Пути создания биоселективных полимерных систем комбинированного противовирусного действия тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

СЕРБИИ Александр Владимирович

ПУТИ СОЗДАНИЯ БИОСЕЛЕКТИВНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ КОМБИНИРОВАННОГО ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ

02 00 06 — Высокомолекулярные соединенш

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте нефтехимического синтеза имени A.B. Топчиева Российской академии наук и Исследовательском центре биомодуляторов и лекарственных соединений Научно-инновационного фонда Здоровья

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Фролов Вадим Михайлович

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

доктор химических наук, профессор Заиков Геннадий Ефремович

Ведущая организация: Институт высокомолекулярных соединений

Российской академии наук

Защита диссертации состоится «27» января 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.234.01 в Институте нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинский проспект, 29, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева РАН

Автореферат разослан « 27 » декабря 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук ( Сорокина Е. Ю.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рост и интенсификация жизнедеятельности человека в экологической системе планеты порождает встречную эволюцию вирусов, специализированных на эксплуатации биоресурсов человеческого организма [30]. Уже сегодня известно не менее 1500 вирусных генотипов, способных поражать клетки человека, приводя к различным заболеваниям, включая энцефалиты, гепатит, раковые опухоли, СПИД. Природный иммунитет проигрывает вирусам в эволюционном соревновании, а значит, возникает актуальная необходимость искусственного вмешательства, которое, на наш взгляд, неразрывно связано с целенаправленным развитием соответствующих разделов науки о полимерах медицинского назначения.

Анализ известных научных данных показывает, что молекулярный фундамент вирусных частиц, их паразитической интеграции в клетки и естественных иммунных реакций составляют биополимерные формы ВМС. В то же время традиционные подходы к созданию противовирусных препаратов основаны на химии низкомолекулярных соединений (НМС). Это несоответствие закономерно становится объективным препятствием полноценному развитию данной области медицинской практики.

Физико-химическая основа недостаточной эффективности НМС -ограниченность потенциала молекулярного воздействия «малых» молекул на вирусные ВМС узкими рамками соразмерно «малых» - точечных (локально-специфичных) воздействий. При этом вирусы, как мобильные генетические паразиты, способны к быстрым мутационным изменениям химических структур, подпадающих под точечную блокаду, и легко выходят из-под контроля таких препаратов. Поэтому применение НМС-лекарств приводит к искусственной селекции вирусных мутантов, невосприимчивых к традиционным лекарственным средствам [21,27,30,40]. На практике цена вопроса только по линии ВИЧ/СПИД за четверть века его истории достигает сотни миллионов человеческих жизней.

Все более очевидной становится актуальность и востребованность разработки нового поколения высокоэффективных противовирусных препаратов с целенаправленным использованием преимуществ полимерного состояния вещества [27, 30]. Именно на уровне ВМС, адекватном биополимерной природе вирусов и вирус-специфических процессов, открывается перспектива радикального решения важнейшей проблемы -расширения диапазона противовирусной защиты: 1) в ряду огромного разнообразия вирусных патогенов - возможность блокады не одного вида вирусов, а, по крайней мере, нескольких наиболее опасных разновидностей; 2) в системе координат жизненного цикла конкретного вируса - возможность блокады не одной молекулярной мишени а, нескольких - ключевых в цепи инфекционно-молекулярных событий. Речь идет о необходимости развития принципов и методов полимер-

ных систем комбинированного противовирусного действия, которые и являются объектом исследования настоящей работы

Не менее актуальным требованием к полимерам медицинского назначения является их токсическая безопасность, макромолекулярные методы оптимизации которой также вошли в систему исследовательских приоритетов диссертационной работы. Успешность результатов оценивалась количественным критерием - индексом селективности (18):

18 = ТС/ЕС (1)

где: ЕС - концентрация вещества, обеспечивающая целевой противовирусный эффект, ТС - концентрация проявления токсичности. В итоге планировалось создание не просто активных, но и биоселективных полимерных систем с 18 > 30, - перспективных для продвижения в клиническую практику.

Цель и задачи работы.

Целью диссертационной работы является развитие молекулярно-функциональной стратегии, форм и методов синтеза нового поколения искусственных полимерных систем, обладающих расширенным диапазоном комбинированного воздействия на вирус-специфические мишени при минимальном уровне токсичности.

В задачи исследования входило:

1. Изучение макромолекулярной организации вирусов человека (в первую очередь - ВИЧ) на уровне природных ВМС в целях разработки рабочих структурно-функциональных моделей для создания искусственных ВМС-систем адекватной противовирусной защиты.

2. Синтез и селекция полимерных матриц, обладающих собственным потенциалом противовирусной защиты и оптимизация их параметров;

3. Проектирование и синтез биоселективных полимерных систем комбинированного противовирусного действия, сочетающих активность полимерных матриц с вирус-ингибирующими функциями НМС-фармако-форов (РР) различной химической природы, строения и специфичности.

4. 8А11*-анализ альтернативных схем интра- и интер-полимерной кооперации химических носителей вирус-ингибирующих функций, разработка критериев оптимизации целевых свойств и создание опытных образцов, перспективных для продвижения в клиническую практику.

Научная новизна

В отличие от традиционных сфер применения полимеров в качестве депо- или транспортных форм доставки известных лекарственных соединений, либо для реализации частных аспектов противовирусной активности (например, полимер-адъювантной вакцинации), в данной работе обоснованы и впервые экспериментально продемонстрированы возможности создания принципиально нового поколения искусственных полимерных систем, обладающих комплексом комбинированного биологического действия,

- соотношение «структура - активность», как объект научного анализа

биоселективно направленного на подавление патогенных макромолекуляр-ных процессов вирусного инфицирования клеток

Впервые предложена макромолекулярная стратегия, и разработаны конкретные формы и методы целенаправленного синтеза многофункциональных ВМС-систем, в которых преимущества полиэлектролитного состояния вещества (как активного фактора стимулящии иммунитета) соединены с биоселективной активностью специализированных химических структур „ - фармакофоров (РР), обретающих мощный потенциал адресного вирус-

блокирующего действия в условиях полимерной кооперации.

В качестве основы для создания таких систем теоретически обосновано применение полиэлектролитов анионного типа и выполнены исследования по двум направлениям- 1) целенаправленный синтез и структурно-функциональная оптимизация полимерных аналогов янтарной кислоты, 2) синтез и целевая селекция карбокси- и сульфокислотных модификаций природных полисахаридов. Впервые исследован ряд особенностей участия малеинового ангидрида в реакциях радикальной полимеризации, передачи цепи, диен-диенофильного присоединения, обрыва цепи на аддукты Дильса-Альдера, а также частные аспекты регулирования структуры и ММ полианионных продуктов Разработаны эффективные и нетоксичные ВМС, способные к индукции интерферона, активации антителообразования и клеточных факторов иммунитета, в сочетании с функциями подавления адсорбции вирусов на поверхности клеток. Определены структурные и молекулярномассовые параметры для отбора «базовых» полианионных матриц (АБ) - оптимальных платформ макромолекулярного синтеза более сложных целевых систем комбинированного типа.

В отличие от доминирующих молекулярных подходов к созданию противовирусных ингибиторов внутриклеточного действия, для которых неизбежен эффект «терапевтического запаздывания» (попытка остановить инфекцию внутри уже инфицированной клетки), избрана молекулярная стратегия «опережающего действия». В качестве ключевого приоритета выбраны РР мембранотропного типа (би-, три- и поли-циклические каркасные углеводороды, их моноциклические и ациклические аналоги, холестерин). Разработаны и реализованы такие формы и методы химической кооперации А8 + РР АБ.РР, которые не только сохраняют ценные противови-« русные функции компонент, но и синергически их усиливают, позволяя

блокировать инфекционный процесс уже на самых ранних этапах проникновения вирусов в клетки - на клеточной мембране ' Параллельно с мембранотропными ВМС синтезированы аналогичные

ВМС-конъюгаты с базовым препаратом терапии СПИДа - азидотимидином (AZT) - классическим агентом немембранотропного внутриклеточного действия и экспериментально подтверждены преимущества ВМС мембранотропного типа для предотвращения формирования резистентных вирусных мутантов, подавления известных AZT-нeвocпpиимчивыx штаммов ВИЧ-1 и изоля-тов вируса гриппа, устойчивых к ремантадину (мембранотропному НМС).

Впервые осуществлено конструирование и синтез опытных образцов полимер-асооциированных имитаторов естественных ВИЧ-специфичных рецепторов клеток человека. В отличие от природных рецепторов, новые ВМС-продукты растворимы в водной фазе, не фиксированы на клеточной мембране, и поэтому более мобильны в конкурентном связывании вирусов, предотвращая их проникновение в клетки.

Изучены закономерности «структура - противовирусная активность -биоселективность» всех впервые созданных в ходе работы ВМС-систем.

В результате создано новое поколение биоселективных полимерных систем с уникально широким комплексом химически регулируемых противовирусных функций- 1) иммуномодуляции, 2) ингибирования вирусной адсорбции, 3) мембрано-протекторной блокады вирусной фузии и 4) рецептор-имитационного вмешательства в жизненный цикл вирусов.

Авторские приоритеты на научные разработки и новые синтетические продукты химии ВМС (более 250 оригинальных соединений) закреплены в патентах и пионерских публикациях (см. список публикаций).

Практическая значимость

Получены новые фундаментальные знания о возможностях и закономерностях формирования биологически активных функций средствами химии ВМС, имеющие важное значение для практического конструирования противовирусных агентов комбинированного действия с акцентированной блокадой самых ранних этапов инфекционного цикла.

Полученные знания реализованы в конкретных полимерных структурах с регулируемым комплексом противовирусного действия, достоверно подтвержденного в экспериментах на широком спектре вирусных инфекций: гриппа (ВГР), парагриппа (ВПГ), герпеса (ВГП), иммуно-дефици-та человека (ВИЧ-1, ВИЧ-2), бешенства (ВБ), везикулярного стоматита (ВВСТ), восточного энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ), крымской геморрагической лихорадки (ВКГЛ), клещевого энцефалита (ВКЭ) и др., включая возбудителей особо опасных заболеваний, неподдающихся лечению известными клиническими препаратами. В частности, разработаны ингибиторы ВИЧ - инфекционного возбудителя СПИД. Высокая эффективность новых анти-ВИЧ агентов (до 100% защиты т vitro) против различных изолятов вируса, выделенных из крови ВИЧ-инфицированных пациентов, лабораторных штаммов и AZT-резистентных мутантов, подтверждена в ведущих вирусологических центрах России [НИИ вирусологии; ГНЦ ВБ «Вектор»], Европы [Rega Institute] и США [NIH]

Ключевое практическое значение имеет тот экспериментально подтвержденный факт, что комбинированный характер противовирусной активности созданных ВМС-субстанций, на несколько порядков снижает вероятность формирования лекарственно резистентных вирусных мутантов по сравнению с известными НМС-препаратами [21,27,30,40,52]. Решающую роль для практического продвижения выполненных разработок

в медицинскую практику играет и фактор токсической безопасности ВМС, реализованный наравне с противовирусными функциями на основе объективной оценки результата по критерию биоселективности - 18, формула (1). В итоге получена новая генерация противовирусных соединений с весьма высокими показателями 18 от 50 до 10 ООО и более.

В настоящее время порядка 30 разработанных субстанций отобраны в качестве активной основы для создания эффективных средств лечебно-профилактической защиты от СПИДа на базе НИИ вирусологии РАМН (Москва) и ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово) при поддержке МНТЦ (Москва) и Национальных Институтов Здоровья США Ряд опытных образцов лекарственных форм успешно прошел предварительные этапы доклинических испытаний и запланирован к клинической апробации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Макромолекулярное конструирование ВМС, обладающих комплексом свойств комбинированной противовирусной защиты при минимальной токсичности (на уровне биоселективности 18 > 30).

2. Исследование противовирусного потенциала природных полисахаридов и синтетических полимерных аналогов янтарной кислоты в зависимости от их структуры и макромолекулярных параметров

3. Исследование особенностей частных механизмов радикальной сополимеризации МА (включая процессы, осложненные реакцией Дильса-Альдера) в целях регулирования ММ продуктов.

4. Исследование последовательных и конкурирующих реакций алкоголиза, аминолиза и гидролиза полиангидридов в целях управляемой модификации РР-реагентами различной структуры и термолабильности.

5. Разработка рациональных схем синтеза и синтез бифункциональных макромолекулярных систем А8.РР на основе анионных ВМС и РР потенциально противовирусного действия в ряду:

- трициклических каркасных производных адамантана;

- синтетических аналогов бициклических каркасных терпеноидов;

- полициклических каркасных соединений более сложного строения;

- полициклических некаркасных структур на основе холестерина;

- моноциклических некаркасных углеводородов;

- ациклических липофильных углеводородов;

- производных азидотимидина.

6 Макромолекулярное конструирование и синтез полимерных имитаторов естественных клеточных рецепторов ВИЧ, в целях защиты клеток человека от инфицирования вирусными штаммами различной рецепторной специфичности.

7. Создание и исследование мультифункциональных противовирусных систем на основе интра- и интерполимерных комбинаций вышеперечисленных типов ВМС.

Апробация работы.

Материалы исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на всесоюзных, российских и международных конференциях (конгрессах и симпозиумах), в частности. "Синтетические полимеры мед. назначения" (Киев, 1989; Звенигород, 1991), "Перспективы развития химии и практического применения каркасных соединений" (Волгоград, 1992); Каргинских конференциях по полимерам (Москва, 1997, 2004), Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1996, 1997, 1998, 2000); по СПИДу, раку и родственным проблемам (Санкт-Петербург, 1992, 1993, 1995, 1997, 1999, 2000, 2002); «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 1999); «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 2000; Высокие Татры, Словакия, 2002, 2003; Хургада, Египет 2004); «Новые технологии в медицине и биологии в третьем тысячелетии» (Феодосия, Украина, 2002, Судак, Украина 2004); по полимерам для передовых технологий (Пиза, Италия, 1995; Лейпциг, Германия 1997); по фарм. технологии (Париж, Франция, 1998); по СПИДу (Женева, Швейцария, 1999); по экспериментальным исследованиям СПИДа (Тампере, Финляндия, 1999); по ВИЧ-инфекции (Тулон, Франция, 1999); Международного общества микробиологов (Иерусалим, Израиль, 1996; Сидней, Австралия 1999); Европейского общества микробиологов (Любляна, Словения, 2003); Международного общества противовирусных исследований (Венеция, Италия, 1993, Иерусалим, Израиль, 1999; Балтимор, США, 2000, Прага, Чехословакия, 2002; Саванна, США, 2003; Тусон, США 2004); Микробициды 2004 (Лондон, Великобритания) и др. (более 80 сообщений).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 333 стр машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения и списка цитируемой литературы (546 наименований), иллюстрирована 52 рисунками, содержит 37 таблиц. В главе 1 представлен обзор современных данных о фундаментальной роли природных ВМС во взаимоотношениях вирусов, клеток и иммунитета с акцентом на конкретные механизмы ВИЧ-инфекции, а также о задействованных ресурсах химии НМС и ВМС для создания искусственных противовирусных средств. Дан анализ проблемы, обоснованы цели и задачи исследования. В главе 2 теоретически обоснована стратегия целевого макромолекулярного синтеза. В главе 3 рассмотрен синтез, БАЛ-анализ и селекция «базовых» полианионных матриц. В главе 4 описаны формы, методы и продукты синтеза фармакофор-модифицированных полианионных систем Глава 5 посвящена исследованию закономерностей и направлений оптимизации «структура - активность - биоселективность» би-потен-циальных полимерных продуктов АЯ.РГ В главе 6 освещены вопросы создания и исследования мультикомбинированных интра- и интерполимерных систем противовирусной защиты и опытных лекарственных форм.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

11.1. Молекулярно-функционалъная стратегия создания противовирусных систем на полимерной основе

II. 1.1. Стратегические приоритеты и молекулярные инструменты

Анализ молекулярно-химических факторов центральных проблем традиционной терапии вирусных заболеваний (узкий диапазон, низкая эффективность, ненадежность защиты; формирование резистентных вирусов; эффект «терапевтического запаздывания»; множественные побочные эффекты) [] 1, 13, 21, 27, 30, 36, 46, 49, 52] позволяет сформулировать систему стратегических приоритетов, представленных в таблице 1

Таблица 1 Стратегические приоритеты и молекулярные инструменты

Стратегические приоритеты

Молекулярные инструменты

1 Адекватность молекулярного уровня средств терапевтической защиты уровню структурной организации и сирессии вирусов (уровень био - ВМС)

2. Совместимость с водной фазой

биологических сред.

3 Реализация специфических полимерно-кооперативных противовирусных функций

- активация противовирусного иммунитета,

- прямое электростатическое действие

4 Комбинированное противовирусное действие -на нескольких уровнях молекулярных механизмов защитною действия в целях' расширения диапазона противовирусной защиты, повышения ее эффективности и предотвращения формирования резистентных вирусов

5 Мембранотропная ориентация действия Прогнозируемые результаты

- перенос акцента из области внутриклеточной терапии уже инфицированных клеток в область упреждающей защиты клеток от проникновения вирусов через клеточные мембраны,

- возможность подавления сборки - созревания ви-рионов на выходе из уже инфицированных клеток

- перспектива противовирусных агентов «двойной степени надежности» - блокирующих и начальные, и завершающие этапы инфекционного иикла

6. Конкурентная дезориентация взаимодействий вирусов с клеточными рецепторами

7. Оптимизация биоселективности по соотношению (противовирусная активность) (токсичность)

1 Смещение базового приоритета в сферу химии ВМС

2 ВМС гидрофильного типа

3 ВМС (п 2) на основе полиэлектролитов, предпочтительно полианионов

4 Рациональная модификация ВМС (п 3) НМС-фармакофорами с дополнительными противовирусными функцииями

5 В ряду ВМС (п 4) приоритет фармакофо-рам

а) тропным к липидно-му матриксу мембран;

б) «Кай»-тропным производным холестерина,

в) лигандам рецепторов, локализованных на вирусных и клеточных мембранах

6. Реконструкция ВМС (п 3-5) в имитаторы природных рецепторов

7. Оптимизация всех вышеприведенных ВМС

II. 1.2. Анализ природных ВМС, лежащих в основе молекулярной организации вирусов и их проникновения в клетки, и прогноз химических структур для создания искусственных ВМС систем противовирусной зашиты.

11.1.2-1. Медиаторы косвенного воздействия на вирусы.

Наиболее универсальными медиаторами повышения естественной сопротивляемости клеток к вирусному инфицированию являются специализированные иммуномодулирующие природные полимеры - белки интерфероны, клеточный синтез которых активируется в ответ на обнаружение молекулярных признаков угрозы интервенции чужеродного вирусного генома. Поэтому на пути создания искусственных индукторов интерферона логично следовать принципу имитации типовых внешних признаков РНК и ДНК молекул: 1) линейная полимерная структура, 2) чередование в полимерном остове кислотных носителей отрицательного заряда и гетероциклов фуранового ряда:

' ' (2)

11.1.2-2. Молекулярные мишени для прямого терапевтического вмешательства. С молекулярно-химической точки зрения внеклеточные вирусные частицы (вирионы, рис. 1) представляют собой самоорганизую-

Капсид

(белковый комплекс)

ГЕНОМ

(РНК или ДНК)'

Рис. 1.

