0)

40 2.58 9.8 (7.7-12.9) 21.3 (16.3-25.2)

Для выяснения молекулярных причин наблюдаемых кинетических эффектов подробно изучены структурные свойства фермента в зависимости от олигомерного состава. Из анализа полученных данных следует, что механизм изменения каталитических параметров РНВН при образовании мономера, связан с конформационными перестройками в молекуле фермента при диссоциации димера, приводящими с одной стороны к изменению каталитических свойств, а с другой стороны - к инактивации мономерной формы в водном растворе и склонности к агрегации. Таким образом, в случае РНВН роль димера по-видимому, заключается в поддержании конформации фермента. Другими словами, в димерной молекуле РНВН каждая из субъединиц может рассматриваться как своего рода носитель для другой субъединицы.

Следует сказать, что это ие единственный пример, когда наибольшая активность в мицеллярной системе наблюдается для олигомерной формы фермента не реализующейся в водном растворе.

Например, для Fusgalox и GALDH также рассматриваемых в данной работе, максимальная активность в мицеллах наблюдалась для димерных форм, в то время как в водном растворе данные ферменты функционирует в виде мономера. Данный факт обращает на себя особое внимание, поскольку микроокружение ферментов в системе обращенных мицелл по своим физико-химическим характеристикам во многом сходно с внутриклеточной средой, которая, в свою очередь, существенно отличается от водного раствора. Неслучайно, мицеллярные системы в литературе часто рассматриваются как модель внутриклеточной среды. Возможно, в системах т vivo олигомерный состав многих ферментов также отличается от водного, а межсубъединичные взаимодействия здесь выполняют регуляторную функцию.

Влияние липидов на каталитическую активность мембранотропных ферментов (на примере кислой фосфатазы). В случае мембранотропных ферментов логично предположить, что регуляторную функцию может выполнять липидный состав биомембран. Для изучения возможных механизмов регуляции мембранотропных ферментов в биологических системах исследовали влияние природы липидов биомембран на каталитическую активность КФ, периферического мембранного фермента, функционирующего в природе в связанном с мембраной состоянии. Применение системы обращенных мицелл, является удобным и исключительно информативным подходом для проведения такого исследования: позволяет варьировать липидный состав мицеллярной матрицы путем получения смешанных мицелл; учитывать влияние химической природы липидов на каждую из олигомерных форм фермента, а также исследовать влияние структуры липида на мембранотропные свойства фермента, сродства фермента к мицеллярной матрице.

Профиль зависимости каталитической активности КФ от степени гидратации в исходной модельной системе обращенных мицелл АОТ характеризуется двумя оптимумами активности фермента при степенях гидратации 20 и 24 (рис. 24.)

Рис. 24. Зависимость каталитической активности КФ от степени гидратации ПАВ в системе обращенных мицелл 0,1 M АОТ в октане в отсутствии липидов (•); (А) - при включении кардиолипина: (■) - 5% и (о) 10%, г/г; (Б) - холестерина: (а) - 2,5%, (■) - 5% и (о) - 10%, г/г.

Седиментациошшй анализ мицеллярной системы показал, что при степени гидратации №0 = 20 фермент функционирует в виде мономера (48 кДа), а при И'о = 24 в виде димера (98 кДа). Обнаружено, что включение в систему обращенных мицелл АОТ липидов уже в минимальных количествах (от 1 до 5%), вызывает ряд значительных кинетических эффектов в функционировании КФ, и эти эффекты ключевым образом зависят от природы липидов. Так, в случае КЛ и ФХ наблюдается изменение уровня каталитической активности одной или обеих олигомерных форм фермента (рис. 24 и 25); при включении в систему ФХ (при концентрации 10% г/г) также наблюдается сдвиг оптимумов каталитической активности фермента в область более низких степеней гидратации (рис. 25А). а в случае ФИ - в область более высоких степеней гидратации (вис. 25Б). В случае ФЭ и холестерина каталитической активность фермента не зависит от степени гидратации.

ис0 IV»

Рис. 25. Зависимость каталитической активности КФ от степени гидратации ПАВ в системе обращенных мицелл 0,1 М АОТ в октане в отсутствии липидов (•); (А) - при включении ФХ: (■) -5% и (□) 10%, г/г, (Б) - ФИ: (о) - 2%, г/г.

Влияние липидов на эффективность взаимодействия фермента с мицеллярной матрицей. Тестом на мембраноактивность ферментов является чувствительность каталитической активности фермента к изменению концентрации ПАВ (которая определяет число мицелл и, соответственно, площадь поверхности раздела фаз в системе). Тангенс угла наклона зависимости активности фермента от концентрации ПАВ является количественной характеристикой степени сродства фермента к мицеллярной матрице. На рис. 26. представлены зависимости каталитической активности мономерной мономерной и димерной форм КФ от концентрации АОТ. Из рисунка следует, что как мономерная, так и димерная форма КФ обладают мембранотропными свойствами; степень сродства фермента к мицеллярной матрице для мономерной и димерной форм фермента различаются в два раза (Табл. 5). Найдено, что включение липидов в систему обращенных мицелл может оказывать как увеличение, так и уменьшение сродства фермента к мицеллярной матрице в зависимости от структуры липида. Данные по влиянию липидов на мембраноактивность КФ суммированы в Таблице 5.

а

в >

0,05 0,1 0,15 0,2 [АОТ], M

Рис. 26. Зависимость каталитической активности КФ от концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл АОТ при степенях гидратации, соответствующих функционированию мономерной (□) и димерной (■) формы фермента. 1 -значение активности КФ в водном буферном растворе.

В ФИ содержащих мицеллах, напротив, обнаружено снижение эффективности взаимодействия димерной фермы КФ с мицеллярной матрицей. В независимых экспериментах (на основе кинетических данных по влиянию ФИ на активность КФ в водном растворе, а также в экспериментах по тушению собственной флуоресценции КФ при взаимодествии с ФИ) было показано, что ФИ образует комплекс с КФ. Таким образом, снижение мембраноактивности КФ в присутствии ФИ объясняется экранированием участков связывания фермента с мембраной (углеводных остатков КФ, ответственных за мембраноактивные свойства фермента) при комплексообразовании с ФИ.

Таблица 5. Мембраноактивные свойства кислой фосфатазы.

Система Сродство к мицеллярной матрице, МЕ/М

Мономер Димер

Мицеллы АОТ 36 74

Мицеллы +10% кардиолипин 36 76

Мицеллы + 10% холестерин 80 -

Мицеллы +10% фосфатидилинозит 36 53

Влияние структуры липидов на мембранотропные свойства КФ подтверждается также методом флуоресцентной анизотропии. Значительное увеличение анизотропии, наблюдаемое при солюбклизации фермента в системе обращенных мицелл АОТ (от 0.112±0.006 до 0.141±0.005) указывает на ограничение молекулярной подвижности фермента за счет связывания с мицеллярной матрицей. Увеличение анизотропии в смешанных мицеллах кореллирует со степенью сродства фермента к мицеллярной матрице. Так, при введении в систему холестерина (10 % г/г) увеличение сродства к мицеллярной матрице сопровождается увеличением флуоресцентной анизотропии в системе (от 0.141±0.005 до 0.163±0.008). И напротив, в случае, если присутствие липида не оказывает влияния на мембранную активность КФ (при содержании холестерина 2.5 %), анизотропия также остается неизменной по сравнению с исходной системой АОТ. Таким образом, полученные

-30-

результаты позволяют сделать вывод о том, что мембраноактивность КФ чувствительна к липидному составу матрицы.

Влияние липидного состава па вторичную структуру КФ в системе обращенных мицелл было изучено методом КД спектроскопии. Обнаружено, что солюбилизация фермента в системе обращенных мицелл приводит к изменениям во вторичной структуре белка: наблюдается возрастание содержания р - структурных областей и уменьшение а - спиральных (Табл. 6). Включение липидов в мицеллярную систему оказывает влияние на вторичную структуру КФ в зависимости от природы липида и олигомерного олигомерного состава фермента. Так, при включении в систему обращенных мицелл КЛ. вторичная структура димепной формы не изменяется, а для мономерной формы наблюдается уменьшение содержания а - спиралей и увеличение содержания Р - структур по сравнению с системой АОТ. Найденные структурные изменения могут являться причиной двухкратного увеличения каталитической активности мономерной формы КФ в присутствии КЛ в системе обращенных мицелл (рис. 24).

Таблица 6. Содержание элементов вторичной структуры КФ в водном буферном растворе и в системе обращенных мицелл АОТ в присутствии и отсутствии липидов.

