Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.7.

Список аббревиатур и условных обозначений.

1 ШВА I - ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ^

Часть I - Состав, строение и форма эритроцитов

1.1. Современные представления о структуре

V эритроцитов человека.

1.2. Форма и размеры эритроцитов.■•Vе*

1.3. Взаимосвязь формы эритроцитов и их функциональной активности в норме и патологии^.

Часть 2 - Методы измерения размеров, формы эритроцитов и содержания в них гемоглобина.,.

2.1. Традиционные методы измерений.25.

2.2. Современные методы лабораторного , анализа с применением лазерной техники и голографии.

ГЛАВА П - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Объект исследования.тт.

2. Методы исследования.39.*

2.1. Голографическая интерференционная микроскопия.??.

1.1.1. Метод реального времени.

2.1.2. Анализ интерференционного поля.

2.1.3. Чувствительность голографической микроинтерферометрии.

2.1.4. Голографический интерференционный микроскоп:

A. Схемы микроскопа. Получение голограмм.

Б. Система усреднения когерентных оптических шумов.

B. Пути совершенствования схемы микроскопа.5?.

2.1.5. Методики количественной оценки формы, размеров эритроцитов, массы и концентрации плотных веществ в клетках по данным голографической интерферометрии.

A. Получение интерферограмм эритроцитов.

Б. Линейные размеры и параметры формы эритроцитов.Й,

B. Измерение массы и концентрации плотных веществ в эритроците.??.

2.2. Микроскопия в когерентном свете.??.

2.2.1. Микроскопия в проходящем свете:

A. Анализ эритроцитов в когерентном свете.:.«

Б. Оценка разрешающей способности лазерной и голографической микроскопии.

B. Измерение геометрических параметров эритроцитов в монетных столбиках.

2.2.2. Микроскопия в отраженном свете.

2.3. Погрешности измерений количественных характеристик эритроцитов.7?.

2Л. Метод светорассеяния.

Обсуждение результатов.

ГЛАВА 3 - СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ В НОРМЕ, ПРИ НАРУШЕНИЯХ СОСТАВА ПЛАЗМЫ И МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ

1. Размеры и форма эритроцитов.

1.1. Сравнительная характеристика линейных размеров эритроцитов.

1.2. Форма эритроцитов.

2. Площадь поверхности, объем и коэффициент сферичности.104.

3. Связь коэффициента сферичности с осмотической резистентностью эритроцитов.

Теоретический анализ полученных результатов на основе явления фрагментации.

5. Сравнительная характеристика эритроцитов в норме и при наследственном микросфероцитозе по массе и концентрации гемоглобина.,.

Обсуждение результатов.«

ГЛАВА 4 - СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ ФОРМЫ ЭРИТРОЦИТОВ В НОРМЕ И ПРИ НАСЛЕДСТВЕННОМ МИКРОСФЕРОЦИТОЗЕ

1. Анализ изменений формы эритроцитов здоровых детей.???«

2. Анализ эритроцитов при наследственном микросфероцитозе.? ??,

Обсуждение результатов.гг.

Актуальность темы. Расширение и углубление представлений о жизнедеятельности эритроцитов периферической крови непосредственно связано с внедрением в практику новейших методов исследования. Этим определяется актуальность проблемы изучения нефиксированных эритроцитов человека с целью изучения и количественной оценки их размеров» формы, массы и концентрации гемоглобина в норме и патологии методами голографической интерферометрии и лазер вой микроскопии.

В литературе имеется сравнительно мало работ, посвященных ана лизу свойств нефиксированных эритроцитов, что объясняется трудностями исследования живых клеток. Традиционные методы анализа размеров эритроцитов, как правило, позволяют получать усредненные данные, что делает невозможным оценку внутренней структуры популяции эритроцитов. Даже такие современные методы исследования как электронная микроскопия /трансмиссионная и растровая/, требуют фиксации клеток, что приводит к определенному изменению их истинных размеров и значительно затрудняет изучение эритроцитов в динамике.