Схема молекулярной организации вирионов А-

без оболочки Б-

с оболочкой -«оболочечных»

Оболочка (бислойная липидная мембрана)

. Внешние сенсорь

(гликопротеины)

щиеся интербиополимерные комплексы сложного строения, где геном вирусов (РНК или ДНК) обычно упакован в белковый капсид. Внешняя поверхность «оболочечных» вирусов покрыта липидной оболочкой, заимствованной из мембранных структур родительской клетки. При всем разнообразии молекулярная организация поверхности всех вирионов подчинена доминирующей функциональной задаче - инфицирования новых клеток. Важными этапами инфекционного проникновения в клетку являются: 1) первичное молекулярное «сканирование» - обратимое связывание с поверхностями разнообразных клеток; 2) вторичная специфическая фиксация (адсорбция) на рецепторах тех клеток, которые наиболее подходят (являются «пермиссивными») для инфицирования данным конкретным вирусом; 3) активация процесса проникновения вируса через клеточную мембрану. Соответственно, в качестве мишеней терапевтической защиты клеток от вирусного инфицирования нами рассмотрены [46, 52, 53]:

1) Молекулярные структуры поверхности вирионов, ответственные за неспецифическое связывание с клеточными мембранами;

2) Вирусные лиганды специфической адсорбции на рецепторах клеток и соответствующие эпитопы клеточных рецепторов;

3) Вирусные и клеточные структуры, активирующие постадсорбционное проникновение вируса через клеточную мембрану.

1) По первой группе молекулярных объектов следует учитывать, что внешняя поверхность клеток животных и человека несет избыточный отрицательный заряд, а вирусы, как цитотропные агрессоры, на внешней поверхности (в отличие от генома, упакованного внутри капсида) обычно имеют избыток положительного заряда Поэтому, выделяя в ряду ВМС полиэлектролиты, как активные иммуностимуляторы [Кабанов В.В., Петров Р.В. и др ], [1, 2, 6, 8, 22, 24, 29, 30], мы сфокусировали внимание на полианионах (табл. 1). Именно отрицательно заряженные ВМС, на наш взгляд [11], наиболее перспективны с точки зрения реализации комбинированного противовирусного действия - как носители дополнительного потенциала электростатической нейтрализации «цитотропности» вирусов. В частности, от вышеуказанных полианионов формулы (2), правомерно ожидать комбинации трех механизмов противовирусной активности: а) полиэлектролитной иммуномодуляции, б) индукции биосинтеза интерферона (с позиций клетки они имитируют чужеродный геном) и в) электростатической нейтрализации собственно вирусных частиц (с позиций вируса полианионы имитируют отрицательный заряд клетки).

2-3) По второй и третьей группам молекулярных объектов задача существенно усложняется, поскольку требует перехода от «типовых молекулярных проектов» к индивидуальным - учитывающим специфику взаимодействий субмолекулярных структур на селективном уровне «лиганд - рецептор» для конкретных пар' вирус (определенный генотип) -клетка (из числа пермиссивных к данному вирусу) [46,49, 52, 53, 56].

Тем не менее, по всем трем группам общей особенностью является локализация их функциональной активности в районе клеточной мембраны, а в случае «оболочечных» вирусов, оболочка последних также представляет собой мембрану. Это привело нас к заключению [11, 13, 18, 28, 36, 52], что вслед за выбором полимерных анионов формулы (2), второй логичный шаг молекулярного конструирования ингибиторов проникновения вирусов в клетку - обеспечение мембранотропности.

Потенциальная роль мембранотропных соединений в сфере противовирусной терапии впервые четко обозначилась на частном примере клинических препаратов адамантанового (Ас!) и норборнанового (N5) ряда, формулы (3) и (4). Однако анализ соотношения «активность -структура» (вАЯ-анализ) показывает [18, 30], что «мембранотропность в низкомолекулярном исполнении» сопряжена с двумя существенными недостатками: 1) типичная для НМС узко ограниченная эффективность и 2) множественность побочных эффектов (токсичность)

I - производные адамантана (3) (трицикло{3,3,1,13 7]декана)

1а - амантадин, мидантан (-Х- = -), 16 ремантадин (-Х- = -СН(СН3)-) 1с - адапромин (-Х- = -СН(СН2СН3)-),

II - производное норборнана (4) (бицикло[2,2,1]гептана) - дейтифорин где в лекарственных формах

/Т4Ап = низкомолекулярные анионогены (кислоты)

Известно, что противовирусная активность этой группы соединений определяется в основном взаимодействием с гидрофобным кластером аминокислот -Р25ЬУУАА81Ю34- трансмембранного белка М2 вируса гриппа А. Но мутационные отклонения в указанном аминокислотном мотиве М2, или замена М2 на иные модификации трансмембранных белков в вирусах гриппа В и большинства других вирусов, обуславливают утрату восприимчивости к данным препаратам в терапевтически допустимых дозах. А дозы соединений I и II ограничены множественными побочными эффектами, о чем свидетельствуют многочисленные публикации, официальная статистика ВОЗ, а также наши собственные исследования [18, 30, 34]. Тем не менее, и именно благодаря этому данная группа наиболее широко изученных соединений с достоверно подтвержденным потенциалом мембранотропной активности, но типичными для НМС недостатками, наиболее интересна в качестве «стартового» модельного объекта для экспериментальных исследований преимуществ химии ВМС, прогнозируемых в рамках разрабатываемой нами стратегии. Предполагалось, что химическое связывание с анионными полимерами позволит наложить «макромолекулярный запрет» на бесконтрольную диффузию мембранотропных РР, ограничивая их токсичность. Одновременно за счет кооперации активности производных Ас1 или 1ЧЬ и полимерных анионов ожидался рост общего противовирусного потенциала.

11.1.2-3. Макромолекулярные аспекты создания анти-ВИЧ агентов.

В ряду частных вирусологических объектов, наиболее актуальных для безотлагательного изучения и активного терапевтического вмешательства, выбраны вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ) - инфекционные возбудители неизлечимого заболевания СПИД. Совместно с экспертами вирусологического профиля ГНЦ ВБ «Вектор», осуществлен цикл теоретических исследований по анализу структурно-функциональной организации природных ВМС - посредников ВИЧ-инфицирования клеток человека на начальных стадиях инфекционного цикла. Результаты анализа, выводы и прогнозы, нашедшие экспериментальное подтверждение в диссертационной работе, рассмотрены нами в обзорах [46, 52, 53].

Обобщающая интерпретация молекулярных механизмов адсорбции ВИЧ 1 типа с активацией слияния вирусной и клеточной мембран представлена на рис. 2 и позволяет выделить две группы природных ВМС

Н+Ап Х!ЧН2

Ап" Г*Ш2

ВИЧ-1 распознает клетки-мишени окончаниями сенсорных шипов -гликопротеиновыми молекулами црИО, £р120 связан доменами Ы-конца белка gp41, который заякорен в мембране вируса. Белки ассоциированы в интерполимерные комплексы ^р120-йр41)3.

Рецептор СГ)4, играющий первостепенную роль в организации иммунитета, -первая мишень связывания gpl20-CD4. Но инфицирование не активируется без подключения а-хе-мокиновых рецепторов ССЯ5 (для R5 штаммов ВИЧ-1) или ССИ4 (для 1*4 штаммов ВИЧ-1). Комплекс (СБ4-gpl20-CCR5/4) разрушает связи §р120-§р41, и активирует ^р41)3 Его липофи-льное «жало» (РР) проникает в мембрану клетки. Спирали Н1 и Н2 скручиваются. Итог - слияние вирусной и клеточной мембран, проникновение ВИЧ в клетку [46. 53].

Рис. 2. Биополимерные медиаторы адсорбции и фузии ВИЧ-1

объектов - участников начальною этапа проникновения вируса в клетки' 1) гликопротеины внешней оболочки вируса - gpl20 и gp41; 2) белки-рецепторы клеток - CD4 и CCR5 или CCR4 Соответственно, первоочередными мишенями «упреждающей» анти-ВИЧ-1 терапии должны быть вирусные полимерные структуры gp120 и gp41, тогда как клеточные рецепторы, особенно CD4 и CCR4, крайне важные для нормальной физиологии клеток, требуют более осторожных подходов [16 5~] Поэтому в отношении последних нами выбрана тактика не блокады, а конкурентной имитации субмолекулярных ВИЧ-связывающих функций [49. 55. 56], раздел II 3 3

А. На этапе вирусной адсорбции

Актом предварительного ¡ащитного действия полимерных анионов может быть электростатическое экранирование положительно заряженного сайта (Arg35...Lys 6...Arg59) домена D1 клеточного рецептора CD4, ответственного за первичный контакт с gpl20 (домены СЗ, С4) Но наиболее благоприятной мишенью для электростатической атаки полимерными анионами является субмолекулярный эпицентр положительного заряда макромолекул gpl20 в районе V3 петли (Arg311Lys3l2..Arg315..Arg318...Arg322...Lys129, ВИЧ-1, штамм ВШ). В естественных условиях доступ к V3 инициирует конформационная перестройка gpl20 в результате первичного контакта с CD4. Однако правомерно ожидать, что полимерные анионы с достаточно высоким электрическим потенциалом будут способны самостоятельно инициировать необходимую перестройку и нейтрализовать заряд V3, предотвращая ее взаимодействие с клеточными рецепторами CCR5/4, внеклеточная часть которых также имеет необычайно высокую плотность отрицательного заряда [46, 53]

В дополнение к анализу предпосылок акцентированного воздействия полимерных анионов нами, в кооперации со специалистами Института Молекулярной биологии ГНЦ ВЬ «Вектор» (г. Кольцово, И.В Тимофеев, H Г. Перминова, Бакунина А ) проведено компьютерное моделирование докинга Ad и Nb к gpl20 с учетом имеющихся баз данных о первичной и пространственной структуре вирусного белка. Компьютерное моделирование позволило выявить в структуре gpl20 семейство сайтов энергетически выгодного (рис. 3) связывания Ad и Nb. Но энергетический выигрыш моноассоциатов не превышает 4-6 ккал/моль. Это согласуется с тем фактом, что в наших экспериментах все низкомолекулярные формы мембрано-тропных PF оказались неэффективными в отношении ВИЧ-1 [30, 35, 36] Однако, согласно расчетам, вирусный белок gpl20 имеет не один, а серию сайтов потенциального связывания Ad и Nb, что подразумевает возможность образования мультимерных ассоциатов с энергетически значимым суммарным эффектом Для реализации такой возможности необходимо было создать специальные условия 1) транспортная доставка в водной фазе гидрофобных PF (Ad или Nb) и 2) повышение их локальной концентрации в районе белковых макромолекул gp!20

О)

го

о

Ас!

О -П ...П .О. €3. О аа _

О)

го

N5

Рис. 3. Молекулярные структуры и результаты (¿ЗЛЯ оценки энергий (ккал/молъ) докинга N13 и Ас! к биопотиериой макромолекуле §р120

Оба аспекта имеют решение на уровне ВМС - путем кооперации РЕ с полимерной анионной матрицей, где гидрофильная часть (Ап*) обеспечит растворимость в водной фазе. А поскольку Ап" через систему интраполиме-рных связей пространственно кооперированы с РР, то, испытывая электростатическое притяжение к УЗ петле вирусного белка, они неизбежно будут увлекать за собой и РР, повышая локальную концентра-цию РР вблизи §р120. Возможность же докинга РР не только в области УЗ петли, но и за ее пределами - по поверхности макромолекулы gpl20 регулируется протяженностью и адаптационной гибкостью полимерной цепи. Для этих же целей в проектируемой структуре ВМС нами предусмотрены (раздел 11.3.1) «спейсерные» мостики (-8р-). В итоге создаются теоретические предпосылки для нейтрализации gpl20 с образованием интерполимерного комплекса (5).

Б. На этапе фузии

Обнажается комплекс трансмембранных белков (§р41)3, (рис. 2) и формируются еще более благоприятные условия для терапевтической блокады с участием полимерных анионов Ап" в сочетании именно с мембранотропными РР. Во-первых, повышенной гидрофобностью отличается домен (РР)3 = (-SR+AGMTSGAAGLFGLFLAGICVA-N^Ь)^' - мем-бранотропное «жало», нацеленное на проникновение в липидный матрикс мембраны клетки. (РР)з - благоприятный объект для гидрофобной блокады РР. В ближайшем соседстве с (РР)-, располагается спираль Н1.

Анализ ее структуры 5465С1У000ШЬЬК+А1ЕА00Н+ЬЬ0ЬТЛ^С1К+0-ЬОАЯ+579 обнаруживает сочетание как гидрофобных, 1ак и положительно заряженных сайтов - оптимальное для многоточечной блокады с участием анионных ВМС и гидрофобных РР. Блокада Н1, препятствуя ее ассоциации со спиралью Н2, означает остановку инициируемого этой ассоциацией процесса «стягивания» вирусной и клеточной мембран - т.е. предотвращение фузии.

Таким образом, создание противовирусных агентов с рационально комбинируемым бинарным потенциалом анионных ВМС (АБ) и мембра-нотропных РР подразумевает высокую вероятность достижения успеха в терапии не только гриппа, но и ВИЧ-инфекции - с эстафетной реализацией защитного действия, как на этапе адсорбции, так и фузии.

Кроме вышеупомянутых мембранотропных структур А(1ЛЧЬ ряда особого внимания заслуживают модификации, тропные не просто к липидному матриксу мембран, а к жидкокристаллическим «КаЛ»-зонам мембран - обогащенным молекулами холестерина Согласно данным последних лет именно «ЯаЛ»-зоны образуют па клеточной мембране специфические платформы оптимальной агрегации клеточных рецепторов СЭ4, ССЯ5 (ССЯ4), играя важную роль в проникновении ВИЧ в клетку. С учетом этого нами инициировано [54] соответствующее направление научного поиска по приданию создаваемым терапевтическим агентам также «ЯаЙ-тропности» - в целях их упреждающего концентрирования в зонах «повышенного риска инфекционного вторжения» ВИЧ.

В дополнение к «мембранотропной» и «КаЛ»-акцентированной стратегии нами предложено [46. 49] и реализовано [55, 56] новое макромолекулярное направление проектирования и синтеза полимер-ассоциированных имитаторов ВИЧ-специфичных клеточных рецепторов ССЯ5 и ССЯ4, раздел И-З.

11.2. Анионные полимерные носители противовирусных функций

11.2.1. Критерии отбора.

Целенаправленная селекция полимерных носителей противовирусных функций («базовых» полимерных матриц) осуществлялась в рамках стратегии, изложенной в разделе 11.1, включая следующие критерии: 1) растворимость в водных средах, 2) наличие анионогенных групп, 3) желательность чередования анионных фрагментов с фурановыми циклами, 4) экспериментально подтвержденная иммуностимулирующая или прямая противовирусная активность, 5) нетоксичность, 6) пригодность для использования в качестве сборочной платформы для синтеза комбинированных макромолекулярных систем более сложного строения.

Преимуществом синтетических полимеров является возможность

ции, что обеспечивает стабильность структуры и свойств в биологических средах. Однако, ввиду критерия 5), этот же фактор (в случае перспективы внутриинъекционных лекарственных форм) накладывает особые требования к ограничению верхних значений ММ < 30-50 103 - с учетом порога проницаемости почек человека по выведению макромолекулярных веществ из организма. В отношении природных ВМС, расщепляемых ферментами, данное ограничение менее критично

В связи с требованием нетоксичности, в ряду анионогенных групп в качестве отправной точки выбраны мягкие анионогены карбоксикислот-ного типа. Поликарбоксилаты вполне пригодны для приведения в соответствие с критериями 1), 2), 5) и 6), причем последнему критерию - пригодности для химической модификации - удовлетворяют не только карбоксильные, но в еще большей степени - их более реакционно активные ангидридные предшественники. Доступными полимерными продуктами такого рода являются сополимеры малеинового ангидрида (МА). При этом, возможности радикальной сополимеризации МА с электронодонорными сомономерами (ЭМ) позволяют получать продукты регулярно-чередующегося строения, благоприятные для выполнения критерия 3).

Н.2.2. Синтетические полимерные аналоги янтарной кислоты

а)Сополимеризация МА с электронодонорными сомономерами (ЭМ)

БМ +

о

1Г

о

ОМ

си

яг

-эм

7~Л

20С сог

о' - "О'

МА МАБМ МКБМ

где Ъ = ОН или О У (см. ниже, формула (10) стр. 18), а -БМ,- =

X п -енг-с З-СН,-

ОМ, ОМ2а (я,■=сно) ОМ3°(Х-о я. = Н) Г>М4 ° ОМ5а

(6а)

ОМ2Ь (1*. = сн(Ой)2) РМ3а (Х-Б, я. - Н)

м

ОМ7а(Я| = н) ЙМ6 ОМ7Ь(я.-гн,)

соон

БМ.

БМ0

I I

ОМ,„

Н,0

ноос соон

-сн2—^ У—сн2-~ о

ОМ5Ь

б)Реакция Дильса-Алъдера МА с полифурфуриловым спиртом (РРА)

-сн2.

Н/ --сн2

РРА

МА

МАРРА

тс сог МКРРА

Методами радикальной чередующейся сополимеризации МА (6а), а также полимераналогичного присоединения МА к РРА (66), осуществлен целенаправленный синтез серии полимерных ангидридов МАОМ и МАРКА различной структуры. Их последующий гидролиз приводит к поликарбо-новым кислотам МКБМ или МКРРА, где остатки МА трансформируются в форму 2,3-дизамещенной янтарной кислоты. Соответственно, конечные продукты могут рассматриваться, как синтетические полимерные аналоги янтарной кислоты. С учетом критерия 3) особое внимание уделено структурам фуранового ряда (ОМь ОМ2, ОМ3, ОМ4, ОМ5).

Ввиду критерия 5), раздел 11.2.1., важное значение имел контроль ММ продуктов синтеза. В большинстве случаев сополимеризация МА, протекает с высокими скоростями, приводя к достаточно высокомолекулярным продуктам, что требует тщательной проработки методов ограничения ММ < 3050 1 03 Решение этой задачи достигалось оптимизацией условий синтеза (концентрации реагентов, температура, растворитель) и применением агентов передачи цепи (рис. 4) При необходимости конечные ВМС продукты фракционировали с использованием ультрафильтрационных технологий, моделирующих порог проницаемости почек.

М„ 10'3 Ы, ДЛ/Г

04

Рост цепи

й 1 ПНР

- в К1-МП

4 ГЛ 1

\ / Передача цепи

"о.

\ □ • \Ч

Рис. 4.

Регулирование ММ МАОМ5'с

использованием тетрагидрофурана (ТГФ) в качестве агента передачи цепи

Концентрация [ТГФ]0 моль/л

Противоположная задача встала при сополимеризации МА с фураном (Ф), приводящей к сополимеру МАБМ3 с крайне низкими значениями ММ < 3103, которые не обеспечивали степени полимеризации, достаточной для проявления желаемых свойств биологической активности. Проведенное нами [2,6] детальное исследование показало (рис.5), что 1) рост цепи протекает через гомополимеризацию эквимолярного комплекса с переносом заряда [Ф->МА] (КПЗ) с умеренными скоростями; 2) на начальном этапе процесса в обрыве цепи преобладает мономолекулярный механизм с достаточно высокими расчетными значениями среднекинетической ММ > 20 103 Однако, 3) в системе конкурентно быстро образуется побочной аддукт реакции Дильса-Альдера (АДА), который, как выяснилось, является активным агентом обрыва цепи с константой скорости обрыва в десятки раз превосходящей константу мономолекулярного обрыва Этот побочный процесс, заложенный в химической природе мономерной пары Ф + МА, и становится доминирующим фактором ограничения роста цепи - до расчетных значений среднекинетической ММ = 4-8 103, рис 5 Более того, 4) на фоне невысоких скоростей

Схема основных элементарных реакций

О -

ф и

I

о MA

Ô

КГЦ

о

te

ф

-я

О'

о^ 0s*~ о АДЛ

КГП Ф + MA j-^ni

^л:

К

АДА

Инициатор KIIJ) ~R,+ K4i î —рост цепи

• к Г

_________ обрыв цепи

R/ АДА

MADMj" II

VIA

обрыв цепи передача цепи

Расчетные значения кинетической длины цепи, вычисленные на основе экспериментального исследования кинетических и энергетических параметров

ММк 10'

ММк = f (Т)

8 6 100 Температура, "С

1.