Система »0 Содержание вторичных структур %

а-спирали 3-структуры

Водный раствор - 10,1 (9.7-10.4). 33,1 (33.0-34.2)

Мицеллы АОТ 20 (Мономер) 8,6 35,7

Мицеллы АОТ 24 (Димер) 8,7 35,2

Мицеллы + 5% кардиолипин 20 (Мономер) 7,9 36,8

Мицеллы + 5% кардиолипин 24 (Димер) 8,8 34,9

Мицеллы + 10% холестерин 20-24 (Мономер) 9,6 33,7

В случае холестерин-содержащих мицелл, вторичная структура фермента при степенях гидратации, 1¥а=20 и 24 (обе соответствуют функционированию мономерной формы фермента) практически не различается по сравнению с водным раствором (Табл. 6). Оказалось, что в данной системе взаимодействие с мицеллярной матрицей не оказывает влияние на структуру фермента. По-видимому, при включении в систему холестерина, липид взаимодействует с мицеллой, увеличивая жесткость мицеллярной матрицы, что затрудняет выполнение принципа геометрического соответствия внутренней полости мицелл и фермента необходимого для существования оптимумов. В результате чего активность фермента не зависит от степени гидратации.

Таким образом, на примере КФ показано, что липидный состав матрицы играет ключевую роль в функционировании мембранотропных ферментов. Обнаружено, что включение в мицеллярную систему липидов, в зависимости от структуры, может влиять на конформацию, олигомерный состав фермента, а также на сродство фермента к мицеллярной матрице, что является причиной влияния

липидного состава на каталитические свойства КФ. Показано, что наблюдаемые кинетические эффекты могут быть вызваны как влиянием липидов на структуру и свойства мицелл, так и являться следствием белок-липидных взаимодействий.

Третьей рассматриваемой модельной системой, в которой изучали функционирование ферментов в составе надмолекулярных структур, являются водно-органические среды. Также как в случае систем обращенных мицелл ПАВ, применение водно-органических сред позволяет в широких пределах варьировать условия функционирования ферментов, а также силу и характер взаимодействий компонентов в фермент-содержащих комплексах. Если в мицеллярных системах это достигается за счет изменения размера внутренней полости мицелл, то в водно-органических смесях -за счет изменения полярности среды, что будет влиять в первую очередь на электростатические взаимодействия в фермент-содержащих комплексах. В связи с вышесказанным, для регуляции каталитических свойств ферментов в водно-органических средах перспективным подходом является образование фермент-полиэлектролитных комплексов электростатической природы. Влияние комплексообразования с ПЭ на каталитическую активность ферментов в водно-органических смесях. Каталитические свойства фермент-ПЭ комплексов в водно-органических средах были изучены для широкого круга систем: ферментов различных классов и ПЭ различной структуры (Таблица 8). Структурные формулы используемых в работе ПЭ представлены в Таблице 9.

Таблица 8. Состав систем, содержащих комплекс ферментов с ПЭ.

Фермент ПЭ фермент/ПЭ, г/г Субстрат

ХТ ПБ 1/1 - 10/1 БТНА, БТЭЭ, МиТМАС

ХТ Хитозан, ПЭИ, ПВП 1/2,8 БТНА

ХТ ПАК, ПМА, гепарин 1/1-32/1 БТНА

пир-ХТ ПБ, ОА, ПМА, ПАК 1/2,8 БТНА, БТЭЭ, М1ЯМАС

ХТ ОА 1/2,8-1/50 БТНА

Трипсин ПБ, ПАК 1/2,8 БАНА, БТНА

ПРХ нативная ПБ, гепарин 1/6,5 Пирогаллол

ПРХ рекомбинантная ПБ, гепарин 1/4,0 Пирогаллол

Лизоцим ПБ, ОА 1/4,0 М. и$ос]е~1сПсш

Щелочная протеаза Хитозан, ПБ, ПАК 1/2,8-45/1 Азоказеин

Целлюлазы Хитозан, ПБ, ПАК 1/2,8-45/1 КМЦ

Таблица 9. Структурные формулы используемых в работе полнэлектролитов.

Название ПЭ Формула MM, кДа

Полибрен (ПБ) (3,6-ионен) (—(СНа)з— g—(СЮ«-В? ВТ0 6,5

N-ашшлированиый поли(4-винилпиридин) (ПВП) t—СНг-СН-1ж £ e Bt 120

Полиакриловая Кислота (ПАК) сн2—(|;н J n COOH 20,30, 240

Полиметакр иловая Кислота (ГМА) CH3 [— CH-C—jn COOH 300

Пектин COOCH, coo- 120

Гепарин COOH Cn:SOjn OSOJH NHSOjH 7

Хитозап (Cht) CH,OH (on / u ноу 1/ 'NH. t'H.OH NIL, CH.OH ( Ann /">011 SR 1 - (Cht-1), 20-90 (Cht-2) 60-200 (Cht-3)

Спермин (sp) NH2-(CH2)4-NH2

Спермидин (smd) NH2-(CH2)3-NH4CH2)4-NH2

Путресцин (put) NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2

Наиболее подробно изучены свойства комплекса ХТ с полибреном (ПБ). Было найдено, что образование комплексов с ПБ приводит к стабилизации фермента в водно-органических средах. Существенно расширяется интервал концентраций растворителя (на 30-40 об. %), в котором фермент сохраняет каталитическую активность, как было обнаружено для широкого круга растворителей (этанол, 1,4-диоксана, ДМФ, ДМСО). Неожиданным результатом является существенная активация ХТ: при концентрациях органических растворителей 10-30 об. % ХТ-ПБ в 5-7 раз более активен, чем в водном растворе (рис. 27).

Рис. 27. Зависимость каталитической активности ХТ в комплексе с ПБ (1) и свободного ХТ от концентрации органических растворителей в реакции гидролиза БТНА.

Изучены факторы, определяющие наличие и величину кинетических эффектов комплексообразования.

1. Влияние структуры ПЭ (знака заряда на ПЭ; длины цепи ПЭ);

2. Влияние специфики фермента (структуры и функции);

3. Влияние числа электростатических контактов фермента с ПЭ;

4. Влияние природы субстрата: (наличие заряда на субстрате; степени полимеризации субстрата);

5. Влияние ионной силы раствора;

6. Влияние стехиометрического соотношения фермент-ПЭ.

Были обнаружены следующие общие закономерности: стабилизационный эффект при взаимодействии фермента с ПЭ был обнаружен для всех изученных систем, для ферментов различных классов независимо от класса растворителя, знака заряда и структуры ПЭ. Так, стабилизационный эффект наблюдался как в случае гидролитических ферментов, ХТ (рис. 26), трипсина, лизоцима, так и в случае окислительно-восстановительных ферментов, рекомбинантной пероксидазы хрена (рис. 28).

16

1

о

О -1-1-1-

О 20 40 60

изо-Лропанол, об.%

0 20 40 60 >0 100

шо-Лропанолб об.%

10 100

Рис. 28. Зависимость каталитической активности ПРХ в реакции окисления пирогаллола пероксидом водорода от концентрации юопроганола в смеси с водой. А - нативная ПРХ, Б - рекомбинантная ПРХ. 1 - свободный фермент, 2 - ПРХ-ПБ, 3 - ПРХ-гепарин. [Е] = 1 нМ.

Знак заряда на ПЭ также не влияет на кинетические эффекты. Так, активационный и стабилизационный эффекты (близкие по величине) наблюдались в системе вода-этанол как при комплексообразовании ХТ с поликатионом (ПБ), так и с полианионом (ПАК) (рис. 29).

О 20 40 60 80 100 Концентрация этанола, об.%

Величина стабилизационного и активационного эффектов при комплексообразовании с ПЭ проявляет ярко выраженную зависимость от числа электростатических контактов ПЭ с поверхностью фермента.

0.5

0.0

Рис. 29. Зависимость каталитической активности ХТ, включенного в комплекс с ПБ (кривая 1), с ПАК (кривая 2) и свободного ХТ (кривая 3) в реакции гидролиза БТНА от концентрации этанола. [ХТ] = 1 мкМ.

Этанол, об. % Этанол, об. %

Рис. 30. Зависимости каталитической активности препаратов ХТ в реакции гидролиза БТНА от концентрации этанола в водно-органической системе. А: 1 - ХТ; 2 - пир-ХТ; 3 - ХТ-ПБ; 4 - пир-ХТ-ПБ. Б: 1 - ХТ; 2 - пир-ХТ; 3 - ХТ-СП; 4 - пир-ХТ-СП. Концентрация фермента в системе Ю^М.

Так, увеличение числа отрицательных зарядов на поверхности ХТ при ковалентной модификации пиромеллитовым или янтарным ангидридом, приводит к существенному увеличению активационного и стабилизационного эффектов при комплексообразовании с поликатионами, что показано для поликатионов различной структуры, длинноцепочечного ПБ (рис. ЗОА) и короткоцепочечных ОА (рис. ЗОБ). Детально изучено влияния числа возможных электростатических контактов фермента с ПЭ на каждый из кинетических эффектов комплесообразования (активационный эффект, стабилизационный эффект и увеличение уровня остаточной активности фермента). Были получены корелляции между уровнем каталитической активности ХТ в комплексе с ПБ и числом зарядов введенных на поверхность фермента при концентрациях этанола 20, 50 и 90 об. %, где соответствующие кинетические эффекты выражены наибольшим образом (рис. 31). В качестве сравнения приведены аналогичные зависимости для соответствующих модифицированных препаратов ХТ в отсутствии ПБ (рис. 31, кривые 1). Из рисунка следует, что максимальные величины кинетических эффектов для всех концентраций этанола достигаются при образовании комплекса ПЭ с препаратом фермента, в котором плотность отрицательных зарядов на поверхности максимальна. В результате применения комбинации методов ковалентной модификации и комплексообразования с ПЭ, был получен биокатализатор, способный сохранять высокий уровень каталитической активности (не менее 80% от исходного) практически во всем интервале концентраций этанола от 0 до 98 об. %. Полученные результаты открывают новые перспективы применения стабилизированных ферментных преператов в биотехнологии.

