Функциональная топография транспортно-матричной РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет 004689517

На правах рукописи

ШПАНЧЕНКО Ольга Валерьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТОПОГРАФИЯ ТРАНСПОРТНО-МАТРИЧНОЙ РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ 3 О СЕН 2010

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

и

Москва-2010 г.

004609517

Работа выполнена на кафедре факультета Московского М.В. Ломоносова.

Химии природных государственного

соединений Химического университета имени

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор, член-корреспондент РАН Лаврик Ольга Ивановна доктор химических наук,

профессор, член-корреспондент РАН Кочетков Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор Колб Вячеслав Адамович

Ведущая организация: Институт Биоорганической Химии

Защита состоится 26 октября 2010 г. в 16 часов на заседании совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университет имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, стр. 40, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГ1 имени М.В. Ломоносова.

им. академиков Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН

Автореферат разослан__сентября 2010 г.

Учёный секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биосинтез белка на рибосомах является ключевым этапом реализации генетической информации в клетке. Этот процесс, получивший название трансляция, изучают уже более полувека. За прошедшие годы накоплен огромный объём информации о структуре как самой рибосомы, так и других молекул, необходимых для синтеза белка, исследовано взаимодействие различных компонентов аппарата трансляции, охарактеризованы все этапы прохождении функционального цикла. Значение этих работ для развития современного естествознания высоко оценивается мировым научным сообществом, в 2009 году Нобелевская премия по химии была присуждена за исследования в области изучения структуры и функции рибосом. В последнее время всё больший интерес учёных вызывают вопросы, связанные с механизмами регуляции экспрессии генов, в том числе, и ролью трансляции в этом процессе. Одним из путей, осуществляющих контроль качества белкового синтеза и регулирующих экспрессию генов на уровне трансляции в клетках прокариот, является транс-трансляция.

Трднс-трансляция - уникальный механизм переключения синтеза полипептидной цепи с мРНК на матричную область тмРНК, молекулы, соединяющей в себе черты матричной РНК и транспортной РНК. Транстрансляция позволяет, с одной стороны, освободить для новых раундов трансляции рибосомы, заблокированные при трансляции мРНК без стоп-кодона, а с другой, направить на деградацию проблемную мРНК и синтезированный с неё полипептид. Активность тмРНК необходима для выживания бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды и для регуляции некоторых физиологических процессов в клетках.

Молекулу тмРНК активно исследуют на протяжении многих лет. Способность тмРНК объединять в одной молекуле функции тРНК и мРНК, узнавать А-участок рибосомы без обычного кодон-антикодонового взаимодействия, переключать рибосому с повреждённой мРНК на открытую рамку считывания тмРНК, делает тмРНК интересным объектом исследований. Изучение пространственной структуры тмРНК и механизма её взаимодействия с рибосомой внесет большой вклад в понимание процесса трансляции в целом.

К настоящему времени накоплен большой объём информации о процессе транс-трансляции: известны первичная и вторичная структуры тмРНК, выяснен состав системы транс-трансляции, охарактеризовано взаимодействие тмРНК с различными белковыми факторами, определена структура комплексов тмРНК с рибосомой, соответствующих начальным этапам /иранс-трансляции. Однако детальный механизм взаимодействия тмРНК с рибосомой неизвестен, равно как и молекулярный механизм протекания транс-трансляции.

Цель работы. Понять механизм процесса транс-трансляции и создать модель его протекания. Задачи:

1. Выявить особенности взаимодействия тмРНК с белковыми партнерами -участниками /иранс-трансляции.

2. Охарактеризовать пространственную организацию тмРНК.

3. Установить роль отдельных элементов тмРНК в осуществлении различных этапов транс-трансляции.

4. Создать систему выделения тмРНК-рибосомных комплексов, остановленных на разных этапах транс-трансляции.

5. Исследовать выделенные комплексы тмРНК с рибосомой с помощью химических и физических подходов.

6. Предложить механизм прохождения тмРНК через рибосому в процессе транс-трансляции.

Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе работы было показано существование неканонического комплекса деацилированной тмРНК с EF-Tu»GDP, в формировании которого принимают участие нуклеотидные остатки U308 спирали 2 и U268 псевдоузла 4 тмРНК.

На основе результатов, полученных с помощью фотоаффинного химического сшивания и метода сайт-направленного мутагенеза, была предложена двухдоменная модель пространственной организации тмРНК, которая позволяет объяснить, как такая объёмная и высокоструктурированная молекула, содержащая 4 псевдоузла, проходит через рибосому в ходе транстрансляции.

В ходе выполнения работы была создана система, позволяющая блокировать транс-трансляцию in vivo на разных этапах прочтения ОРС тмРНК, и выделять соответствующие комплексы тмРНК с рибосомой. Использование данной системы позволило выделить комплексы, содержащие тмРНК, белок SmpB и рибосомы в стехиометрическом количестве, и доказать, что белок SmpB, который, как предполагалось ранее, необходим на стадии инициации транстрансляции, входит также в состав элонгационного и терминационного комплексов.

Методом криоэлектронной томографии была продемонстрирована конформационная подвижность петли тмРНК, состоящей из псевдоузлов, что объясняет сложности, возникающие при изучении структуры элонгационных комплексов тмРНК с рибосомой методом криоэлектронной микроскопии.

Исследование спектров модификаций нуклеотидов тмРНК в различных комплексах с рибосомой с помощью метода химического пробинга показало, что структура и контакты тмРНК (за исключением мРНК-подобного домена и спирали 5) практически не изменяются в ходе транс-трансляции, что подтвердило адекватность двухдоменной модели и позволило создать динамическую модель транс-трансляции.

Динамическая модель транс-трансляции позволила выявить структурный элемент (сформированный псевдоузлом 1 и петлёй А79-А86 тмРНК, и белком SmpB), который, совершая поворот при транслокации TLD тмРНК из А-участка рибосомы в Р-участок, задаёт правильное позиционирование кодона возобновления синтеза в A-участке рибосомы.

Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют не только фундаментальную научную ценность, но и могут быть использованы для

прикладных разработок. Поскольку механизм транс-трансляции существует только в бактериальных клетках и необходим для проявления вирулентности некоторыми патогенными организмами, он представляется хорошей мишенью для синтеза новых антибиотиков, направленных на подавление активности тмРНК или белка SmpB. Известно, что активная концентрация для многих уже известных и широко используемых антибиотиков может быть существенно снижена при одновременном ингибировании транс-трансляции.

Результаты работы опубликованы в виде 14 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах.

Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как способ остановки транс-трансляции in vivo и метод аффинного выделения полученных комплексов, могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии, как в нашей стране, так и за рубежом. Компоненты разработанной нами системы уже были предоставлены ряду коллег из зарубежных лабораторий.

Работа была поддержана грантами РФФИ, HHMI, CRDF.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции: The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark; The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июня, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия; International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа - 1 сентября, 2001, Пущино, Россия; The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 - February 1, 2002, Queenstown, New Zealand; The 6th International Conference on Ribosome Synthesis "Ribosome Synthesis 2003", June 6-10,2003, Arcachon, France; RNA 2003, 8th Annual meeting of the RNA society, July 1-6, 2003, Vienna, Austria; The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protein Interactions", 19-24 августа, 2006, Московская обл., Россия; Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation, May 3-7, 2006, Roscoff, France; EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control - partnered with Cold Spring Harbor Laboratories, September 12-16, 2007, Heidelberg, Germany; Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation, April 4-8, 2009, Roscoff, France; 34th FEBS Congress Life's Molecular Interactions, July 4-9, 2009, Prague, Czech Republic; 21st IUBMB and 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology Biomolecules for Quality of life, August 2-7, 2009, Shanghai, China; Ribosome 2010, May 3-7,2010, Orvieto, Italy.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 221 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы, приложения. Материал иллюстрирован 64 рисунками, 9 таблицами и 3 приложениями. Библиографический указатель включает 226 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Неканоническое взаимодействие тмРНК с элонгационным фактором Tu Синтез модифицированной тмРНК

Известно, что при выполнении своих функций молекулы РНК в клетке взаимодействуют с разнообразными белками. Для поиска клеточных партнеров тмРНК нами был выбран метод фотоаффинного химического сшивания. При использовании этого метода в исследуемую молекулу РНК необходимо ввести фотоаффинные аналоги нуклеотида, образующие ковалентную связь с белком и/или РНК при облучении УФ-светом. Это можно осуществить путем транскрипции РНК с соответствующей ДНК-матрицы с помощью РНК-полимеразы фага Т7, заменяя один из рибонуклеозид-трифосфатов его фотоаффинным аналогом.

В данной работе в качестве реагента для фотоаффинной модификации был выбран 4-тиоуридин, который является близким аналогом уридина, хорошо включается в цепь РНК в ходе Т7-транскрипции и не вызывает существенных изменений конформации РНК. Так, молекулы 5S рРНК, содержащие 20% остатков 4-тиоуридина, успешно участвовали в реконструкции 50S рибосомных субчастиц in vitro. Полученные модифицированные 50S и субчастицы, реконструированные с использованием Т7-транскрипта 5S рРНК без модификаций, проявляли одинаковую активность в синтезе полифенилаланина с использованием полиуридиновой РНК в качестве матрицы. При облучении мягким УФ-светом (>>330 нм) 4-тиоуридин образует так называемую «сшивку нулевой длины». Реагенты «нулевой длины» способны образовывать ковалентную связь с расположенными в непосредственной близости (на расстоянии 3-4 Á) некоторыми группами РНК и белков. За редким исключением, детальный механизм фотохимических реакций неизвестен. Химическая «сшивка» образуется преимущественно из одноцепочечного района РНК, а её образование жёстко детерминировано взаимной пространственной ориентацией фотоаффинной группы реагента и функциональных групп РНК или белка. Жёстко детерминированная пространственная структура РНК-белкового комплекса возможна только в случае их специфического взаимодействия. Таким образом, образование уникальной (по одному или немногим положениям) «сшивки» тмРНК с белком свидетельствует об их специфическом взаимодействии.

тмРНК, содержащая по два статистически включённых остатка 4-тиоуридина на молекулу, была синтезирована с помощью Т7-транскрипции по ДНК-матрице в присутствии dNTPs, 4-sUTP и a-[P32]UTP. ДНК-матрица была получена при обработке эндонуклеазой рестрикции MsK плазмиды pUClOSa, содержащей ген тмРНК Е. coli, клонированный под контроль Т7-промотора. При такой обработке получалась линейная ДНК, дающая при транскрипции 3'-конец тмРНК, соответствующий природному. Уровень включения 4-тиоуридина в молекулу тмРНК контролировали методом фингерпринтов после обработки РНКазой Т2.

Выход аминоацилирования модифицированной тмРНК составлял 40%, что хорошо соотносится с данными, полученными другими исследователями.

Формирование и анализ ковалентного соединения тмРНК с белками S100 экстракта

Для поиска белковых партнеров тмРНК использовали пост-рибосомный супернатант бактериального клеточного экстракта (S100 экстракт), дополнительно очищенный от молекул тРНК с помощью хроматографии на DEAE-сефарозе. Образование комплекса проводили в условиях, при которых тмРНК связывается с рибосомой, в присутствии GTP и системы регенерации GTP. Радиоактивно меченую молекулу тмРНК, содержащую остатки 4-тиоуридина, облучали в реакционной смеси УФ-светом (Х>330 нм).

Продукты реакции анализировали с помощью SDS-ПААГ (Рис. 1). Появление новой полосы, содержащей тмРНК, в положении, соответствующем молекулам с более высоким молекулярным весом (Рис. 1, сравнить дорожки 2 и 1) свидетельствует об образовании при облучении ковалентной связи с белком, так как обработка образца после облучения с помощью протеиназы К приводит к исчезновению полосы (Рис. 1, дорожка 3).

Для очистки ковалентного соединения тмРНК с белком от комигрирующих с ним в геле тяжелых белков из S100 экстракта, его экстрагировали из геля и после расщепления РНКазой Т] подвергали второму электрофоретическому

разделению в тех же условиях. Только «сшившийся» белок (или белки) изменит подвижность за счёт уменьшения молекулярной массы после удаления РНК части. Только одна белковая полоса была видна на геле после такой обработки в области миграции более легких, чем «сшивка» с тмРНК, белков. Район геля, содержащий белковую полосу, вырезали и обрабатывали трипсином. Полученные пептиды анализировали методом MALDI масс-спектрометрии1. Большая часть пептидов соответствовала фрагментам элонгациоиного фактора Tu Е coli, причём идентифицированные пептиды покрывали 65% последовательности белка, что свидетельствует о том, что именно EF-Tu является основным белковым компонентом ковалентного соединения с тмРНК.

Комплекс деацилированной тмРНК с элонгационным фактором Tu в присутствии GTP или GDP

При облучении УФ-светом модифицированной тмРНК в S100 экстракте выход ковалентного соединения составлял около 20%. Однако, по нашим данным

1 2 3

Рисунок I. Анализ продуктов реакции фотоаффинного химического сшивания в 7,5% ЭОЗ-ПААГ. Дорожка I необлучённая модифицированная тмРНК; дорожка 2 - облучённая тмРНК в ЭЮО экстракте; дорожка 3 - облучённая тмРНК в 5100 экстракте, обработанная протеиназой К после облучения. Стрелками показаны полосы, соответствующие тмРНК и образовавшемуся ковалентному соединению (X),

Анализ проводили в сотрудничестве с М. Калкумом (Бекмановский исследовательский институт, Дуарт, США).

лишь незначительное количество тмРНК ацилировалось аланином в условиях проведения эксперимента. Высокий выход «сшивки» в отсутствие аминоацилирования позволил предположить возможность образования комплекса EF-Tu с деацилированной тмРНК. Действительно, при добавлении аланина в реакционную смесь выход аминоацилирования повышался до 10%, однако выход «сшивки» при этом не изменялся.

Взаимодействие деацилированной тмРНК с EF-Tu в присутствии GDP или GTP было исследовано методом фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры. В контрольных экспериментах измеряли константы ассоциации комплексов Phe-тРНКр|>е и А1а-тРНКд)а с EF-Tu-GTP фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры и методом «торможения в геле». Константы ассоциации EF-Tu с тмРНК составили порядка lxlO6 М"1 как в присутствии GDP, так и в присутствии GTP, что в 10-20 раз меньше, чем соответствующие константы для комплексов А1а-tPHK'EF-Tu-GTP и Phe-TPHK-EF-Tu'GTP (Таблица 1).

Таблица 1. Константы ассоциации комплексов тмРНК и тРНК с EF-Tu.

Комплекс Константа ассоциации (М1)

нитроцеллюлозные фильтры «торможение в геле»

tmPHK'EF-Tu'GDP 1.0 (±0.2)х106

tmPHK'EF-Tu'GTP 1.4 (±0.2)х106

Ala-TPHK«EF-Tu»GTP 1.1 (±0.1)х107

Phe-TPHK'EF-Tu'GTP 2.9 (±0.3)х107 0.7 (±0.2)х107

Следовательно, деацилированная тмРНК может эффективно и специфично взаимодействовать с ЕР-Ти*СОР. В случае тРНК даже 40-кратный ее избыток не позволяет детектировать комплекс тРНК'ЕР-Ти'СЭР.

Известно, что для ацилирования тРНК и тмРНК необходим полноценный ССА-3' конец. Следовательно, простейшим контролем для проверки того, действительно ли деацилированная тмРНК может взаимодействовать с ЕР-Ти, будет проверка необходимости ССА-3' конца для формирования ковалентного комплекса (Рис. 2).

Молекулы тмРНК без двух (СА) или четырех (АССА) нуклеотидных остатков на 3'-конце, которые использовали далее в экспериментах по фотоаффинному химическому сшиванию, были получены с помощью реакции Т7-транскрипции. После очистки ковалентных соединений и гидролиза РНК с

1 2 3 4 5 6

8100 -АССА 8100

КК-Ти -С\ тмРНК

Рисунок 2. Анализ белкового компонента продуктов реакции фотоаффинного химического сшивания в 808-ПААГ после обработки РНКазой Ть Дорожки 1 и 6 - суммарный белок 8100 экстракта, 2 - очищенный белок ЕР-Ти, 3 - белок, сшившийся с тмРНК без АССА-3' конца, 4 - белок, сшившийся с тмРНК без СА-3' конца, 5 - белок, сшившийся с полноразмерной тмРНК.

помощью РНКазы Т] белковые составляющие «сшивки» анализировали в БОБ-ПААГ. Видно, что подвижность полученных белков в геле соответствует подвижности ЕР-Ти, следовательно, укороченные формы тмРНК взаимодействуют с ЕР-Ти'СОР столь же эффективно, как и полноразмерная молекула тмРНК.

Является ли способность взаимодействовать с ЕР-Ти'вОР свойством только деацилированной тмРНК? Для проверки молекулы [32Р]тмРНК, содержащие по 5+2 остатка 4-тиоуридина на молекулу, аминоацилировали с помощью [14С]А1а и использовали в экспериментах по сшиванию с ЕР-Ти'СРР (Таблица 2). В контрольной полосе, соответствующей несшитому образцу, соотношение 32Р/|4С составляло 2,7. В полосе, соответствующей «сшивке», это соотношение равнялось 2,4, что доказывает присутствие значительного количества [14С]А1а-тмРНК в ковалентном соединении, хотя деацилированной тмРНК в нём несколько больше. Следовательно, эффективность взаимодействия элонгационного фактора Ти с обеими формами тмРНК практически одинакова.

Таблица 2. Результаты эксперимента по фотоаффинному химическому сшиванию _между ЕР-Ти'ОРР и [14С]А1а-[32Р]тмРНК._

образец (1рш |32Р1/(1рт |14С1 соотношение

«сшивка» 1268/467 2,7:1

А1а-тмРНК 786/323 2,4:1

А

А О С

Б

А Б и С §211

Необычный комплекс тмРНК'ЕР-Ти'ООР может представлять собой новый тип взаимодействия РНК с белком ЕР-Ти, поэтому мы подвергли его более детальному анализу методами удлинения праймера и химического футпринтинга.

Для определения нуклеотид-ного остатка тмРНК, который может быть в контакте с ЕР-Ти, было получено ковалентное соединение тмРНК с ЕР-Ти'СБР в условиях оптимального комплек-сообразования - трехкратного избытка белка. Сшившаяся РНК была выделена из геля в присутствии протеиназы К, очищена и использована как матрица в реакции обратной транскрипции (Рис. 3). В количестве контроля была использована не изменившая подвижность после облучения фракция тмРНК, выделенная из

Рисунок 3. Нуклеотиды Ш68 (А) и 1)308 (Б) тмРНК участвуют в образовании ковалентного соединения с ЕР-ТиЮОР. А, О, С и и - дорожки сиквенса тмРНК. X и К - дорожки, содержащие продукты реакции обратной транскрипции по сшившейся с белком и несшившейся тмРНК, соответственно. Стрелкой обозначена полоса, соответствующая месту остановки обратной транскриптазы за 1 нуклеотид до места «сшивки».

того же геля.

Обратная транскриптаза не может встроить нуклеотидный остаток напротив нуклеотида, участвующего в образовании ковалентного соединения, поэтому удлинение праймера прекращалось за 1 нуклеотид до места «сшивки».

Использование в качестве контроля облучённой, но не сшившейся тмРНК обеспечивало детекцию изменений, внесенных именно образованием ковалентного соединения с белком. Обратная транскриптаза останавливалась в положении С269-С270 (Рис. 3, А) и А309 (Рис. 3, Б). Таким образом, основаниями, участвующими в «сшивании», являются Ш68 и Ш08. Появление других полос в дорожках эксперимента и контроля (Рис. 3, дорожки х и к) может быть объяснено деградацией тмРНК и/или образованием внутримолекулярных «сшивок», так как модификация 4-тиоуридином позволяет получать «сшивки» между основаниями внутри одной молекулы РНК.

А С в У 12 3 4

А309 А312

А316

*

(•»ит . '

|'КЛ| - • »

Рисунок 4. Анализ доступности остатков тмРНК действию СМСТ в комплексе с ЕР-Ти-ООР. А, в, С и и - сиквенс тмРНК. Дорожки 1-4 содержат продукты реакции обратной транскрипции: 1 - тмРНК в растворе без обработки СМСТ; 2 - тмРНК в комплексе без обработки СМСТ; 3 -тмРНК. модифицированная СМСТ в растворе; 4 - тмРНК, модифицированная СМСТ в комплексе. Стрелками обозначены положения полос, показывающих усиление реакционной способности оснований тмРНК в присутствии ЕК-Ти-СОР (чёрная) или их защиту (белая). Отмеченные полосы соответствуют месту остановки обратной транскриптазы за 1 нуклеотид от места модификации.

Вторым широко используемым методом для определения мест контактов между РНК и белками является метод химического футпринтинга. В качестве

модифицирующего агента был выбран 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид л;е/яо-/7-толуолсульфонат (СМСТ), модифицирующий N3 II и N1 в, находящиеся в одноцепочечных участках РНК. Позиции модификации РНК были определены с помощью метода обратной транскрипции.

Наиболее сильное изменение реакционной способности оснований тмРНК в присутствии ЕР-Ти'СЭР было отмечено в районе спирали 2 тмРНК (Рис. 4). Реакционная способность оснований 0315 и Ш11 существенно снижена, о чем свидетельствует уменьшение сигнала остановки обратной транскриптазы на

нуклеотидных остатках АЗ 16 и АЗ 12 в комплексе по сравнению с соответствующими сигналами в растворе (Рис. 4, дорожки 3 и 4).