Начальная стадия, когда [АДА] - 0

ММК = (Мф+Ммл^ростЛУионом обр =УИНИЦ)

= 166 к„„ [Иниц][Ф][МА]А„'; [Иниц]'1 = 166 к„т к„' [Ф] [МА] где к„т = Ккгп^ крк0„'

ктХ' = ехр((дН#11-дН#нач)К'1Т''-(д5,,„-д5*„ач)К'') 2.

Стадия равновесного присутствия АДА'

ММ, = (Мф+Ммл^росДУобр яаАДА=Уи1ши) = 166 к,„, [Иниц] ¿„'[Иниц] 1

= 166 кра, к,'

где кр„ = Ккт К-лм 'кикрк„л ', Када = кА/кА2

кра, ки' = ехр((дн#„-дн#ра,ж "ГЧ^"^'^')

III

Значения материальной длины цепи в зависимости от температуры (а), времени реакции (б), соотношения [МА]0 : [Ф]о и природы растворителя (в) М„ Ю3 М„ Ю3 М„ Ю" Офуран

О Бензол А Укс ангидрид А Этилацетат О Ацетон О Метил этил кето! ® Циклогексанон Хлороформ 10 п Ацетонитрил Н ДМСО

05

Молярная доля MA

Рис. 5 (1-Ш). Факторы управления молекулярной массой (ММ) сополимера МАОМ3°, в условиях радикальной сополимеризации с учетом особенностей химической природы Ф+МА и конкурирующей реакции Дильса-Альдера

роста цепи заметный вклад вносит передача цепи через молекулы МА, приводя к значительному снижению среднечисловой длины материальной цепи по сравнению с расчетной кинетической по мере роста молярной доли МА в

реакционной смеси. При этом 5) важную регулирующую роль играют также донорно-акцепторные свойства растворителя и его полярность (рис 5 Ш-в). Всесторонний учет всех выявленных нами факторов, их кинетических и энергетических параметров, позволил оптимизировать синтез и получить продукты с достаточными значениями М„ порядка 10 ООО.

11.2.3. Полианионы на основе природных полисахаридов

Параллельно с синтетическими полианионами изучены также карбокси- и сульфокси- модифицированные производные широко распространенных природных полисахаридов - декстрана (Б8) и хитина (СИ):

Производные декстрана (DS)

OR

or4

DS1" (MM = 14 ООО)

-R2, -R3, -R4= -CH2-COOH (30%,

преимущественно -R2) или -H (70%),

получен карбоксиметилированием

декстрана (Pharmacia) хлоруксусной

кислотой

DSs (MM = 8 ООО)

-R2, -R3, -R4 = -S020H, продукт (Sigma)

(8)

Производные хитина (Ch)' Chcs

ro

—О

-R2

(MM = 17 000) -CO(CH2)2COOH;

r2hn

-R = -OH, -R = -S020H

Chscs (MM = 20 000) -R2 = -C0CH(S02H)CHC00H; -R3 = -OH, -R6 = -S020H, образцы предоставлены дх н А И Гамза-Заде

(9)

П.2.4. Модуляция анионогенной активности полимеров

Как видно из приведенных химических структур (6), (8), (9), анионогенная активность исследуемой группы ВМС задается типом кислотных фупп (-ОБОзОН » -СООН), их соотношением, плотностью вдоль цепи, взаимным расположением и возможностью макромолеку-лярной кооперации. Кроме того, пределы вариации анионной активности были расширены за счет частичной или полной модификации кислотных групп в солевые композиции с противоионами различной природы, либо химическим превращением части кислотных групп в амидные или сложноэфирные производные, -АпЪ =

чЛЛЛЛЛЛ <ЛЛЛ/\Л/> ЛЛЛЛАЛ ^ ^ ^

АпХ АпОН —АпОеУ®

где: -Ап = -СО, -0802; X = ЫН2, ЫН(СН2СООСН3)2, ОЯ; У+ = Н+, П+, К+, Ыа+, ЫН4+, Са++, 8г"+, Ва++, Си++, ЪпГ, №++, Р1++(>Шз)2, РсГ(»Н3)2, Ре+++, ...

Предполагалось, что такая модуляция может иметь существенное значение для предотвращения токсичности (кислотного шока), регулирования растворимости и оптимизации целевых противовирусных функций.

И.2.5. Исследование биофункциональных свойств анионных ВМС.

Задачи данного раздела работы заключались в выявлении закономерностей «Структура - Активность» (SAR-анализ) исследуемых ВМС в целях оценки «собственных» возможностей полианионов и селекции «базовых» полимерных матриц - наиболее перспективных для создания интра- и интер-полимерных систем комбинированного противовирусного действия. Экспериментальное изучение биологической активности ВМС осуществлялось в кооперации с соответствующими специалистами научно-медицинского профиля НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского, НИИ гриппа, РАМН, ЦОЛИУВ, ГНЦ ВБ «Вектор», НИФ Здоровья и др. (акад. РАМН Ф.И. Ершов, проф. H.H. Носик и сотр., проф. И.Ф. Баринс-кий и сотр., проф. Букринская А.Г. и сотр., акад. РАМН Кашкин К.Г. и сотр., д.м.н. Сухин Г.М. и сотр, к.м.н. И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова и сотр. и др.). Эксперименты проводились на клеточных культурах (in vitro) и частично на экспериментальных животных (in vivo).

II.2.5-1. Токсикологическая безопасность (in vitro и in vivo)

1) По типу анионогенных групп «мягкие» карбоксикислотные производные более безопасны, чем полимерные аналоги серной кислоты -сульфокислотные. В ряду солевых модификаций полимерных карбокси-латов установлена следующая зависимость:

_^ повышение токсикологической безопасности _^

Cu++< Ni++< Zn++ < Ва++ < К+ < Н+ < Pt++(NH3)2 < Pd++(NH3)2 < М* (100) (190) (470) (1100) (>1000) (1600) (1700) (2000) (>2000)

где М* = Sr++, Li+, NH4+ (± CONH2), Са++, Na+ (И)

(в скобках, представлены дозы, мг/кг, соответствующих солей MKDMj, вызывающие 50% токсический эффект на мышах при внутрибрюшинном применении)

Наилучшими показателями отличаются натриевые (50%) и кальциевые (25%) соли, но последние при повышении концентрации кальция приводят к интерполимерной агрегации с потерей растворимости в физиологических средах. Отметим также низкую токсичность амидно-аммониевых модификаций, что немаловажно для выбора методов химической инкорпорации фармакофоров (раздел 11.3.1).

2) По структуре мономерного звена.

В ряду чередующихся сополимеров MKDM (6а), по фрагменту -DM-:

-повышение токсикологической безопасности-

DMi (> 200) <<: DM4(< 1400) < DM5b(1600) < DM10(>2000) (12) DM2(<300) DM9(£ 1200) - U1V|5Ö>1ÖU^ DM3 (>2000) '

(в скобках приведены те же показатели, что и в предыдущем примере)

- наблюдается тенденции роста токсичности по мере увеличения жесткости и гидрофобности полимерной цепи.

Умеренно токсичен и синтетический полианион MKPFA (66) (600), а карбоксилированные полисахариды сопоставимы с MKDM3 и MKDM10.

3) По молекулярной массе. Поскольку примененные нами методы регулирования ММ синтетических полианионов были направлены на понижение ММ < 30-50 103, то с учетом риска увеличения проникающей способности через биозащитные барьеры, наиболее актуальной представлялась экспериментальная оценка безопасности чрезмерного снижения степени полимеризации. Как выяснилось, переход от ВМС к олигомерам и НМС может быть небезопасным. Так, в ряду модификаций MKDM30: ВМС продукты (М„ > 10103) наименее токсичны (LD50 >2000 мкг/кг, внутрибрюшинно, мыши), олигомеры (Mn ~ 3103) имеют пониженный уровень переносимых доз (LDS0> 1600 мкг/кг), а НМС аналог - ADA крайне токсичен (LD50 « 50 мкг/кг). Обратный перевод ADA в ВМС-форму полимера MKPFA нейтрализует его токсичность до LD50~600 мкг/кг.

ЫаООС СООН ЫаООС СООН ЫаООС СООН

МК,)М-'° АБАон мкрра

Трехкратное увеличение токсичности (но уже на клеточных культурах) отмечено и на примере МКОМбЬ при переходе от ВМС (Мп = 10-14 103) к олигомерной форме (Мп ~ 3 103). Таким образом, именно полимерные продукты умеренной, но не слишком низкой степени полимеризации (30'Ю3 > ММ > 10'Ю3), токсикологически наиболее оптимальны. В целом, исследуемые полианионы, особенно МКОМ9, МКХ>М4, МКОМ5ь, МКОМз и МКОМю, можно классифицировать, как весьма нетоксичные -на 1-2 порядка менее токсичные, чем типичные противовирусные НМС.

11.2.5-2. Иммуномодулирующая противовирусная активность.

Интерферон индуцирующая активность.

Способность к индукции биосинтеза эндогенного интерферона выявлена в ряду синтетических полимерных аналогов янтарной кислоты МКОМ (6). Зависимость эффекта от структурных параметров представлена ниже (указан титр интерферона, ед./мл, в крови мышей через 6-28 часов после внутрибрюшинного введения МКОМ в дозах до 200 мг/к?).

1) Зависимость от структуры -ОМ-, на примере серии Ъ = ОН /СЖа

остальные ОМ (£10) < ОМ9 (< 40) < ЭМз0 (< 320) < ОМ5Ь (< 640) (13) - подтверждается теоретический прогноз (раздел II. 1.2-1) о потенциальной активности в ряду полимерных соединений с чередованием анионных и фуран содержащих структур: активность МКОМз0 и МКОМ5Ь начинает проявляться уже при Мп ~ 3 103, но более выражено - при М„ > 8-14 103.

2) Зависимость от модуляции кислотных групп, на примере МКОМ3°:

-ONH,

(<10) (< 40) (< 80) (£320)

•О" ni О" Си++ •О" nh4+

-О" Li+

-О" Sr~ < -OTd++(NH3)z

-ОН

-О Са++/ Ва+ О" Zn++

-О" Na

-0'К+ (14)

- эффект последовательно снижается по мере снижения электролитической диссоциации и полностью подавляется амидированием Применение двухвалентных противоионов может приводить к утрате растворимости (модификация более 25%). 50% модификация кислотных групп в соли Na+ или К+ оказывается достаточной для получения максимального эффекта.

Активация гуморального фактора иммунитета.

Тестирование проводили по реакции образования антител (метод к Ерне и Нордина) и реакции иммунного розеткообразования в ответ на

ввод модельного антигена (эритроцитов барана) мышам линии СВА. Выявлена следующая зависимость уровня образования антител

1) от структуры -DM-:

рост активности

DM-io (< 122) ~ DMi (< 121) < DMsb(<250) <DM3°(<360) О5)

2) от природы противоиона в ряду солевых модификаций MKDM3:

Zn++ ~ Sr++ < Ва++ < Са++ < Н+ < К+ ~ Na+ (16) (60) (60) (160) (190) (280) (310) (360)

(в скобках указан уровень гуморального иммунного ответа в % по отношению к контролю на 5-7 день после инъекции антигена и внутрибрюшинного введения полимерных соединений в дозах от 10 до ¡00 иг/кг)

Установлено, что в ряду MKDM имеется возможность > 2-3-кратной стимуляции иммунного ответа, при этом оптимальными являются также «фурановые» формы MKDM5b и MKDM3° в виде полунатриевых солей

Активация клеточного фактора иммунитета.

Кроме модуляции гуморальных факторов иммунитета, в ряду MKDM экспериментально обнаружены и факты активации иммуно-компетентных клеток, включая нейтрофилов (макрофагов) и натуральных киллеров. Так, совместная инкубация макрофагов с MKDM в концентрациях 12-50 мкг/мл приводит к мобилизации их метаболической активности по продуцированию бактерицидных форм кислорода в следующей зависимости от структуры -DM- (процент активации)"

ациклические DM (< 380) < DM3° (<575) < DM5b (< 1785) (17)

Как и в предыдущих случаях, фуран-содержащие модификации MKDM проявляют наиболее выраженную активность вплоть до 18-кратной стимуляции.

Иммуноадъювантный противовирусный эффект (in vivo)

Выявленная интерфероногенная и дополнительная иммуноадъю-вантная активность в ряду MKDM позволила прогнозировать определенный потенциал противовирусной защиты Действительно, наиболее активные модификации MKDM3° и MKDMsb проявили достоверно высокие уровни профилактической и лечебно-профилактической защиты

животных от летальных доз опасных нейровирусных инфекций ВВЭЛ, ВКГЛ, ВКЭ, ВБ, ВВС [1, 2, 8, 11, 22, 24, 29, 30].

Максимальный защитный эффект достигался в режиме сочетанно-го применения: полианион + вакцина. А поскольку вакцины представляют собой инфекционно неактивные формы вирусов, а последние с точки зрения ВМС - биополимерные комплексы, то, создавая бинарные композиции MKDM + Вакцина, мы по существу приходим к прототипам ВМС-систем комбинированного противовирусного действия интерполимерного типа: вирусный антиген + синтетический полимерный иммуноадъювант. Причем, в дополнение к стратегии искусственных полимерных вакцин [Кабанов В.А., Петров Р.В., Хаитов P.M. и др.] в нашем случае роль синтетических полимеров не ограничивается только стимуляцией антителообра-зования, а включает дополнительные ресурсы параллельных факторов иммунной защиты по линии индукции интерферона и фагоцитирующих клеток (см. выше). Более того, целевая селекция анионогенных форм полиэлектролитов, в соответствии с теоретическим прогнозом (раздел II. 1.2-2), открывает возможности не только иммуноопосредованной противовирусной защиты, но и прямой электростатической дезактивации или дезориентации непосредственно вирусных частиц.

II.2.5-3. Прямая противовирусная активность {in vitro)

Оценка прямого электростатического подавления инфекционной активности вирусов, проведена нами в ряду синтетических и природных полианионов имеющих дифференцированный набор анионогенных групп различной силы на экспериментальной модели ВИЧ-1 в клеточной культуре. Оказалось, что слабые анионогены, содержащие взаимно изолированные вдоль цепи карбоксильные группы, например, карбокси-метилированные полисахариды, совершенно неактивны. Синтетические полимерные аналоги янтарной кислоты (MKDM), где анионогенная активность карбоксильных групп существенно усилена их попарно-вицинальным расположением и кооперацией вдоль цепи, проявили умеренную активность. Высокую активность показали лишь наиболее

Рост анионогенной и ВИЧ-ингибирующей активности

Карбоксилированные полисахариды

«

MKDM

«

Сульфатированные полисахариды

о

NHCO

ноос

COONa

I

COOH/Na

COOH/Na

(> 500)

(> 14-100)

(<1-10)

(указаны концентрации, мкг/мл, 50% подавления вирусной репродукции)

сильные полианионы, содержащие сульфокислотные группы, например (8) или СЬС8, СЬ^ (9) [36, 41, 50]. На примере МКОМ5ь и [36] экспериментально установлено, что защитное действие и карбокси- и сульфокислотных полимеров реализуется именно в начальной фазе проникновения вируса в клетку - на этапе адсорбции. Это согласуется с теоретическим прогнозом (разделы 11.1.2-2. -3) и полностью вписывается в рамки мембранотропной стратегии превентивной блокады вирусов > Хотя сульфокислотные модификации оказались более эффектив-

ными, с токсикологической точки зрения они менее предпочтительны, чем «мягкие» анионогены карбоксилотного типа. Встает классическая дилемма выбора: «высокая активность, но повышенная токсичность» или «низкая токсичность, но умеренная активность»9 В этой критической точке мы избрали третий путь, впервые предложив конкретную альтернативную стратегию комбинированной защиты, где умеренная противовирусная активность «мягких», но нетоксичных полианионов на стадии вирусной адсорбции по эстафете будет усилена специфической блокадой последующих этапов внедрения вируса в клеточную мембрану. Именно этой ключевой идее и посвящены нижеследующие исследования структурно-функциональной кооперации полимерных анионов с мембранотропными РР.

Ввиду предложенной стратегии и на основе системного анализа вышеизложенных результатов, в качестве «базовых» полимерных матриц для синтеза более сложных продуктов комбинированной структуры нами выбраны две модификации полимерных синтетических аналогов янтарной кислоты - МКОМз° и МКОМбЬ (или их ангидридные предшественники МАОМз0 и МАОМбЬ) Остальные полимерные анионы, по мере необходимости, изучались в качестве альтернативы и образцов сравнения Полисахаридные аналоги исследованы также в связи с возможностью их биодеструкции и более простой утилизации из организма

П.З. Полимерные системы, усиленные НМС- носителями адресных вирус - специфических функций.

П.3.1. Формы и методы синтеза.

И.3.1-1. Основные подходы к инкорпорации фармакофоров в макро-молекулярные системы базовых полианионов.

В целях настоящей работы под фармакофорами (РР) нами подразумеваются компактные структурные фрагменты биологически активных молекул, заключающие в себе наиболее существенные предпосылки адресно-специализированного воздействия на природные молекулярные объекты, вовлекаемые в инфекционные процессы жизненного цикла вирусов Например, в случае противогриппозных препаратов формулы (3), под фармакофором адресной мембранотропной функции подразумевается адамантановый цикл РР):

ю

При химической инкорпорации компактных структур РР в макро-молекулярные системы полимерного типа существует риск дезактивации биологического потенциала РР из-за стерических затруднений в случае слишком близкой и жесткой привязки РР к полимерному остову. Поэтому в «типовую программу» синтеза нами заложен этап создания для каждого фармакофора серии «спейсерных» мостиков (-вр-) различной длины и конфигурационной подвижности, позволяющих не просто связать между собой РР и полимерную макромолекулу, но и регулировать стерическую доступность и относительную пространственную свободу РР в полимер-кооперированной системе химических связей.

Цикл работ по целенаправленному синтезу полимерных систем бинарного противовирусного потенциала (РР + полианион) включал в себя получение необходимых производных РР (в реакционно активной форме с заготовками спейсерных мостиков):

рр -РР—Яр—т (19)

синтез (и, или отбор необходимых структур из числа доступных реагентов) где -8р— в виде цепочек из числа -СН2-, -СНК-. -О-, -МН-, -СО- и т д -Т - терминальная реакционно активная груша - для образования химической связи с полимерной молекулой;

Далее осуществлялось химическое связывание в полимерную систему А5.РГ = (Полианион)-вр-РР и выполнялись последующие стадии оптимизации «структура - свойства». Синтез целевых продуктов исследован по двум основным направлениям (в шести вариантах А-Р, схема (20)).

П.3.1-1. А. Введение РР на стадии сополимеризации МА в форме инициаторов радикальной полимеризации приводит к присоединению РР к концевой части полимерной цепи до 2-х РР на полимерную цепь.

11.3.1-1. В-С. Введение РР на стадии сополимеризации МА в форме мономеров приводит к чередующимся сополимерам с содержанием РР 1:1 на каждый сомономерный остаток полимерной цепи (100%). Но столь высокое содержание РР, как показали последующие эксперименты, является чрезмерным, поскольку, особенно в случае объемных гидрофобных структур, резко снижает растворимость в водной фазе, экранирует активность анионогенных групп (дезактивируя противовирусный потенциал полианионов) и приводит к неприемлемо высокой токсичности. Ситуация может быть скорректирована методами тройной сополимеризации, возможности которой, были апробированы на системах РР-8р-Т (где Т= >С=С<) + ЭМ3 + МА [7, 9]. Однако это усложняет процесс синтеза и затрудняет оптимизацию противовирусных функций. Более гибкими и регулируемыми оказываются приемы введения РР на этапах полимераналогичной модификации предварительно подготовленных синтетических или природных полимеров.