NN N

Рис. 31. Зависимости каталитической активности ХТ в реакции гидролиза БТНА от числа введенных при модификации карбоксильных групп. Концентрации этанола в системе: А - 20 об.%; Б - 50 об.%; В - 90 об.%. о - ХТ; - янту- ХТ; Д - ииргХТ; V - пирц-ХТ. 1 - нативный и модифицированные препараты ХТ в свободной форме; 2 - нативный и модифицированные препараты ХТ в комплексе с ПБ.

Для выяснения молекулярных механизмов влияния комплексообразования с ПЭ на каталитические свойства ферментов в водно-органических смесях исследовали термодинамические характеристики и структурные свойства ферментов в комплексе методом равновесного диализа (при изучении комплексов белков с низкомолекулярными ОА), методами тушения флуоресценции и флуоресцентной анизотропии. С применением данных методов было установлено, что константы диссоциации (Ко) изученных фермент-ПЭ комплексов составляют 1-10 мкМ в зависимости от структуры фермента и ПЭ. Например, константы диссоциации комплекса ХТ-ПМА в системе вода-этанол определяли методом стационарной флуоресцентной анизотропии. Метод основан на том, что при взаимодействии с белками происходит структурирование ПЭ, приводящее к увеличению анизотропии (рис. 32). За флуоресцентной анизотропией следили по флуоресцентной метке, пирену, ковалентно пришитой к ПМА. Было найдено, что эффективное значение Ко комплекса ХТ-ПМА в водном растворе составляет 6±2 мкМ (рис. 32Б).

40 50 60 Этанол, об. *А

0.16 - Б растворимый комплекс ХТ-ПМА —

0.12

$ /♦

0.04 */ нерастворимый / комплекс ХТ-ПМА

> 5 10 15 1ХП.11М 20

Рис. 32. (А): Зависимость флуоресцентной анизотропии пирен-ПМА в комплексе с ХТ при различных соотношениях ХТ/ПМА от концентрации этанола в системе; (Б): Определение константы диссоциации комплекса ХТ-ПМА в водном растворе из анализа зависимости флуоресцентной анизотропии от концентрации ХТ. Длина волны возбуждения 340 нм.

В водно-этанольной смеси константа диссоциации комплекса снижается по мере увеличения концентрации этанола за счет усиления электростатических взаимодействий в комплексе. Вследствие этих же причин, существенно отличается и стехиометрический состав комплексов при переходе от водного раствора к водно-органическим смесям. Так, из анализа данных полученных методом равновесного диализа для комплексов ХТ-ОА (где в качестве OA использовали путресцин, спермидин и спермин, содержащие соответственно 2, 3 и 4 аминогруппы на молекулу) было установлено, что при переходе в 20% этаноле число молекул OA, связанных с ферментом, увеличивается в 1.5-2 раза (в зависимости от OA) по сравнению с водным раствором (Табл. 9).

Таблица 9. Константы диссоциации и стехиометрический состав комплексов ХТ-ОА определенные методом равновесного диализа в водном растворе и в системе, содержащей 20 об. % этанола.

Комплекс Водный раствор Этанол 20 об. %

KD, Ю-8М Стехиометрия ОА:ХТ KD*10-8M Стехиометрия ОА:ХТ

ХТ-спермин 6±2 7,8(±0,5): 1 2±1 13,1(±0,6):1

ХТ-спермидин 13+2 4,9(±0,7): 1 4±1 7,6(±0,8): 1

ХТ-путресцин 25±4 1,8(±0,3):1 18+2 5,3(10,5): 1

Установление пространственной структуры фермент-ПЭ компчексов позволило получить детальную информацию о молекулярных механизмах, лежащих в основе влияния комплексообразования с ПЭ, на каталитические свойства ферментов. Так, при изучении молекулярной подвижности комплексов ХТ с ПМА методом Т^А было обнаружено, что при взаимодействии ХТ с ПМА (ММ ЗООкДа) происходит образование компактной упорядоченной структуры комплекса. Аналогичные структуры были обнаружены при взаимодействии другой белок-ПЭ пары, ОБА с пектином. Обнаружено, что в избытке ПЭ взаимодействие с белком приводит к структурированию молекулы ПМА вокруг молекулы белка (рис. 33).

Времена вращения ХТ-ПМА

П

169 .. ®93 Время,

Структура ХТ-ИМА

Рис. 33. Предполагаемая пространственная структура комплекса ХТ-ПМА при соотношении ХТ/ПМА=1/1. Указаны корреляционные времена вращения

независимо вращающихся фрагментов комплекса, полученные методом Т^А.

Вращательная подвижность ХТ-ПМА в избытке ПЭ

НС

ММ- 150 к.'1а

ММ вращающегося фрагмента комплекса составляет 150 кДа, что означает, что в образование

компактной структуры комплекса вовлечена только часть молекулы ПМА (примерно 50%).

Оставшаяся часть молекулы ПМА не связана с ферментов и проявляет свободное вращение. Фермент

-38-

сохраняет также независимую вращательную подвижность в составе комплекса, которая ограничена по сравнению со ферментом, не включенным в комплекс (величины корреляционного времени вращения, фбравны соответственно 16 и 12 не).

При увеличении соотношения фермент-ПЭ к системе (ХТ/ПМА=4/1) наблюдается образование доменной пространственной структуры комплекса, состоящей из нескольких идентичных сегментов с независимым вращением, в каждом из которых белок окружен участком ПЭ. Корреляционное время вращения сегментов <р5ср11 =59 не, что соответствует ММ =100 кДа. Предполагаемая пространственная структура комплекса при соотношении ХТ/ПМА=4/1 представлена на рис. 34.

При «насыщении» ПЭ белком (ХТ/ПМА= 10/1) наблюдается образование общей компактной глобуло-подобной структуры комплекса (рис. 35), что проявляется в появлении вращательного движения комплекса как целой частицы (ф=278 не, что соответствует ММ=550-600 кДа).

Времена вращения ХТ-ПМА: общее вращение комплекса

0,1

0,08 0,06 0.04 0,02

ф1 И ф2

1

28,7 778

Время, не

ММ = 600 кДа

Рис. 35. Предполагаемая пространственная структура комплекса ХТ-ПМА при соотношении ХТ/ПМА=10/1. Указаны корреляционные времена вращения независимо вращающихся фрагментов комплекса, полученные

методом ТИР А.

Переход в систему вода-этанол приводит к образованию более конденсированной и «жесткой» структуры комплекса. Следует заметить, что уменьшение подвижности фермента, как общей, так и внутренней, в системе вода-этанол кореллирует с каталитической активностью фермента. Лктивационный эффект. Обнаружено, что в системе, содержащей 20% этанола, наблюдается максимально ограниченная подвижность комплекса как внутренняя, так и общая (корреляционное время вращение всего комплекса и его отдельных сегментов увеличивается вдвое по сравнению с

водным раствором). Именно при этой концентрации этанола наблюдается 5-6 кратный активационный эффект при комплексообразовании ХТ с ПЭ (рис. 25). Наиболее вероятно, что в случае ХТ активационный эффект связан с тем, что в результате образования комплекса «заморожена» каталитически активная конформация фермента. Это вызывает увеличение эффективности обобщенного нуклеофила в активном центре ХТ (А8рЮ2...Н1857...5ег195) за счет сближения и пространственной фиксации функциональных групп. Подтверждением предложенной гипотезы является тот факт, что активационный эффект при взаимодействии ХТ с ПЭ наблюдается только в случае субстратов, для которых скорость-лимитирующей стадией является нуклеофильная атака с образованием ацилфермента.

Стабилизационный эффект. Образование компактной и упорядоченной структуры фермент-ПЭ комплекса, является, по-видимому, также основной причиной стабилизации ферментов в водно-органических системах. Так, методом флуоресцентной спектроскопии было изучено влияние комплексообразования с ПЭ на конформацию фермента и состояние активного центра ХТ в водно-органических средах. За конформацией ХТ следили по собственной флуоресценции фермента. Для слежения за состоянии активного центра фермента в водно-органической системе использовали фермент, модифицированный по активному центру антранильной меткой (А-ХТ). Для комплексов ХТ с ПЭ различной структуры (ПБ, ПМА, ПА) методом флуоресценции было установлено, что в комплексе с ПЭ конформация белка стабилизирована и активный центр фермента экранирован от контакта с органическим растворителем, благодаря чему высокий уровень активности фермента сохраняется в более широком интервале концентраций органических растворителей (на 20-30 об. %). Методом КД спектроскопии для комплексов ХТ с ПЭ различного состава (ХТ-ПБ и пир-ХТ-ПБ, ХТ-ПМА, ХТ-ОА), было установлено, что взаимодействие с ПЭ приводит к стабилизации вторичной структуры фермента в водно-органических системах. Например, изменения во вторичной структуре в случае нативного ХТ наблюдается при 30% этанола, в то время как денатурация белка в комплексе с ПМА наблюдается при концентрации этанола 70% (рис. 36).