Доступность Ш08 действию модифицирующего агента возрастает (сравнить сигнал, соответствующий А309 в растворе и комплексе, Рис. 4, дорожки 4 и 3, соответственно). Полученные данные свидетельствует о контакте ЕЕ-Ти*С.ЮР с данным районом тмРНК и хорошо соотносятся результатами фотоаффинного химического сшивания с нуклеотидом Ш08.

Нуклеотидные остатки тмРНК, защищающиеся ЕР-Ти*СОР от химической модификации, частично перекрываются с последовательностью АСССА (основания 312-316 тмРНК), гомологичной сиквенсу пяти РНК-аптамеров, отобранных методом БЕЬЕХ как эффективно связывающиеся с обеими формами

EF-Tu (GDP и GTP) из T. thermophilus. Домен II EF-Tu был предложен как сайт взаимодействия с этими аптамерами. Он не претерпевает сильных структурных изменений при переходе EF-Tu из GTP в GDP форму и служит связывающим звеном между доменами I и III, расстояние между которыми сильно изменяется при переходе из одной формы в другую.

Последовательность ACCGA гомологична также сегменту консервативной а-сарциновой петли 23S рРНК (нуклеотиды 2677-2681 в Т. thermophilus). а-сарциновый домен важен для связывания факторов элонгации с рибосомой, а-сарциновая шпилька защищается от действия химических реагентов при связывании элонгационных факторов. Элонгационные факторы связывают Т7-транскрипты РНК, соответствующие району спирали 42-44 23 S рРНК и а-сарциновой шпильке. Положение EF-Tu на рибосоме было определено с помощью криоэлектронной микроскопии. Фактор контактирует с 50S субчастицей в основании Ь7/Ь12-протуберанца, в котором локализована а-сарциновая шпилька.

Спираль 2 тмРНК, где локализована последовательность ACCGA, U 308 и защиты EF-Tu (Рис. 5) - один из наиболее консервативных элементов вторичной структуры тмРНК, что может свидетельствовать о её функциональной важности. Так, U308 консервативен в 90% известных тмРНК, а следующее основание, G307, консервативно во всех известных тмРНК.

Другой образующий «сшивку» нуклеотид, U268, находится в псевдоузле рК4 и недоступен действию модифицирующего агента даже в свободной тмРНК в растворе. Известно, что 4-тиоуридин, который участвует в формировании Уотсон-Криковской пары, с трудом образует «сшивки» после фотоактивации.

Таким образом, участие этого основания в УФ-индуцированном сшивании предполагает, что взаимодействие EF-Tu с тмРНК может менять конформацию РНК в данном районе.

Формирование двух «сшивок» позволяет предположить, что спираль 2 и псевдоузел 4 в молекуле тмРНК укладываются вокруг EF-Tu, формируя комплекс tmPHK*EF-Tu»GDP, отличный от канонического комплекса с TLD тмРНК.

В группе Ниборга также было показано существование второго сайта взаимодействия между EF-Tu и тмРНК из T. thermophilus, отличного от канонического. Можно предположить, что такой

Рисунок 5. Область тмРНК, вовлечённая во взаимодействие с ЕР-Ти-ООР. Большими чёрными точками отмечены нуклеотиды,

консервативные в 90% генов, маленькими - в 75%. X - нуклеотиды, участвующие в образовании продуктов фотоаффинного

химического сшивания. Стрелками обозначены положения нуклеотидов, показывающих усиление реакционной способности оснований тмРНК в присутствии ЕР-Ти-вОР (чёрная) или их защиту (белая).

необычный комплекс tmPHK'EF-Tu'GDP является следствием нового и, возможно, необходимого для функционирования тмРНК в клетке типа взаимодействия. Роль подобного взаимодействия между деацилированной тмРНК и EF-Tu'GDP, в котором не принимает участия универсальный ССА-3' конец, неизвестна. EF-Tu, возможно, придает тмРНК конформацию, необходимую для вхождения тмРНК в А-участок рибосомы без кодон-антикодонового узнавания.

Другой возможной функцией подобного комплекса может быть защита тмРНК от деградации РНКазами, всегда присутствующими в клетках эубактерий. Известно, что тмРНК синтезируется в клетке конститутивно, однако, данная молекула необходима только в определенных специфических условиях. Можно предположить, что большая часть тмРНК в клетке хранится в форме рибонуклеопротеида в комплексе с фактором элонгации Tu, подобно тому, как некоторые мРНК сохраняются в клетке в виде РНП.

Другая, не обязательно альтернативная, роль может заключаться в участии комплекса EF-Tu'GDP в освобождении тмРНК из Е-участка рибосомы после завершения синтеза сигнального пептида и/или защите тмРНК во время трансляции ОРС тмРНК. После прочтения нескольких кодонов, присутствующих в ОРС, TLD тмРНК будет освобожден из рибосомы. При этом тмРНК, возможно, образует вторичный комплекс с EF-Tu'GDP для защиты от действия клеточных рибонуклеаз до тех пор, пока трансляция tag-пептида не будет полностью завершена. Следует заметить, что эукариотический EF-la-GDP может формировать стабильный комплекс с деацилированной тРНК, что, возможно, указывает на существование прямого пути транспорта деацилированной тРНК из Е-участка рибосомы к соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазе.

Таким образом, наряду с каноническим комплексом, образуемым аминоацилированным тРНК-подобным доменом тмРНК с EF-Tu'GTP, деацилированная тмРНК может формировать специфический и устойчивый комплекс с EF-Tu'GDP. В образовании этого комплекса участвуют спираль 2 и псевдоузел 4 тмРНК. Его роль, возможно, заключается в стабилизации структуры молекулы тмРНК, защите её от деградации, а также в транспортировке деацилированной тмРНК из Е-участка рибосомы к аминоацил-тРНК-синтетазе. Модель взаимодействия тмРНК с рибосомой Двухдоменная организация тмРНК

Центральным вопросом в понимании механизма ш/мне-траисляции остаётся вопрос о том, как молекула тмРНК взаимодействует и движется в рибосоме. Присутствие четырёх псевдоузлов во вторичной структуре тмРНК Е. coli хорошо доказано. Сложно представить, что псевдоузлы расплетаются в ходе движения тмРНК внутри рибосомы. Мы предполагаем, что тмРНК состоит из двух компактно свернутых доменов (включающих псевдоузлы), которые взаимодействуют со специфическими участками рибосомы и сохраняют эти контакты во время трансляции кодирующей части тмРНК (Рис. б)2.

Домен 1 сформирован тРНК-подобной областью, спиралью 2 и псевдоузлом 1. Он, возможно, необходим для вхождения тмРНК в рибосому и содержит, во-

2 Моделирование проведено совместно с Г, Аглямовой и В. Лимом (ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия).

у и

иРИКчкж^нхм .

ч

Домен 2

.А

\<*У

гт

Рисунок 6. Модель пространственной структуры тмРРПС Показаны А- Р- и Е-участки рибосомы. Номера спиралей и псевдоузлов соответствуют рис. 5. А. тмРНК в растворе; тРНК-подобная часть тмРРПС выделена чёрным цветом. Обозначены домены 1 и 2. Б. тмРРГК с первым кодоном мРНК-подобной части в А-участке и тРНК-подобной структурой домена 1 в Р-участке рибосомы. В. тмРНК после нескольких раундов транслокации.

первых, амииноацилирован-ную тРНК-подобную часть, взаимодействующую с ЕР-Ти и белком 8трН. и, во-вторых, элемент, который структурно мимикрирует кодон-антикодоновый дуплекс мРНК и тРНК, узнающийся А-участком рибосомы. Оставшиеся элементы данного домена, возможно, необходимы для стабилизации формы тРНК-мРНК комплекса и образования канонического комплекса с ЕР-Ти. Домен 2, как мы полагаем, состоит из спирали 5 и псевдоузлов 2 и 3. Домены 1 и 2 соединены мРНК-подобной областью и псевдоузлом 4. Домены 1 и 2 образуют в растворе компактную структуру, пряча между собой одноцепочечный мРНК-подобный модуль (Рис. 6, А).

Для проверки нашей гипотезы о двухдоменной организации молекулы тмРНК мы применили метод фотоаффинного химического сшивания. тмРНК со случайно распределенными по молекуле остатками 4-тиоуридина была обработана УФ-светом. Облучённый образец про-анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 7) и обнаружили, по крайней мере, 5 продуктов

фотоаффинного химического сшивания. Для

1 2

определения нуклеотидных остатков, принимающих участие в формировании «сшивок», использовали стандартные подходы анализа продуктов фотоаффинного химического сшивания (помощью РНКазы Н и обратной транскрипции),

Рисунок 7. Гель-электрофоретический анализ продуктов фотоаффинного химического сшивания тмРНК, содержащей 2-5 остатков 4-тиоуридина на молекулу РНК, после облучения УФ светом. Дорожка 1, тмРНК без облучения УФ; дорожка 2, тмРНК, облучённая УФ светом. Х1-5 -продукты фотоаффинного химического сшивания.

1X5 1X4

ранее неоднократно успешно использованные в нашей лаборатории для изучения ковалентных соединений мРНК и 5Б рРНК с рибосомой.

РНКаза Н является рибонуклеазой, специфически разрезающей гибридный дуплекс ДНК-РНК. Имея набор олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных определённым участкам тмРНК, можно получить фрагменты РНК известной длины, и, следовательно, с известной подвижностью в геле. Изменение подвижности какого-либо фрагмента в геле свидетельствует о его участии в фотоаффинном химическом сшивании. Пример подобного анализа для аддуктов XI и Х5 (рис. 7) приведен на рисунке 8.

Разрезание контрольного образца в присутствии олигонуклеотида, комплементарного последовательности 200-217 тмРНК, приводит к образованию двух продуктов: 5'-концевого фрагмента длиной 214 и 3'-концевого фрагмента длиной 149 нуклеотидов (рис. 8, дорожка 4). Для продукта XI (рис. 8, дорожка 5) наблюдается фрагмент с подвижностью большей, чем для 214-звенной РНК, и, следовательно, в образовании продукта фотоаффинного химического сшивания участвует 5'-концевой фрагмент тмРНК. При использовании дополнительных олигонуклеотидов, лежащих в 3'-концевой области от нуклеотида 217, изменение длины фрагмента 149 происходит одинаково для контрольного (рис. 8, дорожки 7, 10, 13, 16) и экспериментального (рис. 8, А, дорожки 8, 11, 14, 17) образцов.

Рнсунок 8. Анализ продуктов фотоаффинного химического

сшивания XI и Х5 (рис. 7) в ПААГ в денатурирующих условиях после разрезания РНК РНКазой Н. Дорожки 1-3 - без олигонуклеотида. Дорожки 4-6 - в присутствии олигонуклеотида, комплементарного последовательности 200-217 тмРНК. Дорожки 7-9 -в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 200-217 и 346-363 тмРНК. Дорожки 10-12 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 200-217 и 312325 тмРНК. Дорожки 13-15 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 200-217 и 274-291 тмРНК. Дорожки 16-18 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 200-217 и243-250 тмРНК. Дорожки 19-21 — в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 200-217 и 128-145 тмРНК. Дорожки 22-24 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 200-217 и 56-73 тмРНК. Дорожки 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 -гидролиз контрольного образца (рис. 7, дорожка1). Дорожки 2, 5, 8, И, 14,17,20,23 - гидролиз образца XI. Дорожки 3,6,9,12,15,18,21,24 - гидролиз образца Х5. Размеры продуктов разрезания РНКазой Н обозначены цифрами рядом с соответствующей полосой.

1 2 345« 7 8 9 10 1! 12 131415161718192021222324

■ ь Л

363:

- - -- 4 » ф

214 " Я4- ?14» г,Л 21Г

........щ

78

т\1

69

В присутствии второго олигонуклеотида, комплементарного области 56-73 (т.е. лежащего в 5'-направлении от нуклеотида 217), в контрольном образце (рис. 8, дорожка 22) видны продукты длиной 149, 145 и 69 нуклеотидов. В образце XI (рис. 8, дорожка 23) не детектируется полоса с подвижностью, соответствующей фрагменту длиной 145 нуклеотидов. Проведённый анализ позволяет сделать вывод, что в образовании «сшивки» XI участвуют нуклеотиды, лежащие в области 69-214 тмРНК. К сожалению, использование олигонуклеотидов, комплементарных этому району, не позволило сократить интервал (рис. 8, дорожка 20), поскольку компактность структуры данного района препятствует гибридизации олигонуклеотидов.

При обработке РНКазой Н в присутствии олигонуклеотида, комплементарного району 200-217, продукта фотоаффинного химического Х5 (рис. 8, дорожка 6) не происходит образования ожидаемых фрагментов 214 и 149 (сравнить с контрольным образцом (рис. 8, дорожка 4)). Следовательно, можно предположить, что в формировании этого продукта фотоаффинного химического сшивания участвуют 5'- и 3'-концы тмРНК. Выщепление фрагментов соответствующей длины при использовании второго олигонуклеотида (рис. 8, дорожки 9, 12, 15 и 18) позволяет локализовать 3'-концевого участника продукта фотоаффинного химического сшивания в районе 324-358 тмРНК. Аналогичный анализ 5'-концевой части приводит к заключению, что в образовании аддукта Х5 принимает участие какой-либо нуклеотид из первых 69. Результаты анализа суммированы на рисунке 9. Тот факт, что поведение продукта сшивания Х4 при обработке РНКазой Н в присутствие различных олигонуклеотидов совмещает черты, присущие XI, Х2 и ХЗ, с одной стороны, и Х5, с другой, говорит о том, что Х4 может быть комбинацией Х5 и одного из продуктов Х1-ХЗ.

Для идентификации конкретного нуклеотида,

принимающего участие в образовании «сшивки», мы использовали реакцию

обратной транскрипции, что позволило локализовать 5 'концевого участника «сшивки» Х5 в районе нуклеотидов 11-16 тмРНК (рис. 10, А). Нам удалось так же определить одного из участников «сшивок» XI, Х2, ХЗ и Х4 -нуклеотид U182 (рис. 10, Б).

Таким образом, продукт фотоаффинного химического сшивания Х5 был локализован в тРНК-подобной части тмРНК; в его формировании участвуют районы 11-16 и 325-345 тмРНК. Продукты Х1-ХЗ содержат U182 из петли псевдоузла 2, связанный с тремя

И*»4 14S+H* ШО« ISb-lt Ilt'H

12

5' 1 59 145 214 285 324 368 а

1 9 н?т U182

2 ? ()Ш

3 ? UI82

4 U16-I7 \ ? UI82 (Ш2Я 9 У

5 Ш6-17 (Ш22)

3'

Рисунок 9. Схема, суммирующая результаты экспериментов по анализу продуктов фотоаффинного химического сшивания с помощью РНКазы Н и метода обратной транскрипции.

различными нуклеотидами из области второго и третьего псевдоузла. Продукт Х4 представляет собой комбинацию двух продуктов сшивания: продукта Х5 и одного из продуктов XI-ХЗ (рис. 9).

a g с и к х1 х2 х5

a g с и к х1 х2хзх4х5

u10-+.

ш.

а15 «

А20

«

а25 -+■ * "

А $

Рисунок 10. Анализ продуктов фотоаффинного химического сшивания методом обратной транскрипции. A. A, G, С, U - сиквенс тмРНК. Дорожки XI, Х2, Х5, анализ соответствующих продуктов фотоаффинного химического сшивания (рис. 7). Область сигналов остановки обратной транскрипции в позициях, соответствующих «сшивкам» нуклеотидов, показана стрелками. Б. A, G, С, U - сиквенс тмРНК. Дорожки Х1-Х5, анализ соответствующих продуктов фотоаффинного химического сшивания (рис. 7). Сигнал остановки обратной транскрипции в положении С183, соответствующий «сшивке» нуклеотида U182, показан стрелкой.

К сожалению, нам не удалось определить места «сшивок» с точностью до нуклеотида, поскольку тмРНК, как упоминалось выше, обладает очень компактной структурой, и после её облучения УФ-светом отжиг праймеров затруднен. Тем не менее, данные по фотоаффинному химическому сшиванию, полученные в нашей работе, подтверждают существование двух компактно свернутых доменов в молекуле тмРНК.

Согласно нашей модели, домены 1 и 2 связаны между собой кодирующей частью и псевдоузлом 4 (рис. 6). Мы предполагаем, что в растворе домены 1 и 2 располагаются близко друг к другу, формируя очень компактную структуру, которая, возможно, стабилизирована взаимодействием с белками (например, SmpB, рибосомным белком S1 или EF-Tu). В такой третичной структуре мРНК-подобная часть тмРНК «спрятана» между двумя структурно-функциональными доменами 1 и 2 тмРНК (рис. 6, А).

Мы предполагаем, что такая компактно свернутая аминоацилированная форма тмРНК входит в рибосомный A-участок в комплексе с EF-Tu-GTP и SmpB. Можно полагать, что данный комплекс похож на канонический комплекс, сформированный аа-тРНК и EF-Tu. Когда домен 1 тмРНК взаимодействует с А-участком рибосомы, в рибосоме происходит конформационное изменение, которое вызывает гидролиз GTP до GDP. Это ведет к информационным изменениям в EF-Tu и, возможно, также в тмРНК. Аминоацилированный ССА-конец тмРНК перемещается в пептидил-трансферазный центр рибосомы, и EF-Tu покидает рибосому. На этой стадии домен 2 должен занять свой сайт связывания на рибосоме.

И- С183

Далее ЕР-в взаимодействует с рибосомой и способствует прохождению транслокации, после которой тРНК-подобная часть домена 1 тмРНК и структурно-функциональный аналог кодон-антикодонового дуплекса перемещаются в Р-участок рибосомы, а первый кодон мРНК-подобной части, кодирующий аланин, входит в А-участок рибосомы благодаря раскрытию данной области (рис. 6, Б). В то же время домен 2 остается связанным со своим сайтом на рибосоме. На следующих стадиях домен 1 движется из Р-участка рибосомы в Е и затем выходит из рибосомы. Домен 2 остаётся связанным со своим сайтом до терминации трансляции мРНК-подобной часта тмРНК. Транслокация кодирующей части тмРНК осуществляется обычным путем. В тот момент, когда стоп-кодон матричной части тмРНК появляется в А-участке рибосомы, происходит каноническая терминация трансляции, и тмРНК покидает рибосому после диссоциации последней на субчастицы. Таким образом, в ходе транстрансляции домены 1 и 2 не подвергаются значительным структурным перестройкам, происходит лишь разворачивание мРНК-подобной части и поворот псевдоузла 1 транспортно-матричной РНК.

Поиск элемента тмРНК, обеспечивающего узнавание А-участком рибосомы

Известно, что декодирующий центр ЗОБ субчастицы узнает геометрию комплементарного кодон-антикодонового комплекса. Расшифровка кристаллической структуры комплекса 308 субчастицы с гексауридиновым фрагментом мРНК и тРНКРЬе выявила особенности, характерные для этого узнавания. Было показано, что универсальный А1493 образует контакты с первой парой оснований кодон-антикодонового дуплекса, а нуклеотиды С530 и А1492 взаимодействуют с малым желобком, образованным второй парой оснований. Третья пара оснований узнается элементами рибосомы менее специфично, что хорошо согласуется правилом генетического кода, позволяющим образование неканонического взаимодействия в третьем положении кодон-антикодонового дуплекса.

Ацилированная тмРНК узнает рибосомы, «арестованные» на мРНК, утративших стоп-кодон. В этом случае в А-участке рибосомы невозможно образование классического кодон-антикодонового дуплекса. Как уже упоминалось выше, мы полагаем, что домен 1 тмРНК содержит некий элемент, который структурно мимикрирует кодон-антикодоновый дуплекс между тРНК и мРНК, узнающийся А-участком рибосомы. Для поиска нуклеотидных остатков, формирующих такой структурный элемент, мы применили метод сайт-направленного мутагенеза.

Первым кандидатом на роль «кодона» были нуклеотиды 87СиС89, предшествующие кодону, кодирующему первую аминокислоту tag-пeптидa.

В роли потенциального «антикодона» для этих нуклеотидов мы рассматривали частично комплементарный к последовательности 87виС89 триплет 318САШ20 (принимая во внимание, что образование в-и пары достаточно распространено в мире РНК). Данный триплет располагается в тРНК-подобной части тмРНК рядом с областью, соответствующей антикодоновой петле канонической тРНК. Согласно некоторым данным, эта область тРНК-подобной части тмРНК, возможно, взаимодействует с декодирующим центром рибосомы.

Для проведения сайт-направленного мутагенеза на базе вектора pGEM-T мы создали конструкцию pGEMtmRNA, в которую клонировали ген ssrA, кодирующий тмРНК, под контролем своего конститутивного промотора и заканчивающийся своим терминатором транскрипции. Эта конструкция позволяет экспрессировать тмРНК in vivo. Все мутантные варианты тмРНК были созданы в дальнейшем на базе данной плазмиды.

Для проверки активности тмРНК мы применили две системы. Первая основана на использовании гибридного фага XimmP22. Известно, что этот фаг требует для своего роста присутствие в клетке активных молекул тмРНК. Разница между титром фага, выросшего на клетках, содержащих ген тмРНК, и на штаммах с делецией ssrA, составляет примерно 10 ООО раз, что позволяет достоверно оценить функциональную активность молекул тмРНК.

