Химическая модификация биологически активных веществ с целью создания новых лекарственных форм тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

005018175

ПОЛЯКОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

ФОРМ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

ФОРМ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Гинак Анатолий Иосифович

Официальные оппоненты: Шугалей Ирина Владимировна

доктор химических наук, профессор, профессор кафедры экологической и производственной безопасности СПбГТИ(ТУ)

Попова Лариса Михайловна доктор химических наук, профессор, профессор кафедры органической химии Санкт-Петербургского государственного технологического университета растительных полимеров

Ведущая организация: ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится «Jf » ar&uj, 2012 г. в « часов на заседании

совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.230.02 при федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении V/V высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государст-^ венный технологический институт (технический университет)» по адресу: 190013, г. Санкт-Петербург, Московский пр., 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбГТИ(ТУ)

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 190013, г. Санкт-Петербург, Московский пр., 26, СПбГТИ (ТУ), Ученый совет; тел.: (812)494-93-75; факс: (812)712-77- 91; e-mail: dissovet@lti-gti.ru; e-mail: dissovet@technolog.edu.ru.

Автореферат разослан « /£"» марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212,2-30.02,

кандидат химических наук, доцент ß ' Соколова Н.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди широко используемых противовирусных лекарственных средств основное место занимают синтетические препараты. Их существенным недостатком является относительно высокая токсичность и наличие разнообразных нежелательных побочных эффектов, таких как респираторные расстройства, боли в эпигастрии, метеоризм, повышение уровня билирубина в крови, головная боль, бессонница, нервозность, головокружение, нарушение концентрации внимания, кожная сыпь.

Поэтому весьма актуальной задачей является поиск и разработка новых высокоэффективных препаратов без побочных эффектов с длительным противовирусным и иммуностимулирующим действием для профилактики и лечения гриппа, герпеса и других вирусных инфекций.

Одним из перспективных методов повышения эффективности медико-биологических свойств препаратов является их модификация природными полимерами. В литературе описано множество примеров модификации высокомолекулярных веществ с помощью нерастворимых матриц. Однако изучению взаимодействия низкомолекулярных биологически активных веществ (БАВ) с растворимыми полимерными матрицами уделялось меньше внимания. Поэтому представляется актуальным выяснить, каким образом влияет химическая модификация низкомолекулярных БАВ природными высокомолекулярными соединениями, например декстраном, на их биологические свойства. В качестве низкомолекулярных БАВ целесообразно рассмотреть аминокислоты (АК). АК интересны тем, что олигомеры аминокислот - пептиды обладают иммуностимулирующим действием. Были выбраны аминока-проновая кислота, аминоуксусная кислота, L-аргинин, L-тирозин, также ремантадин, который представляет собой солянокислую соль первичного амина и как специфический ингибитор репродукции вирусов гриппа типа А остается единственным препаратом, действенность которого аналогична эффективности от использования противовирусных вакцин. В тоже время ремантадин

обладает рядом противопоказаний, ограничивающих его применение. Поэтому представляло интерес выяснить, как влияет модификация ремантадина декстраном в растворе на его химические и биологические свойства.

Основная цель работы - исследовать взаимодействие природного высокомолекулярного носителя с биологически активными веществами (аминокислотами, ремантадином) и получить полимерную растворимую ремантадинсодержащюю субстанцию и препарат на ее основе, который не проявляет в тех же дозах токсических эффектов, характерных для чистого ремантадина и обладает пролонгированным действием.

Основные задачи:

1 Изучить условия химической модификации низкомолекулярных аминов (аминокапроновой кислоты, аминоуксусной кислоты, Ь-аргинина, Ь-тирозина и ремантадина) под действием полимерной матрицы - диальдегид-декстрана.

2 Изучить влияние степени окисления матрицы и времени проведения реакции на относительную молекулярную массу полимерного модификатора.

3 Определить оптимальные условия химической модификации ремантадина диальдегиддекстраном, обеспечивающие получение высокомолекулярного производного.

4 Исследовать биологические свойства полимерного производного -модифицированного ремантадина (МР) в сравнении с нативным ремантадином (Р). Изучить противовирусную активность МР, изучить влияние МР на репродуктивную и гемагглютинирующую активность различных штаммов вируса гриппа, изучить активность МР на модели герпетической инфекции и инфекции клещевого энцефалита, изучить токсичность МР, его аллергизи-рующие свойства.

5 Выбрать оптимальные условия проведения процесса модификации, обеспечивающие возможность его промышленного производства. Рекомендовать МР для проведения дальнейших клинических исследований и оформ-

ления регистрационного досье с целью проведения медицинской экспертизы и последующей регистрации препарата.

Научная новизна. Впервые проведено исследование процесса химической модификации низкомолекулярных соединений, в том числе аминокислот и ремантадина, путем их ковалентного связывания с окисленным декстраном. Впервые изучены биологические свойства модифицированного ремантадина на моделях гриппозной, герпетической и энцефалитной инфекций на биологических объектах (куриных эмбрионах, мышах, морских свинках).

Практическая значимость. Синтезирована новая полимерная форма ремантадина (МР). Показана высокая эффективность МР при действии на вирусы различных штаммов вируса гриппа, герпеса и клещевого энцефалита, а так же его пониженная токсичность при действии на куриные эмбрионы и на мышей. На получение МР разработан и утвержден лабораторный регламент. Новая форма ремантадина рекомендована для проведения дальнейших клинических исследований с целью разработки технологии новой лекарственной формы.