Рис. 36. Спектры кругового дихроизма в дальней УФ области свободного ХТ (а) и ХТ в комплексе с ПМА (б) в системе вода-этанол. Соотношение ХТ-ПМА по весу 4/1. Концентрации этанола, об. %. а: 1- 0; 2- 20; 3-30; 4- 50. б: 1- 0; 2- 20; 3-50; 4-70. [ХТ] = 4 мкМ.

Влияние комплексообразования па агрегацию фермента. Образование компактной структуры комплекса, в которой молекулы белка пространственно разделены друг от друга участками полиэлектролитной цепи, подавляет агрегационные процессы, как показано методом стационарной флуоресцентной анизотропии. За агрегацией фермента следили по увеличению флуоресцентной анизотропии за счет увеличения гидродинамического объема частиц. Так, было найдено, что агрегация свободного XT в системе вода-этанол наблюдается при концентрациях этанола выше 25%; в комплексе с ПМА агрегация наблюдается при концентрациях этанола выше 60 об. %.

В целом, образование комплексов с ПЭ можно рассматривать как эффективный и универсальный метод контроля функциональных свойств ферментов и белков перспективный для применения в биотехнологии.

Применимость метода образования фермент-ПЭ для решения практических задач была продемонстрирована на примере стабилизации гидролитических ферментов (щелочной протеазы из Bacillus licheniformis и ферментов целлюлазного комплекса из Chrysosporium lucknovense) при их использовании в составе CMC. Для данных систем в качестве ПЭ использовали поликатион природного происхождения - хитозан. Хитозан - биосовместимый, биодеградируемый и экологически безопасный ПЭ; используется в качестве носителя для пищевых добавок, а также в качестве компонентов косметических и лекарственных средств.

Обнаружено, что взаимодействие с хитозаном существенно стабилизирует оба фермента в условиях моделирующих процесс стирки (повышенные температуры, щелочная область pH 10 и присутствие анионных ПАВ): уровень остаточной активности, наблюдаемый при температуре 55— 60°С, увеличивается в 1.5-2 раза (рис. 36). Помимо стабилизации в присутствии хитозана наблюдается также увеличение уровня начальной активности ферментов: на 30-40%. Общий эффект повышения каталитической активности ферментов, учитывая как увеличение уровня начальной активности фермента, так и стабилизационный эффект, составляет 50-60%.

Рис. 37. Влияние хитозана на термоинактивацию препаратов ЩП (А) и целлюлазы (Б) в условиях моделирующих процесс стирки: 60°С, pH 10 в присутствии 0.1% LAS и 1 мМ СаС1;. Соотношение фермент-хитозан в системе (моль/моль) - 1:0 (7); 1:1 (2); 1:5(3); 1:25 (4); 1:125(5).

Таким образом, использование хитозана в качестве стабилизирующей добавки могло бы позволить снизить количество используемого в CMC ферментных преператов (как ЩП, так и Ц) в 2 раза, что важно с точки зрения безопасности использования фермент-содержащих CMC.

Следует отметить, что в случае целлюлазы термоинактивационные кривые в присутствии хитозана имеют необычный вид: в течение 60 минут фермент эффективно стабилизируется хитозаном (остаточная активность фермента составляет 95%), после чего наблюдается резкий спад активности фермента. Методом хроматографического анализа было найдено, с течением времени происходит деструкция хитозана под действием ферментов (эндоглюканаз) целлюлазного комплекса (рис. 37), что обуславливает резкий спад активности фермента. Способность хитозана к ферментативной деструкции может быть использована для регуляции эффекта стабилизации во времени. Варьируя ММР хитозана и содержание протеиназ в смеси можно добиваться управляемой инактивации целлюлаз и целенаправленного их исключения из реакционной системы.

Причинами стабилизации ферментов при взаимодействии с хитозаном являются закрепление конформации фермента и защита от агрегации (как было показано для широкого круга ПЭ). Важным свойством хитозана является также способность экранировать фермент от контакта с протеазами. Способность хитозана предотвращать протеолиз фермента особенно важна с точки зрения его применения в качестве стабилизирующей добавки в CMC-системах, поскольку в состав CMC, помимо других гидролитических ферментов, входят высокоактивные протеазы.

РИ,

отн.ед.

Рис.' 38. Изменение ММР хитозана (ММ 1 кДа) при инкубировании в присутствии ферментного препарата целлюлазы и 1 мМ СаС12, температура 60°С. Е/Ш=1: 5 моль/моль. Инкубация смеси в течение 30 (2), 60 (3), 90 мин (4). 1 -без инкубации.

6000 ЭМО 590 342 214 ММ, Да

выводы

1. Впервые разработаны подходы, позволяющие исследовать структурно-динамические свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз (вода-воздух) в режиме реального времени. Данные подходы основаны на применении микроспектроскопических методов: разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии и инфракрасной спектроскопии в режиме внешнего отражения, соответственно ER-TRFA и IRRAS. Для получения информации о диффузионных свойствах белков на поверхности раздела фаз впервые адаптирован и применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Для интерпретации данных, полученных микроспектроскопическими методами в режиме внешнего отражения (ER-TRFA и IRRAS), разработаны методы спектральной симуляции, позволяющие получать количественную информацию о свойствах адсорбированных на поверхности вода-воздух белков (концентрации, конформации, степени агрегации, молекулярной подвижности).

2. Впервые продемонстрировано, что методы ER-TRFA, IRRAS, FCS, являются высокочувствительными и исключительно информативными при изучении свойств белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. С применением комбинации данных методов впервые получена детальная количественная информация о распределении белка в поверхностном слое, кинетике адсорбции, а также о структурно-динамических свойствах белков адсорбированных на поверхности вода-воздух на примере овальбумина и р-лакгоглобулина. Показано, что применение комбинации методов ER-TRFA, FCS и IRRAS открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции биополимеров и их комплексов на поверхностях раздела фаз.

3. Разработаны подходы для регуляции поверхностно-активных свойств белков и реологических свойств белковых пленок. Установлено, что поверхностную активность белков можно целенаправленно регулировать, изменяя их степень агрегации; включая в комплекс с полиэлектролитами и варьируя физико-химические свойства среды.

4. Предложен новый подход для изучения влияния липидного состава матрицы на функционирование мембранотропных ферментов, оспованный на применении системы обращенных мицелл ПАВ. Преимуществами данного подхода являются возможность варьировать липидный состав мицеллярной матрицы путем получения смешанных мицелл; учитывать влияние химической природы лшшдов на каждую из олигомерных форм фермента, а также исследовать влияние структуры липида на мембранотропные свойства фермента. С применением мицеллярного подхода впервые было продемонстрировано на примере периферического мембранного фермента, кислой фосфатазы, что химический состав липидной матрицы играет ключевую роль в функционировании мембранотропных ферментов.

5. С применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ, позволяющей целенаправленно регулировать олигомерный состав ферментов, изучена роль межсубъединичного взаимодействия в функционировании олигомерных ферментов на примере п-гидроксибензоат гидроксилазы (РНВН) и галактозооксидазы (Fusgalox). Впервые получены полностью активные олигомерные формы данных ферментов, не реализующиеся в водных растворах (мономерная и тетрамерная, соответственно), и изучены их каталитические и структурные свойства. На основе анализа полученных данных выдвинута гипотеза, что в системах in vivo олигомерный состав многих ферментов также отличается от водного, а межсубьединичные взаимодействия в таких системах играют ключевую роль в регуляторных процессах.

6. На оспове "мицеллярного подхода" разработан принципиально новый эффективный и универсальный метод рефолдинга рекомбинантных ферментов, образующихся в виде тел включения. На примере рекомбинантных белков, галактозооксидазы (Fusgalox) и галактонолактон оксидазы (TcGAL) продемонстрировано, что солюбилизация в системе обращенных мицелл ПАВ позволяет проводить диссоциацию тел включения и восстанавливать каталитическую активность ферментов с выходом порядка 20-30%.