Введение плазмиды pGEM-tmRNA, экспрессирующей тмРНК, в клетки штамма К8619 (AssrA) восстанавливает титр гибридного фага XimmP22 до уровня дикого типа, который существенно отличается от титра фага на штамме с делецией гена ssrA. Разница между титрами составляет величину близкую к опубликованной (рис. 11, колонки WT и ssrA::cat). Данный метод не лишён ряда недостатков. Во-первых, он является трудоёмким, во-вторых, этот подход не отвечает на вопрос, связано ли нарушение функциональной активности тмРНК с её способностью выполнять транс-трансляцию или со способностью напрямую взаимодействовать с каким-либо репрессорным белком. В частности, существуют данные о прямом взаимодействии тмРНК с LacI and el фага L

Другой метод оценки функциональной активности тмРНК («генетический»)

разработан Вильямсом и соавт. В клетки Е. coli с делегированным геном ssrA вводили две плазмиды, одна из которых позволяла конститутивно экспрессировать исследуемую тмРНК, а другая (рбА) содержала модуль, дающий возможность отслеживать функциональную активность тмРНК (рис. 12). Данный модуль состоит из двух генов. Первый, в котором все стоп-кодоны в рамке считывания удалены, находится под контролем lac промотора, кодирует укороченный вариант фагового репрессора Arc и заканчивается терминатором транскрипции.

ЕОР

О О О О О

Н О* <N СО СО Ш

5I з з % ч <г

i 8 i 1 I I

ео « 50 <0 да

Рисунок 11. Эффективность роста гибридного фага XimmP22 на штамме AssrA с плазмидами серии pGEM, кодирующими мутантные варианты тмРНК. ЕОР - Efficiency of Plating -титр фага. WT - дикий тип, в данном случае штамм Е. coli К37.

1 термина гор и тс, \ /— тмРНК г—и 1**1-ч 1

X Alt f V Т ptnpeecef) IJ Г*" ~........Т........... Е. coli

"- -У

Рисунок 12. функциональной in vivo. Система для активности оценки тмРНК

Второй ген придаёт клеткам устойчивость к канамицину и находится под контролем фагового промотора Pant, являющее-гося мишенью для репрессора Arc. При добавлении индуктора в среду образуется мРНК фагового репрессора Arc, не содержащая стоп-кодона. Рибосомы, транслирующие такую мРНК, будут «арестованы» на её 3'-конце. Образующийся комплекс является естественной мишенью для тмРНК. В клетках с активной тмРНК Arc репрессор будет маркирован и деградирует под действием клеточных протеиназ. Такие клетки будут устойчивы к канамицину. Если в клетках тмРНК отсутствует или функционально неактивна, деградация Arc репрессора не произойдёт, и он будет репрессировать экспрессию гена, дающего устойчивость к канамицину, связавшись с промотором Pant. Такие клетки чувствительны к присутствию канамицина в среде.

Оригинальная система ' была модифицирована с целью её улучшения. Мы переклонировали функциональный модуль из рбА в вектор pACYC 184, совместимый с pGEM-tmRNA, получив плазмиду pR. Клетки штамма Х91 (AssrA), трансформированные данной плазмидой, не росли на среде, содержащей

канамицин, в присутствии индуктора IPTG (рис. 13, Б, сектор 1). Введение в клетки второй плазмиды (pGEM tmRNA) восстанавливало рост клеток в присутствии канамицина и ИПТГ (рис. 13, Б, сектор 2). Таким образом, мы получили высокоэффективную и удобную в работе систему, позволяющую оценить активность мутантных форм тмРНК.

В табл. 3 суммированы данные о мутациях, введенных нами в последова-

3 Штамм клеток Е. coli Х91 и плазмида рбА были предоставлены К. Вильямсом (Университет штата Индиана, Блумингтон, США).

4 б 4

Рисунок 13. Определение активности мутантных молекул тмРНК, закодированных на плазмидах серии pGEM. Рост клеток Е. coli штамма Х91 (AssrA), трансформированных плазмидой-репортёром pR и одной из плазмид серии pGEM в отсутствие (А) и в присутствии (Б) индуктора ИПТГ. 1 - без pGEM; 2 - pGEMtmRNA(WT), 3 -pGEMtmRNA(UA300,301CC); 4 - pGEMtmRNA(2a-2b); 5 -pGEMtmRNA(UA85,86CC); 6 - pGEMtmRNA(A86C).

Таблица 3. Влияние мутаций в области 87-89 и 318-320 на функциональную активность тмРНК.

Последовательность Рост1 Амино-ацилирование2

87GUC89 (WT) +++ +++

87GAG89 +++ +++

87GAC89 +++ +++

87UAC89 +++ +++

318GAU320 (WT) +++ +++

318GAG320 +++ +++

318AAG320 +++ +++

318АСА320 +++ +++

1 „+++" - скорость роста сопоставима со скоростью клеток дикого типа; 2 „+++" - эффективность аминоацилирования сопоставима с эффективностью аминоацилирования тмРНК дикого типа.

тельность потенциальных «кодона» (87-89) и «антикодона» (318-320) для частичного или полного нарушения их гипотетического взаимодействия.

Оказалось, что ни одна из мутаций в данных районах не сказывается ни на аминоацилировании, ни на функциональной активности тмРНК, что было подтверждено как в фаговой системе проверки активности (рис. 11), так и в «генетической» системе. Следовательно, представляется маловероятным непосредственное участие нуклеотидов 87-89 и 318-320 в формировании структурного элемента, который узнает A-участок рибосомы.

Вероятно, в этом узнавании задействованы более сложные механизмы. Так, согласно литературным данным, петля тмРНК, соответствующая антикодоновой петле классической тРНК, может взаимодействовать с декодирующим центром рибосомы. Для проверки важности данного структурного элемента в процессе траис-трансляции нуклеотиды, образующие данную петлю, были изменены таким образом, чтобы стало возможным формирование спирального участка (pGEMtmRNA(2a-2b)). Однако эта мутация не затрагивала активности тмРНК (рис. 13, Б, сектор 4), что свидетельствует против того, что данная петля выполняет функцию, аналогичную функции канонической антикодоновой петле тРНК. Возможно, что другие части тмРНК образуют структурный элемент, узнающийся декодирующим центром рибосомы, или данное взаимодействие определяется какими-либо транс-факторами.

Известно, что белок SmpB необходим для от/>а«с-трансляции, в частности, показана его необходимость для начального связывания тмРНК с А-участком рибосомы, а также влияние на аминоацилирование тмРНК как in vitro, так и in vivo. Возможно, именно белок SmpB и какой-то структурный элемент РНК играют главную роль в узнавании тмРНК декодирующим центром рибосомы.

Исследование роли некоторых

консервативных нуклеотидов тмРНК

Филогенетический анализ генов, кодирующих тмРНК, позволил выявить ряд высококонсервативных нуклеотидов (рис. 14). Продолжая поиск структурного элемента, необходимого для узнавании тмРНК декодирующим центром рибосомы, и элементов тмРНК, необходимых для процесса /яранс-трансляции, мы

предположили, что кандидатами на их роль могут являться консервативные нуклеотиды.

Для анализа были выбраны, во-первых, нуклеотиды 307GU308. Ранее при изучении необычного комплекса между тмРНК и EF-Tu»GDP нами было показано, что нуклеотид U308 непосредственно участвует в образовании продукта фотоаффинного химического сшивания с EF-Tu. Хотя эти результаты не позволяют однозначно судить

Ы-инаариан1н|

• >90%

• >75%

Рисунок 14. Карта консервативных нуклеотидов тмРНК, созданная на основе филогенетического анализа генов, кодирующих тмРНК.

Таблица 4. Влияние мутаций некоторых высококонсервативных нуклеотидов на функциональную активность тмРНК.

о доминирующей роли данного нуклеотида в образовании комплекса, они указывают на важность региона тмРНК, окружающего данный нуклеотид, для взаимодействия с EF-Tu»GDP (рис. 5). Интересно отметить, что предшествующий U308 нуклеотид G307 был инвариантен во всех известных на тот момент генах тмРНК (более 150 эубактерий с известной последовательностью генома).

Следующими кандидатами для анализа были высококонсервативные нуклеотиды 85-86, отстоящие на триплет от первого кодона мРНК-подобной части тмРНК. Нуклеотиды 300UA301 также являются высококонсервативными (консервативность более 95%) и комплементарны паре нуклеотидов 85UA86. Возможно, что эти нуклеотиды являются частью структурного элемента, узнаваемого А-участком рибосомы.

Данные о мутациях, введенных по описанным выше сайтам, и их влиянии на функционирование тмРНК, суммированы в таблице 4.

Видно, что мутации UA300,301CC и UA85,86CC приводят к гибели клеток, и, следовательно, полностью инактивируют тмРНК (рис. 13, Б, секторы 3 и 5, соответственно; сравнить с рис. 13, А, секторы 3 и 5). Молекулы тмРНК, мутант-ные по положениям 85-86, аминоацилировались в

условиях in vitro с той же эффективностью, что тмРНК дикого типа, выход аминоацилирования составлял 40%, следовательно, эти мутации затрагивают именно способность тмРНК осуществлять транс-трансляцию.

Транс-траисляцш - это многостадийный процесс и оставалось неясным, какую именно стадию затрагивают мутации UA85,86CC в молекуле тмРНК. Известно, что мутантные тмРНК связываются с рибосомой, но транс-трансляция не завершается. Мы предположили два возможных сценария:

1. если тмРНК входит в А-участок, но пептид остается связанным с тРНК, соответствующей последнему кодону повреждённой мРНК, значит, нарушена аккомодация тмРНК в А-участке или перенос пептида с тРНК на тмРНК;

2. если же перенос пептида на тмРНК проходит, тогда нарушена транслокация тмРНК или адаптация матричной части в декодирующем центре рибосомы.

Для определения положения пептида в комплексе мы создали специальную конструкцию, позволяющую экспрессировать в клетках репортёрный пептид, имеющий в своем составе аффинный эпитоп His6 и 10 С-концевых а.к. белка

Последовательность Рост1 Амино-ацилирование2

85UA86 (WT) +++ +++-

85UC86 ± +++

85СА86 ++ +++

85СС86 - +++

300UA301 (WT) +++ +++

300СС301 - Nd

U308C ++ Nd

G307A + +++

„++ - скорость роста незначительно замедлена по сравнению со скоростью клеток дикого типа, „+" -замедленна, „±" - сильно замедленна, „-" - клетки не растут совсем. 2 „+++" - эффективность аминоацилирования сопоставима с эффективностью аминоацилирования тмРНК дикого типа. N(1 - не было определено.

YbeL. Известно, что в клетках Е. coli дикого типа белок YbeL на 30-40% маркируется деградационным пептидом. Белок YbeL содержит ингибирующий терминацию контекст Glu-Pro-stop(UAA). Показано, что замена природного терминационного контекста на Pro-Pro-stop(UGA) усиливает эффект, поэтому мы использовали именно его. Располагая такой конструкцией, мы можем выделить пептид и связанную с ним молекулу РНК и детектировать комплекс, остановленный как до переноса пептида (пептид связан с тРНКРга, находящейся в Р-участке), так и после (пептид связан с тмРНК).

В клетках, не содержащих тмРНК, репортёрный пептид был связан исключительно с тРНКРго, что соответствует литературным данным об остановке терминации на контексте CCG-CCG-UGA-A. В присутствии тмРНК дикого типа происходил перенос пептида на тмРНК, однако, тот факт, что пептид присутствовал и на тРНКРго, а кроме того маркирование проходило успешно, свидетельствует о том, что эта картина отражает транзитные стадии, возможно, замедленные в силу каких-то причин. В присутствии мутантной формы тмРНК репортёрный пептид был связан исключительно с тмРНК. Это означает, что мутация UA85,86CC в молекуле тмРНК не затрагивает перенос пептида на тмРНК, но нарушает какую-либо из последующих стадий транс-трансляции: транслокацию, адаптацию мРНК-подобной части или связывание следующей тРНК в А-сайт.

Известно, что многие мутации и делеции нуклеотидов в области 84-89 тмРНК приводят к сдвигу рамки считывания tag-пептида. В экспериментах по случайному мутагенезу области, прилегающей к кодирующей части тмРНК, показана важность нуклеотидов 85-86 для функционирования тмРНК. Интересно, что А86С не влияет на связывание тмРНК с рибосомой, но ингибирует транстрансляцию как in vitro, так и in vivo (наши данные, рисунок 13, сравнить А и Б, сектор 6). Таким образом, мы предполагаем, что область 84-89 служит для позиционирования первого кодона GCA, кодирующего аланин, причём решающую роль играют нуклеотиды 85UA86.

Поиск интрамолекулярных супрессорое для летальных мутаций UA85,86CC и UA300,301CC

Для проверки существования в тмРНК взаимодействия нуклеотидов, мутации которых приводят к летальному фенотипу, между собой или с другими нуклеотидами тмРНК мы провели поиск супрессоров летального эффекта этих мутаций.

Известно, что ген mutD (dnaQ) кодирует одну из субъединиц полимеразы III и контролирует 3'—♦5'-экзонуклеазную (proofreading) активность полимеразы. Мутации, затрагивающие данный ген, приводят к повышенному (примерно в 1000 раз) уровню спонтанных ошибок в ходе репликации.

В нашей работе мы использовали клетки Е. coli штамма SL185, содержащие мутации в гене mutD, для получения случайных замен нуклеотидов в плазмидах, кодирующих тмРНК с летальными мутациями UA85,86CC или UA300,301CC. Полученный набор плазмид со случайными мутациями протестировали в системе in vivo для отбора тмРНК, обладающих активностью. Нуклеотидная последовательность отобранных тмРНК была определена.

Все мутации, восстанавливающие активность тмРНК с летальной мутацией UA300,301CC, являются реверсиями этих нуклеотидов к дикому типу UA (9 вариантов из 9 отсеквенированных). В случае тмРНК с летальными мутациями в положении UA85,86CC во всех вариантах в положении 86 появлялся нуклеотид А (14 из 14), что соответствует дикому типу. Вариантов тмРНК, восстановивших свою активность, не изменив нуклеотиды в позициях 86 или 300,301, обнаружено не было.

Таким образом, результаты данного эксперимента указывают на важность нуклеотидов 85UA86 и 300UA301 для активности тмРНК, хотя взаимодействий между этими нуклеотидами обнаружено не было. Не выявлены и потенциальные партнеры этих функционально важных нуклеотидов, мутации в которых могли бы компенсировать летальный фенотип.

Ответ на вопрос о роли этих нуклеотидов в транс-трансляции, а также на многие другие вопросы о функционировании тмРНК может дать изучение структуры комплексов тмРНК с рибосомой методами рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии.

Мутации нуклеотидов тРНК-подобиой части, затрагивающие активность тмРНК

Для поиска других функционально важных нуклеотидов в молекуле тмРНК мы провели случайный мутагенез гена ssrA с последующим отбором мутантных молекул тмРНК, проявляющих пониженную активность в системе селекции in vivo. Для проведения мутагенеза мы использовали клетки Е. coli штамма SL185 с мутациями в гене mutD.

Мутации тмРНК, приводящие к потере или существенному снижению активности, суммированы в таблице 5.

Все отобранные нами в этом эксперименте тмРНК имеют мутации в тРНК-подобной части -наиболее консервативной области тмРНК (рис. 14). Этот район тмРНК является также одним из наиболее изученных. Методами ЯМР и РСА определена его пространственная организация (в комплексе с SmpB). Однако в этих экспериментах использовали фрагменты тмРНК. Было также проведено исследование влияния мутаций в тРНК-подобном домене тмРНК на её активность в условиях in vitro; предпринята попытка идентификации стадии транс-трансляции, протекание которой нарушает каждая замена. Результаты, полученные нами в условиях in vivo, в целом, коррелируют с данными, полученными in vitro.

Таблица 5. Анализ случайных мутаций в тмРНК, приводящих к потере или существенному снижению функциональной активности in vivo.

Мутация Рост1

GG13,14UC -

G14C ±

G7C +

UC17,18GA ±

C335G +

G333U +

Характеристика роста клеток, содержащих плазмиду с мутацией в гене, кодирующем тмРНК, соответствует

описанной в табл. 4.

Единичная замена G14C существенно снижает функциональную активность тмРНК, а мутация GG13,14UC приводят к полной её потере в нашей системе in vivo. Нуклеотиды G13G14 являются филогенетически консервативными и

располагаются в сильно редуцированной D-петле тмРНК. В канонической тРНК D-петля взаимодействует с "PPC-петлей с помощью нуклеотидов Gl 8-Ч'55 и G19-С56. Как было показано методом ЯМР, в молекуле тмРНК в подобном взаимодействии участвуют нуклеотиды G13-*F342 и G14-C343.

Энзиматический пробинг структуры молекулы тмРНК с мутацией GG13,14CC показал, что в ней действительно дестабилизировано взаимодействие "PFC- и D-петель, а кроме того, нарушена структура аминоакцепторного стебля. Это приводит к ухудшению аминоацилирования в условиях in vitro более чем в 20 раз и, как следствие, к полной потере способности тмРНК связываться с рибосомой и осуществлять транс-трансляцию.

Единичная замена G14A тоже снижает, хотя и в меньшей степени, ацилирование (в 3 раза) и активность (в 5 раз) мутантной тмРНК in vitro. В нашем эксперименте клетки, несущие тмРНК с мутацией G14C сохраняли некоторую способность к росту в присутствии канамицина.

Нарушением аминоацилирования из-за дестабилизации аминоакцепторного стебля можно объяснить влияние мутации G7C на функциональную активность тмРНК in vivo. Нуклеотид G7 лежит в основании аминоакцепторного стебля тмРНК и взаимодействует с нуклеотидом С353. Данное взаимодействие инвариантно для всех известных тмРНК.

Согласно модели структуры комплекса белка SmpB с тРНК-подобной частью тмРНК A. aeolicus наблюдаемое нами влияние нуклеотидных замен UC17,I8GA; G333U и C335G на активность тмРНК можно объяснить нарушением взаимодействия с белком SmpB. Нуклеотидные остатки U16 (U17 Е. coli), С17 (С18 Е. coli) и G317 (G333 Е. coli) взаимодействуют с аминокислотными остатками Leu86, Lys 117, Glu26, Val30 и His88, составляющими высоко консервативную область белка SmpB, а С319 (С335 Е. coli) - с инвариантным остатком Arg 40.

В условиях in vitro существенное снижение функциональной активности выявлено только для мутанта C335G. Данное противоречие с нашими результатами можно объяснить меньшей чувствительностью системы проверки активности in vitro, или влиянием того, что соотношение компонентов транстрансляции в ней существенно отличается от природного. Выделение комплексов транспортно-матричной РНК с рибосомой

Как для экспериментального подтверждения нашей модели прохождения тмРНК через рибосому в процессе транс-трансляции, так и для дальнейшего изучения особенностей функционирования тмРНК необходимо иметь индивидуальные комплексы между тмРНК и рибосомой, соответствующие определённым этапам транс-трансляции. Принципиально возможны два подхода к формированию комплексов - реконструкция in vitro либо остановка процесса на заданном этапе в живых клетках с последующим выделением комплекса. Первый подход требует получения препаративных количеств высокоочищенных компонентов, причём выход целевого продукта оказывается невысоким, что приводит к необходимости проведения дополнительной стадии очистки комплекса. Поэтому мы воспользовались способностью живых клеток к

эффективному проведению т/?<знс-трансляции и создали систему, позволяющую останавливать процесс на заданном этапе.

Выделение тмРНК-рибосомных комплексов для последующего исследования с использованием различных биохимических и структурных подходов проводили с помощью аффинной хроматографии.

В качестве аффинного эпитопа мы выбрали РНК-аптамер, специфичный к стрептавидину, эффективность применения которого для выделения высокомолекулярных рибонуклеопротеидных комплексов, таких как РНКаза Р, сплайсосома и рибосома, была убедительно продемонстрирована ранее. Данный аптамер имеет высокую аффинность к стрептавидину (Kj около 7х1(Г8 М). Стрептавидин-сефароза широко распространена и коммерчески доступна. И, наконец, элюция молекул, связанных со стрептавидин-сефарозой, осуществляется биотином и проходит в мягких условиях, не требующих использования высокой концентрации соли, изменений pH или применения денатурирующих агентов. Константа связывания биотина со стрептавидином составляет 1x10м М"1, что позволяет количественно элюировать связанные со смолой молекулы.

РНК-аптамер к стрептавидину был введён вместо псевдоузла 3 в молекулу тмРНК. Известно, что в тмРНК Е. coli псевдоузлы 2, 3 и 4 взаимозаменяемы. Более того, их замещение одноцепочечными участками не сказывается на аминоацилировании тмРНК и её функциональной активности в бесклеточной системе транс-трансляции. Кроме того, согласно нашей модели пространственной организации тмРНК в рибосоме (рис. 6) псевдоузел 3 находится на поверхности макромолекулы и должен быть доступным для взаимодействия на всех этапах транс-трансляции. Мутантная тмРНК, несущая аптамер к стрептавидину, сохраняла функциональную активность в тесте in vivo,

Для изучения особенностей функционирования тмРНК необходимо было выделить комплексы тмРНК с рибосомой, соответствующие определенным этапам транс-трансляции. Мы

использовали штамм Е. coli SKZ1, в котором ген ssrA, кодирующий тмРНК, был заменен геном, кодирующим хлорамфеникол-ацетилтран-сферазу, обеспечивающую устойчивость к хлорамфени-колу (Рис 16.). Кроме того, данный штамм содержал ген термочувствительного RF2.

описанном ранее (Рис. 15, сектор pGEMstra).

-iPTO

EäGEMsa» p£r£MStra 4

-НРТС»

»GEMsiííi pGEMsU-з Л

Рисунок 15. Мутантные молекулы тмРНК в тесте in vivo. Только клетки, содержащие активную тмРНК, могут расти на среде, содержащей канамицин, в присутствии IPTG. -тмРНК - клетки штамма E.coli Х91 с делегированным геном тмРНК, pGEMstra, pGEMstra 4 и pGEMstra 11 - клетки штамма E.coli Х91, трансформированные соответствующими плазмидами.

