Химическое моделирование процессов возможных превращений in vivo противовирусного препарата "Триазавирин" тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На провар-рукописи

Av'

МЕДВЕДЕВА Наталья Розыевна

ХИМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ВОЗМОЖНЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ ш vivo ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА «ТРИАЗАВИРИН»

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

11 ДЕК 2014

Екатеринбург - 2014

005556704

005556704

Работа выполнена на кафедре органической химии Химико-технологического института ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России

Б.Н. Ельцина»

доктор химических наук, доцент Уломский Евгений Нарциссовпч

Бутин Александр Валерианович,

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет», профессор кафедры органической химии

Фвсюк Александр Семенович,

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского», заведующий кафедрой органической химии, профессор кафедры органической химии, заведующий лабораторией органического синтеза.

Ведущая организация: ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский

федеральный университет»

Защита состоится «$» января 2015 г. в 15:00 ч на заседании диссертационного совета Д 212.285.08 на базе ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» по адресу: 620002, г. Екатеринбург, ул. Мира 19, ауд. И-420 (зал Ученого совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина», Ы1р:/&5зоуе1.8с1епсе.urfu.ru/news2/

Автореферат разослан 2014 г.

Научный руководитель -Официальные оппоненты:

Ученый секретарь

диссертационного совета, (■_

кандидат химических наук, с.н.с. Жо.-с^-'Л Поспелова Татьяна Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актуальность создания новых противовирусных средств обусловлена совместным действием таких постоянно действующих факторов, как распространение социально значимых, особо опасных инфекций, а также появление патогенных вирусных штаммов, устойчивых к действию существующих лекарственных средств. Совместными усилиями Уральского федерального университета, Института органического синтеза УрО РАН и Института гриппа МЗ РФ создан новый противовирусный препарат «Триазавирин» (натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5Д -с] [ 1,2,4]триазпн-7-она, дищдрат), проявляющий высокую активность, широкий спектр действия и низкую токсичность. «Триазавирин» и его аналоги обладают высокой эффективностью в опытах in vivo и пониженной активностью в экспериментах на клеточных культурах, что позволяет предположить противовирусное действие не самого «Триазавирина», а продуктов его превращений в организме. Одним из способов выявления таких превращений является прогнозирование возможных продуктов модификаций соединений, химический синтез моделей, исследование противовирусного действия и выявление их в биологических объектах.

Цели и задачи исследования:

Определение влияния молекулярных фрагментов 1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов - «Триазавирина» и его структурных аналогов - на противовирусное действие.

- Химическое моделирование возможных процессов превращений «Триазавирина» в организме и прогнозирование продуктов реакций (метаболитов).

- Разработка методов синтеза новых 1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов - возможных активных метаболитов и их структурных аналогов.

- Поиск новых противовирусных соединений в ряду исследуемых 1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов.

Научная новизна работы:

Разработаны методы синтеза новых 2-11-6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов.

- Разработан альтернативный метод синтеза «Триазавирина» и его гомологов, заключающийся в диазотировании иминотиоуразола, последующем азосочетании - циклизации с получением динатриевой соли 2-меркапто-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-она и дальнейшем ее алкилировании галоидными алкилами, приводящем к целевым натриевым солям 2-алкилсульфанил-6-шггро-1,2,4-триазоло[5,1-с] [ 1,2,4]триазин-7-онов.

- Сформулирована концепция возможных превращений «Триазавирина» в организме и предложен план структурных модификаций молекулы препарата, включающий б основных направлений: реакции центров С-2, С-б и С-7 с нуклеофильными фрагментами белков, алкилирование атома N-4, моделирующее процессы гликозилирования, восстановление нитрогруппы и окисление алкилсульфанильной группы.

Автор выражает благодарность академику О.Н. Чупахину, академику О.И. Киселеву и чл.-корр. РАН В.Л. Русинову за постоянное внимание и ценные советы, а также сотрудникам кафедры органической химии УрФУ, ИОС УрОРАН и ФБГУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения РФ, принявшим участие в работе

- В соответствии с планом структурных модификаций «Триазавирина» исследована реакция окисления в качестве модели действия оксидаз и разработаны методы синтеза 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов, содержащих в триазольном цикле суль-фоксидный и сульфонильный фрагменты.

- Исследованы реакции замещения сульфонильного фрагмента в 2-метилсульфонил-б-нитро-1,2,4-триазоло[5,1 -с] [ 1,2,4]триазин-7-оне биогенными S-нуклеофилами: цистеамином, ¿-цистеином, глутатионом.

Разработаны методы N-алкилирования 2-R-6-Hirrpo-1,2,4-триазоло[5,1 -с][1,2,4]триазин-7-онов в качестве моделей процессов N-гликозилирования и для использования в виде защитных групп.

- Разработаны методы замещения нитрогруппы в 2-R-4-R'-6-HHTpo-1,2,4-триазоло[5,1 -с] [1,2,4]триазин-7-онах S- и N-нуклеофилами с образованием 2-R-6-aMHHO- и б-апкилсульфанил-1,2,4-триазоло[5,1 -с] [ 1,2,4]триазин-7-онов.

- Установлено ингибирующее действие «Триазавирина» на протеиндисульфидизо-меразу.

- Впервые выявлено влияние молекулярных фрагментов «Триазавирина» и его структурных аналогов на их противовирусное действие.

Практическая значимость исследования

Установлены молекулярные фрагменты «Триазавирина», необходимые для противовирусной активности препарата, к которым относятся нитрогруппа триазинового фрагмента и алкилсульфанильный фрагмент в триазольном цикле.

Выявлены соединения - структурные аналоги «Триазавирина», проявляющие высокую противовирусную активность, в отношении которых получено 4 патента РФ на изобретение.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и получены 4 патента РФ на изобретение. Результаты работы с опубликованием тезисов доложены на конференциях всероссийского и международного уровней: XI Молодежной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2008); XII Молодежной школе-конференции по органической химии (Иваново, 2009); 16th European Symposium on Organic Chemistry (Prague, Czech Republic, 2009); XIII Молодежной школе-конференции «Актуальные проблемы органической химии» (Новосибирск, 2010); 18th International Conference on Organic Synthesis (Bergen, Norway, 2010); XIV Молодежной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2011); XV Молодежной школе-конференции по органической химии (Уфа, 2012); Всероссийской конференции «Органический синтез: химия и технология» (Екатеринбург, 2012); IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии (Уфа, 2013), 18th European Symposium on Organic Chemistry (Marseille, France, 2013); Уральском научном форуме по органической химии (Екатеринбург, 2014).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и приложения. Работа содержит 107 ссылок на литературные источники, 27 таблиц и 19 рисунков.

основное содержание работы литературный обзор

Литературный обзор посвящен различным аспектам биологического действия азо-ло[5,1-с][1,2,4]триазинов, где рассмотрена активность соединений в отношении различных заболеваний и объекты молекулярно-биологического действия.

обсуждение результатов 1. исследование влияния молекулярных фрагментов на противовирусную активность «триазавирина» и его аналогов

Для выявления структурных фрагментов лекарственного препарата, существенных для его биологического действия, необходимы соединения - аналоги, в которых одна или несколько функциональных групп исходной структуры заменены другими или модифицированы. Исследования активности соединений в исследуемом ряду позволяют определить молекулярные фрагменты, определяющие действие базового соединения.

Молекула «Триазавирина» содержит 7 атомов обода гетероциклической структуры, мостиковый атом Ы(7а) и три функциональные * 2 группы: С(2)-5Ме, С(6)-Ы02 и С(7)=0. В рабо-

те рассмотрены структурные модификации, затрагивающие положения С(2), С(6) и N(4) в молекуле 1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазина.

о

1

IV-

3 ; 4 .. n.

«Триазавирин» (1а)

1.1. синтез и биологическая активность гомологов

триазавирина

Исследование влияния метилсульфанильной группы на противовирусное действие «Триазавирина» в первом аспекте предполагает установление роли метилтиогруппы группы.