7. Систематически исследованы возможности различных методов регуляции свойств ферментов в водно-органических системах. Установлено, что одним из наиболее эффективных и технологичных методов регуляции каталитических свойств ферментов в неводных средах является образование фермент-полиэлектролитных комплексов. Исследованы молекулярные механизмы влияния ПЭ на функционирование ферментов. Впервые установлена пространственная структура фермент-ПЭ комплексов в водно-органических смесях с применением метода разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии на примере комплексов а-химотрипсина с полиметакриловой кислотой. Найдено, что взаимодействие белков с ПЭ приводит к образованию компактной двухуровневой структуры комплекса: внутренней — доменной и общей — глобулоподобной. Показано, что образование компактной регулярной структуры комплексов лежит в основе механизма регуляции свойств ферментов при комплексообразовании с ПЭ: стабилизации вторичной и третичной структуры фермента; акшвационного эффекта; предотвращения агрегационных процессов.

8. Продемонстрировано, что метод образования белок-полиэлектролитных комплексов применим для решения широкого спектра практических задач, в том числе, для стабилизации ферментов в водно-органических средах или других денатурирующих условиях. Так, на основе образования комплексов с природным поликатионом, хитозаном, разработан новый подход к стабилизации гидролитических ферментов, щелочной протеазы и целлюлазы, при их использовании в составе синтетических моющих средств.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Е.В. Кудряшова, И.О. Васильева, И.Н. Зоров, Л.П. Синицын, A.B. Левашов. Стабилизация щелочной протеиназы и целлюлаз комплексообразовапием с хитозаном для применения в составе синтетических моющих средств. Биоорганическая химия. 2009. 35(3) с. 1-8.

2. Е.В. Кудряшова, BJI. Бронза, A.B. Левашов. Влияние липидов на каталитическую активность кислой фосфатазы в системе обращенных мицелл. Биохимия. 2009. 74(3) с. 420 -428.

3. E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser, WJ.H. van Berkel. Monomer formation and ftmctioning of p-hydroxybenzoatc hydroxylase in reverse micelles and in dimethylsulfoxide-water mixtures. ChemBiochem. 2008,9(3). 413-419.

4. E.V. Kudryashova, H.H.J. de Jongh. Modulation of the adsorption properties of the complex of egg white ovalbumin with pectin by the dielcctric constant. J. Coll. Int. Sei. 2007. 318(2). 430439.

5. E.V. Kudryashova, AJ.W.G. Visscr, A. Hoek, H.H.J. de Jongh. Molecular details of ovalbumin-pectin complexes at the air/water interface: a spectroscopic study. Langmuir. 2007. 23(15). 79427950.

6. E.V. Kudryashova, AJ.W.G. Visser, H.H.J, de Jongh. Reversible self-association of ovalbumin at air-water interfaces and the consequences for the exerted surface pressure. 2005. Protein Science. 14(2). 483-493.

7. H.HJ. de Jongh, H.A. Kosters, E.V. Kudryashova, M.B.J. Meindcrs, D. TroCmova, P.A. Wierenga. Protein adsorption at air-water interface: a combination of details. 2004. Biopolymers. 74.131-135.

8. E.V. Kudryashova, AJ.W.G. Visser, A.V. Levashov. Stabilization of a-chymotiypsin by formation of quasi-regular compact structure of enzyme-polyclcctrolyte complexes. 2004. Article in Proceedings. The International Symposium "Highly-Organized catalytic systems". Moscow. 2004.

9. E.V. Kudryashova, M.BJ. Meindcrs, AJ.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J. de Jongh. Structural properties and rotational dynamics of egg white ovalbumin adsorbed at the air/water interface. 2003. Eur. Biophys. J, 32.553-562.

10. E.V. Kudryashova, T.A. Artemova, A.A. Vinogradov, A.K. Gladilin, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Stabilization and activation of ot-cbymotrypsin in water-organic solvent systems by complex formation with oligoamines. 2003. Protein Eng. 16 (4). 303-309.

11. A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov, W.M.A.M. van Dongen. Solubilization and refolding of inclusion body proteins in reverse micelles. Analytical Biochemistry. 2003. 320. 234-238.

12. E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Levashov. Белки (ферменты) в надмолекулярных ансамблях: исследование структурной организации методом разрешенно-временной анизотропии. Успехи Биол. Химии. 2002.42.257-294.

13. A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, V.Ya. Grinberg, N.V. Grinberg, T.V. Burova, A.V. Levashov. The chemical modification of a-chymotrypsin with both hydrophobic and hydrophilic compounds stabilizes the enzyme against denaturation in water-organic media. 2001. Protein Eng. 14(9). 683-689.

14. E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, V.A. Izumrudov, A. van Hoek, AJ.W.G. Visser, A. V. Levashov. Formation of Quasi-Regular Compact Structure of Poly(methactylic acid) upon an Interaction with Chymotrypsin. 2001. Biochim. Biophys. Acta. 1550 (2). 129-143.

15. E.V. Kudryashova, T.M. Artemova, A.K. Gladilin, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Thedesign of supramolecular biocatalytic assembles in water-organic solvent mixtures by using complex formation with PE and OA. 1999. Article in Proceedings. The International Symposium on "Lipid and Surfactant Dispersed Systems". Moscow. 1999. pp. 55-56.

16. E.V. Kudryashova, V.V. Mozhaev, C. Balny. Catalytic activity of thermolysin under extremes of pressure and temperature: modulation by metal ions. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1386. 199210.

17. E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Vakurov, F. Heitz, A.V. Levashov, V.V. Mozhaev. Enzyme-polyelectrolyte complexes in water-cosolvent mixtures. Negatively charged groups artificially introduced into a-chymotrypsin provide additional activation and stabilization effects. 1997. Biotechnology & Bioengineering. 55 (2). 267-277.

18. V.V. Mozhaev, E.V. Kudryashova, N.V. Efremova, I.N. Topchieva. Stability of chymotrypsin conjugated with poly(ethylene glycols) and proxanols at high temperature and in water-cosolvent mixtures. 1996. Biotechnology Techniques. 10(11). 849-854.

19. V.V. Mozhaev, E.V. Kudryashova, N. Bee. Modulation of enzyme activity and stability by high pressure: a-chymotrypsin. 1996. R. Hayashi and C. Balny (Editors). High Pressure Bioscience and Biotechnology. Elsevier Science. 221-226.

20. V.V. Mozhaev, R. Lange, E.V. Kudryashova, C. Balny. Application of high hydrostatic pressure for increasing activity and stability of enzymes. 1996. Biotechnology & Bioengineering. 52(2). 320-331.

21. E.V. Kudryashova, I.B. Galperin, A.K. Gladilin, A.V. Levashov. Stabilization of peroxidase by non-covalent complex formation with polyelectrolytes in water-cosolvent mixtures. 1996. In.-"Plant peroxidases. Biochemistry and physiology", C. Obinger, U. Burner, H. Grippin, eds., Geneva. 1996. pp. 390-395.

22. A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Enzyme-polyelectrolyte noncovalent complexes as catalysts in binary mixtures of polar organic solvents with water. 1995. Biotechnol. Lett. 17.1329-1334.

23. E.B. Кудряшова, А.Б. Белова, A.A. Виноградов, B.B. Можаев. Влияние гидрофобных свойств поверхности белка на устойчивость к денатурации в органических растворителях. 1994. Биоорганическая химия. 20(3). 274-280.

Конференции

1. H.H.J, de Jongh, E.V. Kudryashova, P.A. Wierenga, R.A. Ganzevles. Polyelectrolytes as modulator of interfacial properties in food-related systems. Polyelectrolytes. 2008. Coimbra. Portugal.

2. E.V. Kudryashova, A.JAV.G. Visser and A.V. Levashov. Stabilization and Activation of a-Chymotrypsin by Formation of Quasi-Regular Compact Structure of Enzyme-Polyelectrolyte Complexes. Highly-Organized catalytic systems. 2004. Moscow. Russia.

3. V.L. Bronza, E.V. Kudryashova, and A.V. Levashov. Regulation of catalytic activity of acid phosphatase by lipids in reverse micellar system. International Symposium on Engineering and Understanding Protein Functionality. 2003. Moscow. Russia.

4. A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov, W.M.A.M. van Dongen. The use of reverse micellar system for solubilization and refolding of inclusion bodies protein. International Symposium on Engineering and Understanding Protein Functionality. 2003. Moscow. Russia.

5. E.V. Kudryashova, M. Meinders, A.J.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J, de Jongh, Molecular properties of ovalbumin at air/water interface. The 14th Surfactant in Solution Symposium (SIS-2002). 2002. Barcelona. Spain.

6. A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov, W.M.A.M. van Dongen. Solubilization of inclusion bodies protein in reverse micelles. The 14th Surfactant in Solution Symposium (SIS-2002). 2002. Barcelona. Spain.

7. E.V. Kudryashova, T.M. Artemova, M. Meinders, H.H.J, de Jongh, A.V. Levashov. Modification of ovalbumin at air/water interface for stabilization of "interfacial" protein conformation. The International Conference "Biocatalysis". 2002. Moscow. Russia.

8. E.B. Кудряшова, A.B. Левашов, каталитическая активность и структура комплексов ферментов с поли- и олигоэлектролитами в водно-органических системах. 5 Международный Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». 2002. Москва, Россия.