ШтамГс^: SK2

"rA:(i1

ДОфЯ-ЛаХИ:')

a 14 »"

Дкхмхтал си лЛЛС (,л(; (iAAЛЛС V; AC <i<4 OA (¿CA (iCI; |;ЛЛ Ггл «теп

lmKNA-2 CCAIGAAAC <!ЛЛ ЛАС Ц АС ОПИ'ЧЛ ССЛОС1) 11.ЛЛ U.AA

Pro спи

•mKNA-J (iCA (ДСГСЛ k;a АЛС UACOCV CUAOCA ОСИ НАЛ МАЛ

I'ru «ТОП

lmRNA-5 (|( Л ЛАС <; ЧГ < <Л Г<. Ч ЛАС C.CU IМ ГА ОСА C.CU I ..\А I Д А

Р ГЦ «ТОК

lmRV\-ll «СЛАЛО ОАО ПАЛЛЛС1<АГ«11 (Ч'ЛЯЛС <<АГКААЛЛ

Рисунок 16. Вторичная структура молекулы тмРНК. Изменения, внесённые в тмРНК, показаны на врезке в правом верхнем углу (последовательность РНК-аптамера к стрептавидину) и в нижней части рисунка (замены, произведённые в MLD тмРНК).

В молекуле тмРНК терминация синтеза tag-пептидэ происходит на стоп-кодоне UAA, находящемся в положении 11 кодирующей области, который могут узнавать оба фактора терминации. Для использования термочувствительного RF2 для остановки транс-трансляции стоп-кодон UAA был заменён на UGA.

Так как эффективность терминации трансляции зависит не только от природы стоп-кодона и активности фактора терминации, но также и от нуклеотидов, окружающих стоп-кодон, то была изменена последовательность перед стоп-кодоном. Для терминации трансляции на стоп-кодоне UGA наименее благоприятным является контекст GAC CCA UGA А (Рис. 16). Перемещение стоп-кодона и окружающего его контекста GAC CCA UGA А по матричной области тмРНК позволяет остановить процесс транс-трансляции на более ранних этапах, а именно, на 2, 4 и 5 кодонах мРНК-подобной части тмРНК.

В итоге были созданы 4 плазмиды, кодирующие тмРНК со стрептавидиновым аптамером и изменённым стоп-кодоном, которые получили название pGEMstra 2, pGEMstra 4, pGEMstra 5 и pGEMstra 11, соответственно (Рис. 16).

< 2»

Ш

ш

Рисунок 17. Анализ маркированных белков, полученных при использования йпШМА^а-СШб) в штаммах Х91 с Е1Р2 дикого типа и 5К21 с термочувствительным 1^2.

Для подтверждения того, что внесённые в штамм SKZ1 изменения не нарушили возможность протекания транс-трансляции, мы использовали тмРНК с ОРС, кодирующей tag-пептид, содержащий 6 остатков гистидина (His6) вместо последних 6 аминокислот. Данное изменение препятствует деградации маркированных белков и позволяет идентифицировать их в клетках, используя коммерчески доступные антитела против His6. Клетки Е. coli штаммов Х91 с инактивированным геном ssrA и SKZ1 с инактивированным геном ssrA и термочувствительным RF2 были трансформированы плазмидой pGEMtm-stra-6His. Анализ суммарного клеточного белка (Рис. 17) показывает, что маркирование белков происходит одинаково в обоих штаммах, подтверждая, что тмРНК нормально функционирует в штамме SKZ1. В отсутствие тмРНК оба штамма продуцируют одинаковые пептиды, неспецифично связывающиеся с антителами против His6.

Для выделения комплексов клетки штамма SKZ1 трансформировали плазмидами, несущими мутантные тмРНК, и выращивали до оптической плотности 0,3 при температуре 37°С в присутствии необходимых антибиотиков. Затем повышали температуру до 42°С. В этих условиях эффективность терминации резко снижалась из-за термочувствительности RF2 и неблагоприятного контекста вокруг стоп-кодона в тмРНК, что позволяло блокировать комплекс. Клетки собирали центрифугированием, получали S30 экстракт и с помощью ультрацентрифугирования через сахарозную подушку осаждали фракцию рибосом. Фракцию рибосом, содержащих тмРНК, выделяли с помощью аффинной хроматографии на стрептавидин-сефарозе. Элюцию комплекса проводили с помощью биотина, его состав анализировали электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях.

Для подтверждения специфичности выделения комплекса аналогичную процедуру очистки проводили с использованием клеток штамма SKZ1, трансформированных плазмидой pGEMstra, кодирующей тмРНК дикого типа. Анализ белкового состава фракций комплекса, выделенного с использованием тмРНК дикого типа, собранных на разных этапах выделения, показал, что неспецифического взаимодействия рибосом со стрептавидин-сефарозой не происходит.

Для подтверждения остановки трансляции в выделенных комплексах на стоп-кодоне L'GA мы использовали свойство токсина Reí Е разрезать цепь мРНК по кодону, расположенному в A-участке рибосомы в комплексах со свободным А-участком, несущих тРНК в Р-участке. Только одна полоса, соответствующая

разрезанию цепи РНК в ожидаемом месте в A-участке, появляется при обработке выделенных комплексов токсином Reí Е (Рис. 18, дорожки 1 и 5).

тмРНК-4 тмРНК-5 Рисунок 18. Эндонуклеотичес-

кий гидролиз токсином RelE цепи тмРНК-4 и тмРНК-5 в А-участке рибосомных

комплексов (комплекс) и в растворе (тмРНК). Т, G, С, А -сиквенсные линии.

Последовательность молекулы тмРНК показана справа. Стрелки указывают места разрезания.

Анализ РНК, входящих в состав выделенных комплексов

Анализ РНК, входящих в состав выделенных тмРНК-рибосомных комплексов, проводили с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 19). тмРНК, выделенная из S30 экстракта (дорожка 1), была использована как маркер подвижности мутангной формы тмРНК в геле. Первичную рибосомную фракцию (дорожка 3) и рибосомную фракцию, не связавшуюся с колонкой (дорожка 4), использовали в качестве контрольных. Выделенный комплекс (дорожка 2), наряду с полосами, соответствующими

рибосомным 16S, 23S и 5S РНК, содержал

Л О 1 А С

дополнительную полосу, по подвижности схожую с тмРНК. Нозерн-блот анализ с использованием DlG-содержащей пробы, комплементарной тмРНК, показал, что эта полоса действительно соответствует тмРНК. Таким образом, при связывании со стрептавидин-сефарозой действительно происходит выделение комплекса тмРНК с рибосомой. Полученный результат свидетельствует о том, что стрептавидиновый аптамер (и, вероятно, рКЗ) экспонирован на поверхности тмРНК-рибосомного комплекса и сохраняется неизменной свою структуру.

Для оценки стехиометрии выделенных тмРНК-рибосомных

комплексов проводили количественный анализ РНК, входящих в их состав, с помощью гель-электрофореза в

денатурирующих условиях. ПААГ окрашивали бромистым этидием и фотографировали, используя специальную программу ''Gel" (Рис. 20).

»- 23SPHH — 16S PI«

Рисунок 19. Анализ РНК комплекса, выделенного с использованием тмРНК со стоп-кодоном в четвёртом положении в 6% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Дорожки: 1 - тмРНК, выделенная из .$30 экстракта, 2 -фракция, полученная при элюции биотином, 3 - фракция, которая была нанесена на смолу, 4 - фракция, не связавшаяся со смолой, 5 - фракция, полученная при промывке смолы. Положение рибосомных 235, 16Б и 5Б РНК, тмРНК и тРНК показано стрелками.

комплексы

i

fv ¡í <о > ^ -S"

/ / ^ #

•С с ^ ^

Таблица 6. Соотношение тмРНК к 5Б рРНК в различных комплексах. (Суммированы результаты трёх независимых экспериментов.)

комплексы trnRNA/5S RNA

tmRNA-2 3.1 ±0.1

tmRNA-4 3.0 ±0.2

tmRNA-5 2.7 ±0.1

tmRNA-l 1 2.9 ±0.1

Рисунок 20. Анализ РНК комплексов, выделенных с использованием тмРНК со стоп-кодоном во 2, 4, 5 и 11 положениях (дорожки подписаны соответственно), в 8% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Положение 5Б рРНК и тмРНК показано стрелками.

Интенсивность полос, соответствующих 58 рРНК и тмРНК, в каждой дорожке была оценена с помощью программы 1та§е<3иап1 5.0.1тк. Известно, что интенсивность окраски бромистым этидием пропорциональна длине РНК, что позволяет соотнести сигнал на геле с количеством РНК. Подсчитанное соотношение тмРНК к 5Б рРНК составило 3:1 (Таблица 6). Поскольку тмРНК в 3 раза длиннее, чем 5Б рРНК (363 и 120 нуклеотидов, что содержание тмРНК в выделенных

при

7" РГО

соответственно), можно утверждать, комплексах составляло около 100%.

Исходя из конструкции плазмид, используемых в эксперименте, остановке транс-трансляции в Р-участке рибосомы должна находиться тРНК что было подтверждено с помощью Нозерн-блот анализа с использованием DIG-меченных олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных последовательности тРНКРг0.

Таким образом, разработанная система выделения тмРНК-рибосомных комплексов позволяет останавливать транс-трансляцию на определенных этапах прочтения ОРС тмРНК и получать комплексы, содержащие рибосомы и тмРНК в соотношении 1:1. Принципиальная возможность такого выделения является доказательством того, что рКЗ тмРНК находится на поверхности рибосомы и остается структурированным на всех этапах транс-трансляции. Анализ белкового состава выделенных комплексов

Анализ белкового состава выделенных комплексов проводили с помощью гель-электорфореза (рис. 21).

Рибосомные белки, выделенные из 30S (ТР30) и 50S (ТР50) рибосомных субчастиц, были использованы в качестве маркеров. Белки из первичных рибосомных фракций (дорожки 1) и фракций, не связавшихся с колонкой (дорожки 2), были использованы как контроль. Комплексы, выделенные за счёт

связывания тмРНК-4 и тмРНК-11, несущих стрептавидиновый аптамер, содержат рибосомные белки (Рис. 21, А и Б, дорожки 3).

А Б

Рисунок 21. Анализ белкового состава комплексов, выделенных с использованием тмРНК со стоп-кодоном в четвертом (А) или одиннадцатом (Б) положениях, с помощью электрофоретического разделения белков в 17,5% Tricine-SDS-ПААГ. Дорожки: 1 - исходная рибосомная фракция, которая была нанесена на смолу, 2 - фракция белков, не связавшихся со смолой, 3 - фракция, полученная при элюции биотином, ТРЗО и ТР50 - белки, выделенные из 30S и 50S субчастиц рибосом, соответственно, молекулярная масса некоторых из них показана справа. Звёздочкой отмечена неспецифическая полоса, которая появляется при взаимодействии стрептавидин-сефарозы с рибосомной фракцией. Толстыми стрелками показано местонахождение прокариотических факторов элонгации. MALD1 масс-спектры под гелями получены в результате HDMMS эксперимента, определяющего присутствие гипотетического пептида ANISDSYVLLR с m/z равным 1250.67 в триптическом лизате, полученном для соответствующих фрагментов геля из контрольных (ТРЗО, ТР50) и экспериментальных (3) дорожек.

Полосы, соответствующие по подвижности элонгационным факторам G, Tu и Ts, отмеченные стрелками на Рис. 21, слева от дорожек 1, пропадают в дорожках 3, соответствующих комплексам. Дополнительная полоса с молекулярной массой порядка 18-19 kDa, что соответствует белку SmpB, появляется в дорожках 3. Фрагменты геля, содержащие данную полосу, были вырезаны и после триптического гидролиза проанализированы с помощью MALD1 масс-спектрометрии4.

Анализ белкового состава комплексов, содержащих тмРНК со стоп-кодонами во 2 или 5 положениях ОРС, показал, что и в них наряду с рибосомными белками появляется дополнительная полоса, соответствующая белку SmpB.

Первоначально количество SmpB в комплексах было оценено денситометрически по соотношению интенсивности полосы, соответствующей белку SmpB, к интенсивности полосы, соответствующей рибосомному белку L2, в ПААГ, окрашенном красителем кумасси голубым R250. Проведенный анализ

4 Анализ проводили в сотрудничестве с М. Кал кумом (Бекмановский исследовательский институт, Дуарт. США).

показал, что не более одной молекулы БтрБ связывается с одной рибосомой в выделенных комплексах.

Для уточнения полученных результатов был проведен Вестерн-блот анализ для комплексов, содержащих тмРНК со стоп-кодонами во 2, 4, 5 или 11 положениях (Рис. 22, дорожки подписаны соответственно).

л комплексы

•> у- 'р > ^ # # ^

У у ¡? ^ ^ ^ ^

ЭгарВ

Рисунок 22. Анализ соотношения количества белка 5трВ и рибосомного белка 53 в комплексах рибосом с тмРНК со стоп-кодоном во 2, 4, 5 или 11 положениях. А. Белки БтрВ и "53 БЗ в составе различных комплексов (дорожки

подписаны соответственно). Дорожки 1-5 - 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 и 0.025 пмоль очищенного белка ЙтрВ. Дорожки 6-10 - 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 и 0.4 пмоль суммарного белка ЗОЭ. Б. Калибровочный график

зависимости интенсивности сигнала на рентгеновской плёнке от количества белков БтрВ или БЗ в образце.

10 20 30 «0 50 ео 70 60

Сигнал (у. ся.)

10 20 30 13 50 № 70

Сигнал (>. сл.)

Визуализацию белков проводили с помощью антител против белка 8трВ и рибосомного белка 83. Белок 8шрВ (дорожки 1-5) и суммарный рибосомный белок 830 субчастицы (дорожки 6-10), нанесенные на гель в количествах от 0,025 до 0,4 пмоль, были использованы для построения калибровочного графика зависимости интенсивности сигнала на рентгеновской пленке от количества белка в пробе (Рис. 22, Б). Использование этого графика позволило нам оценить количество 8шрВ и белка 83 в комплексах, содержащих тмРНК со стоп-кодонами

в положених 2, 4, 5 или 11, и

Таблица 7. Соотношение белка 8шрВ к рибосомному белку 83 в разных комплексах (Суммированы результаты трёх

независимых экспериментов.)

комплексы 8шрВ/83

ИпЯКА-2 1.00 ±0.05

йп1УЧА-4 0.94 ± 0.09

мЯКД-З 1.06 ±0.05

шАКА-! 1 1.03 ±0.08

установить, что одна рибосома связывает одну молекулу 8трВ во всех изученных комплексах (Таблица 7).

Из литературных данных известно, что белок 8трВ необходим для первоначального связывания тмРНК с рибосомой, однако дальнейшая его судьба оставалась неясной. Кроме того, разногласия возникали и при

обсуждении вопроса о числе молекул белка SmpB в комплексе с рибосомой и тмРНК. Мы показали, что SmpB остаётся связанным с тмРНК-рибосомным комплексом до конца процесса транс-трансляции. Стехиометрия комплекса SmpB-тмРНК-рибосома равна 1:1:1 на всех стадиях транс-трансляции от этапа, когда TLD тмРНК находится в Е-участке рибосомы, до терминации транстрансляции на природном стоп-кодоне.

Исследование комплексов тмРНК с рибосомой методом химического пробита

Как уже отмечалось ранее, сведения о взаимодействии компонентов тмРНК-рибосомных комплексов между собой крайне ограничены. Одним из методов изучения рибонуклеопротеидных комплексов, позволяющим исследовать контакты компонентов комплекса между собой, а также изменения в структуре РНК, вызванные комплексообразованием, является метод химического пробинга. Для проведения такого исследования необходимо выделение комплекса в препаративных количествах, именно трудность такого выделения и объясняет отсутствие подобных работ. В литературе описано единственное исследование, в котором метод химического пробинга использовали для изучения тмРНК-рибосомных комплексов. В этой работе были исследованы начальные этапы процесса транс-трансляции. В условиях in vitro путем последовательного добавления компонентов были сформированы комплексы тмРНК с рибосомой от преинициаторного до элонгационного, в котором TLD тмРНК располагался в Е-сайте рибосомы.

Выделенные нами из клеток тмРНК-рибосомные комплексы, в которых /пранс-трансляция был а заблокирована на разных этапах прочтения ОРС, позволяют изучить взаимодействие тмРНК с рибосомой на более поздних этапах - от стадии, когда тРНК-подобная часть тмРНК всё ещё связана с Е-участком рибосомы до терминации на стоп-кодоне, закодированном в ОРС тмРНК.

В качестве модифицирующих агентов для изучения изменений структуры тмРНК и её контактов с компонентами системы транс-трансляции были использованы DMS, СМСТ и кетоксаль. DMS метилирует А по положению N1 и в меньшей степени С в положении N3, СМСТ модифицирует U в положении N3 и в меньшей степени G в положении N1, и кетоксаль модифицирует G в положениях N1 и N2. Каждый из четырех выделенных комплексов рибосомы, соответствующих различным этапам трансляции ОРС тмРНК, был обработан DMS, СМСТ или кетоксалем. Нуклеотиды, подвергнувшиеся модификации, определяли с помощью реакции обратной транскрипции. Интенсивность полосы, соответствующей остановке обратной транскриптазы, позволяет определять доступность каждого отдельного нуклеотида для модифицирующего реагента и, таким образом сделать вывод о его контактах с другими участниками в составе комплекса или изменениях в структуре РНК. Как контроль мы использовали соответствующие свободные тмРНК, выделенные из клеток с помощью аффинной хроматографии. Нам удалось исследовать большую часть последовательности тмРНК (фрагменты от Gl72 до С239, и от U341 до А363 не были изучены) в составе четырёх комплексов, соответствующих различным стадиям трансляции ОРС тмРНК (данные суммированы на рисунке 23).

Аптамер к CTpenTaBnaHHv

Дкккй-nm tmRNA-2 tmRNA-4 tmRNA-5 tniRNA-ll

uv 11VII CJUJl и/

A GUC GCA AAC GAC GAA AAC UAC GCU UUA GCA GCU UAA UAA CCU GCU UAG AGC

Pro стоя _

A Cil) С CCA ЦДЛ AAC ДАЛ AAC UAC CiCU UUA GCA GCU UAA UAA C( I GCU UAG AGC

Pro стоп ___

A GUC ICABAC CCA UjA AAC,UAC GCU UUA GCA GCU UAA UÀA CCI I GCU UAG AGC Pro стоп

Л 6UC |СЛ AAClÀC CCA ЦЩЛАЛС GCU UUA GCA GCU UAA UAA CCU ССЩКС AGC

Pro стоп

A GUC |CA AAC Ggc GAA AAC UAC GCU L'UA|AC ССАЦЛ AAAlCf GCfflfAO AGC

.124 325 lmRNA-2 G G

tmRNA-4 G'Ci

tmRNA-5 G'C

tniRNA-ll G G

Рисунок 23. Спектр модификаций нуклеотидов тмРНК в различных рибосомных комплексах по сравнению со свободной тмРНК в растворе. Внизу рисунка выделена область мРНК-подобной части тмРНК с прилегающими районами (от 86 до 137 нуклеотида последовательности тмРНК), слева - нуклеотидов 3240 0325. Зелёный цвет обозначает уменьшение доступности действию модифицирующего агента нуклеотидов тмРНК в комплексе с рибосомой по сравнению с тмРНК в растворе, красный - увеличение, синий - без изменения, серый или чёрный - неспецифическое разрезание цепи РНК.

мРНК-подобная часть тмРНК, предшествующий регион и спираль 5.

Наибольшее число эффектов было найдено в районе МЬЭ тмРНК и прилегающих к нему участков - области перед кодоном возобновления синтеза и спирали 5 (Рис. 23, 24 и 25). Именно здесь наблюдались сильные изменения доступности нуклеотидов тмРНК для модифицирующих реагентов в различных рибосомных комплексах по сравнению со свободной тмРНК в растворе. Сравнение между собой спектров модификации для разных комплексов выявило также существенные изменения реакционной способности нуклеотидов тмРНК при переходе от комплекса, остановленного на 2-ом кодоне ОРС, к комплексу, заблокированному на природном стоп-кодоне (Рис. 23).

А

1тКЫА-2

Г7-

ОМЭ Ке1 СМСТ ым С 1т С ип С 1т С гт

— п г Е

-В -ш

: Е

Б ИпРЫА-Д

г

оме Ке1 СМСТ ММ

с 1т с 1т

—* «и

— —.

м

л а ' « в

: £=яе

^ИЫА-б

1 ОМЭ Ке! СМСТ ЫМ 1 С Ш1 С 1т С 1т С 1т - - •*• ► I ш

I

ОМв Ке1 СМСТ ЫМ С 1т С 1т С 1т С 1т

?2 £2

==

Рисунок 24. Модификации нуклеотидов в области С86-С137 для комплексов рибосомы с тмРНК-2 (А), -4 (Б), -5 (В) и -II (Г), йп - дорожки, соответствующие свободной тмРНК в растворе, С - дорожки, соответствующие комплексу. Панель ЭМ8, Ке1, СМСТ относятся к образцам, обработанным соответствующими реагентами. ЫМ - ^модифицированный образец. В рамках выделена последовательность сигнала терминации. Стрелками обозначены эффекты, описанные в тексте.

