Химический состав и биологическая активность хиноидных и полифенольных соединений из дальневосточных растений Lithospermum erythrorhizon, Eritrichium sericeum, Maackia amurensis, Vitis amurensis, Taxus cuspidata и их клеточных культур. Препарат максар из древесины маакии амурской тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ФЕДОРЕЕВ Сергей Александрович

Химический состав и биологическая активность хиноидных и полифенольных соединений из дальневосточных растений Lithospermum erythrorhizon, Eritrichium sericeum, Maackia amurensis, Vitis amurensis, Taxus cuspidata и их клеточных культур. Препарат максар из древесины маакии амурской

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

- з ИЮН 2010

Владивосток - 2010

004603025

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, главный научный сотрудник Макарьева Татьяна Николаевна

доктор химических наук, профессор Семенов Аркадий Алексеевич

доктор биологических наук, профессор Кушнерова Наталья Федоровна

Ведущая организация: Институт молекулярной

генетики РАН

Защита состоится « Я » 2010 г. в IO часов на заседании

диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан 2010 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор химических наук,

старший научный сотрудник •--■' /Монастырная М.М./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение и практическое применение природных соединений имеют большое значение для укрепления здоровья и увеличения продолжительности жизни людей. Действительно, биомолекулы, химические структуры и биологические функции, которых изучает биоорганическая химия, используются в качестве биологически активных субстанций лекарств и ценных пищевых компонентов. На протяжении многих лет и до настоящего времени основными источниками новых природных соединений были и остаются высшие наземные растения. Многие из них биосинтезируют метаболиты, обладающие выдающейся биологической активностью. Признано, что растения являются основным источником биологического материала при производстве лекарственных препаратов [Стоник В.А., 2004].

В последнее время доказано, что многие патологические состояния животных и человека вызываются нарушением нормального уровня свободных радикалов в их органах и тканях. Это в полной мере относится к естественному процессу старения, сердечно-сосудистым заболеваниям, воспалительным явлениям, ожогам и, прямо или косвенно, к онкологическим заболеваниям. В современной клинической практике коррекция подобных нарушений нередко выполняется применением экзогенных антиоксидантов полифенольной природы, благодаря чему полифенольные и хиноидные соединения природного происхождения стали в настоящее время важными объектами для изучения их структур и биомедицинских исследований. Весьма существенным является и то, что природные полифенольные антиоксиданты не только являются защитой организма от окислительного стресса путем нейтрализации активных форм кислорода, но и могут регулировать окислительно-восстановительные свойства клеток или их компонентов и, таким образом, защищать клетки от старения. Повсеместное распространение полифенольных соединений в растениях, достаточно хорошая изученность некоторых из них, низкая токсичность и высокая фармакологическая активность привели к созданию ряда лекарственных препаратов на их основе [Rice-Evans С., 2001].

Природные ресурсы Российского Дальнего Востока предоставляют широкие возможности для получения разнообразных антиоксидантов и их композиций, прежде всего из лекарственных растений. Разработка новых лекарственных средств на основе дальневосточных растений, в первую очередь способных усиливать регенеративные процессы в печени, и внедрение их в широкую медицинскую практику приобрели особую социальную значимость. Сегодня большинство зарегистрированных в Российской Федерации препаратов данной группы являются импортными и, вследствие высокой стоимости, малодоступными для населения. Это обуславливает создание эффективных, малотоксичных отечественных гепатопротективных средств на основе природных антиоксидантов полифенольной природы, устраняющих основное звено патогенеза токсического гепатита - усиление перекисного окисления липидов, и улучшающих антитоксическую и экскреторную функции гепатоцитов.

С другой стороны, поскольку вследствие интенсивного и нерегулируемого сбора растительного сырья его запасы в природе истощаются, все большее значение приобретают биотехнологические способы получения ценных природных веществ, в том числе методы клеточной биотехнологии. Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях на питательных средах неограниченно долго, при этом часть полученной биомассы используют для экстракции целевых продуктов, а другую часть пересаживают на свежую питательную среду для возобновления культуры. Независимость от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, погода, почвенные

условия, вредители), а нередко и более высокий выход и хорошее качество продукта делают эту технологию привлекательной. В настоящее время происходит развитие новых методов биотехнологии клеточных культур растений [Булгаков В.П. и соавт., 2004]. Одним из первых примеров практического применения такого подхода стал биосинтез в промышленном масштабе эфиров шиконина клеточными культурами Lithospermum erythrorhizon, осуществленный в Японии и в нашей стране.

Считается, что биотехнология клеточных культур растений поможет решить проблему сохранения в природе редких видов растений, а также создаст реальную возможность для разработок новейших методов получения наиболее ценных лекарственных веществ и, в конечном счете, новых медицинских препаратов. В условиях, когда постоянно падает доля лекарственных субстанций отечественного производства, представляется особенно важным развивать современные технологии, создающие надежную сырьевую базу для производства отечественных препаратов.

Объектами настоящего исследования явились редкие и ценные растения дальневосточной флоры. Выбор растений был произведен на основе литературных данных и личного опыта с учетом основного критерия -возможности их использовать для создания оригинальных отечественных препаратов. В итоге для углубленного исследования отобрано 5 перспективных видов растений - Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zucc. и Eritrichium sericeum (Lehm.) A. DC. сем. Boraginaceae, Maackia amurensis Rupr. et Maxim, сем. Fabaceae, Vitis amurensis Rupr. сем. Vitaceae, Taxus cuspidata Sieb, et Zucc. сем. Taxaceae. Для каждого вида осуществлен тщательный химический анализ его компонентов и вместе с сотрудниками Биолого-почвенного института ДВО РАН предприняты попытки получить активно-растущие клеточные культуры -воспроизводимые биотехнологические источники целевых хиноидных и/или полифенольных соединений. Большое внимание было уделено повышению продуктивности полученных клеточных культур растений и изучению фармакологической активности их метаболитов.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось выделение, установление строения и исследование биологической активности природных полифенольных и хиноидных соединений из экстрактов дальневосточных растений L. erythrorhizon (воробейник краснокорневой), Е. sericeum (незабудочник шелковистый), М. amurensis (маакия амурская), V. amurensis (виноград амурский), Т. cuspidata (тис остроконечный) и их клеточных культур, а также завершение разработки нового гепатопротективного лекарственного средства "Максар®" на основе полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) На основе полученных суммарных экстрактов из растений и их клеточных культур разработать методы выделения биологически активных соединений, выделить индивидуальные соединения и установить их химическое строение;

2) провести сравнительное изучение качественного состава и количественного соотношения полифенольных и хиноидных соединений в растениях и их клеточных культурах;

3) изучить биологическую активность препаратов из клеточных культур L erythrorhizon, Е. sericeum и М. amurensis для определения перспективности их использования в косметике и медицине;

4) провести сравнительное изучение гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов из древесины М. amurensis и ее клеточной культуры;

5) определить антиоксидантную и антирадикальную активность полифенольных соединений из Т. cuspidata;

6) разработать с применением генно-инженерных методов и новых технологий подходы к увеличению биосинтеза биологически активных соединений культурами клеток;

7) разработать аналитические методы для установления подлинности и количественного определения активных компонентов в препаратах: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг";

8) разработать нормативную документацию на сырье, субстанцию и лекарственную форму препарата "Максар®";

9) осуществить регистрацию на территории Российской Федерации и промышленные выпуски препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

Положения, выносимые на защиту:

1. Получены высокопродуктивные клеточные культуры из L. erythrorhizon, способные в течение длительного периода (20 лет) стабильно биосинтезировать изогексенилнафтазарины (ИГН) и изогексенилбензохинонилфураны (ИГБФ). Показано, что препарат "Масло шикониновое", приготовленный на основе ИГН и ИГБФ из биомассы клеток воробейника краснокорневого, обладает выраженным противовоспалительным действием при лечении рожистых воспалений.

2. Незабудочник шелковистый и его клеточные культуры Ег-1 и Е-4 содержат (-)-рабдозиин, розмариновую кислоту и новый полифенольный метаболит эритрихин. Воробейник краснокорневой и его клеточная культура ВК-39 синтезируют (+)-энантиомер рабдозиина и розмариновую кислоту. Содержание полифенолов в культурах клеток увеличено по сравнению с их содержанием в растениях.

3. Основными компонентами спиртовых экстрактов ядровой древесины маакии амурской, составляющими полифенольный комплекс препарата максар, являются 27 соединений, принадлежащих к разным классам природных полифенолов.

4. Клеточные культуры, полученные из побегов, черешков, цветковой кисти, почек и корней М. amurensis, способны синтезировать изофлавоны и птерокарпаны. Клеточная культура А-18 М. amurensis, полученная из проростков семян, продуцирует изофлавоноиды, представляющие собой moho-, ди- и малонилглюкозиды изофлавонов и птерокарпанов, и новый метаболит, структура которого установлена как б'-О-малонил-З-О-Д-D-глюкопиранозил-6,6а-дегидромаакиаин. В отличие от растения, клеточные культуры маакии амурской не биосинтезируют мономерные и димерные стильбены.

5. Полифенольные комплексы, приготовленные из древесины М. amurensis и клеточной культуры А-18, обладают выраженным гепатопротективным и антиоксидантным действием.

6. Препарат максар снижает интенсивность процессов свободно-радикального окисления липидов, восстанавливает резервы эндогенных антиоксидантов в крови и печени животных, регулирует глутатионзависимые ферментативные антиоксидантные механизмы печени и способствует коррекции нарушений липидного обмена крови и липоидоза печени. Максар обладает противоопухолевым действием, характеризуется малой острой и хронической

токсичностью, не имеет мутагенного, эмбриотоксического, тератогенного, иммунотоксического и аллергизирующего эффектов.

7. Максар проявляет гепатопротективную активность у больных хроническим гепатитом вирусной и алкогольной этиологии; оказывает более выраженный по сравнению с карсилом терапевтический эффект. На основании результатов клинической апробации препарат максар рекомендован в качестве гепатопротективного средства для медицинского применения и промышленного выпуска.

8. Разработаны методы установления подлинности и стандартизации биологически активной субстанции и препарата максар, подготовлены следующие проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП): "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг", которые прошли экспертизу ФГУ НЦ ЭСМП Росздравнадзора РФ.

9. Спиртовые экстракты стеблей V. amurensis содержат 6 мономерных и димерных стильбенов. Клеточная культура VB2 винограда амурского, трансформированная геном rolB, способна продуцировать только один транс-стильбен - резвератрол с выходом 3.15% на сухой вес клеток.

10. В состав экстракта из древесины Т. cuspidate входят четыре лигнана и два катехина, обладающие высокой антирадикальной и антиоксидантной активностью. Клеточная культура Т. cuspidate продуцирует три известных таксановых дитерпеноида и один новый, таксюнаннин-7(3-ол.

Научная новизна работы. Выполнено сравнительное изучение состава природных полифенольных и хиноидных соединений дальневосточных растений L. erythrorhizon, Е. sericeum, М. amurensis, V. amurensis, Т. cuspidate и их клеточных культур. Совместно с сотрудниками Биолого-почвенного института (БПИ ДВО РАН) получены высокопродуктивные культуры клеток L. erythrorhizon, Е. sericeum, М. amurensis, V. amurensis, Т. cuspidata и исследованы особенности накопления в них вторичных метаболитов. Из экстрактов 5 видов растений и их клеточных культур выделено и идентифицировано 74 природных метаболита. Установлено строение 8 новых природных соединений.

Изучена физиологическая активность целого ряда веществ и препаратов из указанных растений и созданных на их основе клеточных культур, в том числе показано, что косметическое средство "Масло шикониновое", полученное из клеточных культур воробейника, эффективно при лечении рожистых воспалений.

Впервые на основе клеточных культур L. erythrorhizon, Е. sericeum созданы два новых источника рабдозиина, причем в форме различных диастериомеров, (+)- и (-)-рабдозиина. Выявлено выраженное нефропротективное, диуретическое, противовоспалительное и антиоксидантное действие препаратов ПВ и ПН, приготовленных из клеточных культур L. erythrorhizon и £. sericeum.

Впервые установлено, что основными компонентами спиртовых экстрактов ядровой древесины М. amurensis являются растительные полифенолы, составляющие полифенольный комплекс (ПФКД) препарата максар. В состав препарата входят: изофлавоны, птерокарпаны, мономерные стильбены, изофлаваны, изофлаваноны, халконы, олигомерные полифенолы и димерные транс-стильбены. В процессе выделения в кислых водно-спиртовых средах на сорбентах с обращенной фазой димерные транс-стильбены, при их облучении ультрафиолетовым светом, легко изомеризуются в димерные цис-стильбены. Доказано, что в процессе производства и хранения субстанции препарата максар такой изомеризации не происходит.

Показано, что, кроме выраженного гепатопротективного действия, препарат максар способствует коррекции нарушений липидного спектра крови и жировой

дистрофии печени, повышает активность системы антиоксидантной защиты организма и препятствует развитию алиментарной гиперлипопротеинемии у животных. Он оказывает антиоксидантное действие при экспериментальном сахарном диабете, индуцированном аллоксаном, снижает интенсивность образования в печени продуктов перекисного окисления липидов (ДК, МДА), регулирует систему антиоксидантной защиты организма животных преимущественно через глутатионзависимые ферментативные механизмы, улучшает детоксикацию гидропероксидных радикалов. Максар уменьшает коагуляционные свойства крови и препятствует формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа у крыс после овариоэктомии. Впервые показано, что максар обладает противоопухолевым действием -ингибирует рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 и НТ-29.

Впервые из клеточной культуры А-18 M. amurensis выделено и структурно идентифицировано 20 изофлавоноидов и проведено полное отнесение сигналов протонов и углеродов в ЯМР спектрах гликозидной части этих соединений. Культура клеток А-18 является стабильным продуцентом и накапливает до 1.9% изофлавоноидов на сухую массу клеток.

Впервые была проведена сравнительная оценка гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и клеточной культуры М. amurensis. Показано, что оба фитокомплекса в разной степени обладали выраженным гепатозащитным действием и влиянием на активность свободно-радикального окисления. Выраженное противовоспалительное действие обнаружено только у ПФК из древесины М. amurensis.

Практическая значимость работы. Практическая ценность работы состоит в завершении разработки нового отечественного лекарственного средства - препарата "Максар®". В частности, были разработаны аналитические методы определения его качества и подлинности, разработана нормативная документация и осуществлены регистрация на территории Российской Федерации, а также промышленные выпуски этого препарата. Препарат "Маакии амурской экстракт сухой" введен в государственный Реестр лекарственных средств как новая фармацевтическая субстанция, а растение маакия амурская внесено в государственный Реестр лекарственных растений России. Высокая гепатопротективная активность препарата "Максар®" подтверждена результатами клинических испытаний.

Автор участвовал в создании перспективных для углубленного фармакологического изучения и последующего промышленного производства клеточных культур L. erythrorhizon, Е. sericeum, M. amurensis, V. amurensis, T. cuspidata, являющихся воспроизводимыми источниками полифенольных и хиноидных соединений. Они могут быть объектами последующего внедрения.

Апробация работы и публикации. Результаты работы доложены: на 45th Arctic sei. conf. "Bridges of the science between North America and the Russian Far East", 25-27 Aug., 1994, Anchorage, Alaska, 29 Aug. - 2 Sept., 1994, Vladivostok, Russia; VII Междунар. съезд, Санкт-Петербург-Пушкин, 3-5 июля 2003 г.; The 8th Intern, congr. "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin" Phytopharm 2004, June 21-23, 2004, Mikkeii, Finland; 2nd Intern, conf. on natural products and physiologically active substances (ICNPAS-2004) and 3rd EuroAsian heterocyclic meet. "Heterocycles in organic and combinatorial chemistry" (EAHM-2004), Novosibirsk, Russia, Sept. 12-17, 2004; IX Междунар. съезд ФИТОФАРМ 2005 и конф. молодых ученых Европейского фитохим. о-ва "Растения и здоровье", Санкт-Петербург, 22-25 июня 2005; Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию проф. Ш.М. Омарова.

- Махачкала, 2006; III Всерос. конф., 23-27 апр. 2007 г.; Thirteenth intern, biotechnology symp. and exhibition, Oct. 12-17, 2008, Dalian, China; IV Всерос. конф. "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья", Барнаул, 21-23 апр. 2009 г.; Междунар. науч.-практ. конф. "Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства" Шымкент, Казахстан, 2009. По материалам диссертации опубликовано 80 работ, из них 38 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК и 6 патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного строению, биогенезу, биологическим свойствам, функциям и распространению в растениях полифенольных и хиноидных соединений, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты экспериментов, Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал, используемый в работе, а также основные методики и эксперименты. В конце диссертации приведены Выводы и Список цитируемой литературы. Работа изложена на 396 страницах, содержит 59 таблиц и 54 рисунка. В списке цитируемой литературы 681 ссылка.

Благодарности. Автор благодарит к.х.н. В.А. Денисенко, к.ф.-м.н. В.П. Глазунова, к.х.н. П С. Дмитренка за съемку ЯМР, КД, ИК, масс-спектров; член-корр. РАН В.П. Булгакова и к.б.н. К.В. Киселева за предоставленные клеточные культуры растений и помощь в работе с ними. Автор выражает благодарность профессору Я.Ф. Звереву и его сотрудникам (Алтайский государственный медицинский университет), профессору М.Б. Плотникову и его сотрудникам (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН), д.б.н. B.C. Чучалину (Сибирский государственный медицинский университет) и к.б.н. В.И. Яньковой (Владивостокский филиал ДВНЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН -НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения) - за проведение фармакологических исследований препаратов.

Используемые сокращения: ИГН - изогексенилнафтазарины; ИГБФ -изогексенилбензохинонилфураны; ТСХ - тонкослойная хроматография; ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления; ДФПГ- 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил; КД - спектры кругового дихроизма; ЯМР 1Н и 13С -спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода; с-синглет; д - дублет; м.д. - миллионные доли; COSY - корреляционная спектроскопия; HSQC - эксперимент ЯМР гетероядерной корреляции через одну связь; НМВС - эксперимент ЯМР гетероядерной корреляции через несколько связей; FABMS - масс-спектр бомбардировки быстрыми атомами с прямым вводом вещества; ПН - спиртовый экстракт клеточной культуры Е. sericeum Ег-1; ПВ - спиртовый экстракт клеточной культуры L. erythrorhizon ВК-39; ПФК -полифенольные комплексы; ПФКД, ПФКК - полифенольные комплексы из древесины и клеточной культуры М. amurensis; ACT -аспартатаминотрансфераза; AJ1T - аланинаминотрансфераза; ЩФ - щелочная фосфатаза; ГТФ - глутатионтрансфераза; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ТБРП - продукты ПОЛ, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой; ОПА - общая прооксидантная активность; СОД - супероксиддисмутаза; ГПО -глутатионпероксидаза; ОАА - общая антиоксидантная активность; ГЛП -гиперлипопротеинемия; ЛПНП - липопротеины низкой плотности; ЛПВП -липопротеины высокой плотности; ХС - холестерин; а-ТФ - а-токоферол; ДК -диеновые конъюгаты; АОС - антиоксидантная система организма; АОЗ -антиоксидантная защита в организме животных; ОВУ - относительные времена удерживания веществ; ГСО - государственный стандартный образец; МДА -малоновый диальдегид.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Содержание хиноидных пигментов в корнях и клеточной культуре ВК-39 иМоэрегтит егуЛгог/шоп

Изучение девяти видов дальневосточных растений сем. Вогадшасеае показало, что воробейник краснокорневой, содержащий максимальное количество хиноидных пигментов на сухую массу корней (1.8%), является наиболее перспективным растением для получения клеточной культуры. Клеточную культуру воробейника краснокорневого получили из корней дикорастущего растения в Биолого-почвенном институте ДВО РАН методом селекции окрашенных агрегатов каллусов. Культура депонирована во Всероссийскую коллекцию клеток высших растений (Институт физиологии растений РАН, г. Москва) под индексом ВСКК-ВР 36 (штамм ВК-39). Суммарные гексановые экстракты хинонов из клеточной культуры ВК-39 были разделены на индивидуальные компоненты колоночной хроматографией на силикагеле с последующей их очисткой методом гельпроникающей хроматографии на сефадексе Ш-20 в СНС13. Преобладающими компонентами в суммарном экстракте были изогексенилнафтазарины (ИГН): шиконин (1), дезоксишиконин (2), ацетилшиконин (3), изобутирилшиконин (4), изовалерилшиконин (5), сг-метилбутирилшиконин (6), Д/З-диметилакрилшиконин (7) и /3-оксиизовалерилшиконин (8).

он о R R

1 ОН

2 Н

3 ОСОСНз

4 ОСОСН(СНз)2

5 ОСОСН2СН(СН3)2

6 ОСОСН(СН3)СН2СН3

7 ОСОСН=С(СН3)2

8 ОСОСН2(СН3)2ОН

9 ОСОСН2СН3

Структуры соединений 1-8 определены прямым сравнением данных спектров ЯМР 1Н и 13С с данными для аналогичных соединений, ранее выделенных из корней L erythrorhizon. Впервые удалось выделить и установить структуру нового ацильного производного шиконина 9 с молекулярной массой m/z = 344 [М]+, отвечающей составу С^НгоОб. Анализ данных спектров ЯМР 1Н и 13С нафтохинона 9 показал совпадение сигналов атомов, принадлежащих протонам и углеродам нафтазаринового фрагмента и изопентенильного участка боковой цепи, с сигналами атомов известных ИГН (3-8). Сигналы в спектре ЯМР 1Н в виде квартета при б 2.41 м.д. интенсивностью 2Н и триплета при б 1.18 м.д. интенсивностью ЗН, имеющие КССВ J=7.65, свидетельствует о том, что ацильный заместитель при С-11 в соединении 9 состоит из остатка пропионовой кислоты. Таким образом, соединение 9 является новым производным шиконина -пропионилшиконином, а его структура установлена как (Я)-1-(5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинон-2-ил)-4-метилпент-3-енилпропионат. Из фракции, содержащей ИГБФ, были выделены и идентифицированы: эхинофуран (10), эхинофуран В (11),

он о

Д/З-диметилакрилизогексенилбензохиноилфуран (12), изобутирилизогексенилбензохинонилфуран (13) и бензохинонилфуран (14).

а также два новых -изовалерилизогексенил-

R

10 ОСОСНз

11 Н

12 ОСОСН=С(СНз)2

13 ОСОСН(СН3)2

14 0С0СН2СН(СНз)2

Структуры соединений 10-14 определены на основании анализа их спектров ЯМР 1Н и 13С и идентификации продуктов их щелочного гидролиза методами ГЖХ и масс-спектрометрии. Хинон 12 - первый представитель нового класса ИГБФ, впервые был выделен нами из корней L. erythrorhizon. Его структура установлена как (S)-1 -[5-(1,4-бензохинонил)-фуран-3-ил]-4-метилпент-3-енил-3-метилбут-2-еноат. Позднее японские авторы назвали это соединение эхинофураном С. Состав и относительное содержание хинонов в экстрактах корней L. erythrorhizon и его клеточной культуре определяли путем сопоставления в спектрах ЯМР 1Н интегральных интенсивностей сигналов метильных и метиленовых групп, принадлежащих ацильным заместителям. Количественное содержание хинонов определяли также методом ВЭЖХ (рис. 1).

Рис. 1. ВЭЖХ суммы ИГН (А, Б) и суммы ИГБФ (В, Г) в корнях (А, В) и клеточной культуре ВК-39 (Б, Г) L. erythrorhizon; К 520 (А, Б) и 437 (В, Г) нм.

и

Для этого были установлены поправочные коэффициенты (К) для каждого индивидуального соединения при А 520 и 437 нм относительно внутренних стандартов. В качестве внутреннего стандарта для определения содержания ИГН был выбран шиконин, для ИГБФ - шиконин и эхинофуран С.

Состав ИГН в корнях воробейника и клетках ВК-39 одинаков, а количественные соотношения хинонов - различны (рис. 1, табл. 1). В культивируемых клетках штамма ВК-39 преимущественно накапливаются эфиры шиконина 3-6 и 8. Содержание остальных нафтохинонов не превышает 7-10% от суммы ИГН. В Японской суспензионной культуре I. егуИ)гогЫюп преимущественно накапливаются шиконин (1), ацетилшиконин (3) и изобутирилшиконин (4) (табл. 1).

Таблица 1. Состав и относительное содержание ИГН (%) в корнях /.. егуМгогЫгоп, клеточном штамме ВК-39 и в японской суспензионной культуре

Вещество Корни (ВЭЖХ) Корни (ЯМР) ВК-39 (ЯМР) Суспензионная культура*

1 3.1 2.3 7.9 16-18

2 0.9 1.2 1.2 2-4

3 33.8 34.0 27.3 43-49

4 18.8 17.8 39.5 17-20

5 26.4 9.4 12.5 -

6 17.8 6.3 11-14

7 3.4 2.7 1.8 1-3

8 12.4 13.3 9.1 16-18

9 1.2 1.3 3.7 -

Примечание. *Yazaki К., Fukui H., Kikuma M., Tabata M. Regulation of shikonin production by glutamine in Lithospermum erythrorhizon cell cultures // Plant Cell Rep. 1987. V. 6, N2. P. 131-134.

Состав пигментов оранжевого цвета (ИГБФ) в корнях воробейника краснокорневого и клеточной культуре ВК-39 одинаков. Однако корни растения накапливают преимущественно эхинофуран С (12), а клетки штамма ВК-39 биосинтезируют хиноны 12-14 в одинаковых количествах (рис. 1, табл. 2).

Таблица 2. Состав ИГБФ (%) в корнях L. erythrorhizon и клеточном штамме ВК-39

Вещество Корни (ВЭЖХ) ВК-39 (ВЭЖХ) ВК-39 (ЯМР)

10 5.1 6.1 5.8

11 3.1 2.9 3.2

12 55.1 31.1 32.5

13 19.8 28.1 29.5

14 16.9 29.8 29.0

Для оценки суммарного содержания ИГН и ИГБФ в гексановых экстрактах из корней I. erythrorhizon и клеточной культуры ВК-39 использовали спектрофотометрический метод анализа. ИГБФ предварительно отделяли от эфиров шиконина высаживанием последних в виде комплексов с ацетатом меди. Концентрации нафтохинонов и бензохинонов находили по калибровочным кривым, построенным для очищенной суммы эфиров шиконина и эхинофурана С (12). Оптическую плотность растворов образцов ИГН определяли при А 520 нм в интервале концентраций от 10 до 50 мкг/мл, ИГБФ - при А 437 нм в интервале концентраций от 1 до 6 мкг/мл. Было установлено, что суммарное содержание ИГН и ИГБФ в гексановых экстрактах из клеток воробейника, выращенных в производственных условиях, составляет 80.1 ± 3.6 и 9.5 ± 0.4 % соответственно,

что значительно больше, чем в экстрактах из корней растения (67.2 ± 3.4 и 6.2 ± 0.6 % соответственно). Относительное содержание хинонов в клетках штамма ВК-39 выше, а растительных восков и других примесей в более чем 2.5 раза ниже, чем в корнях растения. Низкое содержание растительных восков в клеточной культуре является важной технологической характеристикой, обеспечивающей получение высокоочищенного шиконина и препаратов на его основе. В клеточной культуре воробейника краснокорневого ВК-39 на протяжении 20 лет культивирования сохраняются стабильное соотношение и количественное содержание хинонов. Установлено, что биосинтез хинонов происходит одновременно с ростом каллусов, при этом к концу культурального цикла клетки накапливают в 4 раза больше ИГН и ИГБФ по сравнению с 5-6-летними корнями растения.

2. Регуляция процессов роста и биосинтеза вторичных метаболитов в клеточной культуре ВК-39 иМоврегтит е/уМголЛ/гол

Изучено влияние компонентов питательной среды на рост и продуктивность клеточной культуры 1. егуН1гогЫгоп. Оказалось, что наибольшее влияние на изучаемые параметры оказывают сахароза, нитраты, ионы меди, а также фитогормоны. Определен оптимальный состав компонентов и их концентраций в продукционной питательной среде. Эта оптимизированная среда получила индекс МС-32 и была использована в дальнейшем для культивирования каллусов воробейника. Для увеличения продукции эфиров шиконина клетками ВК-39 /_. ег^ИгогЫгоп предпринято стимулирование фенилпропаноидного пути биосинтеза. С этой целью была проведена селекция культивируемых клеток /.. егуН1гогЫгоп, устойчивых к ингибитору роста 4-фторфенилаланину (4-ФФА). Селекцию клеток вели, постепенно увеличивая дозу ингибитора с 220 до 2170 мкМ в питательной среде. При каждом шаге селекции каллусы пассировали трижды и отбирали лучшие по продуктивности ИГН ткани. В результате последовательного отбора получена клеточная линия ВК-39Р, обладающая самым высоким ростом в присутствии 4-ФФА в питательных средах. Эта культура росла при концентрациях 4-ФФА 10-30 мг/л, при которых наблюдалось ингибирование роста исходной культуры ВК-39 (рис. 2), и сохраняла жизнеспособность при концентрации 4-ФФА 300 мг/л (2170 мкМ).

100

80

60

О 40

□ ВК-39 □ ВК-39Р

п

10 30 100

Концентрация 4-ФФА, мг/л

Рис. 2. Рост клеточных культур ВК-39 и ВК-39Р в присутствии 4-ФФА.

Культура клеток ВК-39Р, обладающая самым высоким ростом при содержании 4-ФФА в питательных средах, была выбрана для дальнейшего

исследования. Анализ содержания нафтохинонов в чувствительных и устойчивых к 4-ФФА линиях был начат только после того, как культуры каллусов были выращены на питательных средах без 4-ФФА (12 пассажей). В результате было установлено, что в линии ВК-ЗЭЯ ИГН накапливалось вдвое больше, чем в исходной культуре ВК-39 и в 7 раз больше, чем в корнях воробейника (1.8 % на сухую массу корней) (табл. 3).

По данным спектроскопии ЯМР 1Н и ВЭЖХ набор ИГН и пропорции между производными шиконина в культурах ВК-39 и ВК-ЗЭЯ сохранялись. В процессе длительного культивирования было установлено, что культуры клеток ВК-39 и ВК-39Я обладают высокой и устойчивой способностью к биосинтезу ИГН и ИГБФ, происходящему параллельно с накоплением биомассы.

Таблица 3. Продукция ИГН и накопление биомассы клеточными культурами 1. егуИтзгЬ 'яоп

Клеточная линия Свежая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Продукция ИГН, г/л Содержание ИГН, %

ВК-39 282 ±36 18.9 ±1.1 1.36 ±0.30 7.2 ±0.6

BK-39F . 295 ±32 21.0 ±1.5 2.64 ± 0.45 12.6 ±0.8

Примечание. Данные представлены как средние из пяти экспериментов.

Таким образом, получены клеточные культуры воробейника краснокорневого, которые являются хорошим сырьевым источником для промышленного получения хинонов в одну стадию культивирования, что имеет существенные экономические преимущества перед двухступенчатым культивированием, применяемым в настоящее время за рубежом.

3. Препарат "Масло шикониновое"

Биомасса клеточных культур ВК-39 и BK-39F была использована для создания нового препарата, названного "Масло шикониновое". Экспериментально показано, что препарат "Масло шикониновое" обладает выраженным противовоспалительным действием, основной механизм которого заключается в том, что он нормализует продукцию одного из ключевых медиаторов воспаления -у-интерферона.

Также была выявлена высокая противомикробная активность ИГН и ИГБФ, входящих в состав препарата "Масло шикониновое". Сумма хинонов из биомасс клеточных культур ВК-39 и BK-39F активно ингибирует рост грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, В. anthracoides), грибковую микрофлору (Candida albicans) и не оказывает влияния на грамотрицательные бактерии {Salmonella enteritidis). Антимикробное действие ИГН и ИГБФ в большинстве тестов выше, чем активность шиконина (2). Исследования на животных показали, что препарат "Масло шикониновое" не оказывает иммунотоксического действия и не обладает аплергенностью. При рекомендуемом способе применения - накожных аппликациях, препарат не вызывает изменений внутренних органов и тканей крыс, не оказывает канцерогенного, эмбриотоксического и тератогенного действия, не поступает в системный кровоток вследствие чрезвычайно низкой всасываемости через кожу. Поэтому его- терапевтическое действие ограничено местом нанесения аппликации.

Препарат "Масло шикониновое" зарегистрирован на территории Российской Федерации как средство косметическое для наружного применения: номер регистрации № 035/001921; ТУ 9158-001-02698186-98. Состав: 0.3% раствор суммы эфиров шиконина в стерильном растительном масле. На основании того,

что препарат "Масло шикониновое" обладает высокой противомикробной активностью и противовоспалительным действием, была изучена его эффективность при лечении таких заболеваний, как рожистые воспаления (булезная и булезно-некротическая формы), трофические язвы, микробная экзема, пиодермия, стрептодермия, инфицированные раны, острый наружный отит. При всех показаниях отмечено положительное терапевтическое действие препарата "Масло шикониновое". Терапевтическая эффективность препарата, приготовленного из клеточных культур ВК-39 и ВК-39Р егуИ1Г0гЫ20П, при лечении рожистых воспалений выявлена впервые.

4. Полифенолы из растений ЕпМсЫит Бепсеит и ШЬоврегтит егу^гогЫгоп и их клеточных культур

Из растения и клеточных культур Ег-1, Е-4 Е. ьепсеит выделены и идентифицированы полифенольные метаболиты: розмариновая кислота (15), (-)-рабдозиин (16а) и новый метаболит кофейной кислоты - эритрихин (17).

соон

166

В отличие от Е. ¡епсеит, растение I. егуШогЫюп и его клеточная культура ВК-39 наряду с розмариновой кислотой синтезируют (+)-рабдозиин (166), что подтверждено спектрами кругового дихроизма (рис. 3).

Строение нового соединения 17 было установлено спектральными методами. Его молекулярная формула СгвНгоОю была рассчитана из масс-спектра высокого разрешения (РАВМБ). В спектре ЯМР 1Н 17 обнаружены сигналы 10 ароматических протонов при б 6.75-8.32 м.д. и 6 сигналов протонов, принадлежащих гидроксильным группам при б 7.80-8.95 м.д. Анализ спиновых систем показал наличие трех ароматических колец в молекуле 17. Два из них были 1,3,4-тризамещенными, а третье представляло собой тетразамещенный нафталиновый фрагмент. Сигналы трех алифатических протонов при б 3.17, 3.24 и 5.40 м.д. образуют классическую спиновую систему АВХ-типа и принадлежат фрагменту кофейной кислоты (2Н-7", Н-8") молекулы 17. Отнесение сигналов ароматических протонов сделано на основании экспериментов СОЗУ-45 и (\ЮЕ. В углеродном спектре соединения 17 имеются сигналы двадцати шести атомов углерода, двенадцать из них принадлежат протонированным атомам, из них десять имеют ароматический характер.

Рис. 3. Спектры кругового дихроизма соединений 15-17.

Полное отнесение сигналов в спектре ЯМР 13С сделано на основании двумерных спектров ЯМР (НМВС, НЭОС). Конфигурация асимметрического центра при С-8" у эритрихина (17) была определена сравнением его КД спектров со спектрами розмариновой кислоты (15) (рис. 3).

Структура нового тримера кофейной кислоты эритрихина, относящегося к группе арилнафталиновых лигнанов, определена как (2Я)-3-(3,4-дигидроксифенил)-2-[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-2-нафтоилокси] пропановая кислота.

Следует отметить, что содержание розмариновой кислоты (15) и (+)- и (-)-рабдозиина (16а, 166) в клеточных культурах ВК-39 и Ег-1 превышает их содержание в растениях I. ег^ЬгогШгоп и Е. зепсеит в 2 и 66 раз соответственно (табл. 4).

Таблица 4. Содержание полифенолов (%) в растениях Е. зепсеит и ¿_. егуШогЫгоп и их клеточных культурах

Объект 15 16а, 166 17 Сумма полифенолов

Е. зепсеит

Каллусы* Е-4 2.04 ± 0.40 0.66 ± 0.22 0.04 ± 0.01 2.74 ± 0.34

Каллусы Е-4*** 5.30 ± 0.40 2.56 ±0.40 следы 7.86 ±0.01

Культура корней* Ег-1 4.50 ± 0.79 1.51 ±0.15 0.10 ±0.02 6.11 ±0.84

Корни растения** 0.07 ± 0.02 0.3210.12 следы 0.41 ±0.12

и егу(/7гог/71гоп

Каллусы* ВК-39 1.10 ±0.15 I 0.8210.08 - 1.9210.12

Корни растения** 0.66 ±0.19 | 0.07 ±0.03 - 0.7310.17

Примечание. * - средние данные восьми определений (в трех повторностях) в течение двухлетнего периода культивирования; ** - средние данные пяти измерений; *** - продукция каллусов Е-4 после селекции и добавления 5 мкМ метилжасмоната; следы - количество вещества < 0.003%; "-" - соединение не обнаружено.

В результате клеточной селекции линии Е-4 и использования индукторов вторичного метаболизма (метилжасмонат и глицерат меди) удалось увеличить продуктивность культуры клеток Е. зепсеит и довести выход метаболитов кофейной кислоты до 7.86% на сухой массу ткани (табл. 4).

Попытки использования методов генной инженерии, в частности, интеграция гена го/С из АдгоЬаМепит гЫгодепеэ в клетки растений сем.

Вогад1пасеае приводили к снижению накопления в них полифенолов в 1.5-2.9 раза.

5. Фармакологическая активность препаратов из биомассы клеточных культур ЕгНпсЫит зепсеит и Líí/70speгmum егуМгог/нгоп

Установлено влияние препаратов из клеточных культур воробейника (ПВ) и незабудочника (ПН) на функцию почек. Применение ПН в дозе 100 мг/кг/сутки в течение 30 суток облегчает и в некоторых случаях предотвращает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс (табл. 5).