9. E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Stabilization of the proteins by non-covalent complex formation with polyelectrolytes. The International Symposium "Folding". 2000. Moscow. Russia.

10. E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Lcvashov. Physico-chemical mechanism of enzyme-polyelectrolyte complex formation. The International Conference "Biocatalysis". 2000. Moscow. Russia.

11. E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Levashov, V.V. Mozhacv. Complex formation with oligoamincs provides for enzyme stabilization in water-organic cosolvent mixtures. The International Symposium on protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical aspects, 1998, Moscow, Russia. 163.

12. E.V. Kudryashova, V.V. Mozhaev, C. Balny. Catalytic activity of thcrmolysin under extremes of pressure and temperature: modulation by metal ions. The International Symposium on High Pressure Bioscience and Biotechnology. 1998. Lisbon. Portugal.

13. A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, A.V. Levashov, V.V. Mozhacv. Enzyme-polyelectrolyte complexes in water-organic mixtures. Influence of the number of sites for electrostatic binding to a polyelectrolyte on the catalytic activity of chymotrypsin in the complex

__I..1_____ T-t_- ------1 ------ n;---.-i---:-. r—j.------... i i ir

vvilu puiyuibuc. lac iuifciiiaiiuuai v^uiiibitiiiyC ишиакиуыа. iuiiuamcuials ill 1U /\ppli Unions,

1998, Puschino, Russia, 4.

14. A.K. Gladilin, A.V. Vakurov, M.V. Kiselev, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov. Proteins in systems with organic solvents: stabilization by complex formation with polyelectrolyte. The International Symposium on protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical aspects, 1998, Moscow, Russia. 57.

15. A.B. Вакуров, E.B. Кудряшова, A.K. Гладшшн, B.A. Изумрудов, B.B. Можаев, А.В. Левашов. Нековалентные комплексы протеолитических ферментов с полиэлектролитами в водно-органических смесях. 6 Симпозиум по химии протеолитических ферментов, Москва, 1997, 119.

16. А.К. Гладилин, Е.В. Кудряшова, А.В. Вакуров, И.В. Гальперин, В.А. Изумрудов, В.В. Можаев, А.В. Левашов. Стабилизация ферментов в водно-органических смесях путем нековалентного комплексообразования с полиэлектролитами. 2 Съезд Биохимического общества РАН, Москва, 1997,7.

17. E.V. Kudryashova, LB. Galperin, A.K. Gladilin, S.N. Nametkin, A.V. Levashov. Peroxidase in water-alcohol mixtures: catalytic behavior and stabilization by complex formation with polycation. The 4th International Symposium on "Plant peroxidases biochemistry and Physiology". 1996. Vienna. Austria. PA-43.

18. E.V. Kudryashova, A.A. Vinogradov, V.V. Mozhaev. Covalent modification imparts additional stability to enzymes in organic solvents. The 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. 1994. New Delhi. India.

19. A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Enzyme-polycation inter-polyelectrolyte complexes. A new approach to enzyme stabilization in organic media. The 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, New Delhi. India. 1994,2,219.

20. A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Stabilization of enzymes in water-organic mixtures by incorporation into non-covalent complexes with polycations. The International Symposium on Molecular mobility and order in polymer systems. St. Petersburg. Russia. 1994, P -12.

21. E.B. Кудряшова, А.Б. Белова, B.B. Можаев. Гидрофилизация поверхности химотрипсина увеличивает его устойчивость к денатурации органическими растворителями. 3 Всероссийский Симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 1993, 121.

Список сокращений

АОТ - натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты

БАНА - и-нитроанилид К-бензоил-Ь-аргинина

БТЭЭ - этиловый эфир Ы-бензоил-Ь-тирозина

БТНА - н-нигроанилид N-бензоил-Х^-тирозина

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - N.N-диметилформамид

ДО - 1,4-диоксан

ИК - инфракрасная спектроскопия

КД - спектроскопия кругового дихроизма

КЛ - кардиолипин

КФ - кислая фосфатаза

ММР - молекулярно-массовое распределение

OA - олигоамины (спермин, спермидин, путресцин)

ОВА — овальбумин из куриного яйца

ПА — полианион

ПАВ - поверхностно активное вещество

ПАК - полиакриловая кислота

ПБ - полибрен (3,6-ионен)

ПВП - N-алкилированный поли-4-винилпиридин

пир-XT - а-химотрипсин, ковалентно модифицированный пиромеллитовым ангидридом ПК - поликатион

ПМА - полиметакриловая кислота

ПРХ - пероксидаза хрена

ПЭ - полиэлектролит

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РИ - рефрактивный индекс

CMC - синтетические моющие средства.

Т-ОВА—термоденатурированный овальбумин

ФАД - флавинаденин динуклеотид

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидиоэтаноламин

ФИ - фосфатидилинозит

ХТ - а-химотрипсин

янт-ХТ - а-химотрипсин, ковалентно модифицированный янтарным ангидридом ADT - автоматическая капельная тензиометрия

AtGALDH - Ь-галактоно-1,4-лактон дегцдрогеназа из Arabidopsis thaliana FCS - флуоресцентная корреляционная спектроскопия

FTIR-ATR - метод ИК-спектроскопии Фурье в режиме нарушенного полного внутреннего отражения Fusgalox - галактозооксидаза из Fusarium ß-lg - ß-лактоглобулин, молочный белок

IRRAS - ИК спектроскопия в режиме внешнего отражения (инфракрасная рефлекционно-абсорбционная спектроскопия)

MUTMAC - 4-метилумбеллиферил п-триметилциннамат хлорид аммония

РНВН - п-гидроксибензоат гидроксилаза

Sagalox -галактозооксидаза из Stigmatella aurantiaca

TcGAL - галактонолактон оксидаза из Trypanosoma cruzi

TRFA - разрешенно-временная флуоресцентная спектроскопия

ER-TRFA - разрешенно-временная флуоресцентная спектроскопия в режиме внешнего отражения

Подписано в печать:

18.09.2009

Заказ № 2537 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. КОМПЛЕКСЫ БЕЛКОВ С ОСНОВНЫМИ КЛАССАМИ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ. ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСОВ.

1.1.1. Углевод-белковые комплексы и конъюгаты.

1.1.2. Липопротеидные комплексы.

1.1.3. Модельные мембраноподобные системы.

1.1.3.1. Липосомы.

1.1.3.2. Обращенные мицеллы.

1.1.3.3. Смешанные обращенные мицеллы.

1.1.4. Субъединичные белки.

1.1.5. Комплексы белков с полиэлектролитами.

1.1.6. Комплексы белков с нуклеиновыми кислотами.

1.1.7. Комплексы белков с олигоэлектролитами, олигоаминами.

1.1.8. Ковалентные конъюгаты ферментов с полиспиртами.

1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ БЕЛОК-СОДЕРЖАЩИХ КОМПЛЕКСОВ. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ.

1.2.1. Применение методов ATR и КД спектроскопии для исследования структуры белков.

1.2.2. Флуоресцентные методы исследования структуры белков.

1.2.2.1. Метод флуоресцентной спектроскопии.

1.2.2.2. Методы тушения флуоресценции.

1.2.2.3. Флуоресцентная анизотропия.

1.2.2.4. Применение флуоресцентных методов для исследования молекулярной подвижности белков.

1.3. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ АДСОРБИРОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТЯХ РАЗДЕЛА ФАЗ ВОДА-ВОЗДУХ И ВОДА-МАСЛО.

1.3.1. Метод мономолекулярных слоев.

1.3.2. Адсорбция белков на гидрофобных «флюидных» поверхностях, вода-воздух и вода-масло

1.3.3. Методы слежения за адсорбцией белков на поверхностях вода-воздух и вода-масло; исследование реологических свойств белковых пленок.

1.3.4. Методы исследования структурных свойств белков на поверхностях вода-воздух

2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.2. МЕТОДЫ.

3.2.1. Каталитическая активность ферментов в водных растворах и водно-органических смесях.

3.2.1.1. а-Хилютрипсин (XT).

3.2.1.2. Трипсин (Г).

3.2.1.3. Пероксидазахрена (ПРХ).

3.2.1.4. Лизоцим из куриного яйца.

3.2.1.5. Щелочная протеаза.

3.2.1.5. Целлюлаза.

3.2.2. Сояюбилизация, сворачивание и изучение каталитической активности ферментов в системе обращенных мицелл ЛОТ.

3.2.2.1. Определение каталитической активности КФ в обращенных мицеллах.

3.2.2.2. Солюбтизация и сворачивание ферментов галактозоксидаз, Fusgalox и Sagalox, в системе обращенных мицелл А ОТ.

3.2.2.3. Сворачивание TcGAL в системе обращенных мицелл ЛОТ.

3.2.2.4. Определение каталитической активности п-гидроксибензоатгидроксшазы (РНВН) в системе вода-ДМСО и в системе обращенных мицелл ЛОТ.

3.2.3. Приготовление модифицированных препаратов белков и ферментов.