Цепь РНК в комплексе с тмРНК-2, остановленном на втором кодоне ОРС тмРНК, наиболее защищена от модификации по сравнению с другими комплексами (Рис. 23 и 24, А). Из 51 нуклеотида в области, начинающейся с -1

кодона ОРС до конца спирали 5 тмРНК, 27 нуклеотидов стали менее доступны действию модифицирующих агентов при формировании комплекса с тмРНК-2. Нуклеотиды U88, U93, U105, U110-112, U119-120, U123, U131-132 и А92, А95-97, А102-103, А106, А113, А116, А121-122, А124-125, С126, А133, А135 тмРНК-2, доступные для модификации СМСТ и DMS, соответственно, в растворе (Рис. 24, А, линии tm в панелях СМСТ и DMS), защищаются от модификации в большей (например, U93) или меньшей (например, А124) степени, когда молекула тмРНК становится компонентом комплекса с рибосомой (Рис. 24, А, линии С в панелях СМСТ и DMS).

В тоже время доступность двух нуклеотидов, а именно, G94 и G99, для модифицирующего агента кетоксаля увеличивается, когда тмРНК-2 находится в составе тмРНК-рибосомного комплекса (сравнить линии С и tm в панели Ket, Рис. 24, А).

Перемещение стоп-кодона, окруженного специальной

последовательностью, неблагоприятной для терминации, в положение 4-ого кодона ОРС тмРНК уменьшает количество нуклеотидов, защищенных в результате образования соответствующего тмРНК-рибосомного комплекса, до 20 (Рис. 23 и 24, Б). Защищенные нуклеотиды в З'-области описываемого района (U105, U110-112, U120, U123, U131-132 и 92, А113, А116, А121-122, А124-125, С126, А133) остаются, в основном, теми же, что и в комплексе с тмРНК-2. Однако, в 5'-области, последовательность которой была изменена, разница в спектре модификаций очевидна. Нуклеотид G87 становится менее, а нуклеотиды G90, G93 и G100 - более доступными для модификации кетоксалем (Рис. 24, Б, панель Ket). Нуклеотид в положении 94, доступный для модификации в комплексе с тмРНК-2, становится защищенным в комплексе с тмРНК-4 (А94 на Рис. 24, Б, панель DMS).

Второй доступный для модификации в тмРНК-2 нуклеотид G99 в тмРНК-4 был изменён на U99, и его доступность для модифицирующего агента в комплексе и в растворе стала одинаковой (Рис. 24, Б, панель СМСТ). Нуклеотид А98 защищается от модификации DMS в комплексе с тмРНК-4 (Рис. 24, Б, панель DMS).

Смещение терминирующей последовательности по мРНК-подобной части тмРНК (тмРНК-5) уменьшает количество нуклеотидов, защищаемых от модификации при образовании комплекса с рибосомой, до 15 (Рис. 23 и 24, В). Защиты нуклеотидов в положениях U105, А121-122, А124-125, и С126 исчезают. В то же время защита G87 и усиление доступности для модификации нуклеотида G90 остаются теми же, что и в комплексе с тмРНК-4, G93 снова приобретает защиту, как в комплексе с тмРНК-2 (Рис. 24, В, панель Ket). Нуклеотиды в положениях 96 и 103 (оба G для тмРНК-5) становятся доступными для модификации кетоксалем в комплексе тмРНК с рибосомой (Рис. 24, В, панель Ket). Нуклеотиды в положениях 94, 97 и 102 (в тмРНК-5 А, А и U, соответственно) более защищены в тмРНК-рибосомном комплексе, чем в тмРНК-5 в растворе (Рис. 24, В, панели DMS и СМСТ, соответственно).

Только 5 нуклеотидов защищены от модификации химическими реагентами в комплексе рибосомы с тмРНК-11 (Рис. 23 и 24, Г), среди них нуклеотиды А97,

U120 и U131-132, упомянутые выше для предыдущих комплексов. Изменения касаются Gl 14, G121 и С126, которые становятся более доступными для модификации химическими реагентами, а также U128, который защищается в комплексе рибосомы с тмРНК-11 (Рис. 24, Г).

Следует упомянуть, что некоторые из нуклеотидов в различных тмРНК были исключены из обсуждения из-за неспецифического разрезания цепи РНК. Мы не можем оценить влияние образования комплексов с рибосомой на доступность модификации нуклеотидов С91, С98, AI00-101 в тмРНК-2; С95-97, А101-102, С104 в тмРНК-4; С91, А92, С99-100 в тмРНК-5; и С91, U105, С109, U112, С119, G129 в тмРНК-11.

Нуклеотиды А79-А84 и А86 в последовательности тмРНК, располагающейся между рК1 и кодоном возобновления синтеза, доступны для модификации DMS во всех изучаемых нами вариантах тмРНК в растворе (Рис. 25). Однако доступность данных нуклеотидов во всех тмРНК-рибосомных комплексах уменьшается (Рис. 23 и 25, линии, обозначенные С), указывая на защиту данной области от модификации.

Авторы единственного

исследования, в котором структуру тмРНК в составе комплексов с рибосомой изучали методом химического пробинга, не обнаружили никаких эффектов в районе MLD тмРНК и прилегающих к ней областях. Возможным объяснением такого результата может быть выбор модифицирующих агентов. В данной работе в качестве основного использовали метод разрезания цепи РНК в присутствии ацетата двухвалентного свинца. Кроме того, как уже упоминалось ранее, тмРНК-рибосомные комплексы были получены в условиях in vitro и отражали лишь начальные этапы транс-трансляции.

Конно и сотрудниками была обнаружена защита нуклеотида U85 от модификации СМСТ в комплексе тмРНК с белком SmpB, изменения доступности нуклеотидов А79-А84 и А86 действию DMS в этой работе не наблюдали. Мы не можем судить достоверно о степени доступности модификации нуклеотида U85 в наших комплексах, поскольку мы наблюдали неспецифическое разрезание цепи РНК в этом положении во всех образцах, за исключением обработанного DMS. Защиты нуклеотидов А79-А84 и А86 в наших комплексах можно объяснить взаимодействием тмРНК с рибосомой, причём при прохождении MLD тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции эти контакты не изменяются. Таким

DMS тмРНК

2 4 5 <1^ CtmCtmCtmCfm TGCA

Рисунок 25. Модификации нуклеотидов иб8-С90 ОМБ для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С - дорожки, соответствующие комплексу, йп - тмРНК в растворе. Т, О, С, А — дорожки, соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте.

образом, можно предположить, что, связавшись со своим сайтом на рибосоме на начальном этапе транс-трансляции, данный район тмРНК продолжает с ним взаимодействовать до стадии терминиции.

Согласно полученным результатам, спираль 5 тмРНК неустойчива в растворе, и её конформация, по-видимому, стабилизируется в комплексах тмРНК с рибосомой, хотя подобный эффект может возникать и в результате прямой защиты тмРНК рибосомой. Стоит отметить, что существование данной спирали тмРНК подтверждено не для всех организмов.

Как видно из рисунка 23, цепь РНК в районе МЫЗ тмРНК подвержена неспецифическим разрывам, причём в молекуле тмРНК-11 в наименьшей степени, вероятно потому, что природное расположение стоп-кодона обеспечивает оптимальное взаимодействие данной тмРНК с рибосомой, влияя таким образом на её стабильность.

Характерные изменения в доступности действию модифицирующих реагентов нуклеотидов стоп-кодона (в и О А нуклеотид в экспонируется во всех комплексах, тогда как нуклеотид и защищается в комплексах рибосомы с тмРНК-2, -5, -11) можно объяснить взаимодействием его с компонентами рибосомы.

В триплете йАС (-2 по отношению к стоп-кодону) последовательности тмРНК экспонируется нуклеотид в в комплексах рибосомы с тмРНК-4, -5, -11 и защищается нуклеотид А в комплексах рибосомы с тмРНК-2, -4, -5. Известно, что

аминокислота, А

кодируемая этим кодоном,

смст

тмРНК

2 4 5 11 СипСИпСтСм

С С А

Г- ГПГ г ~

оме

2 4 5 11 С 1т С 1т С 1т С

тмРНК

Т С С А

Г «с

Рисунок 26. Модификации нуклеотидов в области тРНК-подобной части тмРНК для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С - дорожки, соответствующие комплексу, № - тмРНК в растворе. Панели и СМСТ относятся к

образцам, обработанным соответствующими реагентами. Т, в, С, А - дорожки, соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте.

наряду с соседней с С-конца, определяет эффективность тиране-трансляции, вероятно за счёт определения продолжительности остановки трансляции на стоп-кодоне до узнавания его фактором терминации.

Возможно, этот процесс требует особой конформации данного триплета или/и его

непосредственного взаимодействия с компонентами трансляции.

тРНК-подобная часть тмРНК.

Для изучения 5'- и З'-концевых участков тмРНК были использованы праймеры,

комплементарные нуклеотидам 56-73 и 346-363 тмРНК. Доступность нуклеотидов в положениях Ш6, Ш7 (Рис. 23 и Рис. 26, А) и А334 (Рис. 26, Б) уменьшается во всех четырёх комплексах тмРНК с рибосомой по сравнению со свободными

тмРНК в растворе. Нуклеотид С335 становится более доступным для модификации DMS (Рис. 26, Б), когда тмРНК участвует в образовании комплекса с рибосомой.

Изменения реакционной способности этих нуклеотидов при обработке модифицирующими агентами в составе комплексов могут быть объяснены взаимодействием тмРНК с белком SmpB.

Из литературных источников известно, что нуклеотиды U15, U16, A318 и С319 тмРНК А. aeolicus (U16, U17, А334 и С335 Е. coli) более чем на 90% консервативны. В кристаллической структуре комплекса тРНК-подобной части тмРНК с белком SmpB А. aeolicus нуклеотиды U15, U16, А318 и С319 тмРНК вовлечены во взаимодействие с поверхностью белка в районе OB домена. Нуклеотиды U15, U16, A318 и С319, доступные для разрезания в присутствии ацетата двухвалентного свинца в свободном тРНК-подобном домене тмРНК в растворе, становятся защищенными в комплексе с SmpB. SmpB также защищает A318 от разрезания РНКазой S1, тогда как СЗ19 становится более доступным для РНКазой S1 в комплексе тмРНК-SmpB.

В кристаллической структуре комплекса тРНК-подобной части тмРНК с белком SmpB Т. thermophilus атомы нуклеотидов С15 (С2, С4, С5, N3, 02), U16 (02), А320 (С4, С8, N6, N1) и С321 (С2, N4) тмРНК Т. Thermophilus (U16, U17, А334 и С335 Е. coli) тесно взаимодействуют с SmpB.

Степень расщепления цепи РНК в присутствии ацетата двухвалентного свинца в положениях G333-C335 и U16-U17 тмРНК Е. coli уменьшается при увеличении количества белка SmpB (в молярных соотношениях TMPHK:SmpB от 1:1 до 1:10) в реакционной смеси. Аналогичный эффект был обнаружен и во всех исследованных рибосомных комплексах (от преинициаторного до содержащего TLD тмРНК в Е-сайте рибосомы). Также была обнаружена защита от модификации DMS нуклеотида А334 в комплексе тмРНК с белком SmpB и рибосомных комплексах.

G333 защищается белком SmpB от разрезания РНКазой Ti в комплексе SmpB с тРНК-подобной частью тмРНК.

Таким образом, белок SmpB остается связанным с тмРНК-рибосомным комплексом на всех стадиях транс-трансляции и занимает при этом свой канонический сайт связывания на TLD тмРНК.

Спираль 2 и псевдоузел 1. Связывание тмРНК с рибосомой привело к изменениям доступности некоторых нуклеотидов в спирали 2 и псевдоузле 1 тмРНК для модифицирующих агентов (Рис. 23 и 27). Нуклеотиды G29 (Рис. 27, А), U60 (Рис. 27, В), А309, A316 и А323 (Рис. 27, Е) стали более доступными для модификации нуклеотид специфическими реагентами во всех изученных комплексах. В тоже время нуклеотиды U46 (Рис. 27, Б), U65, U68 (Рис. 27, В), 301, А302, А305 (Рис. 27, Г), U311 (Рис. 27, Д) и A319 (Рис. 27, Е) защищаются от модификаций при образовании комплексов тмРНК с рибосомой. Интерес вызывают некоторые эффекты в спирали 2, которые зависят от природы тмРНК. Нуклеотиды G324 и G325 были доступны для модификации кетоксалем в тмРНК-4 и тмРНК-5 в растворе (Рис. 27, Е), но становятся защищенными от модификации при формировании тмРНК-рибосомных комплексов. Тот факт, что

тмРНК

смст

тмРНК

С \т С ;гп С йг Сян Т ОСА

В

I ,

I

А»« . А»! -

As«

А»! .

А«к -

DMS тмРНК

4 S 71

CtmOtmCtmClmT G С А

г -

" ------¿.Г

- ....... о

д

"т " '

тмРНК

CimCtnîCtiriCaiîCltnCliriCirRCtnTGC

- -

изменение нуклео-тидной последовательности в MLD тмРНК приводит к изменению спектра модификаций в спирали 2, прилегающей к TLD тмРНК, позволяет предположить их сближенность в структуре молекулы тмРНК в растворе. При образовании комплексов с рибосомой модификации этих нуклео-тидов исчезает -они полностью защищены от действия кетокса-ля во всех тмРНК-рибосомных комплексах.

Известно, что А32 и А34 в спирали 2 защищаются от разрезания в присутствии ацетата двухвалентного свинца в комплексе с SmpB и в

комплексах с рибосомой. В нашей работе нуклеотиды А32, А34 в спирали 2 тмРНК одинаково модифицируются в растворе и во всех тмРНК-рибосомных комплексах.

Кроме того, Иванова и соавторы обнаружили увеличение доступности нуклеотидов U59 и G58 в рК1 тмРНК для разрезания в присутствии ацетата двухвалентного свинца в комплексе с белком SmpB и в двух рибосомных комплексах (с TLD тмРНК в А- или Е- сайте). В наших экспериментах соседний нуклеотид, U60, становился более доступным для модификации СМСТ при образовании комплексов (Рис. 27, В). Причина таких различий кроется, вероятно,

Агя -Ок* ~

' -

Рисунок 27. Модификации нуклеотидов в области спирали 2, псевдоузлов 1 и 4 тмРНК для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С - дорожки, соответствующие комплексу, Нп - тмРНК в растворе. Панели БМБ, КеИюха1 и СМСТ относятся к образцам, обработанным соответствующими реагентами. Т, О, С, А - дорожки, соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте.

в разной природе исследованных комплексов и использованных модифицирующих агентов.

Псевдоузел 4. Нуклеотиды А290, А291 и А292 защищены от модификации DMS во всех изученных комплексах (Рис. 23 и 27, Г).

В работе Ивановой и коллег было показано, что нуклеотиды А298, А294 в рК4 доступны для разрезания в присутствии ацетата двухвалентного свинца в комплексе тмРНК с SmpB, а также в комплексе с рибосомой, в котором TLD тмРНК находится в Р-сайте. В нашей работе эти нуклеотиды показывали очень слабый эффект при модификации DMS, который не зависел от образования комплексов тмРНК с рибосомой (Рис. 27). Данное расхождение можно объяснить разной природой комплексов и модифицирующих агентов, использованных в работах.

Псевдоузел 2. Нуклеотид G156 становился более доступным для модификации

кетоксалем во всех исследуемых нами комплексах тмРНК с рибосомой (Рис. 23 и 28). Интересный эффект, воспроизводимый во всех экспериментах, был отмечен для нуклеотида С151. При образовании тмРНК-рибосомных комплексов мы получали сильный сигнал от СМСТ, реагента, который, как известно, модифицирует U в положении N3 и в меньшей степени G в положении N1.

Следует отметить, что вне TLD и MLD тмРНК увеличение доступности нуклеотидов

действию модифицирующих агентов при образовании тмРНК-рибосомных комплексов (Рис. 23) происходит в петлях (G29, G156, А309, A316, А323) или на границе петель (U60, причем комплементарный ему А73 модифицируется и в растворе, и в комплексах, следовательно, эта нуклеотидная пара не является стабильной). Можно предположить, что взаимодействие с рибосомой фиксирует эти нуклеотиды в конформации, предпочтительной для модификации. Формирование тмРНК-рибосомных комплексов приводит к защите от модификаций некоторых нуклеотидов в спиралях тмРНК, возможно, за счет стабилизации пары, например, для U46-A306. Не исключено и возникновение новых контактов с компонентами трансляции или внутри самой тмРНК, например, U65, U311 и A319 защищаются в комплексах, в то время как А51, комплементарный U65, не меняет своего поведения и модифицируется в растворе и в комплексах с равной эффективностью, a G43 и С35, комплементарные, соответственно, U311 и A319, не модифицируется ни в растворе, ни в комплексе. Аналогичным образом можно

Kethoxal

■г 4 5 ÎT fmRNA-4 С tm С tm С tm С tm Т G С А

W*

u153 с с

„, „ «к G

*** ** О

. _ шве

Рисунок 28. Модификации нуклеотидов в области псевдоузла 2 тмРНК для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С - дорожки, соответствующие комплексу, Ил - тмРНК в растворе. Т, в, С, А - дорожки, соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками обозначены эффекты, обсуждаемые в тексте.

объяснить и появление защит нуклеотидов в одноцепочечных участках РНК, например, U68, А290-292, А301-302.

В некоторых местах тмРНК (например, С37, U42 и С139) в области, соединяющей TLD и MLD, происходили неспецифические разрывы цепи РНК даже в отсутствие модифицирующих агентов, возможно, из-за повышенной лабильности связи.

Таким образом, согласно данным, полученным с помощью метода химического пробинга, структура и контакты тмРНК (за исключением MLD) практически не изменяются в ходе транс-трансляции, что хорошо согласуется с предложенной нами моделью прохождения тмРНК через рибосому в ходе трансляции ОРС тмРНК.

Исследование комплекса тмРНК-4 с рибосомой методом криоэлектронной томографии

Выделение комплексов тмРНК с рибосомой, остановленных на определенных стадиях транс-трансляции, позволило нам изучить пространственную организацию элонгационного тмРНК-рибосомного комплекса методом криоэлектронной томографии. На сегодняшний день были опубликованы модели преинициаторного и инициаторного тмРНК-рибосомных комплексов, полученные с помощью крио-ЭМ.

В нашей работе, проведенной совместно с Л. Исакссоном (Стокгольмский Университет, Швеция), мы исследовали комплекс тмРНК с рибосомой, в котором «¿»ямс-трансляция была остановлена на 4 кодоне мРНК-подобной части тмРНК. Метод криоэлектронной томографии позволяет исследовать индивидуальные частицы гетерогенного образца, хотя и не дает столь высокого разрешения, как крио-ЭМ. У нас были основания предполагать, что петля тмРНК, состоящая из псевдоузлов, может обладать определённой подвижностью в растворе, что и помешало нам ранее при решении структуры комплекса с использованием метода крио-ЭМ.

Для реконструкции мы использовали приблизительно 200-300 частиц, причем, в пул рассматриваемых отбирались только те рибосомы, которые состояли из двух субчастиц. В контрольном эксперименте были получены изображения «пустых» рибосом, и «вычитание» из общей электронной плотности комплекса плотности, относящейся к 70S рибосоме, позволило нам определить плотность, соответствующую тмРНК (Рис. 29). Дополнительная плотность, соответствующая тмРНК, выглядит как петля над «плечом» 30S субчастицы рибосомы и, вероятно, сформирована псевдоузлами.

Состоящая из псевдоузлов петля может занимать различные положения на рибосоме, в пределах от «плеча» до вершины «головы» 30S рибосомной субчастицы, что свидетельствует о ее подвижности в растворе и объясняет тот факт, что до сих пор не удалось добиться высокого разрешения структуры для инициаторного тмРНК-рибосомного комплекса методом крио-ЭМ.

Разрешение некоторых частиц позволяет увидеть, что положение концов данной петли тмРНК на рибосоме соответствует входу и выходу из канала мРНК.

ef-tu-smotmmnna

тмРНК

LI suil

30S

Рисунок 29. Сопоставление моделей структуры комплексов тмРНК с рибосомой в преинициаторном состоянии (слева) и на стадии трансляции ОРС тмРНК (справа). Плотность, соответствующая 30S рибосомной субчастице, окрашена в светло-серый цвет, 50S - в голубой, тмРНК - в пурпурный или красный.

При сравнении моделей структуры комплексов в преинициаторном и элонгационом состоянии (Рис. 29) видно, что общий вид петли, состоящей из псевдоузлов, а также положение одного из её концов рядом со входом в канал мРНК совпадают. Другой конец петли в элонгационном комплексе находится рядом с выходом из канала мРНК, свидетельствуя о том, что мРНК-подобная часть тмРНК располагается в канале.

Моделирование структуры комплексов тмРНК с рибосомой

Для того чтобы понять, как молекула тмРНК организована в рибосоме на различных стадиях транс-трансляции, совместно с А. Головиным (Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М.В. Ломоносова), мы провели моделирование структуры тмРНК в рибосоме с помощью методов молекулярной динамики, отработанных ранее при моделировании структуры 5 S рРНК в рибосоме. Учитывая сложность системы, мы использовали упрощённое представление аминокислотных и нуклеотидных остатков в виде Са и Р атомов, соответственно. При моделировании мы использовали полученную методом РСА структуру рибосомы, для которой определен путь прохождения мРНК. Мы предположили, что матричная область тмРНК должна располагаться на рибосоме аналогично мРНК. Для тмРНК-2 терминационный кодон UGA размещали в А-участке рибосомы, а предшествующий ему ССА - в Р-участке. TLD тмРНК, структура которого была взята из ранее опубликованных моделей, занимал Е-участок аналогично акцепторной ветви тРНК. Упомянутые здесь элементы молекулы тмРНК были зафиксированы. Из нуклеотидов, входящих в состав псевдоузлов 2, 3 и 4 и спирали 5, формировали кольцевую цепь.

