Химическая модификация природных полимеров меланинов гриба Inonotus obliquus (чага) с целью получения высокоактивных антиоксидантов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Грачева, Наталья Владимировна АВТОР
кандидата технических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Волгоград МЕСТО ЗАЩИТЫ
2014 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.06 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Химическая модификация природных полимеров меланинов гриба Inonotus obliquus (чага) с целью получения высокоактивных антиоксидантов»
 
Автореферат диссертации на тему "Химическая модификация природных полимеров меланинов гриба Inonotus obliquus (чага) с целью получения высокоактивных антиоксидантов"

На правах рукописи

Грачева Наталья Владимировна

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПРИРОДНЫХ ПОЛИМЕРОВ МЕЛАНИНОВ ГРИБА ШОИОТиБ ОВЬЩииЗ (ЧАГА) С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ

02.00.06. - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Волгоград-2014

2 2 ИЛИ 2014

005548799

Работа выполнена на кафедрах «Промышленная экология и безопасность жизнедеятельности» и «Процессы и аппараты химических производств» Волгоградского государственного технического университета.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор . технических наук, профессор Голованчиков Александр Борисович.

Андриасян Юрик Оганесовнч,

доктор технических наук, профессор, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, кафедра «Перспективные эластомерные материалы», заведующий кафедрой;

Штильман Михаил Исаакович,

доктор химических наук, профессор, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, кафедра «Химическая технология пластмасс», профессор.

Санкт-Петербургский государственный технологический университет

растительных полимеров (СПбГТУРП), г. Санкт-Петербург.

Защита состоится «18 »июня 2014 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.028.01, созданного на базе Волгоградского государственного технического университета по адресу: 400005, г. Волгоград, пр. Ленина 28, ауд. 209.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного технического университета и на сайте www.vstu.ru по ссылке http://www.vstu.ru/nauka/dissertatsionnye-sovety/d-21202801.html.

Автореферат разослан « 24 » апреля 2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

[" Дрябина Светлана Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время в области химии высокомолекулярных соединений наблюдается всплеск интереса к биополимерам с целью разработки на их основе материалов с различными функциями. Особое место среди природных полимеров занимают меланины - представители класса мало изученных конденсированных полифенолов. Наличие высокостабильных парамагнитных центров, разнообразие функциональных групп, а также Система сопряженных связей в молекулах определяют их полифункциональность.

Уникальным свойством меланинов является устойчивое свободно-радикальное состояние. В зависимости от условий мономеры меланиновых пигментов способны находиться в виде феноксильных или семихинонных радикалов. Вступая в окислительные реакции, эти природные полимеры действуют не только в восстановленной гидрохинонной форме фенолов, но и как система полифенол-хинон, в которой в качестве обязательного промежуточного продукта присутствует радикал-семихинон. Компоненты этой системы определяют проявление меланинами антиоксидантных свойств.

Экономическая доступность природных полимеров меланинов обусловливает возможность получения на их основе высокоактивных антиоксидантов, которые могут найти применение, как в медицине, так и в различных отраслях промышленности.

Одним из перспективных сырьевых ресурсов природных полимерных пигментов является гриб трутовик скошенный ЫопоШ оЬИдииэ (чага). Известно, что меланиновые полимеры трутовика скошенного представлены несколькими фракциями, различающимися по химическому составу, степени ароматизации, молекулярно-массовому распределению и содержанию функциональных групп. Однако вопрос их структурно-химической организации остается открытым, что не позволяет регулировать их свойства в требуемом направлении. В связи с этим актуальным и необходимым является исследование структурно-химической организации природных полимеров меланинов гриба I. оЬЩиш (чага) и

разработка способов повышения их аитиоксидантной активности. Особенно перспективным представляется их направленная химическая модификация с целью введения или усиления требуемой функции.

Цель работы Заключается в получении высокоактивных антиоксидантов путем химической модификации природных полимеров меланинов гриба I. оЬНдиш (чага).

Для реализации цели были поставлены и решены следующие задачи:

- исследовать структурно-химическую организацию природных полимеров меланинов гриба I. оЪЩию (чага);

- разработать способы химической модификации меланинов гриба I. оЬИдииз (чага) исходя из особенностей их структурно-химической организации;

- провести модификацию природных полимеров меланинов различными химическими способами;

- исследовать антиоксидантную активность исходных и модифицированных пигментных полимеров;

- разработать способы выделения меланинов из сырья.

Научная новизна. Впервые разработаны и научно обоснованы способы химической модификации меланиновых полимеров чаги методами окислительного гидроксилирования по Эльбсу, периодатного окислительного деметилирования и восстановления сульфитом натрия, позволяющие увеличить содержание фенольных групп на 30 - 40% и в 4-5 раз соответственно. Определено, что увеличение содержания фенольных групп обусловливает повышение аитиоксидантной активности полимеров.

Впервые доказано, что в составе меланинов присутствует химически связанный с полисахаридами лигниноподобный полимер, образованный структурными звеньями гваяцил-сирингильного типа, соединенными между собой сложноэфирными связями. Предложена схема строения фрагмента этого полимера. Разработаны способы выделения лигниноподобного меланина, позволяющие увеличить его выход в 2 и 3 раза. Разработан способ получения

меланина из шрота гриба I. obliquus методом щелочного гидролиза, позволяющий увеличить его выход в 6-8 раз.

Практическая значимость. Разработаны сравнительно простые одностадийные процессы получения производных природных полимеров меланинов гриба чаги. Получены модифицированные меланины, характеризующиеся высокой антиоксидантной активностью. Разработаны способы выделения природных полимеров меланинов из сырья, позволяющие повысить выход при низких энергетических затратах и использовать в качестве сырья отходы переработки гриба чаги. Разработан способ выделения меланина, основанный на его осаждении ацетоном из щелочных растворов, что позволяет получить водорастворимую форму.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались и обсуждались на следующих конференциях: «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine» (S.-Petersburg, 2011); XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 2011); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011 г); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы естественных наук» (Тамбов, 2011); Международной конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» (Санкт-Петербург, 2010); IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010); XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2011); VI Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительного сырья» (Санкт-Петербург, 2010); 46-ой, 47-ой ,49-ой Традиционной внутривузовской конференции ВолгГТУ (Волгоград, 2008, 2009, 2011, 2012, 2013, 2014), 16 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука 21 века» (Пущино, 2012г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК; получен 1 патент РФ.

Достоверность результатов основывается на использовании современных методов исследований, проведенных в различных сертифицированных лабораториях и на поверенных приборах, и обработке полученных результатов методами математической статистики.

Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, библиографического списка, содержащего 133 наименования, 4 приложений. Работа изложена на 128 страницах, содержит 27 рисунков, 29 таблиц.