Первым этапом исследования стала разработка методов синтеза 2-алкилсульфанил-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов. Метод синтеза, разработанный для «Триазавирина», оказался применим и для ближайших гомологов. Так, взаимодействие (5-амино-1,2,4-триазол-3-ил)диазония (3) с этилнитроацетатом в присутствии карбоната натрия приводит к образованию 2-алкилсульфанил-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-оиов (1ь-г) с выходами 49-69 %.

(2Ь-Г)

(ЗЬ-0

о

о

ОЕ1

N3,00,

N0,

14"

(хь-о

n

N3"

и=ь> е^ с) рг, (1) |-рг, с) Ви, 1) е«:о2сн2

Однако применимость такого способа синтеза ограничивается низшими членами ряда (С2-С4, 1Ь-Г). Для более высоких гомологов выходы продуктов не превышают 10 %, что обусловлено низкой растворимостью соответствующих З-алкилсульфанил-5-амино-1,2,4-триазолов (2) в реакционной среде.

В качестве альтернативного пути синтеза 2-алкилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов (1) был разработан метод с использованием иминотиоуразола (4) в качестве исходного соединения. Синтетическая схема включает три стадии: диазотирова-ние иминотиоуразола, азосочетание и циклизацию с образованием динатриевой соли 2-тио-6-нитро-1,2,4-триазоло [5,1-с][1,2,4]триазин-7-она (6) и последующее ее алкилирова-ние с образованием целевых продуктов (1).

R = b) Et, е) Bu, g) C,Hj5, h) СПН25 Таким образом, на первом этапе исследования разработаны альтернативные методы синтеза гомологов и ближайших структурных аналогов «Триазавирина» - 2-алкилсульфашш-6-ншро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов.

Данные биологической активности некоторых производных «Триазавирина» представлены в таблице 1. Максимальные переносимые концентрации соединений определяли с помощью МТТ-теста в культуре клеток Vero.

Таблица 1. Данные противовирусной активности гомологов «Триазавирина» in vitro

№ R МТД, мкг/мл Противовирсуная активность, С, мкг/мл (ЕСян Ig)

б Na* 1000 250П,0)'

1Ь Et 1000 250(1,0)'

1с Pr 1000 100 (1,0)''°

le Bu 1000 100 (0)"

le <40 0

lb C11H25 <40 0

а - вирус А/Виктория/35/72 A(H3N2) b-вирус A/PR/8/34

Как видно из таблицы 1, низшие алзсилтриазолотриазины как и «Триазавирин» обладают невысокой противовирусной активностью, а при переходе к высшим представителям ряда активность исчезает, что можно объяснить их гидрофобностью, а также резко возрастает цитотоксичность соединений.

Стоит также отметить, что при увеличении длины углеводородной цепи при атоме серы (С2-С4) противовирусное действие гомологов «Триазавирина» в отношении некоторых вирусов возрастает (таблицы 2 и 3) по сравнению с активностью препарата.

Автор выражает благодарность О.И, Киселеву и сотрудникам ФБГУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения РФ за проведение биологических испытаний полученных в работе соединений

Таблица 2. Сравнение противовирусной активности «Триазавирина» (1а) и соеди-

нения (lb) in vitro

№ Доза, Вирус Западного Нила Вирус ТОРС Вируса гриппа Н5Ш

мкг/мл а|8 КИ, % Д1е ки- 6 % Alg КИ, %

1а 100 0 0 0.1 18.8 1.5 90

lb 100 0.5 68.8 0.8 84.4 2.7 99.8

Таблица 3. Противогерпетическая активность соединений (1а,с,е) in vitro

№ Доза, мкг/мл Концентрация ВПГ-1 lg (ТЦД50)/мл

1а 1000 60%

1с 500 0%

le 500 0%

Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что «Триазавирин» малоактивен в отношении вируса простого герпеса (ВПГ-1) при концентрации вируса 3 ^ (ТЦД50)/мл даже в максимально переносимой концентрации (1000 мкг/мл). В то же время, соединения (1с,е) в меньшей концентрации (500 мкг/мл) полностью подавляют цитопатическое действие вируса простого герпеса (ВПГ-1), то есть являются более активными противовирусными соединениями по сравнению с «Триазавирином».

1.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СИНТЕЗА 2-Ы-6-ФТОР-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5Д-

с][1Д,4]ТРИАЗИН-7-ОНОВ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Второй функциональной группой, которая может определять биологические свойства препарата «Триазавирин», является нитрогруппа в шестом положении молекулы. Для определения влияния этой функциональной группы на противовирусную активность нами были получены 6-фтор-1,2,4-триазолотриазины, отличающиеся от «Триазавирина» наличием атома фтора вместо нитрогруппы.

Синтез б-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов (8) был осуществлен с использованием реакции Яппа-Клингеманна - азосочетанием солей 1,2,4-триазолил-З-диазония (4а,щ) с этил 2-фторацетоацетатом, с последующими дезацетилированием и циклизацией. Собственно аякилфторацетаты не вступают в реакции азосочетания из-за пониженной СН-кислотности, поэтому нами был использован метод активации фторсо-держащего синтона ацетильной группой, легко уходящей в условиях азосочетания. Стадия азосочетания протекает с образованием 1,2,4-триазолилгидразонов этилового эфира фторглпоксалевой кислоты (7) в присутствии ацетата натрия. Удобным методом превращения фторсодержащих гидразонов (7) в 6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-оны (8) оказалось кипячение в водно-спиртовом растворе ацетата натрия.

О

R-

NH

NO,,Hl

N'

^EtO (2a, ij) F

/-N11

9 (3a,i,j) ✓F

AcONa

R

NH

OEt AcONa,

N- ту H

T IT

(8a,ij) H

NaOH

R-

R: a) SMe, i) H, j) Me

ГГ^кг

Na'

vN

(7a, ij)

<?«J)

ЕЮН, H.O.t»

Исследования биологического действия соединений (8 и 9) /и vitro проводились на первичной культуре клеток почек собаки (MDCK). Для оценки противовирусной активности препаратов использовали референс-вирус A(H1N1) А/Брисбен/59/07. Данный штамм обладает достаточной гемагглютинирующей (1:128) и инфекционной активностью (6,5 lg ИД 50/20 мкл).

Как показали исследования, «Триазавирин» малоактивен в отношении вируса гриппа A(H1N1) А/Брисбен/59/07, как и 6-фторпроизводные в кислотной форме (8а,i,j). В то же время, натриевая соль 2-метил-6-фтортриазолотриазина (9j) обладает умеренной противовирусной активностью (1.5 lg при рабочей концентрации 50 мкг/мл) при токсичности, соизмеримой с токсичностью «Триазавирина» (1000 мкг/мл).

1.3. ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ in vivo «ТРИАЗАВИРИНА» И ЕГО

АНАЛОГОВ

Сравнительный анализ противовирусных свойств «Триазавирина» и его новых и уже известных аналогов в экспериментах т vivo позволяет оценить роль фармакофорных групп на биологическую активность исследуемых триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов.

Таблица 4. Данные противовирусной активности «Триазавирина» и его аналогов ш

_vivo_

Противовирусное действие (эффективность, %) к х Грипп A/California/07/09

_(H1N1)_

SMe NO,_80_

Н NO;_17_■

Me NO;_47_

SMe F_н/а__

SMe C1_2Z2_

_Тамифлю_55.6_

Полученные данные однозначно показывают, что для достижения наибольшей биологической эффективности в отношении вируса гриппа необходимо одновременное присутствие и нитро-, и метилсульфанильной группы. То есть обе функциональные группы существенно влияют на активность препарата и участвуют в его метаболических превращениях.

Таким образом, впервые были получены аналоги «Триазавирина», содержащие в шестом положении атом фтора, был синтезирован ряд гомологов препарата с различной длиной алкильного фрагмента при атоме серы для определения влияния метилтио- и нит-

Na+

рогрупп на противовирусную активность. На основании исследования взаимосвязи «структура-активность» в «Триазавирине» можно утверждать, что наличие метилтиогруп-пы и нитрогруппы является существенным для активности «Триазавирина» в отношении вируса гриппа.