Минимизация энергии с дистанционными ограничениями на псевдоузлы 2, 3, 4 и шпильку 5 тмРНК привела к организации этих элементов вокруг головы 30S субчастицы рибосомы выше «выступа». К сожалению, подобный подход не сработал по отношению к спирали 2 и псевдоузлу 1, так как кольцевая структура выходила за пределы доступного пространства внутри рибосомы. Соответствующий сегмент тмРНК был случайным образом расположен в

заданном пространстве внутри рибосомы. Наложение дистанционных ограничений привело к самоорганизации этого сегмента во внутреннем пространстве рибосомы.

На рисунке 30, А данные о доступности нуклеотидных остатков тмРНК-2 действию модифицирующих агентов представлены на полученной модельной структуре молекулы тмРНК-2 в рибосоме. Белок SmpB занимает сайт связывания на TLD, определённый методом РСА. TLD тмРНК расположен в Е-участке. Петля А79-А86, нуклеотидные остатки которой защищаются в рибосомном комплексе от действия модифицирующих агентов, локализуется на входе в мРНК-связывающий канал. рК1 находится неподалёку от Е-участка в районе выхода тРНК из рибосомы. L1 палец повернут согласно данным криоэлектронной микроскопии о конформационных изменениях в рибосоме, вызванных выходом из неё деацилированной тРНК. Только в этом случае удаётся разместить TLD, белок SmpB и рК1 в межсубъединичном пространстве со стороны белка L1. Спираль 2d соединяет рК1 и арку, сформированную псевдоузлами 2, 3 и 4. Эта арка начинается от плеча 30S субчастицы и окружает её голову. Спираль 5 расположена на входе в канал для мРНК и может быть расплетена при последующих шагах трансляции ОРС без деформации арочной структуры. Кодон возобновления синтеза находится в Р-участке рибосомы, второй кодон ОРС - в А-участке. Видно, что нуклеотидные остатки, которые защищаются от модификации при комплексообразовании, действительно вовлечены во взаимодействие с рибосомой, а усиление реакционной способности нуклеотидов происходит в местах искривления цепи РНК.

50S 50S

Рисунок 29 Модели структурной организации тмРНК-2 (А) и тмРНК-4 (Б) в соответствующих комплексах с рибосомой (показан вид сверху). 30S рибосомная субъединица окрашена голубым цветом, 50S - зелёным. А, Р, Е обозначают соответствующие участки связывания тРНК на рибосоме. тмРНК показана как чёрная линия, соединяющая атомы фосфора. Нуклеотиды тмРНК, которые защищаются при образовании комплексов от действия модифицирующих агентов, выделены зелёным цветом, красным обозначены нуклеотиды, доступность которых увеличивается при комплексообразовании. Белок SmpB представлен в воде пурпурных сфер, соответствующих Са атомам аминокислот. Структурные элементы тмРНК отмечены.

Аналогичный подход мы применили для построения модели структуры тмРНК-4 в соответствующем рибосомном комплексе (Рис. 30, Б). На этой стадии транс-тракстцш комплекс белка SmpB с TLD тмРНК уже вышел из рибосомы и располагается со стороны платформы таким образом, что не мешает выходу деацилированной тРНК. Спирали 2а, 2Ь, 2с соединяют TLD с псевдоузлом 4 (часть арки) с одной стороны, и с псевдоузлом 2 и петлей А79-А86 с другой. Защищаемая петля А79-А86 прочно связывается в кармане для связывания мРНК, что вызывает конформационное изменение в структуре кодона возобновления синтеза, который становится доступнее для модификации. Арка, выявленная с помощью криоэлектронной томографии, состоит из трёх псевдоузлов. Она окружает голову 30S рибосомной субчастицы и начинается от её плеча, как и в случае тмРНК-2. Полученная модель разрешает перемещение арки вокруг головы рибосомной субчастицы, что соответствует данным томографии. Спираль 5 располагается на входе в канал для мРНК. Третий и четвёртый кодоны ОРС тмРНК занимают Р- и А-участки в декодирующем центре. Как и для тмРНК-2, нуклеотидные остатки, которые защищаются от модификации при комплексообразовании, действительно вовлечены во взаимодействие с рибосомой, а усиление реакционной способности нуклеотидов происходит в местах искривления цепи РНК.

Хорошая корреляция результатов моделирования и экспериментальных данных для комплексов с тмРНК-2 и 4 позволила нам перейти к построению моделей организации структуры тмРНК в рибосоме на начальных этапах транстрансляции.

При моделировании инициаторного комплекса мы расположили TLD тмРНК в А-участке, тРНК, связанную с клеточной мРНК - в Р-участке, MLD тмРНК в канале для мРНК и применили вышеописанный подход. Полученная модель представлена на Рис. 31, А. Поскольку в декодирующей области рибосомы недостаточно места для рК1; данная структура сформировалась в межсубъединичном пространстве со стороны белков L7/L12. Как известно из литературных данных, уже в преинициаторном комплексе сайт связывания белка SmpB на тмРНК изменяется по сравнению с его сайтом связывания в растворе. Мы предположили возможность дальнейшего перемещения белка SmpB в инициаторном комплексе и расположили его в области рК1 и одноцепочечной петли А79-А86. Известно, что район А79-А86 является одним из сайтов связывания белка SmpB. Белок защищает от химической модификации нуклеотид U85, мутации в области А79-А86 различным образом сказываются на эффективности транс-трансляции вплоть до полного её подавления.

На рисунке 31, Б представлена модель комплекса тмРНК с рибосомой после первого шага транслокации. TLD тмРНК переместился в Р-участок рибосомы, а кодон возобновления синтеза занял А-участок. Видно, что на данном этапе транс-трансляции единственное доступное место на рибосоме для белка SmpB, рК1 и петли А79-А86 - это межсубъединичное пространство в районе Е-участка 30S субчастицы.

В

SmpB

l7/l12

SmpB рКЗ

АРЕ

АРЕ

L1 "Г TLD

TLD

■

L7/L12

30S 50S

30S 50S

Рисунок 31. Модели структуры тмРНК-рибосомных комплексов, содержащих TLD в А- (А) и Р- (Б) участках рибосомы. Левое изображение - вид со сторона А- (А) или Е- (Б) участка рибосомы, правое - со спины 50S субъединицы. 30S рибосомная субъединица окрашена голубым цветом. 50S - зелёным. А, Р, Е обозначают соответствующие участки связывания тРНК на рибосоме. тмРНК показана как чёрная линия, соединяющая атомы фосфора. Петля А79-А86 тмРНК выделена зелёным цветом. Белок SmpB представлен в воде пурпурных сфер, соответствующих Са атомам аминокислот. тРНК в Р-участке рибосомы показана фиолетовым цветом (А). Структурные элементы тмРНК отмечены. (В) Схематическое представление поворота структурного элемента (красный овал), сформированного белком SmpB и элементами тмРНК (псевдоузлом 1 и одноцепочечным районом непосредственно перед кодоном возобновления синтеза), приводящего к размещению кодона возобновления синтеза в A-участке рибосомы. (Вверху) Пептидил-тРНК в Р-участке представлена чёрной линией с жёлтым и зелёными кружками, аланил-тмРНК в А-участке - чёрной линией с красным кружком для Ala и красным овалом для структурного элемента, сформированного белком SmpB и элементами тмРНК (псевдоузлом 1 и одноцепочечным районом непосредственно перед кодоном возобновления синтеза). (Внизу) После транспептидации тмРНК перемещается в Р-участок рибосомы.

Таким образом, можно предположить, что при EF-G-зависимой транслокации происходит поворот вокруг TLD тмРНК в Р-участке элемента, сформированного рК1, петлей А79-А86 и белком SmpB, приводящий к его перемещению из А- в E-участок (Рис. 31, В). Это движение приводит к точному позиционированию кодона возобновления синтеза в A-участок декодирующего центра рибосомы, поскольку положение элемента SmpB-pKl-A79-A86 строго детерминировано размерами полости в E-участке. Существует ряд биохимических

данных, свидетельствующих в пользу этой модели. Так, известно, что нуклеотиды А79-А86 важны для правильного определения кодона возобновления синтеза, более того, мутации в положении 86 позволяют перенос пептида на TLD тмРНК, но запрещают последующую транслокацию. Наша модель предполагает, что рК1 играет важную структурную роль в определении позиции элемента, несущего белок SmpB. Действительно, мутации и делеции нуклеотидов, входящих в состав рК1 влияют на эффективность транс-трансляции, кроме того удалось создать стабильные шпильки, которые могут функционально заменить рК1.

После первой транслокации пространство в районе L7/L12 освобождается, и элонгационный фактор Tu может приносить Ala-тРНК для инициации трансляции ОРС тмРНК. На следующей стадии транс-трансляции TLD переходит в Е-участок рибосомы, что должно сопровождаться частичным разрушением элемента, несущего белок SmpB, перемещением петли А79-А86 в направлении кармана для связывания мРНК, а белка SmpB - в сайт связывания на TLD. На последующих этапах /ира//с-трансляции петля А79-А86 занимает карман для связывания мРНК, фиксируется в нем с помощью рК1 и остается там до терминации транстрансляции, что подтверждается данными химического пробинга структуры тмРНК в рибосомных комплексах.

Таким образом, нам удалось определить структурно-функциональные особенности взаимодействия тмРНК с рибосомой на разных этапах транстрансляции, предложить молекулярную модель механизма прохождения тмРНК через рибосому и возможный механизм определения кодона возобновления синтеза.

ВЫВОДЫ

1. Элонгационный фактор Tu и тмРНК участвуют во взаимодействии нового типа. В отличие от канонического комплекса между ацилированным тРНК-подобным доменом тмРНК и EF-Tu'GTP деацилированная тмРНК образует комплекс с EF-Tu*GDP за счет взаимодействия со спиралью 2 и псевдоузлом 4.

2. Белок SmpB входит в состав тмРНК-рибосомных комплексов на всех стадиях транс-тртспяцш. Элонгационные комплексы содержат по одной молекуле белка SmpB, связанной с каноническим участком взаимодействия на TLD тмРНК.

3. Молекула тмРНК в растворе существует в виде двух компактно свернутых доменов, между которыми уложена одноцепочечная мРНК-подобная область. В ходе транс-трансляции домены, не изменяя своей структуры, занимают определенные сайты на рибосоме, в то время как матричная область перемещается по ней в экспонированной форме.

4. Экспериментальная проверка двухдоменной модели с помощью химических, физических и биоинформационных подходов позволяет построить динамическую модель транс-трансляции, адекватную всей совокупности имеющихся на сегодняшний день данных. Согласно этой модели структурные элементы тмРНК (псевдоузлы, спирали, арка вокруг головы 30S рибосомной

субчастицы, сформированная псевдоузлами), сохраняются в процессе транстрансляции. Основные изменения при прохождении MLD тмРНК через рибосому затрагивают район мРНК-подобной области и спирали 5 тмРНК.

5. Правильное позиционирование кодона возобновления синтеза в А-участке рибосомы задается структурным элементом, сформированным белком SmpB, и псевдоузлом 1 и петлёй А79-А86 тмРНК, который совершает поворот при транслокации TLD тмРНК из А-участка рибосомы в Р-участок.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах

1. Шпанченко О.В., Бугаева Е.Ю., Головин А.В., Донцова О.А. 2010. Транстрансляция: факты и гипотезы. Молекуляр. биология. 44, 563-572.

2. Shpanchenko О.У.. Golovin A.V., Bugaeva E.Y., Isaksson L.A., Dontsova O.A. 2010. Structural aspects of irons-translation. IUBMB Life. 62,120-124.

3. Bugaeva E.Y., Surkov S., Golovin A.V., Ofverstedt L.-G., Skoglund U., Isaksson L.A., Bogdanov A.A., Shpanchenko O.V.. Dontsova O.A. 2009. Structural features ofthetmRNA-ribosome interaction. RNA. 15,2312-2320.

4. Bugaeva E.Y., Shpanchenko O.V.. Felden В., Isaksson L.A., Dontsova O.A. 2008. One SmpB molecule accompanies tmRNA during its passage through the ribosomes. FEBSLett. 582,1532-1536.

5. Shpanchenko O.V.. Zvereva M.I., Ivanov P.V., Bugaeva E.Y., Rozov A.S., Bogdanov A.A., Kalkum M., Isaksson L.A., Nierhaus K.H. Dontsova O.A. 2005. Stepping transfer messenger RNA through the ribosome. J. Biol. Chem. 280, 1836818374.

6. Шпанченко O.B.. Иванов П.В., Зверева М.Э., Богданов А.А., Донцова O.A. 2004. 7ранс-трансляция: основные участники и роль в жизни клетки. Молекуляр. биология. 38, 914-925.

7. Ivanov P.V., Zvereva M.I., Shpanchenko O.V.. Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Aglyamova G.V., Lim V.I., Teraoka Y., Nierhaus K.H. 2002. How does tmRNA move through the ribosome? FEBS Lett. 514, 55-59.

8. Zvereva M.I., Ivanov P.V., Topilina N.I., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Kalkum M., Teraoka Y., Nierhaus K.H., Shpanchenko O.V. 2001. Complex of tmRNA and EF-Tu: Unexpected modes of interaction. J. Biol. Chem. 276,47702-47708.

9. Зверева М.Э., Шпанченко O.B.. Донцова O.A., Богданов А.А. 2000. Структура и функция тмРНК (10Sa РНК). Молекуляр. биология. 36,1081-1089.

10.Bogdanov А.А., Sergiev P.V., Lavrik I.N., Shpanchenko O.V.. Leonov A.A., Dontsova O.A. 2000. Modern site directed cross-linking approaches: Implication for ribosome structure and function. In: The ribosome: structure, function, antibiotics, and cellular interactions. Eds Garrett R.A., Douthwait S.R., Lilijas A., Matheson A.T., Moore P.B., Noller H.F. Washigton D.C.: ASM Press, pp. 245-256.

11.Zvereva M.I., Shpanchenko O.V.. Dontsova O.A., Nierhaus K.H., Bogdanov A.A. 1998. Effect of point mutations at position 89 of E. coli 5S rRNA on the assembly and activity of the large ribosomal subunit. FEBS Lett. 421, 249-251.

12.Shpanchenko O.V.. Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Nierhaus K.H. 1998. Structure of 5S rRNA within the Escherichia coli ribosome: iodine induced cleavage patterns of phosphorothioate derivatives. RNA. 4, 1154-1164.

13.Shpanchenko O.V.. Zvereva M.I., Dontsova O.A., Nierhaus K.H., Bogdanov A.A. 1996. 5S rRNA sugar-phosphate backbone protection in complexes with specific ribosomal proteins. FEBS Lett. 394, 71-75.

14.Dokudovskaya S., Dontsova O., Shpanchenko P.. Bogdanov A., Brimacombe R. 1996. Loop IV of 5S ribosomal RNA has contacts both to domain II and to domain V of the 23S RNA. RNA. 2,146-152.

Избранные тезисы конференций

15.Dontsova О., Shpanchenko О.. Bugaeva Е., Golovin A., Isaksson L., Bogdanov А. tmRNA: structural features and functional model. Ribosome 2010. 2010. Orvieto, Italy. Abstract book. P. 65.

lö.Bugaeva E., Golovin A., Isaksson L., Bogdanov A., Shpanchenko P.. Dontsova O. Interactions between tmRNA and the ribosome during /rani-translation. Ribosome 2010.2010. Prvieto, Italy. Abstract book. P. 94.

17. Shpanchenko P.V., Bugaeva E.Y., Golovin A.V., Isaksson L.A., Bogdanov A.A., Dontsova P.A. tmRNA - key component of bacterial protein synthesis quality control: structural features and functional model. 21st IUBMB and 12th FAPBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology Biomolecules for Quality of life. 2009. Shanghai, China. Abstract book. P. 76.

18.Bugaeva E.Y., Golovin A.V., Skoglund U., Isaksson L.A., Bogdanov A.A., Shpanchenko P.V.. Dontsova P.A. Structural features of tmRNA-ribosome interaction. 34th FEBS Congress Life's Molecular Interactions. 2009. Prague, Czech Republic. Abstract book. P. 42.

19.Shpanchenko P.V., Bugaeva E.Y., Golovin A.V., Isaksson L.A., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. Trans-translation as mRNA quality control: structural features of tmRNA-ribosome interaction. Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation. 2009. Roscoff, France. Abstract book. P. 49.

20. Shpanchenko P.. Ivanov P., Abakumov M., Bogdanov A., Dontsova P. Transtranslation as mRNA quality control: tmRNA mutagenesis study. EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control - partnered with Cold Spring Harbor Laboratories. 2007. Heidelberg, Germany. Abstract book. P. 240.

21.Shpanchenko P.. Ivanov P., Abakumov M., Bogdanov A., Dontsova P. Transtranslation as mRNA quality control: tmRNA mutagenesis study. International conference Biocatalysis-2007: fundamentals and applications. 2007. Moscow - St. Petersburg, Russian Federation. Abstract book. P. 25.

22.Shpanchenko P.V.. Zvereva M.I., Bugaeva E.Y., Bogdanov A.A., Nierhaus K.H., Isaksson L.A., Kalkum M., Dontsova P.A. How does tmRNA pass through the ribosome during /rans-translation? Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation. 2006. Roscoff, France. Abstract book. P. 125.

23. Shpanchenko P.V., Zvereva M.I., Bugaeva E.Yu., Rozov A.S., Bogdanov A.A., Nierhaus K.H., Isaksson L., Kalkum M., and Dontsova P.A. Mutations in ribosomal

RNA that affect different stages of translation. Meeting of HHMI International Research scholars. 2005. Abstract book. P. 39.

24.Ivanov P.V., Teraoka Y., Shpanchenko O.V.. Zvereva M.I., Topilina N.I., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. How does tmRNA move through the ribosome? The 8th Annual Meeting of the RNA Society RNA 2003. 2003. Vienna, Austria. Abstract book. P. 700.

25.Shpanchenko O.V.. Zvereva M.I., Ivanov P.V., Topilina N.I., Nierhaus K.H., Isaksson L.A., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. Model of tmRNA path through the ribosome. The 6th International Conference on Ribosome Synthesis Ribosome Synthesis 2003. 2003. Arcachon, France. Abstract book. P. 64.

26.Ivanov P.V., Shpanchenko O.V., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Teraoka Y., Nierhaus K.H. Mutational analysis of some conservative regions in tmRNA. The Dynamics of Ribosome Structure and Function. 2002. Queenstown, New Zealand. Abstracts book. P. 147.

27.Zvereva M.I., Ivanov P.V., Teraoka Y., Topilina N.I., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Kalkum M., Nierhaus K.H., Shpanchenko O.V. Complex of tmRNA and EF-Tu: Unexpected modes of interaction. The Dynamics of Ribosome Structure and Function. 2002. Queenstown, New Zealand. Abstracts book. P. 153.

28.Zvereva M.I., Ivanov P.V., Teraoka Y., Topilina N.I., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Kalkum M., Nierhaus K. H., Shpanchenko O.V. Complex of tmRNA and EF-Tu: unexpected mode of interaction. International Conference in honor of Alexander Spirin. 2001. Pushchino. Russia. Abstracts book. P. 68.

29.Dontsova O.A., Sergiev P.V., Avdeeva O.N., Shpanchenko O.V.. Zvereva M.I., Ivanov P.V., Topilina N.I., Aglyamova G.V., Bogdanov A.A., Kalkum M., Teraoka Y., Nierhaus K.H., Brimacombe R. Interaction of RNP with the E.coli ribosome. International Conference in honor of Alexander Spirin. 2001. Pushchino. Russia. Abstracts book. P. 12.

30.Shpanchenko O.V.. Zvereva M.I., Ivanov P.V. , Topilina N.I. , Nierhaus K.H., Dontsova O.A., Bogdanov A.A. Complex of tmRNA and EF-Tu: unexpected mode of interaction. The 5,h International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids. 2001. Sheffield, England. Abstracts book. P. 47.

31.Zvereva M.I., Ivanov P.V., Topilina N.I., Dontsova O.A., Nierhaus K.H., Shpanchenko O.V. Studying of structure and function of tmRNA. International conference Trend in nucleic acid chemistry. 2000. Moscow, Russia. Abstract book. P. 40.

32.Shpanchenko O.V.. Zvereva M.I., Kalkum M., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Nierhaus K.H. Transfer-messenger RNA: folding and interaction with EF-Tu. The Ribosome. Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions. 1999. Helsingor, Denmark. Abstracts book. P. 71.

Подписано в печать: 23,06.2010

Заказ № 3906 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Транспортно-матричная РНК.

Вторичная структура тмРНК.

Процессинг предшественника тмРНК.

Модифицированные основания в тмРНК.

Аминоацилирование тмРНК.

Белок БтрВ.

Пространственная организация белка БтрВ.

Структура комплекса тРНК-подобной области тмРНК с белком ЭтрБ.

Структурная организация комплексов тмРНК и белка ЭтрВ с рибосомой.

Транс- трансляция.

Аминоацилирование тмРНК, её взаимодействие с белками БтрВ и ЕБ-Ти, а также связывание этого комплекса с рибосомой.

Причины появления свободного А-участка в транслирующих рибосомах.

Распознавание «арестованных» рибосом и свободного А-сайта.

Переключение на матричную область, узнавание кодона продолжения синтеза.

Элонгация и терминация.

Деградация белка и мРНК.

Биологическая роль /и/7ш/с-трансляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Неканоническое взаимодействие тмРНК с элонгационным фактором Ти.