Таблица 5. Влияние ПН на проявление симптомов гломерулонефрита у крыс

Группа (количество животных) Тяжесть состояния (выделение белка с мочой, мг/сутки), %*

отсутствие симптомов (<Ю) маловыраженные симптомы (10-30) средневыраженные симптомы (31-100) тяжелые симптомы (>100)

I (п=10) 100 0 0 0

II (п=14) 0 28.5 28.5 43

III (п=13) 23 16 38 23

Примечание. Группа I - интактные животные; группа II - животные с гломерулонефритом, получавшие крахмальную суспензию; группа Ш - животные с гломерулонефритом, получавшие крахмальную суспензию с порошком ПН (100 мг/кг/сутки в течение 30 дней); * - результаты представлены в % от общего числа животных в группе.

При длительном (до двух недель) применении препаратов ПВ и ПН рбнаружено усиление экскреторной функции почек, сопровождающееся диуретическим, калийуретическим и легким натрийуретическим эффектами (табл. 6). Возрастание диуреза, сопровождающееся уменьшением реабсорбции электролитов, на фоне повышения экскреции креатинина позволяет связать мочегонное действие препаратов воробейника и незабудочника с увеличением скорости клубочковой фильтрации и угнетением канальцевой реабсорбции.

Таблица 6. Влияние препаратов ПВ и ПН на экскреторную функцию почек у крыс

Показатель з сутки Контроль Дни введения препарата Через 2 дня"

3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13

ПВ (250 мг/кг/сутки)

Диурез 5.9±0.5 5.5±0.7 6.4±0.9 6.9±1.0 9.1±1.3* 9.7±1.6* 9.4±1.5* 9.2±1.3*

Натрий 48±4 53±9 55±8 76±13 59±6* 49±6* 56±5* 53±5*

Калий 523±38 481±68 634±73 607±83 845±73* 766±102* 921±108* 812±59*

Креатинин 27±3 28±4 32±4 33±4 47±6* 37±4* 39±6* 35±5*

ПН (100 мг/кг/сутки)

Диурез 7.4±0.5 10.1±1.3 12.0И.З 13.1±1.5* 15.1 ±1.6* 13.8±1.3* 14.6±1.6* 13.5±1.2*

Натрий 56 ±4 56±11 73±10 77±10* 81 ±6* 71 ±6 71±5* 75±5*

Калий 640±36 763±67 722±77* 755±77* 898±82* 929±101* 950±86* 900±81*

Креатинин 42±4 45±6 51±6 64±6* 65±5* 63±5* 67±7* 60±5*

Примечание. Диурез - мл; натрий, калий, креатинин - мкмоль; * - достоверное изменение (Р<0.05) по сравнению с контролем; ** - после окончания эксперимента.

На модели острого воспаления, индуцированного каррагенийом, препараты ПВ и ПН при их длительном предварительном введении (14 суток) показали выраженную противовоспалительную активность, проявившуюся в угнетении экссудации на пике воспалительной реакции (табл. 7).

Таблица 7. Влияние длительного (14 суток) предварительного введения препаратов ПВ (250 мг/кг) и ПН (100 мг/кг) на формирование каррагенинового отека конечностей крыс

Вид Часы наблюдения

1 2 4

экспери- Прирост, Угнетение Прирост, Угнетение Прирост, Угнетение

мента отека, воспале- отека воспале- отека воспале-

см3 ния, % см3 ния, % см3 ния,%

Контроль 0.4910.04 - 0.55±0.04 - 0.6710.05 -

ПВ 0.38±0.03* 22.4. 0.38±0.04* 30.9. 0.5510.06 17.9

ПН 0.35±0.03* 28.6 0.3510.04* 36.4 0.5010.05* 25.3

Примечание. * - различия достоверны (Р<0.05) по сравнению с контролем; подчеркнуты цифры, отражающие выраженную противовоспалительную активность; "-" - изменение не обнаружено.

Антизкссудативное действие препаратов ПВ и ПН можно связать с наличием в их составах комплекса полифенольных соединений, представленных олигомерами кофейной кислоты, противовоспалительное действие которых реализуется за счет стабилизации мембран клеток.

Таким образом, обнаруженные в эксперименте под действием препаратов ПВ и ПН усиление экскреторной функции почек и угнетение экссудативной стадии воспаления позволяют считать эти препараты перспективными при лечении воспалительных заболеваний почек.

6. Полифенольные соединения из древесины Мааск'т атигепэ/Б

В процессе многолетних детальных химических исследований спиртовых экстрактов, полученных из измельченной ядровой древесины М. атигепз15, было установлено, что основными компонентами экстракта являются растительные полифенолы, составляющие полифенольный комплекс древесины (ПФКД) маакии амурской.

В ПФКД обнаружены изофлавоны: генистеин (18), даидзеин (19), каликозин (20), псевдобаптигенин (21), формононетин (22), оробол (23), афромозин (24), текторигенин (25), ретузин (26), 5-метоксидаидзеин (27) и 2'-гидроксиформононетин (28).

Своеобразием маакии амурской, произрастающей в Приморье, является присутствие в ее древесине птерокарпанов - (6а/?,11аЯ)-маакиаина (29), (6аЯ,11аЯ)-медикарпина (30) и высокое содержание в ней мономерных стильбенов - резвератрола (31) и пицеатаннола (32).

В дополнение к изофлавонам, стильбенам и птерокарпанам из ядровой древесины М. атигепвя были выделены и идентифицированы еще восемь соединений, относящихся к разным классам природных полифенолов. К ним относятся изофлаванон - (±)-3-гидроксивеститон (33); изофлаван - (±)-веститол (34); флаваноны - нарингенин (35) и ликвиритигенин (36); минорные полифенолы - редкий а,4,2',4'-тетрагидроксидигидрохалкон (37) и восстановленный стильбен дигидрорезвератрол (38).

№ Я 1*1 (*2 Рз 1*4 1*5 1*6

18 Н н н ОН н н н

19 н н н н н н н

20 н н н н он СНз н

21 Н н н н осн2 н

22 Н н н н н СНз н

23 Н н н он он н н

24 н н ОСНз н н СНз н

25 н н ОСНз он н Н н

26 он н н н н СНз н

27 н н Н ОСНз н Н н

28 н н н н н СНз он

ОСН3

НО

29

30

ОН

'Ц]

31 Г*=Н

32 Р*=ОН

Л чон

Структуры выделенных индивидуальных полифенолов 19-39 определены методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, масс-спектрометрии и сравнением спектральных данных с данными, приведенными в литературе для этих соединений.

Наряду с мономерными полифенолами из полярных хроматографических фракций спиртового экстракта древесины маакии амурской выделены олигомерные полифенолы: изофлавоностильбен маакиазин (39) и стильбенолигнан мааколин (40), а также димерные стильбены (£)-сцирпусин А (41), (Е)-сцирпусин В (42), (Е)-маакин (43) и (£)-маакин А (44).

ОСНз

39

40

ОН

он

он

41 К=Н

42 (4=04

43

44

45

Их структуры также определены методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, масс-спектрометрии. (£)-маакин А (44) выделен впервые. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 44 было осуществлено методом селективного подавления дальних КССВ с протонами.

В процессе хроматографического разделения экстрактов маакии амурской на сорбентах с обращенной фазой в кислых водно-спиртовых средах при ультрафиолетовой детекции наряду с транс-стильбенами 41-44 были получены их цис-изомеры и кассигарол О (45). цис-Конфигурация у этих соединений была установлена из наличия в спектрах ЯМР 1Н характерных дублетов олефиновых протонов Н-а и Н-(3 с КССВ ^12 Гц в более сильном поле по сравнению с трансизомерами, для которых КССВ протонов Н-а и Н-(3 и=16 Гц.

Возможность изомеризации стильбенов в , процессе их выделения с использованием хроматографии низкого давления подтверждена облучением ультрафиолетом ртутной лампы спиртовых растворов индивидуальных димерных транс-стильбенов 41-44. цис-Изомеры этих соединений были получены с 50% выходом. В этих же условиях, но при нагревании до 50 °С спиртового раствора 42 с выходом 30% получено соединение 45.

С другой стороны, установлено, что в процессе анализа методом ВЭЖХ при А 254 и 280 нм кратковременное пребывание стильбенов в проточной кювете УФ-детектора не вызывало заметной изомеризации как мономерных, так и димерных транс-стильбенов. Кроме этого, метод ВЭЖХ позволил четко различить по временам удерживания (ВУ) нативные транс-стильбены и их модельные цис-изомеры. Следовательно, этот метод применим для анализа суммарных экстрактов из М. атигепв^. Многократный анализ этих экстрактов методом ВЭЖХ не обнаружил в них даже следовых количеств цис-стильбенов и 45. На основании этого следует признать, что димерные цис-стильбены и кассигарол О (45) не являются нативными компонентами данного растения. Они не образуются на стадии экстракции древесины и в процессе концентрирования экстрактов, а также при длительном хранении сухих экстрактов при дневном рассеянном свете.

Для анализа всех полифенолов, составляющих ПФКД, разработана методика хроматографического разделения его на силикагеле на две фракции -суммы мономерных (фракция А) и олигомерных (фракция Б) полифенолов (рис. 4).

экстракта маакии амурской. Номера пиков на ВЭЖХ соответствует номерам соединений, выделенных из древесины М. атигепБ/з.

Расшифровку хроматограмм и определение состава полифенолов, составляющих эти фракции, осуществляли с помощью заведомых образцов соединений и их смесей, а также использовали "метод добавок". В качестве внутреннего стандарта использовали государственный стандартный образец (ГСО) дигидрокверцетина.

Для уточнения структуры и определения абсолютной стереохимии мааколина (40) методом рентгеноструктурного анализа были определены молекулярная и кристаллическая структура его дибромпентаметильного производного 46. Производное 46 получено метилированием диазометаном 40 с последующим бромированием полученного перметилированного производного раствором брома в диоксане. Общий вид молекулы 46 и упаковка молекул в кристаллической структуре представлены на рис. 5.

Нумерация атомов в структуре 46 выбрана программой для обсчета данных рентгеноструктурного анализа.

Каждая из молекул 46, образующих ячейку кристаллической структуры, имеет по 4 асимметрических центра при атомах углерода С-7, С-8, С-10 и С-11 с попарно противоположными конфигурациями. Таким образом, кристаллическую структуру соединения 46 можно представить как рацемическую смесь двух энантиомеров, причем оба энантиомера имеют цис-сочленение пятичленных циклов при углеродных атомах С-7 и С-10. Аналогичное строение имеет исходное соединение - мааколин (40), а его структура установлена как рацемическая смесь двух энантиомеров: (3S,3aR,8S,8aR)- и (3R,3aS,8R,8aS)-3-(3,4-дигидроксифенил)-8-(4-гидрокси-3,5-диметоксифенил)-3,За,8,8а-тетрагидро-1Н-индено[1,2-с]фуран-5,7-диолов. Методом спектроскопии КД было определено, что олигомерные полифенолы 39-44 маакии амурской не обладают оптическим вращением и, следовательно, являются рацемическими смесями энантиомеров.

7. Изофлавоноиды из клеточной культуры Maackia amurensis

С целью разработки новой технологии для получения воспроизводимого источника изофлавоноидов и исследования путей их биосинтеза, в 1999 г. были получены первые клеточные культуры, из побегов, черешков, цветковой кисти, почек и корней маакии амурской. Изучено влияние различных регуляторов роста на накопление биомассы и полифенолов в клеточных культурах, подобраны условия их выращивания, позволяющие получить максимальный выход изофлавонов. Установлено, что все эти клеточные культуры продуцируют одинаковый набор изофлавонов и птерокарпанов: генистеин (18), даидзеин (19), формононетин (22), маакиаин (29) и медикарпин (30). В 2002 г. из проростков семян М. amurensis была получена новая культура клеток - штамм А-18. Анализ экстрактов сухих каллусов 1999 и 2002 гг. методом ВЭЖХ и ТСХ показал существенные различия в составах их компонентов. Клетки А-18 содержали девятнадцать изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны 18-22, 47 и птерокарпаны 29, 30, а также их moho-, ди- и малонилглюкозиды 48-58.

R,0.

48-56

ОН о 47 деррон

ORs

/З-й-глюкопиранозил (/З-D-Glc)

о о

малонил (mal)

№ Название соединений

48 4'-0-/8-0-глюкопиранозилдаидзин

49 4'-0-/3-0-глюкопиранозилгенистин

50 даидзин

51 З'-метоксидаидзин

52 7-0-/3-0-глюкопиранозилкаликозин

53 генистин

54 6"-0-малонилгенистин

55 ононин

56 6"-0-малонилононин

Структуры соединений 18-22, 47-58 установлены с использованием двумерной спектроскопии ЯМР, масс-спектрометрии и сравнением их спектральных данных с данными, приведенными в литературе для этих соединений. Отнесение сигналов в спектрах выполнено с использованием НМВС и НЭОС экспериментов.

Ri R2 R3 R4 Rs

/З-D-Glc H H ß-D-GIc H

ß-D-Glc OH H ß-D-GIc H

/З-D-Glc H H H H

jß-D-GIc H OCH3 H H

/З-D-Glc H OH CH3 H

/З-D-Glc OH H H H

/З-D-Glc OH H H mal

/З-D-Glc H H CH3 H

/З-D-Glc H H СНз mal

R,o.

or4

57, 58

/J-D-глюкопиранозил (Д-D-Glc)

о о

-^Й^он малонил (mal)

Ri

R2

57

58

(6aR, 11 аЯ)-6'-0-малонил-3-0-/3-0- 3 о D-GIc глюкопиранозилмаакиаин

(6аЯ,11аЯ)-6'-0-малонил-3-0-/3-0- 3 я d.q|c h глюкопиранозилмедикарпин

R3

0CH20 ОСНз

R4

6'-mal 6'-mal

Соединение 59 оказалось новым, ранее не известным птерокарпаном. Его молекулярная формула С25Н22О13 была рассчитана из масс-спектра высокого разрешения МАЛДИ. В этом спектре зарегистрирован пик иона [M+Na]+ при m/z 553.3900 (рассчитанное значение 553.4241). Из данных спектров ЯМР следовало, что в 59 присутствует моносахаридный остаток в форме /З-й-глюкопиранозида (6Н 4.84 д, J=7.55 Гц; 5С 100.4), присоединенный к птерокарпановому фрагменту в положении 3. Сигналы при 6Н 3.41 и 5С 167.8, 166.7 м.д. указывают на наличие малонильного заместителя в углеводном фрагменте при С-6'.

Анализ данных ЯМР 1Н и 13С показал совпадение сигналов, принадлежащих ароматическим и углеводному фрагментам 59 и 57. Молекулярная масса 59 была

меньше на 2 единицы, чем у 57, что предполагало наличие в молекуле 59 дополнительной двойной связи. Сигналы при 5Н 8.31 (с) и 5С 153.9 и 125.6 м.д. в спектрах 1Н и "С ЯМР указывают на положение двойной связи между Сб-Сба в пирановом цикле молекулы 59. Полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 1Н и 13С соединения 59 проведено на основании данных НЭСЮ и НМВС экспериментов (рис. 6).

Таким образом, структура соединения 59 установлена как б'-О-малонил-З-0-/3-0-глюкопиранозил-6,6а-дегидромаакиаин.

8. Биосинтез изофпавоноидов в клеточной культуре А-18 Maackia amurensis

Наши исследования показали, что по химическому составу полифенольные комплексы из ядровой древесины (ПФКД) и клеточной культуры (ПФКК) М. amurensis существенно различаются. Мономерные (31, 32) и димерные (41-44) стильбены, идентифицированные как главные компоненты ПФКД, не были найдены даже в минорных количествах в ПФКК А-18.

По составу полифенолов ПФКК гораздо беднее: в нем отсутствуют полифенолы 23-28, 33-38, выделенные из древесины М. amurensis. Биосинтез изофлавоноидов в клеточной культуре М. amurensis организован так, что изофлавоноиды 18-22, 29, 30 могут быть быстро метаболизированы в их конъюгированные формы 48-58. Напротив, в древесине М. amurensis заключительная стадия биосинтеза изофлавоноидов - образование глюкозидов и малонилгликозидов изофлавонов, не реализуется, вероятно, из-за отсутствия ферментов гликозил- и малонилтрансфераз, катализирующих эти реакции.

Динамика накопления полифенольных соединений клетками штамма А-18 М. amurensis представляет собой типичную сигмоидальную кривую с индукционным периодом (0-7 дней) и фазами экспоненциального (8-21 день), линейного (22-35 дней) и стационарного (36-50 дней) роста. Максимальное содержание изофлавоноидов отмечено к 45-му дню культивирования. После 50 дней культура постепенно стареет и погибает из-за исчерпания питательных веществ. Поэтому в дальнейшем период культивирования клеточной культуры А-18 составлял 45 суток (табл. 8).

Таблица 8. Содержание изофлавоноидов в клеточной культуре А-18 М. amurensis

Соединение Содержание изофлавоноидов (%) в сухих клетках в зависимости от возраста клеток (дней)

30* 40* 50** 60**

Сумма изофлавоноидов 0.342 1.151 1.690 1.129

Примечание.* - результаты измерений, получены на 2 образцах сухих каллусов; ** - результаты измерений, получены на 4 образцах сухих каллусов.

Качественный состав и количественное соотношение изофлавоноидов в культуре клеток А-18 анализировали методом ВЭЖХ на протяжении двух лет (2006-2007 гг.) (табл. 9).

Таблица 9. Содержание изофлавоноидов в клеточной культуре А-18 М. amurensis

Соединение Содержание изофлавоноидов*, % Среднее** содержание, %

март 2006 май 2006 декабрь 2006 февраль 2007 август 2007 октябрь 2007

Изофлавоны и их moho-, ди- и малонилглюкозиды

18 0.008 0.015 0.008 0.009 0.007 0.020 0.011 ±0.002

19 0.004 0.021 0.044 0.049 следы следы 0.020 ± 0.009

20 0.029 0.038 0.034 0.037 0.014 0.024 0.029 ± 0.004

21 0.016 0.030 0.038 0.043 - 0.041 0.028 ± 0.007

22 0.037 0.066 0.074 0.084 следы 0.055 0.053 + 0.012

47 0.058 0.064 0.027 0.029 0.013 0.028 0.037 ± 0.008

48 0.022 0.066 - 0.005 - следы 0.016 ±0.011

49 0.140 0.100 0.007 0.012 0.052 0.049 0.060 ± 0.021

50 0.047 0.083 0.051 0.067 0.076 0.053 0.063 ± 0.006

51 0.013 0.016 0.007 0.011 следы 0.007 0.009 ± 0.002

52 0.035 0.056 0.077 0.089 0.027 0.027 0.052 ±0.011

53 0.132 0.194 0.095 0.129 0.152 0.097 0.133 ±0.015

54 0.051 0.102 0.089 0.098 0.038 0.075 0.076 ±0.011

55 0.035 0.095 0.022 0.028 0.094 0.105 0.063 ±0.016

56 0.258 0.381 0.165 0.192 0.085 0.234 0.219 ±0.041

Птерокарпаны и их малонилглюкозиды

29 0.030 0.040 0.072 0.090 следы следы 0.039 ±0.015

30 0.054 0.056 0.040 0.046 следы 0.016 0.035 ± 0.009

57 0.121 0.231 0.487 0.619 0.101 0.130 0.282 ± 0.089

58 0.147 0.125 0.070 0.093 0.073 0.068 0.096 ±0.013

59 0.056 0.174 0.128 0.139 0.041 0.156 0.116 ±0.022

Сумма 1.293 1.953 1.535 1.888 0.773 1.233 1.437 ±0.178

Примечание. * - средняя проба из 10 образцов; следы - количество вещества <0.003%; "-" - количество вещества, не определяемое методом ВЭЖХ; ** -среднее из трех определений.

Показано, что клетки А-18 синтезируют свободные и глюкозилированные изофлавоны в соотношении -1:7, а свободные и глюкозилированные птерокарпаны в соотношении -1:5.

Соотношение между группами изофлавонов и птерокарпанов, а также свободных изофлавоноидов и их конъюгированных форм в культуре клеток сохранялось на протяжении всего периода наблюденияг

Эти результаты указывают на стабильный биосинтез изофлавоноидов культурой А-18. В течение двухлетнего периода клеточная культура без специального элиситирования постоянно синтезировала изофлавоноиды, среднее содержание которых на сухую массу клеток составляло около 1.44% (табл. 9), что сопоставимо с уровнем их накопления в ядровой древесине маакии амурской (1.57-1.83 % сумма стильбенов и изофлавонов).

Основные биотехнологические параметры клеточной культуры А-18 представлены в табл. 10.

Таблица 10. Производственные параметры клеточной культуры А-18

Свежая биомасса каллусов (г/л*) Сухая биомасса каллусов (г/л*) Продукция изофлавоноидов (мг/л*) Содержание изофлавоноидов (% на сухую массу)

234 ± 21 13.5 ±1.2 194117 1.44 ±0.18

Примечание. Данные представлены как средние (М±т) из 5 независимых экспериментов с 10 повторностями; * - масса на литр питательной среды.

Таким образом, культура клеток А-18 М. amurensis по важнейшему параметру "стабильность биосинтетической активности" соответствует требованиям рекомендации клеточных культур растений к промышленному использованию.

9. Сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенолов из древесины и клеточной культуры Maackia amurensis

Терапевтическую эффективность препаратов, приготовленных из ПФК древесины М. amurensis и биомассы клеток штамма А-18, оценивали по их влиянию на выживаемость животных, морфологические характеристики печени и биохимические показатели сыворотки крови в сравнении с препаратом карсил (табл. 11).

Таблица 11. Влияние ПФКК, ПФКД и препарата карсил на морфологические характеристики печени и биохимические показатели крови крыс при ССЦ-гепатите'

Показатели Экспериментальные группы

Интактные животные ССЦ-гепатит ССЦ-гепатит +ПФКД ССЦ-гепатит +ПФКК ССЦ-гепатит +карсил .

Нектротизированные гепатоциты, % 1.07±0.25 6.80±0.87* 3.52+0.69* 2.3U0.26* 6.60±0.75

Гепатоциты с дистрофией, % 0.53±0.19 9.84±0.57* 5.65Ю.71* 2:81±0.37* 5.95+0.48

Двуядерные гепатоциты, % 2.33±0.78 0.71±0.14* 1.58±0.40* 3.51Ю.27* 5.50±0.65

Плотность клеточного инфильтрата, на 1 мм2 9.4±1.6 80.4±7.8* 41.7±6.0* 25.6±3.9* 36.1±0.5

ACT, мккат/л 0.61+0.04 1.44±0.02* 1.1210.02* 1.1610.04* 1.15±0.03

АЛТ, мккат/л 0.62+0.03 1.38±0.06* 0.8910.03* 0.8710.03* 1.16±0.01

ЩФ, Е/л 290+38 914±48* 705137* 623143* 686 ±37

у-ГТФ, мккат/л 0.09+0.01 0.6610.06* 0.2810.04* 0.3010.03* - •

Холестерин, ммоль/л 5.61+0.33 10.2010.53* 6.73+0.18* 9.7710.91 9.1010.91

Белок, г/л 67.5±2.0 48.9+4.4* 65.710.8* 65.011.4* 60.0±1.6

Общие липиды, г/л 1.76+0.07 2.77+0.24* 1.9310.43* 1.9910.33* 2.06±0.12

Билирубин, мкмоль/л

общий 9.0+0.9 19.210.8* 13.410.6* 12.610.4* 12.9±2.3*

непрямой 2.0410.95 14.9012.02* 6.7610.85* 7.7010.43* 9.63±1.65*

Примечание. Данные представлены как средние (М+т) из 8-10 наблюдений; * - различия достоверны (Р<0.05): для ССЦ-гепатита - по сравнению с интактными животными, для исследуемых препаратов - по сравнению с ССЦ-гепатитом.

В группе животных, получавших препараты ПФКД и ПФКК в эффективной дозе 100 мг/кг внутрижелудочно за 2 часа до введения гепатотоксина, выживаемость животных составила 100%. Оба препарата препятствовали развитию морфологических и метаболических нарушений печени в сравнении с контрольной группой. Содержание некротизированных клеток снизилось в 1.9 и 2.9 раза, гепатоцитов с дистрофией - в 1.7 и 3.5 раза, количество двуядерных гепатоцитов возросло в 2.2 и 4.9 раза соответственно, что указывает на усиление процессов регенерации печени. Плотность клеточного инфильтрата уменьшилась в 1.9 и 3.1 раза соответственно, и он локализовался, преимущественно, периваскулярно. Значительно возросло количество гепатоцитов нормального строения и уменьшилось венозное полнокровие. Между гепатоцитами появляется молодая соединительная ткань с большим содержанием клеточных элементов -фибробластов и фиброцитов. Более эффективно восстанавливал гистоархитектонику печени ПФКК. Терапия полифенолами сопровождалась регрессом биохимических показателей. Оба препарата статистически равноэффективно уменьшали активность в крови ACT - в 1.3 и 1.2 раза, АЛТ - в 1.5 и 1.6 раза, ЩФ - в 1.3 и 1.5 раза, ГТФ - в 2.4 и 2.2 раза соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы. Содержание общего билирубина под влиянием этих препаратов снижалось по сравнению с контролем в 1.4 и 1.5 раза, непрямого - в 2.2 и 1.9 раза соответственно, общих липидов - в 1.4 раза, белка возрастало в 1.3 раза (табл. 11).

Таким образом, установлено, что ПФКК проявляет гепатопротективный эффект, сопоставимый с активностью полифенолов из ядровой древесины М. amurensis, и представляет интерес для дальнейшего исследования в качестве альтернативного источника новых гепатопротекгивных лекарственных средств. Учитывая, что ПФКК, в отличие от ПФКД, не содержит моно- и димерных стильбенов, можно утверждать, что именно изофлавоноиды обуславливают их гепатопротективное действие.

■ В отличие от ПФКК, ПФКД достоверно препятствовал развитию гиперхолестеринемии при ССЦ-гепатите, снижая содержание холестерина в 1.5 раза по сравнению с контролем. Из этого следует, что гиполипидемический эффект ПФКД обусловлен содержащимися в нем стильбенами.

10. Сравнительная оценка антиоксидантных свойств полифенолов из древесины Maackia amurensis и клеточной культуры А-18

Оценку антиоксидантных свойств ПФКД и ПФКК проводили на модели окислительного стресса, вызванного субплантарным введением животным 0.2 мл 3% раствора формалина. Типичный окислительный стресс, возникающий на пике воспалительной реакции, характеризуется резким повышением активности прооксидантной системы (показатели ТБРП и ОПА) с последующей активацией ферментов антиоксидантной защиты и интегративного показателя общей антиоксидантной активности (ОАА). Животным III и IV групп на протяжении 14 суток вводили внутрижелудочно ПФК из древесины маакии амурской и клеточной культуры в дозе 100 мг/кг в виде суспензии на 2% крахмальной слизи (табл. 12).

На фоне развития окислительного стресса оба препарата ПФКД и ПФКК в равной степени предотвращали активацию ПОЛ. При этом содержание ТБРП практически не отличалось от величины, характерной для интактных крыс. Показатель ОПА в случае применения ПФКК снижался до величин, характерных для интактных животных, а в III группе был почти вдвое ниже контроля, значительно уступая показателю интактных животных. Это свидетельствует об уменьшении количества свободных радикалов в плазме крови за счет их "гашения" полифенолами маакии амурской.

Таблица 12. Влияние препаратов ПФКД и ПФКК на оксидантный статус крови крыс и состояние антиоксидантной защиты

Показатель Группы животных

I II III (ПФКД) IV (ПФКК)

ТБРП, мкМ 2.5 ±0.2 4.2 ± 0.2* 2.3 ±0.2 2.4 ±0.2

ОПА, % 45.1 ± 1.1 60.1 ± 1.2* 31.1 ±1.2* 47.6 ±1.1

Каталаза, % 12.2 ± 1.3 22.4 ± 1.0* 20.5 ± 0.8* 14.3 ±0.7

СОД, % 16.9 ±0.8 28.3 ±1.0* 30.0 ± 0.8* 19.4 ±1.0

ГПО, Ед/мг НЬ 233 ±7 243 + 11 250 ±5 209 ±6

ОАА, % 73.7 ± 0.5 87.8 ± 0.9* 75.9 ±1.6 54.6 + 1.7*

Примечание. I - интактные животные; II - группа контрольные животные (окислительный стресс); * - достоверные изменения по отношению к интактным крысам, подчеркнуты достоверные изменения по отношению к контрольным животным.

Применение ПФКД существенно не повлияло на активность антиоксидантных ферментов, показатели которых практически не отличались от таковых в контрольной группе. При использовании препарата ПФКК было зафиксировано достоверное снижение по сравнению с показателями И группу активности каталазы, ГПО и СОД практически до уровня интактных животных.

Учитывая различия в химическом составе ПФК из нативного растения и из клеточной культуры, можно предположить, что стимулирование неферментативных факторов антиоксидантной активности, отмеченное в большей степени для ПФКД, обусловлено присутствием в нем стильбенов. Присутствие в ПФКК конъюгированных форм изофлавонов, вероятно, определяет снижение активности антиоксидантных ферментов под действием ПФК клеточной культуры. Таким образом, в результате сравнительного изучения антиоксидантных свойств ПФКД и ПФКК, установлено влияние обоих фитокомплексов М. атигепЫэ на свободно-радикальное окисление, сопровождающееся прямым подавлением активности свободных радикалов и активацией механизмов антиоксидантной защиты, особенно выраженное для полифенолов нативного растения (ПФКД).

11. Сравнительная оценка влияния полифенолов из древесины и клеточной культуры МаасШа атигепБ/Б на развитие экспериментального воспаления

Антифлогистический эффект препаратов ПФКД и ПФКК при их длительном введении был изучен на модели острой воспалительной реакции, индуцированной каррагенином. В этих условиях длительного (14 суток) предварительного введения препарата ПФКД приводило к существенному ослаблению формирования воспалительного отека лапы крыс, причем эффект препарата ПФКД приобретал статистическую значимость и достигал максимума (42.3%) уже через 1 час после инъекции каррагенина и несколько ослабевал к окончанию эксперимента. Напротив, предварительное введение препарата ПФКК не приводило к существенному ослаблению формирования воспалительного отека лапы крыс. Эффект препарата ПФКК на протяжении всего эксперимента колебался в пределах 6-10.5%, что не может быть признано выраженной противовоспалительной активностью (табл. 13).

Существенные различия в антиэкссудативных эффектах у этих антиоксидантных препаратов можно связать с имеющимися различиями в их химических составах полифенолов. Выраженное противовоспалительное действие препарата максар обусловлено присутствием • в составе его ПФК мономерных и димерных стильбенов.

Таблица 13. Влияние длительного (14 суток) предварительного введения препаратов ПФКД и ПФКК (100 мг/кг) на формирование каррагенинового отека конечностей крыс

Вид Часы наблюдения

1 2 4

экспери- Прирост, Угнетение Прирост Угнетение Прирост, Угнетение

мента см3 воспале- отека, воспале- см3 воспале-

ния, % см3 ния, % ния,%

Контроль 0.52±0.05 - 0.84±0.05 - 1.06±0.04 -

ПФКД О.ЗОЮ.ОЗ* 42.3 0.63±0.03* 25.0 0.73±0.04* 31.1

Контроль 0.38±0.021 - 0.66±0.040 - 0.91±0.036 -

ПФКК 0.34±0.023* 10.5 0.62±0.031* 6.1 0.83±0.029* 8.8

Примечание. * - различия достоверны (Р<0.05) по сравнению с контролем; подчеркнуты цифры, отражающие выраженную противовоспалительную активность;"-" - угнетение воспаления не обнаружено.

Учитывая выраженность раннего эффекта ПФКД и тот факт, что начальная фаза каррагенинового отека конечности у животных обусловлена влиянием флогистика на высвобождение ряда медиаторов воспаления (гистамин, брадикинин, серотонин), можно предположить, что антиэкссудативный эффект изучаемого препарата связан с подавлением выхода этих биологически активных веществ, возможно, за счет его мембраностабилизирующего действия.

12. Влияние препарата максар на состояние липидного обмена у крыс с алиментарной гиперлипопротеинемией IIa типа

Развитие алиментарной гиперлипопротеидемии (ГЛП) сопровождается усилением процессов ПОЛ в гепатоцитах на фоне снижения активности антиоксидантных ферментов в цитозоле этих клеток, вследствие чего происходит окислительная модификация ЛПНП и появление у животных атерогенных свойств. Очевидно, что блокирование ПОЛ в печени является необходимым условием снижения содержания циркулирующих в крови модифицированных липопротеинов и коррекции ГЛП. С этой точки зрения актуальным являлось использование природного антиоксиданта - препарата максар, усиливающего резервы антиоксидантной системы (АОС) организма для коррекции липидных нарушений.

В опытах использовали крыс-самцов линии Вистар массой 200-250 г. Животные контрольной группы I находились на обычном рационе питания по содержанию белков, углеводов, жиров и ХС. У крыс опытной группы II в течение 4 недель воспроизводили модель алиментарной ГЛП IIa типа путем кормления их разбалансированным рационом питания, обогащенным сливочным маслом (25% от рациона) и холестерина (ХС) (2.5% от рациона). Крысам III группы с ГЛП интрагастрально, за 30 мин до кормления, вводили измельченный и тщательно суспендированный в воде препарат максар в дозе 240 мг/кг массы тела в течение 35 суток.

У животных находившихся на атерогенном рационе, характер липидных нарушений соответствовал комбинированной ГЛП На типа, характеризующейся гиперхолестеринемией при нормальном или мало измененном уровне триглицеридов, увеличением содержания ХС ЛПНП, гипер-р-липопротеинемией и гипо-а-холестеринемией (табл.14). Увеличение содержания общих липидов в печени на 13% свидетельствовало о начале развития липоидоза за счет накопления основной фракции нейтральных липидов - триглицеридов. Наблюдаемый дисбаланс между уровнем ПОЛ и состоянием АОС в печени и крови подтверждал положение об усилении процессов пероксидации при развитии

ГЛП, характеризующейся значительным увеличением содержания продуктов ПОЛ на всех стадиях этого процесса (табл. 15).

Таблица 14. Липиды крови и печени крыс с алиментарной ГЛП

Показатель Группы животных

Контроль ГЛП ГЛП+максар

Кровь

Общий ХС, ммоль/л 1.48 + 0.07 2.68 ± 0.06* 1.78 ±0.02*

Триглицериды, ммоль/л 0.39 ± 0.03 0.47 ± 0.03 0.44 ± 0.01

ХС ЛПВП, ммоль/л 0.31 ± 0.07 0.23 ± 0.02 0.25 ± 0.02

ХС ЛПНП, ммоль/л 0.99 ±0.11 2.24 ± 0.08* 1.32 ±0.02*

Общие липиды, ммоль/л 2.04 ± 0.22 2.48 + 0.10 2.27 ±0.04 '

Коэффициент атерогенности 3.77 10.65 6.12

Печень

Общие липиды, мг/г ткани 3.58±0.07 4.05 ± 0.8* 3.52 ± 0.09*

Фракции нейтральных липидов, % от суммы

ХС 16.80 ±0.56 13.84 ±0.82** 12.57 ±0.33

Свободные жирные кислоты 16.07 ±0.44 16.52 ±0.58 16.62 + 0.37

Триглицериды 22.28 ±0.51 26.04 ± 0.82* 22.76 ±0.91**

Эстерифицированные жирные кислоты 14.26 ±0.95 15.20 ±0.58 14.49 ±0.09

Примечание. Различия достоверны: * - Р<0.01, ** - Р<0.05 по сравнению с контролем для ГЛП и по сравнению с ГЛП для ГЛП+максар. Данные представлены как средние значения (М±т) из 7 наблюдений.

В печени интенсификация процессов ПОЛ была более выражена (табл. 15). Об истощении резервов АОС печени в результате компенсаторных затрат свидетельствовало уменьшение содержания а-токоферола (а-ТФ), основного антиоксиданта витаминного звена, снижение функциональной активности звена "глутатионпероксидаза - восстановленный глутатион", тормозящего образование липопероксидов, и активности глутатионредуктазы, катализирующей реакцию восстановления окисленного глутатиона. Наблюдалось угнетение линий защиты АОС и системы биорегенерации окисленного глутатиона.

Таблица 15. Показатели системы ПОЛ-АОЗ (% к контролю) в печени и крови животных с моделью алиментарной ГЛП

Показатель Печень Кровь

ГЛП ГЛП+максар ГЛП ГЛП+максар

Восстановленный глутатион 61.8* 75.7* 72.2* 40.6*

Глутатионредуктаза 68.3* 96.3* 48.1* 63.1* .

Глутатионпероксидаза 82.4 86.8 105.5 71.5*

Диеновые конъюгаты 251.7* 212.4* 188.8* 128.5*

МДА 225* 151.2* •174.7* 129.8*

а-ТФ 75.6* 83.4* 64.3* 74.4**

Примечание. Различия достоверны: * - * - Р<0.01, ** - Р<0.05 по сравнению с контролем для ГЛП и по сравнению с ГЛП для ГЛП+максар. Данные представлены как средние значения (М±т) из 7 наблюдений.

В крови процессы ПОЛ, оцениваемые по уровню продуктов окисления, протекали менее интенсивно, чем в печени, что обусловливало достаточность функционирования второй линии защиты АОС (табл. 15). Происходило более интенсивное расходование а-ТФ, чем в печени. Снижение активности

глутатионредуктазы и уменьшение содержания восстановленного глутатиона в крови крыс наблюдалось на фоне практически неизмененной активности глутатионпероксидазы. Ответная реакция АОС крови выражалась в активации второй линии ее защиты - обезвреживании липидных радикалов а-токоферолом.