1. Введение РР на стадии сополимеризации МА

А. В форме инициатора радикальной полимеризации (Т = Я •)

|СО°1 ^ 2) ¿М +0^С>0 Х-

Л/И*

Схема (20)

и ,2 Sp

I Л/Av |г

® Crip

3) HOZ

х-со2/-

В. В форме производных МА (Т = >СН=СН<) DM +

[¿I

DM

zoc \;oz AS.PF-A

о-

1) R

-DM

2) ног

AS.PF-B

ос^ Voz

NH

Л

cg]

С. В форме сомономеров к МА (Т = >СН=СН<)

ф

1) R

di

гос со/.

2) HOZ

2. Введение PF на стадии полимераналогичной модификации

D. В форме аминореагентов (Т = NH2)

i)

AS.PF-C

Г

D.1 D.2

madm

:рм / \ 1 PDM-

О^^ч-Х^О 00

и -J п.т L

2) ног

АлОН AnNH Ап = СО SOj - Н,0 I

Sp

DM

7 Г zoc coz

DM

TT~ соон

NH

д

7 \

ОС. coz

NH

А8.РР-02 Ав.РР-О, (^Г

Е. В форме окси- реагентов (аналогично О, но Т = ОН)

л

Q^J AS.PF-E2

Е.2 он Е.,

-DM

7~Л

7 ОС COZ

-DM

ОС COZ

о

¿P

AS.PF-E,

Р. В форме карбокси- или сулъфокси- реагентов - зеркально О и Е, Т = СООН или 0803Н, а в полимере должны присутствовать N112 (гидролизованный хитин) или ОН (полисахариды)

vtaaaaaaaaaj/vwwvwww'

NHAn ¿P

F.l

AnOH ¿P

F.2

L^pfJ AS.

PF-Fj

C5

OAn ¿P

as.pf-f2

Ф

II.3.1-1. О. Введение РР в форме аминореагентов

Для обеспечения данного направления макромолекулярного синтеза выполнялся подготовительный синтез необходимых амино-производ-ных РР-5р-1ЧН2. В качестве -Бр- предпочтение отдавалось -СН2 , как наиболее подвижным «шарнирам» спейсерного мостика. В схему получения монометилен-аминов обычно включали синтез соответствующих нитрильных предшественников с последующим восстановлением: -CN -СН2-МН2 Удлиненные полиметиленовые цепочки получали, в частности, по трехступенчатой схеме (21) из доступных мономеров химии ВМС -виниловых, аллиловых и родственных соединений-

В случае подготовки реагентов РР-.$р-1ЧН2

пептидной природы в аминокислотную после- —(СЬ^д—N112

довательность вводили лизин [49, 55, 56]. ~"МН

Для иммобилизации РР-8р-№Н2 на базовые полимерные матрицы исследовали возможности аминолиза как ангидридных (направление 0.1), так и кислотных (Б.2) форм полимеров с применением в последнем случае конденсирующих агентов. Использование ангидридных групп удобно тем, что не требует специальной активации, а растворимость МАЭМ в неводных растворах существенна для присоединения гидрофобных РР. Однако применение полимерных ангидридов сопряжено с повышенными требованиями к «чистоте» полиангидридных реагентов и их защиты от гидролиза. Критический анализ описанных приемов синтеза МАБМ привел к необходимости разработки специальной методики изоляции от влаги (в вакууме и атмосфере сухих инертных газов) по всей цепочке операций- подготовки реагентов, растворителей, реакционной смеси, синтеза, выделения, очистки и консервации полимеров. Так, получение «чистого» полиангидрида, на примере МАОМ5а, подтверждено ИК-спектральным методом, но всего лишь 2-х минутная экспозиция образца на воздухе приводит к всплеску полос поглощения адсорбированной влаги (1300-3800 см"1) и признакам начала гидролитической деструкции ангидридных циклов (1695 см"1) Другими словами, ангидридная форма полимера отличается чрезвычайной гигроскопичностью и гидролитической лабильностью. Тем не менее, изоляция от влаги по всем этапам синтеза позволяет контролировать преждевременный гидролиз А комбинирование в различной последовательности реакций аминолиза, гидролиза, дегидратации, а также замещения и отделения низкомолекулярных противоионов (например, ультрафильтрацией), дают возможность регулировать соотношение различных форм связыва-

РР—(СЩ)—СН= СН2 ') нвг/вг20г, 35°с р].МСН ) Вг

ш

Ш+2

(21)

о

ния (амидной, аммониевой, имидной и комплексной)' • ом-

1 V

-о

' DM-

ноос соон

I ^WVH

DM—j-—

- DM-

j

J ^WyV

-DM-

HOOC COO"

NH3* I

PF— Sp

нон .

NHjSpPF

Y+OH * 4

NH-OC COOH Sp-PF

- DM-

.DM-

HOOC

!

MM ->

(1-3) 102

СОО" У+

•J' -^ww

NH-OC COO" I

Sp—PF

NH3 I

PF—Sp

-DM-

T

NH-OC I

Sp—PF

COO" Y*

MM<(1-3)10J

с: Ь

-нон

MM ->

(1-3) 103

Sp-PF

Н.3.1-1. Е. Введение РР в форме оксиреагентов

Спирты существенно уступают аминам по реакционной способности, что выдвигает на передний план кинетические исследования реакций этерификации, позволяющие прогнозировать степень РР-модификации полимерных матриц в реальном времени синтеза. В отличие от традиционных методов ускоренного высокотемпературного (> 100°С) алкоголиза промышленных продуктов, в нашем случае стояла задача изучения более мягких условий синтеза, приемлемых и для термолабильных РР.

Кинетику накопления сложноэфирных аддуктов (С) в реакции ангидридной группы (А) с молекулой спирта (В) моделировали предложенной нами [4, 6] системой уравнений (23а).

к1 _ „

а\ Ь," С„

In

А + В

(Ср-с0)(а]ЬгсСр) (cp-c)(albl-cuc)

где-

ай - начальная концентрация А Ь0 — начальная концентрация В с,, - начальная концентрация С а,=аи+с0 Ь] = Ь(/ + с0 с - текущая концентрация С Ср — равновесная концентрация С к - константа прямой реакции Т— время реакции

к2

= кт

1

In

V«o 1

«о -Ь0

с

" ■ сап

In

< 90° С, к2 0

Щ

«о " с «о/Ь0 «О - с

К - С b(i/aQ

Ь0- с

с

= кт

(23а)

при а0 < b,i

= кт

при а„ > Ь0

= кт

при а„ = Ъ0

а02-са0 Ь02-сЬо Предложенный математический аппарат хорошо описывает реальный

2В

процесс при умеренных степенях модификации (до 60%) мабм, что экспериментально подтверждено на примере реакции ангидридной формы базовой полимерной матрицы МАБМз0 с участием ряда модельных

спиртов в специально подобранной гомогенной среде (рис. 6)

1 2

08

04

150

время, мин

Рис. 6. Структуры модельных спиртов и примеры кинетических прямых

Определены константы скоростей и энергии активации реакции, с учетом уравнения Тафта оценен вклад индукционных и стерических факторов [4, 6]. Показано, что при приемлемо умеренных температурах ниже 90°С реакция обретает необратимый характер и текущая степень модификации полиангидрида спиртом во времени адекватно описывается уравнением'

Формула расчета текущей степени модификации полиангидрида спиртом [4,6]

Если а о ■ Иначе

Уа0

Ьп

ш

kza0

1 + кта0 (236)

. ехр(1 "о - ъ„\кт)- 1

е*р(1 "о-Ь0\кт)-(а0/ь„)22

Z = - 0 5 при а0 > bo Z = + 0 5 при do ^ Ьо

о 5 -z

Результаты исследований привели нас к крайне интересным выводам о возможности создания таких условий синтеза, когда скорость присоединения спиртов сложного строения корректно прогнозируется с применением кинетических констант, определенных для простейших спиртов, моделирующих ближайшее химическое окружение ОН - группы, например:

-а

(24)

Изучено также влияние кислотных и основных катализаторов Эти исследования нашли важное практическое применение в последующих полимераналогичных синтезах целевых макромолекулярных систем.

Н.3.2. Продукты синтеза систем «Полианион-8р-РР» (Ав.РР)

Все продукты синтеза в ряду полимерных аналогов янтарной кислоты (направления синтеза А, В, С, 0.1 и Е.1) в конечной - гидролизованной форме могут быть сведены к единой формуле (25):

— БМ-

Ткп къЪ

-Ап— = -СО-

эм-

Ап

Р*

х

I

-вр

Апг

(25)

где -ОМ-, РР-, -8р-, -Х-, Z,n,m- варьируемые молекулярно-структурные параметры, позволяющие целенаправленно регулировать желаемые свойства, включая комплекс биологической активности (раздел Н.З.З). Конкретные структурные модификации А8.РР (25) и иных продуктов синтеза представлены ниже (таблицы 2 - 3).

Таблица 2

АДАМАНТАН (А<1)-

содержащие полимерные системы

Нап равление синтеза С

Шифр -БМ- РР -вр- X Ъ РК/Ап*

АБ.Ас1-Со1С Я1 = СН3 1*3 Я2 \ / См - - ОН 0 50 + 0 03

А8.АС1-СО2С: 112=СНз - - он 0 50 + 0 03

АБ.Аа-Со1^'' 1*2 = СР3 Я.,Кз = Р - - он 0 50 + 0 03

AS.Ad-C.Nc я, = н ш=0 -ынсо- - он 0 50 + 0 03

А8.А<1-Ссо1 Я, = Н -соо-сн2- - он 0 50 + 0 03

А8.А<1-С„2с Я2=СН3 1 ^ т=0 - - он 0 14-0 39

Направление синтеза 0.1

А8.А<1-01,„ и — ш он 0 09

А8.А(1-ОГ2 -СН(СНз)— ын он 0 13

А8.А(№13„ 0 — ын он 0 05 - 0 45

Авла-ш', —сн2— N>1 он 0 05-0 17

Авла-оГ, ] -СН(СНз)- ын ОН/Ыа 0 05 -0 17

АвЛа-ЭГг -(СН2)2- ын ОН/Ыа 0 05-0 19

А8.Лс1-01\ V -(СН2)2- ын он 0 13

* здесь и далее указание интервала значений РГ/Ап соответствует синтезу не одного, а серии образцов с различным содержанием РР

Шифр -DM- PF -Sp- X z PF/An

AS.Ad-Dl'o 7 A n AnZ C'Hr—^ CH2~ 0 NH OH/Na 0 07

AS.Ad-Dl'i — CH2— NH OH/Na 0 04-0 16

AS.Ad-DlSi i -СН(СНз)— NH OH/Na 0 04-0 15

AS.Ad-Dl'i 2 -CH(Et)- NH OH/Na 0 06

AS.Ad-Dl52 -(CH2)r- NH OH/Na 0 03-0 21

AS.Ad-Dl5, -(CH2)3- NH OH/Na 0 06

AS.Ad-Dl5N2 -N(CH2)2NH- NH OH/Na 0 06

AS.Ad-Dl'A, —CH2— NH, НО OH/Na H2NSpPF 0 06

AS.Ad-Dl \2 -(CH2)2- NH, НО OH/Na HjNSpPF 0 06

AS.Ad-Dl3A3 —(СН2)з— NH, НО OH/Na H2NSpPF 0 06

AS.Ad-Dl6,, - NH OH/Na 0.060 08

AS.Ad-Dl'o 'w^AnZ - NH OH/Na 0 09

SA-Ado НМС - аналоги coz аддукты янтарной кислоты (n = m = 1 и без -DM-) - NH OH 0 50

SA-AdAo - NH, НО OH 0 50

SA-Ad, —CH2— NH OH 0 50

SA-Ad,, -CH(CHj)- NH OH 0.50

SA-Ad,Ncm —CHr- N(CH3) OH 0 50

AS.AdElDl50 R = Et ZAn AnZ ■CH2—CH2-~ - NH OH/Na 0 06-0 07

AS.AdAnDl3(, R = COZ - NH OH/Na 0 06

Направление синтеза Е1.

AS.Ad-El3i —CH2— 0 OH 0.030 15

AS.DAd-El'i — CH2— 0 OH 0 25

Продукты синтеза охарактеризованы совокупностью аналитических, спектральных и физико-химических методов Перед биологическими испытаниями опытные образцы проходили процедуру 10 000-кратной очистки от возможных НМС примесей методом ультрафильтрации (4 иикла 10-кратного концентрирования водных растворов на мембранах проницаемостью ММ < / ООО, а в случае олигопептидных РТ7 - ММ ^ 3 ООО) и выделялись в форме порошкообразных лиофилизатов

Таблица 2, продолжение НОРБОРНАН (1ЧЬ)- и НОРБОРНЕН (1ЧЬ")-

содержащие полимерные системы

Направление синтеза 0.1

Шифр -ОМ- РГ -вр- X ъ РР/Ап

А8.ЫМ}150 ¿Ап Аг£ сн2—У-сн2~ 0 экзо + эндо /-р\ ЭКЗО ЭКЗО эндо эндо + экзо ын ОН/Ыа 0 07

А8.ЫЬс"-О150 - ын ОН/Ыа 0 07

—СН2— ын ОН/Ыа 0 08

А8.ЫЬел-015, —сн2— ын ОН/Ыа 0 08

АЗ-ЫМЛ5,, -СН(СНз)- ЫН ОН/Ыа 0 07

вА N6,, ¿ь ^ ХС-вр-ХСО СОТ -СН(СНз)— ын ОН 0 50

Ав.ЫЬ^-О!5, ЪАп кт2. сн2—^ У-сн2~ 0 А экзо эндо экзо + эндо экзо + эндо —сн2— ОН/Ыа 0 08

—СНг— ЫН ОН/Ыа 0 08

А8.ЫЬ~-0152 -(СН2)г- ЫН ОН/Ыа 0 08

А8.ЫЬ"-0153 -(СН2)3- ЫН ОН/Ыа 0 08

вА^Ь"", Ь. экзо ^^ч^вр-хсо \'ог эндо —СН2— ЫН ОН 0 50

8А.1ЧЬ"Л —СНг— ын ОН 0 50

А8.ЫЬ°-В15, ХАп Ап/ снД^сн2~ —СН2— ын ОН/Ыа 0 08

SA.NI>0, 8р— ХСО \юг —СН2— ын ОН 0 50

А8.01\Ь"-01'| ТАп Апг сн2—^ У—сн2~-0 —сн2— ын ОН/Ыа 0 08

SA.DNb1 У \~Sp-xco сог —СНг— ын ОН 0 50

ЦИКЛОАЛКАН (СО- и ФЕНИЛ (РЬ)-содержащие полимерные системы

Направление синтеза 0.1

А8.С5-0152 7Ап АпЪ СН2-СН2~ 0 и. -(СН2)2- ын ОН/Ыа 0 08

А8.С6-0152 а —(СН2)г— ын ОН/Ыа 0 08

Направление синтеза Е.1

АБ-Сб-ЕРо а - 0 ОН 0 01 -0 04

Шифр , -ЭМ- РГ -вр- X ъ РР/Ап

Направление синтеза В.

А8.Р11-Во -О- - - он 0.2 - 0 5

Направление синтеза 0.1

А8.РЫЭ13о 2Ап Апг -СНг-Ч^ }— СН2 0 0М5Ь - ын ОН/Ыа 0 08

А8.РМ)15, —СНт— ын ОН/Ыа 0.25

А8.РН-0151+а1 —сн2— ын ОН/Ыа МН25р-РР 0.03-1.00

А8.РМ515а, —СН2— ын, но ОН/Ыа МН28р-РР 0 06-0 50

А8.РЬ-0152 -(СНгЬ- ЫН3 но ОН/Ыа (МИ^р-РИ 0.06

А8.РМ315, -(СН2)3- ын ОН/Ыа 0.06

Ав.РЬ-Ш'д-, —(СН2)з— ЫН, но ОН/Ыа МН28р-РР 0 06

Ав.РИ- -О- о —сн2— ЫН ОН МН25р-РР 0 50-1 00

вА-РЬ, — вр- хсо \,га —СН2— ЫН ОН 0 50

8А-РЬд1 —СН2— ЫН, но ОН 0 50

А8.РЬ°°-0152 ZAп Ап/ сн2—у—сн2* 0 I 1 -(СНгЬ- ын ОН/Ыа 0 06 -0.08

ПОЛИМЕТИЛЕН (С,)- И ХОЛЕСТЕРИН (СНЬ)-содержащие полианионные системы

Шифр -БМ- рр -вр- X ъ РР/Ап

Направление синтеза Е.1

А8.С8-Е1'о ш = 8 г\ 1 (СН2)тСН3 где т = 0 -10 - 0 ОН 0 04-0.18

А8.Сю-Е1 'о т= 10 - 0 ОН 0 04-0.12

Направление синтеза С

А8.С«а"-С3о (сн2)8со г - - ОН 0.09-0.27

Направление синтеза Е.1

Ав СНЬ-Е130 о - 0 ОН 0.02-0 07

АЗИДОТИМИДИН (А7Л>

содержащие полимерные системы

Направление синтеза Е.1

Шифр -бм- РТ -вр- X ъ РР/Ап

АБ-АгТ-НГ,, ¿Ап Ап2 СНг—4 сн2 0 О н,с. 1 ТХН к, 0 ОН/Ыа ) 08-0 17

А5.АХТ-Е15р1 -ОРОСН2— он 0 ОН/Ыа 0 12

Ав.АХТ-Ым ОРО(СН2)4-он 0 ОН/Ыа 0.12

Полисахаридные производные Таблица 3

Шифр Структура X г РР/Ап

Направления синтеза 0.2, Р.2

но

Ав^Аа-Ог, п —сн2— N4 0 05-0.18

г ь

А8°5АС1-022 Ьн Бр'Апг 5р' = СН2, Ап = СО -(СН2)2- ын ОН /Ыа 0 04-0 18

А5сьА(1-Е2о

Бр1 = СО(СН2)2 Ап ~ СО И1, И6 = Н К60-—7 - ын -Х-ЗрЛ^ 0.10

Л8ПЛА(1-022

я1, я6 = Лп2г Ап2 - &02 п -(СН2)2- NH ОН/Ыа 0.03-0.07

5р'=СО(СН2)2 Ап - СО ны—8р'Апг

Л8':1,5А(1-Р2д2 я1, я' - н Бр' - Н Ап = - / 80,Н -(СН2)2- - -Х-5.Д21 0.10

Н.З.З. Имитаторы ВИЧ - специфических рецепторов клеток человека

Анализ пространственной и структурно-функциональной организации макромолекул клеточных рецепторов сся5 и сси4* [46, 53] позволил выделить ключевые субмолекулярные структуры [49, 55, 56], играющие критическую роль в качестве молекулярных посредников ВИЧ-инфицирования клеток человека (см. рис.2, с.11) Соответствующие фрагменты природных белков (рис 7) воспроизведены в виде синтетических олигопеп-тидов методами твердофазного пептидного синтеза и в соответствии с разде-

*ССЯ5 не является жизненно необходимым для человека, ответственен за первичное ВИЧ-инфицирование (макрофагов и др клеток) [46], ССЯ4 - жизненно необходим человеку, но ответственен за прогрессию СПИДа - опосредует ВИЧ-

инфицирование и гибель Т-хелперных лимфотШЬ

емы [531

с- национальная!

