Химический синтез природных и модифицированных РНК фосфотриэфирным методом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Аралов, Андрей Владимирович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2011
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ПАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА
46061
на правах мукописи
Аралов Андрей Владимирович
ХИМИЧЕСКИМ СИНТЕЗ ПРИРОДНЫХ и
МОДИФИЦИРОВАННЫХ РНК ФОСФОТРИЭФИРНЫМ
МЕТОДОМ
Специальность: 02.00.10 - Биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва-2011
1 2 МАЙ 2011
Работа выполнена в Учреждении РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.
Научные руководители:
доктор химических наук, профессор
Ефимов Владимир Алексеевич
доктор химических наук
Чахмахчева Оксана Григорьевна
Официальные оппоненты: Михайлов Сергей Николаевич
доктор химических наук, руководитель лаборатории стереохимии ферментативных реакций Учреждения РАН Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта.
Каюшин Алексей Львович
кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии Учреждения РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.
Ведущая организация:
Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова.
Защита состоится «18» мая 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН. Автореферат разослан « /5» ОпрвАЯ 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета
доктор физико-математических наук _______В.А. Олейников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. За последние 40 лет синтетические фрагменты нуклеиновых кислот зарекомендовали себя как универсальные инструменты для исследований в области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Они широко применяются для диагностики генетических заболеваний и рака, для детекции патогенных вирусов и микроорганизмов, в функциональной ге-номике и нанотехнологии, а также для лечения некоторых заболеваний с помощью антисенс-терапии, что связано с их способностью образовывать комплексы с комплементарными фрагментами нуклеиновых кислот и регуляторными белками. Так, все большее внимание исследователей привлекают такие синтетические фрагменты РНК, как рибозимы, малые интерферирующие РНК ^¡¡ША) и микро-РНК (пнЯКА). Однако использование в живых организмах природных олигонук-леотидов ограничено в основном из-за их нестабильности в биологических системах и жидкостях. Перспективным путем развития этого направления является использование для тех же целей аналогов нуклеиновых кислот, обладающих повышенной биологической стабильностью и улучшенным проникновением в живые клетки. Одним из способов решения этой задачи является введение в РНК химических модификаций по сахаро-фосфатному остову.
В связи с постоянно возрастающей потребностью во фрагментах РНК и их аналогах с заранее заданными свойствами, в последнее время много внимания уделяется разработке новых методов их химического синтеза. Как и в случае синтеза ДНК, в автоматическом химическом синтезе РНК для наращивания цепи олигонуклеотидов используются защищенные нуклеотидные мономеры. Однако по сравнению с ДНК, получение РНК-мономеров осложняется наличием дополнительной 2'-гидроксильной группы. Основная причина, тормозящая развитие химического синтеза фрагментов РНК, заключается в сложности подбора ортогональных защитных групп для 5'- и 2'-гидроксилов. Для решения проблемы синтеза РНК используются два подхода, один из которых заключается в разработке методов, аналогичных современным подходам к синтезу ДНК, а второй - в разработке специальных подходов к синтезу РНК. В обоих случаях возникает проблема подбора защитных групп, которые были бы совместимы с условиями синтеза, и которые можно было бы легко и количественно удалять в условиях, не приводящих к деградации целевого продукта. Кроме того, данная проблема включает не только подбор 5'- и 2'-ОН защитных групп, но также защитных групп гетероциклических оснований и фосфатного остатка.
В последнее время значительный прогресс был достигнут в синтезе РНК амидофосфитным методом, что привело к заметному увеличению эффективности синтеза и улучшению качества целевых продуктов. Однако в силу своих химических особенностей он не может быть использован для синтеза ряда модифицированных олигонуклеотидов, в частности производных, содержащих сильные
электрофильные группировки, такие как азидная и N-оксидная группировки, в составе цепи, а также стереоспецифических фосфоротиоатных аналогов нуклеиновых кислот. Решение этих проблем возможно при использовании фосфотриэфирного метода, который является хорошо разработанным, альтернативным подходом к синтезу олигонуклеотидов.
Цель работы. Диссертация посвящена подбору защитных и модифицирующих групп для 2'-ОН функции рибонуклеотидов, удовлетворяющих требованиям фосфотриэфирного метода и обеспечивающих высокую эффективность автоматического синтеза РНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы впервые был синтезирован ряд рибонуклеотидных мономеров, содержащих различные 2'-0-защитиые группы, количественно удаляемые в близких к нейтральным условиях, и продемонстрирована высокая эффективность синтеза природных олигорибонуклеотидов с их использованием. Кроме того, синтезирован ряд мономеров, содержащих 2'-0-модифицирующие группы, в том числе 2'-0-азидометильную (AZM) группу и 2'-0-метоксиметильную (МОМ) группу. Исследования по ферментативному расщеплению 2'-0-модифицированных олигорибонуклеотидов, а также исследования термической стабильности дуплексов, образованных этими аналогами олигорибонуклеотидов с комплементарными НК, позволяют сделать вывод о возможности их применения для различных молекулярно-биологических исследований.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (158 ссылок). Работа изложена на 117 страницах, содержит 10 рисунков, 64 схемы и 4 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Синтез мономеров, содержащих 2'-0-аз11дометильную или 2'-0-(2-азндометил)-бепзоильиую группу.
Одним из главных требований, предъявляемым к 2-О-защитным группам, является стабильность
олигорибонуклеотидов на финальной стадии их деблокирования. Установлено, что для удаления
2'-0-защитных групп наиболее подходят близкие к нейтральным условия, и примерами групп,
удаляемых в данных условиях, являются азидометильная (AZM) и (2-азидометил)бензоильная
2
(А2МВ) группы. Однако эти группы не нашли применения в амидофосфитном методе синтеза, что связано с низкими выходами на стадии межнуклеотидной конденсации, вероятно из-за образования иминофосфорана по реакции Штаудингера.
О-Азидометильная группа относится к классу защитных групп, удаляющихся в два этапа действием три-замещенного фосфина в водно-органической среде. При взаимодействии азидной группы (как в соединении 1) с три-замещенным фосфином на первом этапе образуется иминофосфоран 2, который впоследствии гидролизуется, давая формамидный гемиацеталь 3. Разложение неустойчивого гемиацеталя 3 приводит к высвобождению гидроксилыюй группы 4 (Схема 1).
яосн^з
Я = РИ, сн.
о-ю О
_______ I
-N3
!ЮСН,М=Р—я1
6
Н20
-РО(РЬ)2К'
аосн2ыи.
яон
-сноын,
3 4
Схема 1
Поскольку в фосфотриэфирном методе синтеза фосфор со степенью окисления (V) не вступает в реакцию с азидной группой, это позволило нам получить 2'-0-А2М-защищенные мономеры 24 и проверить их пригодность в фосфотриэфирном методе синтеза природных фрагментов РНК. Для этого нами была использована предложенная ранее Завгородним и др. схема синтеза 2'-0-А2.М-нуклеозидов 8 (Схема 2).
ОМБО
\гО он
Ас20, АсОН
А
-г ^
_>6 -г
502С12 или Вг, С2Н«С1,
V-*
А -г3;
\..о о.
А
' > -Г ь-
В - ига. СуЧ , Айе , Оиа|В
X = С1 или Вг
Схема 2
Данная схема включала получение 3',5'-О-защищенных нуклеозидов 5, обработку их смесью ОМБО, уксусного ангидрида и уксусной кислоты для получения 2'-0-метилтиометильных (МТМ) производных 6 и последующее их превращение в 2 '-0-А7М-защшценные соединения 8. Обработка 2'-0-МТМ производных 6 сульфурилхлоридом (или ВГ2) должна была бы приводить к образо-
3
ванию высоко реакционноспособного а-хлорэфира 7 (или а-бромэфира в случае Вгг), прибавление к которому раствора азида лития в ЛуУ-диметилформамиде (ЭМР) должно было давать 2'-0-К2М производные 8. Следуя данной методике и используя для активации МТМ группы Вгг, нами было получено, после удаления 3',5'-0-силильной защитной группы, соответствующее Т-0-К7М. ури-диновое производное 14, которое, однако, содержало практически равное количество побочного продукта, представляющего собой по данным 'Н-ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии побочный продукт 15 (Схема 3).
-А сАм
\..о о
Вг,
С2Н4С12
\
да
-г )-
хУ
да
нм
о" ^м
о
-Л сАм^ -А .......
-ГУ- ^ -Г
NN
(Ам
♦ -да
-г г-
-Вг 11
V6
12
1}
Схема 3
Действительно, ранее было показано, что обработка уридинового производного 9 избытком суль-фурилхлорида приводит к хлорированию 5 положения урацильного кольца. Однако при 0°С и использовании минимальных избытков сульфурилхлорида авторам удалось подавить данную побочную реакцию.
Для решения данной проблемы мы использовали более мягкий реагент, 2-нитробенгОлсульфенилхлорид (КВ5С1), который позволил получить чистые 2'-0-А2М нуклеози-ды 18 с практически количественными выходами (Схема 4). Нами было установлено, что в отсутствии основания КВБО избирательно взаимодействует с МТМ группой, не затрагивая гидро-ксильных групп рибозного кольца. Это позволило нам осуществлять введение AZM группы на уровне 3 ',5 '-О-деблокированных производных 16, что имеет ряд преимуществ по сравнению с используемым ранее методом. Главным преимуществом данного способа является отсутствие в молекуле нуклеозида объемной липофильной силильной защитной группы, что приводит к появлению разницы в хроматографической подвижности продуктов 18 и исходных соединений 16 на си-
ликагеле и, как результат, облегчает контроль протекания реакции с помощью ТСХ, а также выделение полученных продуктов 1& В случае 2'-0-МТМ-защищенных пуриновых производных 16 (В = Ас1еВ2,Оиа'Ви) добавление ЫВЭС! осуществляли в присутствии трифторметансульфоновой кислоты (ТГОН) для того, чтобы предотвратить внутримолекулярную побочную реакцию взаимодействия 2'-0-хлорметилыюй группировки промежуточных соединений 17 с нуклеоф ильным N-3 атомом пуриновых оснований, которая приводит к образованию циклонуклеозида. Обработка соединений 18 4,4'-диметокситритилхлоридом (ОМТгС1) в пиридине давала 5'-0-защищенные производные 19.
Л
41-0-1 О в Н0_1 ?