У крыс с ГЛП, получавших максар, отмечалась нормализация состояния липидного фона крови и печени. Наиболее выраженное действие максара установлено в отношении уровня общего ХС и ХС ЛПНП, содержание которых уменьшалось на 33 и 41% соответственно. Прослеживалась тенденция к уменьшению содержания триглицеридов, общих липидов крови, снижался коэффициент атерогенности. Введение максара оказывало липидкорригирующее действие в отношении липоидоза печени. Содержание общих липидов уменьшилось на 13%, фракции триглицеридов - на 12.5%.

Выявлено ослабление интенсивности процессов ПОЛ в печени и крови животных, получавших максар, что проявлялось уменьшением содержания начальных, промежуточных и конечных продуктов окисления липидов (табл. 15). Как в печени, так и в крови отмечалось возрастание активности глутатионредуктазы на 41 и 37% соответственно. В печени активность глутатионредуктазы приближалась к показателям контрольной группы животных. При действии максара у животных достоверно повышалось содержание восстановленного глутатиона и а-ТФ в печени. Увеличение содержания а-ТФ происходило до контрольных значений. Активность фермента глутатионпероксидазы в крови животных с ГЛП при включении в рацион питания животных максара достоверно снижалась при одновременном уменьшении содержания восстановленной формы глутатиона. Это объясняется участием полифенолов, входящих в состав препарата максар, в процессе инактивации свободных радикалов и частичной заменой функциональной активности звена "глутатионпероксидаза - восстановленный глутатион" антиоксидантным действием препарата максар.

Таким образом, введение животным с алиментарной ГЛП На типа препарата максар, содержащего природные полифенольные антиоксиданты, способствует ослаблению процессов ПОЛ в печени и крови, повышению резервов АОС организма, коррекции нарушений липидного обмена крови и липоидоза печени.

13. Противоопухолевая и антимикробная активность полифенолов Maackia amurensis

Обнаружено, что ПФКД проявляет более выраженное противоопухолевое действие в отношении опухолевых клеток рака кишечника человека НТ-29 и DLD-1 в сравнении с изофлавоном генистеином (18) (рис. 7).

Результаты экспериментов показали, что препарат "Маакии амурской экстракт сухой" (ПФКД) ингибирует на 50% по сравнению с контролем рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 и НТ-29 в концентрациях 4.1 и 8.8 мкг/мл соответственно.

Препарат из древесины М. amurensis в дозе 25 мкг/мл проявил себя как эффективное противомикробное средство в отношении всех изученных штаммов представителей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры и грибов: Pseudomonadas aeruginosa ГИСК 453; Escherichia coii, Staphylococcus aureus, Candida albicans.

Концентрации препаратов (мкг/мл)

Рис. 7. Ингибирование роста колоний клеток рака кишечника человека НТ-29 ПФКД и генистеином.

Наличие антимикробной активности у полифенолов из М. атигепвя является весьма полезным свойством при производстве субстанции и лекарственной формы препарата максар.

14. Доклиническое изучение препарата максар

На основании экспериментов по доклиническому исследованию и изучению специфической фармакологической активности, ПФКД маакии амурской предложен в качестве нового лекарственного средства, названного препаратом "Максар®" (максар).

Установлено, что препарат максар характеризуется малой острой и хронической токсичностью, не имеет мутагенного, эмбриотоксического, тератогенного, иммунотоксического и аллергизирующего эффектов. Получено разрешение Минздрава РФ от 24.10.1996 г на проведение клинических испытаний препарата максар у взрослых в качестве гепатопротективного средства в лекарственной форме таблетки.

Кроме вышеперечисленных фармакологических эффектов, максар обладает антитромбогенным и антитромбоцитарным действием. В условиях овариоэктомии у крыс он ослабляет агрегацию тромбоцитов, уменьшает коагуляционные свойства крови и потенцирует антиагрегантную активность сосудистой стенки. Эндотелийпротективный эффект препарата максар осуществляется модуляторами эстрогеновых рецепторов - изофлавоноидами и стильбенами, входящими в его состав.

Кроме этого, препарат ограничивает процессы ПОЛ, препятствует снижению содержания общих липидов, способствует нормализации соотношения липидов и белка, а также устраняет рост лизофосфолипидов в мембранах эритроцитов у овариоэктомированных животных. Эти эффекты способствовуют улучшению вязкоэластических свойств эритроцитов и, следовательно, нормализации показателей клеточной реологии крови.

При экспериментальном синдроме Рейе максар нормализует активность ферментов печеночного происхождения, содержание билирубина, глюкозы и МДА в крови, стимулирует образование кетоновых тел и детоксикацию аммиака, восстанавливает нормальную гистологическую структуру печени и коры большого

мозга. Максар при хроническом ССЦ-гепатите у крыс усиливает ингибирующее влияние преднизолона на пролиферацию фиброзной ткани в печеночных дольках, синтез коллагена, гликозаминогликанов и аккумуляцию липидов в печени.

Он также оказывает антиоксидантное действие при экспериментальном сахарном диабете, индуцированном аллоксаном.

15. Изучение клинической эффективности и безопасности препарата максар

Клиническое изучение препарата "Максар® таблетки, покрытые оболочкой 60 мг" проведено в соответствии с программой клинических испытаний, утвержденной Министерством здравоохранения и социального развития. Препарат назначали 36 больным хроническим гепатитом и циррозом печени вирусной и алкогольной этиологии по 0.12 г 3 раза в день за 30 минут до еды (возраст больных от 18 до 70 лет). 10 пациентов контрольной группы получали препарат сравнения - карсил по 0.07 г 3 раза в день. Курс лечения гепатопротекторами продолжался 4 недели. Через 2-3 дня приема препарата максар наступало значительное улучшение состояния больных - повышалась работоспособность, уменьшались боль и диспептические расстройства. Максимальный клинический эффект препарата наступал через 2 недели курсовой терапии. Он сохранялся в последующие недели наблюдения. Терапия карсилом лишь через 3 недели приводила к умеренному ослаблению клинических симптомов заболеваний печени.

После терапии препаратом максар в течение двух недель активность трансаминаз, ЩФ и содержание билирубина значительно снижались. В течение последующих двух недель возрастало количество альбуминов, продолжала уменьшаться активность АЛТ (дополнительно в 1.8 раза), ЩФ (в 1.3 раза) и содержание непрямой фракции билирубина (в 2 раза) (табл. 16).

Таблица 16. Динамика биохимических показателей крови у больных хроническим гепатитом и циррозом печени при лечении препаратами максар и карсил

Показатели До лечения Через 2 недели Через 4 недели

максар карсил максар карсил максар карсил

Общ. белок, г/л 69.4±3.1 70.3±2.4 70.212.8 71.612.1* 74.512.2* 72.411.5*

Альбумины, г/л 40.2±1.7 41.5±1.2 41.311.8 41.711.6* 46.812.2* 43.312.4*

Глобулины, г/л 29.3±1.5 29.7±1.4 29.312.0 30.511.8* 28.512.0* 29.111.8*

ACT, Е/л 64.8±5.6 57.5±6.4 51.2±3.9* 52.414.9* 48.014.6* 47.812.2*

АЛТ, Е/л 95.7±8.4 96.5±9.1 73.215.1* 81.719.0* 41.412.1* 51.313.4*

ЩФ, Е/л 180.6±9.8 176.4±8.5 120.315.8* 152.619.4* 94.517.8* 140.219.7*

Глюкоза, нмоль/л 4.3Ю.5 4.610.3 4.4+0.5* 4.410.5* 4.1±0.2* 5.010.3*

Фибриноген, г/л 2.3±0.3 2.510.4 3.5+0.2* 3.710.3* 4.010.3* 3.510.1*

Протромбино-вый индекс, % 78 80 90 85 100 92

Билирубин, мкм/л

непрямой 21.2+0.8 18.611.0 10.310.7* 17.1Ю.4* 4.8+0.1* 5.110.2*

прямой 24.610.6 22.710.5 13.610.7* 18.411.3* 9.610.3* 12.410.2*

Примечание. . Данные представлены как средние значения (М±т) из 8-10 наблюдений; * - различия достоверны (Р<0.05) по сравнению с исходным уровнем.

Терапия препаратом максар приводила к уменьшению содержания МДА в крови у 82% больных хроническим гепатитом (в 1.7 раза) и у 72% больных циррозом печени (на 23%). Антиоксидантный эффект развивался через 14-16

дней курсового приема. Карсил незначительно уменьшал уровень МДА в крови у 57% пациентов (табл. 17).

Максар как эффективное желчегонное средство стимулировал экскреторную функцию печени. У больных хроническим гепатитом и циррозом печени содержание в желчи билирубина снижалось в 2.6 раза, желчных кислот - в 2.4 раза, холестерина - в 1.7 раза, фосфолипидов - в 2.9 раза.

Таблица 17. Влияние препаратов максар и карсил на содержание МДА (мкмоль/л) в крови больных хроническим гепатитом и циррозом печени

Группы больных До лечения После лечения

максар карсил Максар карсил

Хронический гепатит 7.04±0.82 5.06±0.36 4.1410.24* 4.7010.10*

Цирроз печени 6.54+0.52 4.85±0.17 5.3010.13* 4.6110.09*

Примечание. Данные представлены как средние значения (М±т) из 8-10 наблюдений; * - различия достоверны (Р<0.05) по сравнению с исходным уровнем.

В результате терапии препаратом максар значительно повышалась экскреция из крови в желчь билирубина, желчных кислот, липидов (табл. 18). Максар восстанавливал нарушенные при хроническом гепатите и циррозе печени процессы свертывания крови. Биохимически было установлено повышение протромбинового индекса и содержания фибриногена в крови (табл. 16).

Таблица 18. Влияние препарата максар на биохимические показатели желчи больных хроническим гепатитом и циррозом печени

Показатели (ммоль/л) Здоровые Больные хроническим гепатитом

До лечения После лечения

Билирубин 668.7 1 34.5 249.719.8* . 281.3И1.1**

Желчные кислоты 21.3 ± 1.1 9.010.7* 11,410,9**

Общие липиды 7.5 ±0.4 6.1Ю.1* 6.5+0.2**

Холестерин 2.2 ±0.1 1.4+0.1* 1.710.1**

Фосфолипиды 4.6 ± 0.2 1.7±0.1* 2.2±0.2**

Примечание. * - различия достоверны (Р<0.05) для показателей у больных по сравнению с показателями у здоровых людей; ** - различия достоверны (Р<0.05) по отношению к показателям после лечения максаром. Количество здоровых людей - 14, количество больных - 36.

Под влиянием терапии препаратом максар размер печени полностью нормализовался у 50% больных, значительно уменьшался у 36% больных. При применении карсила патологические изменения становились менее выраженными через 3 недели, размер печени уменьшался только у 40% пациентов. Максар не оказывал нежелательное побочное действие и хорошо переносился всеми пациентами.

Таким образом, препарат "Максар® таблетки, покрытые оболочкой 60 мг" при курсовом применении обладает гепатопротективной активностью у больных хроническим гепатитом вирусной и алкогольной этиологии с различной активностью процесса в печени. Гепатозащитный эффект препарата максар более выражен при алкогольной этиологии гепатита по сравнению с вирусной. На основании результатов клинической апробации препарат максар рекомендован в качестве гепатопротектора для медицинского применения и промышленного выпуска.

16. Стандартизация препарата максар

Субстанцию для препарата максар получали из экологически чистого сырья - ядровой древесины маакии амурской. По внешнему виду она представляет собой порошок темно-коричневого цвета с блеском, слабым смолистым запахом, характерным для сырья; имеет способность к комкованию. Максар чувствителен к свету. Это свойство препарата обусловлено наличием в его составе таких химически активных соединений, как стильбены и димерные стильбены. Для установления подлинности субстанции и препарата максар использовали методики ТСХ и ВЭЖХ определения веществ, специфичные для этих препаратов. На ТСХ регистрировали количество пятен, их окраску и положение (Р?() на пластинке; на ВЭЖХ - относительные времена удерживания (ОВУ) веществ по сравнению со временем удерживания внутреннего стандарта, в качестве которого использовали ГСО дигидрокверцетина (рис. 8). В обеих методиках хроматографированию подвергали растворы препаратов, приготовленные для количественного определения.

mAV- 5 4 I

« . . j Ii 1 1 6 LLLa1.«A

о [ ■.....'.....■ ■ ■ ■ i.....■ I I—........ '. | ■ ■ . ■—......

О 10 20 30 40 50 мин 60

Рис. 8. ВЭЖХ компонентов бензольно-ацетоновой фракции препарата максар, элюированной с силикагелевой колонки: 1 - ГСО дигидрокверцетин, 2 -пицеатаннол (32), 3 - резвератрол (31), 4 - ретузин (26), 5 - генистеин (18), 6 -формононетин (22). Условия ВЭЖХ: колонка Hypersil ODS, 5 мкм; (250><4 мм); шестиступенчатое градиентное элюирование с увеличением содержания CH3CN в растворе СНзСООН (2%) от 0 до 70%; скорость потока - 1 мл/мин; А - 282 нм.

Расшифровку ТСХ и ВЭЖХ, определение Rf и ОВУ веществ осуществляли с помощью модельных соединений. На ТСХ четко проявляются три пятна, принадлежащие генистеину (18), резвератролу (31) и пицеатаннолу (32), на ВЭЖХ регистрируются не менее 16 пиков, из которых для подтверждения подлинности препаратов выбрали 5 пиков основных веществ, принадлежащих пицеатаннолу (32), резвератролу (31), ретузину (26), генистеину (18) и формононетину (22). Применение этих двух методов хроматографии дает возможность однозначно решить вопрос о подлинности препаратов.

Стандартизацию субстанции и препарата максар проводили по количественному содержанию основных действующих веществ - мономерных полифенолов (по общей сумме стильбенов и изофлавонов). Для этого была разработана методика, основанная на выделении суммы мономерных полифенолов из препарата в виде элюата на колонке с силикагелем в системе растворителей бензол-ацетон и последующим измерением собственного поглощения суммы изофлавонов (А 272 нм) и суммы стильбенов (А 320 нм).

Для каждой группы веществ были рассчитаны удельные коэффициенты поглощения Е]^. Содержание стильбенов (Х1) и изофлавонов (Х2) в расчете на сухую субстанцию, в процентах, вычисляли по формулам:

Р,-50-25-100 Р2-50-25-100 г

1~Е;*-ГП-(100-Щ' 2~Е;*-гт1-(100-Щ' ГД6

М - навеска субстанции в граммах;

Р1 - оптическая плотность испытуемого раствора при А 320 нм;

Р2 - оптическая плотность испытуемого раствора при А 272 нм;

Е™ - удельный показатель поглощения суммы стильбенов при А 320 нм;

Е™ -удельный показатель поглощения суммы изофлавонов при А272 нм;

\Л/ - потеря в массе при высушивании анализируемой пробы в процентах.

Сумму стильбенов и изофлавонов (X) вычисляют по формуле: X = Х-| + Х2, которая в субстанции должна быть не менее 19,8%. Кроме этого, нами модифицированы известные методы определения тяжелых металлов, мышьяка и других показателей применительно к сырью, субстанции и препарату максар. Исследована стабильность сырья, субстанции и препарата, определены сроки их годности и микробиологическая чистота. Установлены ограничительные нормативы содержания примесей и остаточного растворителя. Разработана оптимальная лекарственная форма препарата: "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг". Для определения диагностических признаков цельного сырья, были получены микрофотографии древесины на поперечном и продольном срезах (рис. 9).

Рис. 9. Микроскопия древесины м. амурской в продольном (А) и поперечном (Б) срезах (увеличено в 200 раз).

В продольно-тангентальном срезе ядровой древесины маакии амурской видны сосуды со спирально-пористым утолщением, веретеновидный сердцевинный луч и волокна либриформа. На поперечном срезе древесины у границы двух годичных слоев видны волокна либриформа, узкопросветные сосуды; в ранней древесине последующего года - часть широких просветов сосудов; сердцевинные лучи расширены на границе годичных слоев.

Все эти методы стандартизации препарата максар были использованы для разработки проектов ФСП: "Маакии амурской древесина", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг", которые прошли экспертизу ФГУ НЦ ЭСМП Росздравнадзора РФ.

17. Государственная регистрация препарата Максар®

В результате проведения многолетних работ по разработке и внедрению препарата максар было организовано производство его субстанции и лекарственной формы, расположенное в производственных помещениях химико-технологического участка (ХТУ) ТИБОХ ДВО РАН г. Владивосток и на ЗАО "Брынцалов А" г. Москва.

Разработаны технологические регламенты на производство субстанции и препарата "Максар® таблетки, покрытые оболочкой 60 мг". Осуществлены регистрация на территории Российской Федерации и государственный контроль качества, эффективности, безопасности препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг" (табл. 19).

Таблица 19. Государственная регистрация и лицензирование препарата "Максар®"

Нормативные документы (НД) Зарегистрированные НД

1 "Маакии амурской древесина ангро" ФСП 42-0170-2947-02

2 Регистрационное удостоверение Р №003286/01 от 12.04.2004

3 "Маакии амурской экстракт сухой" ФСП 42-0170-2948-02

4 Регистрационное удостоверение Р №003309/01 от 12.04.2004

5 "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг" ФСП 42-0170-3905-03

6 Регистрационное удостоверение Р №003294/01 от 12.04.2004

7 Опытно-промышленный регламент на препарат "Маакии амурской экстракт сухой" ОПР-02698170-02-03

8 Пусковой регламент на препарат "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг" ПУР 022698170-01-07

9 Инструкция к медицинскому применению препарата "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг"

10 Лицензия № 99-04-000243 от 31 октября 2006 г ТИБОХ ДВО РАН на производство, хранение и реализацию препаратов: "Маакии амурской древесина ангро" и "Маакии амурской экстракт сухой"

Осуществлен выпуск четырех промышленных партий препарата "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг", серии 011207, 021207, 031207 и 041207 в количестве 4110 упаковок (рис. 10).

Рис. 10. Образец препарата "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития подтверждает, что указанные лекарственные средства прошли процедуру государственного контроля качества, эффективности, безопасности и могут быть разрешены ТИБОХ ДВО РАН к выпуску в сферу обращения на территории Российской Федерации. (Решения о выпуске препаратов от 08.06.2005 г. и № 008-1874 от 06.10.2008 г).

18. Полифенолы Vitis amurensis

Из спиртового экстракта стеблей винограда амурского V. amurensis было выделено два мономерных стильбена - резвератрол (31) и пицеатаннол (32) и четыре димерных стильбена - (-)-е-виниферин (60), (-)-паплидол (61), (+)-ампелопсин А (62) и (+)-изоампелопсин F (63). Структурную идентификацию соединений 60-63 провели с использованием экспериментов ЯМР HSQC, НМВС и COSY, а также сравнением их спектров ЯМР 1Н и 13С со спектральными данными, приведенными для этих соединений в литературе. Из этих шести полифенолов в корнях винограда амурского присутствуют только три соединения 31, 32 и 62.

он

За

60 61

но

62 63

19. Клеточные культуры Vатигеп5к

Резвератрол (31) - замечательное природное соединение, имеющее огромный потенциал для использования в качестве кардиопротекторного и хемопревентивного средства в медицине. В связи с этим в последние годы во многих странах мира проводятся работы по поиску новых природных источников этого соединения. Одним из альтернативных источников его получения являются клеточные культуры, поэтому разработка биотехнологических подходов с целью увеличения биосинтеза этого уникального биологически-активного соединения является актуальной.

Методом ВЭЖХ было проанализировано накопление стильбена 31 в культурах клеток VI и У2, впервые полученных из молодых стеблей V. атигепз'я, собранных на юге Приморского края. Эти первичные клеточные культуры синтезировали резвератрол (31) в количествах, не превышающих 0.026% от сухой

массы клеток, что сопоставимо с уровнем его накопления в каллусах другого вида винограда V. чШега.

Методы селекции, а также элиситирование каллусов салициловой кислотой и метиловым эфиром жасмоновой кислоты (клеточные линии у2, УЗ и УЗ-1) оказались малоэффективными, так как биосинтез стильбена 31 оставался на низком уровне (табл. 20).

Таблица 20. Накопление биомассы и продукция резвератрола (31) в клеточных линиях V. атигеп^э

Линии каллусов Накопление биомассы,г Сухая биомасса, % Содержание 31, %

VI 3.3 ± 0.3* 4.7 1 0.2* следы

У2 2.8 ±0.3* 4.7 Ю.1* 0.026 ± 0.010*

УЗ 2.9 ± 0.2* 4.610.1 0.022 1 0.009*

УЗ-1 2.4 ± 0.4* 5.0 1 0.2* 0.023 1 0.009*

\Л/ 4.210.3 3.410.1 следы

УВ1 3.2±0.1* 4.410.1* следы

УВ2 1.5±0.2* 6.2 10.1* 3.15 Ю.ЗО*

Примечание. * - среднее из двух независимых экспериментов с 10 повторностями каждый; следы - количество вещества меньше 0.006%.

Существенное увеличение биосинтеза резвератрола (более чем в 100 раз) было достигнуто трансформацией клеточной культуры геном го/В из АдгоЬаЫепит гЫгодепеэ (рис. 11).

п>Ди 140 120 100 >0 00 40 10

тАЦ 600 500 400 300 200 100 0

а ч х |.....I . Л

Р в 10 15 30 25 30 35 40 43 МИН >

Б

0 Ю 15 20 25 30 35 40 45 МИН

Рис. 11. ВЭЖХ фракции полифенолов из клеточных культур V. атигепв/з У2 (А) и УВ2 (Б); 1 - дигидрокверцетин 2 - транс-резвератрол (31).

Трансгенные клеточные культуры получены трансформацией первичных каллусов У2. Для трансформации использовали "пустой" вектор А. 1ите(ааепз СУ3101/рМР90КК-рРС\/002 (контрольная культура УУ), а также штамм А. Ште!ааепз 6\/3101/рМР90НК, несущий конструкцию рРС\/002-го!В {трансгенные

культуры VB1 и VB2). Культура W по биосинтетическим характеристикам не отличалась от исходной культуры V2. Трансгенность и экспрессия гена roIB в полученных клеточных культурах VB1 и VB2 была доказана и оценена количественно. В культуре VB1 roIB экспрессировался на низком уровне, а в культуре VB2 на высоком. Количественный ВЭЖХ анализ показал низкое содержание 31 в клеточной культуре VB1. Напротив, биосинтез резвератрола в клеточной культуре VB2 был экстремально высоким - более 3% от сухой массы клеток (рис. 11, табл. 20).

20. Таксановые дитерпеноиды из клеточной культуры Taxus cuspidata

С целью поиска новых источников таксанов мы исследовали клеточные культуры, полученные из молодых побегов Т. cuspidata на их способность аккумулировать таксановые дитерпеноиды.

Из экстрактов клеточных культур Т. cuspidata с использованием колоночной хроматографии на силикагеле, сефадексе LH-20 и препаративной ТСХ выделили четыре C-14-оксигенированных таксана: таксюннанин С (64), юннаксан (65), юннанксан (66) и таксюннанин-78-ол (67). Структуры 64-66 были установлены сравнением спектров ЯМР 'Ни С со спектральными данными этих соединений, приведенными в литературе.

Строение нового соединения 67 установили на основании данных спектров ЯМР 1Н и 13С. Молекулярная формула C^H^Og была рассчитана из масс-спектра электронного удара. В этом спектре зарегистрирован пик иона [М]+ при m/z 520. Величина хим. сдвига протона при С-7 (б 3.90 м.д.) в протонном спектре 67 указывает на наличие кислородсодержащего заместителя при С-7. Сравнение данных ИК- и масс-спектров соединений 64 и 67 подтверждает, что соединение 67 содержит гидроксильную группу.

Сдвиг сигнала метильной группы при С-8 в 67 (б 0.75 м.д.) в более сильное поле по сравнению с его положением в 64 (б 0.84 м.д.) указывает, что гидроксильная группа в 67 расположена при С-7. Величина вицинальной КССВ между Н-7 и протонами при С-6 (4.90 и 11.9 Гц) однозначно определяют экваториальное положение гидроксильной группы в молекуле 67. Сравнение спектров ЯМР 13С соединений 67 и 64 также подтверждает положение гидроксильной группы при С-7 и ее ß-ориентацию в 67. Таким образом, структура соединения 67 установлена как 2а,5а,10р,143-тетраацетокси-7р-гидрокси-4(20),11-таксадиен.

Наряду с таксановыми дитерпеноидами растения рода Taxus содержат полифенолы - флавоноиды и лигнаны. Различными методами колоночной хроматографии из спиртовых экстрактов корней и древесины Т. cuspidata были

64 СОСНз

65 СОСН(СНз)СН2СНз

66 СОСН(СНз)СН(СНз)ОН

67 СОСНз

R2

Н Н Н

ОН

21. Лигнаны и катехины Taxus cuspidata

выделены 4 лигнана - (-)-секоизоларицирезинол (68), (+)-изотаксирезинол (69), (+)-изоларицирезинол (70), (+)-таксирезинол (71), и 2 катехина - (+)-катехин (72), (-)-эпикатехин (73). Структуры выделенных соединений 68-73 были установлены сравнением их спектральных параметров с данными, приведенными в литературе.

2 7 9

68

72

ПГ0Н

■'ОН

он

73

Для уточнения структуры и абсолютной стереохимии изотаксирезинола (69) было получено его производное - циклолигнан 74, последующее метилирование которого диазометаном дало триметиловый эфир циклолигнана (75). Структура лигнана 75 была установлена методом рентгеноструктурного анализа как (7'S, 8Я,8'/?)-3',4,4',5-тетраметокси-9,9'-Эпокси-2,7'-циклолигнан. Таким образом, было подтверждено, что асимметрические центры при углеродах С-7', С-8, С-8' в молекуле изотаксирезинола (69) имеют 7'S, 8 R, 8 'R конфигурации, соответственно. Кристаллографическая информация для 75 депонирована в Кембриджском банке Структурных данных № 285469.

22. Содержание лигнанов и катехинов в Taxus cuspidata

Методом ВЭЖХ было проведено определение содержания полифенолов в различных органах растений, собранных в Хасанском и Красноармейском районах Приморского края.

В древесине тиса (Хасанский район) накапливается наибольшее количество лигнанов 68-71, суммарное содержание которых составляет 5.44% на сухую массу древесины. В коре, стеблях и корнях растения содержание лигнанов и катехинов значительно ниже. Хвоя тиса содержит, в основном, катехины. В образцах растений, собранных на юге Приморского края (Хасанский район),

обнаружено значительно больше полифенолов, чем в образцах из северных районов (Красноармейский район) (табл. 21).

Таблица 21. Содержание лигнанов и катехинов в различных органах растения Т. cuspidata

Орган растения Содержание лигнанов и катехинов в сухих экстрактах, %

Хасанский район Приморья

68 69 70 71 72 73

древесина 1.15 1.96 0.29 2.04 - —

хвоя - 0.07 - - 0.80 -

стебли 0.05 0.06 - 0.03 0.78 0.13

кора - 0.06 - 0.05 0.34 0.79

корни 0.21 0.17 - 0.36 0.15 0.17

Красноармейский район Приморья

древесина 0.01 0.1 0.01 0.083 0.0003 -

хвоя - - - - 0.0004 0.001 •

стебли 0.001 0.01 - - - . -

кора - - - 0.003 0.08 0.15

корни 0.005 0.02 - 0.007 0.02 0.02

Примечание."-" - соединение методом ВЭЖХ не обнаружено.

В спиртовых экстрактах из клеточных культур Т. cuspidata методом ВЭЖХ, кроме таксановых дитерпеноидов, идентифицированы (+)-катехин (72) и (-)-эпикатехин (73).

23. Антиоксидантная и антирадикальная активности полифенолов из Taxus

cuspidata

Антирадикальную и антиоксидантную активности лигнанов и катехинов определяли по их способности улавливать свободный .радикал (ДФПГ) и ингибировать автоокисление линетола (табл. 22, рис. 13).

Антирадикальную активность оценивали по уменьшению оптической плотности раствора ДФПГ при К 517 нм в течение 10 мин. Результаты, полученные из ДФПГ теста, показали, что соединения 69, 72 и 73 являются наиболее активными среди испытуемых соединений. Причем соединение 69 проявило антирадикальную активность, сопоставимую с активностью а-токоферола. Антирадикальная активность полифенольных соединений из Т. cuspidata зависит от числа и взаимного расположения гидроксильных групп в молекуле (табл. 22).

Таблица 22. Антирадикальная активность соединений 68-74

Вещество 68 69 70 71 72 73 74 а-токоферол

п 0.6 2.3 0.7 1.1 1.9 1.9 0.9 2.6

Соединения 69, 71, 72 и 73 также в разной степени ингибировали автоокисление линетола, причем значительно эффективнее ионола. (-)-Секоизоларицирезинол (68) в концентрации 10"6 М не оказывал влияния на автоокисление линетола (рис. 12).

вэ

__70

-г- 68

О

5

10 . 15 20 25 Объем, мкл

30

Рис. 12. Автоокисление линетола в присутствии полифенолов 68-74 и ионола.

Сопоставляя данные по антирадикальной и антиоксидантной активности соединений 68-74, можно сделать вывод, что наибольшую активность проявляют полифенолы 69, 71-74, содержащие две гидроксильные группы в орто-положении в ароматическом фрагменте молекулы.

1. Показано, что клеточные культуры и корни иМозрегтит ег^ЬгогЫгоп продуцируют одинаковый набор пигментов - 9 эфиров шиконина и 5 производных бензохинонилфурана, из которых пропионилшиконин, эхинофуран С, изобутирил-й изовалерилизогексенилбензохинонилфуран выделены впервые, а их структуры установлены.

2. На основе клеточной культуры ВК-39Р I. ег^ЬгогЬкоп, продуцирующей до 12.6% изогексенилнафтазаринов на сухой вес клеток, разработан способ получения препарата "Масло шикониновое", зарегистрированного в РФ как средство косметическое для наружного применения. Показана терапевтическая эффективность этого препарата при лечении рожистых воспалений.

3. Из растения ЕпМсЫит вепсеит и его клеточных культур Ег-1 и Е-4 выделены и идентифицированы полифенольные метаболиты: (-)-рабдозиин, розмариновая кислота и новый метаболит кофейной кислоты эритрихин. Структура эритрихина определена как (2Я)-3-(3,4-дигидроксифенил)-2-[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-2-нафтоилокси]пролановая кислота. В отличие от Е. зепсеит, I.. егу^гогЫюп и его клеточная культура ВК-39 биосинтезируют (+)-энантиомер рабдозиина. Содержание рабдозиина и розмариновой кислоты в клеточных культурах воробейника и незабудочника превышает их содержание в растениях от 2 до 66 раз.

4. В условиях длительного применения препаратов из клеточных культур I. егу01го1Ыгоп (ПВ) и Е. Бепсеит (ПН) в дозах 250 и 100 мг/кг/сутки в течение 14 суток установлено усиление экскреторной функции почек и угнетение экссудативной стадии воспаления у подопытных животных. Применение препарата ПН в дозе-100 мг/кг/сутки в течение 30 дней достоверно уменьшает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс.

ВЫВОДЫ

5. Установлено, что основными компонентами древесины Maackia amurensis являются 27 растительных полифенолов, составляющих полифенольный комплекс препарата максар. К ним относятся изофлавоны -генистеин, даидзеин, каликозин, псевдобаптигенин, формононетин, оробол, афромозин, текторигенин, ретузин, 5-метоксидаидзеин, 2'-гидроксиформононетин; птерокарпаны - маакиаин и медикарпин; мономерные стильбены - резвератрол, дигидрорезвератрол и пицеатаннол; изофлаванон - (±)-3-гидроксивеститон; изофлаван - (±)-веститол; флаваноны - нарингенин и ликвиритигенин, а также

а,4,2',4'-тетрагидроксидигидрохалкон. В состав препарата входят также олигомерные полифенолы: изофлавоностильбен - маакиазин, стильбенолигнан -мааколин и димерные транс-стильбены - сцирпусин А, сцирпусин В, маакин, а также ранее неизвестный стильбен - маакин А. Все олигомерные полифенолы состоят из рацемических смесей энантиомеров.

6. Установлено, что препарат "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг" при курсовом применении обладает гепатопротективной активностью; проявляет более выраженный по сравнению с карсилом терапевтический эффект у больных хроническим гепатитом вирусной и алкогольной этиологии, полностью купирует или ослабляет основные клинические проявления заболевания. Кроме того, препарат проявил себя как эффективное желчегонное средство, улучшающее экскреторную функцию печени. Побочные эффекты и противопоказания к применению не выявлены. Препарат разрешен к медицинскому применению. Осуществлены промышленные выпуски,.регистрация на территории Российской Федерации и государственный контроль качества, эффективности и безопасности препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

7. Максар обладает рядом дополнительных полезных свойств. Его применение в экспериментах на животных и в клинике способствует коррекции нарушений липидного спектра крови и жировой дистрофии печени. Препарат проявляет антиоксидантное действие и препятствует развитию алиментарной гиперлипопротеинемии у животных. Максар снижает интенсивность образования в печени и крови продуктов перекисного окисления липидов и регулирует систему антиоксидантной защиты организма, преимущественно через глутатионзависимые ферментативные механизмы, восстанавливает резервы эндогенных антиоксидантов (а-ТФ) и улучшает детоксикацию гидропероксидных радикалов. При действии препарата в дозе 4.1 мкг/мл на клеточные линии DLD-1 и НТ-29 рака кишечника человека отмечено ингибирование образования колоний этих опухолевых клеток на 50% по сравнению с контролем.

8. Из клеточной культуры А-18, полученной из проростков семян М. amurensis, выделено и идентифицировано 19 изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны, птерокарпаны, а также их moho-, ди-, малонилглюкозиды и ранее неизвестный 6'-0-малонил-3-0-/3-0-глюкопиранозил-

б,6а-дегидромаакиаин. Определены основные биотехнологические параметры клеточной культуры А-18, способной стабильно продуцировать изофлавоноиды (до 1.9% на сухой вес клеток). В отличие от растения, клеточные культуры не содержат мономерных и димерных стильбенов.

9. Проведена сравнительная оценка гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и из' клеточной культуры М. amurensis. Показано, что препарат из клеточной культуры обладает выраженным гепатозащитным

действием, не уступающим по основным эффектам препарату из древесины. Гепатопротективная активность обоих ПФК обусловлена наличием в них суммы изофлавоноидов. Установлено влияние этих фитокомплексов на свободно-радикальное окисление, сопровождающееся прямым подавлением активности свободных радикалов и активацией неферментных механизмов антиоксидантной Защиты, особенно выраженное для полифенолов из нативного растения (ПФКД). Выраженное противовоспалительное действие обнаружено только у ПФК из древесины М. amurensis.

10. Из спиртового экстракта стеблей винограда амурского Vitis amurensis выделены и идентифицированы шесть индивидуальных полифенольных соединений: два мономерных стильбена - резвератрол и пицеатаннол и четыре димерных стильбена - (-)-Е-виниферин, (-)-паллидол, (+)-ампелопсин А и (+)-изоам'пелопсин F.

11. Показано, что клеточная культура V. amurensis, трансформированная геном rolB, способна продуцировать резвератрол с выходом 3.15% на сухой вес клеток.

12. Из древесины тиса Taxus cuspidata выделены и идентифицированы четыре лигнана - (-)-секоизоларицирезинол, (+)-изотаксирезинол, (+)-изоларицирезинол, (+)-таксирезинол и два катехина - (+)-катехин, (-)-эпикатехин. Определены их антиоксидантная и антирадикальная активности, а также содержание в различных органах растения.

13. Из клеточной культуры Т. cuspidata выделены и идентифицированы 3 известных таксановых дитерпеноида - таксюннанин С, юннаксан, юннанксан и один новый - таксюннанин-7|3-ол. Его структура определена как 2а,5а,10(3,140-тетраацетокси-7|3-гидрокси-4(20), 11 -таксадиен.

Основные публикации по теме диссертации

1'. Кривощекова О.Е., Федореев С.А., Денисенко В.А, Максимов О.Б., Горовой П.Г. Нафтохиноны Lithospermum erythrorhizon II Химия природ, соединений. - 1976.

- № 6. - С. 726-730.

2. Кривощекова О.Е., Федореев С.А., Денисенко В.А., Максимов О.Б. Новый хиноидный пигмент из Lithospermum erythrorhizon II Химия природ, соединений.

- 1977. - № 5.-С. 702-703.

3. Федореев С.А., Кривощекова О.Е., Денисенко В.А,, Горовой П.Г., Максимов О.Б. Хиноидные пигменты дальневосточных представителей семейства Boraginaceae II Химия природ, соединений. -1979. - № 6. - С. 625-630.

4. Денисенко В.А., Федореев С.А., Мищенко Н.П. Установление структуры нового хиноидного пигмента из Lithospermum erythrorhizon методом спектроскопии ЯМР 'Н и 13С. - Владивосток, 1979. - 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 27.06.79, № 2544.

5. Набиуллин А.А., Федореев С.А., Дешко Т.Н. Круговой дихроизм хиноидных пигментов из дальневосточных представителей семейства Boraginaceae II Химия природ, соединений. - 1983. - № 5. - С. 568-573.

6. Козыренко М.М., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Федореев С.А. Биосинтез производных шиконина в каллусной культуре Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. //Раст. ресурсы. - 1991.-T. 27, вып. 4. - С. 78-81.

7. Пат. 1707073 Российская Федерация, МКИ5 С 12 N 5/04, 5/00. Штамм культивируемых клеток растений Lithospermum erythrorhizon Sieb. et. Zucc. -

продуцент шиконина / Журавлев Ю.Н., Булгаков В.П., Писецкая Н.Ф., Козыренко М.М., Старун Т.В., Артюков A.A., Федореев С.А.; заявители и патентообладатели Биол.-почв. ин-т ДВО АН СССР и Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО АН СССР. - № 4822723/13; заявл. 16.04.90; опубл. 23.01.92, Бюл. № 3.-Зс.

8. Федореев С.А., Денисенко В.А., Кулеш Н.И., Красовская Н.П., Козыренко М.М., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Исследование химического состава хиноидных пигментов из клеточной культуры ВК-39 Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zucc. // Хим.-фарм. журн. - 1993. - T. 27, № 6. - С. 33-37.