2. МОДЕЛИРОВАНИЕ ВОЗМОЖНЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ ПРЕПАРАТА «ТРИАЗАВИРИН»

Исходя из молекулярной структуры «Триазавирина» (1а) и изучения химических свойств 6-нитроазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов можно предположить различные варианты их превращений в организме.

■ Н , 1"1

[О] (А)

(В) I > сн,5^(/ '| II С^ч 1Чи-

// 3 " N3 (С)

I 13

(Е)

Так, редокс-превращения включают восстановление нитрогруппы под действием редуктаз (направление А), окисление алкилсульфанильного фрагмента под действием ок-сидаз (направление В) и их дальнейшие превращения. Участие трансфераз при действии биогенных М- и 8-нуклеофилов, как, например, как лизин, аргинин, цистеин способно приводить к замещению алкилтио- или нитрогрупп (направления С, О). Возможно также алкилирование и рибозилирование по атому N-4 (направление Е).

2.1. ОКИСЛЕНИЕ АЛКИЛСУЛЬФАНИЛЬНОЙ ГРУППЫ

«ТРИАЗАВИРИНА» И ЕГО ГОМОЛОГОВ (НАПРАВЛЕНИЕ В).

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОДУКТОВ

Возможность окисления «Триазавирина» и его гомологов (1) обусловлена присутствием в составе молекулы атома 8(2), способного к превращениям типа в-2 —» Э-0 —> 8+2.

Окисление алкилтиогрупп соединений (1) может происходить уже на ранней стадии вирусного инфицирования, так как происходит образование химически активных элементов (О' , N0', Н2О2, ОМОО", НО"), что позволяет предположить участие оксидаз с образованием сульфоксидов (8~°) и сульфонов (8~2). Действительно, оказалось, что такое окисление протекает легко. При обработке соединений (1а-(1) или (10а-(1) эквимолярным количеством 18 % Н;От в трифторуксусной кислоте получены сульфоксиды (11а-(1). Дальнейшее окисление до соответствующих сульфонов (12а-11) с выходами 62-71% осуществлено постепенным прибавлением избытка 2,2 эквивалента 30% Н2О2 к суспензии 2-алкилтио-1,2,4-триазоло[5,1-с]триазинов (1а-(1) в трифторуксусной кислоте при комнатной температуре.

(lOa-d) H

r-MT T

(12a-d)

R = a) CH3, b) С2Н5, с) л-С3Н„ d) /-C3H7

Представленные реакции моделируют возможные превращения «Триазавирина» и его производных под действием активных форм кислорода, включая Н2О2.

Исследованиями установлено умеренное действие сульфоксидов (11) и сульфонов (12) - продуктов окисления «Триазавирина» и его гомологов в отношении вирусов гриппа типа A(H1N1) A/Puerto Rico/8/34 и A(H3N2) A/Victoria /35/72 в пределах 1 lg ТЦЦ. Результаты биологических испытаний продуктов S-окисления представлены в таблице 5.

Таблица 5. Противовирусная активность соединений (И) и (12) in vitro

NO,

н

Концен- Противовирусная активность (кратность сниже-

Да R МТД, трация, ния репродукции, lg)

мкг/мл мкг/мл A(H1N1) A/Puerto Rlco/8/34 A(H3N2)A/Victoria /35/72

11а Me-S(O) >200 100 1,0 1,0

lib Et-S(O) >200 100 0,5 0,5

11с n-Pr-S(O) >200 100 1,0 1,0

lid /-Pr-S(O) >200 100 1,0 1,0

12а Me-S(02) >200 100 0,0 0.0

12Ь Et-S(Oi) >200 too 0,5 0,5

12с «-Pr-S(02) >200 100 0,0 0,0

12d ¡-Pr-S(Oi) >200 100 1,0 1,0

Как видно из данных, приведенных в таблице 5, S-окисление молекулы «Триазави-

рина» не вызывает существенных изменений его противовирусной активности в опытах in vitro. Но такие метаболические модификации могут явиться проявлением частичных ан-тиоксидантных свойств.

22. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ «ТРИАЗАВИРИНА» С ГЕМАГГЛЮТИНИНОМ И НЕЙРАМИНИДАЗОЙ ВИРУСА ГРИППА A/CALIFORNIA/04/2009(H1N1)

Компьютерное моделирование и исследование связывания «Триазавирина» с гемагппотинином методом поверхностного плазменного резонанса было проведено совместно с ФБГУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения РФ, автор выражает благодарность за помощь В.В. Егорову и А.В. Васину.

Для виртуального моделирования взаимодействия «Триазавирина» с гемагглюти-нином и нейраминидазой использовали структуры белков из базы данных PDB (3LZG(Hl) и 3TI6 (N1) соответственно), и структуру «Триазавирина», оптимизированную в программе HyperChem 8.0 (Trial Version). Для проведения докинга использовали серверную версию программы Hex (http://hexserver.loria.fr/) со стандартными параметрами. Моделирование проводили с учётом электростатических взаимодействий, рассматривали 500 наилучших положений лиганда. Для анализа контактов белков с молекулами лиганда использовали программу RasMol.

Моделирование взаимодействие (1а) с нейраминидазой вируса гриппа A/California/04/2009(H1N1) показало, что все сайты связывания с «Триазавирином» находятся на поверхности молекулы белка вдали от аминокислотных остатков, образующих ферментативный центр нейраминидазы, таким образом возможно исключить ингибирова-ние этого белка препаратом как один вариантов его метаболизма.

По результатам проведенного виртуального моделирования в молекуле гемагглю-тинина было обнаружено 5 потенциальных сайтов взаимодействия с «Триазавирином». Первичная последовательность гемагглютинина вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1), в которой отмечены аминокислотные остатки, потенциально участвующие в координации TZV, представлена на рисунке 1.

•Influenza A virus A/Cal±forn±a/04/2009 (HW1) (веп Bank ас. no. АСР41105)

1 mkailwllytfatanadtlcigyhannstdtvdtvleknvtvthsvnlledkhngklCk 61 LRgVM I#^^^lIIAGglLGNF'gillgASSasyiVTT§SSIUVGrcyPGDFJDlge:i^

21 QLSSVSSFMF£IFPJ<TSSM'Jffi£DSJ^^JrAACPHAGAKS||BfewLVKKGNSYPKLSK

81 syindkgkev1vlwgihhpstsadqqslyqnadtyvfvgssryskkfkpe1airpkvrdq 41 egrmnyywtlvepgdkitfeatgnlwpryafamern ags^ j 7|дриа>сг/ггсст8р

01 ipintslpfqnihpitxgkcpkyv_kstklrlatglrnipsiqsrglfgaiagfieggwtg

61 mvdgwygyhhqneqgsgyaadlkstqnaideitnkvnsviekmntqftavgkefnhlekr 21 ienlnkkvddgfldiwtynaellvllenertldyhdsnvknlyekvrsqlknnakeigng 81 cfefyhkcdntcmesvkngtydypkyseeaklnreeidgvklestriyqilaiystvass 41 lvlwslgaisfwmcsngslqcrici Рисунок 1. Расположение 5 потенциальных сайтов связывания с TZV в соотнесении с первичной структурой гемагглютинина вируса гриппа A/Califomia/04/2009(H1N1).

Пространственная структура гемагглютинина вируса гриппа A/California/04/2009(H1N1), в которой отмечены аминокислотные остатки, потенциально участвующие в координации «Триазавирина», представлена на рисунке 2. Анализ данной структуры показывает, что наилучшими по энергии взаимодействия и взаимных расположений молекул гемагглютинина и «Триазавирина» оказываются сайты, содержащие остатки цистеина, ли-

Рисунок 2. Результаты докинга (1а) и гемагглютинина HI вируса гриппа.