Благодарности. Автор выражает благодарность д.х.н., профессору Лебедеву А.Т. (МГУ им. М.В. Ломоносова) и Таказовой Р.У. (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) за проведение элементного анализа; д.х.н., профессору Перегудову A.C. (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) и к.х.н. Курковской Л.Н. (ИБХФ РАН) за содействие в проведении исследований методом ЯМР-спектроскопии; д.х.н., профессору Солодовникову С.П. (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) за помощь в проведении исследований методом ЭПР-спектроскопии; д.х.н., профессору 1 Рязанову M.A.I (Институт химии Коми НЦ УрО РАН) за помощь в обработке результатов рК-спектроскопических исследований. Глубокую признательность автор выражает д.т.н., профессору Желтобрюхову В.Ф. (ВолгГТУ), д.т.н., профессору Каблову В.Ф. (ВолгГТУ) и к.х.н., доценту Хохловой Т.В. (ВолгГТУ) за участие в постановке цели и обсуждении результатов.

Исследования проводились при поддержке Минобрнауки РФ в рамках базовой части госзадания НИР №20-53/676-14.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цель и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Глава 1 представляет обзор работ, посвященных исследованию физико-химических, структурных характеристик и антиоксидантной активности природных полимеров меланинов чаги и других грибов, а также близких им соединений. Приведены данные о взаимосвязи антиоксидантной активности природных соединений и содержания фенольных групп. Рассмотрены вопросы возможности направленной химической модификации пигментных полимеров гриба I. obliquus с целью усиления требуемых функций. Рассмотрены вопросы выделения меланинов из сырья.

Глава 2 содержит описание объектов исследования: природных полимеров меланинов гриба I. obliquus, и методов их исследования: элементного анализа (анализаторы Варио МикроО и СЕ 1106), ИК-Фурье спектроскопии (ИК-Фурье спектрометр Nicolet 6700 FT-IR ), 13С ЯМР-спектроскопии (прибор Bruker Avance 600), ЭПР-спектроскопии (Спектрометр Varian Е-12), УФ-спектроскопии (спектрофотометр СФ-26), рК- спектроскопии (рН-метр НТ-2211 Hanna), вискозиметрии, криоскопии, количественного определения содержания кислых функциональных групп, сложноэфирных связей, антиоксидантной активности. Приведены основные методики эксперимента: выделение из сырья и разделение меланинов на фракции (МО- меланины очищенные, и выделенные из них МРА-меланины растворимые в ацетоне, МНА- меланины нерастворимые в ацетоне), способы их химической модификации.

Глава 3 Экспериментальная часть 3.1 Исследование структурно-химических характеристик природных полимеров меланинов гриба Inonotus obliquus (чага)

Ввиду ограниченности сведений о структуре полимеров меланинов гриба I. obliquus в части структурообразующих звеньев, а также количества и

расположения функциональных групп были проведены исследования этих аспектов в сравнении с наиболее близкими по природе биополимерами.

Обработка данных элементного анализа меланинов с использованием диаграммы Ван-Кревелена (Рисунок 1) выявила, что полимеры МРА и МНА имеют значительные отличия. Положение полимера МРА на диаграмме свидетельствует о близости его элементного состава гуминовым кислотам почв и торфа, а МНА - грибным меланинам Непс1ег$опи1а 1оги1о1с1еа, \Jlocladium Шгитп и ранним сведениям о меланинах ЬоЫ'щииь (ВаЬкэкауа е1 а1., 2000).

I рибные м еланины_ у»' '—

! К - - - Г ]Щт-

почв и 8Э . ФК

торсра торфа

ОПОЛ! Ддио! мер МРА сан лигнин. з1 13 полимер ©полимер ША7 МО

0 0,2 0,4 0,6 0,8 о/£ 1

Рисунок 1 - Диаграмма Ван-Кревелена для полимеров меланинов чаги

Исследование полимеров МО, МРА и МНА методом ИК-Фурье спектроскопии определило, что образцы характеризуются различным набором полос поглощения и их интенсивностью, что обусловлено различной природой полимеров и способами их выделения (Рисунок 2).

Однако на всех спектрах обнаружены полосы поглощения, характерные для соединений полифенольного типа: при 3300-3500 см"1 (гидроксилсодержащие структуры); 1670-1710 см'1 (карбонилсодержащие структуры); 1590-1600, 15001510, 1400-1420, 700-900 см"1 (ароматические структуры); 1140-1270, 1310-1420, 1020-1070 см"1 (структуры С-ОН фенолов, а также С-0 эфиров); 1120-1150, 10001030 см"1 (С-ОН спиртовых групп, полисахаридов).

И;

ЗЯО Я» MJ Ш НЮ

Рисунок 2 - ИК-Фурье спектры меланинов чаги а- полимеры МО, 5- полимеры МРА (0 - исходные, 1,2 - после кислотного гидролиза), e-полимеры МНА - солевая и Н+- форма

Выявлено, что спектр образца МНАпереосажд. (образец МНА, повторно осажденный из щелочного раствора ацетоном) значительно отличается от других. На спектре имеется сильная полоса поглощения при 1650 см"1, что свидетельствует о присутствии в структуре полимера хиноновых фрагментов. Наличие полосы поглощения в спектрах МРА и МО при 1750-1780 см"1 позволяет предположить наличие сложноэфирной связи с фенолами.

Анализ данных 13С ЯМР-спектроскопии (Рисунок 3) выявил в полимерах МО и МРА присутствие гваяцильных (ХС: 108,6 ppm - С-2; 119,1 ррт - С-6; 149,8 ррт - С-4; 55,6-55,8 ррт - ОСН3) и сирингильных (ХС: 106,4, 104,4 ррт -С-2, С-6; 152,2, 152,4 - С-3, С-5 атомы; 55,6-55,8 ррт - ОСН3) лигниновых единиц и их производных, значительное количество сложноэфирных и карбоксильных групп (165-178 ррт), а также карбогидратных фрагментов полисахаридов (103, 59-75 ррт).

МО

200

ísd

100

Л

u

MPA

200 150 166 ' '....... S0 .........

Рисунок 3 - 13С ЯМР-спектры меланинов а- растворитель 0,1 н NaOH/T^O, б, в- растворитель ДМСО(]6

При этом для образцов МРА отмечается увеличение интенсивности сигналов полисахаридного углерода. Это позволяет предположить, что выделенная фракция содержит значительное количество химически связанных полисахаридов. Плохо разрешенные перекрывающиеся сигналы в диапазоне с ХС 165-185 ррт свидетельствуют о наличии сложноэфирной связи, как одной из основных.

Было проведено исследование содержания сложноэфирных групп в меланинах МО, МРА и МНА. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Выявлено, что меланины МРА содержат значительное количество сложноэфирных групп. Высокая скорость гидролиза эфирных групп МРА косвенно свидетельствует о том, что при гидролизе образуются ОН-группы, связанные непосредственно с углеродом макроцепи. В меланине МНА сложноэфирные группы практически отсутствуют.