3.2.3.1. Ковалентная модификация ферментов и белков (XT и овалъбумина), приготовление термоденатурированного препарата ОБА.

3.2.3.2. Введение флуоресцентных меток (овальбумип, XT, РНВН, [i-лактоглобулип).

3.2.3.3. Приготовление комплексов ферментов и белков с полиэлектролитами и олигоаминами.

3.2.4. Исследование структурных свойств ферментов и белков в гомогенных и микрогетерогенных системах, в растворах и системах обращенных мицелл ПАВ

3.2.4.1. Флуоресцентная спектроскопия

3.2.4.2. Измерение стационарной флуоресцентной анизотропии. 141.

3.2.4.3. Спектроскопия кругового дихроизма.

3.2.4.4. Седиментационный анализ. 142.

3.2.5. Исследование термодинамических характеристик фермент-полиэлектролитных комплексов.

3.2.5.1. Изучение комплекса XT с ПБ методом флуоресцентной спектроскопии с использованием эозина.

3.2.5.2. Определение стехиометрии и констант диссоциации комплексов XT с олигоаминами в воде и в системе вода-этанол методом равновесного диализа.

3.2.6. Исследование адсорбции и структурных свойств белков на поверхности вода-воздух.

3.2.6.1. Тензиометрия (метод автоматической капельной тензиометрии, ADT).

3.2.6.2. Изучение реологических свойств поверхности вода-воздух при адсорбции белков с использованием Ленгмюровской техники.

3.2.6.3. Измерение Фурье ИК-спектров поглогцения (метод спектроскопии нарушенного полного отражения, FTIR-ATR).

3.2.6.4. Измерение ИК спектров в режиме отражения, IRRAS.

3.2.6.5. Измерение трансляционной диффузии белков методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS).

3.2.6.5.1. Измерение трансляционной диффузии п-гидроксибензоатгидроксилазы, меченной Алекса-488, Алекса-488-РНВН в объемной фазе (в водных растворах и в системе вода-ДМСО методом FFS).

3.2.6.5.2. Измерение трансляционной диффузии и профиля распределения концентрации овальбумина, меченного Bodipy TMR, на поверхности вода-воздух методом FCS.

3.2.6.6. Разрешеино-временная флуоресцентная анизотропия (TRFA).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. БЕЛКИ И БЕЛОК-СО ДЕРЖАЩИЕ КОМПЛЕКСЫ НА ПОВЕРХНОСТИ ВОДА-ВОЗДУХНА ПРИМЕРЕ ОВАЛЬБУМИНА ИЗ КУРИНОГО ЯЙЦА (ОВА) И МОЛОЧНОГО В -ЛАКТОГЛОБУЛИНА (B-LG).

4.1.1. Метод инфракрасной абсорбционно-рефлекционной спектроскопии (IRRAS).,

4.1.2. Молекулярная подвижность белков на поверхности вода-воздух.

4.1.3. Трансляционная диффузия белков на поверхности вода-воздух.

4.1.4. Роль межмолекулярных взаимодействий в формировании и свойствах поверхностного слоя белка при адсорбции на поверхности вода-воздух.

4.1.5. Молекулярные свойства овальбумина в условиях сжатия пленки.

4.1.6. Взаимосвязь поверхностной активности белков с их пенообразующей способности.

4.1.7. Влияние комплексообразования с пектином на адсорбционные свойства белков OBAup-lg.

4.1.8. Вращательная динамика комплексов ОВА-пектин и P-lg-пектин на поверхности вода-воздух.

4.2. РЕГУЛЯЦИЯ ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТОВ В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ ПАВ.

4.2.1. Рефолдингрекомбинаитных ферментов, образующихся в виде «тел включения» в системе обращенных мицелл ПАВ.

4.2.2. Роль межсубъединичного взаимодействия в функционировании пара-гидроксибензоат-гидроксилазы (РНВН) и Fusgalox.

4.2.3. Влияние природы липидов на каталитическую активность кислой фосфатазы.

4.3. ФЕРМЕНТЫ В СОСТАВЕ ФЕРМЕНТ-ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ И КОВАЛЕНТНЫХ КОНЪЮГАТОВ С ПОЛИАЛКИЛЕНОКСИДАМИ В НЕВОДНЫХ СРЕДАХ.

4.3.1. Ковалентная модификация ферментов гидрофильными и гидрофобными низкомолекуляриыми соединениями

4.3.2. Фермент-полиэлектролитные комплексы в водно-органических средах.

4.3.3. Молекулярные механизмы влияния комплексообразования с ПЭ на функциональную активность и стабильность ферментов.

4.3.4. Регуляция каталитической активности и стабильности ферментов путем образования конъюгатов ферментов с полиспиртами.

4.3.5. Регуляция каталитической активности и стабильности ферментных препаратов щелочной протеазы и целлюлозы при комнлексообразовании схитозаном для применения в составе синтетических моющих средств (CMC).

ВЫВОДЫ.

Как известно, белки в природе не изолированы от остальных компонентов живой материи и, как правило, функционируют в составе тех или иных надмолекулярных ансамблей, которые являются основой молекулярной организации биологических систем. Состав и пространственная структура белок-содержащих комплексов во многом определяет протекание важнейших биохимических процессов, таких как биосинтез и фолдинг белков. Регуляция функциональной активности и стабильности белков in vivo часто осуществляется именно посредством образования надмолекулярных ансамблей, комплексов белков с соединениями различной природы — липидами, олиго- и полисахаридами, ДНК, с другими белками [1-4]. К настоящему времени накоплено большое количество экспериментальных данных о структуре и свойствах белок-содержащих комплексов, в основном в гомогенных системах.

Однако для детального понимания механизмов регуляции и обмена в живых системах требуется проводить исследования свойств ферментов и белков не только в гомогенных, но также в коллоидных, микрогетерогенных системах. Действительно, структурно-функциональное состояние белков на границах раздела фаз в значительной степени определяет протекание многих жизненно важных процессов в клетках. Именно на границах раздела фаз локализованы и функционируют многие биомолекулы, отвечающие за процессы транспорта, метаболизма и сигнальной трансдукции.

Кроме того, переход к коллоидным системам существенно расширяет возможности исследования свойств ферментов и белков в составе надмолекулярных структур: позволяет получать различные формы надмолекулярной организации белков, в том числе, не реализующиеся в водных растворах; проводить как диссоциацию, так и ассоциацию белковых комплексов. Результаты таких исследований могли бы позволить по-новому взглянуть на основные механизмы, регулирующие функционирование белков и ферментов в живой природе.

Однако в арсенале исследователей практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков, адсорбированных на поверхностях раздела фаз. Информация, встречающаяся в литературе, носит, скорее качественный характер.

В настоящее время благодаря интенсивному развитию новых высокочувствительных микроспектроскопических методов, появилась возможность получать детальную информацию о структурных свойствах белков в гомогенных системах. На основе данных методов, в представленной работе впервые были разработаны новые подходы, позволяющие исследовать структурные свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз, вода-воздух.

С применением разработанных подходов впервые получена детальная информация о структурно-динамических свойствах белков и ферментов, как в случае моно-, так и многокомпонентных коллоидных систем: в составе комплексов с соединениями различной природы - полисахаридами, липидами, в составе олигомерных белков и белковых агрегатов.

Таким образом, разработка новых подходов к исследованию структурно-функциональных особенностей белков и ферментов в модельных коллоидных системах представляет очевидный интерес с фундаментальной точки зрения. Кроме того, исследование на молекулярном уровне механизмов образования и стабилизации искусственных коллоидных систем имеет огромное значение для разработки новых лекарственных форм, а также новых технологий для пищевой и косметической промышленности.

I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Настоящий литературный обзор состоит из трех основных частей. Первая часть посвящена классификации комплексов белков и ферментов с основными классами природных и синтетических соединений. Рассмотрены биологические функции природных белок-содержащих комплексов; особенности структуры комплексов; возможные механизмы регуляция каталитической активности и стабильности ферментов посредством образования надмолекулярных ансамблей. Обсуждаются области практического применения белок-содержащих комплексов в биотехнологии и медицине.

Во второй части литературного обзора систематически рассмотрены наиболее широко используемые физико-химические методы исследования структуры и свойств белков и ферментов в гомогенных системах. Особое внимание уделено флуоресцентным методам анализа. Одним из наиболее информативных методов при исследовании структуры надмолекулярных ансамблей представляется релаксационый флуоресцентный метод -разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии (TRFA). Комплементарную информацию дает метод флуоресцентной флуктуационной спектроскопии (FFS). Благодаря высокой чувствительности и уникальной возможности следить за общими и внутренними динамическими свойствами белок-содержащих комплексов, указанные методы позволяют получать детальную информацию о структурной организации надмолекулярных ансамблей.