г5; У ^ твд^
°ч I-г тир Г—I
\-0 О
-А- 6
В = ига, С)1В!, А(1сВг. Сиа'в"
ОН О С>Н<С1>
\_ В-А11ев",0иа|в| 16 \ +СР,503Н
омг ОН о
ОМТЮ-1 п в
Тф
он о
-М3
Схема 4
Введение остатка фосфорной кислоты, содержащей каталитическую 4-метокси-1-оксидо-2-пиколильную Р-защитную группу, осуществляли двумя способами. Первый вариант включал фосфорилирование 3'-гидроксильной функции 5 '-О-ОМТг защищенных производных 19 бис( 1,2,4-триазолил)(2-хлорфенил)фосфатом 20, полученньш из (2-хлорфенил)дихлорфосфата по ранее предложенной методике. Последующая обработка водным раствором бикарбоната триэтиламмо-ния (ТЕАВ) давала соответствующие нуклеозидные фосфодиэфиры 21, которые превращали в полностью защищенные нуклеозидные фосфотриэфиры 22 действием 1-оксидо-4-метокси-2-пиридинметапола в присутствии 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорида (ТР5С1) и 1-метилимидазола (Ме1ш). В качестве второго варианта нами была разработана упрощенная методика, включавшая превращение 2',5'-0-защищенных нуклеозидов 19 в фосфотриэфир 22 действием предварительно полученным фосфодиэфиром 23 в присутствии конденсирующего реагента. Последующее избирательное удаление 2-хлорфенильной Р-защитной группы из соединений 22 действием 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-еном (ОВЦ) в водном ацетонитриле приводило к образованию целевых мономеров типа 24 (Схема 5).
о
Схема 5
В свою очередь фосфодиэфир 23 получали обработкой 1-оксидо-4-метокси-2-пиридинметанола бкс(2-хлорфенил)хлорфосфатом 25 в присутствии триэтиламина (TEA), с последующим избирательным удалением из фосфотриэфира 26 одной 2-хлорфенильной группы обработкой TEA в смеси ацетонитрил - вода (Схема 6).
ОСН3
Р Hojf),TEA —Я
/=\ ^N / \ л ОСН, ОСН,
£ >s TEA ° Л
ПГ° f X ' H20/CH3CN ¿9 ?
WAci 25 W^CI О 26 О 23
Схема 6
Второй опробованной нами для защиты 2'-ОН функции нуклеотидов группой была 2-(азидометил)бензоильная (AZMB) группа. Удаление данной группы также протекает в две стадии и включает восстановление азидной группы до аминогруппы при действии три-замещенным фос-фином в водно-органической среде с последующей внутримолекулярной атакой образовавшейся аминогруппы сложноэфирной функции, что сопровождается высвобождением ОН функции и образованием бензолактама 29 (Схема 7).
Используя подход, аналогичный описанному ранее для введения AZMB группы по 5'- и З'-ОН функциям дезоксирибонуклеозидов, мы синтезировали 2'-0-AZMB уридиновый мономер 35 (Схема 8).
PR,
-N2, OPR3
PR3 = PBuj, PPh,,CH3PPh2
y— OR
m
-ROH
NH2 28
Схема 7
NH
Для этого 3',5'-0-защищенное уридиновое производное S обрабатывали 2-(азидометил)бензоилхлоридом (AZMB-C1), полученным из соответствующей 2-(азидометил)бензойной кислоты кипячением с тионилхлоридом в толуоле, в присутствии Mclm. Дальнейшее десилилироваиие 5'- и З'-ОН функций соединения 30 обработкой 1М тетрабутилам-монийфторидом (TBAF) в тетрагидрофуране (THF) и диметокситритилирование полученного в результате 2'-0-[2-(азидометил)бензоил]уридина31 давали 5'-O-DMTr производное 32.
\ ÇXn3 \
\i-0-i о Ura 0=Ч «ti-0-i о Ura НОп „о^ Yra
-rV 5 -rV o4J,„ M-/,
Py
OCH3
/ J
N3
N.
H C0_p_0 f j .TPSCI ---
3 I „ N DMTrO-i n^ Yra " l J DMTrO-1 Ura
DMTrO-1 ___O-^ Vra 00 A 33 V ^ H
ОН О ,=4
оф
32 N3
О
э-С^о
2) 1M ТПАВ e О О
НзСО-.рЦ O-.P^o oHJ
n3 X
H3CO-f "n-0 34 H3CO-f Wo 35
Схема 8
Следующим этапом было фосфорилирование соединения 32 действием фосфодиэфира 33 в присутствии конденсирующего реагента. Избирательное удаление метальной Р-защитной группы из фосфотриэфира 34 обработкой пиперидином давало мономер 35. Предварительно, нами была проверена устойчивость А2МВ группы к действию пиперидина на уровне производного 31 и было установлено, что данная группа полностью стабильна в этих условиях в течение более 24 часов, что превышает время обработки пиперидином, требуемое для избирательного удаления из соединения 34 метильной Р-защитной группы. Кроме того, обработка полностью защищенного уриди-нового производного 30 ТВАИ не сопровождалась миграцией AZMB группы, что имеет место в случае других защитных групп ацильного типа.
Фосфодиэфир 33 получали в две стадии обработкой 1-оксидо-4-метокси-2-пиридинметанола ди-метилхлорфосфатом 36 в присутствии TEA, с последующим удалением одной метальной защитной группы обработкой пиперидином (Схема 9).
ОСН3
О ООН;
36
t
о 37
t 2) TEA О© (
О 37 О 33
Схема 9
2. Синтез мономеров, содержащих 1'-0-К1ХЛ и Д-А2МВ группы.
Как один из вариантов, мы изучили эффективность автоматического твердофазного синтеза РНК фосфотриэфирным методом с применением А2МВ группы для защиты экзоциклических амино-функций гетероциклических оснований нуклеотидов. ЛГ-А2МВ группа была использована нами для синтеза мономеров типа 41 и 47 дезоксирибо- и рибо-ряда, соответственно. Данную группу вводили по аминофункциям гетероциклических оснований дезокирибо- и рибо-нуклеозидов 38 действием А2МВ-С1 с предварительным триметилсилилированием гидроксильных функций ри-бозного или дезоксирибозного кольца, в результате чего были получены ^-защищенные производные типа 39 (Схема 10).
Дальнейшее диметокситритилирование 5'-ОН функции, фосфорилирование полученных 5'-0-БМТг производных 40 и обработка их ПВи в водно-органической среде давали мономеры типа 41 (Схема 11). Тимидиновый мономер получали по методике, описанной ранее.
В случае рибонуклеотидов для защиты 2'-ОН функций использовали АЕМ-группу (Схема 12). Нуклеозиды, защищенные во всех случаях, кроме уридинового производного, А'-А7МВ группой,
Схема 10
избирательно блокировали по 3'- и 5'-ОН функциям действием 1,3-дихлоро-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксаном (ПРИБСу, а затем соединения 42 обрабатывали смесью БМБО, уксусного ангидрида и уксусной кислоты, получая полностью защищенные производные 43.
н,со ©
V4! °
Ч I «1ч^О-Р=О.ТР5С1
О _л\ йМТгО—1 о 8
Н01с!^в__», НзС0
3, он 40 3) 1М ТЕАВ 4|
в, Су,«ми лас.«мв,0иа«мв ♦ о0
Схема 11
После 3',5'-0-десилилирования 2'-0-А2М группу вводили обработкой 2'-0-МТМ-защищенных соединений 44 ИВЗО с последующим добавлением Ш раствора азида лития в ЭМР.
^А) ^мзо^^гОт^оВ ТВАГ ь Р^Ъ^ __
°ч I-1. Ас2О.АсОН О > { Т11Р V—/ +СР,50,Н V—;(
' 1 Т АС-»и, Асин \ I 1 " 1 I +СгоичН 1 1
\..0 ОН - \гО О он О в = ОН О
"Г Г~ 42 ^ \ „ 44 \ 0ш"МВ
2) 1л№
Н,СО ®
X о
''Ч..О ,ТР5С1 N
О
ОМТгС! СМТг0
О л /=\
у / " Н3СО 1 Г
1 I 2) эви, Н,0/СН,СЫ О о
Ру 1 Г 2) эви, Н,0/СН,СЫ
ОН О ЗЛМТЕАВ ^
46 Г 47
В = ига.Су1А2мвАаеА»™.0иалгмв О
Схема 12
Превращение МТМ-аденозинового и -гуанозинового производных 44 в А2М-производные 45 проводили в присутствии трифторметансульфоновой кислоты, как описано выше. Дальнейшая защита 5'-ОН функции обработкой ОМТгС1, фосфорилирование З'-ОН функции и избирательное удаление 2-хлорфенильной Р-защитной группы давали мономеры 47.
3. Синтез мономера, содержащего 2'-0-(4-нптробензнлокс11)метШ1Ы1ую группу.
Ранее Гофом и др. было показано, что 2'-0-(4-нитробензилокси)метильная (4-ЫВОМ) защитная группа устойчива в условиях стандартного амидофосфитного метода синтеза и деблокирования
9
олигонуклеотидов, и количественно удаляется при обработке 1М ТВ АР в течение 24 ч. Мы также решили исследовать возможность использования данной защитной группы в синтезе олигорибо-нуклеотидов фосфотриэфирным методом. Гофом и др., а также Цислаком и др., были описаны способы введения (4-ЫВОМ) группы в нуклеозиды обработкой 2',3'-0-дибутилстанниленуридина хлоридом 1-(4-нитробензилоксиметил)пиридиния в присутствии бромида тетрабутиламмония или обработкой 3 ',5 '-0-( 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2 '-О-метилтиометилнуклеозидов смесью М-йодсукцинимида (N15) и ТЮН в присутствии 4-нитробензилового спирта.
>ЛэН + Вг^СООСНз--02М-{ У^сЛсООСНз--02М-( У^сЛсООН-►
\=/ ЭМР 4=/ СН.ОН 4=/ ОМР
48 49 50 51
52
Схема 13
Нами была предложена альтернативная методика региоселективного введения (4-ЫВОМ) группы. На первом этапе был осуществлен синтез ацетоксиметил и-нитробензилового эфира 52. Для этого и-нитробензиловый спирт 48 алкилировали метиловым эфиром бромукеусной кислоты 49 в присутствии карбоната цезия, с последующим омылением сложноэфирной группы соединения 50 и декарбоксилированием полученного соединения 51 при обработке тетраацетатом свинца в ЭМИ (Схема 13).