Таблица 1 - Содержание сложноэфирных групп в меланинах

меланин содержание сложноэфирных групп, ммоль/г

продолжительность гидролиза, ч

0,5 1 1,5 2 2,5

МО 0,56±0,06 1,33±0,05 1,41±0,05 1,51±0,03 1,56±0,05

МРА 2,35±0,05 2,85±0,05 2,98±0,04 3,06±0,04 3,12±0,04

МНА 0,15±0,05 0,17±0,05 0,20±0,06 0,22±0,04 0,22±0,04

С целью отделения полисахаридной фракции был проведен кислотный гидролиз меланинов МРА. Для оценки характера изменений, происходящих в меланине, по результатам ИК-Фурье спектроскопии определяли площади соответствующих пиков и относили к площади пика ароматических сопряженных систем при 1530-1640 см'1 (Таблица 2).

Таблица 2 - Относительные площади пиков полос поглощения в ИК-Фурье спектрах исходных меланинов МРА и после их гидролиза

Относительные площади пиков полос поглощения в ИК-

Фурье спектрах

меланины о О II о о сч го II о О ® и II у о о «л о II и еэ «о О р "о С? й1 § О О СТ\ •о I «VI о о о Оч «О о II о § о о о Оч V"! V у о о о

МРАИСХ 2,41 0,08 1,38 0,47 0,96 0,11

МРАТ 1,94 0,07 0,79 0,10 , 0,47 0,03

МРА2 1,90 0,07 0,64 0,10 0,44 0,03

Установлено, что при гидролизе ароматическая составляющая практически не изменяется (С=С15оо/С=С159о). А относительное содержание полисахаридов уменьшается значительно. При этом наиболее сильные изменения происходят в течение первого часа гидролиза. Отмечено уменьшение относительного содержания простых эфиров. Это позволяет предположить, что меланины связаны

с полисахаридами в МРА простой эфирной связью. Установлено, что 5-часовой гидролиз приводит к уменьшению массы МРА на 13,5%.

Исследования образцов меланинов методом ЭПР-спектроскопии подтвердили наличие парамагнитных свойств (Таблица 3). Обнаружен сигнал ЭПР семихинонного радикала с §-фактором 2,0028 и шириной линии около АН 5 Гс. Выявлено, что концентрация ПМЦ в полимерных пигментах МНА выше в 2 раза по сравнению с МРА.

Таблица 3 - Характеристика ЭПР-сигнала и концентрация ПМЦ меланинов чаги

Характеристика Полимер МО Полимер МРА Полимер МНА

g-фактор 2,0028 2,0028 2,0032

АНрр, Гс 4,7 4,8 4,5

Концентрация ПМЦ Х1017 1,74 1,94 4,2

Проведенные исследования меланинов МРА методом УФ-спектроскопии выявили незначительный пик при длине волны 275-276 нм, что свидетельствует о наличии в структуре лигниновых звеньев. Для меланина МНА УФ-спектр имеет вид нисходящей кривой (Рисунок 4).

длина волны, нм Рисунок 4 - УФ-спектры меланинов гриба Ьюпойю оЬИяшю (0,001%)

Химическими методами определено количественное содержание кислых функциональных групп (Таблица 4). Выявлено, что полимер МРА содержит значительное количество карбоксильных и фенольных групп, в то время как

полимер МНА характеризуется низким содержанием кислых функциональных групп.

Таблица 4 - Содержание кислых функциональных групп в меланинах чаги

Функциональные группы МО МО МРА МНА

Общая кислотность, ммоль/г 2,89±0,5 2,99±0,5 2,94±0,8 1,20±0,3

Карбоксильные, ммоль/г 1,44±0,5 1,53±0,5 1,28±0,3 0,77±0,3

Фенольные, ммоль/г 1,45 1,46 1,66 0,43

Потенциометрическое определение функциональных групп методом рК-спектроскопии выявило, что кислые группы образцов МРА и МО можно разделить на 5 групп, отличающихся по рКа (Таблица 5). В полимере МНА выявлены 2 кислые группы, с рКа в области 5,9-6,5 и 9,7-10,2.

Таблица 5 - Кислотный состав меланинов чаги

1 ! % о ■s § 1 5 g

S s 1 ¿г 1 S ê S Cl â а « CL •i о S CL s V» v .

МО 4,9 0,80 6,3 0,61 7,2 0,16 8,1 0,24 9,6 0,41

МО 5,1 1,46 6,4 0,59 - - 7,9 0,24 9,6 0,43

МРА 4,6 0,77 5,9 0,59 6,9 0,35 8,3 0,29 9,7 0,62

МНА - - 6,0 1,22 - - - - 10,3 0,55

Обобщение полученных результатов исследований позволило предположить, что полимер МРА образован гваяцильными и сирингильными звеньями, соединенными между собой сложноэфирными связями. При этом боковые ароматические звенья соединены с основной цепью также, главным образом, сложноэфирной связью. Лигниноподобный пигментый полимер связан с полисахаридами, предположительно, простыми эфирными связями. На рисунке 5 представлена гипотетическая схема строения лигниноподобного фрагмента МРА.

Данные, полученные при исследовании меланинов МНА, близки данным, описанным в литературе. Определение в МНА хиноновых и пирокатехиновых

групп, а также высокое содержание карбогидратных фрагментов позволили предположить присутствие в меланине структур близких меланоидинам и алломеланинам (Рисунок 5).

он

Рисунок 5 - Схемы строения фрагментов меланинов МРА и МНА а- лигниноподобный фрагмент МРА; б, в- предполагаемые структуры МНА, МНАпереосажд.

С целью характеристики полимерных свойств меланинов было проведено вискозиметрическое исследование образцов. Определено, что для всех образцов меланинов наблюдается линейная зависимость приведенной вязкости от концентрации, что подтверждает их полимерную природу. Криоскопическим методом определены молекулярные массы меланинов, которые в среднем

составили для МО - 5100, МРА - 8140, МНА - 9300. Полученные данные согласуются с нижним пределом молекулярных масс меланинов, приведенных в литературных источниках.

3.2 Разработка способов химической модификации полимеров МО, МРА и МНА гриба ЫопоШэ оЫ'щит

Наличие в структуре полимера МРА гваяцильных звеньев обусловливает направление его химической модификации. Реакционная способность гваяцильных фенилпропановых единиц определяется, прежде всего, наличием свободного 5-го положения ароматического ядра при неэтерифицированном фенольном гидроксиле, а также метоксильной группой, способной деметилироваться.

