Химический состав и биологическая активность полифенолов из дальневосточных растений Taxus cuspidata, Lithospermum erythrorhizon, Eritrichium sericeum, Maackia amurensis и их клеточных культур тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Веселова Марина Владимировна

Химический состав и биологическая активность полифенолов из дальневосточных растений Taxus cuspidata, Lithospermum erythrorhizon, Eritrichium sericeum, Maackia amurensis и их клеточных культур

02 00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2007

%

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской Академии Наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Федореев С. А

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Макарьева Т. Н.

кандидат биологических наук старший научный сотрудник Козыренко М. М.

Ведущая организация: Тихоокеанский океанологический институт ДВО РАН

Защита состоится «_<£_» ноября 2007 г в jQ часов на заседании диссертационного совета Д 005 005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу 690022, г Владивосток, проспект 100-летия Владивостока 159, ТИБОХ ДВО РАН Факс (4232) 314-050, e-mail science@piboc dvo ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г Владивосток, проспект 100-летия Владивостока 159, ТИБОХ ДВО РАН) Текст автореферата размещен на сайте совета http //www piboc dvo ru

Автореферат разослан « ¿J » октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Прокопенко Г И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Полифенолы природного происхождения являются в настоящее время важным объектом для медицины Их повсеместное распространение в растениях, достаточно хорошая изученность, низкая токсичность и высокая фармакологическая активность привели к созданию ряда лекарственных препаратов и биологически активных добавок В последние годы проводится углубленное исследование отдельных специфических веществ или групп веществ растительного происхождения Флора Дальнего Востока является богатейшим источником традиционных и новых лекарственных средств Однако исследования показали, что интенсивные заготовки дикорастущих лекарственных растений приводят к истощению их запасов, исчезновению некоторых видов растений и целых популяций Перед научным сообществом встала проблема поиска новых источников биологически активных соединений Выходом из создавшейся ситуации может стать получение природных соединений биотехнологическими методами - культивированием микроорганизмов и клеточных культур высших растений Развитие этих методов может позволить решить проблему сохранения в природе редких видов растений, а так же создать реальную возможность для разработки новейших технологий получения наиболее ценных лекарственных веществ и, в конечном счете, новых медицинских препаратов

Объектом настоящего исследования явились редкие и ценные растения дальневосточной флоры и их клеточные культуры

Дели и задачи исследования. Целью работы является выделение, установление строения и исследование биологической активности природных полифенольных соединений из экстрактов дальневосточных растений Taxus cuspidata (Sieb and Zucc ) (Taxaceae), Lithospermwn erythrorhizon (Sieb et Zucc ) (Boraginaceae), Eritnchium senceum (Lehm ) A DC (Boraginaceae) и Maackia amurensis (Rupr et Maxim ) (Fabaceae) и их клеточных культур Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи 1) получить суммарные экстракты из растений и клеточных культур Т cuspidata, L erythrorhizon, Е senceum и M amurensis, 2) разработать методы выделения биологически активных соединений, 3) выделить индивидуальные соединения и установить их строение спектральными методами, 4) определить количественное содержание полифенолов в растительном и биотехнологическом материале, 5) определить антиоксидантную и антирадикальную активность лигнанов и катехинов, 6) изучить фармакологическую активность препаратов из клеточных культур L erythrorhizon и Е senceum и M amurensis

Положения, выносимые на защиту:

1) Клеточная культура Т cuspidata биосинтезирует три известных таксановых дитерпеноида и один новый, таксюнаннин-7Р-ол В состав экстракта из древесины Т cuspidata входят четыре лигнана и два катехина, обладающие высокой антирадикальной и антиоксидантной активностью

2) Растение Е senceum и его клеточная культура ЕР-1 содержат (-) рабдозиин, розмариновую кислоту и новый полифенольный метаболит эритрихин Растение L erythrorhizon и его клеточная культура ВК-39 синтезируют (+) энантиомер рабдозиина и розмариновую кислоту Показано, что содержание полифенолов в культурах клеток выше, чем в растениях Выявлено выраженное нефропротективное и диуретическое действие препаратов из клеточных культур L erythrorhizon и Е sericeum

3) Впервые получены клеточные культуры из побегов, черешков, соцветий, почек и корней М amurensis, способные синтезировать изофлавоны и птерокарпаны Клеточная культура М amurensis, полученная из проростков семян, синтезирует изофлавоновды, представляющие собой моно- да- и малонилглюкозиды изофлавонов и птерокарпанов, и новый метаболит, структура которого была установлена как б'-О-малонил-З-О-^-D-глкжопиранозил-6,6а-дегидромаакиаин В отличие от растения, полученные клеточные культуры маккии амурской ие синтезируют мономерные и димерные стильбены

4) Установлено, что полифенольные комплексы, приготовленные из древесины и клеточной культуры М amurensis обладают выраженным гепатопротекгорным действием

Научная новизна и практическая ценность: 1) получены высокопродуктивные культуры клеток Т cuspidata, L erythrorhizon, Е sericeum и М amurensis и исследованы особенности накопления в них вторичных метаболитов полифенольной природы, 2) впервые проведено полное отнесение нротонов и углеродов в ЯМР спектрах гликозидной части изофлавоноидов и структурно идентифицированы 20 природных соединений из клеточной культуры М amurensis, 3) выделены 3 новых соединения и установлено их строение с помощью ЯМР и масс-спекгрометрии, 4) определена абсолютная конфигурация природного лигаана изотаксирезинола, 5) впервые показано нефропротективное, диуретическое и гепатопротекторное действие на животных препаратов из клеточных культур Е sericeum, L erythrorhizon и М amurensis соответственно Показано, что полученные культуры клеток могут использоваться для промышленного культивирования

Апробация работы. Результаты работы были доложены на IX Международном Съезде ФИТОФАРМ 2005, Санкт-Петербург, 2005, International congress "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin Phytopharm 2004", Mikkeli Finland,

2004, 2Ki International Confeience on Natural Products and Physiologically Active Substances (ICNPAS-2004), Novosibirsk, 2004, на региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2004

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в международных журналах, 3 статьи в российских журналах, 1 патент и 10 тезисов докладов

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного растительным полифенолам, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 245 цитируемых работ Работа изложена на Страницах, содержит 22 рисунка и 28 таблиц

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к х н Федорееву С А Автор благодарит к х н Денисенко В А, к ф -м н Глазунова В П , Дмитренка П С за съемку ЯМР, КД, ИК, масс-спектров, член-корр РАН Булгакова В П -за предоставленные клеточные культуры растений, профессора Зверева Я Ф и д б н Чучалина В С - за проведение фармакологических исследований препаратов

Используемые сокращения: ТСХ - тонкослойная хроматография, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления, ДФПГ - 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил, КД - спектры кругового дихроизма, 'Н и 13С ЯМР — спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода, с - синглет, д - дублет, м. д. - миллионные доли, COSY - корреляционная спектроскопия, HSQC -ЯМР-эксперименг гетероядерной корреляции через одну связь, НМВС - ЯМР-эксперимент гетероядерной корреляции через несколько связей, NOE - ядерный эффект Оверхаузера, FABMS - Масс-спектр бомбардировки быстрыми атомами с прямым вводом вещества, ПФКД, ПФКК - полифенольные комплексы из древесины и клеточной культуры M amurensis, Kll11 - кинетин, АНУ - а-нафталинуксусная кислота, ДХУ - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, АсАТ - аспартатаминотрансфераза, АлАТ -аланинаминотрансфераза, ЩФ - щелочная фосфатаза, ГТФ - глутатионтрансфераза, ПВ - спиртовый экстракт клеточной культуры L erythrorhizon ВК-39, ПН - спиртовый экстракт клеточной культуры Е sericeum ЕР-1

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Таксановые дитерпеноиды С целью поиска новых источников таксанов были исследованы клеточные культуры, приготовленные из растения Taxus cuspidata Sieb et Zucc на их способность аккумулировать таксановые дитерпеноиды Для выделения таксоидов были использованы различные виды колоночной хроматографии на силикагеле и сефадексе LH-20, препаративная ТСХ Из экстрактов клеточных культур Т cuspidata были выделены три

известных таксановых дипгерпеноида (1-3) и новый таксоид 4, названный нами таксюннанин-7[!-ол Структуры выделенных соединений 1-3 были установлены сравнением спектров 'Н и 13С ЯМР со спектральньми данными этих соединений, приведенными в литературе

Строение нового соединения 4 установили на основании данных спектров 'Н и 13С ЯМР Молекулярная формула С28Н40О9 была рассчитана из масс-спектра электронного удара В этом спегаре зарегистрирован пик иона [М]+ при m/z 520

АсО r2

ОАс

Ri R2 Название

1 СОСН3 Н таксюннанин С

2 СОСН(СНз)СН2СНз Н юннаксан

3 СОСН(СН3)СН(СН3)ОН Н юннанксан

4 СОСНз ОН таксюннанин-7р-ол

Величина хим сдвига протона при С-7 (5 3 90 м д) в протонном спектре 4 предполагает наличие кислородсодержащего заместителя при С-7 Сравнение данных ШС-и масс-спектров соединений 1 и 4 подтверждает, что соединение 4 содержит гидроксильную группу Сдвиг сигнала метальной группы при С-8 в4(8 0 75м д)в более сильное поле по сравнению с его положением в 1 (8 0 84 м д) указывает, что гидроксильная группа в 4 расположена при С-7 Величина вицинальной КССВ между Н-7 и протонами при С-6 (4 90 и 119 Гц) однозначно определяют экваториальное положение гидроксильной группы в молекуле 4 Сравнение спектров 13С ЯМР соединения 4 и вещества 1 также подтверждает положение гидроксильной группы при С-7 и ее ß-ориентацию в 4 Таким образом, структура соединения 4 установлена как 2a,5cc,10ß,14ß-тетроацетокси-7Р-гидрокси-4(20),11-таксадиен

2. Полифенолы из тиса остроконечного Известно, что кроме таксановых дитерпеноидов различные виды рода Taxus содержат полифенолы, представляющие собой флавоноиды и лигнаны

Различными методами колоночной хроматографии из спиртовых экстрактов корней и древесины Т cuspidata были выделены 4 лигнана (5-8) и 2 катехина (9, 10) Структуры выделенных соединений 5-10 были установлены сравнением их спектральных параметров с данными, приведенными в литературе

н3со

7 ?Г 9 он

5 (+)-таксирезинол

8 (-)-секоизоларицирезинол .он

'"он

10 (-)-эпикатехин

6: Я = Н (+)-изотаксирезинол 7: К = СНз (+)-изоларицирезинол

н3со^

9 (+)-катехин н

Рис. 1. Молекулярная и кристаллическая структура вещества 12 Для установления абсолютной стереохимии изотаксирезинола (6) было получено его производное - циклолигнан 11, последующее метилирование которого диазометаном

дало триметиловый эфир циклолигнана (12). Структура лигнана 12 была установлена методом рентгеноструктурного анализа как (7'8,8К.,8'К.)-3',4,4',5-тетраметокси-9,9'-эпокси-2,7'-циклолигнан (рис. 1). Таким образом, было показано, что асимметрические центры при углеродах 7',8,8' в молекуле изотксирезинола (6) имеют 7'S,8R,8'R конфигурации, соответственно.

3. Содержание лигнапов и катехинов в Т. cuspidata

Методом ВЭЖХ было проведено определение содержания полифенолов в различных органах растений, собранных летом 2002 года в Хасанском и Красноармейском районах Приморского края (рис. 2, табл. !). В древесине тиса (Хасанский район) накапливается наибольшее количество лигаанов 5-8, причем содержание таксирезинола (5) и изотаксирезинол (6) в ней достигало 2%. В коре, стеблях и корнях растения содержание лигнанов и катехинов значительно ниже (табл. 1). Хвоя тиса содержит, в основном, катехины. В образцах растений, собранных на юге Приморского края (Хасанский район), было обнаружено значительно больше полифенолов, чем в образцах из северных районов (Красноармейский район) (табл. 1).

тЫ 175 150 125 Ш 75 SG-2S В

mAV

ISO

WO iSd

59 б

О 5 чй t5 20 2S 30 3S мин

(Л

4„La..

Рис. 2: А. ВЭЖХ смеси индивидуальных катехинов и лигнанов; В. ВЭЖХ спиртового

экстракта древесины Т. сшр1с!а1а. СО - стандартный образец кофейной кислоты

В клеточной культуре Т сизрк^Ша были обнаружены (+)-катехин и (-)-эпикатехин, а лигнаны содержались в следовых количествах

4 Антиоксидантная и антирадикальная активность полифенолов Т. сиврШМа Ангирадикальную и ангиоксидатяую активности лигнанов и катехинов определяли по их способности улавливать свободный радикал (ДФПГ) и ингибироватъ автоокисление линетола (табл 2, рис 3)

Таблица 1 Содержание лигнанов и катехинов в различных органах растения Т сшрикаа

Органы растения Содержание лигнанов и катехинов, %

Хасанский район Приморья

5 6 7 8 9 10

древесина 2 04 1 96 0 29 1 15 - -

хвоя - 0 07 - - 0 80 -

стебли 0 03 0 06 - 0 05 0 78 013

кора 0 05 0 06 - - 0 34 0 79

корни 0 36 017 - 0 21 0 15 017

Красноармейский район Приморья

древесина 0 083 01 0 01 001 0 0003 -

хвоя - - - - 00004 0 00)

стебли - 001 - 0 001 - -

кора - - - 0 003 0 08 0 15

корни 0 005 0 02 - 0 007 0 02 0 02

Антирадикальную активность (п) оценивали как отношение количества молей ДФПГ к количеству молей исследуемого анмоксиданта в растворе при уменьшении оптической плотности раствора ДФПГ в течение 10 минут

По результатам ДФПГ-теста наиболее активными среди испытуемых веществ оказались соединения 6, 9 и 10 Антирадикальная активность соединения 6 сопоставима с активностью а-токоферола Соединения 5, 6, 9 и 10 ингибировали автоокисление линетола, причем значительно эффективнее ионола (рис 3)

Таблица 2 Ангирадикальная активность соединений 5-11

Вещество 5 6 7 8 9 10 11 а-токоферол

п 1 1 23 07 06 1 9 1 9 09 26

Рис. 3. Автоокисление линетола в присутствии полифенолов 6-11 и ионола

Сопоставляя данные по антирадикальной и антиоксидантной активности соединений 5-11, можно сделать вывод, что наибольшую активность проявляют полифенолы, содержащие две гидроксильные группы в орто-положении в ароматическом фрагменте молекулы.