Последующее алкилирование 3',5'-0-(1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)уридина 5 ацетоксиметил п-нитробензиловым эфиром 52 в присутствии хлорида олова (IV) давало полностью защищенное уридиновое производное 53. Для избирательного удаления 3',5'-0-защитной группы из соединения 53 можно использовать раствор 1ЧН4р в метаноле, а мы нашли, что для этих же целей подходит раствор фторида калия в метаноле. Дальнейшее введение БМТг-группы по 5'-ОН функции, фосфорилирование и избирательное удаление с фосфатного остатка 2-хлорфенильной группы давали уридиновый мономер 56 (Схема 14).
4. Синтез мономеров, содержащих модифицирующую 2'-0-метоксиметильную группу.
В настоящее время предложено большое количество 2'-0-защитных групп ацетального типа, удаление которых осуществляется кислотным гидролизом. Данные группы обладают рядом преимуществ, так они неспособны мигрировать, устойчивы в основных условиях, требуемых для деблокирования гетероциклических оснований, межнуклеотидных остатков и отщепления с носителя, и позволяют осуществлять очистку 2'-0-запдЦ!№Н4й(РНК последовательностей в нейтральных или основных условиях, а также не опасаться расщепления эндонуклеазами.
СИ,Oil
KF
Ura
НО-
ОН ,0
Я
Ь
Ura
54
DMTrCI
ь
N02 55
N02 56
Схема 14
Метоксиметильная (MOM) группа нашла широкое применение в органическом синтезе для блокирования гидроксильных функций, благодаря своему малому размеру, легкости введения и устойчивости в основных и слабокислых условиях, а также в условиях, используемых для удаления си-лильных, алкоксиацетильных и бензильных групп. Кроме того, она была использована в качестве 2'-0-модифицирующей группы для олигонуклеотидов, полученных Н-фосфонатным методом. Однако удаление MOM группы обычно предполагает обработку сильными кислотами, которые катализируют расщепление и изомеризацию межнуклеотидных связей олигорибонуклеотидов.
На первом этапе нами было синтезировано модельное соединение 58 (R = СНз) с целью подбора условий деблокирования 3 '-гидроксильной функции, которые не приводили бы к миграции и расщеплению межнуклеотидных связей олигорибонуклетидов. Для этого 5 '-0-(трет-бутилдифенилсилил)тимидин 57 обработали диметоксиметаном в присутствии эфирата трехфто-ристого бора и получили производное 58 (R = СНз) (Схема 15).
Оказалось, что обработка соединения 58 1М раствором Ш в ацетонитриле в присутствии 0.01М НС1 в течение 30 минут приводило к количественному удалению З'-О-МОМ группы, причем добавление воды вплоть до 10 % не влияло на скорость реакции ее удаления. С другой стороны известно, что уридилил-(3'—»5 ")-уридин подвергается расщеплению по межнуклеотидной связи и
57
R = СН3, С2Н5
58
Схема 15
изомеризации с образованием уридилил-(2'—>5')-уридина в 0.1М НС1 (рН 1.0) при 25°С, но в тех же условиях при использовании 0.01М НС1 (рН 2.0) обе эти реакции протекают с ничтожно низкой скоростью. Следовательно, можно было ожидать, что обработка 2-О-МОМ олигорибонуклеоти-дов 0.01М НС1 не будет приводить к их деградации и изомеризации межнуклеотидных связей.
Далее, нами были синтезированы еще два 5',3'-О-защищенных тимидиновых производных, содержащих в 3-положении аналоги MOM группы, этоксиметильную (НОМ) 58 (R = С2Н5) и бензи-локсиметильную (BzOM) 62 группу. Введение ЕОМ группы осуществляли по той же методике, как и введение MOM группы, но с использованием диэтоксиметана (Схема 15). Для введения BzOM группы на первом этапе был получен соответствующий ацетоксиметилбензиловый эфир 61. Бензиловый спирт 59 обрабатывали параформом и триметилхлорсиланом в ССЦ в течение 2 часов, с последующим кипячением полученного а-хлорэфира 60 с ацетатом калия в ацетонитриле. Затем, 5'-0-(т/>ет-бутилдифенилсилил)тимидин 57 конденсировали с соединением 61 в присутствии эфирата трехфтористого бора, в результате чего было получено 5',3'-0-защищенное тимидиновое производное 62 (Схема 16).
СН20, (CH3),SiCI /=\ АсОК
59 60 61
Thy ТЬУ
1 ' тпппел—
TBDPSO
-i^o^l 61, BF3Et2o TBOPSOvO^
I C2H4CI2 1
0H — XK?
Схема 16
Все три группы количественно удалялись при обработке Lil в присутствии 0.01 HCl, причем скорость удаления ЕОМ была равной, a BzOM несколько меньшей, чем скорость удаления MOM группы. Т.к. MOM и ЕОМ группы удаляются с одинаковой скоростью, но первая имеет меньшие размеры, что должно оказывать благоприятный эффект на выходы реакции межнуклеотидной конденсации, MOM группа была выбрана нами для синтеза рибонуклеотидных мономеров типа 66, впоследствии используемых в фосфотриэфирном методе синтеза с О-нуклеофильным внутримолекулярным катализом.
Производные уридина, цитидина и аденозина 5, содержащие блокированные 3'- и 5 '-гидроксилы, а в случае С и А нуклеозидов также блокированные экзоциклические аминофункции гетероциклических оснований, обрабатывали избытком диметоксиметана в присутствии эфирата трехфтористого бора в 1,2-дихлорэтане при комнатной температуре в течение 2 ч. После выделения полно-
стью блокированных нуклеозидов 64, проводили удаление TIPDS-группы действием 1М раствора TBAF в THF в течение 1 ч. Полученные МОМ-производные диметокситритилировали, а затем в полученные таким образом соединения 65 по З'-гидроксилу вводили остаток фосфорной кислоты, содержащий 4-метокси-1 -оксид-2-пиколильную Р-защитную группу последовательной обработкой (4-хлорфенил)-(1-оксидо-4-метокси-2-пиколил)фосфатом 32 в присутствии TPSC1, а затем DBU в водном ацетонитриле. В случае производных гуанозина обработка соответствующего 3',5'-0-защищенного нуклеозида диметоксиметаном в присутствии эфирата трехфтористого бора приводила к образованию большого количества флуоресцирующего побочного продукта, поэтому в этом случае синтез 2'-0-МОМ-производного 64 осуществляли, исходя из метилтиометильного производного 63, обработкой при -40°С трифторметансульфоновой кислотой и NIS в смеси THF -метанол (25:1) в течение 20 мин (Схема 17).
J, ¿Н > I 2) DMTrCI / Ру Si
-Л- _XL ^o''
\ I 5 -( Y-
B =Ura. CytBl. AdeBt
" НзСО o
\ \/ G °\ ^O о
') (1-O-P-O^-/ .TPSCI N „I ~ t So о
CHjOH,NIS,CFJS03H / 2)DBU,CH,CN/H,0
i n Cl
t eo
GualBU / О
3) IM TEAB DMTrO-
X"" s^ B'-Ura, CyIBz, AdeBt Gua'1 OCH
-fv 63 ?снз О О
t °o о
Схема 17
5. Синтез, деблокирование и очистка олигонуклеотидов.
Синтез олигонуклеотидов осуществляли фосфотриэфирным методом на синтезаторе Applied Biosystems Synthesizer 381 А, используя в случае мономеров 24 и 35 CPG-поситель, фупкциопализиро-ванный уридиновыми производными 18 или 31, соответственно, а в случае мономеров 41, 47, 56 и 66, универсальный CPG носитель (Glen Research). Оценка эффективности прохождения этапов наращивания цепи олигонуклеотидов проводилась спектрофотометрическим измерением концентрации образующегося на стадии детритилирования карбокатиона при 478 и 498 нм. Типичный цикл элонгации цепи олигонуклеотида представлен в табл. 1, а в табл. 2 представлены выходы некоторых из полученных олигонуклеотидов.
Таблица 1. Цикл элонгации цепи олигонуклеотида при автоматическом синтезе.
Стадия Растворители и реагенты Время, мин
1. Детритилирование 3% дихлорунсусная кислота в дихлорметане 1.0
2. Промывка ацетонитрил 1.0
3. Промывка Ацетонитрил-пиридин (3:1, об/об) 0.5
4. Конденсация 0.05М мономерный синтон; 0.15М TPSC1 в смеси ацетонитрил-пиридин (3:1, об/об) 3.0*
5. Промывка Ацетонитрил-пиридин (3:1, об/об) 0.5
6. Кэппирование Уксусный ангидрид - 1-метилимидазол - ацетонитрил (1:1:8, об/об) 0.5
7. Промывка ацетонитрил 1.0
* - время реакции межнуклеотидной конденсации для мономеров типа 41 составляло 0.5 мин, для мономера типа 24-2 мин, для мономеров типа 47,56 и 66 - 3 мин и для мономера 35-5 мин.
После завершения наращивания цепи, с олигонуклеотидов удаляли Р-защитную 1-оксидо-4-метокси-2-пиколильную группу. Ранее для этих целей обычно использовался пиперидин (10 часов, 20°С) или смесь тиофенол-диоксан-триэтиламин (1:2:2, об/об, 3-5 часов, 20"С). Позже мы обнаружили, что удобным и эффективным реагентом для деблокирования фосфатных остатков является 1М раствор Ш в ацетонитриле (3 часа, 20°С). Отщепление олигонуклеотидов с носителя и деблокирование стандартных ацильных защитных групп с экзоциклических аминофункций гетероциклических оснований осуществляли действием смеси 28% раствора водного аммиака и этанола (3:1, об/об) при 55°С в течение 3-5 часов. Л'-А2МВ-группы с гетероциклических оснований удаляли как описано в разделе 5.1. Полученные олигонуклеотиды выделяли гель-фильтрацией на сефадексе, и их гомогенность проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и обращено-фазовой ВЭЖХ. Затем проводили удаление 2'-0-защитных групп с олигорибопуклеотидов (см. ниже). Целевые, полностью деблокированные олигонуклеотиды выделяли гель-фильтрацией. Для сравнения те же олигонуклеотиды были получены амидофосфитным методом с использованием коммерчески доступных мономеров и стандартного протокола синтеза.
5.1. Удаление 2'-0-защитных групп.