Для повышения антиоксидантной активности МРА необходимо повысить содержание свободных фенольных гидроксилов в нем. Установлено, что МРА содержит значительное количество метоксильных групп. Следовательно, при целенаправленном отщеплении метальных групп можно получить дополнительное количество свободных фенольных групп. Деметилирование может происходить при периодатном окислении гваяцильных фрагментов. Предполагают, что реакция идет через промежуточный эфир йодной кислоты и

Преимуществом данного окислительного реагента является избирательность и, что немаловажно, способность работать при комнатной температуре. Химическую модификацию полимерных пигментов осуществляли обработкой в слабокислой среде при температуре 25°С 0,14н йодной кислотой при интенсивном перемешивании, варьируя длительность обработки от 1 до 3 часов и долю окислителя. Оптимальное время процесса составило 2-2,5 часа. Восстановление окисленных образцов проводили сульфитом натрия (массовое

соотношение восстановитель-меланин 0,5:1) в щелочной среде при той же температуре в течение 1 часа при перемешивании.

Анализ данных элементного состава исходных и окисленных меланинов выявил, что с увеличением доли окислителя в реакционной смеси наблюдается тенденция к снижению содержания углерода и водорода и увеличению кислорода. Установлено, что увеличение доли йодной кислоты в реакционной смеси приводит к увеличению атомных отношений О/С. Исследование исходных и окисленных меланинов МО, МРА методом ИК-Фурье спектроскопии выявило, что для окисленных меланинов наблюдается уменьшение относительной площади пиков при 2830-2850 см'1, 1200-1290 см"1, 1000-1070 см"1. Это свидетельствует о снижении содержания метоксильных групп в полимерах. Увеличение относительной площади пиков при 1630-1775 см"1 свидетельствует об общем увеличении карбонильного углерода хиноновых и карбоксильных групп. Смещение полосы карбонильного углерода в длинноволновую область обусловлено увеличением доли хиноновых групп. Для восстановленных меланинов на спектрах наблюдается уменьшение доли карбонильного углерода, обусловленное восстановлением хиноновых групп до фенольных падроксильных, что подтверждается увеличением относительной площади пиков при длинах волн 1140-1307 см'1, а также при 3100-3600 см'1.

Определение карбоксильной, фенольной и общей кислотности исходных, окисленных и восстановленных меланинов установило, что содержание карбоксильных групп практически не изменяется, а фенольных падроксильных -увеличивается для восстановленных образцов. Выявленная закономерность обусловлена тем, что образующиеся при окислении хиноновые группы под воздействием сульфита натрия восстанавливаются до фенольных гидроксильных. Установлено, при введении в реакционную смесь йодной кислоты в доле 0,13-0,25 г/г меланинов окислительный процесс происходит без разрушения ароматического кольца.

После восстановления окисленных меланинов содержание гидроксильных фенольных групп в них увеличилось на 35-40% по сравнению с исходными меланинами.

Другим способом модификации структур, содержащих гваяцильные звенья, является окислительное гидроксилирование по Эльбсу:

Эта реакция позволяет получать двухатомные фенолы из одноатомных действием персульфата калия. Этот способ модификации лигнина отличается простотой и низкой энергоемкостью. Реакцию проводят в щелочной среде с насыщенным водным раствором персульфата калия. Процесс окисления МРА проводили при различных соотношениях окисляющего реагента. Оптимальное массовое соотношение составило 0,8:1 персульфата калия к полимеру МРА. Содержание гидроксильных фенольных групп в модифицированном препарате увеличилось на 20-25% по сравнению с исходным МРА.

Анализ данных элементного состава персульфатных меланинов выявил, что все образцы также характеризуются близкими значениями содержания элементов. При этом наблюдается тенденция к снижению содержания углерода и водорода и увеличению кислорода в модифицированных меланинах с увеличением окислителя в реакционной смеси. Установлено, что увеличение доли персульфата калия в реакционной смеси приводит к увеличению атомных отношений О/С. Исследования меланинов ИК-Фурье-спектросхопическим методом выявили, что для гидроксилированных меланинов наблюдается увеличение интенсивности полосы поглощения в области карбонильного углерода, и, кроме того, в области фенольной гидроксильной группы.

Определение карбоксильной, фенольной и общей кислотности исходных и модифицированных меланинов установило, что при гидроксилировании увеличивается содержание кислородных функциональных групп. Содержание

карбоксильных групп практически не изменяется, а фенольных с увеличением доли персульфата калия в реакционной смеси сначала возрастает, а затем снижается. Выявленная закономерность обусловлена тем, что при избытке окислителя образующиеся двухатомные фенолы подвергаются дальнейшему окислению с образованием хинонов или с разрушением ароматического кольца. При этом оптимальное количество окислителя при гидроксилировании по Эльбсу определяется, прежде всего, содержанием в структуре ароматических ядер свободных пара- и орто- положений, по которым протекает реакция, при неэтерифицированном фенольном гидроксиле.

На основании полученных результатов установлено, что введение в реакционную смесь персульфата калия в количестве 0,75-0,80 долей от массы меланинов МО обусловливает увеличение содержания фенольных гидроксильных групп на 30-35%. Это позволяет сделать вывод об эффективности модификации меланинов методом персульфатного окислительного гидрокислирования с целью увеличения содержания фенольных гидроксильных групп.

Так как в полимере МНА имеются хиноидные фрагменты, то усилить фенольную функцию возможно путем их восстановления до двухатомных фенолов:

Восстановление хинонов осуществляется в две стадии. На первой стадии в результате одноэлектронного восстановления образуются анион-радикалы, которые называют также семихинонами. На второй стадии анион-радикал присоединяет еще один электрон с образованием дианиона двухатомного фенола. Восстановление хинонов до двухатомных фенолов проводят с помощью самых разнообразных восстановителей. В экспериментах в качестве восстановителя использовали сульфит натрия. Реакцию проводили в щелочной среде при температуре 25°С и содержании сульфита натрия 25, 50, 75, 100, 125 % по массе

от меланина МНА. Определено, что при содержании сульфита натрия 50% по массе от массы меланина количество фенольных гидроксильных групп увеличивается в 4-5 раз.

Таким образом, в ходе экспериментов установлено, что предложенные методы модификации природных полимеров меланинов МО, МРА и МНА гриба чаги позволяют увеличить содержание фенольных групп.

Исходные и модифицированные полимеры МРА и МНА были исследованы на проявление антиокислительных свойств. Выявлено, что модифицированные препараты характеризуются высокой антиоксидантной активностью, значительно превосходящей такие антиоксиданты как пирокатехин, пирогаллол. Установлено, что концентрация меланинов 1С5оон', при которой происходит инактивация 50% радикальных частиц, для модифицированных меланинов уменьшается в 1,5-2,5 раза. Рассчитанные коэффициенты ингибирования реакции гидроксилирования анилина показали эффективность действия меланинов (Таблица 6).