5. Полифенолы клеточных культур Е. хегкеит и Ь. егуШгогМюп

13 розмариновая кислота 14а (-)-рабдозиин

14Ъ (+)-рабдозиин 15эритрихин

Из растения ЕгугпсЫит ¡епсеит и его клеточной культуры ЕР-] выделены и идентифицированы полифенольные метаболиты: розмариновая кислота (13), (-) рабдозиин (14а) и новый метаболит кофейной кислоты - эритрихин (15). В отличие от Е. яепсеит

растение Шкоярегтит егуШгогкшоп и его клеточная культура ВК-39 синтезируют розмариновую кислоту 13 и (+-) энантиомер рабдозиина 14Ъ (рис 4)

Строение нового соединения 15 было установлено с помощью спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии Молекулярная формула СгбНгоОю была рассчитана из БАВМЭ-спектра высокого разрешения В этом спектре зарегистрирован пик иона [М+Н]+ при т/г 493 1150 (рассчитанное значение 493 1143) В протонном спектре (15) присутствовали сигналы 10 ароматических протонов при 5 7 7 - 8 3 м д иб протонов гидроксильных групп при 5 7 78 (2Н), 8 00 (2Н) и 8 75 (2Н) м д Анализ спиновых систем показал наличие трех ароматических колец в молекуле 15 Два из них были 1,3,4-тризамещенными, а третье представляло собой тетразамещевный нафталиновый фрагмент Сигналы трех алифатических протонов при 5 3 17, 3 24 (Н-7") и 5 40 м д (Н-8") образуют классическую спиновую систему АВХ-типа, и принадлежат фрагменту кофейной кислоты молекулы 15 Отнесение сигналов ароматических протонов было сделано на основании экспериментов СОЗУ-45 и МОЕ В углеродном спектре соединения 15 имеются сигналы 26 атомов углерода 12 из них относились к протонированным атомам, из них 10 имели ароматический характер Полное отнесение сигналов в спектре 13С ЯМР сделано на основании двумерных спектров ЯМР (НМВС, ЖС)С) Конфигурация асимметрического центра при С-8" у эритрихина была определена сравнением его КД спектров со спектрами розмариновой кислоты 13 (рис 12)

Рис 4 Спектры кругового дихроизма По оси X - длина волны (нм), по оси У -эллиптичность(0)

Структура нового тримера кофейной кислоты эритрихина, относящегося к группе арилнафталнновых лигнанов, определена как (2й)-3-(3,4-дигидроксифенил)-2-[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-днгидрокси-2-нафтоилокси]пропановая кислота

Таблица 3 Содержание полифенолов в корнях и клеточных культурах £ егуЛгогИшт (ВК-39) и Е яепсеит (ЕР-1)

Объект Содержание, %

14а,Ь 13 15 Сумма полифенолов

ВК-39 0 82 + 0 08 1 10±0 15 - 1 92 ±0 12

Корни воробейника 0 07 ± 0 03 066 + 019 - 0 73 + 0 17

Стебли воробейника 015 ±0 03 0 28 + 0 08 - 0 43 ± 0 06

ЕР-1 0 66 ± 0 22 2 04 ± 0 40 0 04 ± 0 005 2 74 ± 0 34

Корни незабудочника 0 32 ±0 12 0 07 ± 0 02 0 02 + 0005 041 ±0 12

Стебли незабудочника 0 01 ± 0 007 Следы Следы 0 01 ± 0 007

Интересно отметить, что содержание рабдозиина и розмариновой кислоты в клеточных кулыурах ЕР-1 и ВК-39 превышает их содержание в растениях в 2-10 раз (табл 3) 6. Фармакологическая активность препаратов из биомассы клеточных культур

Е. эепсеит и £. егуМтоМгоп

Установлено влияние препаратов ПВ и ПН на функцию почек Применение ПН в дозе 100 мг/кг/день в течение 30 дней облегчает и в некоторых случаях предотвращает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс (табл 4)

Таблица 4 Влияние ПН (100 мг/кг/день, оральное применение) на крыс с гломерулонефритом

Группы крыс* Дни после начала эксперимента

0 5 10 15 ¡20 25 30 35

Диурез, мл/д

I 2 9+0 2 2 7+0 3 2 8+0 2 2 8+0 3 3 1+0 3 2 7+0 3 2 7+0 2 2 8+0 2

II 3 0±0 2 3 3+0 2 45+02 5 3+02 5 0+02 4 7+0 2 5 3+0 2 5 2+0 2

1П 2 6±0 2 6 8+0 2 76+02 6 5+0 2 6 8+0 2 6 7+0 2 7 0+0 2 64+02

выделение креатинина, мкМ/д

I 14 2±1 3 14 1+1 7 13 3+2 2 121+2 0 13 2+2 4 14 2+2 7 13 1+2 0 14 2+2 9

II 14 3±1 5 30 4±5 5 24 4+3 7 32 7+6 1 28 1+5 8 31 4+7 5 27 1+6 1 29 6+6 5

III 13 1±1 6 24 3+4 1 25 8+6 1 20 6±4 1 25 4+7 4 21 1+6 5 20 0+4 7 18 2+4 6

выделение белка с мочой, мг/д

I 2 3±02 1 9+0 1 2 7+0 3 2 4+0 2 2 4+0 3 2 0+02 24+02 2 2±0 3

II 2 4+0 2 23 9+4 0 46 0±6 0 64 4+6 6 86 6+13 9 71 4+12 0 64 7+9 2 64 7+9 2

1П 2 8±0 5 24 1+6 7 30 1+9 5 63 0±13 1 67 1+16 2 50 4+13 0 42 8+11 0 40 3+12 1

Группа I - ингакгные животные, группа II - животные с гломерулонефритом, получавшие крахмальную суспензию, группа П1 - животные с гломерулонефритом, получавшие крахмальную суспензию ПН (100 мг/кг) ежедневно

В условиях длительного применения ПВ в дозе 250 мг/кг/день установлено усиление экскреторной функции почек в виде диуретического и калийурегического эффектов, реализуемое за счет ослабления процессов почечной реабсорбции (табл 5)

Таблица 5 Влияние препарата клеточных культур ПВ (250 мг/кг) на функцию почек у крыс

Показатель, в сутки Контроль Дни введения препарата Через 2 дня*

3 5 7 9 11 13

Диурез 5 9±0 5 5 5±0 7 6 4±0 9 6 9±1 0 9 1±1 3 9 7±1 6 9 4±1 5 9 2±1 3

Натрий 48±3 5 53±9 2 55±7 5 76±13 0 59±6 0 49±5 7 56±5 2 53±4 9

Калий 523±38 481±68 634±73 607±83 845±73 766±102 921±108 812±59

Креатинин 27±2 7 28±4 1 32±4 0 33±42 47±5 7 37±4 2 39±6 1 35±4 6

Примечание Диурез - мл, натрий, калий, креатинин - мкмоль * - после окончания

эксперимента

7 Клеточные культуры маакии амурской

С целью разработки новой технологии для получения воспроизводимого источника изофлавоноидов, а также для исследования путей их биосинтеза, в 1999 г были получены первые клеточные культуры, приготовленные из побегов, черешков, цветковой кисти, почек и корней маакии амурской (М атигети) Было установлено, что клеточные культуры из различных органов М атигетк продуцируют одинаковый набор изофлавонов и птерокарпанов даидзеин (24), генистеин (27), формононетин (29), маакиаин (33) и медикарпин (34) Ни в одной клеточной культуре не были обнаружены мономерные и олигомерные стильбены, характерные для этого растения Среднее содержание полифенолов в каллусах и древесине М атигетк было 17 27 и 16 65 мг/г, а изофлавонов — 3 7 и 15 7 мг/г, соответственно (табл 6)

Таблица 6 Содержание изофлавоноидов (мг/г) в древесине и каллусах М атигетк

Изофлавоноиды 24 27 29 33 34 Сумма изофлавоноидов

Древесина следы 1 92±0 23 1 15±0 19 0 35±0 06 0 28±0 05 3 7±0 13

Каллусы 0 52+0 18 2 53±0 42 4 23+1 01 5 78+1 94 2 68+0 45 15 7±0 80

Изучено влияние различных регуляторов роста на накопление полифенолов в биомассе Оказалось, что КИН и АНУ ингибируют накопление изофлавоноидов в клетках М атигетк (табл 7) Замена а-нафталинуксусной кислоты на регулятор роста ДХУ существенно увеличивает выход полифенолов в каллусах М атигепнз (табл 7) В результате экспериментов было также установлено, что добавление фенилаланина как предшественника в биосинтезе изофлавонов в питательные среды существенно увеличивало их синтез

Таблица 7 Влияние регуляторов роста на накопление полифенолов в каллусах М атигепягв

Среда Соде) эжание изофлавоноидов, мг/г

24 27 29 33 34 Сумма изофлавоноидов

АНУ 05 1 4 28 5 8 24 12 9

ДХУ 09 1 5 43 52 69 18 8

КИН/АНУ 02 06 05 1 4 - 27

АНУ 06 3,0 29 30 20 11 5

ДХУ 25 3 7 53 33 52 20 0

КИН/АНУ - 05 02 05 - 1 2

В 2002 году из проростков семян М агти'епш была получена новая культура клеток (штамм А-18)

16-29

01*5

Н<Й0

ОН

9 он

6"-0-малонил (6"-0-та1)

30 деррон

О-^-Б-глюкопиранозил (О-р-Ъ-ф)

Наименование

16 4'-0-^-0-глюкопиранозил даидзин

17 4'-0-/3-В-глюкопиранозил генисгин

18 даидзин

19 З'-метоксидаидзин

20 7-0-/№-глюкопираиозил каликозин

21 генисгин

22 6"-0-малонилгенистин

23 ононин

24 даидзеин

25 каликозин

26 6"-0-малонилононин

27 генистеин

28 псевдобаптигенин

29 формононетин

Рис 5 Структуры изофлавонов их глюкозидов и малонилглюкозидов из клеточной культуры М амигепъм Условные обозначения §1с, глюкозид, та1, малонат

Кг Из л, Я5

7-0-р-Т>-%\с Н н 4<-0-Р-Т>-ф н

ОН н А'-О-Р-Ъ-фе н

1-0-р-Ъ-%\с Н н н н

7-О-р-Ъ-ф Н ОСНз н н

1-0-р-0-%\с н он ОСН3 н

1-0-р-0-&\с он н н н

он н н 6"-0-г

1-0-р-0-%\с н н ОСНз н

Н Н н Н -

Н Н он ОСНз -

1-О-р-Ъ-ф Н н ОСНз 6"-0-г

Н он н Н -

Н н ОСНгО -

Н н н ОСНз -

0R4

О о

31-34

н9,

O-ß-D-глюкопиранозил (0-/?-D-glc)

ОН

6"-0-малонил (6"-0-mal)

31

32

33

34

Ri

3-0-/?-D-glc

3-O-^-D-glc

H H

Rî

r,

0CH20

H OCH3

осн2о

H ОСНз

r4

6-O-raal 6'-0-mal

Наименование

(6аЯ,11аЯ)-6"-0-малонил-3-0-Д D-глюкопиранозилмаакиаин (6аЯ,1 1 аД)-6"-0-малонил-3-0-/?-D-глюкопиранозилмедикарпин (6aR,l 1 ай)-маакиаин (бай, 11 ай)-медикарпин

Рис. 6. Структуры птерокарпанов и их малонилглюкозидов из клеточной культуры

M. amurensis. Условные обозначения: glc, глюкозид; mal, малонат.

Анализ экстрактов сухих каллусов 1999 и 2002 гг. методом ВЭЖХ и ТСХ показал существенные различия в составах их компонентов. Клетки M. amurensis (тгамм А-18) содержали 20 изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны и птерокарпаны, а также их моно- ди- и малонилглюкозиды (рис. 5, 6). Структуры соединений 16-34 были установлены с использованием двумерной ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии, а также сравнением с литературными данными. Отнесение сигналов в спектрах было выполнено с использованием НМВС и HSQC экспериментов. Соединение 35 оказалось новым, ранее не известным птерокарпаном.

8. Установление структуры птерокарпана 35

Молекулярная формула С25Н22О13 была рассчитана из масс-спектра высокого разрешения МАЛДИ. В этом спектре зарегистрирован пик иона [M+Na]+ при m/z 553.3900 (рассчитанное значение 553.4241).