9. Венгеровский А.И., Коваленко М.Ю., Арбузов А.Г., Головина Е.Л., Чучалин B.C., Соснина Н.В., Сапрыкина Э.В., Федореев С.А., Саратиков АС. Влияние гепатопротекторов растительного происхождения на эффекты преднизолона при экспериментальном токсическом гепатите // Раст. ресурсы. - 1998. - Т. 34, вып. 3.-С. 91-96.

10.Fedoreyev S.A., Vasilevskaya N.A., Veselova M.V., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Ozhigova I.T., Muzarok T.I., Zhuravlev Yu.N. A new C-14 oxygenated taxane from Taxus cuspidate cell culture // Fitoterapia. - 1998. - Vol. 69, N 5. - P. 430-432.

11. Пат. 2104027 Российская Федерация, МКИ® А 61К 35/78. Способ получения растительных полифенолов, обладающих гепатозащитным действием / Максимов О.Б., Кулеш Н.И., Федореев С.А., Глебко Л.И., Покушалова Т.В., Степаненко Л.С., Кривощекова O.E., Горовой П.Г., Саратиков A.C., Чучалин

B.C., Власова. Т.В.; заявитель и патентообладатель Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО РАН; опубл. 10.02.98, Бюл. №4. -4с.

12. Пат. 2141840 Российская Федерация, МПК6 А 61К 35/78, 31/35. Противовоспалительное и антимикробное средство "Масло шикониновое"- / Журавлев Ю.Н., Федореев С.А, Булгаков В.П., Музарок Т.И., Береснева Н.В., Головко Е.И.; заявитель и патентообладатель Биол.-почв. ин-т ДВО РАН. - № 97119408/14; заявл. 20.11.97; опубл. 27.11.99, Бюл. № 32! - 5 с.

13.Белобородова Э.И., Венгеровский А.И., Гайсаев P.O., Саратиков A.C., Федореев С.А. Новое гепатозащитное средство - максар II Сиб. журн. гастроэнтерологии и гепатологии. - 1999. - № 8. - С. 46-48.

14. Прищеп Т.П., Чучалин B.C., Хоружая Т.Г., Белова Л.С., Федореев С.А, Венгеровский А.И., Саратиков A.C. Рациональные лекарственные формы гепатопротекторов растительного происхождения // Фармация. -1999. - № 6. -

C. 33-34.

15. Кулеш Н.И., Максимов О.Б., Федореев С.А., Денисенко В.А, Глазунов В.П., Покушалова Т.В., Глебко Л.И. О нативности компонентов экстрактов древесины Maackia amurensis И Химия природ, соединений. -1999. - № 5. - С. 664-669.

16.Wei J.H., Liu S.Y. Fedoreyev S.A., Voinov V.G. A Study of resonance electron capture ionization on a quadrupole tandem mass spectrometer // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2000. - Vol. 14, N 18. - P. 1689-1694.

17.Fedoreyev S.A., Pokushalova T.V., Veselova M.V., Glebko L.I., Muzarok T.I. Seletskaya L.D., Bulgakov V.P., Zhuravlev Yu.N. Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis II Fitoterapia. - 2000. - Vol. 71, N 4. - P. 365-372.

18. Венгеровский А.И., Суходоло И.В., Чучалин B.C., Арбузов А.Г., Червякова М.Б., Мельник Ю.Ю., Гришина Е.И., Федореев С.А., Саратиков A.C. Гепатопротекторы оказывают лечебное действие при экспериментальном

синдроме Рейе // Эксперим. и клин, фармакология. - 2000. - Т. 63, № 5. - С. 68-71.

19. Bulgakov V.P., Kozyrenko М.М., Fedoreyev S.A., Mischenko N.P., Denisenko V.A., Zvereva L.V., Pokushalova T.V., Zhuravlev Yu.N. Shikonin production by p-fluorophenylalanine resistant cells of Lithospermum erythrorhizon И Fitoterapia. -2001. - Vol. 72, N 4. - P. 394-401.

20. Янькова В.И., Иванова И.Л., Федореев С.А., Кулеш Н.И. Антиоксидантное действие гепатопротектора максара при экспериментальном диабете // Эксперим. и клин, фармакология. - 2002. - Т. 65, № 4. - С. 33-36.

21.Янькова В.И., Гвозденко Т.А., Иванова И.Л., Федореев С.А., Кулеш Н.И. Состояние антиоксидантной системы у крыс с алиментарной гиперлипопротеидемией На типа при действии препарата Максар // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, № 9. - С. 267-270.

22.Федореев С.А., Кулеш Н.И., Глебко Л.И., Покушалова Т.В., Веселова М.В., Саратиков А.С., Венгеровский А.И., Чучалин B.C. Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской // Хим.-фарм, журн. - 2004. - Т. 38, №11.-С. 22-26.

23. Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология - здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке II Вестн. ДВО РАН. - 2004. - № 3. - С. 93-99.

24. Пат. 2244553 Российская Федерация, МПК6 А 61 К 35/78, 31/05, А61Р 1/16. Гепатопротекторное средство / Федореев С.А., Музарок Т.И., Селецкая Л.Д., Веселова М.В., Кулеш Н.И., Глебко Л.И, Покушалова Т.В., Чучалин B.C., Саратиков А.С., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н.; заявители и патентообладатели Биол.-почв. ин-т ДВО РАН, Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО РАН. - № 2003118009/15; заявл. 16.06.03; опубл. 20.01.05, Бюл. № 2. - 5 с.

25.Fedoreyev S.A., Veselova M.V., Krivoschekova О.Е:, Mischenko N.P., Denisenko V.A, Dmitrenok P.S., Glazunov V.P., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Zhuravlev Yu.N. Caffeic acid metabolites from Eritrichium sericeum cell cultures // Planta Med. - 2005. - Vol. 71, N 5. - P. 446-451.

26.Bulgakov V.P., Veselova M.V., Tchernoded G.K., Kiselev K.V., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Yu.N. Inhibitory effect of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene on rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum and Lithospermum erythrorhizon transformed cell cultures // Planta. - 2005. - Vol. 221, N 4. - P. 471478.

27.Саратиков A.C., Чучалин B.C., Ратькин A.B., Ратькин E.B., Федореев С.А., Булгаков В.П. Гелатопротекторные свойства полифенольных комплексов из древесины и клеточной культуры маакии амурской // Эксперим. и клин, фармакология. - 2005. - Т. 68, № 2. - С. 51 -54.

28. Брюханов В.М. Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Азарова О.В., Федореев С.А., Булгаков В.П., Зяблова О.Н., Макарова И.В. Фармакологическая активность препаратов клеточных культур некоторых растений семейства бурачниковые II Бюл. сиб. медицины. - 2006. - Т. 5, прил. 2. - С. 60-62.

29. Ратькин Е.В., Федореев С.А., Булгаков В.П., Чучалин B.C., Веселова М.В. Сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенольных комплексов ядровой древесины и клеточной культуры маакии амурской // Бюл. сиб. медицины. - 2006. - Т. 5, прил. 2. - С. 127-128.

30. Венгеровский А.И., Чучалин B.C., Буркова В.Н., Федореев С.А. ОпЫт разработки гепатопротекторов природного происхождения научной школой профессора А. С. Саратикова // Бюл. сиб. медицины. - 2006. - Т. 5, прил. 2. -С. 19-25.

31. Кулеш Н.И., Веселова М.В., Федореев С.А., Денисенко В.А. Полифенолы из стеблей Vitis amurensis // Химия природ, соединений. - 2006. - № 2. - С. 194195.

32. Веселова М.В., Федореев С.А., Василевская Н.А., Денисенко В.А., Герасименко А. В. Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного // Хим.-фарм. журн. - 2007. - Т. 41, № 2. - С. 29-34.

33.lnyushkina Y.V., Bulgakov V.P., Veselova M.V., Bryukhanov V.M., Zverev Y.F., Lampatov V.V., Azarova O.V., Tchernoded G.K., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Yu.N. High rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum callus cultures and the effect of the calli on Masugi-nephritis in rats // Biosci. Biotechnol. Biochem. -2007. - Vol. 71 ,N 5. - P. 1286-1293.

34.Азарова O.B., Брюханов В.П., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Макарова И.В., Булгаков В.П., Федореев С.А., Кривощекова О.Е., Веселова М.В. Фармакологическая активность препарата клеточных культур Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. (Boraginaceae) в эксперименте // Раст. ресурсы. -2007. - Т. 43, вып. 4. - С. 102-109.

35.Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J. Biotechnol. - 2007. - Vol. 128, N 3. - P. 681-692. ■

36. Bulgakov VP., Fedoreyev S.A., Kiselev K.V., Shkryl Y.N., Inyushkina Y.V., Mischenko N.P., Zhuravlev Y.N. Manipulation of secondary metabolism in cultured plant cells by agrobacterium rol genes // J. Biotechnol. - 2008. - Vol. 136. - P. S131.

37. Брюханов B.M., Булгаков В.П., Зверев Я.Ф., Федореев С.А., Лампатов В.В., Веселова М.В., Азарова О.В., Зяблов О.Н., Инюшкина Ю.В. Клеточная культура Eritrichium sericeum Lehm. (Boraginaceae) - источник полифенольных соединений, обладающих фармакологической активностью // Хим.-фарм. журн.

- 2008. - Т. 42, № 6. - С. 32-35.

38. Кулеш Н.И., Василевская Н.А., Веселова М.В., Денисенко В.А., Федореев С.А. Минорные полифенолы из древесины Maackia amurensis И Химия природ, соединений. - 2008. - № 6. - С. 575-577.

39.Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Плотникова A.M., Федореев С.А., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П. Влияние экстракта маакии амурской на липидный спектр и перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов после овариоэктомии у крыс // Экслерим. и клин, фармакология. - 2008. - Т. 71, № 6.

- С. 28-30.

40. Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P., Grishchenko O.V., Veselova M.V., Krivoschekova O.E., Kulesh N.I., Denisenko V.A., Tchernoded G.K., Zhuravlev Yu.N. Isoflavonoid composition of a callus culture of the relict tree Maackia amurensis Rupr. et Maxim // J. Agric. Food Chem. - 2008. - Vol. 56, N 16. - P. 7023-7031.

41. Fedoreyev S., Bulgakov V. Isoflavonoid composition of the Maackia amurensis callus culture//J. Biotechnol.-2008.-Vol. 136.-P. S140.

42.Саратиков A.C., Чучалин B.C., Ратькин A.B., Ратькин Е.В., Федореев С.А., Булгаков В.П. Гепатопротективные свойства полифенольных комплексов из древесины и клеточной культуры маакии амурской // Бюл. сиб. медицины. -2008.-Т. 7, №1. -С. 51-55.

43. Пат. 2326165 Российская Федерация, МПК А 61 К 35/78 (2006.01). Способ получения резвератрола / Федореев С.А., Киселев К.В., Дубровина A.C., Веселова М.В., Кулеш Н.И., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н.; заявители и патентообладатели Биол.-почв. ин-т ДВО РАН и Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО РАН - № 2006135294/13; заявл. 05.10.06; опубл. 10.06.08, Бюл. №

. 16.-5 с. „

44. Пат. 2342944 Российская Федерация, МПК А 61 К 36/48 А 61 Р 7/02 (2006 01). Средство, обладающее гемореологической ' и антитромбоцитарной активностью / Плотникова А.М., Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Федореев С.А.,

. Кулеш Н.И., Мищенко Н.П., Василевская H.A., Имбс Т.И., Глебко Л.И.; заявители и патентообладатели ГУ НИИ фармакологии Томского науч. центра СО РАМН, Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО РАН, Плотников М.Б. - № 2007121224; заявл. 06.06.07; опубл. 10.01.09, Бюл. № 1. -6 с.

45. Плотникова А.М., Шульгау З.Т., Плотникова Т.М., Алиев О.И., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П., Федореев С.А. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность экстракта из древесины маакии амурской // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, №2. - С. 164-167.

Соискатель

Федореев С.А.

Подписано в печать 24.03.2010 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2.0. Уч. изд. л. 2.0. Тираж 100 экз. Заказ № 209606

Отпечатано в Типографии «Краски» 690048, г. Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел.: 36-26-16,55-95-31, www.kpacku.com

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Хиноидные соединения растений сем. Вогадтасеае.

1.1.1 Введение в историю алканнина и шиконина----'.

1.1.2 Установление строения алканнина и шиконина.

1.1.3 Природные производные алканнина и шиконина и методы их идентификации.

1.1.4 Новые источники получения производных шиконина.

1.1.5 Биосинтез шиконина.

1.1.6 Биологическая активность изогексенилнафтазаринов.

1.1.6.1 Ранозаживляющие и противовоспалительные свойства изогексенилнафтазаринов.

1.1.6.2 Антимикробная и противовирусная активности изогексенилнафтазаринов.

1.1.6.3 Молекулярные механизмы антимикробных, противовоспалительных свойств ИГН при ранозаживлении---.

1.1.6.4 Противоопухолевая активность ИГН.

1.1.6.5 Клинические исследования изогексенилнафтазаринов.

1.1.6.6 Пролиферативный эффект алканнина и шиконина.

1.2 Полифенольные соединения растений сем. Вогадтасеае.

1.2.1 Розмариновая кислота и ее производные.

1.2.2 Биологическая активность метаболитов кофейной кислоты.

1.2.3 Биосинтез розмариновой кислоты.

1.3 Изофлавоноиды.

1.3.1 Структурные типы флавоноидов.

1.3.2 Структурные типы изофлавоноидов.

1.3.3 Номенклатура изофлавоноидов.

1.3.4 Распространение изофлавоноидов.

1.3.5 Способы выделения и сохранение нативности изофлавоноидов.

1.3.6 Биосинтез изофлавоноидов.

1.3.7 Биологическая активность изофлавоноидов.

1.3.7.1 Фитоэстрогенные свойства изофлавоноидов.

1.3.7.2 Рецепторы эстрогена.

1.3.7.3 Гормональная заместительная терапия изофлавоноидами.

1.3.7.4 Защитный эффект фитоэстрогенов против атеросклероза.

1.3.7.5 Кардиопротекторное действие изофлавоноидов.

1.3.7.6 Противоопухолевая активность изофлавоноидов.

1.3.7.7 Эффективность изофлавонов в предотвращении остеопороза.

1.3.7.8 Антиоксидантные свойства изофлавоноидов.

1.3.7.9 Гепатопротективные, противовоспалительные и антиалкогольные свойства изофлавоноидов.

1.3.7.10 Антимикробная активность 67 изофлавоноидов.

1.3.8 Биосинтез изофлавоноидов клеточными культурами растений.

1.3.9 Химический состав и биологическая активность полифенолов из 70 МаасМа атигепэ'гз.

1.3.9.1 Гепатопротекторы природного происхождения.

1.3.9.2 Гепатопротективные свойства полифенолов Маас/с/а атигепБ!^

1.3.9.3 Результаты клинических исследований препарата максар опубликованные в литературе.

1.4Стильбены.

1.4.1 Структурная классификация стильбенов.

1.4.2 Распространение стильбенов.

1.4.3 Биосинтез стильбенов.

1.4.4 Олигомеры резвератрола из корней Vitis amurensis.

1.4.5 Биологическая активность стильбенов.

1.4.5.1 Нейропротекторная, антиоксидантная и противовоспалительная 88 активность резвератрола.

1.4.5.2 Кардиопротекторная активность резвератрола.

1.4.5.3 Противоопухолевая активность резвератрола и родственных 90 стильбенов.

1.4.5.4 Гепатопротективная активность стильбенов.

1.4.6 Содержание резвератрола и родственных стильбенов в растениях 93 и их клеточных культурах.

1.5 Метаболиты Taxus cuspidata.

1.5.1 Противоопухолевые таксановые дитерпеноиды.

1.5.1.1 Строение и номенклатура таксановых дитерпеноидов.

1.5.1.2 Таксановые дитерпеноиды Taxus cuspidata.

1.5.1.3 Биологическая активность таксановых дитерпеноидов.

1.5.2 Лигнаны.

1.5.2.1 Строение и распространение в природе.

1.5.2.2 Номенклатура лигнанов.

1.5.2.3 Лигнаны рода Taxus.

1.5.2.4 Биологическая активность лигнанов.

1.5.2.5 Биосинтез лигнанов.

2 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1 Введение.

2.2 Культура клеток Lithospermum erythrorhizon.

2.2.1 Получение клеточной культуры ВК-39 Lithospermum erythrorhizon ■

2.2.2 Состав хиноидных соединений в клеточной культуре ВК-39 119 Lithospermum erythrorhizon.

2.2.3 Содержание ИГН и ИГБФ в клеточных культурах Lithospermum 122 erythrorhizon.

2.2.4 Регуляция процессов роста и биосинтеза вторичных метаболитов 125 в клеточной культуре ВК-39.

2.2.5 Повышение продукционных характеристик штамма ВК-39 посредством стимуляции шикимат-фенилаланинового 127 биосинтетического пути.

2.2.6 Содержание хиноидных пигментов в клеточных культурах при их 131 выращивании в промышленных условиях.

2.2.7 Препарат "Масло шикониновое".

2.2.7.1 Фармакологическая активность препарата "Масло шикониновое"

2.2.7.2 Терапевтическая эффективность препарата "Масло 135 шикониновое".

2.3 Полифенолы клеточных культур и растений Eritrichium sericeum и

Lithospermum erythrorhizon.

2.3.1 Выделение и установление структуры олигомеров кофейной кислоты из клеточных культур Eritrichium sericeum и Lithospermum erythrorhizon.

2.3.2 Определение содержания олигомеров кофейной кислоты в клеточных культурах Eritrichium sericeum и Lithospermum erythrorhizon методом ВЭЖХ.

2.3.3 Продукция олигомеров кофейной кислоты в трансформированных клеточных культурах Eritríchium sericeum и Lithospermum 146 erythrorhizon.

2.3.4 Получение высокопродуктивной каллусной культуры Eritríchium 147 sericeum методом селекции.

2.3.5 Антиоксидантная активность розмариновой кислоты и (-)- 149 рабдозиина.

2.3.6 Фармакологическая активность препаратов из биомассы 150 клеточных культур Eritríchium sericeum и Lithospermum erythrorhizon

2.3.6.1 Влияние ПН на крыс с гломерулонефритом.

2.3.6.2 Влияние препаратов воробейника и незабудочника на 152 экскреторную функцию почек у крыс.

2.3.7 Влияние препаратов ПВ и ПН из клеточных культур Lithospermum erythrorhizon и Eritríchium sericeum на развитие экспериментального 153 воспаления.

2.3.7.1 Антимикробная активность препарата из клеточной культуры 155 Eritríchium sericeum.

2.4 Полифенольные соединения из древесины Maackia amurensis.

2.4.1 Выделение и установление строения мономерных полифенолов 156 из древесины Maackia amurensis.

2.4.2 Выделение и установление строения олигомерных полифенолов 161 из древесины Maackia amurensis.

2.4.3 ВЭЖХ анализ спиртового экстракта древесины Maackia amurensis

2.4.4 Изучение стереохимии полифенолов Maackia amurensis методом 167 рентгеноструктурного анализа.

2.5 Изофлавоноиды из клеточной культуры Maackia amurensis.

2.5.1 Клеточные культуры Maackia amurensis.

2.5.2 Установление структуры 6'-0-малонил-3-0-(3-0-глюкопиранозил- 177 6,6а-дегидромаакиаина.

2.5.3 Кислотный гидролиз суммарного спиртового экстракта клеточной 184 культуры Maackia amurensis.

2.5.4 Биосинтез изофлавоноидов в клеточной культуре А-18 Maackia 185 amurensis.

2.6 Фармакологическая активность препаратов из ядровой древесины и клеточной культуры Maackia amurensis.

2.6.1 Гепатопротекторные свойства полифенолов Maackia amurensis.

2.6.1.1 Сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенолов из древесины и клеточной культуры Maackia 189 amurensis.

2.6.1.2 Влияние гепатопротекторов растительного происхождения на эффекты преднизолона при экспериментальном токсическом 193 гепатите.

2.6.1.3 Лечебное действие максара при экспериментальном синдроме 195 Рейе.

2.6.2 Антиоксидантные свойства полифенолов Maackia amurensis.

2.6.2.1 Сравнительная оценка антиоксидантных свойств полифенолов 196 из древесины и клеточной культуры Maackia amurensis.

2.6.2.2 Сравнительная оценка влияния полифенолов из древесины и клеточной культуры Maackia amurensis на развитие 198 экспериментального воспаления.

2.6.2.3 Антиоксидантное действие препарата максар при экспериментальном диабете.

2.6.2.4 Влияние препарата максар на состояние антиоксидантной системы у крыс с алиментарной гиперлипопротеинемией На типа

2.6.3 Антитромбогенные и антитромбоцитарные свойства полифенолов 206 Maackia amurensis при овариоэктомии у крыс.

2.6.3.1 Влияние полифенолов Maackia amurensis на перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов после 210 овариоэктомии у крыс.

2.6.4 Краткий обзор проведенных доклинических исследований 211 препарата максар.

2.6.4.1 Экспериментальное изучение специфической гепатозащитной и желчегонной активности сухого экстракта Maackia amurensis 211 (максар).

2.6.4.2 Экспериментальное исследование сухого экстракта Maackia 213 amurensis (максар), характеризующее его безвредность.

2.6.4.3 Противоопухолевые свойства сухого экстракта Maackia 214 amurensis (максар).

2.6.5 Антимикробная активность полифенолов из древесины и 216 клеточной культуры Maackia amurensis.

2.7 Обобщенный анализ результатов исследований клинической эффективности и безопасности лекарственного средства "Максар® 218 таблетки, покрытые оболочкой 60 мг".

2.7.1 Программа клинических испытаний.

2.7.2 Проведенные исследования по изучению клинической 219 эффективности и безопасности препарата максар.

2.7.3 Оценка эффективности препарата максар на основании 219 клинических отчетов.

2.7.4 Опубликованные результаты клинических исследований 220 препарата максар.

2.7.5 Обобщенный анализ результатов безопасности препарата максар

2.7.6 Инструкция по медицинскому применению препарата МАКСАР®.

2.8 Разработка нормативно-технической документации на препарат

Максар®".

2.8.1 Опытно-промышленный регламент на производство субстанции 226 "Маакии амурской экстракт сухой".

2.8.2 Пусковой регламент на производство "Максар® таблетки, 228 покрытые оболочкой, 60 мг".

2.8.3 Стандартизация препарата максар.

2.8.3.1 ФСП "Маакии амурской древесина ангро".

2.8.3.2 ФСП "Маакии амурской экстракт сухой".

2.8.3.3 ФСП "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

2.8.4 Государственная регистрация препарата максар.

2.8.5 Промышленные выпуски препаратов.

2.9 Полифенолы из стеблей и клеточных культур Vitis amurensis.

2.9.1 Полифенолы из стеблей Vitis amurensis.

2.9.2 Клеточные культуры Vitis amurensis.

2.10 Таксановые дитерпеноиды из клеточной культуры Taxus cuspidata

2.11 Лигнаны и катехины Taxus cuspidata.

2.11.1 Выделение лигнанов и катехинов из Taxus cuspidata.

2.11.2 Содержание лигнанов и катехинов в Taxus cuspidata.

2.11.3 Антиоксидантная и антирадикальная активности полифенолов из 259 Taxus cuspidata.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Приборы и оборудование.

3.2 Препаративная хроматография.

3.3 Аналитическая хроматография.

3.3.1 Аналитическая ТСХ хиноидных соединений.

3.3.2 Определения полифенольных соединений методом ТСХ.

3.3.3 Аналитическая ВЭЖХ.

3.3.4 Подготовка стандартного образца для ВЭЖХ.

3.3.5 Подготовка проб для проведения анализа методом ВЭЖХ.

3.3.6 Определение относительных времен удерживания и поправочных 267 коэффициентов индивидуальных соединений.

3.3.7 Аналитическая ВЭЖХ для анализа хиноидных соединений из 267 клеточных культур и растения Lithospermum erythrorhizon.

3.3.8 Аналитическая ВЭЖХ для анализа полифенольных соединений из Lithospermum erythrorhizon и Eritrichium sericeum и их клеточных 268 культур.

3.3.9 Аналитическая ВЭЖХ хроматографических фракций и экстрактов 268 из клеточных культур и древесины Maackia amurensis.

3.3.10 Аналитическая ВЭЖХ экстрактов из растения и клеточной 269 культуры Taxus cuspidata.

3.3.11 Аналитическая ВЭЖХ экстрактов из растения и клеточных 269 культур Vitis amurensis.

3.4 Биологический материал.

3.4.1 Культура клеток воробейника краснокорневого.

3.4.2 Получение резистентной к 4-фторфенилаланину (4-ФФА) 271 клеточной культуры BK-39F.

3.4.3 Получение клеточной культуры Eritrichium sericeum.

3.4.4 Состав питательных сред для выращивания культур корней и 272 каллусов Eritrichium sericeum.

3.4.5 Получение контрольных и rolC-трансгенных клеточных культур 272 Eritrichium sericeum и Lithospermum erythrorhizon.

3.4.6 Культивирование клеточных культур Maackia amurensis.

3.4.7 Культивирование клеточных культур Vitis amurensis.

3.4.8 Методы культивирования клеточных культур Taxus cuspidata.

3.5 Препаративное выделение хиноидных пигментов из клеточной культуры Lithospermum erythrorhizon.

3.5.1 Выделение нафтохинонов из клеточной культуры ВК-39.

3.5.2 Щелочной гидролиз суммарного экстракта пигментов из Lithospermum erythrorhizon.

3.5.3 Выделение изогексенилбензохинонилфуранов из клеточной 279 культуры ВК-39.

3.5.4 Щелочной гидролиз изогексенилбензохинонилфуранов.

3.6 Препаративное выделение олигомеров кофейной кислоты из клеточных культур Eritrichium sericeum и Lithospermum erythrorhizon

3.7 Фармакологическая активность препаратов из клеточных культур

Lithospermum erythrorhizon, Eritrichium sericeum.

3.7.1 Влияние препаратов из клеточных культур Lithospermum 282 erythrorhizon и Eritrichium sericeum на функцию почек у крыс.

3.7.2 Влияние препарата из клеточной культуры Eritrichium sericeum на 282 течение экспериментального гломерулонефрита.

3.7.3 Противовоспалительная активность препаратов из клеточных 283 культур Lithospermum erythrorhizon и Eritrichium sericeum.

3.7.4 Определение антимикробной активности препарата из клеточной 284 культуры Eritrichium sericeum.

3.8 Выделение полифенольных соединений из ядровой древесины

Maackia amurensis.

3.8.1 Выделение мономерных полифенолов из древесины Maackia 285 amurensis.

3.8.2 Выделение олигомерных полифенолов из древесины Maackia 290 amurensis.

3.9 Выделение и идентификация изофлавоноидов из клеточной культуры А-18 Maackia amurensis.

3.9.1 Экстракция и хроматография изофлавоноидов из клеточной 294 культуры Maackia amurensis.

3.9.2 Кислотный гидролиз суммы изофлавоноидов клеточной культуры 299 Maackia amurensis.

3.10 Фармакологическая активность ПФК из клеточной культуры и 299 ядровой древесины Maackia amurensis.

3.10.1 Методы определения гепатопротективной активности полифенолов из древесины и клеточной культуры Maackia 299 amurensis.

3.10.2 Определение антиоксидантной активности полифенолов из 300 ядровой древесины и клеточной культуры Maackia amurensis.

3.10.3 Метод определения антиоксидантной активности сухого экстракта маакии амурской (максар) при экспериментальном 301 диабете.

3.10.4 Метод определения антиоксидантной активности сухого экстракта маакии амурской (максар) у крыс с алиментарной 302 гилерлипопротеинемией Па типа.

3.10.5 Определение антитромбогенной и антитромбоцитарной 302 активности сухого экстракта маакии амурской.

3.10.6 Метод определения противоопухолевой активности сухого 304 экстракта маакии амурской (максар).

3.10.7 Метод определения антимикробной активности препарата 305 максар.

3.10.8 Методы определения биохимических показателей в крови и 306 печени животных.

3.11 Полифенолы из клеточной культуры и стеблей Vitis amurensis.

3.12 Выделение таксановых дитерпеноидов из клеточной культуры 309 Taxus cuspidata.

3.13 Лигнаны и катехины из Taxus cuspidata.

3.13.1 Выделение лигнанов и катехинов из Taxus cuspidata.

3.13.2 Определение антирадикальной активности полифенолов из 313 Taxus cuspidata.

3.13.3 Определение антиоксидантной активности полифенолов из 313 Taxus cuspidata.

Изучение и практическое применение природных соединений имеют большое значение для укрепления здоровья и увеличения продолжительности жизни людей. Действительно, биомолекулы, химические структуры и биологические функции, которых изучает биоорганическая химия, используются в качестве биологически активных субстанций лекарств и ценных пищевых компонентов. На протяжении многих лет и до настоящего времени основными источниками новых природных соединений были и остаются высшие наземные растения. Многие из них биосинтезируют метаболиты, обладающие выдающейся биологической активностью. Признано, что растения являются основным источником биологического материала при производстве многих лекарственных препаратов.

В последнее время доказано, что многие патологические состояния животных и человека вызываются нарушением нормального уровня свободных радикалов в их органах и тканях. Это в полной мере относится к естественному процессу старения, сердечнососудистым заболеваниям, воспалительным явлениям, ожогам и, прямо или косвенно, к онкологическим заболеваниям. В современной клинической практике коррекция подобных нарушений нередко выполняется применением экзогенных антиоксидантов полифенольной природы, благодаря чему полифенольные и хиноидные соединения природного происхождения стали в настоящее время важными объектами для изучения их структур и биомедицинских исследований. Весьма существенным является и то, что природные полифенольные антиоксиданты не только являются защитой организма от окислительного стресса путем нейтрализации активных форм кислорода, но и могут регулировать окислительно-восстановительные свойства клеток или их компонентов и, таким образом, защищать клетки от старения. Повсеместное распространение полифенольных соединений в растениях, достаточно хорошая изученность некоторых из них, низкая токсичность и высокая фармакологическая активность привели к созданию ряда лекарственных препаратов на их основе.

Природные ресурсы Российского Дальнего Востока предоставляют широкие возможности для получения разнообразных антиоксидантов и их композиций, прежде всего из лекарственных растений. Разработка новых лекарственных средств на основе дальневосточных растений, в первую очередь способных усиливать регенеративные процессы в печени, и внедрение их в широкую медицинскую практику приобрели особую социальную значимость. Сегодня большинство зарегистрированных в Российской Федерации препаратов данной группы являются импортными и, вследствие высокой стоимости, малодоступными для населения. Это обусловливает создание эффективных, малотоксичных отечественных гепатопротективных средств на основе природных антиоксидантов полифенольной природы, устраняющих основное звено патогенеза токсического гепатита - усиление перекисного окисления липидов, и улучшающих антитоксическую и экскреторную функции гепатоцитов.

С другой стороны, поскольку вследствие интенсивного и нерегулируемого сбора растительного сырья его запасы в природе истощаются, все большее значение приобретают биотехнологические способы получения ценных природных веществ, в том числе методы клеточной биотехнологии. Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях на питательных средах неограниченно долго, при этом часть полученной биомассы используют для экстракции целевых продуктов, а другую часть пересаживают на свежую питательную среду для возобновления культуры. Независимость от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, погода, почвенные условия, вредители), а нередко и более высокий выход и хорошее качество продукта делают эту технологию привлекательной. В настоящее время происходит развитие новых методов биотехнологии клеточных культур растений. Одним из первых примеров практического применения такого подхода стал биосинтез в промышленном масштабе эфиров шиконина клеточными культурами ИМоБрегтит егуШогЫгоп, осуществленный в Японии и в нашей стране.

Считается, что биотехнология клеточных культур растений поможет решить проблему сохранения в природе редких^ видов растений, а также создаст реальную возможность для разработок новейших методов получения наиболее ценных лекарственных веществ и, в конечном счете, новых медицинских препаратов. В условиях, когда постоянно падает доля лекарственных субстанций отечественного производства, представляется особенно важным развивать современные технологии, создающие надежную сырьевую базу для производства отечественных препаратов.

Объектами настоящего исследования явились редкие и ценные растения дальневосточной флоры. Выбор растений был произведен на основе литературных данных и личного опыта с учетом основного критерия возможности их использовать для создания оригинальных отечественных препаратов. В итоге для углубленного исследования отобрано 5 перспективных видов растений - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. и Eritrichium sericeum (Lehm.) A. DC. сем. Boraginaceae, Maackia amurensis Rupr. et Maxim, сем. Fabaceae, Vitis amurensis Rupr. сем. Vitaceae, Taxus cuspidata Sieb. et Zucc. сем. Taxaceae. Для каждого вида осуществлен тщательный химический анализ его компонентов и вместе с сотрудниками Биолого-почвенного института ДВО РАН предприняты попытки получить активно-растущие клеточные культуры -воспроизводимые биотехнологические источники целевых хиноидных и/или полифенольных соединений. Большое внимание было уделено повышению продуктивности полученных клеточных культур растений и изучению фармакологической активности их метаболитов.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось выделение, установление строения и исследование биологической активности природных полифенольных и хиноидных соединений из экстрактов дальневосточных растений Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. (воробейник краснокорневой) и Eritrichium sericeum (Lehm.) A. DC. (незабудочник шелковистый) сем. Boraginaceae, Maackia amurensis Rupr. et Maxim, (маакия амурская) сем. Fabaceae, Vitis amurensis Rupr. (виноград амурский) сем. Vitaceae, Taxus cuspidata Sieb. et Zucc. (тис остроконечный) сем. Taxaceae и их клеточных культур, а также завершение разработки нового гепатопротективного лекарственного препарата "Максар®' на основе полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) На основе полученных суммарных экстрактов из растений и их клеточных культур разработать методы выделения биологически активных соединений, выделить индивидуальные соединения и установить их химическое строение;

2) провести сравнительное изучение качественного состава и количественного соотношения полифенольных и хиноидных соединений в растениях и их клеточных культурах;

3) изучить биологическую активность препаратов из клеточных культур L. erythrorhizon, Е. sericeum и М. amurensis для определения перспективности их использования в косметике и медицине;

4) провести сравнительное изучение гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов из древесины М. атигепз18 и ее клеточной культуры;

5) определить антиоксидантную и антирадикальную активность полифенольных соединений из Т. сизр'1ба1а\

6) разработать с применением генно-инженерных методов и новых технологий подходы к увеличению биосинтеза биологически активных соединений культурами клеток;

7) разработать аналитические методы для установления подлинности и количественного определения активных компонентов в препаратах: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг";

8) разработать нормативную документацию на сырье, субстанцию и лекарственную форму препарата "Максар®1;

9) осуществить регистрацию на территории Российской Федерации и промышленные выпуски препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар®таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВЫВОДЫ

1. Показано, что клеточные культуры и корни иШоБрегтит егу1ЬгогЫгоп продуцируют одинаковый набор пигментов - 9 эфиров шиконина и 5 производных бензохинонилфурана, из которых пропионилшиконин, эхинофуран С, изобутирил-и изовалерилизогексенилбензохинонилфуран выделены впервые, а их структуры установлены.

2. На основе клеточной культуры ВК-39Р £. егуШюгЫгоп, продуцирующей до 12.6% изогексенилнафтазаринов на сухой вес клеток, разработан способ получения препарата "Масло шикониновое", зарегистрированного в РФ как средство косметическое для наружного применения. Показана терапевтическая эффективность этого препарата при лечении рожистых воспалений.

3. Из растения ЕгИпсМит эепсеит и его клеточных культур Ег-1 и Е-4 выделены и идентифицированы полифенольные метаболиты: (-)-рабдозиин, розмариновая кислота и новый метаболит кофейной кислоты эритрихин. Структура эритрихина определена как (2Я?)-3-(3,4-дигидроксифенил)-2-[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-2-нафтоилокси]пропановая кислота. В отличие от Е. эегюеит, /. егуМгогЫгоп и его клеточная культура ВК-39 биосинтезируют (+)-энантиомер рабдозиина. Содержание рабдозиина и розмариновой кислоты в клеточных культурах воробейника и незабудочника превышает их содержание в растениях от 2 до 66 раз.

4. В условиях длительного применения препаратов из клеточных культур /. егуМгогМгоп (ПВ) и Е. вепсеит (ПН) в дозах 250 и 100 мг/кг/сутки в течение 14 суток установлено усиление экскреторной функции почек и угнетение экссудативной стадии воспаления у подопытных животных. Применение препарата ПН в дозе 100 мг/кг/сутки в течение 30 дней достоверно уменьшает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс.

5. Установлено, что основными компонентами древесины Маас/с/а атигелв/з являются 27 растительных полифенолов, составляющих полифенольный комплекс препарата максар. К ним относятся изофлавоны -генистеин, даидзеин, каликозин, псевдобаптигенин, формононетин, оробол, афромозин, текторигенин, ретузин, 5-метоксидаидзеин, 2'-гидроксиформононетин; птерокарпаны - маакиаин и медикарпин; мономерные стильбены - резвератрол, дигидрорезвератрол и пицеатаннол; изофлаванон - (±)-3-гидроксивеститон; изофлаван - (±)-веститол; флаваноны - нарингенин и ликвиритигенин, а также а,4,2',4'-тетрагидроксидигидрохалкон. В состав препарата входят также олигомерные полифенолы: изофлавоностильбен - маакиазин, стильбенолигнан -мааколин, и димерные транс-стильбены - сцирпусин А, сцирпусин В, маакин, а также ранее неизвестный стильбен - маакин А. Все олигомерные полифенолы состоят из рацемических смесей энантиомеров.