Апробация работы. Результаты работы доложены на IX международной конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», СПб, 2010 г.; II международной конференции «Наука и современность», Новосибирск, 2010 г.; научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств ГОУ ВПО СПХФА Росздрава 2010 г.; научно-технической конференции молодых ученых «Неделя науки - 2011» СПбГТИ (ТУ); XI международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности», СПб, 2011 г.; XII международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности, СПб, 2011 г.; II международной конференции «Высокие технологии и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине», СПб, 2011 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, включающих 5 статьей в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов сообщений на конференциях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы. Общий объем диссертации составляет 129 страниц, содержит 17 рисунков и 20 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Химическая модификация биологически активных веществ

Для изучения особенностей взаимодействия окисленных декстранов с низкомолекулярными аминами в первую очередь были выбраны аминокислоты.

Биополимер активировали окислением глюкопиранозных звеньев дек-страна (Д) - полиглюкина (ПГ) калием йоднокислым мета до альдегидных групп. Схема окисления Д на примере одного глюкопиранозного звена изображена на рисунке 1.

снС—-Д*0'

н ом

И П-у " "^у

п - 100 мол. % звеньев ПГ; у = % мол. окисленных звеньев ПГ

Рисунок 1 - Окисление декстрана - полиглюкина на примере одного

глюкопиранозного звена

Для определения оптимальной величины рН при модификации АК изучали влияние рН реакционной среды на степень окисления Д взятого в концентрации 500 г/л. Установлено, что при рН 9,0±0,2 степень окисления (у) достигает максимума (рисунок 2). Под степенью окисления Д (у) понимают долю окисленных глюкопиранозных звеньев в полимере по отношению к их общему количеству.

2 КЮ4 рН 4,5±0,1

-щ_о

о ¡Н-

я т

20 -15 -10 ■ 5 -

0 т-1-г-1-1-1-1

0 2 4 б 8 10 12 рН

Рисунок 2 - Влияние рН реакционной среды на степень окисления (у) Д при температуре 20±2 °С; время реакции 1 час

Для определения оптимального времени проведения реакции активации Д изучали гидролиз окисленного Д - диальдегиддекстрана (ДАД) в буферном растворе (натрия углекислого 0,1 М), в котором проходит реакция химической модификации (рисунок 3).

1(в) - исходный Д; 2(о) - окисленный Д

Рисунок 3 - Кинетика деструкции окисленного Д в зависимости от времени реакции при у=0,1; рН 9,0±0,2; температура 20±2 °С

Показано, что в этих условиях относительная молекулярная масса окисленного Д (2) падает. Относительная молекулярная масса исходного Д (1) в течение времени проведения эксперимента в этих условиях остается постоянной. Показано, что скорость деструкции ДАД тем выше, чем больше степень окисления Д и выше рН раствора. Разрушению подвергается только окисленная форма Д. После восстановления ДАД с помощью натрия боргид-рида полисахарид дальнейшей деструкции не подвергается.

Таким образом, для получения высокомолекулярного полимерного производного время взаимодействия активированного полиглюкина должно быть минимальным. В наших последующих экспериментах было выбрано время реакции модификации равным 1 час.

Долю альдегидных групп ДАД ф), вступающих в реакцию модификации, изучали при различных соотношениях начальных концентраций аминогрупп глицина и альдегидных групп ДАД в реакционной среде. В реакцию модификации глицина брали ДАД с различной степенью окисления 0,08;

0,16; 0,30 (рисунок 4).

■ р , %

присутствии глицина от соотношения начальных концентраций аминогрупп и альдегидных групп в исходном растворе

Установлено, что конечная (равновесная) глубина модификации ДАД практически не зависит от степени окисления (у) матрицы, а определяется только исходным соотношением альдегидных и аминогрупп реагирующих компонентов.

Максимальное количество альдегидных групп ДАД, вступающих в реакцию с аминосоединением, не превышает 50 % от общего количества окисленных глюкопиранозных остатков ДАД.

Схема окисления Д и реакции модификации под воздействием ДАД изображены на рисунке 5.

ИНгЛ - аминокислота или нативный ремантадин Рисунок 5 - Схематическое изображение химической модификации аминокислот и ремантадина под действием ДАД

Взаимодействие низкомолекулярных аминов с предварительно активированным ПГ происходит с образованием М-замещенного имина (основания Шиффа), возникающего в результате реакции между альдегидными группами полимера и аминогруппой амина. Восстановление связей -СН=Н- в продукте реакции осуществляли так, чтобы происходила не только их полная трансформация до -СН2-МН- связи, но и трансформация избытка альдегидных (непрореагировавших) до первичных спиртовых -СН2ОН.

Полимерные АК исследовали хроматографически на колонке 50,0 см х 2,0 см, заполненной Сефадексом 0200.

Объем удерживания исходных АК составлял 100 - 113 мл, объем удерживания их полимерных производных - 55 - 70 мл, объем удерживания ДАД - 55 мл. Очевидно, что объем удерживания исходных АК гораздо больше, чем их полимерных производных. Это является серьезным подтверждением образования декстрановых производных АК, так как при гельпроникающей хроматографии чем меньше объем удерживания, тем больше молекулярная масса.

На рисунке 6 приведена гель-хроматограмма исходного Ь-тирозина и полимерного производного Ь-тирозина.

К») ~ исходный Ь-тирозин, 2(о) - полимерное производное Ь-тирозина Рисунок 6 - Гель-хроматограмма исходного Ь-тирозина и полимерного

производного Ь-тирозина

В продуктах, образовавшихся в ходе реакций модификаций, определяли содержание аминокислот (по ГФ XII и в соответствии с ОФС «Определение азота в органических соединениях»). И на основании данных об изменении содержания свободных аминогрупп в реакционной среде рассчитывали величины равновесных концентраций аминогрупп и альдегидных групп, значение кажущейся константы равновесия (Кк), констант скоростей прямой и обратной реакции (таблица 1).