Таблица б - Характеристика антиоксидантной активности меланинов

антиоксидант коэффициент предельное 1С,0Ш\

ингибирования тормозящее мг/мл

йсЮ"6, моль/мг* действие

МО™ 1,09 7,32 0,051

МРА70 1,04 7,88 0,050

МНА70 0,98 9,05 0,034

МО псрсульфаткый 1,38 9,98 0,040

МРА- персульфаткый 1,35 9,04 0,040

МО периодатный 1,22 9,14 0,036

МО периодатный(га/) 1,44 11,08 0,038

МРА периодатный 1,29 8,88 0,036

МРА периодатный(га/) 1,43 9,12 0,040

МНА70пЛ 1,48 10,88 0,042

Мщедоч, 1,00 9,98 0,034

пирокатехин 0,56 7,69 0,093

* количество радикалов, уловленных 1мг меланинов

Высокая антиоксидантная активность меланинов определяет возможность их использования в различных областях: в медицине, как антиоксиданты; в химической промышленности, как ингибиторы радикальных реакций; в пищевой, как консерванты, и др..

3.3 Разработка способов выделения природных полимеров меланинов

С целью повышения эффективности и интенсификации процесса выделения меланинов из сырья проведено исследование процесса экстрагирования пигментов в условиях наложения электрического поля. Математическая обработка результатов униформ-ротатабельного пятифакторного плана позволила получить уравнение регрессии, описывающее процесс экстрагирования меланинов из сырья в условиях наложения электрического поля в диапазоне параметров: XI - 1:10-29 массовые части, х2 - 10-70°С, х3 - 0,5-5,5мм, Х4 - 0,5-Зч, х5 - 0-10,67В/м:

У= 0,4116 - 0,0106x1 + 0,1489X2 - 0,0616х3 + 0,0222x4 + 0,0760х5 + 0,0438х2х5 - 0,0137х3х5 -0.0097Х12- 0,0402х21-0,0635х!2. (1)

Анализ уравнения регрессии и карты Парето установили: наибольшее влияние на выход меланинов оказывают температура процесса и напряженность электрического поля, что обусловлено лучшей растворимостью меланинов в горячей воде и значительным увеличением скорости их диффузии за счет электрофореза. Остальные факторы имеют меньшее значение, но статистически значимы. С учетом оптимальных значений X], х3, Х4, уравнение регрессии (1) преобразовано следующим образом:

У = 0,5192 + 0Д489х2 + 0,1034х5 + 0,0438X2X5- 0,0402х22 - 0,0635х,2. (2)

Математическая обработка этой зависимости показала ее адекватность эксперименту. Установлено, что максимальный выход меланинов достигается при температуре 70°С и напряженности электрического поля 9,60 В/см и составляет 81%. Это более, чем в 3 раза выше по сравнению с выходом меланинов при производстве «Бефунгина» на единицу готовой продукции.

Ввиду того, что полимер МРА является растворимым в органических растворителях, было проведено исследование по его экстрагированию из сырья

органическими растворителями. Установлено, что экстрагирование сырья раствором этилового спирта в присутствии кислотного катализатора увеличивает выход МРА в 2 -3 раза.

С целью выделения полимера МНР проводили щелочное экстрагирование. В качестве сырья использовали шрот гриба. Для осаждения использовали ацетон. Определено, что при экстрагировании 7% раствором гидроксида натрия при температуре 90°С и соотношении сырье-экстрагент 1:20, при перемешивании и продолжительности процесса не более 5 часов получают выход полимера МНА до 35-45 % в пересчете на сухое вещество.

Полученные меланины исследованы методами элементного анализа, ИК-спектроскопии, 13С ЯМР-спектроскопии, количественного определения функциональных групп. Установлено близость полученных продуктов и выделенных и меланинов МРА и МНА.

Выводы:

1. Впервые разработаны и научно обоснованы способы химической модификации полимеров меланинов методами окислительного гидроксилирования по Эльбсу, периодатного окислительного деметилирования и восстановления сульфитом натрия, позволяющие увеличить содержание фенольных групп на 30 - 40% и в 4-5 раз соответственно. Определено, увеличение содержания фенольных групп обусловливает повышение антиоксидантной активности полимеров.

2. Получены модифицированные меланины, характеризующиеся высокой антиоксидантной активностью.

3. Впервые доказано, что в составе меланинов присутствует химически связанный с полисахаридами лигниноподобный полимер, образованный структурными звеньями гваяцил-сирингильного типа, соединенными между собой сложноэфирной связью. Предложена схема строения фрагмента этого полимера.

4. Разработаны способы выделения лигниноподобного меланина, позволяющие увеличить его выход в 2 и 3 раза. Разработан способ выделения меланина из

шрота гриба Inonotus obliquus, позволяющий увеличить его выход в 6-8 раз. Разработан способ выделения меланина, основанный на его осаждении ацетоном из щелочных растворов, что позволяет получить водорастворимую форму.

Содержание диссертации отражено в следующих публикациях

1. Грачева, Н.В. Химическая модификация меланинов гриба Inonotus obliquus (чага) методом периодатного окисления/ Н.В. Грачева, В.Ф. Желтобрюхов, А.Б. Голованчиков// Естественные и технические науки. - 2014. - №2. - С. 4751.

2. Грачева, Н.В. Исследование возможности интенсификации экстракции чаги электрическим полем постоянного тока/ Н.В. Грачева, А.Б. Голованчиков// Химико-фармацевтический журнал. - 2010. - Т. 44, Jfe 11. - С. 22-24.

3. Голованчиков, А.Б. Моделирование процесса экстрагирования чаги в электрическом поле / А.Б. Голованчиков, Н.В. Грачева // Естественные и технические науки - 2011. -№ 5. - С. 381-387.

4. Грачева, Н.В. Химическая модификация природных полимеров меланинов гриба Inonotus obliquus (чага) / Н.В. Грачева, В.Ф. Желтобрюхов, А.Б. Голованчиков// Известия Волгоградского государственного технического университета (Сер. Химия и технология элементорганических мономеров и полимерных материалов): Межвуз. сб. науч. ст./ ВолгГТУ. - Волгоград, 2014. - Вып.12. - №7 (134). - С.93-97.

5. Голованчиков, А.Б. Основные закономерности процесса экстрагирования чаги в электрическом поле / А.Б. Голованчиков, Н.В. Грачева // Вестник Тамбовского государственного технического университета. - 2011. - Т. 17, № 4. - С. 950-958.

6. Пат. 2406515 РФ, МПК А 61 К 36/06, А 61 Р 35/00. Способ получения сухого экстракта чаги / Н.В. Грачева, А.Б. Голованчиков, H.H. Дикарева, М.В. Ефимов; ГОУ ВПО ВолгГТУ. - 2010.