Из данных спектров ЯМР следовало, что в 35 присутствует моносахаридиый остаток в форме /í-D-глюкопиранозида (5Н 4.84 д, J=7.55 Гц; 5С 100.4), присоединенный к птерокарпановому фрагменту в положении 3. Сигналы при 5н 3.41 и бс 167.8, 166.7 м. д. указывают на наличие малонильного заместителя в углеводном фрагменте при С-6'. Птерокарпановому фрагменту принадлежат 12 ароматических атомов углерода (бс 110.4, 158.5, 105.3, 93.2, 104.1, 156.2, 118.3, 105.3, 141.2, 147.5, 153.6 м. д.), 5 из которых протонированы (5Н 7.37 д, J=8.6; 6.72 д, J=8.6, 2.4; 6.57 д, J= 2.4, 6.99 с, 6.52 с). Анализ данных 'Н и 13С ЯМР показал совпадение сигналов, принадлежащих ароматическим и углеводному фрагментам 35 и 31. Молекулярная масса 35 была меньше на 2 единицы, чем

у 31, что предполагало наличие в молекуле 35 дополнительной двойной связи Сигналы при 5Н 8 31 (с) и 8с 153 9 и 125 6 м д в спектрах JH и i3C ЯМР указывают на положение двойной связи между Сб-Сба в пирановом цикле молекулы 35 Полное отнесение сигналов в спектрах 'Н и ,3С ЯМР соединения 35 было проведено на основании данных HSQC и НМВС экспериментов (рис 7) Таким образом, структура соединения 35 была установлена как 6'-0-малонил-3-0-^-0-глюкопиранозил-6,6а-дегидромаакиаин

Рис 7 НМВС-корреляции для 35

9. Содержание изофлавоноидов в клеточной культуре М атигепт (А-18)

Определено количественное содержание изофлавоноидов в клеточной культуре М атигетк (штамм А-18) В процессе культивирования штамма А-18 в течение 2 месяцев происходит постепенное накопление изофлавоноидов, содержание которых достигает максимальных значений на 50-й день культивирования Далее, к 60-му дню культивирования, содержание изофлавоноидов уменьшается (табл 8)

Анализ общего содержания изофлавоноидов в культуре М атигети, культивируемой и поддерживаемой на протяжении четырех (2002-2006 гг) и пяти (20022007 гг ) лет показал, что продукция изофлавоноидов стабилизировалась и достигла 1 9 % от сухой массы клеток (табл 8) Таким образом, культура А-18 соответствует по важнейшему параметру "стабильность биосинтетической активности" требованиям, предъявляемым для промышленного испытания клеточных культур растений

Содержание изофлавоноидов в сухих клетках А-18 в зависи- Содержание изофла- Содержание изофла-

соединение мости от возраста клеток (%) воноидов в воноидов в

30 40 50 60 клетках А-18 клетках А-18

дней дней дней дней (%)2006 г (%)2007 г

16 0 046 - 0 043 - - 0 005

17 0 048 0 155 0 125 0 075 0 007 0 012

18 0018 0 039 0 055 0 031 0 051 0 067

19 0 036 0 024 0 046 0 032 0 077 0 089

20 - 0011 0 014 0 010 0 007 0 011

21 0 069 0 116 0148 0123 0 095 0 129

22 - - 0 070 0 058 0 022 0 028

23 0015 0 042 0 060 0 032 0 089 0 098

24 - - 0 012 - 0 044 0 049

25 - 0 024 0 033 0 017 0 034 0 037

26 0 071 0 204 0311 0 157 0 165 0 192

27 - 0 002 0 003 0 002 0 007 0 009

28 - - 0016 0 006 0 038 0 043

29 0 014 0 029 0 044 0 023 0 074 0 084

30 0 008 0 043 0 073 0 069 0 027 0 029

31 - 0 135 0184 0163 0 487 0 619

32 - 0 132 0162 0 098 0 070 0 093

33 - 0 020 0 039 0 031 0 072 0 090

34 0017 0 040 0 068 0 039 0 040 0 046

35 - 0 135 0 184 0163 0 128 0 139

Сумма 0 342 1,151 1690 1129 1496 1.869

I

10. Сравнительная оценка гепатоиротекторного действия полифенолов из древесины и клеточной культуры М. атигеюк.

Терапевтическую эффективность препаратов, приготовленных из ПФК древесины и клеточной культуры М атигепт (штамм А-18) оценивали по их влиянию на выживаемость животных, морфологические и биохимические показатели печени и сыворотки крови (табл 9) В группе животных, получавших препараты из ПФКД и ПФКК в эффективной дозе 100 мг/кг внутрижелудочно за 2 часа до введения гепатотоксина, выживаемость составила 100% Оба препарата препятствовали развитию морфологических и метаболических нарушений печени в сравнении с контрольной группой (табл 9) Содержание некротизированных клеток снизилось соответственно в 1 9 и 2 9 раза, гепатоцитов с дистрофией - в 1 7 и 3 5 раза, количество двуядерных гепатоцитов возросло в 2 2 и 4 9 раза, что указывает на усиление процессов регенерации печени Плотность клеточного инфильтрата уменьшилась в 1 9 и 3 1 раза, и он локализовался, преимущественно, периваскулярно Значительно возросло количество гепатоцитов нормального строения, уменьшилось венозное полнокровие Между гепатоцитами появляется молодая соединительная ткань с большим содержанием

клеточных элементов - фибробластов и фиброцитов Более эффективно восстанавливал гистоархитектонику печени ПФКК из клеточной культуры Терапия гепатопротекторами сопровождалась регрессом биохимических показателей Оба препарата статистически равноэффективно уменьшали активность в крови АсАТ (в 1 3-1 2 раза), АлАТ (в 15-16 раза), ЩФ (в 1 3-1 5 раза), ГТФ (в 2 4-2 2 раза) по сравнению с показателями контрольной группы

Содержание общего билирубина под влиянием обоих препаратов снизилось по сравнению с контролем в 1 4-1 5 раза, непрямого - в 2 2-1 9 раза, общих липидов - в 1 4 раза, белка возросло в 1 3 раза (табл 9) Учитывая различия в химическом составе ПФК из ядровой древесины и из клеточной культуры М amurensis, которая не содержит моно- и димерных стильбенов, очевидно, что их гепатопротективное действие обусловлено наличием изофлавоноидов

Таблица 9 Влияние ПФК из ядровой древесины и клеточной культуры М атигепвк на биохимические показатели крови крыс при СС^-гепатите (М±т, средние из 810 наблюдений)

Показатели Экспериментальные группы

Интактные животные Препараты

ССЬггепатит CCU-гепатит +ПФКД CCLí-гепатит +ПФКК СС14-гепатит +кареил

Нектротизированные гепатоциты, % 1 07±0 25 6 80±0 87* 3 52±0 69* 2 31±0 26* 6 6±0 75

Гепатоцшы с дистрофией, % 0 53±0 19 9 84±0 57* 5 65±0 71* 2 81±0 37* 5 95±48

Двуядерные гепатоциты, % 2 33±078 0 71±0 14* 1 58±0 40* 5 1±0 65 5 5±0 65

Плотность клеточного инфильтрата, в 1 мм2 9 35±1 60 80 4±7 80* 41 7±6 00* 25 6±3 93* 36 1±0 54'

АсАТ, мккат/л 0 61+0 04 1 44+0 02* 1 12±0 02* 1 16+0 04* 1 15±0 03

АлАТ, мккат/л 0 62±0 03 1 38+0 06* 0 89±0 03* 0 87±0 03* 1 16±001

ЩФ, Е/л 290+ 38 1 914+47 9* 705±37 2* 623+42 6* 686 ±37 5

ГТФ, мккат/л 0 09±0 01 0 66+0 06* 0 28+0 04* 0 30±0 03* -

Билирубин, мкмоль/л

общий 9 00±0 86 19 2±0 79* 13 4+0 55* 12 6±0 41* 12 9±2 3*

непрямой 2 04±0 95 14 9+2 02* 6 76±0 85* 7 70±0 43* 9 63±1 65*

Холестерин, ммоль/л 5 61+0 33 10 2±0 53* 6 73+0 18* 9 77±0 91 9 10+0 91

Белок, г/л 67 5±2 03 48 9+4 41* 65 7+0 84* 65 0+1 43* 60 0±1 6

Общие липиды, г/л 1 76±0 07 2 77+0 24* 1 93±0 43* 1 99±0 33* 2 06±0 12

Примечание * - различия достоверны (р < 0 05) для ССЦ-гепатита - по сравнению

с интактными животными, для исследуемых препаратов - по сравнению с CCLi-гепатитом

Таким образом, установлено, что ПФКК проявляет гепатопротективный эффект, сопоставимый с активностью полифенолов из ядровой древесины и представляет интерес для дальнейшего исследования в качестве альтернативного источника дня получения новых гепатопротективных лекарственных средств

Полученные культуры клеток растений Тахш сияргйсйа, ЕпШекшт яепсеит и Мааскга атигетк синтезируют большой набор разнообразных вторичных метаболитов, обладающих ценными фармакологическими свойствами Способность к биосинтезу вторичных метаболитов у этих клеточных культур не уменьшалась в течение долговременного культивирования Проведенные исследования создают базу для промышленного использования полученных культур Кроме того, созданы предпосылки для дальнейшего проведения работ в области метаболической инженерии полифенольных соединений, т е направленного биосинтеза ценных метаболитов с помощью технологий рекомбинантяых ДНК

ВЫВОДЫ

1 Из клеточной культуры Тахт сихриЫа выделены и идентифицированы 3 известных таксановых дитерпеноида такеюннанин С, юннаксан, юннанксан и один новый - таксюннанин-7Р-ол Его структура определена спектральными методами как 2а,5а,10|3,14р-тетроацетокси-7р-гидрокси-4(20),11-таксадиен

2 Из древесины растения Т сшргсЫа выделены и идентифицированы спектральными методами четыре лигнана (-)-секоизоларицирезинол, (+)-изотаксирезинол, (+)-изоларицирезинол, (+)-таксирезинол и два катехина (+)-катехин, (-)-эпикатехин Определено их содержание в различных органах растения Для подтверждения структуры и абсолютной стереохимии (+)-изотаксирезинола было проведено рентгеноструктурное исследование его производного - (7'5,8Л,8'Л)-3',4,4',5-тетраметокси-9,9'-эпокси-2,7'-циклолигнана

3 Определены антиоксидантная и ангнрадикальная активности лигнанов и катехинов из Т сияр1с1а1а на моделях ингибирования автоокисления линетола и ДФПГ

4 Из растения, Еп&юИшт вепсеит и его клеточной культура ЕР-1 выделены и идентифицированы полифенольные метаболиты (-)-рабдозиин, розмариновая кислота и новый метаболит кофейной кислоты эритрихин Структура эритрихина определена как (2Д)-3-(3,4-дигидроксифенил)-2-[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-2-нафтоипокси]пропановая кислота В отличие от Е яепсеит, растение ШНозрегтит егуЛгогкаоп и его клеточная культура ВК-39 синтезируют (+) энантиомер рабдозиина

5 Содержание рабдозиина и розмариновой кислоты в клеточных культурах ЕР-1 и ВК-39 превышает их содержание в растениях Е яепсешп и Ь ггуЛгогИаоп в 2-10 раз

6 Выявлено выраженное нефропротективное действие препаратов из клеточных культур L erythrorhizon (ПВ) и Е sericeum (ПН) Применение препарата незабудочника (ПН) в дозе 100 мг/кг/день в течение 30 дней уменьшает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс В условиях длительного применения препарата воробейника (ПВ) в дозе 250 мг/кг/день установлено усиление экскреторной функции почек в виде диуретического и калийуретического эффектов

7 Впервые получены клеточные культуры из побегов, черешков, соцветий, почек и корней Maackia amurensis, способные синтезировать изофлавоны даидаеин, генистеин, формононетин и птерокарпаны маакиаин и медикарпин, суммарное содержание которых в каллусах достигает 15 7 мг/г

8 Из клеточной культуры А-18, полученной из проростков семян М amurensis, выделено и идентифицировано 19 изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны и птерокарпаны, а также их моно- ди- и малонилглюкозиды, и новый метаболит, структура которого была установлена как б'-0-малонил-3-0-/?-0-г.ггюколиранозил-6,6а-дегидромаакиаин В отличие от растения маккии амурской, полученные клеточные культуры не синтезируют мономерные и димерные стильбены

9 Проведена сравнительная оценка гепатопротекгорных свойств далифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и клеточной культуры М amurensis Показано, что препарат из клеточной культуры облетает выраженным гепатозащитным действием, не уступающим по основным эффектам препарату из древесины Гепатопротекторная активность ПФК обусловлена наличием в них суммы изофлавоноидов

Основные публикации по теме диссертации

1 Fedoreyev S А , Vasilevskaya N А , Veselova М V , Denisenko V А , Dmitrenok Р S , Ozhigova IT,Muzarok TI, Zhuravlev YuN A new C-14 oxygenated taxane from Taxus cuspidata cell culture // Fitoterapia 1998 V 69 N 5 P 230-232

2 Fedoreyev S A, Pokushalova T V, Veselova M V, Glebko LI, Kulesh NI, Muzarok TI, Seletskaya L P, Bulgakov V P, Zhuravlev Yu N Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis II Fitoterapia 2000 V 71 N 2 P 365-372

3 Федореев С A, Кулеш H И, Глебко Л И, Покушалова Т В , Веселова М В , Саратиков А С , Венгеровский А И , Чучалин В С Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской//Хим-фарм журн 2004 Т 38 № 11 С 22-26

4 Fedoreyev S А , Veselova М V, Knvoschekova О Е, Mischenko N Р, Denisenko V А, Dmitrenok Р S , Glazunov V Р , Bulgakov V Р , Tchernoded G К, Zhuravlev Yu N Caffeic acid metabolites from Eritrickium sericeum cell cultures H Planta Med 2005 V 71 N 5 P 446-451