зина и аргинина. Такое расположение позволяет предположить, что данные фрагменты способны взаимодействовать с «Триазавирином».

Первичное взаимодействие с белками-мишенями для Т2У осуществляется, главным образом, за счет отрицательного заряда основной части молекулы в силу чего при докинге на молекуле гемагглютинина вируса гриппа в качестве сайтов «посадки» идентифицированы короткие последовательности: CK.LR.GV (Цис-Лиз-Лей-Арг-Гли-Вал), ЬйК (Лей-Гли-Лиз), РУКЫШ (Фен-Тир-Лиз-Асн-Лей-Изо-Трп) (рис.1). В пользу первичного кислотно-основного связывания ТХМ и НА свидетельствует обнаруженное методом поверхностного плазмонного резонанса наличие для «Триазавирина» нековалентного и динамического взаимодействия с гемагглютинином, вероятно, ионной природы, так как концентрации были подобраны таким образом, чтобы в белке оставались свободные аминогруппы. На рисунке 3 представлена сенсограмма данного взаимодействия.

Вместе с тем, с точки зрения реализации ингибирующей активности на НА, как лекарственной мишени особый интерес представляет домен, более обогащенный остатками цистеина. Это относится к последовательности

290НПСОТТС№КОА1КТ8ЬРРОМНР1ТЮКСРКУ323. Данный домен содержит остатки ци-стеинов: СХ3СХ22С, разобщенных коротким трипептидом с >)-конца и 22-членным пептидом в области С-конца полипептидной цепи.

2.3. НУКЛЕОФИЛЬНОЕ ЗАМЕЩЕНИЕ В 2-АЛКИЛСУЛЬФОНИЛ-1,2,4-

ТРИАЗОЛО-|5,1-С][1,2,4]ТРИАЗИН-7-ОНАХ (НАПРАВЛЕНИЕ И) И

ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОДУКТОВ

При рассмотрении молекулярной структуры соединения (1) можно предположить его взаимодействие с вирусными белками за счет замещения нитро- или метилсульфа-нильной групп с 1М- и Б-нуклеофильными остатками, таких, как аминокислоты лизин, аргинин, цистеин в составе различных вирусных белков, например в нейраминидазе или ге-магглютинине.

Известно, что алкилсульфонильные фрагменты восприимчивы к реакциям замещения при взаимодействии с нуклеофилами. Что касается поведения нитрогруппы в «Триа-завирине», то хорошо известна склонность МОг-группы, связанной с ароматическим (ге-тероароматическим) циклом к замещению под действием нуклеофилов. Таким образом, в структуре 2-алкилсульфонил-1,2,4-триазоло-[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов (12а-(1) присутствуют две группировки, склонные к нуклеофильному вытеснению. Эта ситуация представляет интерес для исследования сравнительной реакционной способности легко уходящих групп - СНзвОз- в 1,2,4-триазольном и N02- в 1,2,4-триазиновом циклах в соединениях (12а-<1), а также как модель поведения «Триазавирина» в организме. В качестве нук-леофильных реагентов в реакции с 2-метилсульфонил-триазолотриазином были выбраны цистеин, глутатион и цистеамин, которые можно рассматривать с одной стороны как мо~

L5 - 5 TZV

ka:1.36E+05 1/Ms kdl2.86E 011/s KD:2.10E-06 M

; ! 1 ® L5A2 - TZV

-40 0 40 80 120 160 200

Time (s)

Рисунок 3. Сенсограмма взаимодействия гемагглютинина подтипа H3N2 и «Триазавирина» (100 нМ)

дели фрагментов белков, содержащих цистеиновый фрагмент, с другой как биогенные фрагменты, которые могут быть введены в молекулу 1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазина.

Замещение сульфонильного фрагмента в 2-метилсульфонил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазине (12а) под действием цистеина, глутатиона и цистеамина, происходит при кипячении в сухом метаноле в присутствии триэтиламина в течение нескольких дней с образованием веществ (13-15) - продуктов замещения метилсульфонильной группы с выходами 41-46%.

j-

N^N-N(13)

N^N"N №t)'N (Et)3N

(14) (Et)3NH+

GSH 2) HC1 Q

.wTWoMXi

NOj

;НО О Н Ан,"" X" М>

Заместить сульфинильный фрагмент сульфоксидов (11а-<5), в описанных выше условиях не удалось.

Описанное замещение алкилсульфонильной группы в соединении (12а), является аргументами в пользу предположения о возможном участии этого фрагмента в метаболических превращениях «Триазавирина».

2.4. N(4) АЛКИЛИРОВАНИЕ «ТРИАЗАВИРИНА» (НАПРАВЛЕНИЕ Г)

Целесообразность рассмотрения, модификаций молекулы «Триазавирина» по 14-атомам триазолотриазиновой структуры обусловлена двумя основными причинами. Прежде всего, известно, что конденсированные азолоазиноны способны вступать в реакции рибозилирования с образованием природных нуклеозидов с последующим ингибировани-ем синтеза ДНК, чем обусловлена их биологическая активность. Таким образом, исследование модификаций «Триазавирина» по направлению Е представляется важным с точки зрения получения аналогов неприродных нуклеозидов. С другой стороны, Ы-алкилирование «Триазавирина» и его аналогов позволяет реализовать замещение нитро-группы К-нуклеофилами (направление С), невозможное в самих ЫН-гетероциклах из-за образования солей аммония. Таким образом, направление Е представляет интерес и в качестве способа модификации «Триазавирина», и в качестве синтетического приема.

Ранее было установлено, что алкшшрование «Триазавирина» (1а) галоидными ал-килами проходит неселективно и приводит к образованию изомерных продуктов 1ч1-алкилирования.

Введение в положение 4 триазолотриазинового цикла пивалоилоксиметильной группы обусловлено возможностью ее применения в качестве защитной группы, а также ее структурной аналогией с гликозидным фрагментом.

д или В

(10а) н (16)

А: X = СН2С1, Ви4М, ^С03, ПЛЮ1 (35%) В: (Ме)3СО, ХпС1г, (Н^О),, г = 140 °С (82%)

Нами были разработаны два метода получения 4-пивалоилоксиметильного производного «Триазавирина», наиболее эффективный из которых заключается во взаимодействии 2-метилсульфанил-б-нитро-1,2,4-триазоло [5,1 -с] [ 1,2,4]триазин-7-опа (10а) с пивале-вым ангидридом и параформом при 140°С в присутствии хлорида цинка. Данный способ позволяет получить 4-пивалоилоксиметшприазолотриазин (16) с выходом 82 %.

К02ПЕАО, н с ^ X .N0. -ТТС тчг_ .Д. ^N0.

СНОП

(19) Т Й (Юа) (17) Т

* » Ме-СОН РзСС02Н, Н3С СШ

R^R

vV* as? VVn

Взаимодействие триазолотриазина (10a) с винилэталовым эфиром приводит к образованию 4-этоксиэтилтриазолотриазина (17). Реакция проводилась в сухом адетонитри-ле при комнатной температуре, выход продукта составил 85%. Этоксиэтильный фрагмент также известен в качестве защитной группы.

Другим методом введения защитной ашшльной группы является алкилирование спиртами в присутствии сильной кислоты. Так, алкилирование wpem-бутанолом NH-кислоты «Триазавирина» протекает селективно с образованием единственного N(4) -ти/гет-бутилированного изомера (18).

Удобным методом региоселективного алкилирования также является реакция Ми-цунобу. Так, в диоксане в присутствии трифенилфосфина и диэтилазадикарбоксилата была введена бис(4-метоксифенил)метильная группа в N(4) положение триазолотриазина (19) с выходом 74 %.

Для определения приоритетного центра из двух конкурентных направлений реакции нухлеофильного замещения нами были синтезированы производные (22-25). Как и «Триазавирин» и его аналоги, 4-алкил-триазоло1риазшш легко окисляются до соответствующих сульфонов действием избытка перекиси водорода.