Расчет кажущейся константы равновесия реакции Кк, л/моль: Кк = [АК]/([АК]0 х [Д]о)

где [Д]о- количество Д в исходном растворе, моль/л,

[АК]о- количество АК взятой в реакцию модификации, моль/л,

[АК] - количество АК определенное в модифицированной АК, моль/л

Таблица 1 - Анализ полимерных производных аминокислот

Наименование [Д]о, моль/л [АК]0, моль/л [АК], моль/л Кк, л/моль

Модифицированная аминокапроновая кислота (2,68±0,02)-10"2 (7,6±0,2)-10"3 (2,6±0,2)-10'3 12,7±0,2

Модифицированный L-аргинин (2,68±0,02)-10'2 (5,7±0,2)-10"3 (1,3±0,2)'Ю'3 8,5±0,2

Модифицированный L-тирозин (1,34±0,2)-10"2 (2,8±0,2)-10"3 (0,4±0,2)-10"3 10,6±0,2

Таким образом, с учетом погрешности эксперимента можно сделать вывод, что константа равновесия реакции модификации для различных аминов величина одного порядка.

Ремантадин (Р) в отличие от аминокислот, являющихся в нейтральной среде цвиттерионами, представляет собой солянокислую соль первичного амина (а-метил-1-адамантил-метиламина) CnH^N-HCl и в слабощелочной среде переходит в форму с неионизованной первичной аминогруппой.

Схема окисления и дальнейший синтез полимерного производного изображены выше на рисунке 5. На начальном этапе изучения модификации ремантадина был выбран избыток ДАД с молярным соотношением ДАД к Р, соответствующим отношению альдегидных групп к аминогруппам ~ 4,4.

При хроматографическом исследовании образовавшегося МР на колонке размером 50,0 х 1,2 см с гелем Сефадекс G75 (рисунок 7) было показано, что зона исходного Р соответствует 62,5 мл, зона голубого декстрана (ГД) - 24,0 мл, а после реакции модификации объем удерживания МР - 24,0 мл практически совпадает с зоной ГД. Таким образом Р действительно химически связан с высокомолекулярным ПГ.

и

10) - исходный Р; 2(о) - р, связанный с ПГ; 3( А) - ПГ; ГД - голубой декст-ран - вертикальная линия, соответствующая 24 мл

Рисунок 7 - Гель - хроматограмма Р и МР

При фиксированной величине концентрации исходного Д равной 50 мг/мл и Р - 5 мг/мл и при рН раствора 10,0 мы варьировали степенью окисления Д от 0,015 до 0,170.

Полученный МР обессоливали диафильтрацией на установке УПЛ-0,6, затем раствор МР высушивали лиофильно. В высушенном продукте определяли содержание Р после сжигания по методу Кьельдаля, а полисахаридную составляющую с помощью антронового реагента.

Содержание Р в процентах по отношению к Д в конечном высушенном продукте МР возрастает с увеличением у Д взятого в реакцию модификации (рисунок 8).

Количество связанного Р возрастает так же прямо пропорционально с изменением отношения концентрации альдегидных групп к концентрации аминогрупп в исходном растворе (рисунок 9).

Увеличение исходной концентрации полисахарида в растворе при постоянной степени окисления (у) исходного Д приводит к уменьшению доли модифицированного ремантадина в конечном продукте (рисунок 10).

Р. « о 40

25 ----—

О 5 10 15 20 У-0'»

Рисунок 8 - Зависимость содержания Р в конечном продукте МР от степени

окисления (у) Д в исходном растворе

35

25 -----

0 1 2 3 4 5 ГСОНУГКНЛ

Рисунок 9 - Зависимость содержания Р в конечном продукте МР от о соотношения реагирующих компонентов

70 60 50 40 30 20 10

о 20 40 60 80 100 ГЗ. мг/ыл

Рисунок 10 - Зависимость содержания Р в конечном продукте МР от содержания Д в исходном растворе

Обобщая результаты, можно утверждать, что метод модификации низкомолекулярных первичных аминов окисленными полисахаридами приводит к получению высокомолекулярных производных БАВ.

2 Изучение биологических свойств Большой интерес представляет вопрос, как полимерная химическая модификации влияет на основные биологические свойства ремантадина. 2.1 Изучение противовирусной активности МР на развивающихся куриных эмбрионах Использовали образец полимерного производного с содержанием Р -10 % и сравнивали с препаратом исходного Р. Образцы МР и Р (уравненные по действующему веществу) вводили в хориоалантоисную жидкость 9-10 дневных эмбрионов. Затем в эмбрионы вводили вирус гриппа (10 инфекционных доз). Для заражения использовали эпидемически актуальные штаммы вирусов гриппа типов А и В.

Оценку эффективности препаратов проводили путем вычисления индекса защиты (ИЗ) куриных эмбрионов (таблица 2). КЗ 1

И3 =-—х 100% лп

КЗ

где КЗ - коэффициент защиты

КЗ __процент эмбрионов с вирусом в контроле

процент эмбрионов с вирусом в условиях введения препарата ^

Таблица 2 - Индекс защиты на модели куриных эмбрионов

Штамм вируса Индекс защиты (ИЗ), %

MP P

A/Moscow/10/99 (H3N2) 70±5 70±5

A/New Caledonia/20/99 (H,N,) 100±2 0

А/Рг/8/34/ (HoN,) 100±2 0

B/Yamanashi/166/98 50±5 9±5

Из таблицы 2 следует, что на модели куриных эмбрионов МР превосходит по противовирусному действию исходный Р против штаммов вируса гриппа типа А и штамма вируса гриппа типа В.