5 Bulgakov V P , Veselova M V, Tchemoded G К, Kiselev К V , Fedoreyev S A and Zhuravlev Yu N Unusual effect of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene on secondary metabohsm inhibition of rabdosun and rosmannic acid production in plant cell cultures // Planta 2005 V 221 N 4 P 471-478

6 Федореев С A, Музарок T И , Селецкая JIД , Веселова M В , Кулеш H И , Глебко Л И, Покушалова Т В , Чучалин В С , Саратиков А С , Булгаков В П , Журавлев Ю H Гепатопротекторное средство Пат 2244553 Cl Российская Федерация, А61К 35/78, 31/05, А61Р1/16 №2003118009/15/, заявл 16 06 2003, опубл 20 01 2005,Бюл № 2

7 Ратькин Е В , Федореев С А , Булгаков В П, Чучалин В С , Веселова M В Сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенольных комплексов ядровой древесины и клеточной культуры маакии амурской // Бюллетень сибирской медицины 2006 Т 5 Прил 2 С 127-128

8 Веселова M В , Федореев С А , Василевская H А, Денисенко В А, Герасименко А В Антжжсидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного // Хим -фарм журн 2007 Т 42 № 2 С 29-34

9 Inyushkma Y V , Bulgakov V P , Veselova M V , Bryukhanov V M , Zverev Y F , Lampatov V V , Azarova О V , Tchernoded G К, Fedoreyev S A and Zhuravlev Yu N High rabdosun and rosmanrac acid production m Eritrichium sericeum callus cultures and effect of the calli on Masugi-nephntis m rats//Biosci Biotechnol Biochem 2007 V 71 N 5 P 1286-1293

10 Веселова M В , Василевская H A , Федореев С A , Денисенко В A Таксановьге дитерпеноиды из клеточной культуры тиса остроконечного // Материалы научной конференции ТИБОХ ДВО РАН «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» сб тез докл - Владивосток 1998 С 85-86

11 Веселова M В , Федореев С А , Василевская H А , Денисенко В А , Покушалова Т В Полифенолы из корней клеточной культуры тиса остроконечного // Материалы региональной научной конференции «Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока» сб тез докл - Владивосток 2001 С 25-27

12 Покушалова Т В , Веселова M В , Федореев С А , Кулеш H И , Глебко JIИ Изофлавоноиды из клеточной культуры маакии амурской // Материалы региональной научной конференции «Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов из наземных растений Дальнего Востока» сб тез докл -Владивосток 2001 С 144-146

13 Федореев С А , Кулеш H И , Глебко JIИ , Покушалова Т В , Веселова M В , Саратиков А С , Венгеровский А И , Чучалин В С Препарат Максар из дальневосточного растения маакии амурской // Материалы VII международного съезда «Актуальные проблемы

создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» сб тез докл -Санкт-Петербург 2003 С 293-299

14 Веселова М В , Кривощекова О Е, Федореев С А, Денисенко В А Олигомеры кофейной кислоты из клеточных культур и растений семейства Вога^пасеае // Материалы региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» сб тез докл -Владивосток 2004 С 39

15 Федореев С А, Кулеш Н И, Веселова М В , Глебко Л И , Покушалова Т В , Саратиков А С , Чучалин В С Препарат максар из маакии амурской - эффективное гепатозащитное средство // Материалы региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» сб тез докл - Владивосток 2004 С

16 Veselova М V , Knvoschekova О Е , Fedoreyev S А , Mischenko N Р , Bulgakov V Р , Tchemoded GK Polyphenols from Eritrichium sericeum cell cultures // 2Dd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances (ICNPAS-2004) book ofabstr -Novosibirsk Russia 2004 P 121

17 Fedoreyev S A , Veselova MV, Knvoschekova О E , Mischenko N P , Demsenko V A , Bulgakov V P , Tchemoded G К, Zhuravlev Yu N Caffeic acid metabolites from Eritrichium sericeum and Lithospermum erythrorhizon cell cultures // International congress "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin Phytopharm 2004" book of abstr - Mikkeli Finland 2004 P 301-307

18 Федореев С A, Кулеш H И , Ратькин Е В, Агафонова И А , Веселова М В , Чучалин В С , Саратиков А С , Булгаков В П , Глебко Л И, Василевская Н А Сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенолов из древесины и клеточной культуры маакии амурской // Материалы IX Международного Съезда ФИТОФАРМ 2005 сб тез докл -Санкт-Петербург 2005 С 706-712

19 Азарова О В , Федореев С А , Зяблова О Н , Брюханов В М , Инюшкина Ю В , Зверев Я Ф, Веселова М В , Лампатов В В , Журавлев Ю Н Диуретическое действие препарата незабудочника шелковистого в условиях длительного введения крысам // Труды международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию профессора Ш М Омарова «Фармакология и фармакотерапия достижения и перспективы» сб тез докл -Махачкала 2006 С 170-172

98-99

Соискатель

Веселова М В

Подписано в печать 01 10 2007 г Формат 60x90/16 1 уч -изд л Тираж 100 экз Заказ № 82 Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» Г Владивосток, ул Западная, 10

Обозначения и сокращения.

1.ВВЕДЕНИ Е.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Метаболиты из Taxus cuspidata.

2.1.1. Таксановые дитерпеноиды.

2.1.1.1. Строение и номенклатура таксановых дитерпеноидов.

2.1.1.2. Таксановые дитерпеноиды Т. cuspidata.

2.1.1.3. Биологическая активность таксоидов.

2.1.2. Лигнаны.

2.1.2.1. Строение и распространение в природе.

2.1.2.2. Номенклатура лигнанов.

2.1.2.3. Лигнаны рода Taxus. 2.1.2.4. Биологическая активность лигнанов.

2.1.2.5. Биосинтез лигнанов.

2.2. Лигнаны из растений семейства Boraginaceae.

2.1.1. Розмариновая кислота.

2.2.2. Производные розмариновой кислоты.

2.2.3. Биологическая активность метаболитов кофейной кислоты.

2.2.4. Биосинтез розмариновой кислоты.

2.3.Изофлавоноид ы.

2.3.1. Распространение изофлавоноидов.

2.3.2. Номенклатура изофлавоноидов.

2.3.3. Способы выделения и идентификации изофлавоноидов.

2.3.4. Биосинтез изофлавоноидов.

2.3.5. Биологическая активность изофлавоноидов.

2.3.5.1. Изофлавоноиды как фитоэстрогены.

2.3.5.2. Противоопухолевая активность изофлавоноидов.

2.3.5.3. Кардиопротекторное действие изофлавоноидов.

2.3.5.4. Изофлавоноиды как гепатопротекторы.

2.3.5.5. Изофлавоноиды как фитоалексины.

2.3.6. Изофлавоноиды клеточных культур.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Таксановые дитерпеноиды.

3.2. Лигнаны Т. cuspidata.

3.2.1. Содержание лигнанов и катехинов в Г. cuspidata.

3.2.2. Антиоксидантная и антирадикальная активности полифенолов из Т. cuspidata.;.

3.3. Полифенолы клеточных культур Е. sericeum и L. erythrorhizon.

3.3.1. Определение содержания рабдозиина и розмариновой кислоты в клеточных культурах Е. sericeum и L erythrorhizon методом ВЭЖХ.

3.3.2. Антиоксидантная активность розмариновой кислоты и (-)-рабдозиина

3.3.3. Фармакологическая активность препаратов из биомассы клеточных культур Е. sericeum (ЕР-1) и L. erythrorhizon (ВК-39).

3.4. Изофлавоноиды из клеточной культуры М. amurensis.

3.4.1. Препарат максар из дальневосточного растения М. amurensis.

3.4.2. Химический состав препарата максар.

3.4.3. Государственная регистрация и лицензирование препарата максар

3.4.4. Клеточные культуры М. amurensis.

3.4.5. Установление структуры 6'-0-малонил-3-0-/?-В-глюкопиранозил-6,6а-дегидромаакиаина.

4.3.6. Кислотный гидролиз суммарного спиртового экстракта клеточной культуры

M. amurensis.

3.4.7. Содержание изофлавоноидов в клеточной культуре М. amurensis (штамм А-18).

3.4.8. Сравнительная оценка гепатопротекторных свойств полифенолов из древесины (ПФКД) и клеточной культуры (ПФКК) М. amurensis.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Приборы и оборудование.

4.2. Препаративная хроматография.

4.3. Аналитическая хроматография.

4.3.1. Аналитическая ВЭЖХ.

4.3.2. Подготовка стандартного образца (СО) для ВЭЖХ.

4.3.3. Подготовка проб для проведения анализа методом ВЭЖХ.

4.3.4. Определение относительных времен удерживания и поправочных коэффициентов индивидуальных соединений.

4.3.5. Аналитическая ВЭЖХ экстрактов из растения и клеточной культуры

Т. cuspidata.

4.3.6. Аналитическая ВЭЖХ хроматографических фракций и экстрактов клеточных культур М. amurensis.

4.3.7. Аналитическая ВЭЖХ экстрактов L. erythrorhizon и Е. sericeum и их клеточных культур.

4.3.8. Аналитическая тонкослойная хроматография.

4.4. Биологический материал.

4.4.1. Методика культивирования клеточных культур Т. cuspidata. -.-. •

4.4.2. Методика культивирования клеточных культур L. erythrorhizon и Е. sericeum.

4.4.3. Методика культивирования клеточных культур М. amurensis.

4.4:4. Кислотный гидролиз суммарного спиртового экстракта клеточной культуры М. amurensis.

4.4.5. Исследование фармакологической активности препаратов из растений и клеточных культур L. erythrorhizon, Е. sericeum и М. amurensis.

4.5. Полифенолы из Т. cuspidata.

4.5.1. Определение антирадикальной активности полифеиолов из

Т. cuspidata.

4.5.2. Определение антиоксидантной активности полифенолов из

Т. cuspidata.

4.6. Выделение таксановых дитерпеноидов.

4.7. Выделение олигомеров кофейной кислоты из клеточных культур Е. sericeum и L. erythrorhizon.

4.8. Выделение изофлавоноидов из клеточной культуры М. amurensis.Ill

4.8.1. Получение первичного экстракта из клеточной культуры М. amurensis. Ill

4.8.2. Выделение изофлавоноидов из клеточной культуры М. amurensis. Ill 4.8.3; Выделение и идентификация индивидуальных изофлавоноидов.

5. ВЫВОДЫ.

Для защиты от повреждающего действия кислорода и, особенно, его активных форм и свободных радикалов, все аэробные организмы вынуждены создавать многоступенчатые превентивные системы, состоящие из разнообразных ферментов, а также антиоксидантов. В настоящее время доказано, что большинство патологических состояний биологических систем (растений, животных и человека) либо вызывается нарушением нормального уровня свободных радикалов в их органах и тканях, либо такое нарушение возникает как следствие развития патологии. Это в полной мере относится к естественному процессу старения, сердечно-сосудистым заболеваниям, воспалительным явлениям и ожогам и, прямо или косвенно, к онкологическим заболеваниям. Лекарственное или диетическое корректирование подобных нарушений введением экзогенных антиоксидантов стало ведущим направлением в современных фармакологических и клинических разработках. Широкое использование пищевых синтетических антиоксидантов привело к серьезному кризису. Возникла необходимость замены синтетических продуктов в пищевой промышленности и медицине природными соединениями. Такого рода поиски в широких масштабах ведутся в Японии, США, Финляндии, Швейцарии - странах, настойчиво пытающихся научно обосновать пищевой рацион своих граждан. Растения испытывают особую потребность в антиокислительной защите, так как в процессе эволюции их морфология формировалась для максимального взаимодействия с компонентами атмосферы с целью успешного осуществления фотосинтеза. По этой причине растения обладают мощными защитными ферментными системами, а также вырабатывают разнообразнейшие типы антиоксидантов (токоферолы, флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, лигнаны, каротиноиды). Будучи компонентами нормальной диеты человека или их близкими аналогами, антиоксиданты дикорастущих растений могут быть успешно привлечены для восполнения дефицита пищевых антиоксидантов и широкого лекарственного использования.

Природные ресурсы Приморского края представляют широкие возможности для получения разнообразных антиоксидантов и их композиций, прежде всего из растений, применяемых как лекарственные средства. Для детальных фитохимических и последующих фармакологических исследований нами были выбраны несколько групп таких лекарственных растений, экстрактивные вещества которых в сочетании с весьма низкой токсичностью в тоже время проявляли максимальный антиоксидантный эффект.

Флора Дальнего Востока является богатейшим источником традиционных и новых лекарственных средств растительного происхождения, однако современные ресурсоведческие исследования показали, что интенсивные заготовки дикорастущих лекарственных растений приводят к повсеместному истощению их запасов, исчезновению популяций и некоторых видов растений. Складывается парадоксальная ситуация -растения, в которых синтезируются наиболее ценные вещества, которые жизненно необходимы для здоровья человека, являются первыми кандидатами для занесения в "Красную книгу".

По этой причине выходом из создавшейся ситуации является развитие методов биотехнологии (культивирование микроорганизмов и клеточных культур из высших растений). Именно биотехнология клеточных культур высших растений может решить проблему сохранения в природе редких видов растений, а также создаст реальную возможность для разработок новейших технологий для получения наиболее ценных лекарственных веществ и, в конечном счете, новых медицинских препаратов на их основе.

Объектом настоящего исследования явились редкие и ценные растения дальневосточной флоры и их клеточные культуры. t ij>

5. ВЫВОДЫ

1. Из клеточной культуры Taxus cuspidata выделены и идентифицированы 3 известных таксановых дитерпеноида: таксюннанин С, юннаксан, юннанксан и один новый - таксюннанин-7р-ол. Его структура определена спектральными методами как 2а,5а,10р,14р-тетроацетокси-7р-гидрокси-4(20),11-таксадиен.