В третьей части обзора проанализированы физико-химические методы, позволяющие исследовать функциональные и структурные свойства белков в гетерогенных системах, основное внимание уделяется методам, предназначенным для изучения белков адсорбированных на «флюидных» поверхностях, вода-воздух и вода-масло.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработаны подходы, позволяющие исследовать структурно-динамические свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз (вода-воздух) в режиме реального времени. Данные подходы основаны на применении микроспектроскопических методов: разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии и инфракрасной спектроскопии в режиме внешнего отражения, соответственно ER-TRFA и TRRAS. Для получения информации о диффузионных свойствах белков на поверхности раздела фаз впервые адаптирован и применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Для интерпретации данных, полученных микроспектроскопическими методами в режиме внешнего отражения (ER-TRFA и IRRAS), разработаны методы спектральной симуляции, позволяющие получать количественную информацию о свойствах адсорбированных на поверхности вода-воздух белков (концентрации, конформации, степени агрегации, молекулярной подвижности).

2. Впервые продемонстрировано, что методы ER-TRFA, IRRAS, FCS, являются высокочувствительными и высоко-информативными при изучении свойств белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. С применением комбинации данных методов впервые получена детальная количественная информация о распределении белка в поверхностном слое, кинетике адсорбции, а также о структурно-динамических свойствах белков адсорбированных на поверхности вода-воздух на примере овальбумина и лактоглобулина. Показано, что применение комбинации методов ER-TRFA, FCS и IRRAS открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции биополимеров и их комплексов на поверхностях раздела фаз.

3. Разработаны подходы для регуляции поверхностно-активных свойств белков и реологических свойств белковых пленок. Установлено, что поверхностную активность белков молено целенаправленно регулировать, изменяя их степень агрегации; включая в комплекс с полиэлектролитами и варьируя физико-химические свойства среды.

4. Предложен новый подход для изучения влияния липидного состава матрицы на функционирование мембранотропных ферментов, основанный на применении системы обращенных мицелл ПАВ. Преимуществами данного подхода являются возможность варьировать липидный состав мицеллярной матрицы путем получения смешанных мицелл; учитывать влияние химической природы липидов на калсдую из олигомерных форм фермента, а также исследовать влияние структуры липида на мембранотропные свойства фермента. С применением мицеллярного подхода впервые было продемонстрировано на примере периферического мембранного фермента, кислой фосфатазы, что химический состав липидной матрицы играет ключевую роль в функционировании мембранотропных ферментов.

5. С применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ, позволяющей целенаправленно регулировать олигомерный состав ферментов, изучена роль межсубъединичного взаимодействия в функционировании олигомерных ферментов на примере п-гидроксибензоат гидроксилазы (РНВН) и галактозооксидазы (Fusgalox). Впервые получены полностью активные олигомерные формы данных ферментов, не реализующиеся в водных растворах (мономериая и тетрамерная, соответственно), и изучены их каталитические и структурные свойства. На основе анализа полученных данных выдвинута гипотеза, что в системах in vivo олигомерный состав многих ферментов также отличается от водного, а межсубъединичные взаимодействия в таких системах играют ключевую роль в регуляторных процессах.

6. На основе "мицеллярного подхода" разработан принципиально новый эффективный и универсальный метод рефолдинга рекомбинантных ферментов, образующихся в виде тел включения. На примере рекомбинантных белков, галактозооксидазы (Fusgalox) и галактонолактон оксидазы (TcGAL) продемонстрировано, что солюбилизация в системе обращенных мицелл ПАВ позволяет проводить диссоциацию тел включения и восстанавливать каталитическую активность ферментов с выходом порядка 20-30%.

7. Систематически исследованы возможности различных методов регуляции свойств ферментов в водно-органических системах. Установлено, что одним из наиболее эффективных и технологичных методов регуляции каталитических свойств ферментов в неводных средах является образование фермент-полиэлектролитных комплексов. Исследованы молекулярные механизмы влияния ПЭ на функционирование ферментов. Впервые установлена пространственная структура фермент-ПЭ комплексов в водно-органических смесях с применением метода разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии на примере комплексов а-химотрипсина с полиметакриловой кислотой. Найдено, что взаимодействие белков с ПЭ приводит к образованию компактной двухуровневой структуры комплекса: внутренней — доменной и общей — глобулоподобной. Показано, что образование компактной регулярной структуры комплексов лежит в основе механизма регуляции свойств ферментов при комплексообразовании с ПЭ: стабилизации вторичной и третичной структуры фермента; активационного эффекта; предотвращения агрегационных процессов.

8. Продемонстрировано, что метод образования белок-полиэлектролитных комплексов применим для решения широкого спектра практических задач, в том числе, для стабилизации ферментов в водно-органических средах или других денатурирующих условиях. Так, на основе образования комплексов с природным поликатионом, хитозаном, разработан новый подход к стабилизации гидролитических ферментов, щелочной протеазы и целлюлазы, при их использовании в составе синтетических моющих средств.

1. Курганов Б.И., Федуркнна Н.В., Мицкевич Л.Г., Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Поглазов Б.Ф. Изучение ассоциации мышечной гликогенфосфорилазы b методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре // 1999. ДАН. Т. 367. С. 122-125.

2. Жан-Мари Лен. Супрамолекулярная химия. Концепции и перспективы. Наука, Новосибирск. 1998.

3. Lyubarev А.Е., Kurganov B.I. II Organization of Biochemical Systems: Structural and regulatory aspects. / Eds. Kurganov B.I. and Lyubarev A.E. 1996. N.Y.: Nova Science, Inc. P. 2-60.

4. Lehninger A. L., Nelson D.L., Cox M.M. // Principles of biochemistry (4th Ed.). W.H. Freeman & Company. 2004.

5. Bewley C.A., Editor, Protein-Carbohydrate Interactions in Infectious Diseases, RSC Publishing, Cambridge, UK .2006.

6. Rini J M., Leffler H.Carbohydrate Recognition and Signaling. Handbook of Cell Signaling, 2003, PP 87-93.

7. Lowe J.B., Glycosylation, immunity, and autoimmunity. // Cell. 2001. 104. 809-812.

8. Sharon N. and Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules, Glycobiology 14 (2004), pp. 53R-62R

9. Bianco, G.A., Toscano, M.A., Ilarregui, J.M., Rabinovich, G.A. Impact of protein-glycan interactions in the regulation of autoimmunity and chronic inflammation. // Autoimmunity Reviews. 2006,5 (5), p. 349-356.

10. Glycoproteins, The New Comprehensive Biochemistry, V.29B, /Eds. J. Montreuil, H. Schachter, J.F.G. Vliegenthart. Amsterdam: Elsevier Science, 1995.

11. Carlsson S.L.R.// Glycobiology: A Practical Approach. /Eds. M. Fukuda, A. Kobata Oxford: Oxford University Press, 1993. P. 1-26.

12. Хыоз P. Гликопротеины: Пер. с англ. М.: Мир, 1985 (Hughes R.C. Glycoproteins. London; New York: Chapman and Hall Inc. 1983).

13. Kisailus E.C., Allen H.J.I I Glycoconjugates: Composition, Structure and Functions/ Eds. E.C. Kisailus, H.J. Allen. N.Y.: Marcel Dekker Inc. 1992. P. 13-32.

14. NC IUPAC-IUB //Eur. J. Biochem. 1986. V.159. P. 1-6.

15. Lis //., Sharon N. Protein glycosylation. Structural and functional aspects. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 218. P. 1-27.

16. Hart G.W., Haltiwanger R.S., Holt G.D., Kelly W.G. Glycosylation in the nucleus and cytoplasm.// Annu. Rev. Biochem. 1989. V.58. P. 841-874.

17. Montreuil J. II Comprehensive Biochemistry V. 19B. Part II./ Ed. A. Neuberger, Amsterdam: Elsevier. 1982. P. 1-190.

18. Liu Y, Palma AS, Feizi T. Carbohydrate microarrays: key developments in glycobiology. //Biol Chem. 2009;390(7):647-56

19. Dam Т.К., Brewer C.F. //Fundamentals of Lectin-Carbohydrate Interactions. Comprehensive Glycoscience, 2007, Chapter 3.21: 397-452.

20. Datta P.K., Basil P.S., Datta Т.К. Circular dichroism and fluorescence investigations on Vicia faba lectin-saccharide binding// Biochem. J. 1988. Vol. 251. P. 195-199.

21. Wright C.S. New folds of plant lectins II Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7. P. 631-636.

22. Comprehensive Glycoscience From Chemistry to Systems Biology. Editor-in-Chief: Johannis P. Kamerling 2007. Elsevier.

23. Wang J.M., Takeda A., Yang J.T., Wu C.-S. C. Conformation of concanavalin A and its fragments in aqueous solution and organic solvent-water mixtures // J. Prot. Chem. 1992. V.l 1. P. 157-164.

24. Lectins Analytical Technologies. Edited by: Carol L. Nilsson. 2007. Elsevier

25. Stoeva S., Franz M., Wacker R„ Krauspenhaar R., Guthohrlein E., Mikhailov A., Betzel C„ Voelter W. Primary structure, isoforms, and molecular modeling of a chitin-binding mistletoe26.