Устойчивость 2'-0-К7М и 2'-0-А2МВ групп к действию смеси 28% водного аммиака и этанола (3:1, об/об) проверяли на соответствующих нуклеозидных мономерах 18 и 31. Было установлено, что обе группы полностью устойчивы в этих условиях в течение 3 суток при комнатной температуре или в течение 3 ч при 55°С. Затем проверяли эффективность удаления 2'-0-А2М и 2'-О-AZMB групп обработкой мономеров типа 24 и 35 0.1 М трифенилфосфином в смеси ацетонитрил-вода (9:1, об/об) или 0.1М метилдифенилфосфином в смеси диоксан-вода (4:1, об/об).
Таблица 2. Последовательности и выходы некоторых из синтезированных РНК.
№* Последовательность олигонуклеотида Средний выход на стадии Суммарный
конденсации, % выход, %
1 г(иииииииииииииии) 99.2 56
II КАШСШАСССАССССА) 98.5 51
III гГсосисиссисосисиссАиси) 97.4 47
IV г(ААСААОАОССШОАОСССАиси) 98.1 50
V г (АОАиССвСиССАООСиСииСии) 97.6 48
VI ггссисисоисосисиссль'сытт 98.3 49
VII г(САШСАОАОСОАССАОАОС)с1ТТ 97.7 55
VIII г (САОАСААААОАААОСаСА) 99.1 60
IX г (исиССиаиОиАСАЛСиОЛОиСС) 98.9 57
X лсослстсотсастсАссАтат) 99.3 63
XI г(СОСАСиСОиСОСиСАССАШи) 98.2 50
XII г(СОАиСиСАиСАССиСиССАи) 98.4 52
XIII г(иииииииииииииш) 99.1 59
XIV г( ССАиСиСАиСАССиСиССАи) 98.9 57
* - олигонуклеотиды 1-1Х синтезированы, исходя из мономеров 24; олигонуклеотиды X - из мономеров 41; Х1-Х11 - из 47 и ХШ-Х1У - из 66.
Мы нашли, что для полного удаления 2'-0-А2М группы с мономеров 24 требуется 5-10 мин, тогда как удаление 2'-0-К7МЪ группы достигается в течение 30 мин. Затем, 2'-0-А2М- и 2'-0-А2МВ-защищешгые пентадекамерные полиуридиловые олигонуклеотиды подвергали обработке теми же реагентами в течение 1, 2, 3 и 5 часов, с последующим анализом продуктов с помощью электрофореза в ПААГ. Было найдено, что удаление 2'-0-А2М групп с олигорибонуклеотида обработкой 0.1 М трифенилфосфином полностью протекало в течение 2-3 ч при комнатной температуре, а 0.1М метилдифенилфосфином - 30 мин. В то же время удаление 2'-0-А2ЫВ групп с олигорибонуклеотида требовало большего времени (1 ч с метилдифенилфосфином и 3-5 ч с трифенилфосфином) и сопровождалось частичным его расщеплением. На основании полученных данных был сделан вывод о предпочтительности использования 2'-0-А7М-защитной группы в синтезе фрагментов РНК. Олигорибонуклеотиды со смешанной последовательностью оснований и 2'-0-АХМ-защитной группой также полностью деблокировались в вышеописанных условиях (рис. 1).
Отдельно исследовалась устойчивость Л'-А2МВ-защитной группы к действию смеси этилового спирта и концентрированного аммиака. Как показали эксперименты на защищенных мономерах 41 и 47, а также на олигодезоксирибонуклеотиде с1(СОСАСТСОТСОСТСЛССАТОТ), данная группа полностью устойчива в этих условиях в течение времени, требуемого для отщепления олигонуклеотидов с носителя и полностью удаляется за несколько часов при действии 0.1М три-фенил- или метилдифенилфосфином.
Рис. 1. Анализ олигорибонуклеотидов З'СОСисиСОиСОСисиССАШи Ш (дорожки 1-3), и]5 1 (дорожки 4-6) и 5'иС11ССШШиАСААСиОАОШС IX (дорожки 7-9) после удаления защитных групп электрофорезом в 15% денатурирующем ПЛАТ. 1,4,9 - олигонуклеотиды-свидетели, полученные амидофосфитным методом; 2,5,8 -полностью деблокированные олигонуклеоти-ды, полученные фосфотриэфирным методом; 3,6,7 - олигонуклеотиды до удаления 2'-0-Л7М защитных групп. Фотография в отраженном УФ-свете при 254 нм. (ХС - ксилен-цианол К К, ВРВ - бромфеноловый голубой) Затем, мы синтезировали олигорибонуклеотид г(СОСАСиСОиСОСиСАССА1ГСи) XI и провели его деблокирование. После деблокирования фосфатного остатка и отщепления олигонуклеотида с носителя, азидосодержащие защитные группы с аминофункций гетероциклических оснований и 2'-гидроксилов удаляли действием 0.1М раствора трифенилфосфина в смеси ацетонитрил-вода (9:1, 20°С, 5 ч) или метилдифенилфосфина в смеси диоксан-вода (8:1, 20°С, 2 ч). Полученные олигонуклеотиды выделяли гель-фильтрацией, и их гомогенность проверяли электрофорезом в ПААГ
Рис. 2. Анализ олигонуклеотидов г(СОСАСиСОиСССиСАССА1Юи) XI (дорожки 1-3) и с1(СОСАСТССТСОСТСАССАТОТ) X (дорожки 46) после удаления защитных групп электрофорезом в 15% денатурирующем ПААГ. (3, 6) - олигонуклеотиды-свидетели, полученные амидофосфитным методом; (2, 5) - полностью деблокированные олигонуклеотиды, полученные фосфотриэфирным методом с азидосодер-жащими защитными группами; (1, 4) - олигонуклеотиды до удаления 2'-С-А2М и М-Л7МВ защитных групп. Фотография в отраженном УФ-свете при 254 нм.
Используя уридиновый мономер 56, содержащий 2'-0-(4-ЫВ0М)-защитную группу, был синтезирован олигонуклеотид 11|5 с выходами на отдельных стадиях наращивания цепи, превышающими 99%. После деблокирования фосфатного остатка и отщепления олигонуклеотида с носителя 4-МВОМ-группу удаляли с 2'-гидроксилов действием 1М раствора ТВАБ в ТНИ в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем, олигонуклеотид выделяли гель-фильтрацией на колонке с се-фадексом и проверяли его гомогенность с помощью электрофореза в ПААГ (рис. 3) и обращено-фазовой хроматографии.
Также нами исследовалась возможность удаления 2'-(9-МОМ группы с синтезированных олигонуклеотидов на примере олигорибонуклеотидов г(и15) и г(СОАисиСАиСАССисиССАи) , полученных исходя из мономеров 66. После деблокирования фосфатного остатка, аминофункций гетероциклических оснований и отщепления олигорибонуклеотидов с носителя 2'-0-защищенные олигорибонуклеотиды подвергали действию реагентами, обычно используемыми для удаления МОМ защитной группы: 30% трифторуксусной кислотой или 2пВг2 в присутствии меркаптана.
(рис. 2) и обращено-фазовой ВЭЖХ.
12 3 4
Однако в этих условиях в значительной степени протекала деградации цепи олигонуклеотидов. При действии более мягкого реагента -1М Lil в ацетонитриле, содержащем 5-10% воды, в присутствии 0.0Ш НС1 наблюдалось только частичное удаление MOM группы, которое также сопровождалось частичной деградацией цепи олигомеров (рис. 4). 1 2 3
•ХС Щ, 12 3 4
•ВРВ
Рис. 3. Электрофореграмма в 15% денатурирующем ПА АР олигонуклеотида и15, полученного с использованием 2'-СЧ4-ЫВОМ) защитной группы до (1) и после (2) ее удаления, (3) - тот же полностью деблокированный олигонуклео-тид, полученный амидофосфитным методом.
Рис. 4. Электрофореграмма в 15% денатурирующем ПААГ олигонуклеотидов и,5 XIII (1, 2) и 5'- СвАи-СиСАиСАССисиССАи XIV (3, 4). полученных с использованием 2'-0-М0М группы, до (1, 3) и после (2, 4) их обработки 1 М 1Л в смеси ацетонитрил - вода (20:1) в присутствии 0.0] М соляной кислоты. Фотография в отраженном УФ-свете при 254 нм. (ХС -ксиленцианол Н1\ ВРВ - бромфеноловый голубой).
5.2. Ферментатнвное расщепленне 2-О-защищенных и полностью деблокированных олиго-рибонуклеотидов.
Исследования синтетических фрагментов РНК, полученных фосфотриэфирным методом с использованием мономеров 24, 35, 47 и 56 показали, что они обладают теми же свойствами, как олигори-бонуклеотиды, полученные амидофосфитным методом, и дают аналогичную картину при расщеплении нуклеазами. Результаты, полученные при анализе расщепления РНКазой Н, позволяют сделать вывод о том, что олигорибонуклеотиды, синтезированные нами фосфотриэфирным методом, достаточно чисты для использования в биологических исследованиях (рис. 5). В то же время, олигорибонуклеотиды, содержащие 2'-0-АгМ и 2'-0-М0М группы, более устойчивы к действию нуклеаз, чем полностью деблокированные олигонуклеотиды.
Исследовалась также стабильность Т-0-К7М- и 2'-(9-МОМ-модифицированных олигонуклеотидов к действию РНК-специфических нуклеаз, в частности РНказы А и РНказы Т1. Мы обнаружили, что они стабильны к действию данных ферментов при концентрациях, которые приводят к полному расщеплению природных олигорибонуклеотидов. Более того, Б1 нуклеаза, нуклеаза золотистой фасоли и экзонуклеаза III также были неспособны расщеплять 2'-0-кТМ и 2'-0-М0М олигорибонуклеотиды. Наряду с этим, фосфодиэстераза змеиного яда (УРОЕ) и фосфодиэстераза селезенки рогатого скота (БРОЕ) расщепляли 2'-0-модифицированные олигорибонуклеотиды, но их
устойчивость к действию данных ферментов была выше устойчивости природных олигорибонук-леотидов (рис. 6).