2. Из древесины растения Т. cuspidata выделены и идентифицированы спектральными методами четыре лигнана: (-)-секоизоларицирезинол, (+)-изотаксирезинол, (+)-изоларицирезинол, (+)-таксирезинол и два катехина: (+)-катехин, (-)-эпикатехин. Определено их содержание в различных органах растения. Для подтверждения структуры и абсолютной стереохимии (+)-изотаксирезинола было проведено рентгеноструктурное исследование его производного - (7'5,8^,8'Л)-3',4,4',5-тетраметокси-9,9'-эпокси-2,7,-циклолигнана.

3. Определены антиоксидантная и антирадикальная активности лигнанов и катехинов из Т. cuspidata на моделях ингибирования автоокисления линетола и ДФПГ.

4. Из растения Eritrichium sericeum и его клеточной культуры ЕР-1 выделены и идентифицированы полифенольные метаболиты: (-)-рабдозиин, розмариновая кислота и новый метаболит кофейной кислоты эритрихин. Структура эритрихина определена как (2^)-3-(3,4-дигидроксифенил)-2-[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-2-нафтоилокск] ' пропановая кислота. В отличие от Е. sericeum, растение Lithospermum erythrorhizon и его клеточная культура ВК-39 синтезируют (+) энантиомер рабдозиина. .'

5. Содержание рабдозиина и розмариновой кислоты в клеточных культурах ЕР-1 и ВК-39 превышает их содержание в растениях Е. sericeum и L. erythrorhizon в 2-10 раз. .

6. Выявлено выраженное нефропротективное действие препаратов из клеточных культур L. erythrorhizon (ПВ) и Е. sericeum {ПН). Применение препарата незабудочника (ПН) в дозе 100 мг/кг/день в течение 30 дней уменьшает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс. В условиях длительного применения препарата воробейника (ПВ) в дозе 250 мг/кг/день установлено усиление экскреторной функции почек в виде диуретического и калийуретического эффектов.

7. Впервые получены клеточные культуры из побегов, черешков, соцветий, почек и корней Maackia amurensis, способные синтезировать изофлавоны даидзеин, генистеин, формононетин и птерокарпаны маакиаин и медикарпин, суммарное содержание которых в каллусах достигает 15.7 мг/г.

8. Из клеточной культуры А-18, полученной из проростков семян М. amurensis, выделено и идентифицировано 19 изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны и птерокарпаны, а также их моно-, ди- и малонилглюкозиды, и новый метаболит, структура которого была установлена как 6'-0-малонил-3-<9-/?-В-глюкопиранозил-б,6а-дегидромаакиаин. В отличие от растения маккии амурской, полученные клеточные культуры не синтезируют мономерные и димерные стильбены.

9. Проведена сравнительная оценка гепатопротекторных свойств полифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и клеточной культуры М. amurensis. Показано, что препарат из клеточной культуры обладает выраженным гепатозащитным действием, не уступающим по основным эффектам препарату из древесины. Гепатопротекторная активность ПФК обусловлена наличием в них суммы изофлавоноидов.

1. Van Rozendaal E.L.M., Kurstjens S.J.L., van Веек T.A., van der Berg R.G. Chemotaxonomyof Taxus II Phytochemistry. 1999. V. 52. N. 3. P. 427-433.

2. Parmar V.S., Jha A., Bisht K.S., Taneja P., Singh S.K., Kumar A:, Poonam, Jain R., Olsen C.

3. E. Constituents of the yew trees // Phytochemistry. 1999. V. 50. N. 8. P. 1267-1304.

4. Yang S.-J., Fang J.-M., Cheng Y.-S. Lignans, flavonoids and phenolic derivatives from Taxusmairei II J. Chin. Chem. Soc. 1999. V. 46. N. 5. P. 811-820.

5. Wani M.C., Taylor H.L., Wall M.E., Coggon P., McPhail A.T. Plant antitumor agents. VI. Theisolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia II J. Am. Chem. Soc. 1971. V. 93. N. 9. P. 2325-2327.

6. Kingston D.G.I., Molinero A.A., Rimoldi J.M. The taxane diterpenoids. Wien, New York:

7. Springer-Verlag. 1993.206 p.

8. Begley M.J., Jackson C.B., Pattenden G. Total synthesis of verticillene. A biomimeticapproach to the Taxane family of alkaloids // Tetrahedron. 1990. V. 46. N. 13-14. P. 49074924.

9. Miller W.M., Powel R.G., Smith C.R.Jr., Arnold E., Clardy J. Antileukemic alkaloids from

10. Taxus wallichiana Zucc // J. Org. Chem. 1981. V. 46. N. 7. P. 1469-1474.

11. Nicolaou K.C., Yang Z., Liu J.J., Ueno H., Nantermet P.G., Guy R.K., Claiborne C.F., Renaud

12. J., Couladouros E.A., Paulvannan K., Sorensen E.J. Total synthesis of Taxol // Nature. 1994. V. 367 N. 6464. P. 630-634.

13. Зефирова O.H., Нуриева E.B., Рыжов A.H., Зык Н.В., Зефиров Н.С. Таксол: синтез,биоактивные конформации и соотношение структура-активность для его аналогов // ЖОХ. 2005. Т. 41. Вып. 3. С. 329-362.

14. Ellis D.D., Zeldin E.L., Brodhagen М., Russin W.A., McCown B.H. Taxol production innodule cultures of Taxus II J. Nat. Prod. 1996. V. 59. N. 3. P. 246-250.

15. Ma W., Stahlhut R.W., Adams T.L., Park G.L., Evans E.A., Blumenthal S.G., Gomez G.A.,

16. Nieder M.H., Hylands P.J. Yunnanxane and its homologous esters from cell cultures of Taxus chinensis var. mairei II J. Nat. Prod. 1994. V. 57. N. 9. P. 1320-1324.

17. Cheng K., Fang W., Yang Y., Xu H., Meng C., Kong M., He W., Fang Q. C-14 oxygenatedtaxanes from Taxus yunnanensis cell cultures // Phytochemistry. 1996. V. 42. N. 1. P. 7375.

18. Fedoreyev S.A., Vasilevskaya N.A., Veselova M.V., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S.,

19. Ozhigova I.T., Muzarok T.I., Zhuravlev Yu. N. A new C-14 oxygenated taxane from Taxus cuspidata cell culture // Fitoterapia. V. 69. N; 5. P. 430-432.

20. Bai J., Kitabatake M., Toyoizumi K., Fu L., Zhang S., Dai J., Sakai J., Hirose K., Yamore Т.,

21. Tomida A., Tsuruo Т., Ando M. Production of biologically active taxoids by a callus culture of Taxus cuspidata // J. Nat. Prod. 2004. V. 67. N. 1. P. 58-63.

22. Bai J., Ito N., Sakai J., Kitabatake M., Fujisawa H., Bai L., Dai J., Zhang S., Hirose K.,

23. Tomida A., Tsuruo Т., Ando M. Taxoids and abietanes from callus cultures of Taxus cuspidata Hi. Nat. Prod. 2005. V. 68. N. 4. P. 497-501.

24. Baebler S., Camloh M., Kovac M., Ravnikar M., Zel J. Jasmonic acid stimulates taxaneproduction in cell suspension culture of yew (Taxus^media) II Planta Med. 2002. V. 68. N. 5. P. 475-476.

25. Lan W.Z., Yu L.J., Li M.Y., Qin W.M. Cell death unlikely contributes to Taxol production infungal elicitor-induced cell suspension cultures of Taxus chinensis II Biotechnol. Lett. 2003. V. 25. N. 1. P. 47-49.

26. Baloglu E., Kingston D.G.I. A new semisynthesis of paclitaxel from baccatin III 11 J. Nat.

27. Prod. 1999. V. 62. N. 7. P. 1068-1071.

28. Appendino G. The phytochemistry of yew tree // Nat. Prod. Rep. 1995. V. 12. N. 4. P. 349360.

29. Baloglu E., Kingston D.G.I. The taxane diterpenoids // J. Nat. Prod. 1999. V. 62. N. 10. P.1448-1472.

30. Shigemori H., Kobayashi J. Biological activity and chemistry of taxoids from the japaneseyew, Taxus cuspidata II J. Nat. Prod. 2004. V. 67. N. 11. P. 245-256.

31. Yang S.-J., Fang J.-M., Cheng Y.-S. Taxanes from Taxus mairei I I Phytochemistry. 1996. V.43. N. 4. P. 839-842.

32. Banskota A.H., Usia Т., Tezuka Y., Kouda K., Nguyen N.T., Kadota S. Three new C-14oxygenated taxanes from the wood of Taxus yunnanensis // J. Nat. Prod. 2002. V. 65. N. 11. P. 1700-1702.

33. Lavelle F., Gueritte-Voegelein F., Guenard D. Taxotere: from yew's needles to clinicalpractice // Bull Cancer. 1993. V. 80. N. 4. P. 326-338

34. Kashiwada Y., Nishizawa M., Yamagishi T.,Tanaka Т., Nonaka G.-I., Cosentino L.M.,

35. Snider J.V., Lee K.-H. Anti-AIDS agents, 18.1 Sodium and potassium salts of caffeic acid tetramers from Arbenia euchroma as anti-HIV agents // J. Nat. Prod. 1995. V. 58. N. 3. P. 392-400.

36. Kuo Y.-H., Li S.-Y., Wu M.-D., Huang R.-L., Kuo Y.L.-M., Chen C.-F. A new anti-HBeAglignan, kadsumarin A, from Kadsura matsudai and Schizandra arisanensis И Chem. Pharm. Bull. 1999. V. 47. N. 7. P. 1047-1048.

37. Lu Y., Foo L.Y. Polyphenols of Salvia a review // Phytochemistry. 2002. V.59. N. 2. P.117.140.

38. Lewis, N.G., Davin, L.B. Evolution of lignan and neolignan biochemical pathways //1.opentenoids and other natural products: evolution and function. Symposium Series 562. / ed.: Nes W.D., Washington, DC: American Chemical Society, 1994. P. 202-246.

39. Miller R.W., McLaughlin J.L., Powell R.G., Platiner R.D., Weisleder D.,, Smith C.R. Jr.1.gnans from Taxus wallichiana // J. Nat. Prod. 1982. V.45. N. 1. P. 78-82.

40. Martinez J.C.V., Aldana J.M.I., Cuca L.E.S. Dibenzylbutane lignans from Virola sebiferaleaves // Phytochemistry. 1999. V. 50. N. 5. P. 883-886.

41. Das В., Rao S.P. Srinivas K.V.N.S., Yadav J.S. Lignans of Taxus baccata И Fitoterapia.1995. V. 66. N. 5. P. 475.

42. Barrero A.F., Herrador M.M., Akssira M., Arteaga P., Romera J.L. Lignans and polyacetylenes from Bupleurum acutifolium II J. Nat. Prod. 1999. V. 62. N. 7. P. 946-948.

43. Shen Y.-C., Chen C.-Y., Lin Y.-M., Kuo,Y.-H. A lignan.from roots of Taxus mairei II

44. Innocenti G., Puricelli L., Piacente S., Caniato R., Filippini R., Cappelletti E.M. Patavine, anew arylnaphtlialene lignan glycoside from shoot cultures of Haplophyllum patavinum II Chem. Pharm. Bull. 2002. V. 50. N. 6. P. 844-846.

45. Ai-Abed Y., Abu-Zarga M., Sabri S., Atta-Ur-Rahman, Voelter W. A arylnaphthalene lignanfrom Hallophyllum buxbaum II // Phytochemistry. 1998. V. 49. N. 6. P. 1779-1781.

46. Lee S.-S., Lin M.-T., Liu.C.-L., Lin Y.-Y., Liu K.C.S.C. Six lignans from Phyllanthusmyrtifolius // J. Nat. Prod. 1996. V. 59. N. 11. P. 1061-1065.

47. Kuo Y.-H., Li S.-Y., Huang R.-L., Wu M.-D., Huang H.-C., Lee K.-H. Schizarin В, C, D,and E, four new lignans from Kadsura matsudai and their antihepatitis activities I I J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N. 4. P. 487-490.

48. Chen D.-F., Zhang S.-X., Chen K., Zhou B.-N., Wang P., Cosentino L.M., Lee K.-H. Twonew lignans, interiotherins A and B, as anti-HIV principles from Kadsura interior I I J. Nat. Prod. 1996. V. 59. N. 11. P. 1066-1068.

49. Kuroyanagi M., Yoshida K., Yamamoto A., Miwa M. Bicyclo3.2.1.octane and 6-oxabicyclo[3.2.2]nonane type neolignans from Magnolia denudata II Chem. Pharm. Bull. 2000. V. 48. N. 6. P. 832-837.

50. Rossi М.Н., Yoshida M., Maia J.G.S. Neolignans, styrylpyrones and flavonoids from an

51. Aniba species // Phytochemistry. 1997. V. 45. N. 6. P. 1263-1269.

52. Zhang H.-J, Tamez P.A., Hoang V.D., Tan G.T., Hung N.V., Xuan L.T., Huong L.M., Cuong

53. N.M., Thao D.T., Soejarto D.D., Fong H.H.S., Pezzuto J.M. Antimalarial compounds from Rhaphidophora decursiva I I J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N. 6. P. 772-777.

54. Moss G.P. Nomenclature of lignans and neolignans // Pure Appl. Chem. 2000. V. 72. N. 8. P.1493-1523.

55. King F.E., Jurd I., King T.J. Isotaxiresinol (З'-demethylisolariciresinol), a new lignanextracted from the heartwood of English yew Taxus baccata II J. Chem. Soc. 1952. P. 1724.