БИБЛИОТЕКА

СОетсрвург

О® *» иг I

»«V

Рис. 7.

Пространственная и Планерная схемы белковых молекул ССИ5 и ССИ4 с выделенными сайтами, ВИЧ-специфического связывания

CCR4

Внешняя

поверхность

клетки

Клеточная мембрана

Внутренняя ^ ^

поверхность мембраны

Р5

Р5" Р5

P4N Р42

NS

1 2

(26)

разделом II.3.1-1.D модифицированы лизином, который имеет естественный тетраметиленовый -Sp- с концевой аминогруппой, удобной для химического связывания с полианионами:*

so3h so3h

ноос—е S TY^NID^IPSSVQYD —Lys (nh2)—(ch2)4-NH2 hooc— e STYYNIDYIPSSVQYD — Lys (nh2)—(ch2)4-NH2 hooc-c M TNGFDWQAAA — Lys (nh2)—(ch2)4-NH2 hooc-D Y D I S I M E E T Y—Lys (nh2)—(CH2)4-NH2 hooc—Y YYWLDNPYFRD —Lys (nh2)—(CH2)4-NH2

Полианионная природа базовых полимеров соответствует функциям имитации отрицательного заряда, повышенная плотность которого является характерной особенностью молекул CCR5 и CCR4 с внешней стороны клеточной мембраны, и которая используется вирусом для электростатической атаки посредством V3 петли вирусного белка gpl20 (раздел Ii I 23). Для экспериментальной проверки электростатически - имитационной эффективности синтетических полианионов, параллельно с олигопептидом Р5 s, имеющим мощные центры отрицательного заряда (сульфокислотно модифицированные остатки тирозина в положениях 10 и 14 нативного рецептора), синтезирован также его аналог Р5 без сульфокислотных групп

* Аминокислотные остатки синтетических пептидов (кроме лизина - Lys) обозначены общепринятым однобуквенным кодом

Предполагалось, что исключение из Р5Ы5 анионной функции сульфатиро-ванных тирозинов будет восполнено за счет полианионной матрицы в результате ее химического связывания с пептидом в единую макромоле-кулярную систему. Этот подход снимал также проблему нестабильности сульфокситирозиновых реагентов, существенно усложнявших пептидный синтез В таблице 4 представлены структуры некоторых монопептидных и комбинированных конъюгатов на основе базовой матрицы МКЭМ5Ь

ОЛИГОПЕПТИД содержащие полимерные сии емы Таблица 4

Направление синтеза 1

Шифр -DM- PF -Sp- X z PF/An

моно-(олигопептидные)

AS-P5Nb 7An An Z w P5 NH OH/Na 001

AS-P5n P5N NU OH/Na 001

AS-P51 i -CH2—У—CH2~ 0 P51 2 -(C H2)4- NH OH/Na 0 01

AS-P4 N P4N NH OH/Na 0.01

AS-P4' Р42 NH OH/Na 0 01

AS-P6, /-Р7, /-Р8 Р6/7/8* NH OH/Na 001

комбинированные

AS-P5NS Nb" P5ns + Nb" -(CH2)4- —CII2- NU NH OH/Na 0 01 0 05

AS-P5ns Ad P5ns + Ad -(CH2)4-—CH2- NH NH OH/Na 0 01 0 04

AS-P5n Nb" P5n + Nb" -(CH2)4--СН,- NH NH OH/Na 0 01 0 05

AS-P5N Ad P5n + Ad —(CH2)4— —CH2— NH NH OH/Na 0 01 0 04

AS-P5ns P51 2 Nb" pjNb Р512 -(CHj)4- NH NH OH/Na 0 006 0 005

ZAn AnZ \ / + Nb" -cn2~ NH 0 05

AS-P5ns P512 Ad -CH^C», 0 P5Ny P512 -(CH2)4- NH NH OH/Na 0 006 0 005

+ Ad -CH2- NH 0 04

AS-P512 Ad P512 + Ad —(CH2)4— -CH2- NH NH OH/Na 0 01 0 04

AS-P512Nb" P512 + Nb" -CH2- N II NH OH/Na 0 01 0 05

AS-P4n Nb" P4N + Nb" —(CH2)4— -CH2- NH NH OH/Na 001 0 05

AS-P42 Nb" P42 + Nb" -(CH2)4--CH2- NH NH OH/Na 001 0 05

AS-P42 Ad P42 + Ad -(CH2)4- -CH2- NH NH OH/Na 001 0 04

*По химической природе и методу полимерного связывания пептиды Р6 Р7 и Р8 аналогичны,

Н.3.4. Анализ закономерности «Структура-Активность» АБ.РР-систем и оценка целевой результативности стратегии синтеза

Лабораторно-биологические испытания опытных образцов Ав.РР проведены на экспериментальной ба?е научных центров, представленных в разделе II.2.5. Расширенные исследования выполнены с участием проф. Букринской А.Г. и сотр., д м н Карамова Э В. и сотр. (НИИ вирусологии), д.м.н. Козелецкой К.Н. (НИИ Гриппа), к.м.н. Перминовой Н.Г. и сотр. (ГНЦ ВБ «Вектор»), а также проф М Стевенсона и сотр., Д. Ричмана и сотр., Л. Марголиса и сотр. (США), проф. Э. Де Клерка и сотр. (Бельгия) и др . Автор диссертации лично участвовал в планировании, координации и анализе биологических исследований, а также непосредственно выполнял токсикологические эксперименты, не требующие специального допуска.

11.3.4-1. Токсикологическая безопасность

Результаты исследования токсикологических параметров Ав.РР-систем позволяют констатировать позитивный эффект химической кооперации исходных РР с «базовыми» полимерными матрицами В частности, полианионная реконструкция Ас) - содержащих препаратов позволила в несколько раз снизить уровень острой токсичности и цитотоксичности [11, 16, 18, 30, 36, 45. 50, 51], устранить эффекты электродинамического шока ремантадина, оказываемого им на эпителиальные мембраны [18, 30].

Одновременно решена проблема совместимости-транспортабельности РР в водных физиологических средах. Исключение составляют лишь продукты, полученные по направлениям синтеза В и С (20), с.25, приводящие к чрезмерно высокому содержанию РР по отношению к анионо-генным группам - РР/Ап >05 [9]. По совокупности экспериментальных данных мы определили следующий критерий оптимальной токсикологической безопасности АБ.РР по параметру РР/Ап:

«критический порог степени РР / Ап < 0.15-0 20 (27) модификации анионогенных групп» _—

Установлено, что при прочих равных условиях, предпочтительнее гибкоцепные полианионы с высокой плотностью АпОН/Ыа = СООН/Ыа -групп, и с преобладанием гидрофильных структур в полимерном остове.

II 3.4-2. Активность полианионов в составе А8.РЕ-систем

Химическая модификация «базовых» полианионов в А8.РР-системы неизбежно ставит вопрос при каких условиях и в какой мере будут сохраняться ценные биологические свойства полианионов? На примере систем АБ.АсЬряда, где Ас1 - объемный гитрофобный РР, способный экранировать анионогенные группы, показано, чго в пределах степеней модификации, определяемых критерием (2"). АЧ.РР-системы вполне сохраняют: индукцию интерферона (А8.Ас]-ОГ!ь титр интерферона 320 ед/мл),

РР/Ап < 0.15-0.20

адыовантнут защиту от нейровирусов, рис 8 Таким образом, критерий (27) вполне соответствует и условию воспроизводства полезных противовирусных функций, присущих базовым полианионным матрицам

вкэ AS.Ad-Dl'o + Вакцина

AS.Ad-D13, Н

AS.Ad-E-Г, Н

AS.AZT-E1, Н Ва«"

AS.UA-C Щ Щ

НИШ

100%

50%

0%

Рис 8 Иммуноадъювантная защита мышей от летальных доз опасных нейровирусов препарат ами AS.PP (указан % выживания животных)

II.3.4-3. Активность PF в составе AS.PF-систем

Данный вопрос экспериментально исследован на примере двух PF, принципиально различных по типу противовирусного действия:

1) Ad - противогриппозный PF типично мембранотропного действия и

2) AZT - анти-ВИЧ PF типично немембранотропного (внутриклеточного) действия.

Как видно из рис. 8, в составе полимерных AS.PF - систем, PF обоих типов (препараты серии AS.Ad. и AS AZT, см. защиту от ВКЭ) in vivo не препятствуют проявлению иммуноадъювантной активности исходных полианионов. Однако, обратная зависимость - влияния полианиона на активность PF диаметрально противоположна. Полианионная реконструкция мембранотропного Ad в эксперименте in vitro не только сохраняет, но и усиливает присущую ему активность против вируса гриппа (ВГР), тогда как в случае немембранотропного AZT типичная для него активность против ВИЧ не только не усилилась, но даже не успела проявиться во временном масштабе эксперимента (<48 часов) [45]. Следовательно, полианионы наиболее пригодны для создания именно мембранотропных агентов AS.PF Дезактивация же AZT является косвенным аргументом в пользу того, что базовые полимеры действительно обеспечивают желаемый «запрет» на диффузию НМС через плазматическую мембрану внутрь клетки, что крайне важно для защиты клеток не только от вирусов, но и от побочных эффектов самих химио-препаратов. Таким образом, рациональная полианионная реконструкция PF, благотворна как для усиления мембранотропной противовирусной активности, так и для снижения токсичности.

II 3.4-4. Расширение диапазона защиты от различных типов вирусов

Дальнейшие испытания опытных мембранотропных образцов под-

твердили прогнозируемую нами тенденцию существенного усиления и расширения противовирусного потенциала [39 11 ^0 4], например, табл 5

Таблица 5

Кратность подавления вирусных инфекций in vitro

Вирус Культура клеток Ремант-дин агенты AS Ad

Вирусы гриппа (ВГП), штаммы

А/Виктория/35/72(113N2) ХАО - 1000 <3000

A/PR/8/34(HlNl) ХАО <6 <600

В/Санкт-Петербург/71 /97 ХАО 0 <300

Вирус простого герпеса Иер-2 0 <300

1 типа, штамм WIP-2 ФЛЭЧ 0 < 1000

Вирусы парагриппа

1 типа, штамм Сендай ХАО <3 <300

3 типа, штамм III V2932 MA-104 <3 <300

Вирус респираторно-синцит Long MA-104 0 <40

ВИЧ-1 испытано более 15 штаммов различные 0 до 100%

SAR-анализ различных модификаций AS.Ad показывает, что оптимальные параметры для проявления наивысшей активности при минимальной токсичности имеют продукты синтеза по направлению D.1 (табл 2. с. 2931) при Ad/An <0.15 (оптимально 0.5 - 0.1), -Sp- = -(СН2)„- (оптимально п - 1-2) на базе гибкоцепного MKDMsb с чередованием фурановых структур и Mn ~ 104 По-видимому, данные параметры наиболее благоприятны для мембранопротекторного действия Ad, синергически усиленного электростатической фиксацией полианиона на вирусных мишенях При этом резко возрастает целевая специфичность (IS » 50) противовирусной защиты.

II 3 4-5. Многоуровневая (комбинированная) зашита от ВИЧ

Мембранотропные AS.PF, содержащие PF каркасной структуры.

Высокая анти-ВИЧ активность зарегистрирована в ряду мембранотро-пных Ad- или Nb- содержащих AS.PF и их аналогов [12 16-18 25,30-36.42. 48,50 58] В соответствии с теоретическим прогнозом (раздел II 1 2-3) подтвердился факт ВИЧ-ингибирующего действия препаратов, с самого начального этапа - адсорбции вируса на клеточной мембране [36] Как и предполагалось, наиболее активными ингибиторами адсорбции оказались сильные полианионы сульфокислотного типа DSs, Chs и ASCh'sAd-D22, - как наиболее эффективные электростатические конкуренты ВИЧ-специфических сайтов рецепторов CCR5/4. Наличие PF в выше установленных пределах (PF/An <0.15) не препятствует электростатической блокаде адсорбции, а напротив, может способствовать ее усилению Так, изначально малоактивный «мягкий» анионоген MKDMsb после введения Ad (Ad/An ~ 0 05-0.10) обрел способность 4х-кратно замедлять адсорбцию ВИЧ-1 на плазматической мембране лимфоидных клеток [36] Этот факт хорошо согласуется с QSAR-прогнозом (см. с. 12-13) возможности дополнительного мульти-

точечного связывания Ас! и 1ЧЬ с вирусным белком gpl20.

Однако, основной ВИЧ-ингибирующий эффект (до 100% блокады) А8.Ас1/1ЧЬ реализуют на следующем этапе - фузии вирусной и клеточных мембран Анализ распределения вирусных белков и молекул РНК по субклеточным фракциям показал, что в присутствии препаратов серии А8.Ас1ЛЧЬ продвижение вируса останавливается на плазматической мембране без дальнейшего проникновения в цитоплазму и транспорта

л вирусного генома в ядро клетки [32,36]. Этот результат соответствует

прогнозу (с. 13-14) эстафетной пролонгации действия А8.РР от этапа адсорбции к блокаде вирусной фузии, инициируемой белком gp41.

Более того, получены экспериментальные данные о возможности терапевтического вмешательства против ВИЧ-1 не только на входе в клетку, но и на выходе из уже инфицированной клетки. Так, образцы А8.Ас1-01 (А(1/Ап<0.1) проявили способность угнетать продукцию ВИЧ-подобных частиц клетками, зараженными рекомбинантным вирусом оспо-вакцины, в геном которого встроены gag гены ВИЧ-1. Это дает предпосылки нарушения процессов сборки и почкования вирусных частиц - на завершающем этапе вирусной репродукции [47]. Аналогичная закономерность отмечена и на примере другого, но также оболочечного вируса -гриппа [18]. Следовательно, развиваемый нами мембранопротекторный подход открывает перспективу разработки противовирусных агентов бинарно-акцентированного действия (и на входе и на выходе из клетки), а значит, и удвоенной степени надежности противовирусной защиты [54].

Системный 8АЯ-анализ в массиве структурных ВМС-модификаций Ав.РР и низкомолекулярных образцов сравнения 8А-РР (табл.2) позволил выявить важные закономерности «структура-активность-токсичность». Кроме выше рассмотренных факторов 1) анионной активности и 2) критерия РР/Ап <0.15 (27), необходимо отметить следующие закономерности:

3) Жесткость цепи: жесткоцепные полианионы АБ, не содержащие РР, несколько активнее на этапах адсорбции, в то время как гибкоцепные (оптимум МКБМбЬ) существенно более благоприятны для создания максимально эффективных агентов комбинированного типа А8.РР [50];

4) Степень полимеризации: снижение Мп до 5000-3000 понижает активность А8.РР, а НМС аналоги - аддукты янтарной кислоты - вовсе неактивны. Т.е. полимерное состояние необходимо для реализации активности.

5) Каркасная структура РГ - биоспецифический фактор анти-ВИЧ активности:

л. неактивны высоко активны (в составе Ав.Рр^

О-ЦО Ь «

6) Наращивание объема каркасного цикла в ряду 1ЧЬ/1ЧЬ < Ас! < < ЭАс! не приводит к существенному усилению анти-ВИЧ активности, но последовательно увеличивает токсичность. Аналогичная закономерность

наблюдается и при введении в циклы гидрофобных заместителей

7) Введение в каркасные циклы гидрофильных групп (А8.Ас1Ап, А8.1ЧЬ0) подавляет анти-ВИЧ активность (а также активность против ВГР).

8) Введение двойной связи в бицикл 1ЧЬ (АБ.НЬ") повышает уровень активности, причем существенное значение имеет пространственная изомерия положения -8р-: экзо-изомеры AS.Nl)' с пространственно доступной двойной связью в несколько раз более активны, чем их эндо-аналоги [50]

9) В качестве -8р- предпочтительнее -(СН2)т-, где т = 1-2; увеличение длины до т = 3 не улучшает активность. Введение в -вр- боковых гидрофобных ответвлений увеличивает токсичность.

Системный учет выявленных закономерностей и оптимизация соответствующих молекулярно-структурных параметров позволили создать новую генерацию [32-36,42,48,50,59,60] высокоэффективных ингибиторов ВИЧ-инфекции весьма высокой биоселективности 1850 = 300 - 10 000.

ЯдА-акцентированные мембранотропные Л РР-систем ы

В рамках проверки целесообразности создания не просто мембра-нотропных антивирусных агентов, а способных избирательно концентрироваться именно в «зонах повышенного риска вирусного проникновения», синтезированы холестеринсодержащие системы Ав.СНЬ-серии. Как отмечалось в разделе 11.1 2-3, с. 14, обогащенные холестерином «ЯаЛ-зоны» плазматической мембраны клеток формируют агрегаты клеточных рецепторов наиболее восприимчивые к вирусной атаке и активному проникновению ВИЧ (и рядом других вирусов) в клетку. Испытания опытных образцов А8.СНЬ-Е130 действительно подтвердили [50] 2-кратное усиление анти-ВИЧ-1 эффективности по сравнению с немодифициро-ванным полианионом МКБМз0 уже при 4% модификации (РР/Ап = 0.035) анионогенных групп по направлению синтеза Е.1 (табл. 2, с.32).

Имитаторы ВИЧ-специфических рецепторов клеток человека.

Еще более яркие результаты получены при испытаниях опытных А8.РР систем, представленных в таблице 4 (с. 35). Сами по себе синтезированные олигопептиды (26), имитирующие ВИЧ-восприимчивые участки клеточных рецепторов ССИ5/4 в виде разобщенных «отрезков» без полимерной основы оказались практически неактивными в отношении ВИЧ (подобно НМС А(1ЛЧЬ-ряда) даже в высоких концентрациях > 500 мкг/мл Также малоактивными оказались и их механические композиции с базовыми полианионами (совместные водные растворы). Однако химическая кооперация в А8-Р4/-Р5-макромолекулы резко (на 1-2 и более порядка) усилила анти-ВИЧ эффективность базовых полианионов [49, 55, 56, 57].

Мультикомбинированные полимерные системы.

Дополнительные резервы активации противовирусных свойств раскрыты на пути целенаправленного синтеза мульти- функциональных полимерных систем, объединяющих возможности РР различного типа.

Структурно-функциональную кооперацию исследовали в двух направлениях: 1) интраполимерная кооперация - где PF различной структуры и противовирусного действия объединены в одну макромолекулу AS.(P4+P5+Ad+Nb+ ..) и 2) интерполимериая кооперация типа AS'.P4 + AS2.P5 + AS3.Ad + AS4.Nb и т.д..

В таблице 6 представлен наглядный пример усиления ВИЧ-ингиби-рующей активности полианионной системы (AS) по мере ее последовательной интрамолекулярной модификации PF различной химической природы (и различного типа действия)' каркасным углеводородом Nb= (гидрофобно-мембранотропного действия) и синтетическим пептидом P4N (рецептор-имитационного действия)

Таблица 6.

Уменьшение концентраций препарата (1С), достаточных для 50% (■) подавления репродукции ВИЧ-1 (штамм EVK, на культуре МТ-4) по мере моно- и бинарной модификации полианионов AS фармакофорами различной природы Nb= и P4N

Опытный образец

1. Пептид P4N

2. Полианионная матрица AS = MKDMjb _________

3. Механическая смесь 1 + 2

4. Моно-модификация 1% AS-P4N_

5. Моно-модификация 4% AS-Nb"_

6. Би-модификация 1+4% AS-P4N-Nb=

1С, мкг/мл

10 100 1000

>500

S¿f

Системное исследование факторов структурно-функционального синергизма и антагонизма различных РР в интра- или интерполимерной формах в направлении усиления противовирусной активности и снижения токсичности уже сегодня позволило получить опытные образцы с эффективной концентрацией подавления ВИЧ-1 порядка 0 1 мкг/мл (< 10"8 моль/л в пересчете на макромолекулу) и уровнем биоселективности 1Я50 до 1-2 104.