2.2 Изучение влияния МР на репродуктивную и гемагглютинирующую активность различных вирусов гриппа

При сравнительном изучении активности вирусов гриппа без добавления МР (контроль) и в присутствии МР (опыт) в реакции гемагглютинации (РГА) обнаружено значительное уменьшение титра гемагглютинирующей активности у штаммов вируса гриппа типа А (таблица 3).

Таблица 3 - Влияние МР на инфекционную и гемагглютинирующую активность вирусов гриппа ________

Название штамма вируса гриппа Инфекционная активность* (в lg ЭИД5 0/0,2 мл) Титр гемагглютинирующей активности (в обратных величинах)

МР 4,2 мг/мл в 0,9 % растворе натрия хлорида 0,9 % раствор натрия хлорида МР 4,2 мг/мл в 0,9 % растворе натрия хлорида 0,9 % раствор натрия хлорида

A/Moscow/ 1/95 (HiNi) 0 8,00 ± 0,05 4 ± 1 512 ± 11

А/Nanchang/ 933/95 (H3N2) 0 7,75 ±0,05 4 ± 1 128 ±13

B/Beijing/184/93 0,25 ±0,03 7,50 ±0,05 64 ±4 128 ±10

Примечание - *- Инфекционная активность МР ЭИД50/0Д мл) - это доза препарата 0,2 мл, ингибирующая вирусную репродукцию в курином эмбрионе на 50 %. ЭИД - эмбриональная инфекционная доза

Присутствие модифицированной формы ремантадина ингибировало вирусную репродукцию с 8,00 lg ЭИД50/0,2 мл до 0, что является свидетельством значительной антивирусной активности МР.

Изучение влияния МР в концентрации 4,2 мг/мл на вирус гриппа показало его выраженное ингибирующее действие на гемагглютинирующую активность штаммов вирусов гриппа типа А. В опытах in vivo в куриных эмбрионах МР интенсивно блокировал репродукцию штаммов вируса гриппа типов А и В, что, несомненно, является свидетельством его значительной антивирусной активности.

2.3 Изучение противовирусной активности на мышах Препараты МР и Р внутривенно вводили в дозах (по действующему веществу) от 60 до 300 мг/кг мышам, зараженным вирусом гриппа типа А.

15

Сравнивали летальность в группах контрольных мышей и мышей, получавших МР (таблица 4). МР показал 90 - 100 % уровень защиты животных по сравнению с контролем.

Таблица 4 - Противовирусная защита мышей в зависимости от формы ремантадина_

Образец Доза мг/кг Количество выживших животных / исходное количество животных (в скобках % от исходного количества животных)

Время между заражением и введением исследуемых субстанций, часы

24 48 72

МР 30 4/20 (20%) 4/20 (20%) 18/20 (90%)*

МР 60 18/20 (90%)* 20/20 (100%)* 18/20 (90%)*

МР 150 15/20 (75%) 17/20 (85%)* 20/20 (100%)*

МР 300 18/20 (90%)* 14/20 (70%)* 20/20 (100%)*

Р 120 10/20 (50%) 2/20 (10%) 10/20 (50%)

Контроль 8/20 (40%) 5/20 (25%) 10/20 (50%)

Примечание - *-р < 0,05 по сравнению с соответствующей контрольной группой

2.4 Изучение активности МР на модели герпетической инфекции

Изучение лечебного действия МР в сравнении с препаратом Р проводили на белых беспородных мышах массой 15-20 г, зараженных вирусом простого герпеса штаммов ВН и УС. Препараты МР и Р (уравненные по действующему веществу) вводили подкожно, внутриорбитально (в синус глаза) и внутривенно в хвостовую вену. Мышей предварительно заражали вирусом простого герпеса I и II серотипов. На основании полученных результатов рассчитывали коэффициент защиты (КЗ) и индекс защиты (ИЗ) (таблица 5).

Таблица 5 - Противовирусная защита мышей в зависимости от способа введения ремантадина_

Группа Способ введения МР Доза МР, мг/мышь Курсовая доза МР, мг/мышь Летальность^ КЗ ИЗ

I Внутривенно однократно 1,25 1,25 (66,60±0,09) ♦ 1,07±0,02 6,50±0,02

II Подкожно четырехкратно 1,25 5,00 50,00±0,05 1,40±0,02 28,57±0,02

Контроль - - - 71,40*0,05 - -

Примечание - * - нет статистических различий от контроля; р<0,05

Установлено, что раннее лечение зараженных животных и увеличение курсовой дозы МР при внутриорбитальном введении сокращает процент гибели животных.

2.5 Изучение влияния МР на вирус клещевого энцефалита Белым мышам, зараженных вирусом клещевого энцефалита (штамм Абсеттаров 6-08/58,59), вводили Р и МР за 24 часа и 1 час до заражения и через 24, 48 и 72 часа после заражения. В контрольной группе вместо препарата использовали 0,9 % раствор натрия хлорида. Ежедневно в течение всего срока наблюдения фиксировали гибель животных в контрольной и опытной группах. На основании полученных результатов рассчитывали процент летальности и коэффициент защиты. Заболеваемость и летальность в опыте в 1,4 раза выше в группе мышей, получавших Р, по сравнению с группой мышей, получавших МР. КЗ мышей, получавших МР, оказался выше в 1,4 раза, чем у мышей, получавших Р в соответствующей концентрации.