Рнс. 5. Злектрофоретический анализ в 15% денатурирующем ПААГ при расщеплении РНКазой Н Р-меченных олигорибонуклеотидов г(САШОАОАОССАСОАСАОС)с1ТТ (а) и сосисисоисосисис-СА1ГСи (б). Полосы 1-6 показывают расщепление олигорибонуклеотида (а) через 2, 5, 10, 30 и 60 минут выдерживания с ферментом и до обработки, соответственно. Полосы 7 и 8 показывают олигорибонуклео-тид (б), синтезированный фосфотриэфирным и амидофосфитным методом, соответственно, а полосы 9 и 10 тот же самый олигорибонуклеотид (б) после выдерживания с ферментом в течение 2 часов. Визуализацию осуществляли радиоавтографией.
СО СО (У) см ю со
см см см со
Рис. 6. Стабильность 2'-0-А2М оли-гоуридилата к действию нуклеазами. Динамика расщепления 2'-0-АХМ го-мо-11|5 и полностью деблокированного гомо-и^ фосфодиэстеразой селезенки рогатого скота (ЗРБЕ) (кривые 1 и 3) и фосфодиэстеразой змеиного яда (УРРЕ) (кривые 2 и 4).
время (мин)
5.3. Термическая стабильность дуплексов, образованных Т-О-АЛЖ- и 2'-0-МОМ-модифицированными олигорибонуклеотидами с комплементарными НК.
При сравнении температур плавления (Тпл) дуплексов, образованных полностью деблокированными или 2'-0-А2М-защищенными олиогорибонуклеотидами с комплементарными мишенями, было установлено, что Тпл обоих типов дуплексов очень близки (рис. 7). Установлено, что присутствие 2'-ОА7М групп в олигонуклеотидах оказывает незначительное влияние на стабильность дуплексов, хотя и приводит к небольшой их дестабилизации (~0.25°С на пару оснований) (табл. 3). В свою очередь, проверка гибридизационного взаимодействия 2'-ОМОМ-модифицированных
18
РНК с комплементарными фрагментами НК показала, что наличие этих группировок не оказывает значительного влияния на специфичность связывания олнгонуклеотндов (рис. 8). Так, стабильность образованных ими дуплексов с комплементарными фрагментами РНК была несколько выше, и это повышение Т„л составило в среднем около 0.2"С на одно звено по сравнению с природными дуплексами. Однако комплексы 2'-0-МОМ-модифицированных олигонуклеотидов с ДНК-мишенями имели Т.,., несколько меньшую, чем комплексы, образованные с олигорибонуклеотида-ми природного типа с той же последовательностью оснований (дестабилизация составила ~0.3°С на одно звено) (табл. 3). Введение единичных замен нуклеотидов в последовательности ДНК и РНК матриц приводило к снижению температуры плавления соответствующих дуплексов на 10-15°С в зависимости от положения мутации.
0,92 0.90 0.88 0.86 ; о.м о,»: 0.80 0.78
0.76'
» 3 5 4 0 4 5 5 0 55 60 65 70 75 80 «5 температура (°С)
1.21) 1,15 1.10 г 1.05 0,95 (1.90 0.85
___________
20 25 30 35 40 45 50 55 61) температура ("С)
Рис. 7. Кривые плавления дуплексов, образованных олигонуклеотидами 5'СОСисиСОиСОСиСиССАиОи (а) и 11|5 (б) до и после удаления 2'-0-азидометилыюй группы. Растворы олигорибонуклеотидов (1 мкМ) отжигали с такими же объемами растворов комплементарных фрагментов нуклеиновых кислот (1 мкМ) в 0.01 М Трис-НС1 (рН 7.5)/0.01 М 1^С1:/0.1 М ЫаС1 при 90°С в течение 2 минут, медленно охлаждали до 20°С, а затем нагревали со скоростью 0.5°С/мин. Показаны кривые плавления дуплексов, образованных с ДНК-матрицами - полностью деблокированными олигонуклеотидами (кривые 1); олигонуклеотидами с 2'-0-азидометильными группами (кривые 2) и с РНК-матрицей полностью деблокированным и^ (кривая 3).
температура ("С)
Рис. 8. Кривые плавления дуплексов, образованных 2'-0-МОМ-модифицированными олигонуклеотидами и^ (1,2) и 5'-г(СОАисиСАиСАССисиССАЦ) (3,4) с комплементарными олигодезоксирибонуклеотидами (1,3) и олигорибонуклеотидами (2,4). Растворы олигорибонуклеотидов (1 мкМ) отжигали с такими же объемами растворов комплементарных фрагментов нуклеиновых кислот (1 мкМ) в 0.01 М Трис-НС1 (рН 7.5)/0.01 М МёСЬ/0.1 М ЫаС1 при 90°С в течение 2 минут, медленно охлаждали до 20°С, а затем нагревали со скоростью 0.5°С/мин.
Таблица 3. Термическая устойчивость дуплексов, образованных 2'-0-модифицированными оли-горибонуклеотидами с комплементарными мишенями.
Модифицирующая группа Последовательность фрагмента РНК Комплементарный олигонуклеотид т„;с"
т-о-рам иишииишшииии г(ААААААААААААААА) 35 (-2)
2-О-МОМ иииииииииииииии г(ААААААААААААААА) 39(+3)
2'-0-АгМ иииииииииииииии а(ААААААААААААААА) 34(-4)
2'-0-М0М иииииииииииииии а(ААААААААААААААА) 32(-5)
г-о-кгм АШОиСАССОАССССА сКтсссотсоотсассат) 52 (-4)
т-о-Аги сссисисоисосисиссАши а(АСАТООАСАОСОАСОАСАССО) 67(-5)
2'-о-дгм ААСААСАСССибОАССССАиси с!(АСАТС.СОСТССАОаСТСГГСТТ) 65(-6)
Т-О-АТМ АОАШОССиССАООСиСШСШ <1(ААОААОАОССТСаАОСССАТСТ) 64 (-5)
2'-о-лгм г(ссисиссисссь'сисслио)атт ¿(САТСОАОАССОАСОАОАОС) 65 (-5)
2'-0-АгМ г(САиООАСАОССАСС1ЛОАСС)(1ТТ (КОСТСТССТСОСТСТССАТО) 64 (-4)
т-о-кгы САСАСААААСАААССССА с1(ТС;ССЗСТТТСТТТТОТСТО) 60 (-4)
т-о-кгм иСиССиСШиАСААОШАСШС (¡(ОСТСТСАСТТСТАСТСАСОАОА) 66 (-6)
2'-0-М0М ССАисиСАиСАССисиССАи с1(АТОСАОАСОТСАТСАСАТСО 53(-7)
2'-0-М0М СвАисиСАиСАССисиССАи г(АШ0А0АС01ЮА1гаА0АиС0) 54(+3)
* - Значения в скобках показывают разницу в температурах плавления дуплексов, образованных природным и 2 '-(^-модифицированным олигорибонуклеотидом.
Таким образом, впервые была показана возможность проведения эффективного твердофазного синтеза олигорибонуклеотидов фосфотриэфирным методом с использованием О-нуклеофильного внутримолекулярного катализа и удаляющихся в нейтральных условиях азидосодержащих и 4-№ОМ-защитных групп. Разработанный метод также позволяет синтезировать 2 '-0-модифицированные АгМ- или МОМ-группами олигопуклеотиды и открывает перспективу для применения этих соединений и их фосфоротиоатных аналогов для различных молекулярно-биологических исследований.
выводы
1. Разработана методика введения 2'-0-азидометильпой группы в иуклеозиды, позволяющая избежать побочной реакции галогенирования гетероциклических оснований.
2. Разработаны схемы синтеза мономеров, содержащих 2'-0-азидометильную, 2'-0-(2-азидометил)бензоильную и А^-(2-азидометил)бензонльную группы, для фосфотриэфирного метода синтеза олигорибонуклеотидов на основе О-нуклеофилыюго внутримолекулярного катализа. Показано, что использование мономеров, содержащих 2 '-О-азидометильную и N-{2-азидометил)бензоильную группы, позволяет эффективно синтезировать фрагменты РНК.
3. Предложены новые фосфорилирующие реагенты, содержащие в своем составе О-нуклеофильную каталитическую 4-метокси-1-оксидо-2-пиколильную Р-защитную группу, использование которых позволяет повысить суммарные выходы мономеров и сократить время их синтеза.
4. Предложен способ введения (4-нитробекзилокси)метильной группы в состав рибонуклеозидов, получен 2'-0-(4-ЫВОМ) уридиновый мономер для фосфотриэфирного метода и показана эффективность его использования в синтезе фрагментов РНК.
5. Разработаны схемы синтеза мономеров, содержащих модифицирующую 2'-О- метоксиметиль-ную группу, использование которых обеспечивает высокоэффективный синтез 2 '-0-модифицированных олигорибонуклеотидов.
6. Исследования по ферментативному расщеплению олигорибонуклеотидов, 2'-0-модифицированных азидометильной или метоксиметильной группами, а также исследования термической стабильности дуплексов, образованных этими аналогами олигорибонуклеотидов с комплементарными НК, позволяют сделать вывод о возможности их применения для различных мо-лекулярно-биологических исследований.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
1. Ефимов В. А., Аралов А. В., Федюнин С. В., Клыков В. Н., Чахмахчева О. Г. Азидометильная защитная группа в синтезе олигорибонуклеотидов фосфотриэфирным методом. Биоорг. химия 2009, 35, 279-273 (Efimov V. A., Aralov А. У.. Fedunin S. V., Klykov V. N.. Chakhmakhcheva О. G. An azidomethyl protective group in the synthesis of oligoribonucleotides by the phosphotriester method. Russ. J. Bioorg. Chem. 2009, 35, 250-253).
2. Efimov, V.A.; Aralov, A.V.; Klykov, V.N.; Chakhmakhcheva, O.G. Synthesis of RNA by the rapid phosphotriester method using azido-based 2'-0-protecting group. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2009, 28, 846-865.
3. Ефимов В. А., Апалов А. В.. Грачев С. А., Чахмахчева О. Г. Л'-Азидометил-бензоильная защитная группа в синтезе олигонуклеотидов фосфотриэфирным методом Биоорг. химия 2010, 36, 681-687 (Efimov V. A.; Aralov А. У.; Grachev S. A.; Chakhmakhcheva О. G. N-azidomethylbenzoyl blocking group in the phosphotriester synthesis of oligoribonucleotides. Russ. J. Bioorg. Chem. 2010, 36, 628-633).