Исследовано также поведение лидирующих по активности А8.РР в составе различных интерполимерных комплексов с широким кругом природных и синтетических ВМС, используемых для создания современных лекарственных форм В результате создан ряд перспективных композиций, не снижающих активность АБ.РР, но обретающих комплекс

рН-управляемых свойств важных для оптимизации режимов транспорта, своевременной активации ВИЧ-ингибирующего действия и обеспечения токсикологической безопасности.

К вопросу о предотвращении лекарственной резистентности вирусов

Важнейшим недостатком АХТ - базового агента терапии СПИД и родственных ему НМС-аналогов являются жесткие побочные эффекты и быстрая мутационная адаптация вируса с утратой восприимчивости к лекарственным препаратам. В нашем же случае получена группа мало-токичных и высокоактивных ингибиторов ВИЧ, способных эффективно подавлять репродукцию широкого спектра различных штаммов ВИЧ-1 [30-36, 38, 42, 48, 50, 58-60], включая АгТ-устойчивые, рис. 9.

Рис 9.

Репродукция ВИЧ-1, штамм 5/гата/, устойчивого к AZT, эффективно подавляется новыми противовирусными агентам! серии АБ.Ас! и А8.1\Ь

При этом попытки получить новые штаммы ВИЧ, резистентные к разработанным препаратам А8.РЕ (в лабораториях США, [30]) и аналогично резистентные ВПГ (НИИ гриппа, Санкт-Петербург, [40]) не увенчались успехом. Но эта «неудача» означает не что иное, как успешность предложенной и реализованной нами стратегии комбинированного противовирусного действия, поскольку она открыла экспериментально подтвержденную перспективу кардинального решения ключевой проблемы - предотвращения формирования у вирусов лекарственной резистентн ости.

* * *

Таким образом, биологические испытания подтвердили продуктивность разработанной нами макромолекулярной стратегии создания нового поколения биоселективных ВМС-систем комбинированного противовирусного действия. В настоящее время более 30 оригинальных субстанций исследованы в качестве активной основы для создания эффективных средств лечебно-профилактической защиты от СПИДа на базе НИИ вирусологии РАМН (Москва), ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово) при поддержке МНТЦ (Москва) и Министерства Здравоохранения США. Ряд опытных образцов лекарственных форм успешно прошел предварительные этапы доклинических испытаний и запланирован к клинической апробации.

ВЫВОДЫ

1. На основе изучения макромолекулярной организации вирусов, биополимерных механизмов вирусной восприимчивости клеток и иммунной защиты, а также системного анализа химических аспектов терапии вирусных заболеваний разработана молекул ярно-функциональная стратегия создания противовирусных ВМС нового поколения, удовлетворяющих трем ключевым критериям:

- Комбинированное (многоуровневое) противовирусное действие;

- Превентивная терапевтическая защита клеточных мембран,

- Биоселективность (защита при минимальной токсичности)

2. Осуществлено молекулярное конструирование и целенаправленный синтез фармакофор-модифицированных полианионных систем, сочетающих в себе химически регулируемый комплекс биологических функций- полиэлектролит-специфической активации иммунитета;

- полиэлектростатической дезактивации (дезориентации) вирионов;

- полимер-кооперативного усиления потенциала фармакофоров;

- псевдорецепторного вмешательства в жизненный цикл вирусов;

- полимер-специфического снижения остротоксических эффектов.

3. Проведены сравнительные исследования противовирусного потенциала анионогенных полисахаридов и синтетических полимерных аналогов янтарной кислоты в зависимости от их структуры и макромолекулярных параметров. Разработаны малотоксичные иммуностимуляторы, способные к индукции интерферона, активации антителообразования, клеточного иммунитета и эффективные в защите от летальных доз ряда опасных нейровиру-сов. Изучены структурно-функциональные закономерности подавления полимерными анионами адсорбции ВИЧ на поверхности клеток.

4. В ряду полимерных объектов п. 3 выделены оптимальные варианты «базовых» полианионных матриц, перспективные в качестве платформ макромолекулярного синтеза более сложных систем комбинированного типа и выполнены необходимые специализированные исследования:

- особенностей радикальной чередующейся сополимеризации малеино-вого ангидрида с «фураногенными» сомономерами в целях регулирования структуры, степени полимеризации и чистоты продуктов;

- особенностей аминолиза и алкоголиза полимерных ангидридов в целях реализации управляемых процессов химической инкорпорации окси- и амино-производных фармакофоров в макромолекулярные системы.

5. Предложена молекулярная стратегия усиления и расширения диапазона противовирусного потенциала полимерных анионов дополнительными адресными функциями фармакофоров предпочтительно мембрано-акцен-тированного действия - для «опережающей терапевтической блокады» самых ранних этапов проникновения вирусов в клетки через мембрану.

6. Разработаны схемы и методы функционально продуктивной химической кооперации фармакофоров с полианионными матрицами, включая:

- предварительную модификацию фармакофорных соединений в реакционно активные формы с заготовками «спейсерных» мостиков;

- химическую инкорпорацию полученных реагентов в полианионные макромолекулы 1) на стадии полимерного синтеза - в составе инициаторов радикальной полимеризации, мономерных производных малеино-вого ангидрида или элекронодонорных сомономеров, 2) на стадии полимераналогичных превращений - в составе амино-, окси-, карбокси-или сульфокси- реагентов.

7. Предложенная стратегия и схемы синтеза реализованы в конкретные химические структуры (более 250 опытных образцов) синтетических и природных полимерных анионов с включением фармакофорных структур различной природы и специфичности'

- трициклических каркасных соединений адамантанового ряда;

- синтетических аналогов бициклических каркасных терпеноидов;

- полициклических каркасных соединений более сложного строения;

- полициклических некаркасных структур на основе холестерина;

- моноциклических и ациклических липофильных углеводородов и

- производных азидотимидина.

8. Выявлены и изучены закономерности активации противовирусных функций и оптимизации биоселективности новых полимерных систем в зависимости от' степени полимеризации, жесткости цепи и анионогенной силы полимерной матрицы; природы, структуры и пространственной изомерии фармакофоров, степени фармакофорной модификации по отношению к анионогенным группам, подвижности и длины «спейсерных» мостиков и других молекулярно-химических параметров.

9. Впервые осуществлено молекулярное конструирование и синтез полимерных имитаторов естественных клеточных рецепторов ВИЧ - нового класса эффективных агентов защиты клеток человека от ВИЧ-инфицирования штаммами различной рсцепторной специфичности.

10. Созданы и исследованы мультифункциональные интра- и интерполимерные комбинации вышеперечисленных ВМС, а также природных и синтетических полимеров, используемых в современной практике лекарственных форм. Высокая эффективность новых анти-ВИЧ агентов на уровне индекса биоселективности до 10 ООО и более с перспективой продвижения в клиническую практику профилактики и терапии СПИДа подтверждена в ведущих вирусологических центрах России, Европы и США.

11. На стыке химии ВМС, биохимии и молекулярной вирусологии создано новое научное направление - молекулярное проектирование и синтез биоселективных полимерных систем комбинированного противовирусного действия.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ"

1. Давыдова А Г, Стоцкая Л Л, Березина Л К . Осипова Л В, Баринский И Ф, Крениель Б А, Кнороз МЮ, Микули С А, Попова ОМ Сербии А В Противовирусный и иммуностимулирующий эффект сополимеров малеинового ангидрида при экспериментальных нейровирусных инфекциях II Вопр вирусологии, 1986, № 5, с 595-598 .

2. Сербии А В , Стоцкая Л.Л, Кренцель Б А, Грибенча С В, Давыдова А А, Лазоренко А А, Березина Л К, Баринский И Ф Сополимеры на основе фурана и малеинового ангидрида и перспективы их использования в медицине // Сб Полимеры медицинского назначения, М Наука, 1988, с 127-152

3. Русаков И Г, Щитков К Г, Старшинова И В, Ильина А И, Стоцкая Л Л, Сербии А В , Дмитриев ДГ Влияние полимеров-индукторов интерферона на противоопухолевую активность 5-фторурацила, метотрексата и доксорубицина // Тр I Всесоюз совещ "Применение индукторов интерферона в радиобиологии и онкологии", Томск, ТТУ, 1989, с.74-76.

4. Сербии А В, Карева ЮГ, Стоцкая Л Л, Кренцель Б А Полуэтерификация чередующегося сополимера фурана с малеиновым ангидридом // Высокомол. соед., 1989, т 31А № 9, с 1975-1982.

5. Чиссов В И , Борисов В И, Щитков К Г, Русаков И Г, Стоцкая Л.Л, Иорданская Л И, Сербии АВ., Улогова Ю В Способ лечения злокачественных опухолей //Ас 4782699 СССР, 1990.

6. Barinsky I F, Krentsel В А, Gnbencha S V, Serbin А V, Davydova АА, Stotskaya L L., 1 .azarenko A. A and Berezina L К Furan-maleic anhydride copolymers and their potential uses in the chemotherapy of viral infections //Sov Med Rev E Virol Rev., 1991, N4, p 79-102

7. Морозова И Ф, Сербии А В, Стоцкая Л Л, Козловский М М. Сополимеры на основе ундециленовой кислоты и их биологическая активность // Тез докл IX Всесоюз науч. симп. "Синтетические полимеры медицинского назначения", Звенигород 1991, с 42

8. Иорданская Л.И, Сербии А В, Стоцкая Л Л . Улогова Ю В, Алексеева С Д, Гурашев В Н, Губайдулин Л Ю, Козловский М М , Виноград И А Сополимеры малеинового ангидрида с 1,4-ди-изо-пропоксибутеном-2 и их производные, обладающие противовирусными свойствами//А с. 1684290 СССР, 1991

9. Осипова Л В, Сербии АВ, Абрамов О В, Долгополова 1Д, Климочкин Ю.Н, Багрий Е И. Стоцкая Л Л, Козловский М М Синтез и свойства сополимеров на основе ненасыщенных производных адамантана и малеинового ангидрида // Тез докл. VI Конф "Перспективы развития химии каркасных соединений", Волгоград, 1992, с 131

10. Сербии А В, Букринская А Г, Богдан О П, Климочкин Ю Н, Стоцкая Л Л., Кренцель Б А. Тарлецкова Т Ю Применение каркасных соединений для конструирования макромо-лекулярных терапевтических средств против вируса СПИД//там же, с. 149.

11. Stotskaya L.L, Serbin AV, Buknnskaya AG, Bogdan OP, Alimova IV Anti-AIDS Macromolecular Therapeutic Systems based on Non-toxic Biological Active Polymers and Membranotropic Polycyclic Substances // Abstr Iя Int Conf on AIDS, Cancer and Hum Retroviruses. St-Petersburg, 1992, p 60.

12. Buknnskaya A G, Serbin A V, Bogdan O.P, Stotskaya L L, Klimochkin Yu N Adamanta-ne Analogues Block Early Steps of Hftr Infection //Antiviral Res 1993, v 20, Nl,p 63

13. Stotskaya LL, Serbin AV Antiviral Macromolecular Therapeutic Systems (MIS) Principles and Methods ofDesign// Antiviral Res 1993 v 20, Nl,p 184

14. Stotskaya L L, Serbin А/V/, Munshi К, Bogdan О P, Buknnskaya A G, Alimova IV Some new aspects ofHW-l inhibition by membranotropic polymeric substances // Abstr 2nd Int Conf "AIDS, Cancer and Hum Retroviruses" St-Petersburg, 1993, p 38-39

* Всего no теме работы более 100 публикаций

15. Иорданская Л И Стоцкая Л Л. Улогова Ю В Сербии Л В Крснцель Б А, Старшинова И В, Щитков К Г, Русаков И Г. Чиссов В И. Козлов А М, Сухин Г" М. I [ечерских Е В, Саранцева О С. Нагочин Ю В, Резник Л В. Воронина 3 Д Комплексное соединение цис-диаминоплатины (II) с сополимером Na-соли малеиновой кислоты и фурана, обладающее иммуностимулирующей и противоопухолевой активностью, с широким интервалом терапевтических доз при низкой нефротоксичности // Пат 2033998 РФ, 1995 "

16. Serbin А V, Stotskaya L L, Alymova IV, Natochm Yu V , Bukrinskaya Д G Study of new anti-HIV adamantane containing drugs // Abstr 3rd Int Conf "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, 1995, p 72-73

17. Stotskaya LL, Serbin AV, Munchi K, Kozeletskaya KN, Natochin YuV Antiviral efficiency of new adamantane containing polymeric drugs // Abstr 3ri Int Symp on Polymers for advanced technologies Pisa, Italy, 1995, p 277

18. Стоцкая JIЛ , Сербии А В, Мунши К, Козелецкая К Н, Сомнина А А, Киселев О И, Зайцева К В, Наточин Ю В Эффективность новых адамантансодержащих полимерных соединений против вируса гриппа и их влияние на мембранный транспорт ионов // Хим -фарм. ж, 1995, т 29, N 3, с 19-21

19. Лебедев Б В. Кулагина Т Г, Васильев В Г, Стоцкая Л Л. Сербии AB, Кренцель Б А Термодинамика чередующегося сополимера фурана с малеиновым ангидридом в области 0-420 К'//Высокомол соед 1996, т 38А,№5,с 772-778

20. Stotskaya L L, Serbin А V, Munshi К, Bukrinskaya A G New anti-HIV agents based on polymeric adamantane derivatives /'Abstr Xth Int Virology Congr Jerusalem. Israel 1996, p 123

21. Munshi К, Stotskaya L L, Serbin A V, Kozeletskaya К N A few macromolecular approaches to overcome viral drug resistance // там же, p 154

22. Serbin AV, Stotskaya L L, Bannsky IF, Gnbencha S V Amplified anti-viral vaccine effects of newly synthesizedpolycarboxylates //там же, p 212

23. Стоцкая Л Л, Сербии AB, Мунши К., Баринский И Ф, I рибенча С.В. Иммуноопосре-дованное защитное действие новых адамантансодержащих полимеров против опасных нейровирусных инфекций //IV Росс нац конгр "Человек и лекарство" Москва 1997, с 296

24. Сербии AB. Стоцкая ЛЛ, Баринский ИФ, Грибенча С.В Усиление действия противовирусных вакцин иалотоксичными полимерами поликарбоксилатного типа // -там же, с 205

25. Serbin А V , Stotskaya L L. Alymova IV, Bukrinskaya A G Adamantane containing anti-HIV drugs macromolecular design - bioactivity correlation // Russian J of HIV/AIDS and Related Problems St Petersburg 1997, p. 273-274

26. Serbin A V, Stotskaya L L, Munshy К, Kozeletskaya К N Anti-HIV and anti-Influenza activity of polymeric adamantane derivative drugs J/ Russian J of HTV/AIDS and Related Problems. St Petersburg. 1997, p 275-276

27. Serbin A V , Stotskaya L L, Ermakov I V , Bukrinskaya A G. Polymeric approaches to overcome virus drug resistance // Abstr 4th Int Symp on Polymers for Advanced Technologies, ' Leipzig Germany 1997, p 23

28. Munshi К , Stotskaya L L, Serbin A V, Bukrinskaya A G, Kozeletskaya К N Newly synthesized membranetropic polymers inhibitors of influenza and HIV-I replication // Abstr 4th , Int Symp on Polymers for Advanced Technologies, Leipzig Germany 1997, p 16

29. Serbin A V , Stotskaya L L. Bannsky I F, Gnbencha S V Polycarboxilic adjuvants for antiviral vaccines development // Abstr 4th Int Symp on Polymers for Advanced Technologies, Leipzig Germany 1997, p 22

30. Serbin A V New anti-viral drug design for ecological security of people // Ecological Congress International J, 1997, v 1. N 2, p 31 -34

31. Serbin A V . Stotskaya L L К N Kozeletskaya, Yu V Natochin. A G Bukrinskaya -

Polymeric adamantane compounds as new antiviral drugs // 2nd World Meeting on Pharmaceutics Biopharmaceutics Pharmaceutical Tecnology Pans 1998, Proceedings, p 1177-1178

32. Bouknnskaia A G, Serbin A V . Bogdan О P, Stotskaya L L, Alymova I V, Klimochkin YuN Polymeric Adamantane Analogues //Pat US005880154A USA, 1999

33. Bourcteine M E, Serbin A V, Khakhulma T V , Kasyan LI, Kasyan А О, Bouknnskaya A G Newly developed polyamomc derivative of norbornene inhibits HIV-I replication // Antiviral Res 1999, v 41,N2,p 45

34. Serbin A V, Kasyan L I, Bourcteine M E, Bouknnskaya A G Norbornene containing anti-virals synthesis and evaluation of polyamomc derivatives // Antivir Res, 1999, v 41, N 2, p 46

35. Serbin A V, Stotskaya L L, Klimochkin Yu N, Barinsky IF, Bouknnskaya A G, Kozelet-skaya К N Adamantane containing antivirals comparative study of the known drugs and newly developed polyamomc derivatives //Antiviral Res, 1999, v. 41, N 2, p. 70

36. Burstein M E, Serbin A V, Khakhuhna T V, Alymova I.V, Stotskaya L, Bogdan О P, Manukchina E E, Sharova N К, Bukrinskaya A G. Inhibition of HIV-1 replication by newly developed adamantane-containing polyamomc agents // Antiviral Res 1999, v 41, N 3, p. 135-144

37. Serbin A V, Stotskaya L L, Bukrinskaya A G, Kozeletskaya KN Advances in Anti-Viral Vaccine Adjuvants for Designing an Anti-HIV Preventive Agent // Russian J of HIV/AIDS and Related Problems. St Petersburg. 1999, v. 3, № 1, p 163-164.

38. Serbin A V , Bourchteine M E, Kasyan L.I, Khahuhna T, Kasyan A O., Bukrinskaya AG New anti-HIV agents based on polyamomc derivatives of norbornene // Abstr XIth Int Congress of Virology, Sydney, Australia, 1999, p 309

39. Serbin A V, Klimochkin YuN, Stotskaya LL, Kozeletskaya KN, Bukrinskaya AG From anti-influenza to anti-HIV drug design polyamomc derivatives of adamantane // Abstr XIth Int Congress of Virology, Sydney, Australia, 1999, p 310

40. Козелецкая К H, Медведева Н А , Стоцкая Л Л, Сербии А В. Принцип разработки антивирусных препаратов, препятствующих развитию резистентности // Тез докл. Науч. Конф с междунар участием «Вирусные инфекции на пороге XXI века- эпидемиология и профилактика», Санкт-Петербург, 1999, с 254-255.

41. Сербии А В , Стоцкая Л Л, Букринская А Г, Бурштейн М Е, Карамов Э В, Козелецкая К Н Усиление и расширение диапазона вирус-специфической активности лекарственных соединений //VII Росс нац конгр «Человек и лекарство» Москва, 2000, с 544

42. Bourchteine М, Serbin А V, Khakhulma Т, Bukrinskaya A Different adamantane derivatives inhibit HIV-I replication in vitro//Antiviral Res 2000, v 46, N1, p 44

43. Перминова H Г. Тимофеев И В, Сербии А В . Касьян Л И., Букринская А Г Молекулярная ловушка как подход к снижению вирусной нагрузки ВИЧ 1/2 у бопьных СПИД //Русский ж ВИЧ/СПИД и родственные проблемы 2000, т. 4. № 1, с 34.