2.6 Изучение токсичности МР на куриных эмбрионах В экспериментах по изучению токсичности МР на куриных эмбрионах препарат при введении в хорионаллантоисную полость 9-10 дневных эмбрионов не вызывал их гибели. МР не проявлял раннего и позднего токсического действия на куриных эмбрионах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение процесса химической модификации ремантадина под действием окисленного декстрана позволило синтезировать новую полимерную водорастворимую форму ремантадина. Установлено, что новый препарат на основе полимерного ремантадина оказался более эффективным при лечении и оказании экстренной помощи тяжелым больным с вирусными поражениями мозга и тяжелыми интоксикациями. К таким заболеваниям, кроме тяжелых форм гриппа, относятся генитальные формы герпетических заболеваний, заболевания клещевым энцефалитом с поражением ЦНС.

выводы

1 Установлено, что при взаимодействии аминокислот с окисленными декстранами образуются полимерные водорастворимые производные этих аминокислот. Только одна из двух карбонильных групп глюкопиранозного звена окисленного полимера принимает участие в реакции связывания аминогрупп низкомолекулярных аминосодержащих компонентов.

2 Изучена реакция ковалентного связывания полимерной матрицы с ремантадином, приводящая к получению полимерного растворимого высокомолекулярного производного модифицированного ремантадина. При этом доля высокомолекулярного полимерного производного ремантадина возрастает при увеличении концентрации альдегидных групп в реакционной смеси и при увеличении степени окисления полимерной матрицы.

3 Исследованы медико-биологические показатели полимерного растворимого производного. Препарат ремантадина на основе полимерной формы более эффективен, чем исходный ремантадин. Показано, что модифицированный ремантадин обладает в 20 раз меньшей острой токсичностью и на 20% меньше выраженными аллергизирующими свойствами по сравнению с ремантадином.

4 По сравнению с исходным модифицированный ремантадин показал вдвое больший уровень защиты животных против штаммов вируса гриппа типа А и при заражении вирусом клещевого энцефалита. Достигнут лечебный эффект модифицированного ремантадина в отношении герпесвирусной инфекции.

5 Определены условия проведения процесса модификации, положенные в основу лабораторного регламента. Такая нормативная документация может быть основой для производства модифицированного ремантадина.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Полякова, И.Н. Изучение химической модификации ремантадина с помощью полисахаридов / И.Н. Полякова, Б.В. Москвичев, А.И. Гинак // Известия Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). СПбГТИ (ТУ), 2009. - №6 (32) - С. 57-59.

2. Полякова, И.Н. Технология получения полимерной формы ремантадина и ее некоторые биологические свойства / И.Н. Полякова, А.И. Гинак // Высокие технологии, исследования, промышленность: сборник трудов IX международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». 22-23 апреля 20 Юг, Санкт-Петербург / под ред. А.П. Кудинова. - СПб: Изд-во Политехи, ун-та, 2010. - Т. 2. - С. 35-36.

3. Полякова, И.Н. Противовирусная активность модифицированного ремантадина на модели герпетической инфекции / И.Н. Полякова, Г.С. Шитикова, И.В. Нынь // сборник материалов II международной научно-практической конференции «Наука и современность». 16 апреля 2010г., Новосибирск / под. общ. ред. С.С. Чернова. -Новосибирск: Издательство «СИБПРИНТ», 2010. - Ч. 3. - С. 23-27.

4. Полякова, И.Н. Синтез и противовирусная активность модифицированного ремантадина / И.Н. Полякова, Г.С. Шитикова, И.В. Нынь // сборник материалов II международной научно-практической конференции «Наука и современность». 16 апреля 2010г., Новосибирск / под. общ. ред. С.С. Чернова. - Новосибирск: Издательство «СИБПРИНТ», 2010. - Ч. 3. С. 27-31.

5. Полякова, И.Н. Получение модифицированной формы ремантадина и ее биологические свойства / И.Н. Полякова, Г.С. Шитикова // сборник научных трудов научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств. 03 декабря 2010г., Санкт-Петербург. - СПб: Изд-во СПХФА, 2010.-Ч. 1.-С. 145-148.

6. Полякова, И.Н. Влияние модифицированного ремантадина на репродуктивную и геммагглютинирующую активность некоторых вирусов гриппа / И.Н. Полякова, А.И. Гинак, A.A. Гаврилов // Известия Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). - СПбГТИ (ТУ), 2010. -№7 (33)-С. 98.

7. Полякова, И.Н. Изучение влияния модифицированного ремантадина на заболеваемость мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита / И.Н. Полякова, А.И. Гинак Г.С. Шитикова // сборник тезисов научно-технической конференции молодых ученых «Неделя науки - 2011» Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 30 марта - 1 апреля 2011г., Санкт-Петербург. -СПбГТИ (ТУ), 2011. -С. 86.

8. Полякова, И.Н. Химическая модификация ремантадина с помощью полисахаридов и свойства полученного продукта / И.Н. Полякова, А.И. Гинак, Б.В. Москвичев, Г.С. Шитикова // Известия Волгоградского государственного технического универ-

ситета. Серия Химия и технология элементоорганических мономеров и полимерных материалов. - Волгоград, 2011. - №2 (75) - С. 99-102.