56. Erdtman H., Tsuno K. Taxus heartwood constituents // Phytochemistry. 1969. V. 8. N. 5. P.931.932.

57. Mujumdar R.B., Srinivasan R., Venkataraman K. Taxiresinol, a new lignan in the heartwoodof Taxus baccata II Indian J. Chem. 1972. V. 10. P. 677-680.

58. Das В., Rao S.P., Srinivas K.V.N.S., Yadav J.S. Lignans, biflavones and taxoids from

59. Himalayan Taxus bacata И Phytochemistry. 1995. V. 38. N. 3. P. 715-717.

60. Kawamura F., Kikuchi Y., Ohira Т., Yatagai M. Phenolic constituents of Taxus cuspidta I:lignans from the roots // J. Wood. Sci. 2000. V.46. P. 167-171.

61. Erdemoglu N., Sahin E., Sener В., Ide S. Structural and spectroscopic characteristics of twolignan from Taxus baccata L // J. Mol. Struct. 2004. V. 692. N. 1. P. 57-62.

62. Erdemoglu N., Sener В., Ozcan Y., Ide S. Structural and spectroscopic characteristics of twonew dibenzylbutane type lignans from Taxus baccata LI I J. Mol. Struct. 2003. V. 655. N. 3. P. 459-466.

63. Chattopadhyay S. K., Kumar T.R.S., Maulik P.R., Srivastava, S. Garg A., Sharon A., Negi

64. A.S., Khanuja S.P.S. Absolute configuration and anticancer activity of taxiresinol and related lignans of Taxus wallichiana И Bioorg. Med. Chem. 2003. V. 11. P. 4945-4948.

65. Banskota A. H., Tezuka Y., Nguen N. Т., Awale S., Nobukawa Т., Kadota S. DPPH radicalscavenging and nitric oxide inhibitory activities of the constituents from the wood of Taxus yunnanensis И Planta Med. 2003. V. 69. N. 6. P. 500-505.

66. Braca A., De Tommasi N., Di Ban L., Pizza C., Politi M., Morelli I. Antioxidant principlesfrom Bauhinia tarapotensis И J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N. 7. P. 892-895.

67. Prasad К. Hydroxyl radical-scavenging property of secoisolariciresinol diglucoside (SDG)isolated from flax-seed // Mol. Cell. Biochem. 1997. V. 168. N. 1-2. P 117-123.

68. Prasad K. Oxidative stress as a mechanism of diabetes in diabetic BB prone rats: effect ofsecoisolariciresinol diglucoside (SDG)//Mol. Cell. Biochem. 2000. V: 209. N. 1-2. P. 8996. .

69. Prasad K., Mantha S.V., Muir A.D., Westcott N.D. Protective effect of secoisolariciresinoldiglucoside against streptozotocin-induced diabetes and its mechanism // Mol. Cell. Biochem. 2000. V. 206. N. 1-2. P. 141-149.

70. Chen С .-С., Chen H.-Y., Shiao M.-S., Lin Y.-L., Kuo Y.-H., Ou J.-C. Inhibition of lowdensity lipoprotein oxidation by tetrahydrofurofuran lignans from Forsythia suspensa and Magnolia coco // Planta Med. 1999. V. 65. N. 8. P. 709-711.

71. Navarro E., Alonso S.J., Trujillo J., Jorge E., Perez C. General behavior, toxicity, andcytotoxic activity of elenoside, a lignan from Justicia hyssopifolia II J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N. 1. P. 134-135.

72. Chen I.-S., Chen J.-J., Duh C.-Y., Tsai I.-L. Cytotoxic lignans from Formosan Hernandianymphaeifolia // Phytochemistry. 1997. V. 45. N. 5. P. 991-996.

73. Ma C.-M., Nakamura N., Min B.S., Hattori M. Triterpenes and lignans from Artemisiacaruifolia and their cytotoxic effects on Meth-A and LLC tumor cell lines // Chem. Pharm. Bull. 2001. V. 49. N. 2. P. 183-187.

74. Day S.-H., Lin Y.-C., Tsai M.-L., Tsao L-T., Ко H.-H., Chung M.-I., Lee J.-C., Wang J.-P.,

75. Won S.-J., Lin C.-N. Potent cytotoxic lignans from Justicia procumbens and their effects on nitric oxide and tumor necrosis factor-a production in mouse macrophages // J. Nat. Prod. 2002. V. 65. N. 3. P. 379-381.

76. Cho J.Y., Kim A.R., Park M.H. Lignans from the rhizomes of Coptis japonica differentiallyact as anti-inflammatory principles I I Planta Med. 2001. V. 67. N. 4. P. 312-316

77. Kupeli E., Erdemoglu N., Ye§ilada E., Sener B. Anti-inflammatory and antinociceptiveactivity of taxoids and lignans from the heartwood of Taxus baccata L // J Ethnopharmacology. 2003. V. 89. N. 2-3. P. 265-270.

78. Nguen N.T., Banskota A.H., Tezuka Y., Tran Q.L., Nobukawa T. Kurashige Y., Sasahara

79. M., Kadota S. Hepatoprotective effect of taxiresinol and (77?)-7'-hydroxyIariciresinol on D-• galactozamine and lipopolysaccharide-induced liver injury in mice // Planta Med. 2004. V. 70. N.l. P. 29-33.

80. Banskota A.H., Nguen N.T., Tezuka Y., Tran Q.L., Nobukawa Т., Kurashige Y., Sasahara

81. M., Kadota S. Secoisolariciresinol and isotaxiresinol inhibit tumor necrosis factor-a-dependent hepatic apoptosis in mice // Life Sci. 2004. V. 74. N. 22. P. 2781-2792.

82. Gurbuz I., Erdemoglu N., Yesilada E., Sener B. Anti-ulcerogenic lignans from Taxus baccata1.// Z. Naturforsch. 2004. V. 59. N. 3-4. P. 233-236.

83. Ishida J., Wang H.-K., Oyama M., Cosentino M.L., Hu C.-Q., Lee K.-H. Anti-AIDS agents.

84. Anti-HIV activity of harman, an anti-HIV principle from Symplocos setchuensis, and its derivatives // J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N. 7. P. 958-960.

85. Wang C.-Y., Sun S.-W., Lee S.-S. Pharmacokinetic and metabolic studies of retrojusticidin

86. B, a potential anti-viral lignan, in rats // Planta Med. 2004. V. 70. N. 12. P. 1161-1165.

87. Gertsch J. Tobler R.T., Brun R., Sticher O., Heilmann J. Antifungal, antiprotozoal, cytotoxicand piscicidal properties of justicidin В and a new arylnaphthalide lignan from Phyllanthus piscatorum II Planta Med. 2003. V. 69. N. 5. P. 420-424.

88. Xia Z.-Q., Costa M.A., Proctor J., Davin L.B., Lewis N.G. Dirigent-medialed podophyllotoxin biosynthesis in Linum jlavum and Podophyllum pdtatum И Phytochemistry. 2000. V. 55. N. 6. P. 537-549.

89. Kuhlmann S., Kranz K., Lucking В., Alfermann A.W., Petersen M. Aspects of cytotoxiclignan biosynthesis in suspension cultures of Linum nodijlorum II Phytochemistry Rev. 2002. V. 1. P. 37-43.

90. Старченко B.M. Бурачниковые (Boragenaceae G. Don) советского Дальнего Востока.

91. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1985.108 с.

92. Kelley C.J., Mahajan J.R., Brooks L.C., Neubert L.A., Breneman W.R., Carmack M.

93. Polyphenolic acid of Lithospermum ruderale Dougl. ex Lehm. (Boraginaceae). I. Isolation and structure determination of lithospermic acid // J. Org. Chem 1975. V. 40. N. 12. P. 1804-1815.

94. Agata I., Hatano Т., Nishibe S., Okuda T. Rabdosiin, a new rosmarinic acid dimmer with alignan skeleton, from Rabdosia japonica II Chem. Pharm. Bull. 1988. V. 36. N. 8. P. 32233225.

95. Agata I., Hatano Т., Nishibe S., Okuda T. A tetrameric derivative of caffeic acid from

96. Rabdosia japonica И Phytochemistry. 1989. V. 28. N. 9. P. 2447-2450.

97. Nishizawa M., Tsuda M., Havashi K. Two caffeic acid tetramers having enantiomericphenyldihydronaphthalene moieties from Macrotomia euchroma II Phytochemistry. 1990. V. 29. N. 8. P. 2645-2649.

98. Petersen M., Simmonds M.S.J. Molecules of interest. Rosmarinic acid // Phytochemistry.2003. V. 62. N. 2. P. 121-125.

99. Ellis B.E., Towers G.H.N. Biogenesis of rosmarinic acid in Mentha II Biochem. J. 1970. V.118. N. 2. P. 291-297.

100. Yamamoto H., Inoue K., Yazaki K. Caffeic acid oligomers in Lithospermum erythrorhizoncellsuspension cultures//Phytochemistry. 2000. V. 53. N. 6. P. 651-657.

101. Lu Y., Foo L.Y., Wong H. Sagecoumarin, a novel caffeic acid trimer from Salvia officinalis

102. Phytochemistry. 1999. V. 52. N. 6. P. 1149-1152.

103. Tanaka Т., Nishimura A., Kouno I., Nonaka G.-I., Young T.J. Isolation and characterizationof yunnaneic acids A-D, four novel caffeic acid metabolites from Salvia yunnancnsis И J. Nat. Prod. 1996. V. 59. N. 9. P. 843-849.

104. Lu Y., Foo L.Y. Rosmarinic acid.derivatives from Salvia officinalis И Phytochemistry. 1999.1. V. 51. N. 1. P. 91-94.

105. Al-Sereiti M.R., Abu-Amer K.M., Sen P. Pharmacology of rosemary (Rosmarinus officinalis1.nn.) and its therapeutic potential // Indian J. Experimental Biology. 1999. V. 37. N. 2. P. 124-130.

106. Winterhoff H., Gumbinger H.-G., Sourgens H. On the antigonadotropic activity of Lithospermum and Lycopus species and some of their phenolic constituents // Planta Med. 1988. V. 54. N. 2. P.101-106.

107. Ito H., Miyazaki Т., Ono M., Sakurai H. Antiallergic activities of rabdosiin and its relatedcompounds: chemical and biochemical evaluations // Bioorg. Med. Chem. 1998. V. 6. N. 7. P. 1051-1056.

108. Ahn S. C., Oh W. K., Kim B. Y., Kang D. O., Kim M. S., Heo G. Y., Ahn J. S. Inhibitoryeffects of rosmarinic acid on Lck SH2 domain binding to a synthetic phosphopeptide // Planta Med. 2003. V. 69. N. 7. P. 642-646.

109. Kang M.-A., Yun S.-Y., Won J. Rosmarinic acid inhibits Ca2+-dependent pathways of T-cellantigen receptor-mediated signaling by inhibiting the PLC-y 1 and Itk activity // Blood. 2003. V. 101. N. 9. P. 3534-3542.

110. Youn J., Lee К. H., Won J., Huh S.J., Yun H.S., Cho W.G., Paik D.J. Beneficial effect ofrosmarinic acid on suppression of collagen induced arthritis // J. Rheumatol. 2003. V. 30. N. 6. P. 1203-1207.

111. De-Eknamkul W., Ellis B. Tyrosine aminotransferase: the entrypoint enzyme of the tyrosinederived pathway in rosmarinic acid biosinthesis // Phytochemistry. 1987. V. 26. N. 7. P. 1941-1946.

112. Petersen M. Cytochrome P450-dependent hydroxylation in the biosynthesis of rosmarinicacid in Coleus II Phytochemistry. 1997. V. 45. N. 6. P. 1165-1172.

113. Matsuno M., Nagatsu A., Ogihara Y., Ellis B.E., Mizukami H. CYP98A6 from Lithospermumerythrorhizon encodes 4-coumaroil-4'-hydroxyphenyllactic acid 3-hydrozylase involved in rosmarinic acid biosynthesis // FEBS Lett. 2002. V. 514. N. 2. P. 219-224.

114. Brooks C.J.W., Watson D. G. Phytoalexins //Nat. Prod. Rep. 1985. V. 2. N. 5. P. 427-459.

115. Reynaud J., Guilet D., Terreux R., Lussignol M., Walchshofer N. lsoflavonoids in non-leguminous families: an update // Nat. Prod. Rep. 2005. V. 22. N. 4. P. 504-515.'

116. Mackova Z., Koblovska R., Lapcik O. Molecules of interest. Distribution of isoflavonoids in non-leguminous taxa an update // Phytochemistry. 2006. V. 67. N. 9. P. 849-855.

117. Veitch N. C. Isoflavonoids of the Leguminosae // Nat. Prod. Rep. 2007. V. 24. N. 2. P. 417464.

118. Tanaka H., Oh-Uchi Т., Etoh H., Sako M., Sato M., Fukai Т., Tateishi Y. An arylbenzofuran and four isoflavonoids from the roots of Erythrina poeppigiana II Phytochemistry. 2003. V. 63. N. 5. P. 597-602

119. Wandji J., Awanchiri S.S., Fomum Z.T., Tillequin F., Libot F. Isoflavones and alkaloids from the stem bark and seeds of Erythrina senegalensi I I Phytochemistry. 1995. V; 39. N. 3. P. 677-681.

120. Nkengfack A.E., Vouffo T.W., Vardamides J.C., Kouam J., Fomum Z.T., Meyer M., Sterner O. Phenolic metabolites from Erythrina species // Phytochemistry. 1997. V. 46. N. 3. P. 573-578.

121. Tanaka H., Tanaka Т., Hosoya A., Kitade Y., Etoh H. An isoflavan from Erylhrinaxbidwillii // Phytochemistry. 1998. V. 47. N. 7. P. 1397-1400.