Методы голографической интерферометрии и лагерной микроскопии лишены описанных недостатков и позволяют исследовать живые клетки, анализировать форму эритроцитов по их поперечному сечению /91/» производить количественную оценку формы //3#» измерять объем и площадь поверхности эритроцитов, определять концентрацию внутриклеточных веществ /92/* Новые цитоморфометрические методы - гологра-фическая интерферометрия и лазерная микроскопия - позволяют проводить оценку состояния эритроцитов в динамике по таким важнейшим параметрам как форма и размеры, масса и концентрация плотных веществ в клетке. В настоящее время в Советском Союзе и за рубежом не имеется специальной голографической аппаратуры для исследования биомз дицинских микрообъектов. В связи с вышеизложенный представляются актуальнымидели и задачи данной работы.

Целями исследования являлись:

1. Выбор и реализация наиболее оптимальной схемы лазерного, голографического интерференционного микроскопа для анализа биологи чееких микрообъектов, разработка количественных методик оценки раз меров, формы, массы и концентрации гемоглобина в эритроцитах.

2. Проведение сравнительной характеристики свойств популяций эритроцитов в норме и патологии. Сопоставление полученных новыми методами результатов с известными данными. Количественный и качест венный анализ основных преобразований фермы и размеров эритроцитов в норме, при наследственных изменениях цитомембраны эритроцитов и при нарушениях состава плазмы.

Задачи работы:

1. Выбор и реализация наиболее оптимальной схемы лазерного, голографического интерференционного микроскопа для получения высококачественных интерфереграмм и микрофотографий живых клеток.

2. Разработка количественных методик анализа эритроцитов на основе данных голографической интерферометрии и лазерной микроскопии по следующим параметрам: диаметр, максимальная и минимальная толщина, площадь поверхности, объем, коэффициент сферичности эритроцитов, масса и концентрация гемоглобина в клетках. Выработка количественных критериев оценки эритроцитов по их поперечному сечению.

3. Анализ свойств нефиксированных эритроцитов /на основе мето дик количественной и качественной оценки состояния клеток/ в норме при нарушениях ионного состава плазмы /диффузный гломерулонефрит/, содержания глюкозы /сахарный диабет/ и при нарушениях свойств цито мембраны эритроцитов /наследственный микросфероцитоз/.

Сравнительная характеристика эритроцитов в норме и наследственном микросфероцитозе в исследованиях <мтгЖч> при индуцированных изменениях формы клеток от дискоидальной до сферической / количественная и качественная оценка/.

Научная новизна. Количественные данные, полученные на препаратах без изменения нативных свойств клеток с использованием оригинальных количественных методик интерференционного анализа, указывают на однозначную взаимосвязь между формой, размерами эритроцитов, массой и концентрацией в них гемоглобина. Характер взаимосвязи одинаков для эритроцитов г норме и при наследственном микросфероци-тозе /НС/. Выявлено полное отсутствие истинных сфероцитов в плазме крови детей больных НС. Установлено, что увеличение сферичности эритроцитов при данном заболевании связано с уменьшением площади - поверхности клеток. Исследование Уп ьйко явления перехода эритроцитов от двояковогнутого диска к сфере в норме и при НС показало, что этот переход в обоих случаях представляет собой последовательный обратимый процесс, однако форма поверхности эритроцитов сферической формы в норме и при НС различна. Установлено, что переход от диска к сфере у эритроцитов больных НС происходит при менынх физико-хи-мических воздействиях, что указывает на увеличенную способность эритроцитов к сферуляции при данном заболевании.