Синтез модифицированной тмРНК.

Формирование и анализ ковалентного соединения тмРНК с белками Б100 экстракта.

Комплекс деацилированной тмРНК с элонгационным фактором Ти в присутствии вТР или вБР.

Модель взаимодействия тмРНК с рибосомой.

Двухдоменная организация тмРНК.

Поиск элемента тмРНК, обеспечивающего узнавание А-участком рибосомы

Исследование роли некоторых консервативных нуклеотидов тмРНК.

Поиск интрамолекулярных супрессоров для летальных мутаций ЦА85,86СС иЦАЗ()0,301СС.

Мутации нуклеотидов тРНК-подобной части, затрагивающие активность тмРНК.

Выделение комплексов транспортно-матричной РНК с рибосомой.

Анализ РНК, входящих в состав выделенных комплексов.

Анализ белкового состава выделенных комплексов.

Исследование комплексов тмРНК с рибосомой методом химического пробинга.

Исследование комплекса тмРНК-4 с рибосомой методом криоэлектронной томографии.

Моделирование структуры комплексов тмРНК с рибосомой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Реактивы и биопрепараты.

Буферы и растворы.

Олигодезоксирибонуклеотиды и штаммы.

Фотоаффинное химическое сшивание тмРНК.

Синтез тмРНК с помощью Т7-РНК-полимеразы.

Синтез тмРНК, содержащей 4-тиоуридин, с помощью Т7-РНК-полимеразы

То-фингерпринты.

Комплексообразование и фотоактивируемое химическое сшивание тмРНК

Анализ белкового компонента «сшивки».

Определение позиции «сшивки» в тмРНК.

Футпринтинг.

Внутримолекулярное фотоаффинное^химическое сшивание тмРНК.

Анализ продуктов сшивания с помощью реакции обратной транскрипции

Гидролиз тмРНК с помощью РНКазы Н.

Измерение констант ассоциации комплексов тмРНК и тРНК с EF-Tu.

Манипуляции с ДНК.

Приготовление компетентных клеток Е. coli для трансформации с помощью теплового шока.

Трансформация компетентных клеток Е. coli с помощью теплового шока 163 Приготовление компетентных клеток Е. coli для электротрансформации

Электротрансформация клеток Е. coli.

Выделение плазмидной ДНК.164

Определение концентрации ДНК в растворе.

Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.

Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

Приготовление векторов и вставок.

Лигирование.

Сайт-направленный мутагенез.

Создание штамма Е. coli SKZl(Assr./4).

Клонирование гена, кодирующего тмРНК.

Создание плазмиды pR для генетической системы определения активности тмРНК.

Конструирование плазмиды pGEMstra.

Сайт-направленный мутагенез тмРНК.

Клонирование гена репортёрного пептида в плазмиды семейства pGEM.

Случайный мутагенез тмРНК in vivo и анализ мутантов.

Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру.

Анализ активности молекул тмРНК.

Анализ активности молекул тмРНК с помощью «генетической» системы. 173 Определение активности молекул тмРНК с помощью гибридного фага

XimmP22.

Аминоацилирование тмРНК.

Анализ положения пептида в комплексе.

Выделение и анализ комплексов тмРНК с рибосомой.

Выделение комплексов.

Анализ РНК-состава комплекса.

Анализ белкового состава комплекса.

Изучение комплексов тмРНК с рибосомой методом химического пробинга.184 Определение структуры комплекса рибосомы с тмРНК-4 методом криоэлектронной томографии.

Моделирование структуры комплексов тмРНК с рибосомой.

ВЫВОДЫ.

выводы

1. Элонгационный фактор Tu и тмРНК участвуют во взаимодействии нового типа. В отличие от канонического комплекса между ацилированным тРНК-подобным доменом тмРНК и EF-Tu*GTP деацилированная тмРНК образует комплекс с EF-Tu*GDP за счёт взаимодействия со спиралью 2 и псевдоузлом 4.

2. Белок SrapB входит в состав тмРНК-рибосомных комплексов на всех стадиях транс-трансляции. Элонгационные комплексы содержат по одной молекуле белка SmpB, связанной с каноническим участком взаимодействия на TLD тмРНК.

3. Молекула тмРНК в растворе существует в виде двух компактно свернутых доменов, между которыми уложена одноцепочечная мРНК-подобная область. В ходе транс-трансляции домены, не изменяя своей структуры, занимают определённые сайты на рибосоме, в то время как матричная область перемещается по ней в экспонированной форме.

4. Экспериментальная проверка двухдоменной модели с помощью химических, физических и биоинформационных подходов позволяет построить динамическую модель транс-трансляции, адекватную всей совокупности имеющихся на' сегодняшний день данных. Согласно этой модели структурные элементы тмРНК (псевдоузлы, спирали, арка вокруг головы 30S рибосомной субчастицы, сформированная псевдоузлами), сохраняются в процессе шранотрансляции. Основные изменения при прохождении MLD тмРНК через рибосому затрагивают район мРНК-подобной области и спирали 5 тмРНК.

5. Правильное позиционирование ко дона возобновления синтеза в А-участке рибосомы задается структурным элементом, сформированным белком SmpB, псевдоузлом 1 и петлёй А79-А86 тмРНК, который совершает поворот при транслокации TLD тмРНК из А-участка рибосомы в Р-участок.

1. Lee S.Y., Bailey S.C., Apirion D. 1978. Small stable RNAs from Escherichia colt evidence for the existence of new molecules and for a new ribonucleoprotein particle containing 6S RNA. J. Bacteriol. 133, 1015-1023.

2. Jentch, S. 1996. When proteins receive deadly message at birth. Science. 271, 955-956.

3. Inouye M., Delihas N. 1988. Small RNAs in the prokaryotes: a growing list of diverse roles. Cell. 53, 5-7.

4. Jain S.K., Gurevitz M., Apirion D. 1982. A small RNA that complements mutants in the RNA processing enzyme ribonuclease P. J. Mol. Biol. 162, 515-533.5. http://rnp .uthct.edu/rnp/tmRDB/tmRDB .html

5. Komine Y., Inokuchi H. 1991. Physical map locations of the genes that encode small stable RNAs in Escherichia coli. J. Bacteriol. 173, 5252.

6. Chauhan A.K., Apirion D. 1989. The gene for a small stable RNA (lOSa RNA) of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 3, 1481-1485.

7. Komine Y., Kitabatake M., Yokogawa Т., Nishikawa K., Inokuchi H. 1994. A tRNA-like structure is present in lOSa RNA, a small stable RNA from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 9223-9227.

8. Keiler K.C., Shapiro L., Williams K.P. 2000. tmRNAs that encode proteolysis-inducing tags are found in all known bacterial genomes: A two-piece tmRNA functions in Caidobacter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 7778-7783.

9. Mao C., Bhardwaj K., Sharkady S.M., Fish R.I., Driscoll Т., Wower J., Zwieb C., Sobral B.W., Williams K.P. 2009. Variations on the tmRNA gene. RNA Biol. 6, 355-361.

10. Moore S.D., Sauer R.T. 2005. Ribosome rescue: tmRNA tagging activity and capacity in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 58,456-466.

11. Hallier M., Ivanova N., Rametti A., Pavlov M., Ehrenberg M., Felden B. 2004. Pre-binding of small protein B to a stalled ribosome triggers /raws-translation. J. Biol. Chem. 279, 25978-25985.

12. Karzai A.W., Susskind M.M., Sauer R.T. 1999. SmpB, a unique RNA-binding protein essential for the peptide-tagging activity of SsrA (tmRNA). EMBOJ. 18,3793-3799.

13. Hanawa-Suetsugu K., Takagi M., Inokuchi H., Himeno H., Muto A. 2002. SmpB functions in various steps of /ram-translation. Nucleic Acids Res. 30, 1620-1629.

14. Keiler K.C., Shapiro, L. 2003. TmRNA is required for correct timing of DNA replication in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol 185, 573-580.

15. Hong S.J., Tran Q.A., Keiler K.C. 2005. Cell cycle-regulated degradation of tmRNA is controlled by RNase R and SmpB. Mol. Microbiol. 57, 565-575.

16. Oh B.K., Apirion D. 1991. lOSa RNA, a small stable RNA of Escherichia coli, is functional. Mol. Gen. Genet. 229, 52-56.

17. Huang C„ Wolfgang M.C., Withey J., Koomey M., Friedman D.I. 2000. Charged tmRNA but not tmRNA-mediated proteolysis is essential for Neisseria gonorrhoeae viability. EMBO J. 19, 1098-1107.

18. Hutchison C.A., Peterson S.N., Gill S.R., Cline R.T., White O., Fräser C.M., Smith H.O., Venter J.C. 1999. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science. 286, 2165-2169.

19. Akerley B.J., Rubin E.J., Novick V.L., Amaya K., Judson N., Makalanos J.J. 2002. A genome-scale analysis for identification of genes required for growth or survival of Haemophilus influenzae. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 99, 966971.

20. Thibonnier M., Thiberge J.M., De Reuse H. 2008. Irajw-translation in Helicobacter pylori: essentiality of ribosome rescue and requirement of protein tagging for stress resistance and competence. PLoS One. 3(1 l):e3810.

21. Zwieb C., Wower I., Wower J. 1999. Comparative sequence analysis of tmRNA. Nucleic Acids Res. 27, 2063-2071.

22. Williams K.P., Bartel D.P. 1996. Phylogenetic analysis of tmRNA secondary structure. RNA. 2, 1306-1310.

23. Felden B., Himeno H., Muto A., McCutcheon J.P., Atkins J.F., Gesteland R.F. 1997. Probing the structure of the Escherichia coli 10Sa RNA (tmRNA). RNA. 3, 89-103.

24. Felden B., Himeno H., Muto A., Atkins J. F., Gesteland R. 1996. Structural organization of Escherichia coli tmRNA. Biochimie. 78, 979-983.

25. Gaudin C., Zhou X., Williams K.P., Felden B. 2002. Two-piece tmRNA in cyanobacteria and its structural analysis. Nucleic Acids Res. 30, 2018-2024.

26. Sharkady S.M., Williams K.P. 2004. A third lineage with two-piece tmRNA. Nucleic Acids Res. 32, 4531-4538.

27. Ulve V.M., Cheron A., Trautwetter A., Fontenelle C., Barloy-Hubler F. 2007. Characterization and expression patterns of Sinorhizobium meliloti tmRNA (ssrA). FEMS Microbiol. Lett. 269, 117-123.

28. Gueneau de Novoa P., Williams K.P. 2004. The tmRNA website: reductive evolution of tmRNA in plastids and other endosymbionts. Nucleic Acids Res. 32, D104-D108.

29. Lin-Chao S„ Wei C.L., Lin Y.T. 1999. RNase E is required for the maturation of ssrA RNA and normal ssrA RNA peptide-tagging activity. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 12406-12411.

30. Li Z., Pandit S., Deutscher M.P. 1998. 3' exoribonucleolytic trimming is a common feature of the maturation of small, stable RNAs in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95, 2856-2861.

31. Ray B.K., Apirion D. 1979. Characterization of 10S RNA: a new stable RNA molecule from Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 174, 25-32.

32. Felden B., Hanawa K., Atkins J.F., Himeno H., Muto A., Gesteland R.F., McCloskey J.A., Crain P.F. 1998. Presence and location of modified nucleotides in Escherichia coli tmRNA: structural mimicry with tRNA acceptor branches. EMBOJ. 17, 3188-3196.

33. Felden B., Atkins J.F., Gesteland R.F. 1996. tRNA and mRNA both in the same molecule. Nat. Struct. Biol. 3, 494.

34. Suddath F.L., Quigley G.J., McPherson A., Sneden D., Kim J.J., Kim S.H., Rich A. 1974. Three-dimensional structure of yeast phenylalanine transfer RNA at 3.0 angstroms resolution. Nature. 248, 20-24.

35. Kealey J.T., Santi D.V. 1994. High-level expression and rapid purification of tRNA (m5U54)-methyltransferase. Protein Expr. Purif. 5, 149-152.

36. Nurse K., Wrzesinski J., Bakin A., Lane B.G., Ofengand J. 1995. Purification, cloning, and properties of the tRNA psi 55 synthase from Escherichia coli. RNA. 1, 102-112.

37. Cusack S., Hartlein M., Leberman R. 1991. Sequence, structural and evolutionary relationships between class 2 aminoacyl-tRNA synthetases. Nucleic Acids Res. 19, 3489-3498.

38. Francklyn C., Schimmel P. 1989. Aminoacylation of RNA minihelices with alanine. Nature. 337, 478-481.

39. Beuning P.J., Yang F., Schimmel P., Musier-Forsyth K. 1997. Specific atomic groups and RNA helix geometry in acceptor stem recognition by a tRNA synthetase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94, 10150-10154.r • I

40. Shi J.P., Schimmel P. 1991. Aminoacylation of alanine minihelices. "Discriminator" base modulates transition state of single turnover reaction. J. Biol. Chem. 266, 2705-2708.

41. Hou Y.M., Schimmel P. 1988. A simple structural feature is a major determinant of the identity of a transfer RNA. Nature. 333, 140-145.

42. McClain W.H., Foss K. 1988. Changing the identity of a tRNA by introducing a G-U wobble pair near the 3' acceptor end. Science. 240, 793796.

43. Nameki N., Tadaki T., Muto A., Himeno H. 1999. Amino acid acceptor identity switch of Escherichia coli tmRNA from alanine to histidine in vitro. J. Mol. Biol. 289, 1-7.

44. Barends S., Karzai A.W., Sauer R.T., Wower J., Kraal B. 2001. Simultaneous and functional binding of SmpB and EF-Tu-GTP to the alanyl acceptor arm of tmRNA. J. Mol. Biol 314, 9-21.

45. Rudinger-Thirion J., Giege R., Felden B. 1999. Aminoacylated tmRNA from Escherichia coli interacts with prokaryotic elongation factor Tu. RNA. 5, 989992.

46. Corvaisier S., Bordeau V., Felden B. 2003. Inhibition of transfer messenger RNA aminoacylation and /raws-translation by aminoglycoside antibiotics. J. Biol. Chem. 278, 14788-14797.

47. Miczak A., Chauhan A.K., Apirion D. 1991. Two new genes located between 2758 and 2761 kilobase pairs on the Escherichia coli genome. J. Bacteriol. 173, 3271-3272.

48. Sundermeier T.R., Dulebohn D.P., Cho H.J., Karzai A.W. 2005. A previously uncharacterized role for small protein B (SmpB) in transfer messenger RNA-mediated /raws-translation. Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 102, 2316-2321.

49. Jacob Y., Sharkady S.M., Bhardwaj K., Sanda A., Williams, K.P. 2005. Function of the SmpB tail in transfer-messenger RNA translation revealed by a nucleus-encoded form. J. Biol. Chem. 280, 5503-5509.

50. Dong G., Nowakowski J., Hoffman D.W. 2002. Structure of small protein B: the protein component of the tmRNA-SmpB system for ribosome rescue. EMBOJ. 21, 1845-1854.

51. Gutmann S., Haebel P.W., Metzinger L., Sutter M., Felden B., Ban N. 2003. Crystal structure of the transfer-RNA domain of transfer-messenger RNA in complex with SmpB. Nature. 424, 699-703.

52. Stagg S.M., Frazer-Abel A.A., Hagerman P.J., Harvey S.C. 2001. Structural studies of the tRNA domain of tmRNA. J. Mol. Biol. 309, 727-735.

53. Valle M„ Gillet R., Kaur S., Henne A., Ramakrishnan V., Frank J. 2003. Visualizing tmRNA entry into a stalled ribosome. Science. 300, 127-130.

54. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F., Nyborg J. 1995. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science. 270, 1464-1472.

55. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch T., Ramakrishnan V. 2000. Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature. 407, 327-339.

56. Yusupov M.M., Yusupova G.Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H., Noller H.F. 2001. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science. 292, 883-896.

57. Valle M., Sengupta J., Swami N.K., Grassucci R.A., Burkhardt N., Nierhaus K.H., Agrawal R.K., Frank J. 2002. Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process. EMBOJ. 21, 3557-3567.

58. Valle M., Zavialov A., Li W., Stagg S.M., Sengupta J., Nielsen R.C., Nissen P., Harvey S.C., Ehrenberg M., Frank J. 2003. Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 10, 899-906.

59. Knudsen B., Wower J., Zwieb C., Gorodkin J. 2001. tmRDB (tmRNA database). Nucleic Acids Res. 29, 171-172.

60. Stark H., Rodnina M.V., Wieden H.J., Zemlin F., Wintermeyer W., van Heel M. 2002. Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex. Nat. Struct. Biol. 9, 849-854.

61. Haebel P.W., Gutmann S., Ban N. 2004 Dial tm for rescue: tmRNA engages ribosomes stalled on defective mRNAs. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 58-65.

62. Kaur S., Gil let R., Li W„ Gursky R., Frank J. 2006. Cryo-EM visualization of transfer messenger RNA with two SmpBs in a stalled ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 16484-16489.

63. Metzinger L., Hallier M., Felden B. 2005. Independent binding sites of small protein B onto transfer-messenger RNA during /raws-translation. Nucleic Acids Res. 33, 2384-2394.

64. Ivanova N., Pavlov M.Y., Bouakaz E., Ehrenberg M., Schiavone L.H. 2005. Mapping the interaction of SmpB with ribosomes by footprinting of ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 33, 3529-3539.

65. Cheng K., Ivanova N., Scheres S.H., Pavlov M.Y., Carazo J.M., Hebert H., Ehrenberg M., Lindahl M. 2010. tmRNA-SmpB complex mimics native aminoacyl-tRNAs in the A site of stalled ribosomes. J. Struct. Biol. 169, 342348.

66. Weis F., Bron P., Rolland J.P., Thomas D., Felden B., Gillet R. 2010. Accomodation of tmRNA-SmpB into stalled ribosomes: a cryo-EM study. RNA. 16, 299-306.

67. Hallier M., Desreac J., Felden B. 2006. Small protein B interacts with the large and the small subunits of a stalled ribosome during /ram-translation. Nucleic Acids Res. 34, 1935-1943.

68. Gillet R., Kaur S., Li W., Hallier M., Felden B., Frank J. 2007. Scaffolding as an organizing principle in ¿raws-translation. The roles of small protein B and ribosomal protein SI. J. Biol. Chem. 282, 6356-6363.

69. Tu G.F., Reid G.E., Zhang J.G., Moritz R.L., Simpson RJ. 1995. C-terminal extension of truncated recombinant proteins in Escherichia coli with a lOSa RNA decapeptide. J. Biol. Chem. 270, 9322-9326.

70. Keiler K.C., Sauer R.T. 1996. Sequence determinants of C-terminal substrate recognition by the Tsp protease. J. Biol Chem. 271, 2589-2593.

71. Keiler K.C., Waller P.R., Sauer R.T. 1996. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993.

72. Withey J., Friedman D. 1999. Analysis of the role of ¿raws-translation in the requirement of tmRNA for lambdaimmP22 growth in Escherichia coli. J. Bacteriol 181, 2148-2157.

73. Gottesman S., Roche E., Zhou Y., Sauer R.T. 1998. The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev. 12, 1338-1347.

74. Herman C„ Thevenet D., Bouloc P., Walker G.C., D'Ari R. 1998. Degradation of carboxy-terminal-tagged cytoplasmic proteins by the Escherichia coli protease HflB (FtsH). Genes Dev. 12, 1348-1355.

75. Metzinger L., Hallier M., Felden B. 2008. The highest affinity binding site of small protein B on transfer messenger RNA is outside the tRNA domain. RNA. 14, 1761-1772.

76. Konno T., Kurita D., Takada K., Muto A., Himeno H. 2007. A functional interaction of SmpB with tmRNA for determination of the resuming point of iraws-translation. RNA. 13, 1723-1731.

77. Ivanova N., Lindell M., Pavlov M., Holmberg Schiavone L., Wagner E.G., Ehrenberg M. 2007. Structure probing of tmRNA in distinct stages of transtranslation. RNA. 13, 713-722.

78. Sundermeier T.R., Karzai A.W. 2007. Functional SmpB-ribosome interactions require tmRNA. J. Biol. Chem. 282, 34779-34786.

79. Abo T., Inada T., Ogawa K., Aiba H. 2000. SsrA-mediated tagging and proteolysis of LacI and its role in the regulation of lac operon. EMBO J. 19, 3762-3769.

80. Ujiie H, Matsutani T, Tomatsu H, Fujihara A, Ushida C, Miwa Y, Fujita Y, Himeno H, Muto A. 2009. 7ra/«-translation is involved in the CcpA-dependent tagging and degradation of TreP in Bacillus subtilis. J. Biochem. 145, 59-66.

81. Yamamoto Y., Sunohara T., Jojima K., Inada T., Aiba H. 2003. SsrA-mediated /ram-translation plays a role in mRNA quality control by facilitating degradation of truncated mRNAs. RNA. 9, 408-418.

82. Ueda K., Yamamoto Y., Ogawa K., Abo T., Inokuchi H„ Aiba H. 2002. Bacterial SsrA system plays a role in coping with unwanted translational readthrough caused by suppressor tRNAs. Genes Cells. 7, 509-519.

83. Abo T., Ueda K., Sunohara T., Ogawa K., Aiba H. 2002. SsrA-mediated protein tagging in the presence of miscoding drugs and its physiological role in Escherichia co/i. Genes Cells. 7, 629-638.

84. Li X., Hirano R., Tagami H., Aiba H. 2006. Protein tagging at rare codons is caused by tmRNA action at the 3' end of nonstop mRNA generated in response to ribosome stalling. RNA. 12, 248-255.