6. Установлено, что препарат "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг" при курсовом применении обладает гепатопротективной активностью, проявляет более выраженный по сравнению с карсилом терапевтический эффект у больных хроническим гепатитом вирусной и алкогольной этиологии, полностью купирует или ослабляет основные клинические проявления заболевания. Кроме того, препарат проявил себя как эффективное желчегонное средство, улучшающее экскреторную функцию печени. Побочные эффекты и противопоказания к применению не выявлены. Препарат разрешен к медицинскому применению. Осуществлены промышленные выпуски, регистрация на территории Российской Федерации и государственный контроль качества, эффективности и безопасности препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар®таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

7. Максар обладает рядом дополнительных полезных свойств. Его применение в экспериментах на животных и в клинике способствует коррекции нарушений липидного спектра крови и жировой дистрофии печени. Препарат проявляет антиоксидантное действие и препятствует развитию алиментарной гиперлипопротеинемии у животных. Максар снижает интенсивность образования в печени и крови продуктов перекисного окисления липидов и регулирует систему антиоксидантной защиты организма, преимущественно через глутатионзависимые ферментативные механизмы, восстанавливает резервы эндогенных антиоксидантов (а-ТФ) и улучшает детоксикацию гидропероксидных радикалов. При действии препарата в дозе 4.1 мкг/мл на клеточные линии DLD-1 и НТ-29 рака кишечника человека отмечено ингибирование образования колоний этих опухолевых клеток на 50% по сравнению с контролем.

8. Из клеточной культуры А-18, полученной из проростков семян М. amurensis, выделено и идентифицировано 19 изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны, птерокарпаны, а также их moho-, ди-, малонилглюкозиды и ранее неизвестный 6'-0-малонил-3-0-/3-0-глюкопиранозил

6,6а-дегидромаакиаин. Определены основные биотехнологические параметры клеточной культуры А-18, способной стабильно продуцировать изофлавоноиды (до 1.9% на сухой вес клеток). В отличие от растения, клеточные культуры не содержат мономерных и димерных стильбенов.

9. Проведена сравнительная оценка гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и клеточной культуры М. amurensis. Показано, что препарат из клеточной культуры обладает выраженным гепатозащитным действием, не уступающим по основным эффектам препарату из древесины. Гепатопротективная активность обоих ПФК обусловлена наличием в них суммы изофлавоноидов. Установлено влияние этих фитокомплексов на свободно-радикальное окисление, сопровождающееся прямым подавлением активности свободных радикалов и активацией неферментных механизмов антиоксидантной защиты, особенно выраженное для полифенолов из нативного растения (ПФКД). Выраженное противовоспалительное действие обнаружено только у ПФК из древесины М. amurensis.

10. Из спиртового экстракта стеблей винограда амурского Vitis amurensis выделены и идентифицированы шесть индивидуальных полифенольных соединений: два мономерных стильбена - резвератрол и пицеатаннол и четыре димерных стильбена - (-)-е-виниферин, (-)-паллидол, (+)-ампелопсин А и (+)-изоампелопсин F.

11. Показано, что клеточная культура V. amurensis, трансформированная геном roIB, способна продуцировать резвератрол с выходом 3.15% на сухой вес клеток.

12. Из древесины тиса Taxus cuspidata выделены и идентифицированы четыре лигнана - (-)-секоизоларицирезинол, (+)-изотаксирезинол, (+)-изоларицирезинол, (+)-таксирезинол и два катехина - (+)-катехин, (-)-эпикатехин. Определены их антиоксидантная и антирадикальная активности, а также содержание в различных органах растения.

13. Из клеточной культуры Т. cuspidata выделены и идентифицированы 3 известных таксановых дитерпеноида - таксюннанин С, юннаксан, юннанксан, и один новый - таксюннанин-7р-ол. Его структура определена как 2a,5a,10ß,14ß-тетраацетокси-7р-гидрокси-4(20),11-таксадиен.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фундаментальные исследования, направленные на изучение природных соединений, установление структур этих соединений, их биогенеза, биологической активности и механизма действия из редких ценных растений дальневосточной флоры и их клеточных культур, являются основой для разработки и создания новых лекарственных препаратов.

Ранее выполненные работы по химическому исследованию хиноидных пигментов дальневосточных представителей сем. Вогадтасеае, включающие разработку различных способов выделения индивидуальных соединений, анализа качественного состава и количественного соотношения компонентов суммарных экстрактов и фракций, применение тонкослойной, гельпроникающей, абсорбционной, высокоэффективной жидкостной хроматографии и ЯМР спектроскопии были использованы в работе по созданию отечественного штамма

- суперпродуцента эфиров шиконина. Эти работы предшествовали изучению физиологических и биохимических аспектов регуляции воробейника краснокорневого. Разработку методов регулирования биосинтеза шиконина (2) и его производных в культивируемых клетках воробейника было проведено совместно с сотрудниками Биолого-почвенного института ДВО РАН.

В результате был определен качественный состав и количественное соотношение хинонов в клеточных культурах ¿. егуМгогЫгоп. Установлено, что клеточные культуры и корни растения продуцируют одинаковый набор пигментов

- 9 эфиров шиконина и 5 производных изогексенилбензохинонилфурана, из которых пропионилшиконин, эхинофуран С, изобутирил- и изовалерилизогексенилбензохинонилфуран, оказались новыми соединениями. Количественные соотношения хинонов в клеточных культурах и корнях растения были различны.

Изучено влияние компонентов питательной среды на рост и продуктивность клеточной культуры воробейника краснокорневого. С помощью методов селекции и оптимизации компонентов питательной среды получен высокопродуктивный клеточный штамм ВК-39, способный в течение длительного периода (20 лет) стабильно накапливать более чем 8% суммы эфиров шиконина на сухой вес клеток. Повышение продукционных характеристик штамма ВК-39 было также достигнуто посредством стимуляции шикимат-фенилаланинового биосинтетического пути. Для решения этой задачи была получена культура клеток воробейника резистентная к 4-фторфенилаланину (штамм BK-39F) и устойчивая к действию этого ингибитора, способная накапливать свыше 12.6% ИГН на сухой вес клеток.

Штаммы клеток ВК-39 и BK-39F L. erythrorhizon были использованы для промышленного получения эфиров шиконина, причем процесс промышленного культивирования клеток воробейника экономически имеет существенные преимущества перед двухступенчатым процессом их культивирования, применяемым в настоящее время за рубежом.

Биомассы культур ВК-39 и BK-39F оказались хорошими источниками для продукции нового косметического средства, названного "Масло шикониновое". В 2003 г. в Приморском крае освоено производство препарата "Масло шикониновое" в промышленных масштабах. Препарат эффективно ингибирует грамположительную микрофлору (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. lutea, Bacillus subtilis и др.), обладает противогрибковым действием, является эффективным нестероидным противовоспалительным препаратом, так как нормализует продукцию ключевого медиатора воспаления - у-интерферона, снижает отек и сосудистую проницаемость в очаге острого воспаления. Антимикробное и противовоспалительное действие препарата сочетается с его способностью регенерировать эпителий после различных поражений [680].

Экспериментальное изучение препарата "Масло шикониновое" показало, что он обладает выраженным противовоспалительным действием, причем терапевтическая эффективность препарата при лечении рожистых воспалений выявлена впервые.

Кроме ИГН и ИГБФ, растения сем. Boraginaceae биосинтезируют олигомеры кофейной кислоты, обладающие антивирусной, антибактериальной, антиоксидантной и антирадикальной активностью.

Следующей задачей работы было сравнительное изучение химического состава и биосинтеза полифенольных метаболитов в клеточных культурах и в растениях сем Boraginaceae. Показано, что Eritrichium sericeum и его клеточная культура Ег-1 биосинтезируют полифенольные метаболиты: (-)-рабдозиин, розмариновую кислоту и новый метаболит кофейной кислоты эритрихин. В отличие от Е. sericeum, растение L. erythrorhizon и его клеточная культура ВК-39 синтезируют (+)-энантиомер рабдозиина. Содержание рабдозиина и розмариновой кислоты в клеточных культурах ВК-39 и Ег-1 в десятки раз превышает их содержание в органах нативных растений.

Таким образом, впервые созданы два новых источника рабдозиина, причем в форме различных диастериомеров, (+)- и (-)-рабдозиина. Оба вещества (рабдозиин и розмариновая кислота) могут оказаться полезными для медицины. В последние годы появились сообщения о том, что розмариновая кислота ингибирует образование 5-гидокси-6,8,11,14-эйкозатетраеновой кислоты и лейкотриена В4, усиливает выработку простагландина Е2. Эти свойства позволяют применить ее для лечения воспалительных аутоиммунных артритов.

Увеличение продукции этих полифенолов в клеточной культуре незабудочника не удалось осуществить трансформированием их геном го/С, влияющем на экспрессию отдельных форм ключевых генов биосинтеза вторичных метаболитов [681]. Эта задача была выполнена путем долговременной селекции. Только два элиситора - метилжасмонат и ионы меди, могли существенным образом повлиять на увеличение продуктивности культуры. В итоге получена линия Е-4, накапливающая метаболиты кофейной кислоты с выходом до 7.86% от сухого веса ткани.

Фармакологические исследования комплексов полифенолов из клеточных культур егуМгогЫгоп (ПВ) и Е. эегюеит (ПН), содержащих олигомеры кофейной кислоты, начатые в 2003 г., подтвердили их антимикробное, противовоспалительное, и антиоксидантное действие. Обнаруженные в эксперименте под действием препаратов ПВ и ПН усиление экскреторной функции почек, угнетение экссудативной стадии воспаления, а также существенное воздействие на активность свободно-радикального окисления делают эти препараты перспективными при воспалительных заболеваниях почек. Впервые выявлено выраженное нефропротективное действие препарата незабудочника (ПН). Применение препарата ПН в дозе 100 мг/кг/день в течение 30 дней уменьшает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс.

В течение многих лет в лаборатории химии природных хиноидных соединений ТИБОХ ДВО РАН проводился поиск природных антиоксидантов среди представителей дальневосточных растений. Наибольший интерес среди видов этих растений вызывает маакия амурская. Ее экстрактивные вещества обладают выраженными антиоксидантыми свойствами и низкой токсичностью, что побудило исследовать их в качестве гепатопротекторов при токсических поражениях печени. На основе полифенольного комплекса маакии амурской создан гепатопротективный препарат максар, который по активности превосходит известные гепатопротекторы - легалон и силибор. В процессе многолетних детальных химических исследований спиртовых экстрактов, полученных из измельченной ядровой древесины Maackia amurensis Rupr. et Maxim., было установлено, что основными компонентами маакии амурской являются 27 растительных метаболитов, принадлежащих к разным классам природных полифенолов. В состав препарата входят также олигомерные полифенолы и димерные стильбены. Все олигомерные полифенолы состоят из рацемических смесей энантиомеров.

Установлено, что в процессе выделения в кислых водно-спиртовых средах на сорбентах с обращенной фазой димерные транс-стильбены при облучении ультрафиолетовым светом легко изомеризуются с 50% выходом в соответствующие им димерные цис-стильбены. Однако в процессе производства и хранения субстанции и препарата максар такой изомеризации не происходит. Методом ВЭЖХ не было обнаружено даже следовых количеств димерных цис-стильбенов в образцах экстрактов, субстанции и лекарственной форме препарата после более чем четырех лет хранения в стандартных условиях.

После исследования химического состава компонентов ПФК препарата максар главным направлением исследований было изучение специфической фармакологической активности максара, проведение его клинических испытаний, разработка и утверждение нормативной документации на препарат.

Специфическая фармакологическая активность максара исследована в объеме требований ФГУ НЦ ЭСМП Росздравнадзора РФ к доклиническому изучению гепатопротекторов. В эксперименте препарат препятствует развитию острого гепатита, вызванного тетрахлорметаном, причем гепатопротективное действие максара более выражено, чем влияние легалона. Результатами лечения максаром (200 мг/кг) острого токсического гепатита являются: отсутствие гибели животных, нормализация структуры печеночных долек, защита паренхимы печени от некроза, белковой и жировой дистрофии. Максар препятствует развитию характерных для токсического гепатита нарушений ультраструктуры гепатоцитов. Терапия максаром приводит к улучшению антитоксической функции печени. Максар предохраняет цитохром Р-450 от конверсии в метаболически инертный цитохром Р-420, восстанавливает нормальное течение реакций окисления и глюкуронирования.

Максар характеризуется малой острой и хронической токсичностью, лишен мутагенного, эмбриотоксического, тератогенного, иммунотоксичеекого и аллергизирующего эффектов.

Клинические исследования максара у больных хроническим гепатитом вирусной и алкогольной этиологии были проведены в соответствии с "Программой клинических испытаний" утвержденной Фармакологическим комитетом МЗ РФ. Препарат способствовал уменьшению субъективных признаков заболевания (повышалась работоспособность, уменьшались боль и диспепсические расстройства). При этом снижались активность аминотрансфераз, щелочной фосфатазы и содержание билирубина в крови; улучшались показатели печеночной структуры по данным ультразвукового исследования, показатели клеточного и гуморального иммунитета. Максар проявил себя как эффективное желчегонное средство, улучшающее экскреторную функцию печени, - у больных повышалось содержание в желчи билирубина, желчных кислот, холестерина, фосфолипидов. По клинической эффективности максар превосходил препарат сравнения - карсил. Побочные эффекты и противопоказания к применению не выявлены.

На основании результатов клинической апробации препарат максар рекомендован в качестве гепатопротектора для медицинского применения и промышленного выпуска.

Для установления подлинности препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг" были разработаны методы ТСХ- и ВЭЖХ- определения веществ, специфичных для этих препаратов. Применение этих двух методов хроматографии дает возможность однозначно решить вопрос о подлинности препаратов. Стандартизацию активных компонентов в субстанции и препарате максар проводили по количественному содержанию основных действующих веществ - мономерных полифенолов (по общей сумме стильбенов и изофлавонов). Для этого была разработана методика, основанная на выделении суммы мономерных полифенолов из препарата, в виде элюата на колонке с силикагелем в системе растворителей бензол-ацетон и последующим измерением собственного поглощения суммы изофлавонов (А 272 нм) и суммы стильбенов (А 320 нм).

Кроме этого, модифицированы известные методы определения тяжелых металлов, мышьяка и других показателей применительно к сырью, субстанции и препарату максар. Исследована стабильность сырья, субстанции и препарата и определены сроки их годности и микробиологическая чистота. Установлены ограничительные нормативы содержания примесей и остаточного растворителя.

Разработана оптимальная лекарственная форма препарата Максар® - таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг. Для определения диагностических признаков цельного сырья, были получены микрофотографии древесины на поперечном и продольных срезах.

На основе этих методов стандартизации разработаны проекты ФСП: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг", которые прошли экспертизу ФГУ НЦ ЭСМП Росздравнадзора РФ.

Организовано производство субстанции и препарата максар, расположенное в производственных помещениях химико-технологического участка (ХТУ) ТИБОХ ДВО РАН и на ЗАО "Брынцалов А".

Разработаны технологические схемы и регламенты на производство субстанции и препарата "Максар® таблетки, покрытые оболочкой 60 мг". Осуществлены регистрация на территории Российской Федерации, промышленные выпуски и государственный контроль качества, эффективности, безопасности препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар®таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

Несмотря на то, что препарат максар был уже зарегистрирован и рекомендован в качестве гепатопротектора, исследование его фармакологических эффектов было продолжено.

В результате было выяснено, что, кроме гепатопротективного действия, максар способствует коррекции нарушений липидного спектра фона крови и жировой дистрофии печени, повышает активность системы антиоксидантной защиты организма, препятствует развитию алиментарной гиперлипопротеинемии у животных. Он также оказывает антиоксидантное действие при экспериментальном сахарном диабете, индуцированном аллоксаном. Максар снижает интенсивность образования в печени продуктов перекисного окисления липидов (ДК, МДА), регулирует систему антиоксидантной защиты преимущественно через , глутатионзависимые ферментативные механизмы и улучшает детоксикацию гидропероксидных радикалов.

Известно, что изофлавоноиды и стильбены как фитоэстрогены, входящие в состав препарата максар, по сравнению с эстрадиолом, имеют дифференцированные агонист- антагонистические эффекты, выборочно модулируют Е1Чаг и ЕН(3 рецепторы эстрогена и вызывают соответствующие биологические реакции на молекулярном, клеточном, и физиологическом уровне.

Высокое содержание фитоэстрогенов в зарегистрированном гепатопротективном препарате из маакии амурской явилось основанием для изучения его эффектов в условиях гипоэстрогенемии.

Проведенные под руководством профессора Плотникова М.Б экспериментальные исследования по изучению его антитромбогенного и антитромбоцитарного эффектов при овариоэктомии у крыс в сравнении с гормональной заместительной терапией этинилэстрадиолом показали, что препарат максар обладает антитромбогенным действием, ослабляет агрегацию тромбоцитов, уменьшает коагуляционные свойства крови и потенцирует антиагрегантную активность сосудистой стенки. Преимуществом препарата максар, по сравнению с гормональной заместительной терапией, является наличие антитромбоцитарной активности, которая не выявлена у этинилэстрадиола в этих условиях. Результаты экспериментов переданы в ФГУ НЦ ЭСМП Росздравнадзора РФ для получения разрешения на проведение клинических исследований препарата по новому медицинскому применению как средства для лечения кпитмактеричекого синдрома у женщин.

Впервые изучено противоопухолевое действие максара. Для его оценки были использованы опухолевые клетки НТ-19, DLD-1 (рак кишечника), RPMI-7951 (меланома - рак кожи человека) и применены MTS-метод и метод мягкого агара.

Результаты экспериментов показали, что под действием препарата "Маакии амурской экстракт сухой" в исследованном интервале концентрации происходит ингибирование роста колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 и НТ-29 по сравнению с контролем. Ингибирование роста колоний на 50% для клеток DLD-1 и НТ-29 происходит при концентрациях 4.1 и 8.8 мкг/мл, соответственно. Эти результаты указывают на то, что препарат "Маакии амурской экстракт сухой" обладает более сильным противоопухолевым действием по отношению к клеткам рака кишечника человека НТ-29 и DLD-1 по сравнению с генистеином. Кроме этого показано, что максар в исследованных концентрациях ингибирует рост колоний рака кишечника человека и не влияет на рост колоний клеток меланомы кожи человека RPMI-7951, что указывает на избирательное действие препарата.

С целью разработки новой технологии для получения воспроизводимого источника субстанции препарата максар, а также для исследования путей биосинтеза полифенольных соединений, входящих в его состав, впервые получены клеточные культуры из различных органов М. amurensis. Из клеточной культуры, полученной из проростков семян (штамм А-18) выделено и идентифицировано 19 изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны и птерокарпаны, а также их моно- ди- и малонилглюкозиды, и новый метаболит, структура которого установлена как 6'-0-малонил-3-0-/3-0-глюкопиранозил-6,6а-дегидромаакиаин. Клеточная культура А-18 в течение 2 лет стабильно биосинтезировала до 1.9% изофлавоноидов на сухой вес клеток, однако в отличие от растения маккии амурской, не синтезировала мономерные и димерные стильбены.

Впервые проведена сравнительная оценка гепатопротективных, противовоспалительных и антиоксидантных свойств полифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и клеточной культуры М. amurensis. Показано, что препарат из клеточной культуры обладает выраженным гепатозащитным действием, не уступающим по основным эффектам препарату из древесины. Следовательно, гепатопротективная активность ПФК обусловлена наличием в обоих препаратах суммы изофлавоноидов. Установлено влияние обоих фитокомплексов маакии на свободно-радикальное окисление, сопровождающееся прямым подавлением активности свободных радикалов и активацией неферментных механизмов антиоксидантной защиты, особенно выраженное для полифенолов нативного растения. Выраженное противовоспалительное действие, обнаруженное только у ПФК из древесины М. amurensis, обусловлено присутствием в препарате максар мономерных и димерных стильбенов.

Обнаружены антимикробные свойства у полифенольных комплексов маакии. Оба препарата в концентрации 25 мкг/мл предотвращали рост микроорганизмов: Pseudomonadas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans.

В последние годы является актуальным поиск новых природных источников с высоким содержанием резвератрола, обладающим множеством ценных фармакологических свойств. Из спиртового экстракта стеблей винограда амурского было выделено и идентифицировано шесть индивидуальных полифенольных соединений: резвератрол, пицеатаннол, (-)-е-виниферин, (-)-паллидол, (+)-ампелопсин А и (+)-изоампелопсин F.

Впервые получена трансформированная геном rolB клеточная культура VB2 винограда амурского, способная биосинтезировать резвератрол с выходом 3.15% на сухой вес клеток. Трансформация клеток V2 культуры Vitis amurensis геном rolB из Agrobacterium rhizogenes привело более чем 100-кратному увеличению продукции резвератрола. Такой выход резвератрола оказался рекордным и более чем на два порядка превышал его продукцию в клеточных культурах, сообщенных ранее многими исследователями. Кроме этого, впервые продемонстрирована возможность с использованием потенциала генетической трансформации биологического синтеза практически индивидуального природного соединения с высоким выходом.

Химическое исследование метаболитов из клеточной культуры растения Taxus cuspidata позволило выделить и идентифицировать четыре С-14-оксигенированных таксановых дитерпеноида, один из которых - таксюннанин-7р-ол - оказался новым таксаном. Его структура определена спектральными методами как 2а,5а,10р,14р-тетроацетокси-7р-гидрокси-4(20),11-таксадиен. Из древесины растения Т. cuspidata выделены и идентифицированы четыре лигнана: (-)-секоизоларицирезинол, (+)-изотаксирезинол, (+)-изоларицирезинол, (+)-таксирезинол, и два катехина: (+)-катехин, (-)-эпикатехин. Определены антиоксидантная и антирадикальная активность полифенолов, а также их содержание в различных органах растения.

В заключение следует отметить, что большинство исследованных клеточных культур оказались не способны продуцировать полный набор метаболитов, синтезируемых растениями. Чаще всего культуры клеток накапливают только часть из этих соединений, однако, существенно в больших количествах, чем растения. Подобные эффекты описаны в литературе для многих клеточных культур. Они свидетельствуют о переходе клеток к более "древнему" (примитивному) пути биосинтеза [680]. Однако следует отметить, что клеточные культуры L. erythrorhizon и Е. sericeum содержат наборы вторичных метаболитов, которые в точности повторяют имеющиеся у нативных растений.

1. Bolley Р., Wydler R. Ueber den farbstoff der Anchusa tinctoria И Justus Liebigs Ann. Chem. 1847. - Bd. 62. - S. 141-157.

2. Brockmann H. Die konstitution des alkannins, shikonins und alkannans // Justus Liebigs Ann. Chem. 1936. - Vol. 521, N 1. - P. 1-47.

3. Jain A.C., Mathur S.K. A chemical study of the pigments of Arnebia hispidissima И Bull. Nat. Sei. India. 1965. - N 28. - P. 52-56.

4. Kuhara M. On the red colouring matter of the Lithospermum erythrorhizon II Chem. News. 1878. - Vol. 38. - P. 238.

5. Thomson R.H. Naturally Occurring Quinones. 2 nd ed. - London ; New York : Acad. Press, 1971. - 734 p.

6. Thomson R.H. Naturally Occurring Quinones. III. Recent advances. 3 d ed. -London ; New York : Chapman and Hall, 1987. - 732 p.

7. Papageorgiou V.P., Assimopoulou A.N., Couladouros E.A., Hepworth D., Nicolaou K.C. The chemistry and biology of alkannin, shikonin, and related naphthazarin natural products //Angew. Chem. Int. Ed. 1999. - Vol. 38, N 3. - P. 270-300.

8. Winter R.A. Consumer's Dictionary of Cosmetic Ingredients : Crown, ed. New York. 1984.

9. Kuhara M. Rather Farbstoff von Lithospermum erythrorhizon II Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1878. - Bd. 11. - S. 2143.

10. Liebermann С., Romer M. Ueber Alkannin // Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1887. - Bd. 20.-S. 2428-2431.

11. Underwood A.L., Neumann W.F. Color reaction of beryllium with alkannin and naphthazarin (spectrophotometric studies) //Anal. Chem. 1949. - Vol. 21, N 11. -P. 1348-1352.

12. Raudnitz H., Redlich L., Fiedler F. Zur Konstitution des Alkannins // Ber. Dtsch. Chem. Ges.-1931.-Bd. 64, N7.-S. 1835-1841.

13. Dieterle H., Salomon A., Nosseck E. Zur Konstitution des Alkannins // Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1931. - Bd. 64, N 8. - S. 2086-2090.

14. Brand K., Lohmann A. Beitrag zur Kenntnis des roten Farbstoffs der Alkannawurzel // Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1935. - Bd. 68, N 8. - S. 1487-1494.

15. Majima R., Kuroda C. On the colouring matter of the Lithospermum erythrorhizon II Acta Phytochim. 1922. - Vol. 1, N 3. - P. 43-65.

16. Brockmann H., Muller К. Uber die synthese des alkannans und anderer alkyl-naphtazarine //Justus Liebigs. Ann. Chem. 1939. - Vol. 540, N 1. - P. 51-72.

17. Toribara T.Y., Underwood A.L. Preparation of alkannin and naphthazarin for use as reagents for beryllium // Anal. Chem. 1949. - Vol. 21, N 11. - P. 1352-1356.

18. Arakawa H., Nakazaki M. Absolute configuration of shikonin and alkannin // Chem. Ind. 1961. -Vol. 21.-P. 947.

19. Papageorgiou V.P. A new pigment of Alkanna tinktoria, having naphtoquinone structure // Planta Med. 1977. - Vol. 31, N 4. - P. 390-394.

20. Papageorgiou V.P. Naphthaquinones from roots of Macrotomia cephalotes DC // Planta Med. 1979. - Vol. 37, N 11. - P. 259-263.

21. Papageorgiou V.P., Mellidis A.S., Sagredos A.N. Study on the antibiotic fraction of Alkanna tinctoria Tausch // Chim. Chron. 1980. - Vol. 9. - P. 57-63.

22. Papageorgiou V.P., Winkler A., Sagredos A.N., Digenis G.A. Studies on the relationship of structure to antimicrobial properties of naphthaquinones and other constituents of Alkanna tinctoria II Planta Med. 1979. - Vol. 35, N 1. - P. 56-60.

23. Papageorgiou V.P. 1H- NMR spectra of naturally occurring isohexenylnaphthazarin pigments // Planta Med. 1979. - Vol. 37, N 10. - P. 185-187.

24. Papageorgiou V.P., Digenis G.A. Isolation of two new alkannin esters from Alkanna tinctoria II Planta Med. 1980. - Vol. 39, N 5. - P. 81-84.

25. Papageorgiou V.P. Study on the structure of the components of Alkanna tinctoria // Chim. Chron. 1978. - Vol. 7. - P. 45-54.

26. Романова A.C., Баньковский А.И., Тареева H.B., Маренова Л.Д., Боряев К.И. О выделении шиконина из некоторых видов сем. Boraginaceae // Лекарственные растения / Всесоюз. науч.-исслед. ин-т лекарств, растений. 1969. - Т. 15 : Химия. - С. 529-537.

27. Тареева Н.В., Романова А.С., Баньковский А.И., Кибальчич П.Н. О шиконине из Lithospermum officinale II Химия природ, соединений. 1966. - № 5. - С. 359360.

28. Тареева Н.В. Химическое изучение нафтохинонов некоторых видов сем. Бурачниковых : автореф. дис. . канд. фарм. наук. Москва, 1971. - 19 с.

29. Романова А.С., Тареева Н.В., Баньковский А.И. Выделение шиконина из Onosma caucasicum и Echium rubrum И Химия природ, соединений. 1967. - № 1.-С. 71.

30. Романова А.С., Тареева Н.В., Первых Л.Н., Калашникова Г.К., Боряев К.И., Пакалн Д.А., Патудин А.В. Шиконин из Macrotomia echioides, Onosma livanovii, Onosma sericeum, Onosma setosum II Химия природ, соединений. 1981. - № 1.-C. 96.

31. Щербановский Л.Р. Шиконин из Onosma tauricum II Химия природ, соединений. 1972. - № 2.-С. 238.

32. Щербановский Л.P. Onosma visianii новый источник шиконина // Химия природ, соединений. - 1971. - № 4. - С. 517-518.

33. Щербановский Л.Р. Наявнють щиконшу в деяких видах родини шорстколистих i його вплив на молочнокисл! бактерп // Укр. ботан. журн. 1971. - Т. 28, № 4. -С. 504-508.

34. Щербановский Л.Р., Луке Ю.А. Шиконин из Echium lycopsis II Химия природ, соединений. 1974. - № 4. - С. 513-514.

35. Morimoto I., Т. Kishi Т., S. Ikegami S., Y. Hirata Y. Naphthoquinone derivatives from Lithospermum erythrorhizon II Tetrahedron Lett. 1965. - Vol. 6, N 52. - P. 47374739.

36. Morimoto I., Hirata Y. New naphthoquinone derivative from Lithospermum erythrorhizon II Tetrahedron Lett. 1966. - Vol. 7, N 31. - P. 3677-3680.

37. Kazuaki K., Hiroyuki Т., Yasuhide Т., Takashi S., Manki K. Constituents of shikon. I. Structure of three new shikonin derivatives and isolation anhydroalkannin // Shoyakugaku Zasshi. 1973. - Vol. 27, N 1. - P. 24-30.

38. Zhu F.-f., F.-s. Lu F.-s., G.-q. Xiang G.-q. Isolation of shikonin and its derivatives by HPLC//Sepu. 1984. - Vol. 1, N 2. - P. 131-133.

39. Sung C.-W., Liu K.-S., Li N.-W. Survey on resource of Lithospermum erythrorhizon and related herbs in China //Yao Hsueh Tung Pao. 1980. - Vol. 15, N 5. - P. 3-5.

40. Fu S., Xiao P. Naphthoquinone pigments on Xinjiang Ruanzicao (Arnebia euchroma) //Zhongcaoyao. 1986. - Vol. 17, N 10. - P. 434-437.

41. Fu S., Shang Т., P. Xiao P. Analysis of naphthaquinone pigments in some Chinese medicinal "Zi Cao" // Yaoxue Xuebao. 1984. - Vol. 19, N 12. - P. 921-925.

42. Bai G., Jin X.-J. Chemical constituents of Lithospermum erythrorhizon И Chem. Res. Chin. Univ. 1994. - Vol. 10, N 3. - P. 263-265.

43. Liu G.-S. Isolation and identification of alkannin ß.ß'-dimethylacrylate, a new naphthoquinone component in Arnebia euchroma Johnst. // Yao Hsueh T'ung Pao. -1981.-Vol. 16, N5.-P. 14-15.

44. Papageorgiou V.P., Assimopoulou A.N., Samanidou V.F., Papadoyannis I.N. Analytical methods for the determination of alkannins and shikonins // Curr. Org. Chem. 2006. - Vol. 10, N 5. - P. 583-622.

45. Khan H.A., Chandrasekharan I., Ghanim A. Naphthazarins from Arnebia hispidissima II Phytochemistry. 1983. - Vol. 22, N 2. - P. 614-615.

46. Shukla Y.N., Tandon J.S., Bhakuni D.S., Dhar M.M. Chemical constituents of the antibiotic fraction of the of Arnebia nobilis И Experientia. 1969. - Vol. 25, N 4. - P. 357-358.

47. Shukla Y.N., Tandon J.S., Bhakuni D.S., Dhar M.M. Naphthoquinones of Arnebia nobilis II Phytochemistry. 1971. - Vol. 10, N 8. - P. 1909-1915.

48. Болдырев H.H. Советский алканнин //Фармация. 1939. - № 10. - С. 24-25.

49. Ning W., Yu Т., Cao R. Effect of an shikonin elicitor produced by Aspergillus oryzae on the metabolism of Onosma panicuiatum cells // Zhiwu Shengli Xuebao. 1996. -Vol. 22, N1.-P. 74-80.

50. Fukui H., Tsukada M., Mizukami H., Tabata M. Formation of stereoisomeric mixtures of naphthoquinone derivatives in Echium lycopsis callus cultures // Phytochemistry. 1983. - Vol. 22, N 2. - P. 453-456.

51. Mita G., Gerardi C., Miceli A., Bollini R., De Leo P. Pigment production from in vitro cultures of Alkanna tinctoria Tausch // Plant Cell Reports. 1994. - Vol. 13, N 7. -P. 406-410.

52. Hisamichi S., Yoshizaki F. Studies on the shikon I. Structures of new minor pigments and isolation of two isomers of shikonin derivatives from Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zucc. // Shoyakugaku Zasshi. 1982. - Vol. 36, N 2. - P. 154-159.

53. Ai К., Li F., Li Y., Wang W., Wu Y. Naphthaquinone constituents of Onosma confertum W. W. Smith and quantitative determination of shikonin // Zhiwu Xuebao. 1989. - Vol. 31, N 7. - P. 549-553.

54. Tabata M., Mizukami H., Hiraoka N., Konoshima M. Pigment formation in callus cultures of Lithospermum erythrorhizon // Phytochemistry. 1974. - Vol. 13, N 6. -P. 927-932.

55. Mizukami H., Konoshima M., Tabata M. Effects of nutritional factors on shikonin derivative formation in Lithospermum callus cultures // Phytochemistry. 1977. -Vol. 16, N 8.-P. 1183-1186.

56. Mizukami H., Konoshima M., Tabata M. Variation in pigment production in Lithospermum erythrorhizon callus cultures // Phytochemistry. 1978. - Vol. 17, N 1.-P. 95-97.

57. Fukui H., Yoshikawa N., Tabata M. Induction of shikonin formation by agar in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Phytochemistry. 1983. -Vol. 22, N 11. - P. 2451-2453.

58. Afzal M., Al-Oriqat G. Shikonin derivatives. 5. Chemical investigations of Arnebia decumbens II Agric. Biol. Chem. 1986. - Vol. 50, N 3. - P. 759-760.

59. Afzal M., Al-Oriquat G. Shikonin derivatives. 6. Chemical investigations of Arnebia decumbens II Agric. Biol. Chem. 1986. - Vol. 50, N 6. - P. 1651-1652.

60. Cisowski W., Dembinska-Migas W., Dzikowska J. Naphtoquinone dyes from the roots of Lithospermum an/ense L. // Acta Pol. Pharm. 1993. - Vol. 50, N 6. - P. 443-446.

61. Koul S., Sambyal M., Khajuria R.K., Jain S.M. Acetylshikonin from callus cultures of Onosma echioides var. hispidum I/ Fitoterapia. 1993. - Vol. 64, N 6. - P. 552-553.

62. Давыденков B.H., Патудин A.B., Попов Ю.Г., Рабинович С.А., Мирошников А.И. Культура клеток Arnebia euchroma (Royle) Jonst. новый источник получения шиконина // Хим.-фарм. журн. - 1991. - Т. 25, № 1. - С. 53-55.

63. Afzal М., Muhammad N. Shikonin (3,(3-dimethylacrylate: a component of Alkanna hirsutissima // Agric. Biol. Chem. 1983. - Vol. 47, N 2. - P. 411-412.

64. Salam N.A., Ibrahim Y., Khafagy S., Sarg T. Shikonin derivatives, flavonoids, and triterpenoids isolated from Moltkiopsis ciliate, Lithospermum callosum Vahl (Forsk) Jahnst//Acta Pharm. Jugosl. 1981. - Vol. 31, N 4. - P. 237-241.

65. Cong P. Mass spectrometric studies on alkannins and structure of O-p-acetoxyisovalerylshikonin //Yaoxue Xuebao. 1984. - Vol. 19, N 6. - P. 450-454.

66. DeLeo P., Miceli A., Ronzini L., Sanasi L., Sgarra R. Chemical characterization of alkannin esterified derivatives // Agro Food Ind. Hi-Tech. 1996. - Vol. 7, N 1. - P. 23-25.

67. Urbanek H., Bergier K., Saniewski M., Patykowski J. Effect of jasmonates and exogenous polysaccharides on production of alkannin pigments in suspension cultures of Alkanna tinctoria II Plant Cell Reports. 1996. - Vol. 15, N 8. - P. 637641.

68. Zho R., Cao R., Wang M., Pan D., Du Zh., Lu W., Shi Y. Purple-red pigment formed in callus of Onosma paniculatum Bur. et Franch // Zhiwu Xuebao. 1990. - Vol. 32, N 10.-P. 749-752.

69. Chaisuksant R., Niopas I., Voulgaropoulos A., Mellidis A., Papageorgiou V.P. Analysis of some isohexenylnaphthazarins by reversed-phase HPLC // Pharmazie. -1995. Vol. 50, N 5. - P. 363-363.

70. EI-Afly T.S., El-Tanbouly N.D., Sokkar N.M. Naphthoquinones of Arnebia tinctoria (Forssk.) // Egypt. J. Pharm. Sci. 1996. - Vol. 37, N 1-6. - P. 65-70.

71. Mellidis A.S., Papageorgiou V.P. Naphthazarins from Onosma heterophylla II J. Nat. Prod. 1987. - Vol. 50, N 4. - P. 618-619.

72. Kirimer N., Bozan B., Baser K.H.C. A new naphthaquinone from the roots of Arnebia densiflora II Fitoterapia. 1995. - Vol. 66, N 6. - P. 499-500.

73. Ballantine J.A. The'isolation of two esters of the naphthaquinone alcohol, shikonin, from the shrub Jatropha glandulifera // Phytochemistry. 1969. - Vol. 8, N 8. - P. 1587-1590.

74. Nickel S.L., Carroll T.F. Reversed-pase ion-pair high-performance liquid chromatography of napthazarins // J. Chromatogr. A. 1984. - Vol. 295. - P. 521525.

75. Sankawa U., Ebizuka Y., Miyazaki T., Isomura Y., Otsuka H., Shibata S., Inomata M., Fukuoka F. Antitumor activity of shikonin and its derivatives // Chem. Pharm. Bull. 1977. - Vol. 25, N 9. - P. 2392-2395.

76. Yoshikawa N., Fukui H., Tabata M. Effect of gibberellin A3 on shikonin production in Lithospermum callus cultures // Phytochemistry. 1986. - Vol. 25, N 3. - P. 621622.