7. Gracheva, N.V. Effect of electric field application during chaga extraction on chromogenes output /N.V. Gracheva, A.B. Golovanchikov //Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine. RR 2011 : [abstr. of Int. Conf.], S.-Petersburg, June 21-24, 2011/ S.-Petersburg State University [et al.]. - Saint-Petersburg, 2011.- C.62-63. - Англ.

8. Грачева, H.B. Влияние наложения электрического поля в процессе экстракции чаги на выход полифенолоксикарбонового комплекса / Н.В. Грачева, А.Б. Голованчиков// Проблемы теоретической и экспериментальной химии : тез. докл. XXI рос. молодёжной науч. конф., посвящ. 150-летию со дня рожд. акад. Н.Д. Зелинского (Екатеринбург, 19-23 апр. 2011) / УрО РАН, Уральский гос. ун-т им. А.М. Горького. - Екатеринбург, 2011. - С. 432-434.

9. Грачева, Н.В. Изучение антиоксидантной активности экстрактов чаги, полученных в электрическом поле постоянного тока / Н.В. Грачева // Химия и полная переработка биомассы леса : тез. докл. сателлитных конференций (Первый кластер конференций ChemWasteChem), Санкт-Петербург (пос. Репино), 14-18 июня 2010 г. / Санкт-Петербургская гос. лесотехн. академия [и др.]. - СПб., 2010. - С. 235-236.

10. Грачева, Н.В. Интенсификация процесса экстракции биологически активных веществ чаги в электрическом поле / Н.В. Грачева, А.Б. Голованчиков // Экстракция органических соединений. ЭОС-2010 : каталог докл. IV междунар. конф., Воронеж, 20-24 сент. 2010 г. / Воронежская гос. технол. академия [и др.]. - Воронеж, 2010. - С. 87.

П.Грачева, Н.В. Комплексная переработка чаги/ Н.В. Грачева, А.Б. Голованчиков// Химия и полная переработка биомассы леса : тез. докл. сателлитных конференций (Первый кластер конференций ChemWasteChem), Санкт-Петербург (пос. Репино), 14-18 июня 2010 г./ Санкт-Петербургская гос. лесотехн. академия [и др.].-СПб.,2010.-С.26.

12. Грачева, Н.В. Особенности формирования полифенолоксикарбонового комплекса при экстрагировании чаги в электрическом поле / Н.В. Грачева,

24 7 А/

А.Б. Голованчиков // XI междунар. конф. "Проблема сольватации и комплексообразования в растворах" и VI конф. мол. учёных "Теор. и экспер. химия жидкофаз. систем" (Крестовские чтения), 10-14 окт. 2011 : тез. докл. / Ивановский гос. химико-технол. ун-т [и др.]. - Иваново, 2011. - С. 222-223.

13. Грачева, Н.В. Получение экстракта чаги со сниженным содержанием зольных элементов / Н.В. Грачева, А.Б. Голованчиков // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Волгоград, 25-30 сент. 2011 г.). В 4 т. Т. 3 / РАН, РХО им. Д.И. Менделеева, Администрация Волгогр. обл. [и др.]. - Волгоград, 2011.-С. 59.

14. Грачева, Н.В. Влияние условий экстрагирования на свойства меланиноподобных соединений ЫопоШз оЪЩиш/ Н.В. Грачева, С.М. Кавеленовой// 16 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука 21 века» (Пущино, 2012г): тез. докл., / Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пущинский научный центр Российской академии наук. - Пущино, 2012. - С. 214.

Подписано в печать 23.04.2014 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Печ. л.1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 262.

Типография ИУНЛ Волгоградского государственного технического университета. 400005, г. Волгоград, просп. им. В.И. Ленина, 28, корп. №7.

 
Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата технических наук, Грачева, Наталья Владимировна, Волгоград

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный технический университет»

На правах рукописи

04201459996

Грачева Наталья Владимировна

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПРИРОДНЫХ ПОЛИМЕРОВ МЕЛАНИНОВ ГРИБА ШОИОТиБ овидиш (ЧАГА) С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель доктор технических наук, профессор

Голованчиков Александр Борисович

Волгоград - 2014

Список сокращений и условных обозначений

МО - меланины очищенные

МРА - меланины, растворимые в ацетоне

МНА - меланины, нерастворимые в ацетоне

ГК - гуминовые кислоты

ФК - фульвокислоты

ГМ - грибные меланины

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - диметилформамид

Оглавление

Введение.................................................................................... 5

ГЛАВА 1 Современное состояние и основные тенденции развития в области исследований меланинов гриба 1попо1и8 оЬНцш^................. 10

1.1 Характеристика меланинов гриба ¡попоШб оЬ^иш и их

антиоксидантные свойства.............................................................. 10

1.2 Модификация меланинов гриба 1попоШб оЬ^иш и близких им по химической природе природных полимерных соединений..................... 20

1.3 Выделение меланинов гриба 1попо1ш оЬПциш из сырья.................... 27

ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования..................................... 34

2.1 Объекты исследования.............................................................. 34

2.2 Методы исследования............................................................... 35

2.ЗТехника эксперимента............................................................... 38

ГЛАВА 3 Экспериментальна часть................................................ 43

3.1 Структурно-химическая характеристика меланинов гриба 1попоШ8 оЪЩит (чага)........................................................................... 43

3.2 Химическая модификация меланинов гриба 1попоЫ8 оЬЩит (чага)... 58

3.2.1 Модификация меланинов методом окислительного

гидроксилирования по Эльбсу......................................................................... 58

3.2.2 Модификация меланинов методом периодатного окисления............ 62

3.2.3 Модификация меланинов методом восстановления сульфитом

натрия в щелочной среде................................................................ 68

3.3 Разработка способов выделения меланинов гриба ЫопоШб оЬНдиш

(чага) из сырья............................................................................. 70

3.3.1 Разработка способа выделения меланинов из чаги экстракцией в электрическом поле...................................................................... 70

3.3.2 Разработка способа выделения меланинов из чаги с использованием

в качестве экстрагента этилового спирта.......................................... 78

3.3.3 Разработка способа выделения меланинов из чаги методом

щелочного гидролиза..................................................................... 85

3.4 Антиоксидантная активность меланинов грибаЫопоШб оЫ'щит (чага)

и их модифицированных продуктов.................................................. 92

Выводы.................................................................................... 103

Список литературы..................................................................... 104

Приложение 1 Основные формулы и расчет элементного состава

образцов меланинов...................................................................... 123

13

Приложение 2 Отнесения сигналов в спектрах С ЯМР........................ 124

Приложение 3 Матрица планирования униформ-ротатабельного пятифакторного плана исследования экстрагирования меланинов

в условиях наложения электрического поля........................................ 125

Приложение 4 Обработка результатов униформ-ротатабельного пятифакторного плана исследования экстрагирования меланинов в условиях наложения электрического поля........................................ 127

Введение

В настоящее время в области химии высокомолекулярных соединений наблюдается всплеск интереса к биополимерам с целью разработки на их основе материалов с различными функциями [1-3]. Особое место среди природных полимеров занимают меланины - представители класса мало изученных конденсированных полифенолов [4-6]. Наличие высокостабильных парамагнитных центров, разнообразие функциональных групп, а также система сопряженных связей в молекулах определяют их полифункциональность [7-11].