Наиболее существенные результаты: I/ На основе отечественной аппаратуры создан оригинальный макет голографического микроскопа, который дает возможность методами интерферометрии и лазерной микроскопии проводить количественную и качественную оценку состояния эритроцитов в динамике. 2/ Получены экспериментальные данные, позволяющие в количественном отношении анализировать форму эритроцитов, измерять площадь поверхности, объем клеток, массу гемоглобина и его концентрацию в эритроцитах без окраски и фиксации, что дает возможность изучать в динамике процессы сферуляции эритроцитов и отщепления микропузырьков от поверхности эритроцитов. 3/ Анализ параметров поперечного сечения эритроцитов и их интерферограмм позволил выявить следующие закономерности: а/ при уменьшении диаметра эритроцитов происходит изменение формы централь ной и периферической части клеток и сдвиг максимальной толщины к центру; б/ с уменьшением диаметра эритроцитов наблюдается уменьшение площади поверхности клеток и массы гемоглобина, увеличение его объемной концентрации; в/ распределение эритроцитов в зависимости от их диаметров носит полимодальный характер с наличием пяти пиков. Эти закономерности характерны для эритроцитов как в норме так и при патологических состояниях. 4/ Не показано достоверных различий между эритроцитами в норме при диффузном гломерулонефрите и сахарном диабете по измеренным параметрам. Эритроциты больных наследственным микросфероцитозом в аутоплазме имеют форму утолщенных двояко вогнутых дисков с уменьшенной площадью поверхности и неизменным объемом, что соответствует снижению коэффициента сферичности клеток при данном заболевании по сравнению с нормой. 5/ Наблюдаемое в эксперименте изменение формы эритроцитов от дискоидальной до сферической представляет собой обратимый процесс, который сопровождается уменьшением общей площади поверхности без значительного изменения объема. Этот переход не зависит от природы действующего фактора и является специфической реакцией эритроцитов на внешние воздействия. Эритроциты при наследственном микросфероцитозе переходят в сферическую форму при меньших по сравнению с нормой воздействиях на клетки Экпериментальные работы по созданию макета голографического интерференционного микроскопа для биомедицинских исследований проведены во ВНИИ оптико-физических измерений под научным руководством д.т.н. В.М.Гинзбург. Исследование эритроцитов в норме и патологии проведено на базе лаборатории гормональной диаг ностики 2-го Московского ордена Ленина Государственного медицинского института имени Н.И.Пирогова под руководством д.м.н., профессора Князева Ю.А.

Хочется поблагодарить директора ВНИИ оптико-физических измерений профессора Степанова Б.М. за постоянную поддержку и помощь в развитии работ по внедрению новых методов в биомедицинские исследования; директора ЦНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР, профессора Вельтищева Ю.Е. за помощь в организации клинической базы исследований, за участие в обсуждении результатов работы; зав.лабораторие! гемоцитологии ЦНИЭДГАК, профессора Козинца Г.И. за ценные замечания по гематологической части работы.

Хочется также поблагодарить сотрудников кафедры факультативной педиатрии А.Г.Румянцева и В.Н.Манина и сотрудников лаборатории гормональной диагностики Л.Ф.Марченко и Г.В.Тананов|у. 2-го МОЛГМИ, а также зав.отделением 1-ой детской клинической больницы А.Г.Таладае-ва, сотрудников МНИИ педиатрии и детской хирургии - Капелько М.А., Цветкову Т.В. и Титова Г.Н. за участие в обсуждении результатов работы, помощь в подборе клинического материала; сотрудников ВНИИ оптико-физических измерений - Преснякова Ю.П., Гордеева А.П., Лехциера E.H. за помощь в математической обработке и физической * (тврпретации экспериментальных данных, за ценные замечания по оформлению работы. список

АББРЕВИАТУР И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Н - норма, практически здоровые дети , ДГН - диффузный гломерунонефрит СД - сахарный диабет НС - наследственный микросфероцитоз

Н&А, Н&Р, Н6Р - различные типы молекул гемоглобина, различающиеся по сочетанию полип^п^дяых цепей

Н$5 - патологический тип гемоглобина, вызывающий нарушение формы эритроцитов при серпсвидноклеточной анемии цепи - типы полипегадных цепей, входящих в состав молекул гемоглобина

2,3 - ДФГ - 2,3 - дифосфоглицериновая кислота

Г-б - ФДГ - Гл|юкозо-£-фосфат- дегидрогеназа

НАД - нифтинамидадениндинуюйтид

АТФ - адено^йнтрифосфат

СДЭ. - средний диаметр эритроцита

СОЭ - средний объем эритроцита

СПЭ - средняя площадь эритроцита

Т - средняя толщина эритроцита ксф. ~ средний коэффициент сферичности

РЭМ - растровый электроннй микроскоп

Об - объектив

МИ - мнимое изображение

Г - голограмма ф - фоторегистрирующее устройство: фотоаппарат, киноаппарат, телекамера г - оптический путь 1- длина волны лазера

5- ширина интерференционной полосы / период полос /

Вабс абсолютная чувствительность интерференционного метода д^- - смещение интерференционных полос

- разность хода д - число интерференционных полос на единицу длины в плоскости объект^ [1 к> - показатель преломления д Р - амплитуда колебания лазерного луча

-гелий-неоновый лазер Ф(х,д) - фазовое возмущение, вносимое объектом в предметную волну