Н3С

в

¿. (22-25)

Я' = 20,22) Ме, 21,23) Е1,16,24) СН20С(0)СМе3,18,25) СМе3

(16,18,20,21)

Таким образом, на данном этапе работы нами были разработаны четыре методики алкилирования 6-нитротриазоло[5,1-е][1,2,4]триазина, с помощью которых были синтезированы новые 4-алкилтриазолотриазины. Кроме того, стоит отметить, что бис(4-метоксифенил)метальная, пивалоилоксиметильная и этоксиэтильная группы являются легкоуходящими и могут быть использованы как защитные для блокирования N11 протона в 4 положении для облегчения замещения нитрогруппы и последующего удаления защиты. То есть появляется возможность получить продукты замещения самого «Триазавири-на», а не только его алкилированных аналогов на Э- и И-нулеофилы.

2.5. ЗАМЕЩЕНИЕ НИТРОГРУППЫ В «ТРИАЗАВИРИНЕ»

(НАПРАВЛЕНИЕ С)

2.5.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ^НУКЛЕОФИЛАМИ

Следующим аспектом работы стало исследование пуклео фильного замещения нитрогруппы в 4-алкил-6-шпро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онах. Предыдущими исследованиями показано, что 4-алкил-б-нитро-1,2,4-триазоло[5,1 -с] [ 1,2,4]триазин-7-оны способны к замещению нитрогруппы под действием Ы-нуклеофилов, однако не всегда эта реакция протекает однозначно. В ходе исследований обнаружено, что 2-метилтио-4-Я-б-нитро-1,2,4-триазоло[5,1 -с][1,2,4]триазины, в отличие от триазолотриазина (1а) не способны к образованию солей с основаниями, активно взаимодействуют с М-нуклеофилами - первичными, вторичными аминами и циклоалкилиминами.

При взаимодействии 4-тре/и-бутил-триазоло[5,1-с]триазина (18) с М-нуклеофилами наиболее легко реакция проходит с первичными аминами - этаноламином и н-бутиламином (60-77 %). В то же время реакция со в/иор-бутиламином, диалкиламинами, а также с циклоалкилиминами требует более жестких условий. Образование продуктов замещения нитрогруппы (26а-§) происходит при кипячении реагентов в ДМФА от 2 ч для первичных аминов до 15 часов для вторичных и циклических аминов. Выходы целевых продуктов (26а^) составили 15-77%.

1)МЕ, 1 ОС « N

I ,

(26) Ви

н н

ь)ч^"чд:н3 с) \n~~oh

н

н

Структурное строение соединения (26с!) было также подтверждено методом рентгеноструктурного анализа. Структура молекулы приведена на рисунке 4.

Взаимодействием 4-11-6-нитро-1,2,4-

триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов с некоторыми М-нуклеофилами был получен ряд соединений (28-31). Для проведения данных превращений были использованы те же условия, что и в случае замещения нитро-группы в 4-трет-бутил-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазине: тройной избыток амина в ДМФА при нагревании. Продукты реакции были выделены с помощью колоночной хроматографии.

(17,20,21,27) (28-31)

28а, И = Ме, Я' = ГШВи; 29а, К = Е1, И' = 1ЧНВи;

29Ь, И = Е^ И' - ГШСН2СН2ОН;

29с, И » И' = морфолил,

30а, Я - Вп, Я' = 1ЧНСН,СН2ОН;

31а, И = —Л—, И' = ГтСН,СН,ОН

н3соЕ4

При исследовании взаимодействия 4-пивалоилоксиметил-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазина (16) с первичными аминами (бутиламин, этаноламин) установлено, что одновременно с замещением нитрогруппы проходит удаление пивалоилок-симетильного фрагмента и образование б-алкиламинотриазоло[5,1-с]триазинов (32а,Ь) с выходами 27-39%.

я^гГ* О ЭММ ОС г^р^4

к л ,

(16) О Ви (32а;Ь)

т • н н

' а) Ь)

Таким образом, пивалоилоксиметильный фрагмент оказался в условиях реакции эффективной защитной группой, позволяющей реализовать замещение нитрогруппы амином и получить б-алкиламино-триазолотриазины (32), не содержащие алкильную группу при Ж-атоме.

Рисунок 4. Структура 4-третя-бутил-б-морфолил-1,2,4-триззоло[5,1-е]-1,2,4-триазина (26(1)

В полученном по описанному ранее методу 2-метилтио-4-(4-ацетоксибутил-1)-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7(4Н)-оне (33) также было проведено замещение нитрогруппы на остаток этаноламина и н-бутиламина. Реакция была проведена в ДМФА при 100 °С с тройным избытком амина в течение 3 ч.

Взаимодействие соединения (33) с этаноламином. идет с получением единственного продукта (34а) и с высоким выходом (85%). При замещении бутиламином было выделено два продукта: 6-н-бутиламинозамещенный триазолотриазин (34Ь) с выходом 40% и 4-гидроксибутил-6-бутиламино-триазоло[5,1-с]триазин (35а) с выходом 35%. Таким образом, одновременно с замещением под действием амина частично проходит гидролиз ацетильной защитной группы, что объясняется характером ацетильной группы как защитной группы, снимаемой основаниями.

8 н

о 1УН2(СН2)2ОН, 1)МК

Н,С N.

т т

(33)

100 °С (34а)

О

"з'л / N т^ 100 °С в—I II

Н

1ЧН2Ви, ЭМР

(34Ь,35а) Я = 34Ь) Ас, 35а) Н

Также удалось смоделировать замещение нитрогруппы биогенными Ы-нуклеофилами. В качестве модельного соединения был выбран этиловый эфир ¿-лизина. Вследствие того, что сам лизин плохо растворяется в органических растворителях, а исходные триазолотриазины, напротив, являются гидрофобными соединениями, нами был использован этиловый эфир лизина.

1ЧНз О N11,

^ Т Т -3 1 I

^ ЕЮИ, 60-70 "С, 14,1

Я 3-7 дн., ТЕА

(18,20,21,2733)

I

К (26И,28Ь,29(1,30Ь,34с)

Я : 20,28Ь) Ме; 21,29(1) ЕС 27,30Ь) Вп; 18,26Ь) (СН3)3С; 33,34с)

Взаимодействие алкилированных аналогов «Триазавирина» с этиловым эфиром /.лизина проводили в абсолютном этаноле и умеренном нагревании (60-70 °С) от трех дней до недели. Выход полученных соединений не превышает 20 %.

Продукт взаимодействия с аргинином, который также содержит концевую аминогруппу, получить в описанных выше условиях не удалось.

В таблице 6 приведены данные биологических испытаний для наиболее активных представителей ряда 6-алкиламино-4-11-триазоло[5,1 -с] [ 1,2,4]триазинов.

Таблица 6. Противовирусная активность продуктов взаимодействия алкилирован-ных аналогов «Триазавирина» с N-нулеофилами in vitro.

А/Петербург/16/09 A(H3N2)

А/Викторня/35/72 A(H3N2)

А/Петербург/5/09 A(H1N1)

№ МТД, мкг/мл доза, мкг/мл снижение титра ви-pyca(lg) доза, мкг/мл снижение титра вируса (lg) доза, мкг/мл снижение титра вируса (1g)

26с 200 100 1,0 100 1,0

28а >100 100 1,0

30а >100 100 1,5

31а >100 100 1,0

Полученные данные позволяют продолжить перспективный поиск биологически активных соединений в ряду 6-алкиламино-4-К-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов, так как соединения (26с,28а,30а,31а) проявляют умеренную противовирусную активность.

2.5.2. ВЗАИМОДЕИСТВИЕ С в-НУКЛЕОФИЛАМИ

Моделирование процесса взаимодействия анкетированных аналогов «Триазавирина» с цистеин-содержащими белками нами было осуществлено на примере цистеина - как ключевой аминокислоты и трипептида глутатиона как доступной модели цистеин-содержащих белков. При взаимодействии соединения (10а) с цистеином и глутатионом в температурных условиях, приближенных к температуре человеческого тела - 38°С, а также в атмосфере аргона был получен только продукт нуклеофильного замещения нитро-группы на глутатион после недельной выдержки реакционной массы в описанных условиях.