122. Vetter J. Isoflavones in different parts of common Trifolium species I I J. Agric. Food Chem. 1995. V. 43.N. l.P. 106-108.

123. Wang S., Ghisalberti E.L., Ridsdill-Smith J. Bioactive isoflavonols and other components from Trifolium subterramum II J. Nat. Prod. 1998. V. 61. N. 4. P. 508-510.

124. Palazzinoa G., Rasoanaivo P., Federici E., Nicoletti M., Galeffi C. Prenylated isoflavonoids from Millettia pervilleana II Phytochemistry. 2003. V. 63. N. 4. P. 471-474.

125. Abd El-Latif R. R., Shabana M.H., El-Gandour A.H., Mansour R.M., Sharaf M. A new isoflavone from Astragalus peregrinus // Chem. Nat. Compd. 2003. V. 39. N. 6. P. 536537.

126. Maver M., Queiroz E. F., Wolfender J.-L., Hostettmann K. Flavonoids from the stem of Eriophorum scheuchzeri II J. Nat. Prod. 2005. V. 68. N. 7. P. 1094-1098.

127. Chang C.-H., Lin C.-C., Kadota S., Hattori M., Namba T. Flavonoids and a prenylated xantone from Cudrania cochinchinensis var. gerontogea II Phytochemistry. 1995. V. 40. N. 3. P. 945-947.

128. Lopes N.P., Kato M.J., Yoshida M. Antifungal constituents from roots of Virola surinamensis I I Phytochemistry. 1999. V. 51. N. 1. P. 29-31.

129. Talukdar A.C., Jain N., De S., Krishnamurty H.G. An isoflavone from Myristica malabarica И Phytochemistry. 2000. V. 53. N. 1. P. 155-157.

130. Messanga B.B., Fon Kimbu S., Sondengam B.L., Bodo B. Triflavonoids of- Ochna calodendron II Phytochemistry. 2002. V. 59. N. 4. P. 435-438.

131. Sanduja R., Martin G.E., Weinheimer A J., Alam M., Hossain M.B., Van der Helm D. Secondary metabolites of the coelenterate Echinopora lamellosa II J. Heterocycl. Chem. 1984. V. 21. N.3. P. 845-848.

132. Anhut S., Zinsmeister H.D., Mues R., Barz W., Mackenbrock K., Koster J., Markham K.R. The first identification of isoflavones from a bryophyte // Phytochemistry. V. 23, N. 5. P. 1073-1075.

133. Park H.-H., Hakamatsuka Т., Noguchi H., Sanakawa U., Ebizuka Y. Isoflavone glucosides exist as their 6"-OmaIonyl esters in Pueraria lobata and its cell suspension cultutes // Chem. Pharm. Bull. 1992. V. 40. N. 7. P. 1978-1980.

134. Chkadua N.F., Alanlya M.D., and Kemertelidze Ё.Р. Flavonoids of the rhizomes of Pueraria hirsuta II Chem. Nat. Compd. 1996. V. 32. N. 6. P. 920.

135. Rong H., Stevens J.F., Deinzer M.L., De Cooman L., De Keukeleire D. Identification of isoflavones in the roots of Pueraria lobata II Planta Med. 1998. V. 64. N. 7. P. 620-627.

136. Yuldashev M.P., Batirov E.Kh., Malikov V.M., Yuldasheva N.P. Flavonoids of Psoralea drupaceae and Reseda luteola II Chem. Nat. Compd. 1996. V. 32. N. 6. P. 923-924.

137. Caballero P., Smith С. M. Isoflavones from an insect-resistant variety of soybean and the molecular structure of afromosin // J. Nat. Prod. 1986, V. 49. N. 6. P. 1126-1129.

138. Watanabe K., Kinjo J., Nohara T. Three new isofkavonoid glycosides from Lupinus luteus and L. polyphyllus*arboreus II Chem. Pharm. Bull. 1993. V. 41. N. 2. P. 394-396.

139. Kinoshita Т., Ichinose K., Takahashi С., Ho F.-C., Wu J.-B., Sankawa U. Chemical studies on Sophora tomentosa: the isolation of a new class of isoflavonoids // Chem. Pharm. Bull. 1990. V. 38. N. 10. P. 2756-2759.

140. Тапака Т., Ohyama M., Iinuma M., Shirataki Y., Komatsu M., Burandt C. Isoflavonoids from Sophora secundiflora, S. arizonica and S. gypsophila I I Phytochemistry. 1998. V. 48. N. 7. P. 1187-1193.

141. Yamamoto H., Ichimura M., Тапака Т., Iinuma M., Mizuno M. A trifolirhizin malonate from Sophora JIavescens var. angustifolia and its stability // Phytochemistry. 1991. V. 30. N. 5. P. 1732-1733.

142. Lee H.-J., Lee O.-K., Kwon Y.-H., Choi D.-H., Kang H.-Y., Lee H.-Y., Paik K.-H., Lee H.-J. Isoflavone glycosides from the bark of Amorpha fruticosa II Chem. Nat. Compd. 2006. V. 42. N. 4. P. 415-418.

143. Herath H.M.T.B., Dassanayake R.S., Priyadarshani A.M.A., De Silva S., Wannigama G.P., Jamie J. Isoflavonoids and a pterocarpan from Gliricidia sepium II Phytochemistry. 1998. V. 47. N. 1. P. 117-119.

144. Markham K.R., Mabry T.J., Swift T.W. New isoflavones from the genus Baptisia (Leguminosae) // Phytochemistry. 1968. V. 7. N. 5. P. 803-808.

145. Stevenson P.C., Veitch N.C. Isoflavenes from the roots of Cicer judaicum II Phytochemistry. 1996. V. 43. N. 3. P. 695-700. • ■

146. McMurry T.B.H., Martin E., Donnelly D.M.X., Thompson J. C. 3-Hydroxy-9-methoxy and 3 -methoxy-9-hydroxypterocarpans // Phytochemistry. 1972. V. 11. N. 11. P. 3283-3286.

147. Yahara S., Ogata Т., Saijo R., Konishi R., Yamahara J., Miyahara K., Nohara T. Isoflavan and related compounds from Dalbergia odorifera. I // Chem. Pharm. Bull. 1989. V. 37. N. 4. P. 979-987.

148. Erasto P.; Bojase-Moleta G., Majinda R.R.T. Antimicrobial and antioxidant flavonoids from the root wood of Bolusanthus speciosus И Phytochemistry. 2004. V. 65. N. 7. P. 875-880.

149. Maximo P., Louren?o A. A pterocarpan from Ulex parviflorus II Phytochemistry. 1998. V. 48. N. 2. P. 359-362.

150. Chibber S.S., Sharma R.P. Derrone, a new pyranoisoflavone from Derris robusta seeds // Phytochemistry. 1980. V. 19. N. 8. P. 1857-1858.

151. Coronado C., Zuanazzi J.A.S., Sallaud C., Quirion J.-C., Esnault R., Husson H.-P., Kondorosi A., Ratet P. Alfalfa root flavonoid production is nitrogen regulated // Plant Physiol. 1995. V. 108. N. 2. P. 533-542

152. Keung W.-M., Vallee B.L. Daidzin: A potent, selective inhibitor of human mitochondrial aldehyde dehydrogenase//Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. V. 90. N. 4. P. 1247-1251.

153. Stocker P., Yousfi M., Salmi C., Perrier J., Brunei J.M., Moulin A. Maackiain 3-0-(6'-0-malonyl-6-D-glucopyranoside) from Oudneya africana, a powerful inhibitor of porcine kidney acylase I // Biochimie. 2005. V. 87. N. 6. P. 507-512.

154. Qin M.J., Ji W.L., Wang Z.T., Ye W.C. A new isoflavonoid from Belamcanda chinensis (L.) DC // J. Integrative Plant Biology. 2005. V. 47. N. 11. P. 1404-1408.

155. Lap6ik O., Klejdus В., Davidova M., Kokoska L., Kuban V., Moravcova J. Isoflavonoids in the Rutaceae family: 1. Fortunella obovata, Murraya paniculata and four Citrus species // Phytochem. Anal. 2004. V. 15. N. 5. P. 293-299.

156. Puripattanavong J., Weber S., Brecht V., Frahm A.W. Phytochemical investigation of Aglaia andamanica II Planta Med. 2000. V. 66. N. 8. P. 740-745.

157. Matsuda H., Morikawa Т., Xu F., Ninomiya K., Yoshikawa M. New isoflavones and pterocarpane with hepatoprotective activity from the stems of Erycibe expansa II Planta Med. 2004. V. 70. N. 12. P. 1201-1209.

158. McCormick S., Robson K., Bohm B. Flavonoids of Wyethia angustifolia and W. helenioides II Phytochemistry. 1986. V. 25. N. 7. P. 1723-1726.

159. Al-Khalil S., Al-eisawi D. New isoflavones from Iris nigricans I I J. Nat. Prod. 1994. V. 57. N. 2. P. 201-205.

160. Choudhary M.I., Kharim S., Tashkhodzhaev В., Turgunov K.K., Sultankhodzhaev M.N., Atta-ur-Rahman, Israr M. Crystal and molecular structure of the isoflavones irilin В and betavulgarin // Chem. Nat. Compnd. 2005. V. 41. N. 4. P. 396-399.

161. Atta-ur-Rahman, Nasim S., Baig I., Ara Jahan I., Sener В., Orhan I., Choudhary M.I. Isoflavonoid glycosides from the rhizomes of Iris germanica И Chem. Pharm. Bull. 2002. V. 50. N. 8. P. 1100-1102.

162. Minimi H., Okubo A., Kodama M., Fukuyama Y. Highly oxygenated isoflavones from Iris japonica II Phytochemistry. 1996. V. 41. N. 4. P. 1219-1221.

163. Harborne J.B., Williams C.A. Review. Advances in flavonoid research since 1992 // Phytochemistry. 2000. V. 55. N. 6. P. 481-504.

164. Tahara S., Ibrahim R.K. Prenylated isoflavonoids an update // Phytochemistry. 1995. V. 38. N. 5. P. 1073-1094.

165. Chacha M., Bojase-Moleta G., Majinda R.R.T. Antimicrobial and radical scavenging flavonoids from the stem wood of Erythrina latissima И Phytochemistry. 2005. V. 66. N. 1. P. 99-104.

166. Кривощекова O.E., Степаненко Л.С., Максимов О.Б. Новый изофлавоностильбен из ядровой древесины Maackia amurensis II Хим. природ, соедин. 1986. Т. 1. С. 39-42.

167. Rao J. R., Rao R.S. Dalpaniculin, a C-glycosylisoflavone from Dalbergia paniculata seeds // Phytochemistry. 1984. V. 23. N. 9. P. 2106-2108.

168. Chawla H.M., Chibber S.S., Seshadri T.R. Volubilinin, a new isoflavone-C-glycoside from Dalbergia volubilis flowers // Phytochemistry. 1976. V. 15. N. 1. P. 235-237.

169. Park H.J., Park J.H., Moon J.O., Lee K.T., Jung W.T., Oh S.R., Lee H.K. Isoflavone glycosides from the flowers of Pueraria thunbergiana II Phytochemistry. 1999. V. 51. N.1.P. 147-151.

170. Ma W.G., Fukushi Y., Hostettmann K., Tahara S. Isoflavonoid glycosides from Eriosema tuberosum II Phytochemistry. 1998. V. 49. N. 1. P. 251-254.

171. Nomenclature of organic chemistry // Eds.: Rigaudy J., Klesney S.P., Oxford, NY, Toronto, Sydney, Paris, Frankfurt: Pergamon Press, 1979. P. 53-72.

172. Murphy P.A., Ваша K., Hauck C.C. Solvent extraction selection in the determination of isoflavones in soy foods. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 777. N. 1-2. P. 129-138

173. Rostagno M.A., Palma M., Barroso C.G. Ultrasound-assisted extraction of soy isoflavones //J. Chromatogr. A. 2003. V. 1012.N. 2. P. 119-128.

174. He X.-G., Lin L.-Z., Lian L.-Z. Analysis of flavonoids from red clover by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 1996. V. 755. N. 1. P. 127-132

175. Luczkiewicz M., Giod D., B^czek Т., Bucinnski A. LC-DAD UV and LC-MS for the analysis of isoflavones and flavones from in vitro and in vivo biomass of Genista tinctoria LI I Chromatographia. 2004. V. 60. N. 3-4. P. 179-185

176. Jaspars M. Computer assisted structure elucidation of natural products using two-dimensional NMR spectroscopy //Nat. Prod. Rep. 1999. V. 16. N. 2. P. 241-248.

177. Dhaubhadel S., McGarvey B.D., Williams R., Gijzen M. Isoflavonoid biosynthesis and accumulation in developing soybean seeds // Plant Mol. Biol. 2003. V. 53. N. 6. P. 733743.

178. Colliver S.P., Morris P., Robbins M.P. Differential modification of flavonoid and isoflavonoid biosynthesis with an antisense chalcone synthase construct in transgenic Lotus corniculatus II Plant Mol. Biol. 1997. V. 35. N. 4. P. 509-522.

179. Landini S., Graham M.Y., Graham T.L. Lactofen induces isoflavone accumulation and glyceollin elicitation competency in soybean // Phytochemistry. 2003. V. 62. N. 6. P. 865874.

180. Yu O., Shi J., Hession A.O., Maxwell C.A., McGonigle В., Odell J.T. Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed // Phytochemistry. 2003. V. 63. N. 7. P. 753-763.

181. Schijlen E.G.W.M., de Vos C.H. R., van Tunen A.J., Bovy A.G. Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants // Phytochemistry. 2004. V. 65. N. 19. P. 2631 -2648.