44. Perminova N G., Timofeyev I V, Serbin A V. A strategy to development of therapeutic autologous HIV-1/2 vaccine // tot. Conf "Problems of Biological and Ecological Safety'", Obolensk, 2000, Proceedings, p 340-343

45. Serbin AV. Klimochkin YuN, Boukrinskaya AG, Stotskaya LL. Kasyan LI, Kozeletskaya К N Polymeric redesign of adamantane, norbornane and azidothymidine related antiviral drugs //Antiviral Res. 2002, v. 53, N 3, p. 50.

46. Тимофеев И В, Бакулина А Ю., Тимофеев Д И, Киселева Я Ю, Перминова Н Г Биотехнологические аспекты анализа функции хемокинового рецептора CCR5, его пространственной организации и роли в паю1енезс ВИЧ-инфекции Биотехнология, 2002, №4, с 15-31

47. Serbin А V, Alikhanova О L, Bourstaine М Е, Bukrinskaya A G Gag proteins of HIV-1 as therapeutic targets at early and late stages of the virus replication // Russian J HTV/AIDS and Related Problems St Petersburg 2002, v. 6, № 1, p 167

48. Serbin Л V, Grebinik T S . Kasyan LI. Alikhanova О L. Kozeletskaya К N, Bourstain M , Bukrmskaya A G, Timofeev I V , Perminova N G Polymer-associated synthetic analogs of bicyclic terpenoids as a novel generation for antivirals // Abstr Iя FEMS Congr of European Microbiologists, 2003, Ljubljana. Slovenia, p 484

49. Serbin A V, Alikhanova О L. Timofeev I V, Perminova N G, Karbyshev N, Bakunina A From natural Jusion co-receptors toward synthetic inhibitors of the HIV-1 replication // Abstr Iя FEMS Congress of European Microbiologists, 2003, Ljubljana, Slovenia, p 483-484

50. Тимофеев Д И, Перминова H Г, Сербии А В, Киселева Я Ю, Неклюдов В В , В ахолии Г Ю, Касьян Л И , Гребиник I С, Тимофеев И В ВИЧ-ингибирующая активность поликарбоксилатных матриц и соединений на их основе, содержащих адамантановые и норборненовые фармакофоры //Антибиотики и химиотер 2003, т 48, №5, с 7-15

51. Козелецкая К 11, Стоцкая JI J1, Сербии А В, Мунши К, Соминина А А , Киселев О И Структура и антивирусная активность адамантансодержащих препаратов // Вопр вирусологии, 2003, № 5, с 19-26

52. Тимофеев Д И, Перминова Н Г, Сербии А В, Тимофеев И В Мембранотропные соединения и препараты, воздействующие на ранние стадии ВИЧ-инфекции // Антибиотики и химиотер, 2003, т 48, № 2, с 29-41

53. Тимофеев И В, Сербии А В, Тимофеев Д И, Бакулина А Ю., Киселева Я Ю, 11ерми-нова Н Г Анализ структурно-функциональной организации хемокинового рецептора СХС-R4 и поиск новых подходов к терапии ВИЧ-инфекции ^Биотехнология, 2003, № 4, с 3-21

54. Serbin А V, Alikhanova О L, Timofeev IV, Perminova N G , Bourstain M Y, Bukrmskaya AG An approach to development of anti-HIV agents with double antiviral protection //Antiviral Res 2003, v 57, N3, p 50

55. Перминова H Г, Тимофеев Д И, Плясунова О А, Киселева Я Ю, Карпышев Н Н, Ватолин Г Ю, Неклюдов В В, Бакулина А Ю, Тимофеев И В Экспериментальная оценка анти-ВИЧ эффективности комплексных мембранотропных соединений с включением пептидных псевдолигандов// Биотехнология, 2003, № 5, с 26-36

56. Serbin А V , Timofeyev I V , Alikhanova О L , Perminova N G , Semerikov V N., Karpyshev N N , Ermakov I V , Timofeyev D I., Grebinic T S , Bakulina A Yu , Margolis L , Kiseleva Ya Yu Synthetic polymeric antagonists for receptors of IIIV-1 entry into human cells II Antiviral Res 2004, v 62, N 2, p 35

57. Timofeyev I, Serbin A V , Timofeyev D , Plyasunova О . Karpyshev N , Varaksin N , Ryabicheva T , Nekludov V Kiseleva Y , Perminova N Design of anti-HIV microbicides with inclusion of pharmacophore modifiers and pseudoligands // Int Conf Microbicides 2004, London, 2004, Abstr p 92

58. Сербии А В , Семериков В H , Стоцкая JI JI, Букринская А Г , Бурштейн М IO , Козелецкая К Н , Климочкин Ю Н , Касьян Л И , Тимофеев И В , Перминова Н.Г Макромолекулярные терапевтические системы комбинированного противовирусного действия III Всеросс Каргинская конф. «Полимеры - 2004», Москва, 2004, Тез т 2, с 146

59. Букринская А Г, Бурштейн М Е, Алиханова О Л, Ермаков И В , Касьян Л И, Касьян А О. Сербии А В , Тарабара И11 Ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека на основе почианионных производных норборнана и способ их получения //Заявка на патент РФ or 23 08 2004 № 2004 125 523

60. Киселева ЯЮ.1 (ерминова Н Г. Плясунова О А . Тимофеев Д И, Сербии А В . Касьян Л И, Егоров Ю А, Гребиник Т С. Тимофеев И В Противовирусная активность мембранотропных соединений, модифицированных адамантановыми и норборненовыми фарма-кофорами в отношении различных штаммов ВИЧ-1 II Молек генетика, микробиология и вирусология 2005, № 1, в печати

Список сокращений

ВМС и НМС - соответственно' высоко- и низкомолекулярные соединения,

ММ - молекулярная масса,

AS - анионогенная полимерная система,

AZT - азидотимидин

IS - индекс селективности (соотношение биоактивности и токсичности), PF - фармакофор (структура, имеющая потенциал биологической активности), SAR - соотношение «стрктура - активность» как объект научного анализа Вирусы:

ВБ - бешенства,

ВВС - везикулярного стоматита,

ВВЭЛ - восточного энцефаломиелита лошадей,

ВГР - гриппа,

ВГП - герпеса,

ВИЧ - иммунодефици La человека,

ВКЭ - клещевого энцефалита,

ВКГЛ - крымской гемморрагической лихорадки,

ВПГ - парагриппа.

27184

РНБ Русский фонд

2006-4 796

Принято к исполнению 22/12/2004 Заказ № 527

Исполнено 23/12/2004 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т. 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autoreferat ru

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: вирусы как продукт природной химии ВМС и химия ВМС как закономерный инструмент создания противовирусных средств)

1.1. Макромолекулярные основы жизненного цикла вирусов.

1.2. Биополимерные аспекты противовирусного иммунитета.

1.3. Низкомолекулярные противовирусные агенты и современные проблемы противовирусной терапии

1.4. О применении ВМС в сфере создания противовирусных агентов

1.5. Проблемы, перспективы и задачи

Глава II. МОЛЕКУЛЯРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СТРАТЕГИЯ

СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СИСТЕМ НА

ПОЛИМЕРНОЙ ОСНОВЕ.

11.1. Стратегические приоритеты и молекулярные инструменты

11.2. Прогноз химических структур для создания искусственных ВМС-систем комбинированной противовирусной защиты

11.2.1. Медиаторы косвенного воздействия на вирусы

11.2.2. Молекулярные мишени для прямого терапевтического вмешательства

11.2.3. Макромолекулярные аспекты конструирования анти-ВИЧ агентов

Глава III. АНИОННЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НОСИТЕЛИ

ПРОТИВОВИРУСНЫХ ФУНКЦИЙ

111.1. Полимерные структуры, синтез и особенности управления макромолекулярными параметрами

III. 1.1. Критерии отбора.

III. 1.2. Синтетические полимерные аналоги янтарной кислоты

III. 1.3. Полианионы на основе природных полисахаридов

III. 1.4. Модуляция анионогенной активности полимеров

111.2. Исследование структурно-управляемых биофункциональных свойств 140 анионных ВМС

111.2.1. Токсикологическая безопасность

111.2.2. Иммуномодулирующая противовирусная активность

111.2.3. Прямая противовирусная активность

III.3. Выбор «базовых» полианионных матриц для создания ВМС-систем комбинированного противовирусного действия

Глава IV. ПОЛИМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ, СО СТРУКТУРНО УСИЛЕННЫМИ

АДРЕСНЫМИ ПРОТИВОВИРУСНЫМИ ФУНКЦИЯМИ

IV.1. Формы и методы синтеза

IV. 1.1. Основные подходы к инкорпорации фармакофоров в макромолекулярные системы базовых полианионов

IV. 1.2. Введение фармакофоров на стадии полимеризации 154 IV. 1.3. Введение фармакофоров на стадии полимераналогичной модификации

IV.2. Продукты синтеза «бинарных» систем «Полианион-фармакофор»

IV.2.1. Общая структурная формула и сводная таблица синтезированных систем

IV.2.2. Адамантан- содержащие полианионные системы

IV.2.3. Норборнан- и норборнен- содержащие поланионные системы

IV.2.4. Циклоалкан- и фенил- содержащие полианионные системы

IV.2.5. Полиметилен- и холестерин- содержащие полианионные системы

IV.2.6. Азидотимидин- содержащие полианионные системы

IV.3. Имитаторы ВИЧ-специфических рецепторов клеток человека

IV.3.1. Анализ структурно-функциональной организации природных

ВМС - рецепторов CCR5 и CXCR4 184 IV.3.2. Принципы структурно-функционального конструирования синтетических полимерных имитаторов ВИЧ- восприимчивых рецепторов

IV.3.3. Продукты синтеза рецептор-имитационных полимерных систем

Глава V. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ «СТРУКТУРА

АКТИВНОСТЬ» ФАРМАКОФОР-МОДИФИЦИРОВАННЫХ

ПОЛИАНИОННЫХ СИСТЕМ

V.I. Общие закономерности модуляции биофункциональных свойств на уровне разработанных ВМС-систем

V. 1.1. Токсикологическая безопасность 194 V.I.2. Модуляция противовирусного потенциала полианионов 198 V.1.3. Модуляция противовирусного потенциала фармакофоров 199 V.I.4. Расширение диапазона защиты от различных вирусов и синергизм действия

V.2. Многоуровневая комбинированная защита от ВИЧ

V.2.I. Мембранотропные полианионные системы, содержащие фармакофоры каркасной структуры и их моноциклические аналоги

V.2.2. «Raft» - акцентированные мембранотропные системы

V.2.3. Имитаторы ВИЧ-специфических рецепторов клеток человека

V.3. К вопросу о предотвращении лекарственной резистентности вирусов

Глава VI. МУЛЬТИКОМБИНИРОВАННЫЕ

ИНТРА- И ИНТЕР- ПОЛИМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ

VI. 1. Интер-полимерный синергизм и антагонизм биологического действия полимерных систем в режиме вариации структуры фармакофора

VI.2. Интра-полимерные системы кооперации различных групп противовирусных фармакофоров

VI.3. Интер-полимерные комплексы и иные надмолекулярные системы

VI.3.1. Интерполимерные комплексы

VI.3.2. Гидрогели

VI.3.3. Микрочастицы

VI.3.4. Липосомы

Актуальность и состояние проблемы

Рост и интенсификация жизнедеятельности человека в экологической системе планеты порождает встречную эволюцию вирусов, специализированных на эксплуатации биоресурсов человеческого организма [1]. Уже сегодня известно не менее 1500 вирусных генотипов, способных поражать клетки человека, приводя к различным заболеваниям, включая энцефалиты, гепатит, раковые опухоли, СПИД. Природный иммунитет проигрывает вирусам в эволюционном соревновании, а значит, возникает актуальная необходимость искусственного вмешательства, которое, на наш взгляд, неразрывно связано с целенаправленным развитием соответствующих разделов науки о полимерах медицинского назначения.

Анализ известных научных данных (глава Г) показывает, что молекулярный фундамент вирусных частиц, их паразитической интеграции в клетки и естественных иммунных реакций составляют биополимерные формы ВМС. В то же время традиционные подходы к созданию противовирусных препаратов основаны на химии низкомолекулярных соединений (НМС). Это несоответствие закономерно становится объективным препятствием полноценному развитию медицинской практики в данной области охраны здоровья и жизни человека.

Физико-химическая основа недостаточной эффективности НМС - ограниченность потенциала молекулярного воздействия «малых» молекул на вирусные ВМС узкими рамками соразмерно «малых» - точечных (локально-специфичных) взаимодействий. При этом вирусы, как мобильные генетические паразиты, способны к быстрым мутационным изменениям химических структур, подпадающих под точечную блокаду, и легко выходят из-под контроля таких препаратов. Поэтому применение НМС-лекарств сопровождается формированием вирусных мутантов, невосприимчивых к традиционным лекарственным средствам [1-3]. На практике цена вопроса только по линии ВИЧ/СПИД за четверть века его истории достигает сотни миллионов человеческих жизней.

Все более очевидной становится востребованность новых подходов к созданию высокоэффективных противовирусных препаратов с целенаправленным использова-ниием достижений современной химии ВМС [2]. К моменту постановки диссертационной работы (1980-е годы) это направление только набирало силу, и к настоящему времени можно отметить ряд успехов в области создания ВМС-микробицидов, полиэлектролитных иммуноадъювантов и синтетических вакцин {раздел 1.4). Однако в целом исследования ВМС противовирусного назначения все еще далеки от системного теоретического анализа и эффективного практического развития. В центре проблемы, на наш взгляд, - разрозненность узко-специализированных поисковых направлений, при объективной неспособности каждого отдельно взятого направления полноценно решить важнейшую задачу - предотвращения мутационной адаптации вирусов. Цель и задачи диссертационного исследования

Ключевая идея диссертационной работы заключается в кооперации различных потенциальных возможностей химии ВМС в целях создания адекватных вирусной угрозе принципиально новых макромолекулярных систем расширенного диапазона эффективной противовирусной защиты: 1) в ряду огромного разнообразия вирусных патогенов - с возможностью блокады не одного вида вирусов, а, по крайней мере, нескольких опасных разновидностей; 2) в системе координат жизненного цикла конкретного вируса - с возможностью блокады не одной молекулярной мишени а, нескольких - критических в цепи инфекционно-молекулярных событий. Речь идет о развитии принципов и методов молекулярного конструирования полимерных систем комбинированного противовирусного действия. Не менее актуальна и биоселективность создаваемых ВМС с точки зрения избирательного достижения противовирусной защиты при эффективных концентрациях (ЕС), существенно меньших, чем концентрации токсикологического риска (ТС). В итоге планировалось создание противовирусных ВМС с индексом селективности IS = ТС/ЕС - 30, - перспективных для продвижения в клиническую практику.

Таким образом, целью диссертационной работы является развитие молекулярно-функциональной стратегии и методов полимерного синтеза нового поколения высокоэффективных ВМС-систем, обладающих расширенным диапазоном комбинированного воздействия на вирус-специфические мишени при минимальном уровне токсичности.

В задачи исследования входило: 1. Анализ молекулярной организации вирусов человека (в первую очередь - ВИЧ) и вирус-специфических процессов на уровне природных ВМС для выявления причин недостаточной эффективности естественных (иммунных) и известных искусственных механизмов противовирусной защиты.

2. Теоретический прогноз рабочих структурно-функциональных моделей для создания искусственных ВМС-систем адекватной противовирусной защиты.

3. Разработка полимерных матриц, обладающих собственным потенциалом противовирусной защиты и оптимизация их параметров;

4. Проектирование и синтез биоселективных полимерных систем комбинированного противовирусного действия, сочетающих активность полимерных матриц с вирус-ингибирующими функциями НМС-фармакофоров различной химической природы, строения и специфичности.

5. Выявление закономерностей «структура - активность», анализ биофункциональной эффективности альтернативных схем интра- и интер-полимерной кооперации химических носителей вирус-ингибирующих функций, разработка критериев оптимизации целевых свойств и создание опытных образцов, перспективных для продвижения в клиническую практику.

Научная новизна.

Цели и задачи диссертационного исследования предполагали по существу разработку нового научного направления и создание принципиально новых полимерных продуктов с уникально широким спектром регулируемых противовирусных функций.

Предложена макромолекулярная стратегия, и разработаны конкретные формы и методы целенаправленного синтеза (глава II) многофункциональных ВМС-систем, в которых преимущества полиэлектролитного состояния вещества (как активного фактора имму но стимуляции) оптимизированы по параметрам структура -активность - безопасность (глава III) и соединены с дополнительной биоселективной активностью специализированных химических структур (фармакофоров), обретающих мощный потенциал адресного вирус-блокирующего действия в условиях разработанных нами схем оптимально организованной интра- и интерполимерной химической кооперации (главы IV-VII).

В отличие от доминирующих молекулярных подходов к химиотерапевтической блокаде вирусов внутри уже инфицированной клетки, когда неизбежен эффект «терапевтического запаздывания», избрана молекулярная стратегия «опережающего действия». В качестве ключевого приоритета выбраны ВМС-системы мембранотроп-ного типа и синтетические имитаторы природных вирус-восприимчивых рецепторов клеточных мембран, позволяющие блокировать инфекционный процесс на самых начальных этапах - проникновения вирусов в клетки.

Решен ряд ранее недостаточно исследованных частных вопросов классической химии ВМС, включая: особенности участия малеинового ангидрида в конкурирующих реакциях радикальной полимеризации (роста, передачи цепи), диен-диенофильного присоединения; обрыва цепи на аддукты Дильса-Альдера; частные аспекты регулирования структуры и степени полимеризации полимерных аналогов янтарного ангидрида и янтарной кислоты; реакционной активности полимерных ангидридов, конкурентных реакций их гидролиза, аминолиза и алкоголиза и др., а также системное исследование ранее неизвестных закономерностей и целенаправленная оптимизация комплекса параметров «структура - биофункциональная активность».

В итоге создано новое поколение биоселективных полимерных систем с уникально широким комплексом химически регулируемых противовирусных функций: 1) иммуномодуляции, 2) ингибирования вирусной адсорбции, 3) мембрано-протекторной блокады вирусной фузии и 4) рецептор-имитационного вмешательства в жизненный цикл вирусов. Новые ВМС продукты отличаются широким спектром противовирусной защиты, повышенной эффективностью и предотвращают формирование лекарственно-резистентных вирусных мутантов.

Авторские приоритеты диссертанта в данной области подтверждены пионерскими публикациями в ведущих отечественных и зарубежных журналах, российскими и международными патентами.

Работы выполнены в ходе плановых исследований Института нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН, а также плановых и инициативных исследований ИЦ биомодуляторов и лекарственных соединений НИФ Здоровья в сотрудничестве с Самарским ГУ (проф. Климочкин Ю.Н. и сотр.), Днепропетровским национальным университетом Украины (проф. Касьян Л.И. и сотр.), ведущими медико-биологическими и вирусологическими центрами России: НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва (проф. Ершов Ф.И., Носик Н.Н. и сотр., проф. Баринский И.Ф. и сотр., проф. Букринская А.Г. и сотр., д.м.н. Карамов Э.В. и сотр), НИИ Гриппа РАМН, Санкт-Петербург (д.м.н. Козелецкая К.Н. и др.), ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове, Новосибирской обл. (к.м.н. Тимофеев И.В., Перминова Н.Г. и сотр.); Бельгии: Rega Inst, for Med. Research, Leuven, (prof. E. De Clercq и сотр.); США: Univ. of Nebraska Med. Center

Omaha, and Univ. of Massachusetts Med. School, Program in Molecular Medicine, Worchester (prof. M. Stevenson и сотр.), National Inst, of Child Health and Human Development, NIH, Bethesda (Dr. L. Margolis и сотр.) и др. Часть исследований выполнена при поддержке МНТЦ/ВТЕР (США) - партнерский Проект 2175р.(2001 - 2005 гг.). Основные положения, выносимые на защиту

1. Макромолекулярное конструирование ВМС, обладающих комплексом свойств комбинированной противовирусной защиты при минимальной токсичности (на уровне биоселекгивности IS > 30).