- толщина объекта к:л. - разрешающая сила микроскопа Л - численная апертура микрообъектива , с1™а. - разрешающая сила голографического микроскопа С - ток ФЭУ О - диаметр эритроцита £ - радиус эритроцита 1~1 - максимальная толщина эритроцита /и - минимальная толщина эритроцита р - диаметр лазерного луча аДс,(£ - основные параметры формы эритроцита производные параметры формы эритроцита Су ~ объемная концентрация внутриклеточных веществ т/ - масса плотных веществ в эритроците

- характеристический коэффициент, связывающий показатель преломления /гъ/ и концентрацию /<7„/ растворенных веществ

5 э, - площадь поверхности эритроцита

Уэ. ~ объем эритроцита

Ккр. - коэффициент сферичности.

Результаты работы А.Н.метелкина по разработке и внедрению впрактиву голографических методов цитологического анализа форменных элементов крови /эритроцитов/ исподьзуэтся в научно-исследовательской работе лаборатории биохимии гормонов, на кафедре факультетской педиатрии 2-го МОЛГМИ им. Н.ИЛшрогова начиная с1978 года. Проводимая совместная работа показала перспективность использования нового метода для многопараметрической, количеств венной оценки состояния живых, нефиксированных эритроцитов. Наиболее важные результаты о характере изменений размеров и формы эритроцитов при разведении плазмы изотоническим раствором хлористого натрия, а также анализ эритроцитов детей с заболеваниями - сахарный диабет и наследственный сфероцитоз, показали, что голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия, как методы цитоморфометрии могут быть успешно использованы для получения новой информации о состоянии эритроцитов в количественном виде,что приведёт к дальнейшей объективизации лабораторно-клини-ческих анализов крови»

VПроректор по научной работе

•*»•* / с ¿-го ИОЛГМЙ им. Н.и.Пирогова

Й; профессор

Ю. СЛ'атаринов

16 января 1981г, иъ '

О внедрении результатов диссертационной работы А.Н. Метелкина на тему: Топографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов".

Работы по изучению состояния живых, нефиксированных эритроцитов детей с наследственным сфероцитозом проведены а.Н.Метёлкиным совместно с сотрудниками кафедры факультетской педиатрии 2-го МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова на основе голографичес-кого микроскопа, разработанного соискателем для проведения цитонорфометрических исследований.С помощью методик количественной оценки эритроцитов по многим параметрам, предложенных а.Н.Кетелкинымгбыли получены результаты, уточняющие имеющиеся представления о форме и размерах эритроцитов при данном заболевании. Новые данные углубляют и расширяют современные воззрения на характер патогенеза данного типа гемолитической анемии и могут быть использованы для поиска новых путей лечения наследственного сфероцитоза. Результаты работы доложены на гематологической секции врачей педиатров г. Москвы, что способствует их внедрению в практику.

Заведующая кафедрой факультетской педиатрии 2-го МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова, чл.-корр. АМН СССР, . профессор

Н.С.Кисляк и.^шь. о внедрении результатов диссертационной работы А.Н.Метёлкина на тему:ьГолографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов".

В Московском КИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР, начиная е--1978-Года,-на основании договора о научно-техническом содружестве с ВНИИ оптико-физических измерений проводились исследовательские работы по внедрению в практику новых, гологра фических методов анализа эритроцитов.Проведенные исследования показали безусловную перспективность использования, предложенных соискателем количественных, топографических методик оценки состояния нефиксированных эритроцитов в норме и патологии". Сравнительная характеристика свойств эритроцитов здоровых детей и больных диффузным гломерулонефритом показала, что эритроциты ^^яСданнпм ажтлр-вяииц пп фпр^р и размерам не отличаются от нормы, что указывает на выоок 'стойчивость клеток к внешним воздействиям со стороны аутоплазмы при нарушениях ей состава. Полученные в результате работы данные,о неблагоприятном воздействии на эритроциты больших разведений аутоплазмы изотоническим раствором хлористого,натрия.могут быть использованы практическими работниками»

Д --лЛмюектот) МНИИ педиатрии сирургии МЗ РСФ л д.м.н., профессор

Ю.Е.Вельтищев

16 января 1981г.