о

NaHCO,

-W I »

NO,

nh2

—*—

Н (10а)

38 °С, над. атм. Аг

Какого-либо ковалентного взаимодействия «Триазавирина» с цистеином даже после двухнедельного инкубирования обнаружить не удалось даже на ТСХ.

При взаимодействии алкилированных аналогов «Триазавирина» (1618,20,21,27,33,37) с ¿-цистеином при комнатной температуре в абсолютном этаноле в присутствии гидрокарбоната натрия происходит практически мгновенное замещение нит-рогруппы с образованием 2-метилтио-4-К-6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов (261,28с,29е,30с,31 Ь,34с1,38а,39а). Реакции протекают как в присутствии 1 эквивалента гидрокарбоната натрия, так и в его отсутствии, при этом получены продукты в солевой либо кислотной формах соответственно.

NaO

О

О f NHj

S—(' I I N N

NaHC03, EtOH

i

i

R

(16-18,20,21,27,33,37)

R

(26i,28c,29e,30c,31b,34d,38a,39a)

R: 20,28c) Me; 21,29e) Et; 18,26i) (CH3)3C; 16,38a) (CH3)3CC02CH2; 2730c) Bn;

17,31b) ^ ; 3334с1)[^^ОАс; 37,39a) [^O^OAc

При исследовании противовирусной активности было выявлено, что соединение (38а) проявляет высокий уровень противовирусной активности. Так при МТД 177 мкг/ мл и рабочей концентрации 62,5 мкг/ мл происходит снижение титра вируса А/Петербург/16/09 A(H3N2) на 3.5 lg и вируса А/С Петербург/5/09 A(H1N1) на 3 lg. Таким образом, введение цистеинового фрагмента в качестве заместителя в молекулу «Триазави-рина» (соединение 38а) приводит к значительному усилению противовирусной активности in vitro, что, вероятно, делает эти соединения более близкими по метаболическим свойствам к обмену тиол-содержащих метаболитов в клетках, инфицированных вирусами гриппа.

Также гладко идет замещение нзггрогруппы и при взаимодействии соединений (16,20,21,27,33,37) с более приближенным к цистеинсодержащим белкам трипептидом I-глутатионом. В результате образуются 2-мегилтио-4-Я-6-(глутатион-3-ил)-1,2,4-триазоло[5,1 -с] [1,2,4]триазин-7-оны (28d,29f,30d,34e,38b,39b).

Провести реакцию при участии 2-метилтио-4-(р-диметокси-дифенил-метил)-б-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1>2,4]триазина (19) не удалось ни с цистеином, ни с глутатио-ном, вероятно, это можно объяснить стерическими затруднениями вследствие большого объема алкильного заместителя.

Из двух возможных конкурентных направлений реакции триазоло-1,2,4-триазинов (22,23) с цистеином при комнатной температуре также происходит замещение только нитрогруппы с сохранением метилсульфонильного фрагмента и образованием соединений (40,41), о чем свидетельствуют данные 'Н ЯМР и ИК-спектроскопии.

О

О G

R

(16,20,21,27,23,33,37)

R

(28d,29f,30d,34e,38b,39b) R: 20,28d) Me; 21^91) Et; 16,38b) (CHj)3CC02CH2; 27r30d) Bn; 33,34e) L^J^OAc ; 37,39b) j^O^OAc

О

?1

N..

н.с-в—((

3 II У

о

N0,

но^о

Г'КЩ ЭН *НС1>

N311003, ЕЮН

и

О

I

О N N

1ЧН,

ОН

О

I

И (40,41)

(22,23) и = 22,40) Ме, 23,41) Е1 Получение 1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов с цистеиновым фрагментом свидетельствуют о том, что и в физиологических условиях возможен ферментативный катализ синтеза таких соединений.

2.5.3. УДАЛЕНИЕ ЗАЩИТНЫХ ГРУПП

Чтобы расширить круг соединений для биологических испытаний нами были проведены реакции по удалению введенных защитных групп в полученных ранее соединениях. Так, 2-металтио-4-(2-гидроксиэтокси)метил-б-(глутатион-8-ил)-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-он (42) содержит моделирующий фуранозильный фрагмент, подобно противовирусному препарату «Ацикловир» был получен при обработке соединения (39Ь) Ш раствором соляной кислоты.

} ■ ■ О в

О

Нзс

л

Г*-"4

Ш НС1

Нзс

(39Ь)

л

N

*НС1

ОАс

(42)

^О^ОН

Этоксиэтильная группа удалена в Ш растворе соляной кислоты при комнатной температуре в течение 72 часов. В результате было получено соединение (43) с выходом 53 %.

|? ¡ун2

Л0л

ОН

Ш НС1

\ -^Х. 141 п

ш2*па он

(31Ь)

н

Н3с

Рисунок 5. Структура 2-метилтио-6-{2'-амино-2'-карбоксиэти.ттио)-1^,4-триазол[5,1-с]-1,2,4-триазина (43)

(43)

Строение 2-метилтио-6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-1,2,4-триазол [5,1 -с][1,2,4]триазина (43) было подтверждено данными рентгеноструктурного анализа, соединение (43) представляет собой монохлорид моногидрат. Структура молекулы приведена на рисунке 5.

Пивалоилоксиметильная группа широко используется в качестве защитной, удаляемой в основных условиях.

R

NH4OH, MeOH

(44a) NH4+ O G

(38a,b)

R: a) Cys, a) SG

(44b) NH4T

В результате удаления пивалоилоксиметильной группы в соединениях (38а,Ь) были получены незамещенные по положению 4 триазолотриазинового цикла цистеин- и глута-тионпроизводные (44а,Ь). Реакции были проведены в растворе аммиака в метаноле при комнатной температуре в течение нескольких часов.

2.6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРОГРУППЫ КАК ПРИЧИНА ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ «ТРИАЗАВИРИНА» (НАПРАВЛЕНИЕ А).

В отношении превращений по типу «А» при изучении фармакокинетики препарата ранее было зафиксировано наличие 2-метилтио-6-амино-1,2,4-триазоло[5,1-е][1,2,4]триазин-7(4Н)-она, однако противовирусным действием in vitro это соединение не обладает. Первоначально считалось, что это обусловлено обычным действием редуктаз, не относящееся к механизму противовирусного действия. Однако оказалось, что «Триазави-рин» является ингибитором протеиндисульфидизомеразы - фермента, ответственного за образование и изомеризацию дисульфидных связей в процессе созревания гемагглютини-на.

О 20 40 60 80 100 120 С.иМ • «Тркмавирян» —▼— Бацитржция --------- Контроль

Рисунок 6. Ингибирующее действие «Триазавирина» в от-

20

ношении ПДИ

120 с.ш

• Контроль

Оценка влияния «Триазави-рина» на ферментативную активность протеиндисульфидизомеразы (ПДИ) проводилась in vitro с использованием набора «PDI Inhibitor Screening Assay Kit» (Abeam, кат. номер abl 39480). Набор основан на катализируемом ПДИ восстановлении инсулина в присутствии DTT (дитиотреитол), приводящим к образованию инсулиновых агрегатов, которые связываются с флуороген-ным реагентом «PDI Detection Reagent». В качестве ингибитора ПДИ

Эксперимент по воздействию «Триазавирина» на ПДИ был проведен совместно с ФБГУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения РФ, автор выражает благодарность за помощь В.В. Егорову и С.А. Клотченко

в наборе используется бацитрацин (ВАС). Из данных, приведенных на рисунке 6 видно, что в концентрации 125 тМ «Триазавирин» ингибирует активность ИДИ на порядок (снижение флуоресценции с 17 до 1,5 у.е.).

Воздействие препарата на протеиндисульфидизомеразу и гемагглютинин можно представить в виде рисунка 7.