4. рфимов B.Aj Апалов A.B., Чахмахчева О.Г. Метоксиметильная и (я-нитробензилокси)метильная группы в синтезе олигорибонуклеотидов фосфотриэфирным методом. Биоорг. химия. 2011, 37, 284-288 (Efimov, V.A.; Aralov, A.V.: Chakhmakhcheva, O.G. Me-thoxymethyl and (p-Nitrobenzyloxy)methyl Groups in Synthesis of Oligoribunucleotides by the Phosphotriester Method. Russ. J. Bioorg. Chem. 2011, 35, 254-258).
Тезисы докладов па конференциях:
1. Аралов А.В.. Чахмахчева О, Г., ¡Ефимов В.А.|Химический синтез природных и модифицированных РНК фосфотриэфирным методом. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2011, 63.
Подписано в печать:
11.04.2011
Заказ Ка 5302 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Список сокращений.
Введение.
Защитные группы, используемые в синтезе фрагментов РНК (литературный обзор).
Выводы
1. Разработана методика введения 2'-0-азидометильной группы в нуклеозиды, позволяющая избежать побочной реакции галогенирования гетероциклических оснований.
2. Разработаны схемы синтеза мономеров, содержащих 2О-азидометильную, 2'-О-{2-азидометил)беизоильную и /У-(2-азидометил)бензоильную группы, для фосфотриэфирного метода синтеза олигорибонуклеотидов на основе 0-нуклеофильного внутримолекулярного катализа. Показано, что использование мономеров, содержащих 2'-О-азидометильную и -/V- (2-азидометил) бснзоильную группы, позволяет эффективно синтезировать фрагменты РНК.
3. Предложены новые фосфорилирующие реагенты, содержащие в своем составе О-нуклеофильную каталитическую 4-метокси-1-оксидо-2-пиколильную Р-защитную группу, использование которых позволяет повысить суммарные выходы мономеров и сократить время их синтеза.
4. Предложен способ введения (4-нитробензилокси) метальной группы в состав рибонуклеозидов, получен 2'-0-(4-ЫВ0М) уридиновый мономер для фосфотриэфирного метода и показана эффективность его использования в синтезе фрагментов РНК.
5. Разработаны схемы синтеза мономеров, содержащих модифицирующую 2 '-О-метоксиметильную группу, использование которых обеспечивает высокоэффективный синтез 2 '-0-модифицированных олигорибонуклеотидов.
6. Исследования по ферментативному расщеплению олигорибонуклеотидов, 2 ' О-модифицированных азидометилыюй или метоксиметильной группами, а также исследования термической стабильности дуплексов, образованных этими аналогами олигорибонуклеотидов с комплементарными НК, позволяют сделать вывод о возможности их применения для различных молекулярно-биологических исследований.
1. Yan, А. С.; Bell, К. М; Breeden М. М.; Ellington, A. D. Aptamers: Prospects In Therapeutics And Biomedicine. Front. Biosci., 2005, 10, 1802-1827.
2. Bevilacqua, P. C.; Yajima, R. Nucleobase catalysis in ribozyme mechanism. Curr. Opin. Chew. Biol., 2006, 10, 455-464.
3. Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mello, С. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391, 806-811.
4. Elbashir, S. M.; Harborth, J.; Lendeckel, W.; Yalcin, A.; Weber, K; Tuschl, T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 2001, 411, 494-498.
5. Dorsett, Y.; Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat. Rev. Drug Discovery, 2004, 3, 318-329.
6. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004, 116, 281-297.
7. Reese, C.B. The chemical synthesis of oligo and poly-nucleotides by the phosphotriester approach. Tetrahedron, 1978, 34, 3143-3179.
8. Jarvinen, P.; Oivanen, M.; Lonnberg, H. Interconversion and phosphoester hydrolysis of 2',5' and 3',5'-dinucleoside monophosphates: Kinetics and mechanisms. J. Org. Chem., 1991, 56, 5396-5401.
9. Kuusela, S.; Lonnberg, H. Hydrolysis and isomerisation of the internucleosidic phosphodiester bonds of polyuridylic acids: Kinetics and mechanism. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1994, 2, 2109-2113.
10. Griffin, B.E.; Jarman, M.; Reese, C.B. The synthesis of oligoribonucleotides. IV. Preparation of dinucleoside phosphates from 2',5' protected ribonucleoside derivatives. Tetrahedron, 1968, 24, 639-662.
11. Schaller, II.; Weimann, G.; Lerch, В.; Khorana, H.G. Protected derivatives of deoxyribonucleosides and new syntheses of deoxyribonucleoside-3'-phosphates. J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 3821-3827.
12. Chattopadhyaya, J.В.; Reese, C.B. The 9-phenylxanthen-9-yl protecting group. J. Chem. Soc.; Chem. Commun., 1978, 639-640.
13. Sonveaux, E. Protecting groups in oligonucleotide synthesis. In Protocols for Oligonucleotide Conjugates: Synthesis and Analytical Techniques (Ed. Agrawal, S.) Humana Press, Totowa, N.J., 1994, 1-71.
14. Chattopadhyaya, J.B.; Reese, C.B.; Todd, A.H. 2-Dibromobenzoyl: An acyl protecting group removable under exceptionally mild conditions. J. Chem. Soc.; Chem. Commun., 1979, 987-988.
15. Rao, M.V.; Reese, C.B.; Schehlmann, V.; Yu, P.S. Use of the l-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin-4-yl (Fpmp) protecting group in the solid phase synthesis of oligo- and polyribonucleotides. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1993, 1, 43-55.
16. Vinayak, R.; Anderson, P.; McCollum, C.; Hampel, A. Chemical synthesis of RNA using fast oligonucleotide deprotection chemistry. Nucleic Acids Res., 1992, 20, 1265-1269.
17. Jones, S.S.; Reese, C.B.; Sibanda, S.; Ubasawa, A. The protection of uracil and guanine residues in oligonucleotide synthesis. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 4755-4758.
18. Reese, C.B.; Skone, P.A. The protection of thymine and guanine residues in oligodeoxyribonucleotide synthesis. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1984, 1, 1263-1271.
19. Reese, C.B.; Zard, L. Some observations relating to oximate ion promoted unblocking of oligonucleotide aryl esters. Nucleic Acids Res., 1981, 9, 4611-4626.
20. Kamimura, 71; Tsuchiya, M.; Urakami, K.; Koura, K.; Sekine, M.; Shinozaki, K.; Miura, K.; Hata, T. Synthesis of a dodecaribonucleotide GUAUCAAUAAUG by use of fully protected ribonucleotide building blocks. J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 4552-4557.
21. Reese, C.B. A systematic approach to oligoribonucleotide synthesis. Colloq. Int. Cent. Natl. Rech. ScL, 1970, 182, 319-328.
22. Reese, C.B.; Titmas, R.C.; Yau, L. Oximate ion promoted unblocking of oligonucleotide phosphotriester intermediates. Tetrahedron Lett., 1978, 30, 2727-2730.
23. Honda, S.; Urakami, K; Koura, K.; Terada, K; Sato, Y.; Kohno, K.; Sckine, M.; Hata, T. Synthesis of oligoribonucleotides by the use of S,S-diphenyl TV-monomethoxytrityl ribonucleoside 3'-phosphorodithioates. Tetrahedron, 1984, 40, 153-163.
24. Griffin, B.E.; Reese, C.B.; Stephenson, G.F.; Trentham, D.R. Oligoribonucleotide synthesis from nucleoside 2'-0-benzyl ethers. Tetrahedron Lett., 1966, 4349-4354.
25. Reitz, G. and Pfleiderer, W. Synthese und Eigenschaften von 0-benzyl substituierten Diuridylphosphaten. Chem. Ber., 1975, 108, 2878-2894.
26. Ohtsuka, E.; Tanaka, S.; Ikehara, M. Synthesis of the heptanucleotide corresponding to a eukaryotic initiator tRNA loop sequence. J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 8210-8213.
27. Hayes, J.A.; Brunden, M.J.; Gilham, P.T.; Gough, G.R. High-yield synthesis of oligoribonucleotides using o-nitrobenzyl protection of 2'-hydroxyls. Tetrahedron Lett., 1985, 26, 2407-2410.
28. Ohtsuka, E.; Iwai, S. Chemical synthesis of RNA. In Synthesis and Applications of DNA and RNA (Ed. Narang, S.A.) Academic Press, San Diego. 1987, 115-136.
29. Takaku, H; Kamaike, K. Synthesis of oligoribonucleotides using 4-methoxybenzyl group as a new protecting group of the 2'-hydroxyl group of adenosine. Chem. Lett., 1982, 189-192.
30. Takaku, H.; Kamaike, K.; Tsuchiya, H. Synthesis of ribooligonucleotides using the 4-methoxybenzyl group as a new protecting group for the 2'-hydroxyl group. J. Org. Chem., 1984, 49, 51-56.
31. Takaku, IL; Ito, T.; Lwai, K. Use of the 3,4-dimethoxybenzyl group as a protecting group for the 2'-hydroxyl group in the synthesis of oligoribonucleotides. Chem. Lett., 1986, 1005-1008.
32. Klösel, R.; König, S.; Lahnhoff.; Karl, R.M. l,l-Dianisyl-2,2,2-trichlorethyl ethers—a new protection for the hydroxyl group. Tetrahedron Lett., 1996, 52, 1493-1502.
33. Saneyoshi H.; Ando K; Seio K.; Sekine M. Chemical synthesis of RNA via 2'-cyanoethylated intermediates. Tetrahedron, 2007, 63, 11195-11203.
34. Saneyoshi, H.; Seio, K.; Sekine, M. A General Method for the Synthesis of 2 '-0~ Cyanoethylated Oligoribonucleotides Having Promising Hybridization Affinity for DNA and RNA and Enhanced Nuclease Resistance. J. Org. Chem., 2005, 70, 10453-10460.
35. Masaki, Y.; Miyasaka, R.; Ohkubo, A.; Seio K; Sekine, M. Linear Relationship between Deformability and Thermal Stability of 2'-O Modified RNA Hetero Duplexes. J. Phys. Chem. B, 2010, 114, 2517-2524.
36. Tanaka, S.; ILirakawa, T.; Oishi, K.; Hayakawa, Y.; Kitamura, M. A new synthetic route to oligoribonucleotides based on CpRu-catalyzed deallylation. Tetrahedron Lett., 2007, 48, 73207322.