85. Roche E.D., Saue R.T. 1999. SsrA-mediated peptide tagging caused by rare codons and tRNA scarcity. EMBO J. 18, 4579-4589.

86. Hayes C.S., Bose B., Sauer R.T. 2002. Stop codons preceded by rare arginine codons are efficient determinants of SsrA tagging in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Set USA. 99, 3440-3445.

87. Li X., Yagi M., Morita T„ Aiba H. 2008. Cleavage of mRNAs and role of tmRNA system under amino acid starvation in Escherichia coli. Mol. Microbiol '. 68, 462-473.

88. Hayes C.S., Sauer R.T. 2003. Cleavage of the A site mRNA codon during ribosome pausing provides a mechanism for translational quality control. Mol. Cell. 12, 903-911.

89. Roche E.D., Sauer R.T. 2001. Identification of endogenous SsrA-tagged proteins reveals tagging at positions corresponding to stop codons. J. Biol. Chem. 276, 28509-28515.

90. Collier J., Binet E., Bouloc P. 2002. Competition between SsrA tagging and translational termination at weak stop codons in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 45, 745-754.

91. Hayes C.S., Bose B., Sauer R.T. 2002. Proline residues at the C terminus of nascent chains induce SsrA tagging during translation termination. J. Biol. Chem. 277, 33825-33832.

92. Sunohara T., Abo T., Inada T., Aiba H. 2002. The C-terminal amino acid sequence of nascent peptide is a major determinant of SsrA tagging at all three stop codons. RNA. 8, 1416-1427.

93. Li X., Yokota T., Ito K., Nakamura Y., Aiba H. 2007. Reduced action of polypeptide release factors induces mRNA cleavage and tmRNA tagging at stop codons in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 63, 116-126.

94. Muto H., Ito K. 2008. Peptidyl-prolyl-tRNA at the ribosomal P-site reacts poorly with puromycin. Biochem. Biophys. Res. Commim. 366, 1043-1047.

95. Garza-Sanchez F., Janssen B.D., Hayes C.S. 2006. Prolyl-tRNA(Pro) in the A-site of SecM-arrested ribosomes inhibits the recruitment of transfermessenger RNA. J. Biol. Chem. 281, 34258-34268.

96. Cruz-Vera LR, Rajagopal S, Squires C, Yanofsky C. 2005. Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol. Cell. 19, 333-343.

97. Sunohara T., Jojima K., Yamamoto Y., Inada T., Aiba H. 2004. Nascent-peptide-mediated ribosome stalling at a stop codon induces rnRNA cleavage resulting in nonstop mRNA that is recognized by tmRNA. RNA. 10, 378-386.

98. Asano K., Kurita D., Takada K., Konno T., Muto A., Himeno H. 2005. Competition between trans-translation and termination or elongation of translation. Nucleic Acids Res. 33, 5544-5552.

99. Crandall J., Rodriguez-Lopez M., Pfeiffer M., Mortensen B., Buskirk A. 2010. Ribosomal RNA mutations that inhibit transfer-messenger RNA activity on stalled ribosomes. J. Bacteriol. 192, 553-559.

100. Holberger L.E, Hayes C.S. 2009. Ribosomal protein S12 and aminoglycoside antibiotics modulate A-site mRNA cleavage and transfer-messenger RNA activity in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 284, 32188-32200.

101. Ogle J.M., Ramakrishnan V. 2005. Structural insights into translational fidelity. Annu. Rev. Biochem. 74, 129-177.

102. Garza-Sánchez F., Shoji S., Fredrick K., Hayes C.S. 2009. RNase II is important for A-site mRNA cleavage during ribosome pausing. Mol. Microbiol. 73, 882-897.

103. Ivanova N., Pavlov M.Y., Felden B., Ehrenberg M. 2004. Ribosome rescue by tmRNA requires truncated mRNAs. J. Mol. Biol. 338, 33-41.

104. Yusupova G.Z., Yusupov M.M., Cate J.H., Noller H.F. 2001. The path of messenger RNA through the ribosome. Cell. 106, 233-241.

105. Jenner L., Romby P., Rees B., Schulze-Briese C., Springer M., Ehresmann C., Ehresmann B., Moras D., Yusupova G., Yusupov M. 2005. Translational operator of mRNA on the ribosome: How repressor proteins exclude ribosome binding. Science. 308,120-123.

106. Ivanova N., Pavlov M.Y., Ehrenberg M. 2005. tmRNA-induced release of messenger RNA from stalled ribosomes. J. Mol. Biol. 350, 897-905.

107. Williams K.P., Martindale K.A., Bartel D.P. 1999. Resuming translation on tmRNA: a unique mode of determining a reading frame. EMBO J. 18, 54235433.

108. Lim V.I., Garber M.B. 2005. Analysis of recognition of transfer-messenger RNA by the ribosomal decoding center. J. Mol. Biol. 346, 395-398.

109. Miller M.R., Healey D.W., Robison S.G., Dewey J.D., Buskirk A.R. 2008. The role of upstream sequences in selecting the reading frame on tmRNA. BMC Biol. 6, 29.

110. Watts T., Cazier D., Healey D., Buskirk A. 2009. SmpB contributes to reading frame selection in the translation of transfer-messenger RNA. J. Mol. Biol. 391, 275-281.

111. O'Connor M. 2007. Minimal translation of the tmRNA tag-coding region is required for ribosome release. Biochem. Biophys. Res. Commim. 357, 216281.

112. Weber-Ban E.U., Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. 1999. Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. Nature. 401, 90-93.

113. Kim Y.I., Burton R.E., Burton B.M., Sauer R.T., Baker T.A. 2000. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell. 5, 639-648.

114. Wiegert T., Schumann W. 2001. SsrA-mediated tagging in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183, 3885-3889.

115. Farrell C.M., Grossman A.D., Sauer R.T. 2005. Cytoplasmic degradation of ssrA-tagged proteins. Mol. Microbiol. 57, 1750-1761.

116. Bohn C., Binet E., Bouloc P. 2002. Screening for stabilization of proteins with a /ram-translation signature in Escherichia coli selects for inactivation of the ClpXP protease. Mol. Genet. Genomics. 266, 827-831.

117. Baker T.A., Sauer R.T. 2006. ATP-dependent proteases of bacteria: recognition logic and operating principles. Trends Biochem. Sci. 31, 647-653.

118. Flynn J.M., Levchenko I., Seidel M., Wickner S.H., Sauer R.T., Baker T.A. 2001. Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 1058410589.

119. Levchenko I., Grant R.A., Wah D.A., Sauer R.T., Baker T.A. 2003. Structure of a delivery protein for an AAA+ protease in complex with a peptide degradation tag. Mol. Cell. 12, 365-372.

120. Flynn J.M., Levchenko I., Sauer R.T., Baker T.A. 2004. Modulating substrate choice: the SspB adaptor delivers a regulator of the extracytoplasmic-stress response to the AAA+ protease ClpXP for degradation. Genes Dev. 18, 22922301.

121. Levchenko I., Seidel M., Sauer R.T., Baker T.A. 2000. A specificity-enhancing factor for the ClpXP degradation maphine. Science. 289, 23542356.

122. Wah D.A., Levchenko I., Rieckhof G.E., Bolon D.N., Baker T.A., Sauer R.T. 2003. Flexible linkers leash the substrate binding domain of SspB to a peptide module that stabilizes delivery complexes with the AAA+ ClpXP protease. Mol. Cell. 12, 355-363.

123. Lessner F.H., Venters B.J., Keiler K.C. 2007. Proteolytic adaptor for transfermessenger RNA-tagged proteins from alpha-proteobacteria. J. Bacteriol. 189, 272-275.

124. Dougan D.A., Reid B.G., Horwich A.L., Bukau B. 2002. ClpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. Mol. Cell. 9, 673-683.

125. Ito K., Akiyama Y. 2005. Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu. Rev. Microbiol. 59, 211-231.

126. Herman C., Prakash S., Lu C.Z., Matouschek A., Gross C.A. 2003 Lack of a robust unfoldase activity confers a unique level of substrate specificity to the universal AAA protease FtsH. Mol. Cell. 11, 659-669.

127. Choy J.S., Aung L.L., Karzai A.W. 2007. Lon protease degrades transfermessenger RNA-tagged proteins. J. Bacteriol. 189, 6564-6571.

128. Mehta P., Richards J., Karzai A.W. 2006. tmRNA determinants required for facilitating nonstop mRNA decay. RNA. 12, 2187-2198.

129. Richards J., Mehta P., Karzai A.W. 2006. RNase R degrades non-stop mRNAs selectively in an SmpB-tmRNA-dependent manner. Mol. Microbiol. 62, 1700-1712.

130. Karzai A.W., Sauer R.T. 2001. Protein factors associated with the SsrA.SmpB tagging and ribosome rescue complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 30403044.

131. Baumler A.J., Kusters J.G., Stojiljkovic I., Heffron F. 1994. Salmonella fyphimnrium loci involved in survival within macrophages. Infect. Immim. 62, 1623-1630.

132. Wiegert T., Schumann W. 2001. SsrA-mediated tagging in Bacillus subtilis. J. Bacteriol 183, 3885-3889.

133. Olcan N.A., Bliska J.B., Karzai A.W. 2006. A Role for the SmpB-SsrA system in Yersinia pseudotuberculosis pathogenesis. PLoS Pathog. 2, e6.

134. Muto A., Fujihara A., Ito K.I., Matsuno J., Ushida C., Himeno H. 2000. Requirement of transfer-messenger RNA for the growth of Bacillus subtilis under stresses. Genes Cells. 5, 627-635.

135. Julio S.M., Heithoff D.M., Mahan M.J. 2000. ssrA (tmRNA) plays a role in Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. J. Bacteriol. 182, 1558-1563.

136. Braud S., Lavire C., Bellier A., Mazodier P. 2006. Effect of SsrA (tmRNA) tagging system on translational regulation in Streptomyces. Arch. Microbiol. 184, 343-352.

137. Shin J.H., Price C.W. 2007. The SsrA-SmpB ribosome rescue system is important for growth of Bacillus subtilis at low and high temperatures. J Bacteriol. 189, 3729-3737.

138. Singh N.S., Varshney U. 2004. A physiological connection between tmRNA and peptidyl-tRNA hydrolase functions in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 32, 6028-6037.

139. Szaflarski W., Vesper O., Teraoka Y., Plitta B., Wilson D.N., Nierhaus K.H. 2008. New features of the ribosome and ribosomal inhibitors: non-enzymatic recycling, misreading and back-translocation. J. Mol. Biol. 380, 193-205.

140. Kuroha K., Horiguchi N., Aiba H., Inada T. 2009. Analysis of nonstop mRNA translation in the absence of tmRNA in Escherichia coli. Genes Cells. 14, 739-749.

141. Janssen B.D., Hayes C.S. 2009. Kinetics of paused ribosome recycling in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 394, 51-67.

142. Christensen S.K., Gerdes K. 2003. RelE toxins from Bacteria and Archaea cleave mRNAs on translating ribosomes, which are rescued by tmRNA. Mol. Microbiol. 48, 1389-1400.

143. Christensen S.K., Pedersen K., Hansen F.G., Gerdes K. 2003. Toxin-antitoxin loci as stress-response element: ChpAK/MazF and ChpBK cleave translated mRNA and are counteracted by tmRNA. J. Mol. Biol. 332, 809-819.

144. Pedersen K., Zavialov A.V., Pavlov M.Y., Elf J., Gerdes K., Ehrenberg M. 2003. The bacterial toxin RelE displays codon-speciflc cleavage of mRNAs in the ribosomal A site. Cell. 112, 131-140.

145. Munavar H., Zhou Y., Gottesman S. 2005. Analysis of the Escherichia coli Alp phenotype: heat shock induction in ssrA mutants. J. Bacterial. 187, 47394751.

146. Ranquet C., Geiselmann J., Toussaint A. 2001. The tRNA function of SsrA contributes to controlling repression of bacteriophage Mu prophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 10220-10225.

147. Billington S.J., Johnston J.L., Rood J.I. 1996. Virulence regions and virulence factors of the ovine footrot pathogen, Dichelobacter nodosus. FEMS Microbiol Lett. 145, 147-156.

148. Ebeling S., Kundig C., Hennecke H. 1991. Discovery of a rhizobial RNA that is essential for symbiotic root nodule development. J. Bacteriol. 112>, 63736382.

149. Keiler K.C., Shapiro L. 2003. tmRNA in Caulobacter crescentus is cell cycle regulated by temporally controlled transcription and RNA degradation. J. Bacteriol. 185, 1825-1830.

150. Hong S.J., Lessner F.H., Mahen E.M., Keiler K.C. 2007. Proteomic identification of tmRNA substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 1712817133.

151. Hayes C.S., Keiler K.C. 2010. Beyond ribosome rescue: tmRNA and co-translational processes. FEBSLett. 584, 413-419.

152. Campo N., Tjalsma H., Buist G., Stepniak D., Meijer M., Veenhuis M., Westennann M., Miiller J.P., Bron S., Kok J., Kuipers O.P., Jongbloed J.D. 2004. Subcellular sites for bacterial protein export. Mo I. Microbiol. 53, 15831599.

153. Russell J.H., Keiler K.C. 2009. Subcellular localization of a bacterial regulatory RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 16405-16409.

154. Shiomi D., Yoshimoto M., Homma M., Kawagishi I. 2006. Helical distribution of the bacterial chemoreceptor via colocalization with the Sec protein translocation machinery. Mol. Microbiol. 60, 894-906.

155. Sprinzl M., Kucharzewski M., Hobbs J.B., Cramer F. 1977. Specificity of elongation factor Tu from Escherichia coli with respect to attachment to the amino acid to the 2' or 3' hydroxyl group of the terminal adenosine of tRNA. Biochemistry. 78, 55-61.

156. Homung V., Hoffman H.P., Sprinzl M. 1998. In vitro selected RNA molecules that bind to elongation factor Tu. Biochemistry. 37, 7260-7267.

157. Moazed D., Robertson J.M., Noller H.F. 1988. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature. 334, 362-364.

158. Munishkin A., Wool I.G. 1997. The ribosome-in-pieces: binding of elongation factor EF-G to oligoribonucleotides that mimic the sarcin/ricin and thiostrepton domains of 23S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Set USA. 94, 12280-12284.

159. Stark H., Rodnina M.V., Rinke-Appel J., Brimacombe R., Wintermeyer W., van Heel M. 1997. Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature. 389,403-406.

160. Stepanov V.G., Nyborg J. 2003. tmRNA from Thermus thermophilus. Interaction with alanyl-tRNA synthetase and elongation factor Tu. Eur. J. Biochem. 270, 463-475.

161. Сергиев П.В., Донцова О.А., Богданов A.A. 2001. Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: Судный день. Молекулярная биология. 35, 559-583.

162. Karzai A.W., Roche E.D., Sauer R.T. 2000. The SsrA-SmpB system for protein tagging, directed degradation and ribosome rescue. Nat. Struct. Biol. 7, 449-455.

163. Wower I., Zwieb C., Guven S., Wower J. 2000. Binding and cross-linking of tmRNA to ribosomal protein SI, on and off the Escherichia coli ribosome. EMBOJ. 19, 6612-6621.

164. Nissen P., Thirup S., Kjeldgaard M., Nyborg J. 1999. The crystal structure of Cys-tRNACys-EF-Tu-GDPNP reveals general and specific features in the ternary complex and in tRNA. Structure Fold Des. 7, 143-156.

165. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Clark B.F.C., Nyborg J. 1996. The ternary complex of aminoacylated tRNA and EF-Tu-GTP. Recognition of a bond and a fold. Biochimie. 78, 921-933.

166. Nierhaus K.H. 1990. The allosteric three-site model for the ribosomal elongation cycle: features and future. Biochemistry. 29, 4997-5008.

167. Ogle J.M., Brodersen D.E., Clemons W.M. Jr., Tarry M.J., Carter A.P., Ramakrishnan V. 2001. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science. 292, 897-902.

168. Steitz J.A., Jakes K. 1975. How ribosomes select initiator regions in mRNA: Base pair formation between the 3' terminus of 16S rRNA and the mRNA during initiation of protein synthesis in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 72, 4734-4738.

169. Lim V.I., Curran J.F. 2001. Analysis of codon:anticodon interactions within the ribosome provides new insights into codon reading and the genetic code structure. RNA. 7, 942-957.

170. Retallack D.M., Johnson L.L., Friedman D.I. 1994. Role for lOSa RNA in the growth of lambda-P22 hybrid phage. J. Bacteriol. 176, 2082-2089.

171. Retallack D.M., Friedman D.I. 1995. A role for a small stable RNA in modulating the activity of DNA-binding proteins. Cell. 83, 227-235.

172. Bjomsson A., Isaksson L.A. 1996. Accumulation of a mRNA decay intermediate by ribosomal pausing at a stop codon. Nucleic Acids Res. 24, 1753-1757.

173. Hanawa-Suetsugu K., Bordeau V., Himeno H., Muto A., Felden B. 2001. Importance of the conserved nucleotides around the tRNA-like structure of Escherichia coli transfer-messenger RNA for protein tagging. Nucleic Acids Res. 29, 4663-4673.

174. Gaudin C., Nonin-Lecomte S., Tisne C., Corvaisier S., Bordeau V., Dardel F., Felden B. 2003. The tRNA-like domains of E. coli and A. aeolicus transfermessenger RNA: structural and functional studies. J. Mol. Biol. 331, 457-471.

175. Srisawat C., Engelke D.R. 2001. Streptavidin aptamers: affinity tags for the study of RNAs and ribonucleoproteins. RNA. 7, 632-641.

176. Jurica M.S., Licklider L.J., Gygi S.R., Grigorieff N., Moore M.J. 2002. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8, 426-439.

177. Leonov A.A., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. 2003. Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23 S rRNA that affects the translocation. J. Biol. Chem. 278, 25664-25670.

178. Green N.M. 1990. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67.

179. Nameki N., Tadaki T., Himeno H., Muto A. 2000. Three of four pseudoknots in tmRNA are interchangeable and are substitutable with single-stranded RNAs. FEBSLett. 470, 345-349.

180. Roche E.D., Sauer R.T. 2001. Identification of endogenous SsrA-tagged proteins reveals tagging at positions corresponding to stop codons. J. Biol. Chem. 276, 28509-28515.

181. Mukherjee S., Shukla A., Guptasarma P. 2003. Single-step purification of a protein-folding catalyst, the SlyD peptidyl prolyl isomerase (PPI), from cytoplasmic extracts of Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem. 37, 183186.

182. Pedersen K., Zavialov A.V., Pavlov M.Y., Elf J:, Gerdes K., Ehrenberg M. 2003. The bacterial toxin RelE displays codon-specific cleavage of mRNA in the ribosomal A site. Cell. 112, 131-140.

183. Kalkum M., Lyon G.J., Chait B.T. 2003. Detection of secreted peptides by using hypothesis-driven multistage mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 2795-2800.

184. Rohl R., Nierhaus K.H. 1982. Assembly map of the large subunit (50S) of Escherichia coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 729-733.

185. Moazed D., Stern S., Noller H. 1986. Rapid chemical probing of conformation in 16S ribosomal rRNA and 30S subunits using primer extension. J. Mol. Biol. 187, 399-416.

186. Tate W., Greuer B., Brimacombe R. 1990. Codon recognition in polypeptide chain termination: site directed crosslinking of termination codon to Escherichia coli release factor-2. Nucleic Acids Res. 18, 6537-6544.

187. Frank J. 2006. Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. New York: Springer Science.

188. Yusupova G., Jenner L., Rees B., Moras D., Yusupov M. 2006. Structural basis for messenger RNA movement on the ribosome. Nature. 444, 391-394.

189. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M., Frank, J. 2003. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114, 123-134.

190. Harms J., Schluenzen F., Zarivach R., Bashan A., Gat S., Agmon I., Baitels H., Franceschi F., Yonath A. 2001. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell. 107, 679-688.

191. Wower I.K., Zwieb C., Wower J. 2009. Escherichia coli tmRNA lacking pseudoknot 1 tags truncated proteins in vivo and in vitro. RNA. 15, 128-137.

192. Tanner D.R., Dewey J.D., Miller M.R., Buskirk A.R. 2006. Genetic analysis of the structure and function of transfer messenger RNA pseudoknot 1. J. Biol. Chem. 281, 10561-10566.

193. Krutchinsky A.N., Kalkum M., Chait B.T. 2001. Automatic identification of proteins with a MALDI-quadrupole ion trap mass spectrometer. Anal. Chem. 73, 5066-5077.

194. Inoue H., Nojima H., Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28.

195. Mullis K.B., Faloona F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350.

196. Sambrook J., Russell D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

197. Piatt Т., Mueller-Hill В., Miller J. H. 1972. In: Experiments in Molecular Genetics. Ed Miller J. H. Cold Spring Harbor, NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 352—355.

198. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

199. Schagger H., von Jagow G. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem, 166, 368-379.

200. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

201. Moazed D., Noller H.F. 1986. Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell. 47, 985-994.

202. Adrian M., Dubochet J., Lepault J., McDowall A.W. 1984. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308, 32-36.

203. Skoglund U., Ofverstedt L.G., Burnett R.M., Bricogne G. 1996. Maximum-entropy three-dimensional reconstruction with deconvolution of the contrasttransfer function: a test application with adenovirus. J. Struct. Biol. 117, 173188.

204. Rullgard H., Oktem O., Skoglund U. 2007. A component-vise iterated relative entropy regularization method with updated prior and regularization parameter. Inverse Problems. 23, 2121-2139.

205. DeLano, W.L. 2002. The PyMOL Molecular Graphics System on World Wide Web http://www.pymol.org226. http://www.vim.org