182. Hakamatsuka Т., Hashim M.F., Ebizuka Y., Sankawa U. Р-450-dependent oxidative rearrangement in isoflavone biosynthesis: reconstitution of P-450 and NADPH:P-450 reductase // Tetrahedron. 1991. V. 47. N. 31. P. 5969-5978.

183. Hakamatsuka T, Mori K, Ishida S, Ebizuka Y, Sankawa U. Purification of 2-hydroxyisoflavanone dehydratase from the cell cultures of Pueraria lobata I/ Phytochemistry. 1998. V. 49. N. 2. P. 497-505.

184. Akashi Т., Aoki Т., Ayabe S.-I. Cloning and functional expression of a cytochrome P450 cDNA encoding 2-hydroxyisoflavanone synthase involved in biosynthesis of the isoflavonoid skeleton in Licorice // Plant Physiol. 1999. V. 121. N. 3. P. 821-828.

185. Lopez-Meyer M., Paiva N. L. Immunolocalization of vestitone reductase and isoflavone reductase, two enzymes involved in the biosynthesis of the phytoalexin medicarpin // Physiol. Molec. Plant Pathol. 2002. V. 61. N. 1. P. 15-30.

186. Hinderer W., Flentje U., Barz W. Microsomal isoflavone 2- and 3-hydroxylases from chickpea (Cicer arietinum L.) cell suspensions induced for pterocarpan phytoalexin formation // FEBS Lett. 1987. V. 214. N. 1. P. 101-106.

187. Aronson W.J., Tymchuk C.N., Elashoff R.M., McBride W.H., McLean C., Wang H., Heber D. Decreased growth of human prostate LNCaP tumors in SCID mice fed a low-fat, soy protein diet with isoflavones // Nutrition and Cancer. 1999. V. 35. N. 2. P. 130-136.

188. Sartippour M.R., Rao J.Y., Apple S., Wu D., Henning S., Wang H., Elashoff R., Rubio R., Heber D.^ Brooks M.N. A pilot clinical study of short-term isoflavone supplements in breast cancer patients //Nutrition and Cancer. 2004. V. 49. N. 1. P. 59-65.

189. Hintz К. K., J. Ren. Phytoestrogens isoflavones daidzein and genistein reduce glucose-toxicity-induced cardiac contractile dysfunction in ventricular myocytes // Endocrine Research. 2004. V. 30. N. 2. P. 215-223.

190. Sarkar F.H., Li Y. Soy isoflavones and cancer prevention // Cancer Investigation. 2003. V. 21. N. 5. P. 744-757.

191. Adlercreutz H., Heinonen S.-M., Penalvo-Garcia J. Phytoestrogens, cancer and coronary heart disease // BioFactors. 2004. V. 22. N. 1-4. P. 229-236.

192. Cornwell Т., Cohick W., Raskin I. Dietary phytoestrogens and health // Phytochemistry. 2004. V. 65. N. 8. P. 995-1016.

193. Tominaga Y., Wang A., Wang R.-H., Wang X., Cao L., Deng С.-Х. Genistein inhibits В real mutant tumor growth through activation of DNA damage checkpoints, cell cycle arrest, and mitotic catastrophe // Cell Death Differ. 2007. V. 14. N. 3. P. 472-479.

194. Chen W.-F., Huang M.-H., Tzang C.-H., Yang M., Wong M.-S. Inhibitory actions of genistein in human breast cancer (MCF-7) cells // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1638. N. 2. P. 187-196.

195. Reinwald S., Weaver С. M. Soy Isoflavones and bone health: a double-edged sword? // J. Nat. Prod. 2006. V. 69. N. 3. P. 450-459.

196. Mizunuma H., Kanazawa K., Ogura S., Otsuka S., Nagai H. Anticarcinogenic Effects of isoflavones may be mediated by genistein in mouse mammary tumor virus-induced breast cancer// Oncology. 2002. V. 62. N. 1. P. 78-84.

197. Dalu A., Blaydes B.S., Bryant C.W., Latendresse J.R., Weis C.C., Delclos K.B. Estrogen receptor expression in the prostate of rats treated with dietary genistein // J. Chromatogr B. 2002. V. 777. N. 1-2. P. 249-260.

198. McCue P., Shetty K. Health benefits of soy isoflavonoids and strategies for enhancement: a review//Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2004. V. 44. N. 5. P. 361-367.

199. Kondo К., Suzuki Y., Ikeda Y., Umemura K. Genistein, an isoflavone included in soy, inhibits thrombotic vessel occlusion in the mouse femoral artery and in vitro platelet aggregation // Eur. J. Pharmacol. 2002. V. 455. N. 1. P. 53-57.

200. Aoki Т., Akashi Т., Ayabe S.-i. Flavonoids of Leguminous plants: structure, biological activity, and biosynthesis // J. Plant Res. 2000. V. 113. N. 4. P. 475-488.

201. Wu Q., Preisig C.L., VanEtten H.D. Isolation of the cDNAs encoding (+)6a-hydroxymaackiain 3-O-methyltransferase, the terminal step for the synthesis of the phytoalexin pisatin in Pisum satvium II Plant Mol. Biology. 1997. V. 35. N. 5. P. 551-560.

202. He X.-Z., Reddy J.T., Dixon R. A. Stress responses in alfalfa (Medicago sativa L). XXII. cDNA cloning and characterization of an elicitor-inducible isoflavone l-O-methyltransferase // Plant Mol. Biology. 1998. V. 36. N. 1. P. 43-54.

203. Kim B.G., Kim S.-Y., Song H. S., Lee C., Hur.H.-G., Kim S.I., Ahn J.-H. Cloning and expression of the isoflavone synthase gene (IFS-Tp) from Trifolium pratense I I Mol. Cells. 2003. V. 15. N.3. P. 301-306.

204. Li W., Koike K., Asada Y., Hirotani M., Rui H., Yoshikawa Т., Nikaido T. Flavonoids from Glycyrrhiza pallidiflora hairy root cultures // Phytochemistry. 2002. V. 60. N. 4. P. 351-355.

205. Menhard В., Eisenreich W., Hylands P.J., Bacher A., Zenk M.H. Taxoids from cell cultures of Taxus chinensis II Phytochemistry. 1998. V. 49. N. 1. P. 113-125.

206. Charlton J. L. Antiviral activity of lignans //J. Nat. Prod. 1998. V. 61. N. 11. P. 1447-1451.

207. Raffaelli В., Hoikkala A., Leppala E., Wahala K. Enterolignans // J. Chromatogr. B. 2002. V. 777. N. 1-2. P. 29-43.

208. Jew S.-S., Lim D.-Y., Bae S.-Y., Kim H.-A., Kim J.-H., Lee J., Park H.-G. Enantioselective synthesis of (2fl,3S)-(+)-catechin// Tetrahedron: Asymmetry. 2002.13. N. 7. P. 715-720.

209. Jacques D., Opie C.T., Porter L.J., Haslam E. Plant proanthocyanidins. Part 4.1 Biosynthesis of procyanidins and observations on the metabolism of cyanidin in plants // J. Chem. Soc. Perkin 1.1997. V. 14. P. 1637-1643.

210. Веселова М.В., Федореев С.А., Василевская Н.А., Денисенко В.А., Герасименко А.В. Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного //Хим.-фарм. журн. 2007. Т.41. № 2. С. 29-34.

211. Уткина Н.К., Макарченко А.Е., Щелокова О.В., Вировая М.В. Антиоксидантная активность фенольных метаболитов из морских губок. // Хим. природн. соедин. 2004. №4. С. 305-308.

212. Kelley C.J., Harruff R.C., Carmack М. The polyphenolic acid of Lithospermum ruderale. II. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of lithospermic and rosmarinic acids // J. Org. Chem. 1976. V. 41. N. 3. P. 449-454.

213. Венгеровский А. И., Седых И. M.,. Власова Т. В, Саратиков А.С. Гепатозащитные свойства полифенолов Maackia amurensis Rupr et Maxim, при экспериментальной токсической патологии печени // Растит, ресурсы. 1993. № 3. С. 95-99.

214. Венгеровский А.И., Седых И.М., Саратиков А.С. Влияние полифенолов маакии амурской на антиоксидантную функцию печени // Экспер. и клин, фармакол. 1993. Т. 56. №5. С. 47-49.

215. Власова Т.В., Венгеровский А.И., Саратиков А.С. Полифенолы маакиии -эффективное гепатозащитное и желчегонное средство // Хим.-фарм. журн. 1994. Т. 28. №3. С. 56-59.

216. Саратиков А.С., Венгеровский А.И. Новые гепатопротекторы природного происхождения // Экспер. и клин, фармакол. 1995. Т. 58. № 1. С. 8-11.

217. Федореев С.А., Кулеш Н.И., Глебко Л.И., Покушалова Т.В., Веселова М.В., Саратиков А.С., Венгеровский А.И., Чучалин B.C. Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской // Хим.-фарм. журн. 2004. Т. 38. № 11. С. 80-84.

218. Максимов О.Б., Кривощекова О.Е., Степаненко JI.C. Богуславская JI.B. Изофлавоны и стильбены ядровой древесины Maackia amurensis II Химия природ, соедин., 1985, № 6. С. 775-781.

219. Максимов О.Б., Горовой П.Г., Кольцова Е.А., Уткина Н.К. Природные антиоксиданты. // Вестник ДВО РАН. 1996. № 1. С. 40-50.

220. Fedoreyev S.A., Pokushalova T.V., Veselova M.V., Glebko L.I., Muzarok T.I. Seletskaya L.D., Bulgakov V.P., Zhuravlev Yu.N. Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis II Fitoterapia. 2000. V. 71. N. 4. P. 3 65-272.

221. Федореев С.А., Музарок Т.И., Селецкая Л.Д, Веселова М.В., Кулеш Н.И., Глебко Л.И, Покушалова Т.В., Чучалин B.C., Саратиков А.С., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Гепатопротекторное средство // Патент № 2244553. Б.И. № 2.2005.

222. Максимов О.Б., Кулеш Н.И., Степаненко Л.С. Маакия амурская. Экстрактивные вещества древесины и их биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 1998. Т. 6. С. 447-460.

223. Саратиков А.С., Чучалин B.C., Ратькин А.В., Ратькин Е.В., Федореев С.А., Булгаков

224. B.П. Гепатопротективные свойства полифенольных комплексов из древесины и клеточной культуры маакии амурской // Экспер. и клин, фармакол. 2005. Т. 68. № 2.1. C. 51-54.

225. Bruker (1998). SMART and SAINT-Plus. Versions 5.0. Data Collection and Processing Software for the SMART Sistem. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.

226. Bruker (1998). SHELXTL/PC. Versions 5.10. An Integrated System for Solving, Refining and Displaying Crystal Structures From Diffraction Data. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.

227. Fonseca S.F., Campello J.P., Barata L.E.S., Ruveda Е.А. 13C NMR spectral analysis of lignans from Araucaria angustifolia II Phytochemistry. 1978. V. 17. N. 3. P. 499-502.

228. Porter L.J., Newman R.H., Foo L.Y., Richard H.W., Hemingway W. Polymeric . proanthocyanidins. I3C N.M.R. studies of procyanidins // J.C.S. Perkin I. 1982. P. 12171221.

229. Bilia A.R., Morelli I., Hamburger M., Hostettmann K. Flavans and A-type proanthocyanidins from Prunusprostrata //Phytochemistry. 1996. V. 43. N. 4. P. 887-892.

230. Markham K. R. and Ternai B. 13C NMR of flavonoids-II. Flavonoids other then flavone and flavonol aglycones // Tetrahedron. 1976. V. 32. P. 2607-2612.

231. Senba Y., Nishishita Т., Saito K., Yoshioka H., Yoshioka H. Stopped-flow and spectrophotometric study on radical scavenging by tea catechins and the model compounds // Chem. Pharm. Bull. 1999. V. 47. N. 10. P. 1369-1374.

232. Максимов О.Б., Горовой П.Г., Чумак Г.Н. Содержание антиоксидантов в семенах некоторых видов флоры Приморского края // Раст. рес. 1990. № 4. С. 487-498.

233. Kobayashi М., Ohta Y. Induction of stress metabolite formation in suspension cultures of Vigna angularis II Phytochemistiy.l 983. V. 22. N. 5. P. 1257-1261.

234. Biggs D.R., Lane G.A. Identification of isoflavones calycosin and pseudobaptigenin in Trifolium pratense II Phytochemistry. 1978. V. 17. P. 1683-1684.

235. Kobayashi M., Noguchi H., Sankawa U. Formation of chalcones and isoflavones by callus culture of Glycyrrhiza uralensis with different production patterns // Chem. Pharm. Bull. 1985. V. 33. N. 9. P. 3811-3816.

236. Weidemann С., Tenhaken R., Hohl U., Barz W. Medicarpin and maackiain 3-O-glucoside-6'-<9-maIonate conjugates are constitutive compounds in chickpea (Cicer arietinum L.) cell cultures // Plant Cell Reports. 1991. V. 10. P. 371-374.

237. Yoon J.S., Sung S.H., Park J.H, Kim Y.C. Flavonoids from Spatholobus suberectus II Arch Pharm Res. 2004. V. 27. N. 6. P. 589-592.

238. Markham K.R., Mabry T.J. The identification of twenty-three 5-deoxy and ten 5-hydroxy-flavonoids from Baptisia lecontei (Leguminosae) // Phytochemistry. 1968. Vol. 7. N. 5. P. 791-801.

239. Rao M.K.S.R., Rukmani C.S., Iyer P.R. Synthesis of alpinum isoflavone, derrone and related pyranoisoflavones // Tetrahedron. 1987. V. 43. N. 13. P. 3015-3019.