37. Gopalakrishanan, V.; Kumar, V.; Ganesh, K.N. Regioselective 2',3'-0-Allylation of Pyrimidine Ribonucleosides Using Phase Transfer Catalysis. Nucleosides and Nucleotides, 1992, 11, 1263-1273.
38. Stork, G.; Hudrlik, P.F. Isolation of ketone enolates as trialkylsilyl ethers. J. Am.Chem. Soc., 1968, 90, 4462-4464.
39. Corey, E.J.; Venkatcswarlu, A. Protection of hydroxyl groups as tert-butyldimethylsilyl derivatives. J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 6190-6191.
40. Ogilvie, K.K.; Sadana, K.L.; Thompson, A.E.; Quillian, M.A.; Westmore, J.B. The use of silyl groups in protecting the hydroxyl functions of ribonucleosides. Tetrahedron Lett., 1974, 2861-2863.
41. Damha, M.J.; Ogilvie, K.K. Oligoribonucleotide synthesis. The silyl-phosphoramidite method. In Protocols for Oligonucleotides and Analogs (Ed. Agrawal, S.) Humana Press, Totowa, N.J. 1993,81-114.
42. Jones, S.S.; Reese, C.B. Migration of i-butyldimethylsilyl protecting groups. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1979,1, 2762-2764.
43. Sproat, B.S.; Calonna, F.; Mullah, B.; Tsou, D.; Andrus, A.; Hampel, A.; Vinayak, R. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 255-273.
44. Brown, T.; Brown, D.J.S. Modern machine-aided methods of oligoribonucleotide synthesis. In Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach (Ed. Eckstein, F.) IRL Press, Oxford. 1991, 1-24.
45. Stawinski, J.; Strdmberg, R.; Thelin, M; Westman, E. Studies on the f-butyldimethylsilyl group as 2'-0-protection in oligoribonucleotide synthesis via the H-phosphonate approach. Nucleic Acids Res., 1988, 16, 9285-9298.
46. Chaix, C.; Molko, D.; Teoule, R. The use of labile base protecting groups in oligoribonucleotide synthesis. Tetrahedron Lett., 1989, 30, 71-74.
47. Mullah, B.; Andrus, A. Purification of 5'-O-trityl-on oligoribonucleotides. Investigation of phosphate migration during purification and detritylation. Nucleosides and Nucleotides, 1996, 15, 419-430.
48. Goodwin, J.T.; Stanick, W.A.; Glick, G.D. Improved solid-phase synthesis of long oligoribonucleotides. Application to tRNAPhe and tRNAGly. J. Org. Chem., 1994, 59, 79417943.
49. Wincott, F.; DiRenzo, A.; Shaffer, C.; Grimm, S.; Tracz, D.; Workman, C.; Sweedler, D.; Gonzalez, C.; Scaringe, S.; Usman, N. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684.
50. Gasparutto, D.; Livache, T.; Bazin, H.; Duplaa, A.-M.; Guy, A.; Khorlin, A.; Molko, D.; Roget, A.; Teoule, R. Chemical synthesis of a biologically active natural RNA with its minor bases. Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5159-5166.
51. Westman, E.; Stromberg, R. Removal of i-butyldimethylsilyl protection in RNA synthesis. Triethylamine trihydrofluoride (TEA-3HF) is a more reliable alternative to tetrabutylammonium fluoride (TBAF). Nucleic Acids Res., 1994, 22, 2430-2431.
52. Capaldi, D.C.; Reese, C.B. Use of the l-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin-4-yl (Fpmp) and related protecting groups in oligoribonucleotide synthesis: Stability of internucleotide linkages to aqueous acid. Nucleic Acids Res., 1994, 22, 2209-2216.
53. Smrt, J.; Sorm, F. Oligonucleotide compounds I. The direct blocking of 2'-hydroxyl in ribonucleoside-3'phosphates. The synthesis of 6-azauridylyl-(5 '—>3')-uridine. Coll. Czech. Chem. Commun., 1962, 27, 73-86.
54. Griffin, B.E.; Reese, C.B. Oligoribonucleotide synthesis via 2,5-protected ribonucleoside derivatives. Tetrahedron Lett., 1964, 2925-2931.
55. Reese, C.B.; Saffhill, R.; Sulston, J.E. A symmetrical alternative to the tetrahydropyranyl protecting group. J. Am. Chem. Soc., 1967, 89, 3366-3368.
56. Reese, C.B.; Saffhill, R.; Sulston, J.E. 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl. A symmetrical alternative to the tetrahydropyranyl protecting group. Tetrahedron, 1970, 26, 1023-1030.
57. Norman, D.G.; Reese, C.B.; Serafinowska, H.T. The protection of 2'-hydroxy functions in oligoribonucleotide synthesis. Tetrahedron Lett., 1984, 25, 3015-3018.
58. Jones, S.S.; Rayner, B.; Reese, C.B.; Ubasawa, A.; Ubasawa, M. Synthesis of the 3'-terminal decaribonucleoside nonaphosphate of yeast alanine transfer ribonucleic acid. Tetrahedron, 1980, 36, 3075-3085.
59. Jones, S.S.; Reese, C.B.; Sibanda, S. Studies directed towards the synthesis of yeast alanine tRNA. In Current Trends in Organic Synthesis (Ed. Nozaki, H.) Pergamon Press, Oxford. 1983, 71-81.
60. Ohtsuka, E.; Yamane, A.; Doi, T.; Ikehara, M. Chemical synthesis of the 5'-half molecule of E.coli tRNA2Gly. Tetrahedron, 1984, 40, 47-57.
61. Kruse, C.G.; Jonkers, F.L.; Dert, V.; van der Gen, A. Synthetic applications of 2-chlorotetrahydrofuran: Protection of alcohols as tetrahydro-2-furanyl (THF) ethers. Rec.Trav. Chim., 1979, 98, 371-380.
62. Tanaka, T.; FuJino, K.; Tamatsukuri, S.; Ikehara, M. Synthesis of oligoribonucleotides via the phosphite triester approach on a solid support. Chew. Pharm. Bull. Jpn., 1986, 34, 41264132.
63. Kierzek, R.; Caruthers, M.H.; Longfellow, C.E.; Swinton, D.; Turner, D.H.; Freier, S.M. Polymer-supported RNA synthesis and its application to test the nearest-neighbour model for duplex stability. Biochemistry, 1986, 25, 7840-7846.
64. Tanimura, H.; Mieda, M.; Fukazawa, T.; Sekine, M.; Hata, T. Chemical synthesis of the 24 RNA fragments corresponding to hop stunt viroid. Nucleic Acids Res., 1989, 17, 8135-8147.
65. Tanimura, II.; Imada, T. The utility of 2'-Thp group in the synthesis of the relatively long RNA fragments on the solid support. Chem. Lett., 1990, 2081-2084.
66. Reese, C.B.; Skone, P.A. Action of acid on oligoribonucleotide phosphotriester intermediates. Effects of released vicinal hydroxy functions. Nucleic Acids Res., 1985, 13, 5215-5231.
67. Christodoulou, C.; Agrawal, S.; Gait, M.J. Incompatibility of acid-labile 2'and 5'protecting groups for solid-phase synthesis of oligoribonucleotides. Tetrahedron Lett., 1986, 27, 1521— 1522.
68. Kierzek, R. The stability of trisubstituted internucleotide bond in the presence of vicinal 2'-hydroxyl. Chemical synthesis of uridylyl(2'-phosphate)-(3'—>5')-uridine. Nucleosides and Nucleotides, 1994, 13, 1757-1768.
69. Lehmann, C.; Xu, Y.-Z.; Christodoulou, C.; Tan, Z.-K.; Gait, M.J. Solid-phase synthesis of oligoribonucleotides using 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) for 5'-hydroxyl protection. Nucleic Acids Res., 1989, 17, 2379-2390.
70. Reese, C.B.; Serafinowska, H.T.; Zappia, G. An acetal group suitable for the protection of 2'-hydroxy functions in rapid oligoribonucleotide synthesis. Tetrahedron Lett., 1986, 27, 22912294.
71. Owen, G.R. and Reese, C.B. A convenient preparation of tetrahydro-4H-pyran-4-one. J. Chem. Soc. C, 1970, 2401-2403.
72. Faja, M.; Reese, C.B.; Song, Q.; Zhang, P.-Z. Facile preparation of acetals and enol ethers derived from l-arylpiperidin-4-ones. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1997, 1, 191-194.
73. Rao, T.S.; Reese, C.B.; Serafinowska, H.T.; Takaku, II.; Zappia, G. Solid phase synthesis of the 3' terminal nonadecaribonucleoside octadecaphosphate sequence of yeast alanine transfer ribonucleic acid. Tetrahedron Lett., 1987, 28, 4897-4900.
74. Sproat, B.S.; Beijer, B.; Groetli, M.; Ryder, U.; Morand, K.L.; Lamond, A.I. Novel solidphase synthesis of branched oligoribonucleotides including a substrate for RNA debranching enzyme. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1994, 1, 419-431.
75. Rao, M.V.; MacfarJane, K. Improvements to the chemical synthesis of biologically-active RNA using 2'-C-Fpmp chemistry. Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 911-915.
76. Rastogi, H.; Usher, D.A. A new 2'-hydroxyl protecting group for the automated synthesis of oligoribonucleotides. Nucleic Acids Res., 1995, 23, 4872-4877.
77. Schwartz, M.E.; Breaker, R.R.; Asteriadis, G.T.; de-Bear, J.S.; Gough, G.R. Rapid synthesis of oligoribonucleotides using 2 '-O-(o-nitrobenzyloxymethyl)-protected monomers. Bioorg. Med. Chem. Lett, 1992, 1019-1024.
78. Gough, G.R.; Miller, T.J.; Mantick, N.A. />Nitrobenzyloxymethyl: A new fluoride-removable protecting group for ribonucleoside 2'-hydroxyls. Tetrahedron Lett., 1996, 37, 981— 982.
79. Sung, W.L. Synthesis of 4-(l,2,4-triazol-l-yl)pyrimidin- 2(lH)-one Ribonucleotide and its application in the synthesis of Oligoribonucleotides. J.Org.Chem., 1982, 47, 3623-3628.
80. Cieslak, J.; Kauffman, J. S.; Kolodziejski, M, J.; Lloyd, J. R.; Beaucage, S. L. Assessment of 4-nitrogenated benzyloxymethyl groups for 2'-hydroxyl protection in solid-phase RNA synthesis. Org. Lett., 2007, 9, 671-674.