77. Yazaki K., Fukui H., Kikuma M., Tabata M. Regulation of shikonin production by glutamine in Lithospermum erythrorhizon cell cultures // Plant Cell Reports. 1987. -Vol. 6, N2.-P. 131-134.

78. Fukui H., Yoshikawa N., Tabata M. Induction of benzoquinone formation by activated carbon in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Phytochemistry. 1984. - Vol. 23, N 2. - P. 301-305.

79. Fujita Y., Takahashi S., Yamada Y. Selection of cell lines with high productivity of shikonin derivatives by protoplast culture of Lithospermum erythrorhizon cells // Agric. Biol. Chem. 1985. - Vol. 49, N 6. - P. 1755-1759.

80. Fujita Y., Hara Y. The effective production on shikonin by cultures with an increased cell population //Agric. Biol. Chem. 1985. - Vol. 49, N 7. - P. 2071-2075.

81. Maeda Y., Fujita Y., Yamada Y. Callus formation from protoplasts of cultured Lithospermum erythrorhizon cells // Plant Cell Reports. 1983. - Vol. 2, N 4. - P. 179-182.

82. Alferman A.W. Syntheses by plant cells // Biocatalysts in organic syntheses. -Amsterdam : Elsevier, 1985. P. 225-238.

83. Brodelius P. Utilization of plant cell cultures for production of biochemicals // Hereditas. 1985. - Vol. 103, N 3 suppl. - P. 73-81.

84. Terada A., Tanoue Y., Hatada A., Sakamoto H. Total synthesis of shikalkin (±)-shikonin. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1983. - N 18. - P. 987-988.

85. Terada A., Tanoue Y., Hatada A., Sakamoto H. Synthesis of shikalkin (±shikonin) and related compounds // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987. - Vol. 60, N 1. - P. 205213.

86. Моисеенков A.M., Баланева H.H., Новиков В.Л., Еляков Г.Б. Полный синтез шикалкина // Докл. АН СССР. 1987. - Т. 295, № 3. - С. 614-617.

87. Новиков В.Л., Баланева Н.Н., Моисеенков A.M., Еляков Г.Б. Синтез шикалкина и некоторых родственных ему соединений // Изв. АН. Сер. хим. / Рос. акад. наук. 1992. - № 8. - С. 1901-1910.

88. Braun М., Bauer С. Synthesis of shikonin and alkannin // Liebigs Ann. Chem. -1991.-N 11.-P. 1157-1164.

89. Braun M., Devant R. (R)- and (S)-2-acetoxy-1,1,2-triphenylethanol effective synthetic equivalents of a chiral acetate enolate // Tetrahedron Lett. - 1984. - Vol. 25, N 44. - P. 5031-5034.

90. Nicolaou K.C., Hepworth D. Concise and efficient total syntheses of alkannin and shikonin //Angew. Chem. Int. Ed. 1998. - Vol. 37, N 6. - P. 839-841.

91. Zhao L.-M., Xu D.-F., Zhou W., Li S.-S. Concise formal synthesis of (+/-)-shikonin via a highly alpha-regioselective prenylation of 1,4,5,8-tetramethoxynaphthalene-2-carbaldehyde // Lett. Org. Chem. 2008. - Vol. 5, N 3. - P. 234-236.

92. Inouye H., Matsumura H., Kawasaki M., Inoue K., Tsukada M., Tabata M. Two quinones from callus cultures of Echium lycopsis II Phytochemistry. 1981. - Vol. 20, N 7.-P. 1701-1705.

93. Okamoto T., Yazaki K., Tabata M. Biosynthesis of shikonin derivatives from L-phenylalanine via deoxyshikonin in Lithospermum cell cultures and cell-free extracts // Phytochemistry. 1995. - Vol. 38, N 1. - P. 83-88.

94. Loscher R., Heide L. Biosynthesis of p-hydroxybenzoate from p-coumarate and p-coumaroyl-coenzyme A in cell-free extracts of Lithospermum erythrorhizon cell cultures // Plant Physiol. 1994. - Vol. 106, N 1. - P. 271-279.

95. Yazaki K., Heide L., Tabata M. Formation of p-hydroxybenzoic acid from p-coumaric acid by cell free extract of Lithospermum erythrorhizon cell cultures // Phytochemistry. 1991. - Vol. 30, N 7. - P. 2233-2236.

96. Schmid H.V., Zenk M.H. p-Hydroxybenzoic acid and mevalonic acid as precursors of the plant naphthoquinone alkannin // Tetrahedron Lett. 1971. - Vol. 12, N44.-P. 4151-4155.

97. Inouye H., Ueda S., Inoue K., Matsumura H. Biosynthesis of shikonin in callus cultures of Lithospermum erythrorhizon II Phytochemistry. 1979. - Vol. 18, N 8. -P. 1301-1308.

98. Heide L. New aspects of shikonin biosythesis: geranyl pyrophosphate synthase and origin of p-hydroxybenzoic acid // Planta Med. 1988. - Vol. 54, N 6. - P. 567.

99. Yazaki K., Fukui H., Tabata M. Isolation of the intermediates and related metabolites of shikonin biosynthesis from Lithospermum erythrorhizon cell cultures // Chem. Pharm. Bull. 1986. - Vol. 34, N 5. - P. 2290-2293.

100. Yao X.-S., Ebizuka Y., Noguchi H., Kiuchi F., iitaka Y., Sankawa U. Structure of arnebinol, a new ansa-type monoterpenylbenzenoid with inhibitory effect to prostaglandin biosynthesis // Tetrahedron Lett. 1983. - Vol. 24, N 23. - P. 24072410.

101. Tabata M., Tsukada M., Fukui H. Antimicrobial activity of quinone derivatives from Echium licopsis callus cultures // Planta Med. 1982. - Vol. 44, N 4. - P. 234236.

102. Fukui H., Tani M., Tabata M. An unusual metabolite, dihydroechinofuran, released from cultured cells of Lithospermum erythrorhizon // Phytochemistry. -1992. Vol. 31, N 2. - P. 519-521.

103. Yazaki K., Fukui H., Tabata M. Dihydroshikonofuran, an unusual metabolite of quinone biosynthesis in Lithospermum cell cultures // Chem. Pharm. Bull. 1987. -Vol. 35, N2.-P. 898-901.

104. Hayashi M. Pharmacological studies of shikon and tooki. I Pharmacological effects of the water and ether extracts // Nippon Yakurigaku Zasshi. 1977. - Vol. 73, N2.-P. 177-191.

105. Hayashi M. Pharmacological studies of shikon and tooki. II. Pharmacological effects of the pigment components, shikonin and acetylshikonin // Nippon Yakurigaku Zasshi. 1977. - Vol. 73, N 2. - P. 193-203.

106. Hayashi M. Pharmacological studies of shikon and tooki. III. Effect of topical application of the ether extracts and Shiunko on inflammatory reactions // Nippon Yakurigaku Zasshi. 1977. - Vol. 73, N 2. - P. 205-214.

107. Ozaki Y., Ohno A., Abe K.-i., Saito Y., Satake M. Comparative study on the accelerative effect of "Koushikon" and "Nanshikon" and their constituents on proliferation of granuloma tissue in rats // Biol. Pharm. Bull. 1993. - Vol. 16, N 7. -P. 683-685.

108. Ozaki Y., Ohno A., Saito Y., Satake M. Accelerative effect of shikonin, alkannin and acetylshikonin on the proliferation of granulation tissue in rats // Biol. Pharm. Bull. 1994. - Vol. 17, N 8. - P. 1075-1077.

109. Ozaki Y., Xing L., Satake M. Accelerative effect of "Nanshikon" and its constituents on the proliferation of granulation tissue in rats // Biol. Pharm. Bull. -1996. Vol. 19, N 2. - P. 233-236.

110. Tanaka S., Tajima M., Tsukada M., Tabata M. A comparative study on antiinflammatory activities of the enantiomers, shikonin and alkannin // J. Nat. Prod. -1986. Vol. 49, N 3. - P. 466—469.

111. Wang W.J., Bai J.Y., Liu D.P., Xue L.M., Zhu X.Y. The antiinflammatory activity of shikonin and its inhibitory effect on leukotriene B4 biosynthesis // Yao Xue Xue Bao. 1994. - Vol. 29, N 3. - P. 161-165.

112. Lin Z.-B., Chai B.-L., Wang P., Guo Q.-X., Lu F.-S., Xiang G.-Q. Studies on the antiinflammatory effect of chemical principle of Zi-Cao Arnebia euchroma (Royle) Johnst. // Pei-ching I Hsueh Yuan Hsueh Pao. 1980. - Vol. 12, N 2. - P. 101-106.

113. Lin Z.-B., Wang P., Ruan Y., Guo Q.-X. Antiinflammatory effect of (3,(3-dimethylacrylshikonin //Acta Pharmacol. Sin. 1980. - Vol. 1, N 1. - P. 60-63.

114. Singh В., Sharma M.K., Meghwal P.R., Sahu P.M., Singh S. Anti-inflammatory activity of shikonin derivatives from Arnebia hispidissima II Phytomedicine. 2003. -Vol. 10, N 5. - P. 375-380.

115. Singh В., Sahu P.M., Jain S.C., Singh S. Estimation of naphthaquinones from Arnebia hispidissima (Lehm.) DC. in vivo and in vitro. I. Anti-inflammatory screening // Phytother. Res. 2004. - Vol. 18, N 2. - P. 154-159.

116. Щербановский Л.P., Шубина Л.С. Бензо-, нафто- и антрахиноны цветковых растений как антимикробные вещества // Раст. ресурсы. 1975. - Т. 11, вып. 3. с. 445-454.

117. Fujii N., Yamashita Y., Arima Y., Nagashima M., Nakano H. Induction of topoisomerase ll-mediated DNA cleavage by the plant naphthoquinones plumbagin and shikonin // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. - Vol. 36, N 12. - P. 25892594.

118. Tanaka Y., Odani T. Pharmacodynamic study on "Shiunko". I. Antibacterial effect of "Shiunko" // Yakugaku Zasshi. 1972. - Vol. 92, N 5. - P. 525-530.

119. Tabata M., Mizukami H., Naoe S., Konoshima M. Antimicrobial activity of Lithospermum erythrorhizon callus cultures //Yakugaku Zasshi. 1975. - Vol. 95, N 11.-P. 1376-1379.

120. Brigham L.A., Michaels P.J., Flores H.E. Cell-specific production and antimicrobial activity of naphthoquinones in roots of Lithospermum erythrorhizon II Plant Physiol. 1999. - Vol. 119, N 2. - P. 417^28.

121. Jain S.C., Jain R., Singh B. Antimicrobial principles from Arnebia hispidissima II Pharm. Biol. 2003. - Vol. 41, N 4. - P. 231-233.

122. Honda G., Sakakibara F., Yazaki K., Tabata M. Isolation of deoxyshikonin, an antidermatophytic principle from Lithospermum erythrorhizon cell cultures // J. Nat. Prod. 1988. - Vol. 57, N 1. - P. 152-154.

123. Rajbhandari M., Schoepke Th., Mentel R., Lindequist U. Antibacterial and antiviral naphthazarins from Maharanga bicolor// Pharmazie. 2007. - Vol. 62, N 8. - P. 633-635.

124. Li C., Fukushi Y., Kawabata J., Tahara S., Mizutani J., Uyeda I. Antiviral and antifungal activities of some naphthoquinones isolated from the roots of Lithospermum erythrorhizon // J. Pesticide Sci. 1998. - Vol. 23, N 1. - P. 54-57.

125. Greenberg E.P., Banin E. Ironing out the biofilm problem: the role of iron in biofilm formation // Control of Biofilm Infections by Signal Manipulation / Ed. Balaban N. Springer Ser. on Biofilm. - 2007. - Vol. 2. - P. 141-156.

126. BjarnsholtT., Kirketerp-Moller K., Jensen P.O., Madsen K.G., Phipps R., Krogfelt K., Hoiby N., Givskov M. Why chronic wounds will not heal: a novel hypothesis // Wound Repair Regen. 2008. - Vol. 16, N 1.-P. 2-10.

127. Sekine T., Masumizu T., Maitani Y., Takayama K., Kohno M., Nagai T. Effect of shikonin and alkannin on hydroxyl radical generation system concerned with iron ion // Yakugaku Zasshi. 1998. - Vol. 118, N 12. - P. 609-615.

128. Gao D., Kakuma M., Oka S., Sugino K., Sakurai H. Reaction of (B-alkannin (shikonin) with reactive oxygen species: detection of (3-alkannin free radicals // Bioorg. Med. Chem. 2000. - Vol. 8, N 11. - P. 2561-2569.

129. Sekine T., Kojima K., Sasaki S., Matsumoto T., Yamamoto T., Maitani Y., Nagai T. Evaluation of antibacterial effect of shikonin ointment against methicillin-resistant Staphylococcus aureus IISTP Pharma Sci. 1998. - Vol. 8, N 4. - P. 255-259.

130. Sekine T., Masumizu T., Maitani Y., Nagai T. Evaluation of superoxide anion radical scavenging activity of shikonin by electron spin resonance // Intern. J. Pharm. -1998.-Vol. 174, N 1-2.-P. 133-139.

131. Locksley R.M., Killeen N., Lenardo M.J. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology // Cell. 2001. - Vol. 104, N 4. - P. 487-501.

132. Chiu S.-C., Yang N.-S. Inhibition of tumor necrosis factor-a through selective blockade of pre-mRNA splicing by shikonin // Mol. Pharmacol. 2007. - Vol. 71, N 6. - P. 1640-1645.

133. Feldmann M., Maini R.N. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned?//Annu. Rev. Immunol.-2001.-Vol. 19.-P. 163-196.

134. Palladino M.A., Bahjat F.R., Theodorakis E.A., Moldawer L.L. Anti-TNF-alpha therapies: the next generation // Nat. Rev. Drug. Discov. 2003. - Vol. 2, N 9. - P. 736-746.

135. Subbaramaiah K., Bulic P., Lin Y., Dannenberg A.J., Pasco D.S. Development and use of a gene promoter-based screen to identify novel inhibitors of cyclooxygenase-2 transcription // J. Biomol. Screen. 2001. - Vol. 6, N 2. - P. 101110.

136. Assimopoulou A.N., Boskou D., Papageorgiou V.P. Antioxidant activities of alkannin, shikonin and Alkanna tinctoria root extracts in oil substrates // Food Chem. 2004. - Vol. 87, N 3. - P. 433-438.

137. Assimopoulou A.N., Papageorgiou V.P. Radical scavenging activity of Alkanna tinctoria root extracts and their main constituents, hydroxynaphthoquinones // Phytother. Res. -2005. Vol. 19, N 2. - P. 141-147.

138. Nishizawa M., Kohno M., Nishimura M., Kitagawa A., Niwano Y. Presence of peroxyradicals in cigarette smoke and the scavenging effect of shikonin, a naphthoquinone pigment // Chem. Pharm. Bull. 2005. - Vol. 53, N 7. - P. 796799.

139. Katti S.B., Shukla Y.N., Tandon J.S. Arnebin derivatives for anticancer activity // Indian J. Chem. Pt. B. Org. Incl. Med. 1979. - Vol. 18, N 5. - P. 440-442.

140. Wagner H., Kreher В., Jurcic K. In vitro stimulation of human granulocytes and lymphocytes by pico- and femtogram quantities of cytostatic agents // Arzneimittelforschung. 1988. - Vol. 38, N 2. - P. 273-275.

141. Lee H., Lin J.Y. Antimutagenic activity of extracts from anticancer drugs in Chinese medicine // Mutat. Res. 1988. - Vol. 204, N 2. - P. 229-234.

142. Miller M.G., Rodgers A., Cohen G.M. Mechanisms of toxicity of naphthoquinones to isolated hepatocytes // Biochem. Pharmacol. 1986. - Vol. 35, N 7. - P. 11771184.

143. Moore H.W. Bioactivation as a model for drug design bioreductive alkylation // Science. 1977. - Vol. 197, N 4303. - P. 527-532.

144. Singh R., Tandon V.K., Khanna J.M., Anand N. Studies on anticancer agents: some 2-substituted naphthoquinones, naphthazarins and 8-chIorojuglones // Indian J. Chem. Pt. B. Org. Incl. Med. 1977. - Vol. 15, N 10. - P. 970-971.

145. Ahn B.-Z., Baik K.-U., Kweon G.-R., Lim K., Hwang B.-D. Acylshikonin analogues: synthesis and inhibition of DNA topoisomerase-l // J. Med. Chem. -1995. Vol. 38, N 6. - P. 1044-1047.

146. Papageorgiou V.P. Wound healing properties of naphthaquinone pigments from Alkanna tinctorialI Experientia. 1978. - Vol. 34, N 11. - P. 1499-1501.

147. Michaelides C., Striglis C., Panayiotou P., loannovich J. The therapeutic action of Alkanna root extract in the conservative treatment of partial-thickness burn injuries // Ann. Medit. Burns Club. 1993. - Vol. 6, N 1. - P. 24-25.

148. Sakaguchi I., Tsujimura M., Ikeda N., Minamino M., Kato Y., Watabe K., Yano I., Kaneda K. Granulomatous tissue formation of shikon and shikonin by air pouch method // Biol. Pharm. Bull. 2001. - Vol. 24, N 6. - P. 650-655.

149. Sidhu G.S., Singh A.K., Banaudha K.K., Gaddipati J.P., Patnaik G.K., Maheshwari R.K. Arnebin-1 accelerates normal and hydrocortisone-induced impaired wound healing // J. Invest. Dermatol. 1999. - Vol. 113, N 5. - P. 773781.

150. Mani H., Sidhu G.S., Singh A.K., Gaddipati J., Banaudha K.K., Raj K., Maheshwari R.K. Enhancement of wound healing by shikonin analogue 93/637 in normal and impaired healing // Skin Pharmacol. Physiol. 2004. - Vol. 17, N 1. - P. 49-56.

151. Pei X.-W., Wang K.-Z., Dang X.-Q., Song J.-H., Shi Z.-B., Gao D.-F. Arnebia root oil promotes wound healing and expression of basic fibroblast growth factor on the wound surface in rabbits // J. Chin. Integr. Med. 2006. - Vol. 4, N 1. - P. 52-55.

152. Graham R.C.B., Noble R.L. Comparison of in vitro activity of various species of Lithospermum and other plant to inactivate gonadotrophin // Endocrinology. 1955. -Vol. 56, N 3. - P. 239-247.

153. Breneman W.R., Zeller F.J. Lithosperm inhibition of anterior pituitary hormones // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. - Vol. 65, N 3. - P. 1047-1053.

154. Breneman W.R., Zeller F.J., Carmack M., Kelley C.J. In vivo inhibition of gonadotropins and thyrotropin in the chick by extracts of Lithospermum ruderale II Gen. Comp. Endocrinol. 1976. - Vol. 28, N 1. - P. 24-32.

155. Кожина И.С., Шухободский Б.А., Ключникова Л.А., Дильман В.М., Аппацкая Э.П. Исследование некоторых представителей сем. Бурачниковых как источников получения физиологически-активных веществ // Раст. ресурсы. -1970. Т. 6, вып. 3. - С. 345-350.

156. Дильман В.М., Кожина И.С., Ключникова Л.А., Кибальчич П.Н., Кусов Ю.Ю. Исследование свойств и состава воробейника лекарственного. Перспективы использования в онкологии // Вопр. онкологии. 1968. - Т. 16, № 7. - С. 86-91.

157. Wagner Н., Wittman D., Schäfer W. Zur chemischen struktur der Lithospermsäure aus Lithospermum officinale L. II Tetrahedron Lett. 1975. - Vol. 16, N8.- P. 547-550.

158. Kelley C.J., Harruff R.C., Carmack M. The polyphenol^ acids of Lithospermum ruderale. II. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of lithospermic and rosmarinic acids //J. Org. Chem. 1976. - Vol. 41, N 3. - P. 449-455.

159. Fukui H., Yazaki K., Tabata M. Two phenolic acids from Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Phytochemistry. 1984. - Vol. 23, N 10. -P. 2398-2399.

160. Yamamoto H., Inoue K., Yazaki K. Caffeic acid oligomers in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Phytochemistry. 2000. - Vol. 53, N 6. - P. 651-657.

161. Agata I., Hatano T., Nishibe S., Okuda T. Rabdosiin, a new rosmarinic acid dimer with a lignan skeleton, from Rabdosia japónica II Chem. Pharm. Bull. 1988. - Vol. 36, N 8. - P. 3223-3225.

162. Agata I., Hatano T., Nishibe S., Okuda T. A tetrameric derivative of caffeic acid from Rabdosia japónica // Phytochemistry. 1989. - Vol. 28, N 9. - P. 2447-2450.

163. Nishizawa M., Tsuda M., Havashi K. Two caffeic acid tetramers having enantiomeric phenyldihydronaphthalene moieties from Macrotomia euchroma II Phytochemistry. 1990. - Vol. 29, N 8. - P. 2645-2649.

164. Petersen M., Simmonds M.S.J. Rosmarinic acid // Phytochemistry. 2003. - Vol. 62, N2.-P. 121-125.

165. Satake T., Kamiya K., Saiki Y., Hama T., Fugimoto Y., Kitanaka S., Kimura Y., Uzava J., Endang H., Umara M. Studies on the constituents of fruits of Helicteres isora L. // Chem. Pharm. Bull. 1999. - Vol. 47, N 10. - P. 1444-1447.

166. Lu Y., Foo L.Y. Rosmarinic acid derivatives from Salvia officinalis II Phytochemistry. 1999. - Vol. 51, N 1. - P. 91-94.

167. Lu Y., Foo L.Y., Wong H. Sagecoumarin, a novel caffeic acid trimer from Salvia officinalis II Phytochemistry. 1999. - Vol. 52, N 6. - P. 1149-1152.

168. Tanaka T., Nishimura A., Kouno I., Nonaka G.-i., Young T.-J. Isolation and characterization of yunnaneic acids A-D, four novel caffeic acid metabolites from Salvia yunnanensis II J. Nat. Prod. 1996. - Vol. 59, N 9. - P. 843-849.

169. Tanaka T., Nishimura A., Kouno I., Nonaka G.-i., Young C.-R. Four new caffeic acid metabolites, yunnaneic acids E-H, from Salvia yunnanensis II Chem. Pharm Bull. 1997. - Vol. 45, N 10. - P. 1596-1600.

170. Al-Sereiti M.R., Abu-Amer K.M., Sen P. Pharmacology of rosemary (Rosmarinus officinalis Linn.) and its therapeutic potential // Indian J. Exp. Biol. 1999. - Vol. 37, N2.-P. 124-130.

171. Winterhoff H., Gumbinger H.-G., Sourgens H. On the antigonadotropic activity of Lithospermum and Lycopus species and some of their phenolic constituents // Pianta Med. 1988. - Vol. 54, N 2. - P. 101-106.

172. Ahn S.C., Oh W.K., Kim B.Y., Kang D.O., Kim M.S., Heo G.Y., Ahn J.S. Inhibitory effects of rosmarinic acid on Lck SH2 domain binding to a synthetic phosphopeptide // Pianta Med. 2003. - Vol. 69, N 7. - P. 642-646.

173. Kang M.-A., Yun S.-Y., Won J. Rosmarinic acid inhibits Ca2+-dependent pathways of T-cell antigen receptor-mediated signaling by inhibiting the PLC-y1 and Itk activity // Blood. 2003. - Vol. 101, N 9. - P. 3534-3542.

174. Bors W., Michel C., Stettmaier K., Lu Y., Foo L.Y. Pulse radiolysis, electron paramagnetic resonance spectroscopy and theoretical calculations of caffeic acid oligomer radicals// Biochim. Biophys. Acta. -2003. Vol. 1620, N 1-3. - P. 97-107.

175. Youn J., Lee K.-H., Won J., Huh S.-J., Yun H.-S., Cho W.-G., Paik D.-J. Beneficial effect of rosmarinic acid on suppression of collagen induced arthritis // J. Rheumatol. -2003. Vol. 30, N 6. - P. 1203-1207.

176. Ito H., Miyazaki T., Ono M., Sakurai H. Antiallergic activities of rabdosiin and its related compounds: chemical and biochemical evaluations // Bioorg. Med. Chem. -1998. Vol. 6, N 7. - P. 1051-1056.

177. Yamamoto H., Zhao P., Yazaki K., Inoue K. Regulation of lithospermic acid B and shikonin production in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Chem. Pharm. Bull.-2002.-Vol. 50, N 8.-P. 1086-1090.

178. Kamata K., Noguchi M., Nagai M. Hypotensive effect of lithospermic acid B isolated from the extract of Salviae miltiorrhizae Radix in the rat I I Gen. Pharmacol. -1994. Vol. 25, N 1. - P. 69-73.

179. Ellis B.E., Towers G.H.N. Biogenesis of rosmarinic acid in Mentha II Biochem. J.- 1970. Vol. 118, N 2. - P. 291-297.

180. De-Eknamkul W., Ellis B.E. Tyrosine aminotransferase: the entrypoint enzyme of the tyrosine-derived pathway in rosmarinic acid biosinthesis // Phytochemistry. -1987. Vol. 26, N 7. - P. 1941-1946.

181. Petersen M. Cytochrome P450-dependent hydroxylation in the biosynthesis of rosmarinic acid in Coleus II Phytochemistry. 1997. - Vol. 45, N 6. - P. 1165-1172.

182. Harborne J.B., Williams C.A. Advances in flavonoid research since 1992 // Phytochemistry. 2000. - Vol. 55, N 6. - P. 481-504.

183. Donnelly D.M.X., Boland G.M. Isoflavonoids and neoflavonoids: naturally occurring O-heterocycles // Nat. Prod. Rep. 1995. - Vol. 12, N 3. - P. 321-338.

184. Veitch N.C. Isoflavonoids of the Leguminosae // Nat. Prod. Rep. 2007. - Vol. 24, N2.-P. 417-464.

185. Tanaka T., Ohyama M., linuma M., Shirataki Y., Komatsu M., Burandt C.L. Isoflavonoids from Sophora secundiflora, S. arizonica and S. gypsophila // Phytochemistry. 1998. - Vol. 48, N 7. - P. 1187-1193.

186. Chacha M., Bojase-Moleta G., Majinda R.R.T. Antimicrobial and radical scavenging flavonoids from the stem wood of Erythrina latissima II Phytochemistry.- 2005. Vol. 66, N 1. - P. 99-104.

187. Tahara S., Ibrahim R.K. Prenylated isoflavonoids an update // Phytochemistry.- 1995. Vol. 38, N 5. - P. 1073-1094.

188. Rao J.R., Rao R.S. Dalpaniculin, a C-glycosylisoflavone from Dalbergia paniculata seeds // Phytochemistry. 1991. - Vol. 30, N 2. - P. 715-716.

189. Chawla H.M., Chibber S.S., Seshadri T.R. Volubilinin, a new isoflavone-C-glycoside from Dalbergia volubilis flowers // Phytochemistry. 1976. - Vol. 15, N 1.- P. 235-237.

190. Park H.-J., Park J.-H., Moon J.-O., Lee K.-T., Jung W.-T., Oh S.-R., Lee H.-K. Isoflavone glycosides from the flowers of Pueraria thunbergiana II Phytochemistry. -1999.-Vol. 51, N 1.-P. 147-151.

191. Ma W.G., Fukushi Y., Hostettmann K., Tahara S. Isoflavonoid glycosides from Eriosema tuberosum II Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, N 1. - P. 251-254.

192. Nomenclature of organic chemistry / Eds.: Rigaudy J., Klesney S.P. Oxford et. al. : Pergamon Press, 1979. - P. 53-72.

193. Brooks C.J.W., Watson D.G. Phytoalexins // Nat. Prod. Rep. 1985. - Vol. 2, N 5. - P. 427-459.

194. Phillips D.A., Kapulnik Y. Plant isoflavonoids, pathogens and symbionts // Trends Microbiol. 1995. - Vol. 3, N 2. - P. 58-64.

195. Boland G.M., Donnelly D.M.X. Isoflavonoids and related compounds // Nat. Prod. Rep. 1998. - Vol. 15, N 3. - P. 241-260.

196. Iwashina T. The structure and distribution of the flavonoids in plants // J. Plant Res. 2000. - Vol. 113, N 3. - P. 287-299.

197. Reynaud J., Guilet D., Terreux R., Lussignol M., Walchshofer N. Isoflavonoids in non-leguminous families: an update // Nat. Prod. Rep. 2005. - Vol. 22, N 4. - P. 504-515.

198. Mackova Z., Koblovska R., Lapcik O. Distribution of isoflavonoids in non-leguminous taxa an update // Phytochemistry. - 2006. - Vol. 67, N 9. - P. 849855.

199. Chen L.J., Zhao X., Plummer S., Tang J., Games D.E. Quantitative determination and structural characterization of isoflavones in nutrition supplements by liquid chromatography-mass spectrometry//J. Chromatogr. A. -2005. Vol. 1082, N 1-2.- P. 60-70.

200. Andlauer W., Martena M.J., Fürst P. Determination of selected phytochemicals by reversed-phase high-performance liquid chromatography combined with ultraviolet and mass spectrometric detection // J. Chromatogr. A. 1999. - Vol. 849, N 2. - P. 341-348.

201. Tsao R., Papadopoulos Y., Yang R., Yong J. C., McRae K. Isoflavone profiles of red clovers and their distribution in different parts harvested at different growing stages // J. Agric. Food Chem. 2006. - Vol. 54, N 16. - P. 5797-5805.

202. Fang N., Yu S., Badger T.M. Characterization of isoflavones and their conjugates in female rat urine using LC/MS/MS //J. Agric. Food Chem. 2002. - Vol. 50, N 9. -P.2700-2707.

203. Wiseman H., Casey K., Clarke D.B., Barnes K.A., Bowey E. Isoflavone aglycon and glucoconjugate content of high- and low-soy U.K. foods used in nutritional studies // J. Agric. Food Chem. 2002. - Vol. 50, N 6. - P. 1404-1410.

204. Krenn L., Unterrieder I., Ruprechter R. Quantification of isoflavones in red clover by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 2002. - Vol. 777, N 1-2.-P. 123-128.

205. Wu Q., Wang M., Simon J.E. Determination of isoflavones in red clover and related species by high-performance liquid chromatography combined with ultraviolet and mass spectrometric detection // J. Chromatogr. A. 2003. - Vol. 1016, N2.-P. 195-209.

206. Yang F., Ma Y., Ito Y. Separation and purification of isoflavones from a crude soybean extract by high-speed counter-current chromatography // J. Chromatogr. A. -2001.-Vol. 928, N 2.-P. 163-170.

207. Tanaka H., Oh-Uchi T., Etoh H., Sako M., Sato M., Fukai T., Tateishi Y. An arylbenzofuran and four isoflavonoids from the roots of Erythrina poeppigiana II Phytochemistry. 2003. - Vol. 63, N 5. - P. 597-602.

208. Wandji J., Awanchiri S., Fomum Z.T., Tillequin F., Libot F. Isoflavones and alkaloids from the stem bark and seeds of Erythrina senegalensis II Phytochemistry. -1995.-Vol. 39, N 3. P. 677-681.

209. Nkengfack A.E., Vouffo T.W., Vardamides J.C., Kouam J., Fomum Z.T., Meyer M., Sterner O. Phenolic metabolites from Erythrina species // Phytochemistry. -1997. Vol. 46, N 3. - P. 573-578.

210. Tanaka H., Tanaka T., Hosoya A., Kitade Y., Etoh H. An isoflavan from Erythrinaxbidwillii II Phytochemistry. 1998. - Vol. 47, N 7. - P. 1397-1400.

211. Vetter J. Isoflavones in different parts of common Trifolium species // J. Agric. Food Chem. 1995. - Vol. 43, N 1. - P. 106-108.

212. Wang S., Ghisalberti E.L., Ridsdill-Smith J. Bioactive isoflavonols and other components from Trifolium subterraneum II J. Nat. Prod. 1998. - Vol. 61, N 4. - P. 508-510.

213. Palazzinoa G., Rasoanaivo P., Federici E., Nicoletti M., Galeffi C. Prenylated isoflavonoids from Millettia pervilleana II Phytochemistry. 2003. - Vol. 63, N 4. - P.471.474.

214. Abd El-Latif R.R., Shabana M.H., El-Gandour A.H., Mansour R.M., Sharaf M. A new isoflavone from Astragalus peregrinus II Chem. Nat. Compd. 2003. - Vol. 39, N 6. - P. 536-537.

215. Maver M., Queiroz E. F., Wolfender J.-L., Hostettmann K. Flavonoids from the stem of Eriophorum scheuchzeri II J. Nat. Prod. 2005. - Vol. 68, N 7. - P. 10941098.

216. Chang C.-H., Lin C.-C., Kadota S., Hattori M., Namba T. Flavonoids and a prenylated xantone from Cudrania cochinchinensis var. gerontogea H Phytochemistry. 1995. - Vol. 40, N 3. - P. 945-947.

217. Lopes N.P., Kato M.J., Yoshida M. Antifungal constituents from roots of Virola surinamensis II Phytochemistry. 1999. - Vol. 51, N 1. - P. 29-31.

218. Talukdar A.C., Jain N., De S., Krishnamurty H.G. An isoflavone from Myristica malabarica II Phytochemistry. 2000. - Vol. 53, N 1. - P. 155-157.

219. Messanga B.B., Kimbu S.F., Sondengam B.L., Bodo B. Triflavonoids of Oehna calodendron II Phytochemistry. 2002. - V. 59, N 4. P. 435-438.

220. Shawl A.S., Kumar T. Isoflavonoids from Iris crocea II Phytochemistry. 1992. -Vol. 31, N4.-P. 1399-1401.

221. Sanduja R., Martin G.E., Weinheimer A.J., Alam M., Hossain M.B., van der Helm D. Secondary metabolites of the coelenterate Echinopora lamellosa // J. Heterocycl. Chem. 1984. - Vol. 21, N 3. - P. 845-848.

222. Anhut S., Zinsmeister H.D., Mues R., Barz W., Mackenbrock К., Köster J., Markham K.R. The first identification of isoflavones from a bryophyte // Phytochemistry. 1984. - Vol. 23, N 5. - P. 1073-1075.

223. Delmonte P., Perry J., Rader J.I. Determination of isoflavones in dietary supplements containing soy, red clover and kudzu: extraction followed by basic or acid hydrolysis // J. Chromatogr. A. 2006. - Vol. 1107, N 1-2. - P. 59-69.

224. Уткин Л.М., Серебрякова А.П. Гликозиды изофлавонов Piptanthus nanus М. Pop. //Химия природ, соединений. 1965. - №1. - С. 70-72.

225. Toebes A.H.W., de Boer V., Verkleij J.A.C., Lingeman H., Ernst W.H.O. Extraction of isoflavone malonylglucosides from Trifolium pratense L. // J. Agric. Food Chem. 2005. - Vol. 53, N 12. - P. 4660^666.

226. Park H.-H., Hakamatsuka Т., Noguchi H., Sanakawa U., Ebizuka Y. Isoflavone glucosides exist as their 6"-0-malonyl esters in Pueraria lobata and its cell suspension cultutes // Chem. Pharm. Bull. 1992. - Vol. 40, N 7. - P. 1978-1980.

227. Chkadua N.F., Alanlya M.D., Kemertelidze Ё.Р. Flavonoids of the rhizomes of Pueraria hirsuta И Chem. Nat. Compd. 1996. - Vol. 32, N 6. - P. 920.

228. Rong H., Stevens J.F., Deinzer M.L., De Cooman L., De Keukeleire D. Identification of isoflavones in the roots of Pueraria lobata II Planta Med. 1998. -Vol. 64, N 7. - P. 620-627.

229. Wang C.-Y., Hang H.-Y., Kuo K.-L., Hsieh Y.-Z. Analysis of Puerariae radix and its medicinal preparations by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1998. -Vol. 802, N 1. - P. 225-231.

230. Yuldashev M.P., Batirov É.Kh., Malikov V.M., Yuldasheva N.P. Flavonoids of Psoralea drupaceae and Reseda luteola II Chem. Nat. Compd. 1996. - Vol. 32, N 6. - P. 923-924.

231. Caballero P., Smith C.M., Fronczek F.R., Fischer N.H. Isoflavones from an insect-resistant variety of soybean and the molecular structure of afrormosin // J. Nat. Prod.-1986.-Vol. 49, N 6. P. 1126-1129.

232. Federici E., Touché A., Choquart S., Avanti O., Fay L., Offord E., Courtois D. High isoflavone content and estrogenic activity of 25 year-old Glycine max tissue cultures // Phytochemistry. 2003. - Vol. 64, N 3. - P. 717-724.

233. Hosny M. Rosazza J.P.N. New isoflavone and triterpene glycosides from soybeans // J. Nat. Prod. 2002. - V. 65, N 6. - P. 805-813.

234. Watanabe K., Kinjo J., Nohara T. Three new isoflavonoid glycosides from Lupinus luteus and L. polyphyllus*arboreus II Chem. Pharm. Bull. 1993. - Vol. 41, N 2. - P. 394-396.

235. Dini I., Schettino O., Dini A. Studies on the constituents of Lupinus mutabilis (Fabaceae). Isolation and characterization of two new isoflavonoid derivatives // J. Agrie. Food Chem. 1998. - Vol. 46, N 12. - P. 5089-5092.

236. Ferrer M.A., Pedreno M.A., Muñoz R., Ros Barceel A. Constitutive isoflavones as modulators indole-3-acetic acid oxidase activity of acidic cell wall isoperoxidases from lupin hypocotyls // Phytochemistry. 1992. - Vol. 31, N 11. - P. 3681-3684.

237. Gagnon H., Ibrahim R.K. Effects of elisitors on the accomulation and secretion of isoflavonoids in white lupin // Phyrochemistry. 1997. - Vol. 44, N 8. - P. 14631467.

238. Kinoshita T„ Ichinose K., Takahashi C., Ho F.-C., Wu J.-B., Sankawa U. Chemical studies on Sophora tomentosa: the isolation of a new class of isoflavonoids // Chem. Pharm. Bull. 1990. - Vol. 38, N 10. - P. 2756-2759.