Уникальным свойством меланинов является устойчивое свободно-радикальное состояние. В зависимости от условий мономеры меланиновых пигментов способны находиться в виде феноксильных или семихинонных радикалов [12, 13]. Вступая в окислительные реакции, эти природные полимеры действуют не только в восстановленной гидрохинонной форме фенолов, но и как система полифенол-хинон, в которой в качестве обязательного промежуточного продукта присутствует радикал-семихинон. Компоненты этой системы определяют проявление меланинами антиоксидантных свойств [6, 9, 14]. Экономическая доступность природных полимерных пигментов обусловливает возможность получения на их основе высокоактивных антиоксидантов, которые могут найти применение, как в медицине, так и в различных отраслях промышленности. Фенольная природа меланинов и присутствие реакционноспособных функциональных групп обеспечивают возможность разнообразных химических модификаций, позволяющих усиливать присущие им свойства.

Одним из перспективных сырьевых ресурсов природных полимеров меланинов является гриб трутовик скошенный 1попоШ оЬЩит (чага) [6, 8, 9, 14]. Известно, что меланиновые полимеры чаги представлены несколькими фракциями, различающимися по химическому составу, степени ароматизации,

молекулярно-массовому распределению и содержанию функциональных групп [6,14,15]. Однако вопрос их структурно-химической организации остается открытым, что не позволяет регулировать их свойства в необходимом направлении. В связи с этим актуальным и необходимым является исследование ♦ структурно-химической организации природных полимеров меланинов гриба 1попоШз оЬЩит (чага) и разработка способов повышения их антиоксидантной активности. Особенно перспективным представляется их направленная химическая модификация с целью введения или усиления требуемой функции.

Цель работы заключается в получении высокоактивных антиоксидантов путем химической модификации природных полимеров меланинов гриба ЫопоШб оЪИдит.

Для реализации цели были поставлены и решены следующие задачи:

- исследовать структурно-химическую организацию природных полимеров меланинов гриба 1попоШ оЬИдиш;

- разработать способы химической модификации меланинов гриба ЫопоШб оЪИцит исходя из особенностей их структурно-химической организации;

- провести модификацию природных полимеров меланинов различными химическими способами;

- исследовать антиоксидантную активность исходных и модифицированных пигментных полимеров;

- разработать способы выделения меланинов из сырья.

Научная новизна. Впервые разработаны и научно обоснованы способы химической модификации меланиновых полимеров чаги методами окислительного гидроксилирования по Эльбсу, периодатного окислительного деметилирования и восстановления сульфитом натрия, позволяющие увеличить содержание фенольных групп на 30-40% и в 4-5 раз соответственно. Определено,

что увеличение содержания фенольных групп обусловливает повышение антиоксидантной активности полимеров.

Впервые доказано, что в составе меланинов присутствует химически связанный с полисахаридами лигниноподобный полимер, образованный структурными звеньями гваяцил-сирингильного типа, соединенными между собой сложноэфирными связями. Предложена схема строения фрагмента этого полимера. Разработаны способы выделения лигниноподобного меланина, позволяющие увеличить его выход в 2 и 3 раза.

Разработан способ получения меланина из шрота гриба I. оЪИцит методом щелочного гидролиза, позволяющий увеличить выход в 6-8 раз.

Практическая значимость. Разработаны сравнительно простые одностадийные процессы получения производных природных полимеров меланинов гриба чаги. Получены модифицированные меланины, характеризующиеся высокой антиоксидантной активностью. Разработаны способы выделения природных полимеров меланинов из сырья, позволяющие повысить выход при низких энергетических затратах и использовать в качестве сырья отходы переработки гриба чаги. Разработан способ выделения меланина, основанный на его осаждении ацетоном из щелочных растворов, что позволяет получить водорастворимую фракцию.

Основные положения, выносимые на защиту.

- теоретическое и экспериментальное обоснование возможности химической модификации природных полимеров меланинов гриба I. оЬИдит чаги, обусловленные особенностями их структурно-химической организации;

- теоретическое и экспериментальное обоснование эффективности химической модификации природных полимеров меланинов гриба I. оЬИдиш чаги с целью получения на их основе высокоактивных антиоксидантов;

- результаты химической модификации меланинов чаги методами

окислительного гидроксилирования по Эльбсу, периодатного окислительного деметилирования и восстановления сульфитом натрия, которые могут быть использованы для разработки способов регулирования антиоксидантных свойств полимеров;

- способы выделения природных полимеров меланинов из сырья, позволяющие повысить выход при низких энергетических затратах, использовать в качестве сырья отходы переработки гриба чаги, получать водорастворимую фракцию меланинов.

Основные полученные с 2008 по 2013 год результаты исследований докладывались и обсуждались на 7 международных и 2 российских конференциях.

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 5 статей - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России; получен 1 патент РФ на изобретение.

Диссертация изложена на 128 страницах, содержит 27 рисунков и 29 таблиц. Работа включает введение, 3 главы, выводы, библиографический список, содержащий 133 наименования, и 4 приложения.

Достоверность результатов. Достоверность результатов основывается на

использовании современных методов исследований таких как: элементный

1 ^

анализ, ИК-Фурье спектроскопия, С ЯМР-спектроскопия, ЭПР- спектроскопия, УФ-спектроскопия, рК-спектроскопия, вискозиметрия, криоскопия и др., проведенных в различных сертифицированных лабораториях и на поверенных приборах, и обработке полученных результатов методами математической статистики.

Личный вклад. Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований. Основные результаты работы

получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.

Благодарности. Автор выражает благодарность д.х.н., профессору Лебедеву А.Т. (МГУ им. М.В. Ломоносова) и Таказовой Р.У. (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) за проведение элементного анализа; д.х.н., профессору Перегудову A.C. (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) и к.х.н. Курковской Л.Н. (ИБХФ РАН) за содействие в проведении исследований методом ЯМР-спектроскопии; д.х.н., профессору Солодовникову С.П. (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) за помощь в проведении исследований методом ЭПР-спектроскопии; д.х.н., профессору

Рязанову М.А.| (Институт химии Коми НЦ УрО РАН) за помощь в обработке результатов рК-спектроскопических исследований. Глубокую признательность автор выражает д.т.н., профессору Желтобрюхову В.Ф. (ВолгГТУ), д.т.н., профессору Каблову В.Ф. (ВолгГТУ) и к.х.н., доценту Хохловой Т.В. (ВолгГТУ) за участие в постановке цели и обсуждении результатов.