УТВКШДАЮ"

Директор ШЛИ оптико-,---физических измерений, , профессор

Б.М.Степанов ' -9-^Г 1981 Г.

АКТ внедрения во ВЕШ оптико-физических измерений результатов диссертации тов. Метелкина А.Н. на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальностям: 14.00.29 -гематология и переливание крови и 01*04.05 - оптика.

Настоящим актом подтверждается, чтоработипо создания макета голографического микроскопа и разработка методик оценки формы и распределения показателя преломления в микрообъектах, в том числе и эритроцитах проводились во ВНШОуШ и были непосредственно связаны с разработкой новых, голографических методов и средств контроля прозрачных /фазовых/ микрообъектов. Работы проводились по хоздоговорным тематикам, связанным с исследованием свойств кристаллов, растровых линз и световодов. Результаты работ используются при проведении хоздоговорных работ группы "Голографическая микроскопия" по разработке интерференционного голографического микроскопа широкого применения.

А.Ф.Клепов Ю.З.Портной Е.Н.Лехциор

Зам.начальника лаборатории Начальник сектора Руководитель группы

А' к а д е м и я и а .у к СССР Отделение общей .физики и астрономии

Г/в п

ОТ доктору физ.-тт.наук, профессору Б.Ы,Степанову г i

Глубокоуважаемый Борис Михайлович!

Заелудав доклад В.Ц.Гинзбург, й.Н.Лехциера, А.Й.Кет&шша, Б.М.Степанова 'Тологрофяческая микроскопия в кедЕко-бкологггсеских ксследовашаях"» Иаучгшй соез? ЛИ СССР по проблеме Толограф-.ш" отвечает, vso проведёнше во ЕНИИСШ исследовавия по разработке методов к сродсч'в голографической ьаяфаскогсм прзиешиташю к кздико-бкоЕогичоскии объектам являются существошаш вкладом в развитие вопросов теории и практического использования голографии. Работа содеряит оригнкаяькыз реиевн.а и выполнена ка высоком тучном урошо.

Результата мзджо-биолоитаесштх исследований на базе шкета годографического шкрэ скопа, разработанного специально для вэучзния клеток котах размеров (5-3-10 икы) без их фиксации, показшзазтг ширеi кие перспективы использования нового метода и аппаратуры в генатодогга

Научный совет по голографии отметил данную работу з числе лучших за 1980 год.

Зам. председателя Научного совета АН СССР по проблеме "Голография" доктор физ.-иат. неук, профессор

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количественная оценка состояния эритроцитов в норме и патологи! проведенная методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии в проходящем и отраженном свете показала эффективность использования данных методов для анализа эритроцитов, позволило в количественном виде выразить общие закономерности изменения размеров и формы эритроцитов, массы гемоглобина и его концентрации в клетках вне зависимости от патологии.Применение новых методов с использованием микрокиносъемки и видеозаписи позволило на нефиксированных клетках проследить основные виды преобразования §ормы и размеров эритроцитов - образования микропузырьков на поверхности эритроцитов и перехода от диска к сфере и дать им количественную оценку.

В результате проделанной работы была разработана схема голо-графического интерференционного микроскопа, выявлены достоинства метода /возможность количественной оценки нефиксированных клеток/, и недостатки /трудоемкость обработки данных/, указаны пути улучшения прибора /введение электронного устройства съема оптической информации и ввода ее в ЭВМ/. Разработаны методики интерференционного анализа эритроцитов.

Методы голографической интерферометрии и лазерной микроскопии в значительной ствлени дополняют традиционные микроскопические методы исследования /анализ клеток в проходящем свете, методы темного поля и фазового контраста/ так как обладают рядом преимуществ, расширяющих возможности оптической микроскопии. Анализ интерферограмм эритроцитов позволяет проводить количественную оценку формы клеток вводя соответствующие коэффициенты, вычислять площадь поверхности и объем эритроцитов. Одновременно можно измерять массу гемоглобина и его концентрацию. Голографический микроскоп позволяет наблюдать клетки в проходящем лазерном свете и выявлять наличие неоднороднос-тей в клетках. Микрокиносъемка интерферограмм эритроцитов в отраженщ. ном лазерном свете позволяет следить за преобразованиями формы и поверхности клеток. Качественная и количественная оценка объектов исследования может проводиться без их окраски и фиксации, что позволяет проводить анализ клеток в динамике.