239. Yamamoto H., Ichimura M., Tanaka T., linuma M., Mizuno M. A trifolirhizin malonate from Sophora flavescens var. Angustifolia and its stability // Phytochemistry. 1991. - Vol. 30, N 5. - P. 1732-1733.

240. Lee H.-J., Lee O.-K., Kwon Y.-H., Choi D.-H., Kang H.-Y., Lee H.-Y., Paik K.-H., Lee H.-J. Isoflavone glycosides from the bark of Amorpha fruticosa II Chem. Nat. Compd. 2006. -Vol. 42, N 4. - P. 415-418.

241. Herath H.M.T.B., Dassanayake R.S., Priyadarshani A.M.A., De Silva S., Wannigama G.P., Jamie J. Isoflavonoids and a pterocarpan from Gliricidia sepium // Phytochemistry.-1998.-Vol.47, N 1. P. 117-119.

242. Markham K.R., Swift W.T., Mabry T.J. New isofiavone glycoside from Baptisia australis II J. Org. Chem. 1968. - Vol. 33, N 1. - P. 462-464.

243. Markham K.R., Mabry T.J., Swift T.W. New isoflavones from the genus Baptisia (Leguminosae) // Phytochemistry. 1968. - Vol. 7, N 5. - P. 803-808.

244. Юсупова С.С., Батуров Е.К., Киамитдинова Ф., Маликов М. Isoflavonoids of Cicer mogoltavicum II Химия природ, соединений. 1986. - № 5. - С. 603-604.

245. Stevenson Р.С., Veitch N.C. Isoflavenes from the roots of Cicer judaicum II Phytochemistry. 1996. - Vol. 43, N 3. - P. 695-700.

246. McMurry T.B.H., Martin E., Donnelly D.M.X., Thompson J.C. 3-Hydroxy-9-methoxy and 3-methoxy-9-hydroxypterocarpans // Phytochemistry. 1972. - Vol. 11, N 11.-P. 3283-3286.

247. Yahara S., Ogata Т., Saijo R., Konishi R., Yamahara J., Miyahara K., Nohara T. Isoflavan and related compounds from Dalbergia odorífera. I // Chem. Pharm. Bull. -1989. Vol. 37, N 4. - P. 979-987.

248. Ramesh P., Yuvarajan C.R. Coromandelin, a new isofiavone apioglucoside from the leaves of Dalbergia coromandeliana И J. Nat. Prod. 1995. - Vol. 58, N 8. - P. 1240-1241.

249. Khan I.A., Avery M.A., Burandt C.L., Goins D.K., Mikell J.R., Nash Т.Е., Azadegan A., Walker L.A. Antigiardial activity of isoflavones from Dalbergia frutescens bark//J. Nat. Prod. -2000. Vol. 63, N 10. - P. 1414-1416.

250. Farag S.F., Ahmed A.S., Terashima K., Takaya Y., Niwa M. Isoflavonoid glycosides from Dalbergia sissoo II Phytochemistry. 2001. - Vol. 57, N 8. - P. 1263-1268.

251. Ito C., Itoigawa M., Kanematsu Т., Ruangrungsi N., Mukainaka Т., Tokuda H., Nishino H., Furukawa H. Isoflavonoids from Dalbergia olivari II Phytochemistry. -2003. Vol. 64, N 7. - P. 1265-1268.

252. Máximo P., Lourengo A. A pterocarpan from Ulex parviflorus И Phytochemistry. -1998. Vol. 48, N 2. - P. 359-362.

253. Chaudhuri S.K., Fullas F., Wani M.C., Wall M.E., Tucker J.C., Beecher C.W.W., Kinghorn A.D. Two isoflavones from the bark of Petalostemon purpureus II Phytochemistry. 1996. - Vol. 41, N 3. - P. 945-946.

254. Chibber S.S., Sharma R.P. Derrone, a new pyranoisoflavone from Derris robusta seeds // Phytochemistry. 1980. - Vol. 19, N 8. - P. 1857-1858.

255. Laupattarakasem P., Houghton P.J., Hoult J., Robin S. Anti-inflammatory isoflavonoids from the stems Derris scandens II Planta Med. 2004. - Vol. 70, N 6. -P. 496-501.

256. Mahabusarakam W., Deachathai S., Phongpaichit S., Jansakul C., Taylor W.C. A benzil and isoflavone derivatives from Derris scandens Benth. // Phytochemistry. -2004. Vol. 65, N 8. - P. 1185-1191.

257. Coronado C., Zuanazzi J.A.S., Sallaud C., Quirion J.C., Esnault R., Husson H.P., Kondorosi A., Ratet P. Alfalfa root flavonoid production is nitrogen regulated // Plant Physiol. 1995. - Vol. 108, N 2. - P. 533-542.

258. He X.-Z., Reddy J.T., Dixon R.A. Stress responses in alfalfa (Medicago sativa L). XXII. cDNA cloning and characterization of an elicitor-inducible isoflavone 7-0-methyltransferase // Plant Mol. Biol. 1998. - Vol. 36, N 1. - P. 43-54.

259. Daniell T., O'Hagon D,, Edwards R. Alfalfa cell cultures treated with fungal elicitor accumulate flavone metabolites rather than isoflavones in the presence of the methylation ingibitor tubericidin // Phytochemistry. 1997. - Vol. 44, N 2. - P. 285291.

260. Keung W.-M., Vallee B.L. Daidzin: a potent, selective inhibitor of human mitochondrial aldehyde dehydrogenase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. -Vol. 90, N4.-P. 1247-1251.

261. Liu Y., Chen H.-B., Zhao Y.-Y., Wang B., Zhang Q.-Y., Zhang L„ Tu P. Quantification and stability studies on the flavonoids of Radix hedysari II J. Agric. Food Chem. -2006. Vol. 54, N 18. - P. 6634-6639.

262. Stacker P., Yousfi M., Salmi C., Perrier J., Brunei J.M., Moulin A. Maackiain 3-0-(6'-0-malonyl-b-D-glucopyranoside) from Oudneya africana, a powerful inhibitor of porcine kidney acylase I // Biochimie. 2005. - Vol. 87, N 6. - P. 507-512.

263. Qin M.-J., Ji W.-L., Wang Z.-T., Ye W.-C. A new isoflavonoid from Belamcanda chinensis (L.) DC // J. Integr. Plant Biol. 2005. - Vol. 47, N 11. - P. 1404-1408.

264. Valderrama J.C.M. Distribution of flavonoids in the Myristicaceae // Phytochemistry. 2000. - Vol. 55, N 6. - P. 505-511.

265. Lapcik O., Klejdus B., Davidova M., Kokoska L., Kuban V., Moravcova J. Isoflavonoids in the Rutaceae family: 1. Fortunella obovata, Murraya paniculata and four Citrus species // Phytochem. Anal. 2004. - Vol. 15, N 5. - P. 293-299.

266. Puripattanavong J., Weber S., Brecht V., Frahm A.W. Phytochemical investigation of Aglaia andamanica II Planta Med. 2000. - Vol. 66, N 8. - P. 740745.

267. Matsuda H., Morikawa T., Xu F., Ninomiya K., Yoshikawa M. New isoflavones and pterocarpane with hepatoprotective activity from the stems of Erycibe expansa II Planta Med.-2004.-Vol. 70, N 12.-P. 1201-1209.

268. McCormick S., Robson K., Bohm B. Flavonoids of Wyethia angustifolia and W. helenioides II Phytochemistry. 1986. - Vol. 25, N 7. - P. 1723-1726.

269. Al-Khalil S., Al-Eisawi D., Kato M., linuma M. New isoflavones from Iris nigricans II J. Nat. Prod.-1994.-Vol. 57, N2.-P. 201-205.

270. Choudhary M.I., Kharim S., Tashkhodzhaev B., Turgunov K.K., Sultankhodzhaev M.N., Atta-ur-Rahman, Israr M. Crystal and molecular structure of the isoflavones irilin B and betavulgarin // Chem. Nat. Compd. 2005. - Vol. 41, N 4. - P. 396-399.

271. Atta-ur-Rahman, Nasim S., Baig I., Ara Jahan I., Sener B., Orhan I., Choudhary M.I. Isoflavonoid glycosides from the rhizomes of Iris germanica II Chem. Pharm. Bull. 2002. - Vol. 50, N 8. - P. 1100-1102.

272. Minami H., Okubo A., Kodama M., Fukuyama Y. Highly oxygenated isoflavones from Iris japonica II Phytochemistry. 1996. - Vol. 41, N 4. - P. 1219-1221.

273. Purev O., Purevsuren C., Narantuya S., Lkhagvasuren S., Mizukami H., Nagatsu A. New isoflavones and flavanol from Iris potaninii II Chem. Pharm. Bull. 2002. - ■ Vol. 50, N 10.-P. 1367-1369.

274. Farag S.F., Backheet E.Y., El-Emary N.A., Niwa M. Isoflavonoids and flavone glycosides from rhizomes of Iris carthaliniae II Phytochemistry. 1999. - Vol. 50, N 8.-P. 1407-1410.

275. Murphy P.A., Barua K., Hauck C.C. Solvent extraction selection in the determination of isoflavones in soy foods // J. Chromatogr. B. 2002. - Vol. 777, N 1-2.-P. 129-138.

276. Rostagno M.A., Palma M., Barroso C.G. Ultrasound-assisted extraction of soy isoflavones //J. Chromatogr. A. 2003. - Vol. 1012, N 2. - P. 119-128.

277. Mathias K., Ismail B., Corvalan C.M., Hayes K.D. Heat and pH effects on the conjugated forms of genistin and daidzin isoflavones // J. Agric. Food Chem. 2006. -Vol. 54, N 20. - P. 7495-7502.

278. Schijlen E.G.W.M., de Vos C.H.R., van Tunen A.J., Bovy A.G. Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants // Phytochemistry. 2004. - Vol. 65, N 19. - P. 2631-2648.

279. Hakamatsuka T., Hashim M.F., Ebizuka Y., Sankawa U. P-450-dependent oxidative rearrangement in isoflavone biosynthesis: reconstitution of P-450 and NADPH:P-450 reductase // Tetrahedron. 1991. - Vol. 47, N 31. - P. 5969-5978.

280. Dhaubhadel S., McGarvey B.D., Williams R., Gijzen M. Isoflavonoid biosynthesis and accumulation in developing soybean seeds // Plant Mol. Biol. 2003. - Vol. 53, N 6. - P. 733-743.

281. Hinderer W., Flentje U., Barz W. Microsomal isoflavone 2'- and 3-hydroxylases from chickpea (Cicer arietinum L.) cell suspensions induced for pterocarpan phytoalexin formation // FEBS Lett. 1987. - Vol. 214, N 1. - P. 101-106.

282. Colliver S.P., Morris P., Robbins M.P. Differential modification of flavonoid and isoflavonoid biosynthesis with an antisense chalcone synthase construct in transgenic Lotus corniculatus// Plant Mol. Biol. 1997. - Vol. 35, N 4. - P. 509-522.

283. Lopez-Meyer M., Paiva N.L. Immunolocalization of vestitone reductase and isoflavone reductase, two enzymes involved in the biosynthesis of the phytoalexin medicarpin // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2002. - Vol. 61, N 1. - P. 15-30.

284. Tiemann K., Hinderer W., Barz W. Isolation of NADPH:isoflavone oxidoreductase, a new enzyme of Pterocarpan phytoalexin biosynthesis in cell suspension cultures of Cicer arietinum // FEBS Lett. 1987. - Vol. 213, N 2. - P. 324-328.

285. Landini S., Graham M.Y., Graham T.L. Lactofen induces isoflavone accumulation and glyceollin elicitation competency in soybean // Phytochemistry. 2003. - Vol. 62, N 6. - P. 865-874.

286. Yu O., Shi J., Hession A.O., Maxwell C.A., McGonigle B., Odell J.T. Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed // Phytochemistry. 2003. - Vol. 63, N 7. - P. 753-763.

287. Kim B.G., Kim S.-Y., Song H.S., Lee C., Hur H.-G., Kim S.-l., Ahn J.-H. Cloning and expression of the isoflavone synthase gene (IFS-Tp) from Trifolium pratense II Mol. Cells. 2003. - Vol. 15, N 3. - P. 301-306.

288. Aronson W.J., Tymchuk C.N., Elashoff R.M., McBride W.H., McLean C., Wang H., Heber D. Decreased growth of human prostate LNCaP tumors in SCID mice fed a low-fat, soy protein diet with isoflavones // Nutr. Cancer. 1999. - Vol. 35, N 2. -P. 130-136.

289. Sartippour M.R., Rao J.Y., Apple S., Wu D., Henning S„ Wang H., Elashoff R., Rubio R., Heber D., Brooks M.N. A pilot clinical study of short-term isoflavone supplements in breast cancer patients // Nutr. Cancer. 2004. - Vol. 49, N 1. - P. 59-65.

290. Hintz K.K., Ren J. Phytoestrogenic isoflavones daidzein and genistein reduce glucose-toxicity-induced cardiac contractile dysfunction in ventricular myocytes // Endocr. Res. 2004. - Vol. 30, N 2. - P. 215-223.

291. Sarkar F.H., Li Y. Soy isoflavones and cancer prevention // Cancer Invest. -2003. Vol. 21, N 5. - P. 744-757.

292. Adlercreutz H., Heinonen S.M., Penalvo-Garcia J. Phytoestrogens, cancer and coronary heart disease // BioFactors. 2004. - Vol. 22, N 1-4. - P. 229-236.

293. Cornwell T., Cohick W., Raskin I. Dietary phytoestrogens and health // Phytochemistry. 2004. - Vol. 65, N 8. - P. 995-1016.

294. Reinwald S., Weaver C.M. Soy isoflavones and bone health: a double-edged sword? // J. Nat. Prod. 2006. - Vol. 69, N 3. - P. 450-459.

295. Tikkanen M.J., Adlercreutz H. Dietary soy-derived isoflavone phytoestrogens. Could they have a role in coronary hert dizeaze prevention? // Biochem. Pharmacol. 2000. - Vol. 60, N 1. - P. 1-5.

296. McCue P., Shetty K. Health benefits of soy isoflavonoids and strategies for enhancement: a review // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2004. - Vol. 44, N 5. - P. 361367.

297. Guan L., Yeung S.Y.V., Huang Y., Chen Z.-Y. Both soybean and kudzu phytoestrogens modify favorably the blood lipoprotein profile in ovariectomized and castrated hamsters // J. Agric. Food Chem. -2006. Vol. 54, N 13. - P. 4907-4912.

298. Kondo K., Suzuki Y., Ikeda Y., Umemura K. Genistein, an isoflavone included in soy, inhibits thrombotic vessel occlusion in the mouse femoral artery and in vitro platelet aggregation // Eur. J. Pharmacol. -2002. Vol. 455, N 1. - P. 53-57.

299. Akiyama T., Ogawara H. Use and specificity of genistein as inhibitor of protein-tyrosine kinases // Methods Enzymol. 1991. - Vol. 201. - P. 362-370.

300. Zielonka J., Gebicki J., Grynkiewicz G. Radical scavenging properties of genistein // Free Radic. Biol. Med. 2003. - Vol. 35, N 8. - P. 958-965.

301. Ferretti G., Bacchetti T., Menanno F., Curatola G. Effect of genistein against copper-induced lipid peroxidation of human high density lipoproteins (HDL) // Atherosclerosis. 2004. - Vol. 172, N 1. - P. 55-61.

302. Mizunuma H., Kanazawa K., Ogura S., Otsuka S., Nagai H. Anticarcinogenic effects of isoflavones may be mediated by genistein in mouse mammary tumor virus-induced breast cancer // Oncology. 2002. - Vol. 62, N 1. - P. 78-84.

303. Dalu A., Blaydes B.S., Bryant C.W., Latendresse J.R., Weis C.C., Delclos K.B. Estrogen receptor expression in the prostate of rats treated with dietary genistein // J. Chromatogr. B. 2002. - Vol. 777, N 1-2. - P. 249-260.

304. Sarkar F.H., Li Y. Mechanisms of cancer chemoprevention by soy isoflavone genistein // Cancer Metastasis Rev. 2002. - Vol. 21, N 3-4. - P. 265-280.

305. Gao S., Liu G.Z., Wang Z. Modulation androgen receptor-dependent transcription by rezveratrol and genistein in prostate cancer cell // Prostate. 2004. - Vol. 59, N 2. - P. 214-225.

306. Tominaga Y., Wang A., Wang R.H., Wang X., Cao L., Deng C.X. Genistein inhibits Brcal mutant tumor growth through activation of DNA damage checkpoints, cell cycle arrest, and mitotic catastrophe // Cell Death Differ. 2007. - Vol. 14, N 3.- P. 472—479.

307. Chen W.F., Huang M.H., Tzang C.H., Yang M., Wong M.S. Inhibitory actions of genistein in human breast cancer (MCF-7) cells // Biochim. Biophys. Acta. 2003. -Vol. 1638, N 2.-P. 187-196.

308. Falcao M.J.C., Pouliquem Y.B.M., Lima M.A.S., Gramosa N.V., Costa-Lotufo L.V., Militao G.C.G., Pessoa C., de Moraes M.O., Silveira E.R. Cytotoxic flavonoids from Platymiscium floribundum II J. Nat. Prod. 2005. - Vol. 68, N 3. - P. 423-426.

309. Sugimoto E., Yamaguchi M. Stimulatory effect of daidzein in osteoblastic MC3T3-E1 cells // Biochem. Pharmacol. 2000. - Vol. 59, N 5. - P. 471-475.

310. Migliaccio S., Anderson J.J.B. Isoflavones and skeletal health: are these molecules ready for clinical application? // Osteoporosis Int. 2003. - Vol. 14, N 5. -P. 361-368.

311. Rice-Evans C. Flavonoid antioxidants // Curr. Med. Chem. 2001. - Vol. 8, N 7.- P. 797-807.

312. Lee J.H., Lee B.W., Kim J.H., Jeong T.-S., Kim M.J., Lee W.S., Park K.H. LDL-antioxidant pterocarpans from roots of Glycine max (L.) Merr. // J. Agric. Food Chem. 2006. - Vol. 54, N 6. - P. 2057-2063.

313. Rüfer C.E., Kulling S.E. Antioxidant activity of isoflavones and their major metabolites using different in vitro assays // J. Agrie. Food Chem. 2006. - Vol. 54, N8.-P. 2926-2931.

314. Verdrengh M., Jonsson I.M., Holmdahl R., Tarkowski A. Genistein as an antiinflammatory agent // Inflam. Res. 2003. - Vol. 52, N 8. - P. 341-346.

315. Keung W.M., Vallee B.L. Daidzin and daidzein suppress free-choice ethanol intake by Syrian golden hamsters // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 1993. - Vol. 90, N21.-P. 10008-10012.

316. Shimada N., Akashi T., Aoki T., Ayabe S. Induction of isoflavonoid pathway in the model legume Lotus japonicus: molecular characterization of enzymes involved in phytoalexin biosynthesis // Plant Sci. -2000. Vol. 160, N 1. - P. 37-^7.

317. Aoki T., Akashi T., Ayabe S. Flavonoids of Leguminous plants: structure, biological activity, and biosynthesis // J. Plant Res. 2000. - Vol. 113, N 4. - P. 475—488.

318. Durango D., Quiñones W., Torres F., Rosero Y., Gil J., Echeverri F. Phytoalexin accumulation in Colombian bean varieties and aminosugars as elicitors // Molecules. -2002.-Vol. 7, N 11.-P. 817-832.

319. Wu Q., Preisig C.L., VanEtten H.D. Isolation of the cDNAs encoding (+)6a-hydroxymaackiain 3-O-methyltransferase, the terminal step for the synthesis of the phytoalexin pisatin in Pisum satvium II Plant Mol. Biol. 1997. - Vol. 35, N 5. - P. 551-560.

320. Li W., Koike K., Asada Y., Hirotani M., Rui H., Yoshikawa T., Nikaido T. Flavonoids from Glycyrrhiza pallidiflora hairy root cultures // Phytochemistry. 2002. -Vol. 60, N4.-P. 351-355.

321. Kessmann H., Barz W. Accumulation of isoflavones and pterocarpan phytoalexins in cell suspension cultures of different cultivars of chickpea (Cicer arietinum) II Plant Cell Reports. 1987. - Vol. 6, N 1. - P. 55-59.

322. Weidemann С., Tenhaken R., Hohl U., Barz W. Medicarpin and maackiain 3-0• glucoside-6-O-malonate conjugates are constitutive compounds in chickpea (C/'cerarietinum L.) cell cultures // Plant Cell Reports. 1991. - Vol. 10, N 6-7. - P. 371374.

323. Boltenkov E.V., Rybin V.G., Zarembo E.V. Flavones from callus tissue of Iris ensata II Chem. Nat. Compd. 2005. - Vol. 41, N 5. - P. 539-541.

324. Li W., Asada Y., Yoshikawa T. Flavonoid constituents from Glycyrrhiza glabra hairy root cultures // Phytochemistry. 2000. - Vol. 55, N 5. - P. 447-456.

325. Li W., Asada Y., Koike K., Hirotani M., Rui H., Yoshikawa Т., Nikaido T. Flavonoids from Glycyrrhiza pallidiflora hairy root cultures // Phytochemistry. 2001. -Vol. 58, N4.-P. 595-598.

326. Park H.-H., Hakamatsuka Т., Sankava U., Ebizuka Y. Effects of various elisitors on the accumulations and secretion of isoflavonoids in the Whit Lupin // Phytochemistry. 1997. - Vol. 44, N 8. - P. 1463-1467.

327. Park H.H., Hakamatsuka Т., Sankawa U., Ebizuka Y. Rapid metabolism of isoflavonoids in elicitor-treated cell suspension cultures of Pueraria lobata II Phytochemistry. 1995. - Vol. 38, N 2. - P. 373-380.

328. Luczkiewicz M., Gtod D. Callus cultures of genista plants in vitro material producing high amounts of isoflavones of phytoestrogen^ activity // Plant Sci. -2003. - Vol. 165, N 5. - P. 1101-1108.

329. Максимов О.Б., Кулеш Н.И., Горовой П.Г. Биологически активные вещества Maackia amurensis Rupr. et Maxim, и перспективы использования этого вида в медицине // Раст. ресурсы. 1992. - Т. 28, вып. 3. - С. 157-163.

330. Molchanova A.I., Sokolova L.I., Gorovoi P.G. Quinolizidine alkaloids from Maackia amurensis runners // Chem. Nat. Compd. 2006. - Vol. 42, N 6. - P. 745746.

331. Van Damme E.J.M., Van Leuven F., Peumans W.J. Isolation, characterization and molecular cloning of the bark lectins from Maackia amurensis II Glycoconjugate. J. 1997. - Vol. 14, N 4. - P. 449-456.

332. Takai M., Yamaguchi H., Saitoh Т., Shibata S. Chemical studies on the oriental plant drugs. XXXV. The chemical constituents of the heartwood of Maackia amurensis var. buergeri II Chem. Pharm. Bull. 1972. - Vol. 20, N 11. - P. 24882490.

333. Максимов О.Б., Кулеш Н.И., Степаненко Л.С. Маакия амурская. Экстрактивные вещества древесины и их биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 1998. - Т. 6. - С. 447-460.

334. Максимов О.Б., Кривощекова О.Е., Степаненко Л.С., Богуславская Л.В. Изофлавоны и стильбены ядровой древесины Maackia amurensis II Химия природ, соединений. 1985. - № 6. - С. 775-781.

335. Кривощекова О.Е., Степаненко Л.С., Максимов О.Б. Новый изофлавоно-стильбен из ядровой древесины Maackia amurensis II Химия природ, соединений. 1986. - № 1. - С. 39-42.

336. Комиссаренко А.И., Ковалев В.Н., Комиссаренко Н.Ф. Изофлавоноиды коры и листьев Maackia amurensis И Химия природ, соединений. 1994. - № 3. - С. 288-290.

337. Kulesh N.I., Denisenko V.A., Maksimov О.В. Stilbenolignan from Maackia amurensis II Phytochemistry. 1995. - Vol. 40, N 3. - P. 1001-1003.

338. Kulesh N.I., Maksimov O.B., Denisenko V.A., Glazunov V.P. Isoflavonoids from heartwood of Maackia amurensis Rupr. et Maxim. // Chem. Nat. Compd. 2001. -Vol. 37, N 1.-P. 29-31.

339. Matsuura N., Nakai R., linuma M., Tanaka Т., Inoue K. A prenylated flavanone from roots of Maackia amurensis subsp. Buergeri // Phytochemistry 1994. - Vol. 36, N 1.-P. 255-256.

340. Kulesh N.I., Denisenko V.A. Polyphenols from Maackia amurensis root bark // Chem. Nat. Compd. 2003. - Vol. 39, N 6. - P. 599-600.

341. Li X., Wang D., Xia M.-y., Wang Z.-h„ Wang W.-n„ Cui Z. Cytotoxic prenylated flavonoids from the stem bark of Maackia amurensis II Chem. Pharm. Bull. 2009. -Vol. 57, N 3. - P. 302-306.

342. Покушалова T.B., Глебко Л.И., Степаненко Л.С., Кулеш Н.И., Горовой П.Г. Содержание экстрактивных веществ и мономерных фенольных компонентов в ядровой древесине Maackia amurensis Rupr. et Maxim. // Раст. ресурсы. 1990. -Т. 26, вып. 4. - С. 555-558.

343. Покушалова Т.В., Глебко Л.И., Максимов О.Б. Определение фенольных компонентов в спиртовых экстрактах из древесины Maackia amurensis // Химия природ, соединений. 1988. - № 6. - С. 801-804.

344. Покушалова Т.В., Кулеш Н.И., Глебко Л.И. Метод количественного определения изофлавонов и полигидроксистильбенов Maackia amurensis // Химия природ, соединений. 1992. - № 5. - С. 440-441.

345. Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопротекторов при экспериментальном токсическом поражении печени : дис. . д-ра мед. наук /Сиб. гос. мед. ун-т. Томск, 1991. -310 с.

346. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

347. Новиков В.Е., Климкина Е.А. Фармакология гепатопротекторов // Обзоры по клин, фармакологии и лекарств, терапии. 2005. - Т. 4, № 1. - С. 2-20.

348. Kren V., Walterova D. Silybin and silymarin new effects and applications // Biomed. Pap. - 2005. - Vol. 149, N 1. - P. 29-41.

349. Pradhan S.C., Girish C. Hepatoprotective herbal drug, silymarin from experimental pharmacology to clinical medicine // Indian J. Med. Res. 2006. - Vol. 124, N 11.-P. 491-504.

350. Венгеровский А.И., Саратиков A.C. Механизм действия гепатопротекторов при токсических поражениях печени // Фармакология и токсикология. 1988. -Т. 51, № 1.-С. 89-93.

351. Чучалин B.C. Фармакологические и технологические аспекты разработки новых гепатопротективных препаратов природного происхождения : автореф. дис. . д-ра фарм. наук. Томск, 2003. - 43 с.

352. Сейфулла Р.Д., Борисова И.Г. Проблемы фармакологии антиоксидантов // Фармакология и токсикология. 1992. - Т. 53, № 6. - С. 3-10.

353. Венгеровский А.И., Саратиков А.С., Чучалин B.C., Паульс О.В. Влияние гепатопротекторов на метаболизм липидов при ССЦ-гепатите // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1987. - № 4. - С. 430-432.

354. Саратиков А.С., Венгеровский А.И. Новые гепатопротекторы природного происхождения // Эксперим. клин, фармакология. 1995. - Т. 58, № 1. - С. 811.

355. Schandalik R., Perucca Е. Pharmacokinetics of silybin following oral administration of silipide in patients with extrahepatic biliary obstruction // Drugs Exp. Clin. Res. 1994. - Vol. 20, № 1. - P. 37-42.

356. Венгеровский А.И., Седых И.M., Власова Т.В., Саратиков A.C. Гепатозащитные свойства полифенолов Maackia amurensis Rupr. et Maxim, при экспериментальной токсической патологии печени // Раст. ресурсы. 1993. - Т. 29, вып. 3. - С. 95-99.

357. Венгеровский А.И., Седых И.М., Саратиков A.C. Влияние полифенолов маакии амурской на антитоксическую функцию печени // Эксперим. клин, фармакология. 1993. - Т. 56, № 5. - С. 47-49.

358. Саратиков A.C., Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Чучалин B.C. Эффективность гепатозащитных средств при экспериментальном хроническом гепатите // Эксперим. клин, фармакология. 1995. - Т. 59, № 1. - С. 24-26.

359. Власова Т.В., Венгеровский А.И., Саратиков A.C. Полифенолы маакии амурской эффективное гепатозащитное средство // Хим.-фарм. журн. - 1994. - № 3. - С. 56-59.

360. Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Чучалин B.C., Саратиков A.C. Влияние гепатопротекторов, содержащих полифенолы, на течение экспериментального хронического гепатита //Хим.-фарм. журн. 1995. - № 2. - С. 3-4.

361. Саратиков A.C., Венгеровский А.И., Мозжелин М.Е., Суходоло И.В. Защитное действие максара при экспериментальном остром панкреатите // Хим.-фарм. журн. 2001. - Т. 35, № 12. - С. 6-7.

362. Саратиков A.C., Лившиц Н.С., Бурченкова Ф.И., Кадычагова Н.Г., Ахмеджанов P.P., Баширова Л.В. Доклиническое изучение безопасности максара // Эксперим. клин, фармакология. 2003. - Т. 66, № 6. - С. 53-55.

363. Гайсаев P.O., Белобородова Э.И. Влияние гепатопротектора максара на функциональное состояние печени при хроническом гепатите // Сиб. журн. гастроэнтерологии и гепатологии. 1997. - № 6-7. - С. 114.

364. Гайсаев P.O., Белобородова Э.И., Шлисман М.Н., Каблукова И.Б. Влияние гепатопротектора максара на свертывающую систему крови у больных хроническим гепатитом и циррозом печени // Сиб. журн. гастроэнтерологии и гепатологии. 1998. - № 7. - С. 314.

365. Гайсаев P.O. Влияние гепатопротектора максара на морфофункциональное состояние печени у больных хроническим гепатитом : автореф. дис. . канд. мед. наук. Томск, 2000. - 30 с.

366. Пат. 2175237 Российская Федерация, МПК 7 А 61К 35/78, А 61 Р 1/16. Способ лечения хронических гепатитов / Гайсаев P.O., Белобородова Э.И.,

367. Саратиков А.С; заявл. 02.06.1998; опубл. 27.10.2001, Бюл. №. 30. -10 с. (Патент передан в 2002 г. ТИБОХ ДВО РАН).

368. Белобородова Э.И., Шаловай А.А., Гайсаев P.O. Эффективность максара в лечении хронического гепатита // Эффективность растительных гепатопротекторов при хронических гепатитах. Томск: Изд-во НТЛ. - 2003. -С. 63-115.

369. Shen Т., Wang X.-N., Lou Н.-Х. Natural stilbenes: an overview // Nat. Prod. Rep. -2009.-Vol. 26, N 7.-P. 916-935.

370. Eckermann C., Schroder G., Eckermann S., Strack D., Schmidt J., Schneider В., Schroder J. Stilbenecarboxylate biosynthesis: a new function in the family of chalcone synthase-related proteins // Phytochemistry. 2003. - Vol. 62, N 3. - P. 271-286.

371. Liu S., Hu Y., Wang X., Zhong J., Lin Z. High content of resveratrol in lettuce transformed with a stilbene synthase gene of Parthenocissus henryana // J. Agric. Food Chem. 2006. - Vol. 54, N 21. - P. 8082-8085.

372. Huang K.S., Lin M. Oligostilbenes from the root of Vitis amurensis II J. Asian Nat. Prod. Res. 1999. - Vol. 2, N 1. - P. 21-28.

373. Huang K.-S., Lin M., Yu L.-N., Kong M. Four novel oligostilbenes from the roots of Vitis amurensis И Tetrahedron. 2000. - Vol. 56, N 10. - P. 1321-1329.

374. Huang K.-S., Lin M., Cheng G.-F. Anti-inflammatory tetramers of resveratrol from the roots of Vitis amurensis and the conformations of the seven-membered ring in some oligostilbenes // Phytochemistry. 2001. - Vol. 58, N 2. - P. 357-362.

375. Li W.-W., Ding L.-S., Li B.-G., Chen Y.-Z. Oligostilbenes from Vitis heyneana II Phytochemistry. 1996. - Vol. 42, N 4. - P. 1163-1165.

376. Ito J., Takaya Y., Oshima Y., Niwa M. New oligostilbenes having a benzofuran from Vitis vinifera Kyohou' // Tetrahedron. 1999. - Vol. 55, N 9. - P. 2529-2544.

377. Oshima Y., Kamijou A., Moritani H., Namao K., Ohizumi Y. Vitisin A and cis-vitisin A, strongly hepatotoxic plant oligostilbenes from Vitis coignetiae (Vitaceae) // J. Org. Chem. 1993. - Vol. 58, N 4. - P. 850-853.

378. Coggon T.P., King J., Wallwork S.C. The structure of hopeaphenol // Chem. Commun. 1966. - N 13. - P. 439-^40.

379. Coggon P., McPhail A.T., Wallwork S.C. Structure of hopeaphenol: X-Ray analysis of the benzene solvate of dibromodeca-O-methylhopeaphenol // J. Chem. Soc. B. 1970. - P. 884-897.

380. Ito J., Niwa M., Oshima Y. A new hydroxystilbene tetramer named isohopeaphenol from Vitis vinifera 'Kyohou' // Heterocycles. 1997. - Vol. 45, N 9. -P. 1809-1813.

381. Zgoda-Pols J.R., Freyer A.J., Killmer L.B., Porter J.R. Antimicrobial resveratrol tetramers from the stem bark of Vatica oblongifolia ssp. oblongifolia II J. Nat. Prod. -2002. Vol. 65, N 11. - P. 1554-1559.

382. De la Lastra C.A., Villegas I. Resveratrol as an anti-inflammatory and anti-aging agent: mechanisms and clinical implications // Mol. Nutr. Food Res. 2005. - Vol. 49, N 5. - P. 405-430.

383. Wu S.-N. Large-conductance Ca2+-activated K+ channels: physiological role and pharmacology//Curr. Med. Chem. -2003. Vol. 10, N 8. - P. 649-661.

384. Zhou C.X., Kong L.D., Ye W.C., Cheng C.H.K., Tan R.X. Inhibition of xanthine and monoamine oxidases by stilbenoids from Veratrum taliense II Planta Med. -2001. Vol. 67, N 2. - P. 158-161.

385. Iliya I., Ali Z., Tanaka T., linuma M., Furusawa M., Nakaya K.-i., Murata J., Darnaedi D., Matsuura N., Ubukata M. Stilbene derivatives from Gnetum gnemon Linn. // Phytochemistry. 2003. - Vol. 62, N 4. - P. 601-606.

386. Lee J.P., Min B.S., An R.B., Na M.K., Lee S.M., Lee H.K., Kim J.G., Bae K.H., Kang S.S. Stilbenes from the roots of Pleuropterus ciliinervis and their antioxidant activities // Phytochemistry. 2003. - Vol. 64, N 3. - P. 759-763.

387. Cherubini A., Ruggiero C., Morand C., Lattanzio F., DeN'Aquila G., Zuliani G., lorio A.D., Andres-Lacueva C. Dietary antioxidants as potential pharmacological agents for ischemic stroke // Curr. Med. Chem. 2008. - Vol. 15, N 12. - P. 12361248.

388. Raval A.P., Lin H.W., Dave K.R., DeFazio R.A., Morte D.D., Kim E.J., Perez-Pinzon M.A. Resveratrol and ischemic preconditioning in the brain // Curr. Med. Chem.-2008.-Vol. 15, N 15.-P. 1545-1551.

389. Adams M., Pacher T., Greger H., Bauer R. Inhibition of leukotriene biosynthesis by stilbenoids from Stemona species // J. Nat. Prod. 2005. - Vol. 68, N 1. - P. 8385.

390. Szewczuk L.M., Lee S.H., Blair I.A., Penning T.M. Viniferin formation by COX-1: evidence for radical intermediates during co-oxidation of resveratrol // J. Nat. Prod. -2005. Vol. 68, N 1. - P. 36-42.

391. Szewczuk L.M. Penning T.M. Mechanism-based inactivation of COX-1 by red wine m-hydroquinones: a structure-activity relationship study // J. Nat. Prod. 2004.- Vol. 67, N 11. P. 1777-1782.

392. Pervaiz S. Resveratrol: from grapevines to mammalian biology // FASEB J. -2003. Vol. 17, N 14. - P. 1975-1985.

393. Matsuda H., Kageura T., Morikawa T., Toguchida I., Harima S., Yoshikawa M. Effects of stilbene constituents from rhubarb on nitric oxide production in lipopolysaccharide-activated macrophages // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. -Vol. 10, N4.-P. 323-327.

394. Renaud S., De Lorgeril M. Wine, alcohol, platelets and the French paradox for coronary heart disease // Lancet. 1992. - Vol. 339, N 8808. - P. 1523-1526.

395. Delmas D., Jannin B., Latruffe N. Resveratrol: preventing properties against vascular alterations and ageing // Mol. Nutr. Food Res. 2005. - Vol. 49, N 5. - P. 377-395.

396. Somoza V. MAGIC-OL resveratrol // Mol. Nutr. Food Res. 2005. - Vol. 49, N 5.- P. 373.

397. Bradamante S., Barenghi L., Villa A. Cardiovascular protective effects of resveratrol // Cardiovasc. Drug Rev. 2004. - Vol. 22, N 3. - P. 169-188.

398. Kim S., Min S.Y., Lee S.K., Cho W.-J. Comparative molecular field analysis study of stilbene derivatives active against A549 lung carcinoma // Chem. Pharm. Bull. -2003.-Vol. 51, N 5.-P. 516-521.