Исследования проводились при поддержке Минобрнауки РФ в рамках базовой части госзадания НИР №20-53/676-14.

Глава 1 Современное состояние и основные тенденции развития в области исследований меланинов гриба 1попо1:1№ оЬ^ииэ 1.1 Характеристика меланинов гриба 1попо1и8 оЬНцииз

Основным действующим веществом, по содержанию которого согласно Государственной Фармакопее (ГФ) [16] проводят стандартизацию сырья и препаратов на основе чаги, являются хромогенные вещества, содержание которых в сырье составляет около 50% от экстрагируемых веществ. В последнее время эти вещества относят к группе меланинов.

Меланины - высокомолекулярные пигменты, синтезируемые растениями, грибами, бактериями, и представляющие собой полимеры фенольной и (или) индольной природы [4]. Исследование вопросов происхождения и образования хромогенных веществ чаги (Шиврина и др., 1959) выявило, что меланины являются, результатом ферментативной окислительной полимеризации продуктов деструкции лигнина, разрушенного полифенолоксидазной системой гриба [17]. Наличие разнообразных мономерных и олигомерных предшественников, нескольких типов межмономерных связей обусловливают нестехиометричный состав, нерегулярное строение и полидисперность меланинов [6, 14, 17].

Среди меланинов чаги выделены и идентифицированы алломеланины (ВаЬкБкауа е1 а1., 2000), относимые к пирокатехиновому типу [18]. Кроме того, высказано предположение, что меланины могут также являться производными гиспидина [6].

Установлено, что меланины чаги представлены несколькими фракциями, различающимися по химическому составу, степени ароматизации, молекулярно-массовому распределению и содержанию функциональных групп (Олейников, 2012; Сухих и др., 2009) [6, 19].

Обобщение данных элементного состава меланиновых пигментов чаги, представленных в литературных источниках, выявило, что пигменты можно условно разделить на 2 группы: с высоким и низким содержанием углерода (таблица!).

Таблица 1 - Элементный состав и мольные отношения атомов меланинов 1попоШ оЬНдит

Соединение содержание элементов, масс.% мольные отношения*

С Н N О и/с О/С

Меланины I. оЪИдит [20] 53,28 4,45 0,40 41,87 1,00 0,59

Меланиновый комплекс [21] 57,88 4,22 0,32 37,58 0,87 0,49

Меланин/. оЬИдит [14] 42,00 5,00 0,70 51,80 1,42 0,93

Меланины I. оЬИдит [6] - - - 1,18*" 0,44***

Меланины I. оЪНдит [6] - - - - 0,98*** *** 0,48

Меланины I. оЪИдит [6] - - - - *** 1,05 0,52***

Меланины I. оЪИдит [6] - - - - _ л *** 1,10 0,52***

Меланины I. оЬИдиш [6] - - - - . „ *** 1,48 *** 0,65

Меланины I. оЬИдиш [6] - - - - *** 0,98 0,55***

Меланин I. оЪИдит [6] - - - - 1,18*** 0,40***

Меланин I. оЪИдит [6] - - - - 1,35*** 0,95***

Меланин I. оЪИдииэ [6] - - - - 1,65*** 0,98***

Меланин I. оЪИдииэ [6] - - - - 1,67*** 1,25***

- Отношение числа молей 2-х сравниваемых элементов. Число молей элемента определяют как частное деления процентного содержания данного элемента (% масс.) на его атомную массу.

-нет данных

-определено по диаграмме Ван-Кревелена

Первую группу относят к гуминоподобным соединениям (Шиврина, 1965; Магигк^ешюг, 2006; Королева и др., 2007), вторую - к грибным меланинам

близким Aspergillus niger (Королева и др., 2007), Uloclodium botrydis (Мирчинк, 1988), Ganoderma lucidum (Fr.) Kast и Aspergillus carbonarius (Bainer) Thorn. (Огарков и др., 2005) и ранним сведениям о меланинах Inonotus obliquus (Babitskaya et all, 2000; Кукулянская и др., 2002) [6,14, 18- 24].

Сравнение величин мольных отношений НУС и О/С выявило, что гуминоподобные меланины характеризуются большей ароматичностью, а грибные - меньшей ароматичностью и высокой окисленностью. Это предполагает присутствие в структуре значительного количества кислородсодержащих функциональных групп [6].

Анализ данных содержания функциональных групп в меланинах чаги, представленных в литературных источниках, показал малую изученность данного вопроса. В меланинах обнаружены следующие функциональные группы: карбоксильные [14, 17, 20, 22], фенольные [6], хиноновые [13, 14, 22, 26], метоксильные [17, 20-21, 27], сложноэфирные [15, 27]. При этом количественно определены только карбоксильные и метоксильные группы [17, 20].

Наличие хиноновых групп определено методом электронного парамагнитного резонанса в работах [13, 14, 18, 22]. Выявлено присутствие сигнала ЭПР с g=2,00, равному g-фактору свободного электрона, слегка ассиметричной формы, что соответствует феноксильному и семихинноному радикалу. Выдвинуто предположение, что в меланинах чаги устанавливается энергетически выгодное равновесие: фенол - семихинон - хинон [13]:

Концентрация парамагнитных центров (ПМЦ) в меланинах составляет

Наличие сложноэфирных групп определено при исследовании карбонильной фракции гидролизатов хромогенов-меланинов [27]. Показано

не

3,5-1017-6,8-1018 спин/г [13,14,18,20-21].

(Ловягина и др., 1960), что в ароматическом ядре пропилфенольные соединения этерифицированы с сиреневыми и гваяцильными структурами.

Наличие кислых функциональных групп определено методами ИК- и 13С ЯМР-спектроскопии [6, 14, 17, 20, 22, 27]. Анализ данных содержания карбоксильных групп в меланинах показал значительный разброс значений: от 0,9% (Сушинская, 2004) до 6,5% (Шиврина и др., 1959; Ловягина и др., 1960), что обусловлено, прежде всего, различными способами выделения и очистки меланинов, и, как следствие, различной структурой.

Количественное определение кислых функциональных групп в меланинах грибов, отличающихся содержанием углерода, выявило высокое содержание карбоксильных и гидроксильных фенольных групп для гуминоподобных меланинов, в то время как для меланинов с низким содержанием углерода содержание этих функциональных групп в 2-3 раза ниже [23].

Наличие метоксильных групп определено в работах [17, 20-21, 27]. Выявлено, что по содержанию метоксильных групп гуминоподобные меланиновые полимеры