»-о

АЛ/

в в I I в э

АД/

уокнелениу

/^ч

сввс сен

эн эн

АД/

эн эн

Восстановленный НА

Рисунок. 7. Механизм ингибирующего действия «Триазавирина» (Т/У) в отношении ПДИ и ге-магглютинина (НА) -

В результате восстановительного и окислительного циклов ПДИ катализирует изомеризацию (смещение) дисульфидных связей, обеспечивая переход белка в оптимальную для функционирования конформацию. Действие ингибитора, в данном случае «Триазавирина», приводит к нарушению этого цикла в комплексе ПДИ - гемагглютинин. Одновременно с этим может происходить образование дисульфидных связи между остатками цис-теина, которые нарушают структуру белка и приводят как к его инактивации, так и развитию окислительного стресса в клетке, что нарушает жизненный цикл репродукции вируса и может привести к апоптозу (гибели) клеток.

Нарушение изомеризации дисульфидных связей в домене, выделенном на рисунке 8 может иметь наиболее важные последствия в нарушении функциональной активности гемагглютинина и приводить к его инактивации, так как домен С1МТТС является основным докинг-сайтом в молекуле гемагглютинина, поэтому изомеризация З-Б-связей в этом участке имеет принципиальное значение для активности этого белка и инфекционности вируса гриппа.

Рисунок 8. Дисульфидные связи в молекуле НА

Доказательством того, что «Триазавирин» способствует образованию и изомеризации 5-5 связей в молекуле гемагглютинина являются масс-спектрометрические исследо-

вания, приведенные ниже. В качестве модельных пептидов были выбраны фрагменты ге-магглютинина - HA-I, HA-1I и НА- III, имеющие в своей последовательности по два остатка цистеина (табл. 7).

Таблица 7. Последовательность и молекулярная масса модельных пептидов

№ Пептид Последовательность М.м.

1 НА-1 DCNTTCQ 783.25

2 НА-И YGNCNTKCQ 1029.4

3 HA-III LCKLGGIAPLHLGKCN-амид 1634.9

Была проведена серия кинетических экспериментов по окислению как каждого из этих пептидов по отдельности, так и их смесей, в присутствии «Триазавирина» и в его отсутствии. На рисунке 9 представлены масс-спектры пептида НА-1. Ниже на рисунке 10 представлены фрагменты из этих масс-спектров с изотопным распределением для мономерных и димерных форм НА-1.

1

1 - < 6R i

700 800 ООО 10СЮ 1100 1200 1300 1400 1500

Рисунок 9. MALDI- масс-спектры смесей пептида НА-1 в присутствии «Триазавирина» (отмечен красным цветом) и без него (отмечен черным цветом)

Мономерные и димерные формы пептида НА-1 регистрируются в виде набора квазимолекулярных ионов сН*ис Na". Набор пиков слева соответствует различным ионам мономера пептида НА-1, набор пиков справа - димерам пептида НА-1.

\ " ..... 1, ¡Z 11 1»Г

j i к ! 1 м ll L

Рисунок 10. Фрагменты MALDI- масс-спектров смесей пептида НА-1 в присутствии «Триазавирина» (отмечен красным цветом) и без него (отмечен черным цветом), представленных на рис. 7. Наборы пиков соответствуют мономерной (слева) и димерной (справа) формам пептида НА-1

Из представленных на рисунке 9 и 10 данных для смесей с HA-I, во-первых, однозначно следует, что присутствие «Триазавирина» способствует образованию димерных форм пептида. При этом каждая из форм пептида представлена в виде смеси продуктов с разной степенью окисления (рис. 10). Для мономерных форм ионы с m/z = 804 соответствуют пептиду (HA-I + Na'1) с внутримолекулярной S-S связью, а ионы с m/z = 806 соответствуют пептиду (HA-I + Na4) с двумя свободными тиольными группами (-SH). Для димерных форм ионы с m/z = 1565.7 соответствуют дипептиду (2HA-I + Н+) с одной межмолекулярной S-S связью, а ионы с m/z = 1563.7 соответствуют пептиду (2 HA-I + Н+) с двумя межмолекулярными S-S связями. Во-вторых, из сравнения соотношения интенсивностей относящихся к разным степеням окисления тиольных групп, следует, что присутствие «Триазавирина» увеличивает степень окисления для обеих форм пептида. Для мономерной формы - с 16% до 41%, для полностью окисленной формы димера - с 40% до 70% .

Аналогичную картину влияния «Триазавирина» наблюдали для пептида НА-И и НА-Ш. Увеличивалось количество димерных форм и степень окисления как для мономера, так и для димера. Отметим, что для НА-Ш наблюдается существенно меньшее образование полностью окисленных форм по сравнению с пептидами HA-I и HA-II. Важно, что при очевидном влиянии «Триазавирина» на окисление тиольных групп во всех пептидах, продуктов ковалентного связывания с «Триазавирином» масс-спекгрометрически не зарегистрировано.

Окисление смеси пептидов HA-I и HA-III не является аддитивным результатом окисления каждого из пептидов отдельно. В этом случае мы наблюдаем отсутствие как мономерных, так и димерных форм для HA-I (см. рис. 9). Для этого пептида мы наблюдаем его ковалентное связывание с пептидом НА-Ш, т.е. образование исключительно гете-родимеров с одной или двумя дисульфидными связями (ионы с m/z = 2417.6 и с m/z = 2415.6, соответственно). При этом пептид HA-III наряду с образованием гетеродимеров образует моно- и гомодимеры.

Из полученных данных следует, что «Триазавирин» однозначно способствует образованию S-S связей, однако тип продуктов (моно- или димера) определяется свойствами самих пептидов.

Таким образом, действие «Триазавирина», являющегося лигандом и окислителем тиоловых групп в белках, интерферирует с активностью ПДИ и является ингибитором репродукции вирусов, белки которых зависят от каталитической активности ПДИ. Второе важное обстоятельство: нитрогруппы различных природных соединений и лекарственных препаратов становятся более реакционно активны в условиях нитрозильного стресса, то есть генерирования пероксинитрита (ONOO"). Поэтому активность препарата «Триазавирин» может возрастать в условиях, например развития вирусной пневмонии. Этим объясняется высокий протективный эффект «Триазавирина» при инфекциях, вызванных особо опасными вирусами, быстро вызывающими легочные осложнения.

Таким образом, установлен по крайней мере один способ ингибирующего действия «Триазавирина» на активность гемагглюганина, участвующего в ключевых стадиях вирусного инфицирования и развития инфекции.

Масс-спектрометрические сследоваяия по окислению пептидов «Триазавирином» были проведены совместно с ФБГУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения РФ, автор выражает благодарность за помощь в.н.с. ОЛ. Миргородской

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны методы синтеза новых 2-К-б-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов.

2. Разработан альтернативный метод синтеза «Триазавирина» и его гомологов, заключающийся в синтезе и алкилировании динатриевой соли 2-тио-б-нитро-1,2,4-триазоло [5,1 -с] [ 1,2,4]триазин-7-она.

3. Сформулирована концепция возможных превращений «Триазавирина» в организме.

4. В соответствии с предложенной концепцией разработаны методы синтеза сульфоксидов и сульфонов в ряду 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов в качестве модели окисления гомологов «Триазавирина».

5. Исследовано замещение сульфонильного фрагмента в 2-метилсульфонил-6-нитро-1,2,4-триазоло [5,1-е] [1,2,4]триазин-7-оне биогенными S-нуклеофилами.

6. Разработаны методы N-алкилирования 2^-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов для получения аналогов неприродных нуклеозидов.

7. Разработаны методы замещения нитрогруппы в 2-R-4-R'-6-HHTpo-1,2,4-триазоло[5,1-с] [ 1,2,4]триазин-7-онах.

8. Выявлены структурные фрагменты «Триазавирина» существенные для его противовирусной активности.

9. Установлено ингибирующее действие «Триазавирина» на протеин дисульфидизомеразу.