81. Wincott, F.E.; Usman. N. 2'-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl protection of the 2'-hydroxyl group in oligoribonucleotide synthesis. Tetrahedron lett., 1994, 35, 6827-6830.
82. Wagner, D.; Verheyden, J.P.H.; Moffatt, J.G. Preparation and synthetic utility of some organotin derivatives of nucleosides. J.Org.Chem., 1974, 39, 24-30.
83. Uchiyama, M; Aso, Y.; Noyori, R.; Hayakawa, Y. O-Selective Phosphorylation of Nucleosides without N-protection. J.Org.Chem., 1993, 58, 373.
84. Pitsch, 51; Weiss, P.A.; Jenny, L.; Stutz, A.; Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2'-0-(triisopropylsilyl)oxy. methyl (2 '-O-tom)-protected phosphoramidites. Helv. Chim. Acta., 2001, 84, 3773-3795.
85. Benneche, 71; Gundersen, L.L.; Undheim, K.A. (teri-Butyldimethilsilyloxy)methyl chloride:Synthesis and use as N-protecting group inpyrimidinones. Acta Chem. Scand., 1988, 42, 384-389
86. Gundersen, L.L.; Benneche, 71; Undheim, K.A. Chloromethoxysilanes as Protecting Reagents for Sterically Hindered Alcohols. Acta Chem. Scand., 1989, 43, 706-709
87. Benneche, 71; Strande, P.; Undheim, K.A. A New Synthesis of Chloromethyl Benzyl Ethers. Synthesis, 1983, 9, 762.
88. Umemoto, T.; Wada, 71 Oligoribonucleotide synthesis by the use of l-(2-cyanoethoxy)ethyl (CEE) as a 2'-hydroxy protecting group. Tetrahedron lett., 2004, 45, 9529-9531.
89. Ohgi, 71; Masutomi, Y.; Ishiyama, K.; Kitagawa, H; Shiba, Y.; Yano, J. A new RNA synthetic method with 2'-0-(2-cyanoethoxymethyl) protecting group. Org. Lett., 2005, 7, 34773480.
90. Zhou, C.; Honcharenko, D.; Chattapadhyaya, J. 2-(4-Tolysulfonyl)ethoxymethyl (TEM) -a new 2' OH protecting group for solid-supported RNA synthesis. J. Org. Biomol. Chem., 2007, 5, 333-343.
91. Bordwell, E.G. Equilibrium acidities in dimethyl sulfoxide solution. Acc.Chem.Res., 1988, 21, 456-463.
92. Semenyuk, A.; Foldesi, A.; Johansson, 7'./ Estmer-Nilsson, C.; Blomgren, P.; Brannvall, M.; Kirsebom, L; Kwiatkowski, M. Synthesis of RNA using 2'-0-DTM protection. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 12356-12357.
93. Olejnik, J.; Krzymanska-OleJnik, E.; Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 361-366.
94. Fang, S.; Bergstrom, D. E. Reversible 5'-end biotinylation and affinity purification of synthetic RNA. Tetrahedron Lett., 2004, 45, 7987-7990.
95. Tomaya, K; Takahashi, M.; Minakawa, N.; Matsuda, A. Convenient RNA Synthesis Using a Phosphoramidite Possessing a Biotinylated Photocleavable Group. Org Lett, 2010, 12, 38363839.
96. Hat a, T.; Azizian. J. 2-chloroethyl orthoformate as a reagent for protection in nucleotides synthesis. Tetrahedron lett., 1969, 51, 4443-4446.
97. Scaringe, S. A.; Wincott, F. E.; Caruthers, M. LI. Novel RNA Synthesis Method Using 5'-Silyl-2'-Orthoester Protecting Groups. J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821.
98. Scaringe, S. A.; Kitchen, D.; Kaiser, R. J.; Marshall, W. S. RNA Oligonucleotide Synthesis Via 5'-Silyl-2'-Orthoester Chemistiy. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Wiley, 2004, 2.10.1-2.10.16.
99. Reese, C.B.; Trentham, D.R. Acyl migration in ribonucleoside derivatives. Tetrahedron Lett, 1965, 2467-2472.
100. Fromageot, H.P.M.; Reese, C.B.; Sulston, J.E. The synthesis of oligoribonucleotides. VI. 2'-0-Acyl ribonucleoside derivatives as intermediates in the synthesis of dinucleoside phosphates. Tetrahedron, 1968, 24, 3533-3540.
101. Ohtsuka, E.; Iwari, S. 5'-Levulinyl and 2'-tetrahydrofuranyl protection for the synthesis of oligoribonucleotides by the phosphoramidite approach. Nucleic Acids Res., 1988, 16, 94439456.
102. Ogilvie, K. K.; Nemer, M. J. The synthesis of oligoribonucleotides VI. The synthesis of a hexadecamer by a block condensation approach. Can. J. Chem., 1980, 58, 1389-1397.
103. Ogilvie, K. K.; Nemer, M. J.; Hakimelahi, G. H.; Proba, Z. A.; Lucas, M. N-Levulination of nucleosides. Tetrahedron Lett., 1982, 23, 2615-2618.
104. Parey, N.; Baraguey, C.; Vasseur, J.-J.; Debart, F. First Evaluation of Acyloxymethyl or Acylthiomethyl Groups as Biolabile 2'-0-Protections of RNA. Org. Lett., 2006, 8, 3869-3872.
105. Lavergne, T.; Bertrand J.-R.; Vasseur J.-J.; Debart, F. A Base-Labile Group for 2'-OH Protection of Ribonucleosides: A Major Challenge for RNA Synthesis. Chem. Eur. J., 2008, 14, 9135-9138.
106. Martin, A. R.; Lavergne, T.; Vasseur, J.-J.; Debart, F. Assessment of new 2'-0-acetalester protecting groups for regular RNA synthesis and original 20-modified proRNA. Bioorg. Med. Chem. Lett, 2009, 19, 4046-4049.
107. Polushin, N. N.; Smirnov I. P.; Verentchikov, /1. N.; Coull, J. M. Synthesis of oligonucleotides containing 2'-azido- and 2'-amino-2'-deoxyuridine using phosphotriester chemistry. Tetrahedron Lett., 1996, 19, 3227-3230.
108. Aimer, H.; Szabo, T.; Stawinski, J. A new approach to stereospecific synthesis of P-chiral phosphorothioates. Preparation of diastereomeric dithymidyl-(3'-5') phosphorothioates. Chem. Commun., 2004, 290-291.
109. Uhlmann E.; Peyman A. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. Chem. Rev., 1990, 90, 543-584.
110. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem., 2003, 270, 1628-1644.
111. Iyer R.P.; Devlin T.; Habus I.; Ho N. II.; Yu D.; Agrawal S. N-Pent-4-enoyl nucleosides: Application in the synthesis of support-bound and free oligonucleotide analogs by the H-phosphonate approach. Tetrahedron Lett., 1996, 37, 1539-1542.
112. Efimov V.A.; Buryakova A.A.; Choob M.V.; Chakhmakhcheva O.G. Polyester and N-methyl analogues of peptide nucleic acids: synthesis and hybridization properties. Nucleosides and Nucleotides, 1999, 18, 2533-2549.
113. Wada, T.; Ohkubo, A.; Mochizuki, A.; Sekine, M. 2-(Azidomethyl)benzoyl as a new protecting group in nucleosides. Tetrahedron Lett., 2001, 42, 1069-1072.
114. Kawanaka, T.; Shimizu, M.; Wada, T. Synthesis of dinucleoside phosphates and their analogues by the boranophosphotriester method using azido-based protecting groups. Tetrahedron Lett., 2007, 48, 1973-1976.
115. Zavgorodny, S.G.; Pechenov, A.E.; Shvets, V.I.; Miroshnikov, A.I. S,X-Acetals in Nucleoside Chemistry. III. Synthesis of 2'-and 3'- O-Azidomethyl Derivatives of Ribonucleosides. Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 2000, 19, 1977-1991.
116. Bizdena, E.; Rozners, E.; Stromberg, R. Synthesis and Properties of 2'-O-Methoxymethyl Oligonucleotides. Collect. Czech. Chem. Commun., 1996, 61, S283-S286.
117. Gomez, C.; Maciay, B.; Lillo, V. J.; Yus, M. 1,2.-Wittig rearrangement from chloromethyl ethers. Tetrahedron, 2006, 62, 9832-9839.
118. ERmov, V.A.; Aralov, A. V.; Klykov, V.N.; Chakhmakhcheva, O.G. Synthesis of RNA by the rapid phosphotriester method using azido-based 2'-O-protecting group. Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 2009, 28, 846-865.
119. Efimov V. A.; Aralov A. V.; Grachev S. A.; Chakhmakhcheva O. G. N-azidomethylbenzoyl blocking group in the phosphotriester synthesis of oligoribonucleotides. Russ. J. Bioorg. Chem., 2010, 36, 6280-633.
120. Efimov V.A.; Buryakova A.A.; Reverdatto, S.V.; Chakhmakhcheva O.G.; Ovchinnikov, Y.A. Rapid synthesis of long-chain deoxyribooligonucleotides by the N-methylimidazole phosphotriester method. Nucleic Acid Res., 1983, 11, 8369-8387.
121. Scott, S.; Hardy, P.; Sheppard, R.C.; McLean, M.J. Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis, 3rd International Symposium (Ed. Epton, R.) Mayflower Worldwide, 1994, 115-124.
122. Eskandari R.; Jayakanthan K; Kuntz D.A.; Rose D.R.; Pinto B.M. Synthesis of a biologically active isomer of kotalanol, a naturally occurring glucosidase inhibitor. Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 2829-2835.
123. Han J.H.; Kwon Y.E.; Sohn J.-H.; Ryu D.H. A facile method for the rapid and selective deprotection of methoxymethyl (MOM) ethers. Tetrahedron, 2010, 66, 1673-1677.
124. Jomes, R.A. Preparation of protected deoxyribonucleotides. Oligonucleotide synthesis: a practical approach (Ed. Gait, M.J.) Oxford, Washington DC: IRL Press, 1984, 23-34.
125. Pechenov, A.E.; Zavgorodny, S.G.; Shvets, V.L.; Miroshnikov, A.I. The S,X-acetals in nucleoside chemistry. I. The synthesis of 2'-and 5'-O methylthiomethylribonucleosides. Russ. J. BioOrg. Chem., 2000, 26, 327-333.