9. Полякова, И.Н. Синтез полимерного производного ремантадина и его некоторые биологические свойства / И.Н. Полякова, А.И. Гинак, И.В. Нынь // Высокие технологии, исследования, промышленность: сборник статей XI международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности». 27-29 апреля 2011г., Санкт-Петербург / под ред. А.П. Кудинова. - СПб: Изд-во Политехи, ун-та, 2010.-Т. 2,-С. 226-227.

10. Полякова, И.Н. Биополимерная форма ремантадина и ее противовирусная активность на модели герпетической инфекции / И.Н. Полякова, Г.С. Шитикова, И.В. Нынь // Высокие технологии, исследования, промышленность: сборник статей XII международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности». 08-10 декабря 2011г., Санкт-Петербург / под ред. А.П. Кудинова. - СПб: Изд-во Политехи, ун-та, 2011. - Т. 1. - С. 234-236.

11. Полякова, И.Н. Биополимерная форма ремантадина и ее противовирусная активность на модели инфекции клещевого энцефалита / И.Н. Полякова, Г.С. Шитикова, И.В. Нынь // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине. Т. 3: сборник статей II международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине». 26-28 октября 2011г., Санкт-Петербург / под ред. А.П. Кудинова, Б.В. Крылова. - СПб: Изд-во Политехи, ун-та, 2011. - С. 49-51.

12. Нынь, И.В. Изучение процесса химической модификации соединений, содержащих первичные аминогруппы, под воздействием окисленных декстранов / И.В. Нынь, А.И. Гинак, И.Н. Полякова, Е.С. Зайцева // Актуальные проблемы химии, биологии и медицины: монография. Кн. 3. / Красноярск: Научно-инновационный центр, 2011. - С. 154-176.

13. Полякова, И.Н. Изучение медико-биологических свойств биополимерного производного ремантадина / И.Н. Полякова, Т.Я. Богданова, И.В. Нынь // Известия Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). - СПбГТИ (ТУ), 2011. - №12 - С. 51-52.

Отпечатано с оригинал-макета. Формат 60х90'Аб Печ.л. 1,25 .Тираж экз. 90. Зак. № 45

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)»

190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26 Типография издательства СПбГТИ(ТУ), тел. 49-49-365, e-mail: publ@technolog.edu.]

61 12-2/581

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)»

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

ФОРМ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

02.00.10 - Биоорганическая химия

Научный руководитель -

доктор химических наук, профессор Гинак А. И.

Санкт-Петербург 2012

) ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................11

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................55

2.1 Материалы......................................................................................................................................55

2.2 Оборудование..............................................................................................................................57

2.3 Методы............................................................................................................58

2.3.1 Методы химических исследований................. ....................................58

2.3.2 Методы биологических исследований............... ..............................62

2.3.3 Погрешность методов......................................................................................................65

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................68

3.1 Химическая модификация БАВ, в том числе аминокислот, ремантадина..............................................................................................................................68

3.2 Изучение биологических свойств..............................................................................87

3.2.1 Изучение противовирусной активности МР на развивающихся куриных эмбрионах....................................................................................................87

3.2.2 Изучение влияния МР на репродуктивную и гемагглютинирующую активность различных вирусов гриппа 88

3.2.3 Изучение противовирусной активности на мышах..............................91

3.2.4 Изучение активности на модели герпетической инфекции............93

3.2.5 Изучение влияния МР на вирус клещевого энцефалита..................98

3.2.6 Изучение токсичности МР на куриных эмбрионах..............................99

3.2.7 Изучение острой токсичности МР на белых беспородных

мышах..............................................................................................................................................101

3.2.8 Изучение аллергизирующих свойств МР на морских свинках 102

3.2.8.1 Изучение общей анафилактической реакции.......... ....................102

3.2.8.2 Изучение активной кожной анафилаксии................................................104

/

3.2.8.3 Изучение непрямой реакции дегрануляции тучных клеток

(РДТК)..........................................................................................................................................105

3.2.9 Изучение иммунотоксических свойств............................................................106

3.2.9.1 Влияние МР на гуморальное звено иммунной системы .............107

3.2.9.2 Влияние МР на клеточное звено иммунной системы....................108

3.2.9.3 Влияние МР на массу и клеточность центральных и периферических органов иммунной системы..........................................108

3.2.9.4 Влияние МР на естественную резистентность организма..........109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................................................110

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................112

з

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

100ТЦД5о/мл - 100 тканевых цитопатогенных доз вируса, необходимых

для того, чтобы погибла половина группы испытуемых животных, содержавшихся в 1мл раствора ЭИД50/0,2 мл - доза препарата 0,2 мл, ингибирующая вирусную репродукцию в курином эмбрионе на 50% Огз5 - оптическая плотность раствора при длине волны 235 нм

в кювете с длиной оптического пути 10 мм ЬЭ5о - средняя летальная доза вещества, при которой погибает

половина группы испытуемых животных Аё - адамантан - химическое соединение, насыщенный три-

циклический мостиковый углерод с формулой СюН^ СОН - альдегидная группа

МНг - аминогруппа

у - степень окисления декстрана - доля окисленных глюко-

пиранозных звеньев в полисахариде по отношению к их общему количеству А - амин

АИ - анафилактический индекс

АК - аминокислоты

БАВ - биологически активные вещества

в/м - внутримышечно

ВПГ - вирус простого герпеса

ДАД - диальдегиддекстран

ЕД - единица действия

ИЗ - индекс защиты

КЗ - коэффициент защиты

К/Э - клещевой энцефалит

к/э - куриные эмбрионы

МПД - максимально переносимая доза - наибольшая доза, введение которой в организм не вызывает его гибели, хотя и сопровождается развитием симптомов отравления

МР - модифицированный ремантадин

ОФС - общая фармакопейная статья

ПГ - полиглюкин

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПЕ - единица протеолитической активности

п/к - подкожно

Р - нативный ремантадин

РГА - реакция гемагглютинации

РН - реакция нейтрализации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ТД - терапевтическая доза

ЦНС - центральная нервная система

ЭБ - эритроциты барана

ВВЕДЕНИЕ

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) представляют собой наиболее массовые заболевания, встречающиеся в течение всего года, но чаще всего - осенью и зимой. По данным Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, ОРВИ занимают первое место в структуре инфекционных заболеваний и составляют 80 - 90 % от всех случаев инфекционной патологии.