10. Среди синтезированных аналогов «Триазавирина» выявлены новые активные противовирусные соединения.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях; Публикации в научных журналах, определенных ВАК:

1. Медведева Н. Р. Фторсодержащие [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидины и [1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазины / E.H. Уломский, Н.Р. Медведева, A.B. Щепочкин, О.С. Ельцов, B.JI. Русинов, О.Н. Чупахин, Э.Г. Деева, О.И. Киселев // ХГС. 2011. № 9. С. 1411-1417 (0,5 п.лУ0,2 пл.).

2. Медведева Н.Р. Алкилирование 2-метилтио-б-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин(4Н)-7-она и взаимодействие продуктов с N-нуклеофилами / О.Н. Чупахин, В.Л. Русинов, E.H. Уломский, Н. Р. Медведева, И.М. Сапожникова // Бутлеровскяе сообщения. 2012. № 9. С. 43-50 (0,5 п.л./0,2 пл.).

Патенты:

3. Пат. № 2404182 Российская Федерация. Натриевая соль 2-этшггио-6-шпро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат ! О.Н. Чупахин, В.Л. Русинов, E.H. Уломский, В.Н. Чарушин, Н.Р. Медведева, О.И. Киселев, Э.Г. Деева, С.Я. Логинова, C.B. Борисевич, В.П. Бондарев; опубл. 20.01.2010.

4. Пат. № 2402552 Российская Федерация. Натриевая соль 2-н-пропилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат и натриевая соль 2-н-бутилтио-б-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4- триазин-7-она дигидрат / О.Н. Чупахин, В.Л. Русинов, E.H. Уломский, В.Н. Чарупшн, Н.Р. Медведева, О.И. Киселев, Э.Г. Деева, О.Г. Синяшин, В.А. Мамедов; опубл. 27.06.2010.

5. Пат. № 2455304 Российская Федерация. 6-(2'-Амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1^,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4н)-он / В.Л. Русинов, О.Н. Чупахин, В.Н. Чарушин, E.H. Уломский, Н.Р. Медведева, О.И. Киселев, Э.Г. Деева; опубл. 10.07.2012.

6. Пат. № 2493158 Российская Федерация. Натриевая соль 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло [5,1 -с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрат, обладающая противовирусным

действием / О.Н. Чупахин, B.JI. Русинов, E.H. Уломский, Н.Р, Медведева, О.И. Киселев, Э.Г. Деева, О.Г. Сишшшн, В.А. Мамедов; опубл. 20.09.2013.

Другие публикации:

7. Медведева Н.Р. Синтез 2-алкилсульфонил[5,1-с]триазинов и нуклеофильное замещение / Н.Р. Медведева, E.H. Уломский, В.Л. Русинов // XI Молодёжная школа по органической химии: тез. докл. - Екатеринбург, 2008. С. 437-438 (0,3 п.л./0,1 п.л.).

8. Медведева Н.Р. Синтез фторсодержащих 1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидинов и 1,2,4-триазоло[5,1 -с][1,2,4]-триазинов / Н.Р. Медведева, A.B. Щепочкин, E.H. Уломский, B.JI. Русинов // XII Молодёжная школа по органической химии: тез. докл. - Иваново, 2009. С. 315-316 (0,3 п.л./0,1 п.л.).

9. Medvedeva N.R. Fluorocontaining Triazoloazines as a structural analogs of 5-Fluroruracil / E.N. Ulomskiy, O.N. Chupakhin, V.L. Rusinov, N.R. Medvedeva, A.V. Shepochkin, S.L. Deev, T.S. Shestakova // 16th European Symposium on Organic Chemistry: abstract-Prague, Czech Republic, 2009. P. 570 (0,1 пл./0,03 пл.).

10. Медведева Н.Р. Азолилтриазены в синтезе триазолотриазинов / Н.Р. Медведева, E.H. Уломский, В.Л. Русинов, О.Н. Чупахин // XIII Молодёжная школа-конференция «Актуальные проблемы органической химии»: тез. докл. - Новосибирск, 2010. С. 142 (0,1 п.л./0,03 пл.).

И. 5-Aminotetrazoles in the synthesis of 6-R-5,5-diamino-l,2,4-triazines / E.N. Ulomskiy, O.N. Chupakhin, V.L. Rusinov, S.L. Deev, T.S. Shestakova, N.R. Medvedeva // 18th International Conference on Organic Synthesis: abstract - Bergen, Norway, 2010. P. 362 (0,1 п.л./0,03 пл.).

12. Медведева Н.Р. Региоселективность в реакции алкилирования 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазинах / И.М. Сапожникова, Н.Р. Медведева, E.H. Уломский, В.Л. Русинов // XIV Молодежная школа-конференция по органической химии: тез. докл. - Екатеринбург, 2011. С. 472 (0,1 п.л./0,03 п.л.).

13. Медведева Н.Р. Нуклеофильное замещение в 2-метилсульфонил-4-алкил-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазинах / И.М. Сапожникова, Н.Р. Медведева, E.H. Уломский, В.Л. Русинов // XV Молодежная школа-конференция по органической химии: тез. докл. - Уфа, 2012. С. 227 (0,1 п.л./0,03 п.л.).

14. Медведева Н.Р. Окисление 2-алкил1ио-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазинов с последующим нуклеофильным замещением / ИМ. Сапожникова, Н.Р. Медведева, E.H. Уломский, В.Л. Русинов // Всероссийская конференция «Органический синтез: химия и технология»: тез. докл. - Екатеринбург, 2012. С. 98 (0,1 п.л./0,03 пл.).

15. Медведева Н.Р. Исследование окислительно-восстановительных превращений 6-нитроазоло[5,1-с][1,2,4]триазиной-потенциальных противовирусных препаратов /

A.B. Иванова, А.Н. Козицина, Т.Н. Митрофанова, Н.Р. Медведева, E.H. Уломский,

B.Л. Русинов II IX Всероссийская конференция «Химия и медицина» с Молодежной научной школой по органической химии: тез. докл. - Уфа, 2013. С. 181 (0,1 п.л./0,03 пл.),

16. Медведева Н.Р. Окисление «Триазавирина» и его аналогов как возможное превращение под действием оксидаз / Н.Р. Медведева, И.М. Сапожникова, E.H. Уломский, В.Л. Русинов // IX Всероссийская конференция «Химия и медицина» с Молодежной научной школой по органической химии: тез. докл. - Уфа, 2013. С, 276 (0,1 п.л./0,03 пл.).

17. Medvedeva N. Oxidation of 2-alkylthio-l,2,4-triazolo[5,l-e][l,2,4]triazines and study of the reaction products with nucleophiles / N. Medvedeva, I. Sapozhnikova, E. Ulomskiy, V. Rusinov, O. Chupakhin // 18th European Symposium on Organic Chemistry: abstract -Marseille, France, 2013. P. P2-060, 56 (0,1 п.л./0,03 пл.).

18. Медведева Н.Р. Моделирование потенциального взаимодействия «Триазавирина» и его аналогов с цистеинсодержащими белками. I. Замещение нитрогруппы цистеином / И.М. Сапожникова, Н.Р. Медведева, E.H. Уломский, В,Л. Русинов // Уральский

научный форум «Современные проблемы органической химии»: тез. докл. -Екатеринбург, 2014. С. 198 (0,1 п.л./0,03 п.л.). 19. Медведева Н.Р. Моделирование потенциального взаимодействия «Триазавирина» и его аналогов с цистеинсодержащими белками. 2. Замещение нитрогруппы глутатио-ном / Н.Р. Медведева, И.М. Сапожникова, E.H. Уломский, B.JI. Русинов // Уральский научный форум «Современные проблемы органической химии»: тез. докл. -Екатеринбург, 2014. С. 172 (0,1 п.лУО.ОЗ пл.).

Плоская печать

Формат 60 х 84 1/16 Бумага писчая

Тираж 100 Заказ № 232

Ризография НИЧ УрФУ 620002, г. Екатеринбург, ул. Мира, 19