399. Pettit G.R., Minardi M.D., Rosenberg H.J., Hamel E., Bibby M.C., Martin S.W., Jung M.K., Pettit R.K., Cuthbertson T.J., Chapuis J.-C. Antineoplastic agents. 509.

400. Synthesis of fluorcombstatin phosphate and related 3-halostilbenes // J. Nat. Prod. -2005. Vol. 68, N 10. - P. 1450-1458.

401. Gill C., Walsh S.E., Morrissey C., Fitzpatrick J.M., Watson R.W. Resveratrol sensitizes androgen independent prostate cancercells to death-receptor mediated apoptosis through multiple mechanisms // Prostate. 2007. - Vol. 67, N 15. - P. 1641-1653.

402. Ulrich S., Wolter F., Stein J.M. Molecular mechanisms of the chemopreventive effects of resveratrol and its analogs in carcinogenesis // Mol. Nutr. Food Res. -2005. Vol. 49, N 5. - P. 452-461.

403. Su J.-L., Yang C.-Y., Zhao M., Kuo M.-L., Yen M.-L. Forkhead proteins are critical for bone morphogenetic protein-2 regulation and anti-tumor activity of resveratrol // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282, N 27. - P. 19385-19398.

404. Gehm B.D., McAndews J.M., Chien P.-Y., Jameson J.L. Resveratrol, a polyphenols compound found in grapes and wine, is an agonist for the estrogen receptor// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. - Vol. 94, N 25. - P. 14138-14143.

405. Wang L.-X., Heredia A., Song H., Zhang Z., Yu В., Davis C., Redefield R. Resveratrol glucuronides as the metabolites of resveratrol in humans: characterization, synthesis, and anti-HIV activity // J. Pharm. Sci. 2004. - Vol. 93, N 10.-P. 2448-2457.

406. Masoro E.J. Caloric restriction and aging: an update // Exp. Gerontol. 2000. -Vol. 35, N 3. - P. 299-305.

407. Bauer J.H., Goupil S., Garber G.B., Helfand S.L. An accelerated assay for the identification of lifespan-extending interventions in Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2004.-Vol. 101, N35.-P. 12980-12985.

408. Orallo F. Trans-resveratrol: a magical elixir of eternal youth? // Curr. Med. Chem. 2008. - Vol. 15, N 19. - P. 1887-1898.

409. Ohyama M., Tanaka Т., Ito Т., linuma M., Bastow K.F., Lee K.-H. Antitumor agents 200. Cytotoxicity of naturally occurring resveratrol oligomers and their acetate derivatives // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. - Vol. 9, N 20. - P. 30573060.

410. Yamada M., Hayashi K.-i., Hayashi H., Ikeda S., Hoshino Т., Tsutsui K., Tsutsui K., linuma M., Nozaki H. Stilbenoids of Kobresia nepalensis (Cyperaceae) exhibiting DNA topoisomerase II inhibition // Phytochemistry. 2006. - Vol. 67, N 3. - P. 307313.

411. Кушнерова Н.Ф., Фоменко C.E., Положенцева М.И., Буланов А.Е. Влияние природных комплексов биологически активных веществ на процессы восстановления функций печени при алкогольной интоксикации // Вопр. мед. химии. 1995. - Т. 41, № 2. - С. 20-23.

412. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф., Гордейчук Т.Н., Фоменко С.Е. Стресс-протективное действие диприма // Эксперим. и клин, фармакология. 2002. -Т. 65, № 4. - С. 56-58.

413. Yang Н., Sung S.H., Kim Y.C. Two new hepatoprotective stilbene glycosides from Acer mono leaves//J. Nat. Prod. 2005. - Vol. 68, N 1.-P. 101-103.

414. Rivera H., Shibayama M., Tsutsumi V., Perez-Alvarez V., Muriel P. Resveratrol and trimethylated resveratrol protect from acute liver damage induced by ССЦ in the rat// J. Appl. Toxicol. 2008. - Vol. 28, N 2. - P. 147-155.

415. Burns J., Yokota Т., Ashihara H., Lean M.E.J., Crozier A. Plant foods and herbal sources of resveratrol // J. Agric. Food Chem. 2002. - Vol. 50, N 11. - P. 33373340.

416. Babu S.K., Kumar K.V., Subbaraju G.V. Estimation of trans-resveratrol in herbal extracts and dosage forms by high-performance thin-layer chromatography // Chem. Pharm. Bull. 2005. - Vol. 53, N 6. - P. 691-693.

417. Teguo P.W., Decendit A., Krisa S., Deffieux G., Vercauteren J., Merillon J.M. The accumulation of stilbene glycosides in Vitis vinifera cell suspension cultures // J. Nat. Prod.-1996.-Vol. 59, N 12.-P. 1189-1191.

418. Krisa S., Larronde F., Budzinski H., Decendit A., Deffieux G., Merillon J.-M. Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures: methyl jasmonate induction and 13C biolabeling // J. Nat. Prod. 1999. - Vol. 62, N 12. - P. 16881690.

419. Krasnow M.N., Murphy T.M. Polyphenol glucosylating activity in cell suspensions of grape (Vitis vinifera) II J. Agric. Food Chem. 2004. - Vol. 52, N 11. - P. 34673472.

420. Ku K.-L., Chang P.-S., Cheng Y.-C., Lien C.-Y. Production of stilbenoids from the callus of Arachis hypogaea: a novel source of the anticancer compound piceatannol //J. Agric. Food Chem. -2005. Vol. 53, N 10. - P. 3877-3881.

421. Jo J.-Y., de Mejia E.G., Lila M.A. Effects of grape cell culture extracts on human topoisomerase II catalytic activity and characterization of active fractions // J. Agric. Food Chem. -2005. Vol. 53, N 7. - P. 2489-2498.

422. Snyder S.A., Zografos A.L., Lin Y. Total synthesis of resveratrol-based natural products: a chemoselective solution // Angew. Chem. 2007. - Vol. 46, N 43. - P. 8186-8191.

423. Van Rozendaal E.L.M., Kurstjens S.J.L., van Веек T.A., van der Berg R.G. Chemotaxonomy of Taxus // Phytochemistry. 1999. - Vol. 52, N 3. - P. 427-433.

424. Parmar V.S., Jha A., Bisht K.S., Taneja P., Singh S.K., Kumar A., Poonam, Jain R., Olsen C.E. Constituents of the yew trees // Phytochemistry. 1999. - Vol. 50, N8.-P. 1267-1304.

425. Yang S.J., Fang J.M., Cheng Y.S. Lignans, flavonoids and phenolic derivatives from Taxus maireiII J. Chin. Chem. Soc. 1999. - Vol. 46, N 5. - P. 811-820.

426. Wani M.C., Taylor H.L., Wall M.E., Coggon P., McPhail A.T. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia II J. Amer. Chem. Soc. 1971. - Vol. 93, N 9. - P. 2325-2327.

427. Kingston D.G.I., Molinero A.A., Rimoldi J.M. The taxane diterpenoids // Progress in the chemistry of organic natural products / Eds. W. Herz, G.W. Kirby, R.E. Moore, W. Steglich, C. Tamm. Vieenna ; New York : Springer, 1993. - Vol. 61. - P. 1206.

428. Begley M.J., Jackson C.B., Pattenden G. Total synthesis of verticillene. A biomimetic approach to the taxane family of alkaloids // Tetrahedron. 1990. - Vol. 46, N 13-14.-P. 4907-4924.

429. Miller R.W., Powell R.G., Smith C.R., Arnold E., Clardy J. Antileukemic alkaloids from Taxus wallichiana Zucc. // J. Org. Chem. 1981. - Vol. 46, N 7. - P. 14691474.

430. Nicolaou K.C., Yang Z., Liu J.J., Ueno H., Nantermet P.G., Guy R.K., Claiborne C.F., Renaud J., Couladouros E.A., Paulvannan K., Sorensen E.J. Total synthesis of taxol // Nature. 1994. - Vol. 367, N 6464. - P. 630-634.

431. Зефирова O.H., Нуриева E.B., Рыжов A.H., Зык Н.В., Зефиров Н.С. Таксол: синтез, биоактивные конформации и соотношение структура-активность для его аналогов // Журн. орган, химии. 2005. - Т. 41, вып. 3. - С. 329-361.

432. Ellis D.D., Zeldin E.L., Brodhagen М., Russin W.A., McCown B.H. Taxol production in nodule cultures of Taxus И J. Nat. Prod. 1996. - Vol. 59, N 3. - P. 246-250.

433. Ma W., Stahlhut R.W., Adams T.L., Park G.L., Evans W.A., Blumenthal S.G., Gomez G.A., Nieder M.H., Hylands P.J. Yunnanxane and its homologous esters from cell cultures of Taxus chinensis var. mairei II J. Nat. Prod. 1994. - Vol. 57, N9.-P. 1320-1324.

434. Cheng K., Fang W„ Yang Y., Xu H„ Meng C., Kong M„ He W„ Fang Q. C-14 oxygenated taxanes from Taxus yunnanensis cell cultures // Phytochemistry. -1996. Vol. 42, N 1. - P. 73-75.

435. Bai J., Ito N., Sakai J., Kitabatake M., Fujisawa H., Bai L., Dai J., Zhang S., Hirose K., Tomida A., Tsuruo T., Ando M. Taxoids and abietanes from callus cultures of Taxus cuspidata II J. Nat. Prod. 2005. - Vol. 68, N 4. - P. 497-501.

436. Baebler S., Camloh M., Kovac M., Ravnikar M., Zel J. Jasmonic acid stimulates taxane production in cell suspension culture of yew (Taxus * media) II Planta Med. -2002. Vol. 68, N 5. - P. 475^176.

437. Lan W.Z., Yu L.J., Li M.Y., Qin W.M. Cell death unlikely contributes to taxol production in fungal elicitor-induced cell suspension cultures of Taxus chinensis II Biotechnol. Lett. -2003. Vol. 25, N 1. - P. 47-49.

438. Baloglu E., Kingston D.G.I. A new semisynthesis of paclitaxel from baccatin III // J. Nat. Prod.-1999.-Vol. 62, N7.-P. 1068-1071.

439. Appendino G. The phytochemistry of yew tree // Nat. Prod. Rep. 1995. - Vol. 12, N 4. - P. 349-360.

440. Baloglu E., Kingston D.G.I. The taxane diterpenoids // J. Nat. Prod. 1999. -Vol. 62, N 10.-P. 1448-1472.

441. Shigemori H., Kobayashi J. Biological activity and chemistry of taxoids from the Japanese yew, Taxus cuspidata II J. Nat. Prod. 2004. - Vol. 67, N 2. - P. 245256.

442. Banskota A.H., Usia T., Tezuka Y., Kouda K., Nguyen N.T., Kadota S. Three new C-14 oxygenated taxanes from the wood of Taxus yunnanensis II J. Nat. Prod. -2002. Vol. 65, N 11. - P. 1700-1702.

443. Yang S.-J., Fang J.-M., Cheng Y.-S. Taxanes from Taxus mairei H Phytochemistry. 1996. - Vol. 43, N 4. - P. 839-842.

444. Lavelle F., GueritteVoegelein F., Guenard D. Taxotere from yew's needles to patients // Bull. Cancer. - 1993. - Vol. 80, N 4. - P. 326-338.

445. Kuo Y.-H., Li S.-Y., Wu M.-D., Huang R.-L., Yang Kuo L.-M., Chen C.-F. A new anti-HBeAg lignan, kadsumarin A, from Kadsura matsudai and Schizandra arisanensis II Chem. Pharm. Bull. 1999. - Vol. 47, N 7. - P. 1047-1048.

446. Lu Y., Foo L.Y. Polyphenols of Salvia a review // Phytochemistry. - 2002. -Vol. 59, N2.-P. 117-140.

447. Lewis, N.G., Davin, L.B. Evolution of lignan and neolignan biochemical pathways // Isopentenoids and other natural products: evolution and function. Symp. Ser. 562. / Eds: W.D. Nes. Washington, DC : Amer. Chem. Soc., 1994. - P. 202-246.

448. Miller R.W., McLaughlin J.L, Powell R.G., Plattner R.D., Weisleder D., Smith C.R. Lignans from Taxus wallichiana II J. Nat. Prod. 1982. - Vol. 45, N 1. - P. 7882.

449. Martinez V.J.C., Aldana J.M.I., Cuca S.L.E. Dibenzylbutane lignans from Virola sebifera leaves // Phytochemistry. 1999. - Vol. 50, N 5. - P. 883-886.

450. Das B., Rao S.P., Srinivas K.V.N.S., Yadav J.S. Lignans of Taxus baccata II Fitoterapia. 1995. - Vol. 66, N 5. - P. 475.

451. Barrero A.F., Herrador M.M., Akssira M., Arteaga P., Romera J.L. Lignans and polyacetylenes from Bupleurum acutifolium // J. Nat. Prod. 1999. - Vol. 62, N 7. -P. 946-948.

452. Shen Y.-C., Chen C.-Y., Lin Y.-M., Kuo Y.-H. A lignan from roots of Taxus mairei II Phytochemistry. 1997. - Vol. 46, N 6. - P. 1111-1113.

453. Filho A.A.S., Albuquerque S., Silva M.L.A., Eberlin M.N., Tomazela D.M., Bastos J.K. Tetrahydrofuran lignans from Nectandra megapotamica with trypanocidal activity // J. Nat. Prod. 2004. - Vol. 67, N 1. - P. 42-45.

454. Innocenti G., Puricelli L., Piacente S., Caniato R., Filippini R., Cappelletti E.M. Patavine, a new arylnaphthalene lignan glycoside from shoot cultures of Haplophyllum patavinum II Chem. Pharm. Bull. 2002. - Vol. 50, N 6. - P. 844-846.

455. Al-Abed Y„ Abu-Zarga M., Sabri S., Atta-Ur-Rahman, Voelter W. A arylnaphthalene lignan from Haplophyllum buxbaumii 1/ Phytochemistry. 1998. -Vol. 49, N 6. - P. 1779-1781.

456. Lee S.-S., Lin M.-T., Liu C.-L., Lin Y.-Y., Liu K.C.S.C. Six lignans from Phyllanthus myrtifolius II J. Nat. Prod. 1996. - Vol. 59, N 11. - P. 1061-1065.

457. Kuo Y.-H., Li S.-Y., Huang R.-L., Wu M.-D., Huang H.-C., Lee K.-H. Schizarin B, C, D, and E, four new lignans from Kadsura matsudai and their antihepatitis activities // J. Nat. Prod. 2001. - Vol. 64, N 4. - P. 487^90.

458. Chen D.-F., Zhang S.-X., Chen K., Zhou B.-N., Wang P., Cosentino L.M., Lee K.-H. Two new lignans, interiotherins A and B, as anti-HIV principles from Kadsura interiorII J. Nat. Prod. 1996. - Vol. 59, N 11. - P. 1066-1068.

459. Kuroyanagi M., Yoshida K., Yamamoto A., Miwa M. Bicyclo3.2.1.octane and 6-oxabicyclo[3.2.2]nonane type neolignans from Magnolia denudata II Chem. Pharm. Bull. 2000. - Vol. 48, N 6. - P. 832-837.

460. Rossi M.H., Yoshida M., Maia J.G.S. Neolignans, styrylpyrones and flavonoids from an Aniba species // Phytochemistry. 1997. - Vol. 45, N 6. - P. 1263-1269.

461. Zhang H.-J., Tamez P.A., Hoang V.D., Tan G.T., Hung N.V., Xuan L.T., Huong L.M., Cuong N.M., Thao D.T., Soejarto D.D., Fong H.H.S., Pezzuto J.M. Antimalarial compounds from Rhaphidophora decursiva II J. Nat. Prod. 2001. - Vol. 64, N 6. -P. 772-777.

462. Moss G.P. Nomenclature of lignans and neolignans // Pure Appl. Chem. 2000. -Vol. 72, N 8. - P. 1493-1523.

463. Erdtman H., Tsuno K. Taxus heartwood constituents // Phytochemistry. 1969. -Vol. 8, N 5. - P. 931-932.

464. Mujumdar R.B., Srinivasan R., Venkataraman K. Taxiresinol, a new lignan in the heartwood of Taxus baccata II Indian J. Chem. 1972. - Vol. 10. - P. 677-680.

465. Das B., Takhi M., Srinivas K.V.N.S., Yadav J.S. Phenolics from needles of Himalayan Taxus baccata II Phytochemistry. 1993. - Vol. 33, N 6. - P. 14891491.

466. Das B., Rao S.P., Srinivas K.V.N.S., Yadav J.S. Lignans, biflavones and taxoids from Himalayan Taxus baccata II Phytochemistry. 1995. - Vol. 38, N 3. - P. 715717.

467. Erdemoglu N., Sahin E., Sener B., Ide S. Structural and spectroscopic characteristics of two lignan from Taxus baccata L. // J. Mol. Struct. 2004. - Vol. 692, N 1-3.-P. 57-62.

468. Erdemoglu N., Sener B., Ozean Y., Ide S. Structural and spectroscopic characteristics of two new dibenzylbutane type lignans from Taxus baccata L. // J. Mol. Struct. 2003. - Vol. 655, N 3. - P. 459-466.

469. Kawamura F., Kikuchi Y., Ohira T., Yatagai M. Phenolic constituents of Taxus cuspidta I: lignans from the roots // J. Wood. Sei. 2000. - Vol. 46, N 2. - P. 167171.

470. Banskota A.H., Tezuka Y., Nguen N.T., Awale S., Nobukawa T., Kadota S. DPPH radical scavenging and nitric oxide inhibitory activities of the constituents from the wood of Taxus yunnanensis II Planta Med. 2003. - Vol. 69, N 6. - P. 500-505.

471. Braca A., De Tommasi N., Bari L.D., Pizza C., Politi M., Morelli I. Antioxidant principles from Bauhinia tarapotensis II J. Nat. Prod. 2001. - Vol. 64, N 7. - P. 892-895.

472. Prasad K. Hydroxyl radical-scavenging property of secoisolariciresinol diglucoside (SDG) isolated from flax-seed // Mol. Cell. Biochem. 1997. - Vol. 168, N 1-2. -P 117-123.

473. Prasad K. Oxidative stress as a mechanism of diabetes in diabetic BB prone rats: effect of secoisolariciresinol diglucoside (SDG) // Mol. Cell. Biochem. 2000. - Vol. 209, N 1-2.-P. 89-96.

474. Prasad K., Mantha S.V., Muir A.D., Westcott N.D. Protective effect of secoisolariciresinol diglucoside against streptozotocin-induced diabetes and its mechanism // Mol. Cell. Biochem. 2000. - Vol. 206, N 1-2. - P. 141-149.

475. Chen C.-C., Chen H.-Y., Shiao M.-S., Lin Y.-L., Kuo Y.-H., Ou J.-C. Inhibition of low density lipoprotein oxidation by tetrahydrofurofuran lignans from Forsythia suspensa and Magnolia coco II Planta Med. 1999. - Vol. 65, N 8. - P. 709-711.

476. Navarro E., Alonso S.J., Trujillo J., Jorge E., Pérez C. General behavior, toxicity, and cytotoxic activity of elenoside, a lignan from Justicia hyssopifolia II J. Nat. Prod. -2001.-Vol. 64, N 1.-P. 134-135.

477. Chen l.-S., Chen J.-J., Duh C.-Y., Tsai l.-L. Cytotoxic lignans from formosan Hernandia nymphaeifolia II Phytochemistry. 1997. - Vol. 45, N 5. - P. 991-996.

478. Ma C.-m., Nakamura N., Min B.S., Hattori M. Triterpenes and lignans from Artemisia caruifolia and their cytotoxic effects on Meth-A and LLC tumor cell lines // Chem. Pharm. Bull. 2001. - Vol. 49, N 2. - P. 183-187.

479. Cho J.Y., Kim A.R., Park M.H. Lignans from the rhizomes of Coptis japonica differentially act as anti-inflammatory principles // Planta Med. 2001. - Vol. 67, N 4. -P. 312-316.

480. Kupeli E., Erdemoglu N. Yesilada E., Sener B. Anti-inflammatory and antinociceptive activity of taxoids and lignans from the heartwood of Taxus baccata L. // J. Ethnopharmacol. 2003. - Vol. 89, N 2-3. - P. 265-270.

481. Gurbuz I., Erdemoglu N., Yesilada E., Sener B. Anti-ulcerogenic lignans from Taxus baccata L. // Z. Naturforsch. 2004. - Vol. 59, N 3-4. - P. 233-236.

482. Ishida J., Wang H.-K., Oyama M., Cosentino M.L., Hu C.-Q., Lee K.-H. Anti-AIDS agents. 46. Anti-HIV activity of harman, an anti-HIV principle from Symplocos setchuensis, and its derivatives // J. Nat. Prod. 2001. - Vol. 64, N 7. - P. 958-960.

483. Wang C.-Y., Sun S.-W., Lee S.-S. Pharmacokinetic and metabolic studies of retrojusticidin B, a potential anti-viral lignan, in rats // Planta Med. 2004. - Vol. 70, N 12.-P. 1161-1165.

484. Gertsch J., Tobler R.T., Brun R., Sticher O., Heilmann J. Antifungal, antiprotozoal, cytotoxic and piscicidal properties of justicidin B and a new arylnaphthalide lignan from Phyllanthus piscatorum II Planta Med. 2003. - Vol. 69, N 5. - P. 420-424.

485. Xia Z.-Q., Costa M.A., Proctor J., Davin L.B., Lewi's N.G. Dirigent-mediated podophyllotoxin biosynthesis in Linum flavum and Podophyllum peltatum II Phytochemistry. 2000. - Vol. 55, N 6. - P. 537-549.

486. Kuhlmann S., Kranz K., Lucking В., Alfermann A.W., Petersen M. Aspects of cytotoxic lignan biosynthesis in suspension cultures of Linum nodiflorum II Phytochem. Rev. 2002. - Vol. 1, N 1. - P. 37-43.

487. Федореев C.A. Химическое исследование хиноидных пигментов дальневосточных представителей семейства Boraginaceae (бурачниковые) : дис. . канд. хим. наук / Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО РАН. -Владивосток, 1980. 151 с.

488. Кривощекова О.Е., Федореев С.А., Денисенко В.А, Максимов О.Б., Горовой П.Г. Нафтахиноны Lithospermum erythrortizon II Химия природ, соединений. -1976.-№ 6.-С. 726-730.

489. Кривощекова О.Е., Федореев С.А., Денисенко В.А., Максимов О.Б. Новый хиноидный пигмент из Lithospermum erythrortizon II Химия природ, соединений.- 1977. № 5. - С. 702-703.

490. Федореев С.А., Кривощекова О.Е., Денисенко В.А., Горовой П.Г., Максимов О.Б. Хиноидные пигменты дальневосточных представителей семейства Boraginaceae //Химия природ, соединений. 1979. - № 6. - С. 625-630.

491. Денисенко В.А., Федореев С.А., Мищенко Н.П. Установление структуры нового хиноидного пигмента из Lithospermum erythrortizon методом спектроскопии ЯМР 1Н и 13С. Владивосток, 1979. - 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 27.06.79, № 2544.

492. Старченко В.М., Федореев С.А., Кривощекова О.Е., Горовой П.Г., Иванова И.Г. Хемотаксономическое исследование дальневосточных Boraginaceae // Хемосистематика и эволюц. биохимия высших растений : тез. докл. М., 1979.- С. 84-85.

493. Федореев С.А., Набиуллин А.А. Хиноидные пигменты дальневосточных представителей семейства Boraginaceae // 5-я Молодеж. конф. по синтетич. иприрод, физиол. актив, соединениям, посвящ. 60-летию Сов. Армении : тез. докл. Ереван, 1980. - С. 38.

494. Cho М.-Н., Paik Y.-S., Hahn T.-R. Propionylshikonin from the roots of Lithospermum erythrorhizon II Arch. Pharm. Res. 1999. - Vol. 22, N 4. - P 414416.

495. Новосельцева Н.П., Робинович A.M., Тареева H.A., Биологическая характеристика роста Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. в Московском районе и содержание в нем шиконина // Фармация. 1979. - Т. 28, № 3. - С. 28-31.

496. Баланева Н.Н. Синтез нафтохиноидных пигментов растений семейства бурачниковых (Boraginaceae) и родственных соединений : дис. . канд. хим. наук / Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО РАН. Владивосток, 1997. - 155 с.

497. Набиуллин А.А., Федореев С.А., Дешко Т.Н. Круговой дихроизм хиноидных пигментов и дальневосточных представителей семейства Boraginaceae // Химия природ, соединений. 1983. - № 5. - С. 568-573.

498. Козыренко М.М., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Федореев С.А. Биосинтез производных шиконина в каллусной культуре Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. II Раст. ресурсы. 1991. - Т. 27, вып. 4. - С. 78-81.

499. Quesnel А.А., Ellis В.Е. Comparison of UV irradiation and p-fluorophenylalanine as selective agents for production of aromatic compounds in plant cell cultures // J. Biotechnol. 1989. - Vol. 10, N 1. - P. 27-37.

500. Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Kiselev K.V., Shkryl Y.N., Inyushkina Y.V., Mischenko N.P., Zhuravlev Y.N. Manipulation of secondary metabolism in cultured plant cells by agrobacterium го/genes//J. Biotechnol. 2008. - Vol. 129, N 136S. -P. S131.

501. Кулеш Н.И., Максимов О.Б., Федореев С.А., Денисенко В.А., Глазунов В.П., Покушалова Т.В., Глебко Л.И. О нативности компонентов экстрактов древесины Maackia amurensis // Xимия природ, соединений. 1999. - № 5. - С. 664-669.

502. Федореев С.А., Кулеш Н.И., Глебко Л.И., Покушалова Т.В., Веселова М.В., Саратиков A.C., Венгеровский А.И., Чучалин B.C. // Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской // Хим.-фарм. журн. 2004. - Т. 38, № 11.-С. 22-26.

503. Кулеш Н.И., Василевская H.A., Веселова М.В., Денисенко В.А., Федореев С.А. Минорные полифенолы из древесины Maackia amurensis // Химия природ, соединений. 2008. - № 6. - С. 575-577.

504. Baba К., Kido Т., Maeda К., Taniguchi М., Kozawa М. Two stilbenoids from Cassia garrettiana// Phytochemistry. 1992. - Vol. 31, N 9. - P. 3215-3218.

505. Nagimova A.D., Zhusurova G.E., Erzhariova M.S. Synthesis of biologically active bromine derivatives of quercetin // Chem. Nat. Compd. 1996. - Vol. 32, N 5. - P. 695-697.

506. Fedoreyev S.A., Pokushalova T.V., Veselova M.V., Glebko L.I., Kulesh N.I., Muzarok T.I. Seletskaya L.D., Bulgakov V.P., Zhuravlev Yu.N. Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis // Fitoterapia. 2000. - Vol. 71, N 4. - P. 365-372.

507. Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P. Isoflavonoid composition of the Maackia amurensis callus culture // J. Biotechnol. 2008. - Vol. 136. - P. S140.

508. Veselova M.V., Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P., Krivoschekova O.E. Isoflavonoids from Maackia amurensis cell culture // 1st Far-Eastern intern, symp. on Life Sciences 2008, Vladivostok, Sept. 2-7, 2008 : abstrs. Vladivostok, 2008. - P. 82.

509. Kobayashi M., Ohta Y. Induction of stress metabolite formation in suspension cultures of Vigna angularis II Phytochemistry. 1983. - Vol. 22, N 5. - P. 12571261.

510. Венгеровский А.И., Чучалин B.C., Буркова В.Н., Федореев С.А. Опыт разработки гепатопротекторов природного происхождения научной школой профессора A.C. Саратикова // Бюл. сиб. медицины. 2006. - Т. 5, прил. 2. - С. 19-25.

511. Саратиков A.C., Чучалин B.C., Ратькин A.B., Ратькин Е.В., Федореев С.А., Булгаков В.П. Гепатопротективные свойства полифенольных комплексов из древесины и клеточной культуры маакии амурской // Бюл. сиб. медицины. -2008.-Т. 7, № 1.-С. 51-55.

512. Янькова В.И., Иванова И.Л., Федореев С.А., Кулеш Н.И. Антиоксидантное действие гепатопротектора максара при экспериментальном диабете // Эксперим. и клин, фармакология. 2002. - Т. 65, № 4. - С. 33-36.

513. Белобородова Э.И., Венгеровский А.И., Гайсаев P.O., Саратиков A.C., Федореев С.А. Новое гепатозащитное средство максар // Сиб. журн. гастроэнтерологии и гепатологии. - 1999. - № 8. - С. 46-48.

514. Прищеп Т.П., Чучалин B.C., Хоружая Т.Г., Белова Л.С., Федореев С.А., Венгеровский А.И., Саратиков A.C. Рациональные лекарственные формы гепатопротекторов растительного происхождения // Фармация. 1999. - № 6. -С. 33-34.

515. Кулеш Н.И., Веселова М.В., Федореев С.А., Денисенко В.А. Полифенолы из стеблей Vitis amurensis II Химия природ, соединений. 2006. - № 2. - С. 194195.

516. Khan М.А., Nabi S.G., Prakash S., Zaman A. Pallidol, a resveratrol dimer from Cissus pallida II Phytochemistry. 1986. - Vol. 25, N 8. - P. 1945-1948.

517. Tanaka T., Ohyama M., Morimoto K., Asai F., linuma M. A resveratrol dimer from Parthenocissus tricuspidata II Phytochemistry. 1998. - Vol. 48, N 7. - P. 1241— 1243.

518. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J. Biotechnol. 2007. - Vol. 128, N 3. - P. 681-692.

519. Fedoreyev S.A., Vasilevskaya N.A., Veselova M.V., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Ozhigova I.T., Muzarok T.I., Zhuravlev Yu.N. A new C-14 oxygenated taxane from Taxus cuspidata cell culture // Fitoterapia. 1998. - Vol. 69, N 5. - P. 430-432.

520. Menhard В., Eisenreich W., Hylands P.J., Bacher A., Zenk M.H. Taxoids from cell cultures of Taxus chinensis И Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, N 1. - P. 113125.

521. King F.E., Jurd L., King T.J. Isotaxiresinol (3'-demethylisolariciresinol), a new lignan extracted from the heartwood of English yew Taxus baccata II J. Chem. Soc. -1952.-P. 17-24.

522. Charlton J.L. Antiviral activity of lignans // J. Nat. Prod. 1998. - Vol. 61, N 11.1. P. 1447-1451.

523. Raffaelli В., Hoikkala A., Leppala E., Wahala K. Enterolignans // J. Chromatogr. B. 2002. - Vol. 777, N 1-2. - P. 29-^3.

524. Das В., Takhi M., Srinivas K.V.N.S., Yadav J.S. A lignan from needles of Himalayan Taxus baccata II Phytochemistry. 1994. - Vol. 36, N 4. - P. 10311033.

525. Jew S.-S., Lim D.-Y., Bae S.-Y., Kim H.-A., Kim J.-H., Lee J., Park H.-G. Enantioselective synthesis of (2R,3S)-(+)-catechin // Tetrahedron: Asymmetry. -2002. Vol. 13, N 7. - P. 715-720.

526. Porter L.J., Newman R.H., Foo L.Y., Wong H., Hemingway R.W. Polymeric proanthocyanidins. I3C N.M.R. studies of procyanidins // J. Chem. Soc. Perkin Trans. Pt. 1.-1982,-N5.-P. 1217-1221.

527. Bilia A.R., Morelli I., Hamburger M., Hostettmann K. Flavans and A-type proanthocyanidins from Prunus prostrata II Phytochemistry. 1996. - Vol. 43, N 4. -P. 887-892.

528. Markham K.R. and Ternai B. 13C NMR of flavonoids-ll. Flavonoids other then flavone and flavono! aglycones // Tetrahedron. 1976. - Vol. 32, N 21. - P. 26072612.

529. Веселова M.B., Федореев C.A., Василевская H.A., Денисенко В.А., Герасименко А.В. Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного // Хим.-фарм. журн. 2007. -Т. 41, №2.-С. 29-34.

530. Уткина Н.К., Макарченко А.Е., Щелокова О.В., Вировая М.В. Антиоксидантная активность фенольных метаболитов из морских губок // Химия природ, соединений. 2004. - № 4. - С. 305-308.

531. SHELXTL/PC, Versions 5.10. An Integrated system for solving, refining and displaying crystal structures from diffraction data. Bruker AXS Inc., Madison, Wl, 1998.

532. Sheldrick G.M. A short history of SHELX // Acta Crystallogr. A. 2008. - Vol. 64, N 1. - P. 112-122.

533. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Chernoded G.K., Zhuravlev Y.N. The impact of plant rolC oncogene on ginsenoside production by ginseng hairy root cultures // Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, N 7. - P. 19291934.

534. Yoon J.S., Sung S.H., Park J.H, Kim Y.C. Flavonoids from Spatholobus suberectus II Arch. Pharm. Res. 2004. - Vol. 27, N 6. - P. 589-592

535. Wei J.H., Liu S., Fedoreyev S.A., Voinov V.G. A Study of resonance electron capture ionization on a quadrupole tandem mass spectrometer // Rapid Commun. Mass Spectrom. -2000. Vol.14, N 18. - P. 1689-1694.

536. Biggs D.R., Lane G.A. Identification of isoflavones calycosin and pseudobaptigenin in Trifolium pratense II Phytochemistry. 1978. - Vol. 17, N 9. -P.1683-1684.

537. Kobayashi M., Noguchi H., Sankawa U. Formation of chalcones and isoflavones by callus culture of Glycyrrhiza uralensis with different production patterns // Chem. Pharm. Bull. 1985. - Vol. 33, N 9. - P. 3811-3816.

538. Markham K.R., Mabry T.J. The identification of twenty-three 5-deoxy- and ten 5-hydroxy-flavonoids from Baptisia lecontei (Leguminosae) // Phytochemistry. 1968. -Vol. 7, N5.-P. 791-801.

539. Van Heerden F.R., Brandt E.V., Roux D.G. Synthesis of the pyranoisoflavonoid, heminitidulan. Isoflavanoid and rotenoid glycosides from the bark of Daibergia nitidda Welw. ex Bak // J. Chem. Soc. Perkin Trans. Pt. I. 1980. - N 11. - P. 24632469.

540. Singab A.N.B. Flavonoids from Iris spuria (Zeal) cultivated in Egypt // Arch. Pharm. Res. -2004. Vol. 27, N 10. - P. 1023-1028.

541. Gottlieb O.R., da Rocha A.I. 5-O-methylgenistein from Ormosia excelsa II Phytochemistry. 1972. - Vol. 11, N 3. - P. 1183.

542. Nakajima K., Taguchi H., Endo Т., Yosioka I. The constituents of Scirpus fluviatilis (Torr.) A. Gray. I. The structures of two new hydroxystilbene dimers, scirpusin A and В // Chem. Pharm. Bull. 1978. - Vol. 26, N 10. - P. 3050-3057.

543. Osawa K., Yasuda H., Maruyama Т., Morita H., Takeya K., Itokawa H. Isoflavanones from the heartwood of Swartzia polyphylla and their antibacterial activity against cariogenic bacteria // Chem. Pharm. Bull. 1992. - Vol. 40, N 11. -P.2970-2974.

544. Youssef D.T.A., Ramadan M.A., Khalifa A.A. Acetophenones, a chalcone, a chromone and flavonoids from Pancratium maritimum II Phytochemistry. 1998. -Vol. 49, N 8. - P. 2579-2583.

545. Утешев Б.С., Байбурин Ф.Я., Прокопенко Л.Г. Иммуномодулирующее и антиокидантное действие (3-каротина и эссенциале при нарушении липидного обмена // Эксперим. и клинич. фармакол. 1998. - Т. 61, № 2. - С. 41-44.

546. Новгородцева Т.П., Эндакова Э.А., Янькова В.И. Руководство по методам исследования параметров системы "Перекисное окисление липидов -антиоксидантная защита" в биологических жидкостях. Владивосток: Изд-во Дальневосточного университета, 2003. - 78 с.

547. Гончаренко М.С., Латинова A.M. Метод оценки перекисного окисления липидов // Лаб. дело. 1985. - № 1. - С. 60-69.

548. Moron M.S., Depierre J.W., Mannervik В. Levels of glutathione, glutathione reductase and glutathione S-transferase activities in rat lung and liver // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - Vol. 582, N 1. - P. 67-78.

549. Bidlack W.R., Tappel A.L. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation // Lipids. 1973. - Vol. 8, N 4. - P. 203-207.

550. Черняускене P.M., Варшкявичене 3.3., Грибаускас П.С. Одновременное флуориметрическое определение концентрации витаминов А и Е в сыворотке крови // Лаб. дело. -1984. № 6. - С. 362-365.

551. Гуревич C.M. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. M. : Наука, 1992.

552. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. - 322 с.

553. Amenta J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography // J. Lipid. Res. 1964. - Vol. 5, № 2. - P. 270-272.

554. Израйлет Л.И., Соминский В.Н., Шибаева Т.Н., Слинько В.Н. Модификация бромсульфалеиновой пробы для изучения функционального состояния печени у крыс // Гигиена и санитария. 1976. - № 3. - С. 59-61.

555. Fonseca S.F., Campello J.P., Barata L.E.S., Ruveda E.A. 13C NMR spectral analysis of lignans from Araucaria angustifolia II Phytochemistry. 1978. - Vol. 17, N 3. - P. 499-502.

556. Senba Y., Nishishita Т., Saito K., Yoshioka H., Yoshioka H. Stopped-flow and spectrophotometric study on radical scavenging by tea catechins and the model compounds // Chem. Pharm. Bull. 1999. - Vol. 47, N 10. - P. 1369-1374.

557. Максимов О.Б., Горовой П.Г., Чумак Г.Н. Содержание антиоксидантов в семенах некоторых видов флоры Приморского края // Раст. ресурсы. 1990. -Т. 26, вып. 4. - С. 487—498.

558. Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке // Вестн. ДВО РАН. - 2004. - № 3. - С. 93-99.