Грипп - острое инфекционное заболевание вирусной этиологии, которое сопровождается поражением верхних дыхательных путей. Грипп снижает защитные силы организма, вследствие чего он может становиться причиной различных заболеваний верхних и нижних отделов дыхательных пу-теи, центральной нервной системы, сердца, почек и других органов. С учетом способности гриппа вызывать ежегодные эпидемии и пандемии в масштабах всего земного шара, можно утверждать, что грипп представляет проблему мирового значения. В период эпидемии болеет от 5 до 20 % населения. При пандемиях, когда происходит изменение свойств вируса, заболевает каждый второй человек. Как правило, новые штаммы гриппа впервые появляются в Китае и Юго-Восточной Азии, а затем быстро распространяются по всему миру.

Экономический ущерб от гриппа как для каждого заболевшего человека (потерянные рабочие дни, траты на лекарства), так и для общества в целом огромен. Сезонная вспышка гриппа в России приносит прямые и косвенные убытки порядка 40 млрд. рублей ежегодно.

Помимо непосредственного вреда здоровью человека, грипп способен обострять течение других заболеваний, что представляет особую опасность для людей с хроническими патологиями и ослабленной иммунной системой - пожилых, новорожденных, пациентов с сердечнососудистыми заболеваниями и др. Многие острые респираторные заболевания (ОРЗ) вызываются

парагриппозными, респираторно-синцитиальным, адено-, корона, энтеро-, риновирусами и другими возбудителями.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), заболевания обусловленные вирусом простого герпеса (ВГП) занимают второе место (15,8 %) после гриппа (35,8 %) как причина смертности от вирусных инфекций.

Профилактика и лечение таких вирусных заболеваний путем иммунизации инактивированными или живыми вакцинами не обеспечивает надежной защиты, эффективность которой снижается в связи с быстрой изменчивостью вирусных штаммов.

Поэтому очень важное значение имеет разработка высокоэффективных химиопрепаратов против вирусных ОРЗ, гриппозной и герпетической инфекции.

Определенные успехи достигнуты при использовании для профилактики и лечения вирусных инфекций производных адамантана.

В настоящее время в медицинской практике применяется для профилактики и лечения гриппа противовирусное средство ремантадин, содержащее в качестве активного вещества (а-метил-1-адамантил-метиламина гидрохлорид). Этот препарат является одним из наиболее эффективных средств борьбы с гриппозной инфекцией. Однако препарат имеет значительные недостатки:

- узкий спектр действия (действует только на вирус гриппа типа А);

- быстрое выведение препарата из организма требует частого его приема для поддержания необходимой терапевтической дозы. Увеличение однократной дозы ведет к нежелательным побочным проявлениям и мало повышает его эффективность;

- эффективность использования ремантадина для профилактики гриппа в период эпидемических вспышек зависит также от регулярности приема

препарата, что создает определенные трудности при проведении широкомасштабных профилактических мероприятий;

- ремантадин относится к умеренно токсическим веществам, обладающим нефротоксическим эффектом.

Сведения о противовирусной активности ремантадина в отношении вируса герпеса отсутствуют. При лечении герпеса применяют противовирусные средства адапромин, дейтифорин, арбидол.

Адапромин - (а -этил- а (1-адамантил) метиламин) активен в отношении вирусов гриппа типа А и В, но токсичнее ремантадина.

Арбидол - (1 метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4диметил-аминометил-5-окси-б-броминдола гидрохлорид моногидрат), несмотря на рекомендацию его использования при герпетической инфекции, по уровню защиты при гриппозной инфекции уступает ремантадину, адапромину, дей-тифорину. Арбидол токсичнее и имеет пониженную биодоступность по сравнению с указанными препаратами.

Среди широко используемых противовирусных лекарственных средств основное место занимают синтетические препараты. Их существенным недостатком является относительно высокая токсичность и наличие разнообразных нежелательных побочных эффектов. Опыт лечения и профилактики гриппа с помощью таких известных антивирусных химио-препаратов, как амантадин, ремантадин, ацикловир показал, что существует возможность возникновения у вирусов резистентности к действию этих веществ.

Поэтому весьма актуальной задачей является поиск и разработка новых высокоэффективных препаратов без побочных эффектов с длительным противовирусным и иммуностимулирующим действием для профилактики и лечения гриппа, герпеса и других вирусных инфекций.

Одним из перспективных методов повышения эффективности медико-биологических свойств препаратов является их модификация природ-

ными полимерами. В литературе описано множество примеров модификации высокомолекулярных веществ с помощью нерастворимых матриц. Однако изучению взаимодействия низкомолекулярных биологически активных веществ (БАВ) с растворимыми полимерными матрицами уделялось меньше внимания. Поэтому представляется актуальным выяснить, каким образом влияет химическая модификация низкомолекулярных БАВ природными высокомолекулярными соединениями, например декстраном, на их биологические свойства. В качестве низкомолекулярных БАВ целесообразно рассмотреть аминокислоты (АК). АК интересны тем, что олиго-меры аминокислот - пептиды обладают иммуностимулирующим действием. Были выбраны аминокапроновая кислота, аминоуксусная кислота, Ь-аргинин, Ь-тирозин, также ремантадин, который представляет собой солянокислую соль первичного амина и как специфический ингибитор репродукции вирусов гриппа типа А остается единственным препаратом, действенность которого аналогична эффективности от использования противовирусных вакцин. В тоже время ремантадин обладает рядом противопоказаний, ограничивающих его применение. Поэтому представляло интерес выяснить, как влияет модификация ремантадина декстраном в растворе на его химические и биологические свойства.

Цель настоящей работы - исследовать взаимодействие природного высокомолекулярного носителя с биологически активными веществами (аминокислотами, ремантадином) и получить полимерную растворимую ремантадинсодержащюю субстанцию и препарат на ее основе, который не проявляет в тех же дозах токсических эффектов, характерных для чистого ремантадина и обладает пролонгированным действием.

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые проведено исследование процесса химической модификации низкомолекулярных соединений, в том числе аминокислот и ремантадина, путем их кова-лентного связывания с окисленным декстраном. Впервые изучены биоло-

гические свойства модифицированного ремантадина на моделях гриппозной, герпетической и энцефалитной инфекций на биологических объектах (куриных эмбрионах, мышах, морских свинках).

Практическая значимость работы заключается в том, что синтезирована новая полимерная форма ремантадина - модифицированный ремантадин. Показана высокая эффективность модифицированного ремантадина при действии на вирусы различных штаммов вируса гриппа, герпеса и клещевого энцефалита, а так же его пониженная токсичность при действии на куриные эмбрионы и на мышей. На получение МР разработан и утвержден лабораторный регламент. Новая форма ремантадина рекомендована для проведения дальнейших клинических исследований с целью разработки технологии новой лекарственной формы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, включающих 5 статьей в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов сообщений на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 129 страницах, проиллюстрированы 17 рисунками, содержат 20 таблиц.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В последние годы отмечается значительное увеличение количества инфекционных заболеваний. Среди них особое место занимают заболевания вирусной этиологии, такие как СПИД, энцефалиты, острые кишечные и респираторные инфекции, геморрагические лихорадки и др.

Среди острых респираторных инфекций наиболее массовым заболеванием человека является грипп. Несмотря на определенные успехи современной медицины, это заболевание наносит огромный вред здоровью людей и приводит к значительным экономическим потерям.

Характер эпидемии приобрела герпетическая инфекция, которая имеет различные клинические проявления, от высыпаний на коже губ, до герпетических менингоэнцефалитов с большим процентом летальности. В медицинской практике при лечении вирусных заболеваний используются препараты различных химических групп (производные адамантана, тио-семикарбазоны, аномальные нуклеозиды, ингибиторы протеолиза и др.).

В настоящее время хорошо изучены свойства таких углеводородов каркасного строения, как производные адамантана. Биологической активностью обладают, прежде всего, азотсодержащие производные, в особенности имеющие аминогруппы.

Эти соединения обладают широким спектром действия: противовирусным, бактериостатическим, фунгицидным, противокаталептическим, гербицидным, противопаркинсоническим и др. [1-9].

Противовирусная активность аминопроизводных адамантана связана с их способностью ингибировать активацию Са -фосфолипидзависимой протеинкиназы (протеинкиназы С) [10].

Противовирусная активность обнаружена у ряда галоген-, гидрокси-и меркаптопроизводных адамантансодержащих амидов общей формулы 1-АёСОШСНгСНгХ и 1-АёШСОСН2Х, где А<1 - адамантан - химическое

соединение, насыщенный трициклический мостиковый углерод с формулой С10Н16, Х=ОН, 8Н. Эти соединения активны в отношении вируса гриппа А, вируса классической чумы птиц, вируса Синдбис [7, 11—18].

Некоторые соединения, например 1-1Ч-(Ь-гидроксиэтиламино) ме-тиладаманты и их соли, служат исходными веществами для синтеза радиопротекторов [19].

Бактерицидную, фунгицидную и гербицидную активность проявляют диалкиламиноалкиловые эфиры адамантантиокарбоновой кислоты [20, 21].

В клинической практике для лечения вирусных заболеваний применяются такие препараты, как ремантадин (полирем, флумадин), амантадин (вирегит-К, глудантан, мидантан, ПК-Мерц), ацикловир (ацикловир -Акри, виролекс, герпесин, зовиракс, лизавир, суправиран, цикловир), ди-данозин, фамцикловир (фамвир), фоскарнет (триаптен), ганцикловир (ци-мевен), идоксуридин (офтан иду), ламивудин, рибавирин (виразол, риба-мидил), ставудин, трифлуридин, валацикловир, видарабин, зальцитабин (хивид), зидовудин (азидотимидин, ретровир).

Но эти препараты имеют ряд недостатков. Это, прежде всего, относительно узкий спектр противовирусного действия, наличие разнообразных побочных реакций, появление резистентных штаммов вирусов и др.

Данные литературы [22, 23] свидетельствуют о том, что при приеме ремантадина нарушения со стороны нервной системы наблюдаются в 45,5 %, зальцитабина в 26,6 %, ацикловира в 26,7 %. Среди побочных реакций, возникающих при лечении рибавирином, доминируют респираторные расстройства. При применении идоксуридина побочные реакции со стороны кожи составляют 45 %. Общие расстройства чаще имеют место при назначении ганцикловира (26,7 %), при использовании зидовудина наблюдаются по