2. Исследование противовирусного потенциала природных полисахаридов и синтетических полимерных аналогов янтарной кислоты в зависимости от их структуры и макромолекулярных параметров.

3. Исследование особенностей частных механизмов радикальной сополимеризации малеинового ангидрида (включая процессы, осложненные реакцией Дильса-Альдера) в целях регулирования ММ продуктов.

4. Исследование последовательных и конкурирующих реакций алкоголиза, аминолиза и гидролиза сополимеров малеинового ангидрида в целях управляемой модификации фармакофорными реагентами различной структуры и термолабильности.

5. Разработка рациональных схем синтеза и синтез бифункциональных макромолекулярных систем (AS.PF) на основе анионных ВМС (AS) и фармакофоров (PF) потенциально противовирусного действия в ряду: трициклических каркасных производных адамантана; синтетических аналогов бицикл ических каркасных терпеноидов; полициклических каркасных соединений более сложного строения; полициклических некаркасных структур на основе холестерина; моноциклических некаркасных углеводородов; ациклических липофильных углеводородов; производных азидотимидина;

6. Макромолекулярное конструирование и синтез полимерных имитаторов естественных клеточных рецепторов ВИЧ, в целях защиты клеток человека от инфицирования вирусными штаммами различной рецепторной специфичности.

7. Создание и исследование мультифункциональных противовирусных систем на основе интра- и интерполимерных комбинаций вышеперечисленных типов ВМС. Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на всесоюзных, российских и международных конференциях, в частности: "Синтетические полимеры мед. назначения" (Киев, 1989; Звенигород, 1991), по полимерам для передовых технологий (Пиза, Италия, 1995; Лейпциг, Германия 1997); по фарм. технологии (Париж, Франция, 1998); "Человек и лекарство" (Москва, 1996, 1997, 1998, 2000); по ВИЧ, СПИДу, раку и родственным проблемам (Санкт-Петербург: 1992, 1993, 1995, 1997, 1999, 2000, 2002; Женева, Швейцария, 1999; Тампере, Финляндия, 1999, Тулон, Франция, 1999); Международного и европейского обществ микробиологов (Иерусалим, Израиль, 1996; Сидней, Австралия 1999; Любляна, Словения, 2003); Международного общества противовирусных исследований (Венеция, Италия, 1993; Иерусалим, Израиль, 1999; Балтимор, США, 2000; Прага, Чехословакия, 2002; Саванна, США, 2003; Тусон, США 2004); Микробициды 2004 (Лондон, Великобритания); и др. (более 80 докладов). Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 333 стр. машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения и списка цитируемой литературы (546 наименований). Диссертация иллюстрирована 52 рисунками, содержит 37 таблиц.

100% защиты in vitro) против различных изолятов вируса, выделенных из крови ВИЧ-инфицированных пациентов, лабораторных штаммов и AZT-резистентных мутантов, подтверждена в ведущих вирусологических центрах России [НИИ вирусологии; ГНЦ ВБ «Вектор»], Европы [Rega Institute] и США [NIH]. Индекс анти-ВИЧ специфической биоселективности оптимизированных опытных образцов (норборнен- и олигопептид- модифицированных полианинов и ряда их межполимерных комплексов) достигает (10 - 20)103, открывая широкий «коридор» для продвижения в реальную клиническую практику. В настоящее время более 30 оригинальных субстанций исследованы в качестве активной основы для создания эффективных средств лечебно-профилактической защиты от СПИДа на базе НИИ вирусологии РАМН (Москва), ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово) при поддержке МНТЦ (Москва) и Министерства Здравоохранения США. Ряд опытных образцов лекарственных форм успешно прошел предварительные этапы доклинических испытаний и запланирован к клинической апробации [509,545,546]. ВЫВОДЫ:

1. На основе изучения макромолекулярной организации вирусов, биополимерных механизмов вирусной восприимчивости клеток и иммунной защиты, а также системного анализа химических аспектов терапии вирусных заболеваний разработана молекулярно-функциональная стратегия создания противовирусных ВМС нового поколения, удовлетворяющих трем ключевым критериям:

- Комбинированное (многоуровневое) противовирусное действие;

- Превентивная терапевтическая защита клеточных мембран;

- Биоселективность (защита при минимальной токсичности).

2. Осуществлено молекулярное конструирование и целенаправленный синтез фармакофор-модифицированных полианионных систем, сочетающих в себе химически регулируемый комплекс биологических функций:

- полиэлектролит-специфической активации иммунитета;

- полиэлектростатической дезактивации (дезориентации) вирионов;

- полимер-кооперативного усиления потенциала фармакофоров;

- псевдорецепторного вмешательства в жизненный цикл вирусов;

- полимер-специфического снижения остротоксических эффектов.

3. Проведены сравнительные исследования противовирусного потенциала анионо-генных полисахаридов и синтетических полимерных аналогов янтарной кислоты в зависимости от их структуры и макромолекулярных параметров. Разработаны малотоксичные иммуностимуляторы, способные к индукции интерферона, активации антителообразования, клеточного иммунитета и эффективные в защите от летальных доз ряда опасных нейровирусов. Изучены структурно-функциональные закономерности подавления полимерными анионами адсорбции ВИЧ на поверхности клеток.

4. В ряду полимерных объектов п. 3 выделены оптимальные варианты «базовых» полианионных матриц, перспективные в качестве платформ макромолекулярного синтеза более сложных систем комбинированного типа и выполнены необходимые специализированные исследования:

- особенностей радикальной чередующейся сополимеризации малеинового ангидрида с «фураногенными» сомономерами в целях регулирования структуры, степени полимеризации и чистоты продуктов;

- особенностей аминолиза и алкоголиза полимерных ангидридов в целях реализации управляемых процессов химической инкорпорации окси- и амино-производных фармакофоров в макромолекулярные системы.

5. Предложена молекулярная стратегия усиления и расширения диапазона противовирусного потенциала полимерных анионов дополнительными адресными функциями фармакофоров предпочтительно мембраноакцентированного действия -для «опережающей терапевтической блокады» самых ранних этапов проникновения вирусов в клетки через мембрану.

6. Разработаны схемы и методы функционально продуктивной химической кооперации фармакофоров с полианионными матрицами, включая:

- предварительную модификацию фармакофорных соединений в реакционно активные формы с заготовками «спейсерных» мостиков;

- химическую инкорпорацию полученных реагентов в полианионные макромолекулы 1) на стадии полимерного синтеза - в составе инициаторов радикальной полимеризации, мономерных производных малеинового ангидрида или элекронодонорных сомономеров; 2) на стадии полимераналогичных превращений - в составе амино-, окси-, карбокси- или сульфокси- реагентов.

7. Предложенная стратегия и схемы синтеза реализованы в конкретные химические структуры (более 250 опытных образцов) синтетических и природных полимерных анионов с включением фармакофорных структур различной природы и специфичности:

- трициклических каркасных соединений адамантанового ряда;

- синтетических аналогов бициклических каркасных терпеноидов;

- полициклических каркасных соединений более сложного строения;

- полициклических некаркасных структур на основе холестерина;

- моноциклических и ациклических липофильных углеводородов и

- производных азидотимидина.

8. Выявлены и изучены закономерности активации противовирусных функций и оптимизации биоселективности новых полимерных систем в зависимости от: степени полимеризации, жесткости цепи и анионогенной силы полимерной матрицы; природы, структуры и пространственной изомерии фармакофоров, степени фармакофорной модификации по отношению к анионогенным группам, подвижности и длины «спейсер- ных» мостиков и других молекулярно-химических параметров.

9. Впервые осуществлено молекулярное конструирование и синтез полимерных имитаторов естественных клеточных рецепторов ВИЧ - нового класса эффективных агентов защиты клеток человека от ВИЧ-инфицирования штаммами различной рецепторной специфичности.

10. Созданы и исследованы мультифункциональные интра- и интерполимерные комбинации вышеперечисленных ВМС, а также природных и синтетических полимеров, используемых в современной практике лекарственных форм. Высокая эффективность новых анти-ВИЧ агентов на уровне индекса биоселективности до 10 ООО и более с перспективой продвижения в клиническую практику профилактики и терапии СПИДа подтверждена в ведущих вирусологических центрах России, Европы и США.

11. На стыке химии ВМС, биохимии и молекулярной вирусологии создано новое научное направление - молекулярное проектирование и синтез биоселективных полимерных систем комбинированного противовирусного действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог выполненной работе, хотелось бы подчеркнуть, что настоящее исследование в целях создания нового поколения противовирусных средств было предпринято нами по специальности высокомолекулярные соединения не просто в ввиду возможностей расширения сферы прикладного применения химии ВМС, но исходя из анализа того фундаментального факта, что сами вирусы (особенно в форме внеклеточных вирионов), механизмы их проникновения в клетки и естественные механизмы иммунной защиты, являются продуктами природной химии биологических ВМС и реализуются по общим законам полимер-кооперированных макромолекулярных взаимодействий. Именно поэтому традиционные методы создания лекарственных соединений на базе НМС не в состоянии обеспечить полноценное решение задачи. Лишь химия ВМС способна восполнить недостающее звено в ряду средств защиты человека, адекватных вирусной угрозе.

Не случайно логика нашего продвижения к поставленной цели в качестве отправного момента опиралась на анализ биополимерных основ молекулярной организации вирусов, их паразитической интервенции в клетки раздел 1.1). Это давало ключ к выявлению и теоретическому прогнозу тех природных вирус-специфических полимерных объектов, которые могли бы стать мишенями терапевтического вмешательства с помощью создаваемых нами искусственных ВМС (глава II). Были рассмотрены также биополимерные аспекты природного иммунитета (раздел 1.2), имеющийся арсенал низкомолекулярных противовирусных препаратов (раздел 1.3) и современный задел химии ВМС в данной области, чтобы оценить задействованные для противовирусной защиты молекулярные ресурсы, понять причины их недостаточной эффективности и наметить перспективные пути дальнейшего развития проблемы.

Результатом целенаправленного теоретического анализа и прогноза стали:

I) выработка макромолекулярной стратегии создания биоселективных протвови-русных полимерных систем комбинированного противовирусного действия (глава

II); 2) создание базовой полимерной основы анионогенного типа (глава 111); 3) разработка форм и методов полимерного и полимераналогичного синтеза макромолекулярных систем, усиленных фармакофорами адресного вирус-специфического (мембранопротекторного и рецептор-имитационного) действия (главы IV);

4) выявление закономерностей «Структура - Биоактивность» (глава V); и 5) создание более сложных интра- и интер-полимерных систем многомерной кооперации химических носителей противовирусного потенциала с поиском форм их структурно-функциональной оптимизации для синергического усиления вирус-ингибирующего эффекта при минимальных токсикологических рисках (глава VI).

В итоге получены новые фундаментальные знания о возможностях и закономерностях формирования биологически активных функций средствами химии ВМС, имеющие важное значение для практического конструирования противовирусных агентов комбинированного действия с акцентированной блокадой самых ранних этапов инфекционного цикла.

Полученные знания реализованы в конкретных химических структурах (выполнен синтез порядка 250 новых соединений), целенаправленная оптимизация «структура - свойства» которых, позволила создать ряд новых генераций оригинальных полимерных и интерполимерных продуктов с уникально широким комплексом комбинированных противовирусных функций: 1) иммуностимуляции (в т.ч. индукции интерферона), 2) ингибирования вирусной адсорбции на клетках, 3) блокады фузии вирусных и клеточных мембран, 4) рецептор-имитационного вмешательства в жизненный цикл вирусов, 5) вирус-ингибирующего потенциала не только на входе вирионов в клетки, но и на завершающих этапах - выхода вирусного потомства из уже инфицированной клетки. Широкий диапазон и высокая эффективность противовирусной защиты новых полимерных систем экспериментально подтверждена 1) на клеточных культурах (in vitro): против вирусов гриппа, парагриппа, герпеса, иммунодефицита человека, 2) на подопытных животных (in vivo): против вирусов бешенства, везикулярного стоматита, восточного энцефаломиелита лошадей, крымской геморрагической лихорадки, клещевого энцефалита и др.

Особую ценность имеют результаты целенаправленного конструирования противовирусных систем, акцентированных на блокаду ВИЧ (инфекционного возбудителя СПИДа). В этом плане созданы принципиально новые противовирусные системы конкурентоспособные на мировом рынке биологически активных субстанций - кандидатов для создания средств профилактики и лечения ВИЧ-инфекции и СПИДа. Высокая эффективность новых анти-ВИЧ агентов (до

1. Букринская А.Г. Вирусология. // М.: Медицина. 1986,336 с.

2. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Вельская Н.А. Микробиология. // М. Медицина. 1987. 512 с.

3. Филдс Б., Найп Д. Вирусология // М.: Мир, 1989, т. 1, 495 с.

4. Прозоркина Н. В., Рубашкина Л. А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии //М.: Феникс. 2002,416 с

5. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и микробиологии. // М.: МИА. 2003, 232 с.

6. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия.//М.: Просвещение. 1987,815 с.

7. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. // М. Высш. шк. 1984,354 с.

8. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. СПИД. // М. Народная акад. культуры и общечелове-ческих ценностей. 1992,352 с.

9. Schwartz S., Felber В.К., Pavlakis G.N. Expression of human immunodeficiency virus type 1 vif and vpr mRNAs is Rev-dependent and regulated by splicing. // Virology. 1991, v. 183, N 2, p. 677-686.

10. HIV resistance and implication for therapy. // MediCom. Atlanta. 1998,69 p.

11. Bukovsky A.A., Dorfman Т., Weimann A., Gottlinger H.G. Nef association with human immunodeficiency virus type 1 virions and cleavage by the viral protease. // J. Virol. 1997. v.71, N2, p. 1013-1018.

12. Aiken C. Mechanistic independence of Nef and cyclophilin A enhancement of human immunodeficiency virus type 1 infectivity. // Virology. 1998, v.248, N 1, p. 139-147.

13. Muller W.E., Okamoto Т., Reuter P., Ugarkovic D., Schroder H.C. Functional characterization of

14. Автобиблиографические ссылки помечены звездочкой

15. Lu Y.L., Spearman P., Ratner L. Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R localization in infected cells and virions. // J. Virol. 1993, v. 67, N 11, p. 6542-6550.

16. Paxton W., Connor R.I., Landau N.R. Incorporation of Vpr into human immunodeficiency virus type 1 virions: requirement for the p6 region of gag and mutational analysis. И J. Virol. 1993, v. 67, N12, p. 7229-7237.

17. Jenkins Y., Pornillos O., Rich R.L., Myszka D.G., Sundquist W.I., Malim M.H. Biochemical analyses of the interactions between human immunodeficiency virus type 1 Vpr and p6(Gag). // J. Virol. 2001, v.75, N21, p. 10537-10542.

18. Chatteijee S., Basak S., Khan N.C. Morphogenesis of human immunodeficiency virus type 1. // Pathobiology. 1992, v. 60, N4, p. 181-186.

19. Nakai M., Goto T. infrastructure and morphogenesis of human immunodeficiency virus. // J. Electron. Microsc. (Tokyo). 1996, v. 45, N 4, p. 247-257.

20. Геннис P. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. // М. Мир. 1997.624 с.

21. Финеан Д., Колмэн Р., Мичелл Р. Мембраны и их функции в клетке. // М.: Мир. 1977. 199 с.

22. De Clercq Е. Strategies in the design of antiviral drugs. // Nature Reviews. Drug Discovery. 2002, v. 1, p. 13-25.

23. Рыбальченко B.K., Курский М.Д. Молекулярная организация и ферментативная активность биологических мембран. // Киев.: Наукова думка. 1977,211 с.

24. Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны. // М.: Наука. 1975,183 с.

25. Fransson LA in book Polysaccharides v.3, ed by G.O. Aspinall, Orlando, 1985, p. 337-415

26. Mummert M.E., Mummert D., Edelbaum D., Hui F., Matsue H., Takashima A. Synthesis and surface expression of hyaluronan by dendritic cells and its potential role in antigen presentation. // J. Immunol. 2002, v. 169, N 8, p. 4322-4331.

27. Dai G., Steede N.K., Landry S.J. Allocation of helper T-cell epitope immunodominance according to three-dimensional structure in the human immunodeficiency virus type I envelope glycoproteingpl20.II J. Biol. Chem. 2001, v. 276,N45,p. 41913-41920.

28. Kwang P.D., Wyatt R., Sattentau Q.J., Sodroski J., Hendrickson A. Oligomeric modeling and electrostatic analysis of the gp 120 envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus. //J. Virol. 2000, v. 74, N 4, p. 1961-1972.

29. Ohshiro Y., Murakami Т., Matsuda K., Nishioka K., Yoshida K., Yamamoto N. Role of cell surface glycosaminoglycans of human T cells in human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection. II Microbiol Immunol. 1996, v. 40, N 11, p. 827-835.

30. Ibrahim J., Griffin P., Coombe D.R., Rider C.C., James W. Cell-surface heparan sulfate facilitates human immunodeficiency virus Type 1 entry into some cell lines but not primarylymphocytes. // Virus Res. 1999, v. 60, N 2, p. 159-169.

31. Vella C, Smith M.H., Farrar G.H., Jones D.H., Daniels R.S. A molecular and serologic study of the envelope gene of the British isolate: HIV-1 GB8. // Vaccine. 1995, v. 13, N 8, p. 735-742.

32. Mori H., Otake Т., Oishi I., Kurimura T. Characterization of human immunodeficiency virus type 1 resistant to modified cyclodextrin sulphate (mCDS71) in vitro. // Antiviral Chemistry & Chemotherapy (International Medical Press). 1999, v. 10, p. 15-21.

33. Szekely Z. A new approach for an HIV docking-inhibitor drug designed on the basis of the dual recognition/binding hypothesis between the CD4 receptor and the envelope glycoprotein of the HIV. II J. Mol. Struct. (Theochem). 1995, v. 334, p. 95-100.

34. Wang J., Meijers R., Xiong Y., Liu J., Sakihama Т., Zhang R., Joachimiak A., Reinherz E.L. Crystal structure of the human CD4 N-terminal two-domain fragment complexed to a class II MHC molecule. II Immunology. 2001, v. 98, N 19, p. 10799-10804.

35. Li S., Saton Т., Korngold R., Huang Z. CD4 dimerization and oligomerization: implications for T-cell function and structure-based drug design. // Viewpoint Immunology Today. 1998, v. 19, N 10, p. 455-461.

36. Boussard C., Klimkait Т., Mahmood N., Pritchard M., Gilbert I.H. Design, synthesis and evaluation of potential inhibitors of HIV gpl20-CD4 interactions. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, v. 14, N 10, p. 2673-2676.

37. Hsu S.T., Bonvin A.M. Atomic insight into the CD4 binding-induced conformational changes in HIV-l gpl20. //Proteins. 2004, v. 55, N 3, p. 582-593.

38. Liu S., Fan S., Sun Z. Structural and functional characterization of the human CCR5 receptor in complex with HIV gpl20 envelope glycoprotein and CD4 receptor by molecular modeling studies. // J. Mol. Model. (Online). 2003, N 5, p. 329-336.

39. Hsu S.T., Peter C., van Gunsteren W.F., Bonvin A.M. Entropy calculation of HIV-l Env gpl20, its receptor CD4 and their complex: an analysis of configurational entropy changes upon complexation. // Biophys J. 2005, v. 88, N 1, p. 15-24.

40. Joost P., Methner A. Phylogenetic analysis of 277 human G-protein-coupled receptors as a toolfor the prediction of orphan receptor ligands. // Genome. Biol. 2002, v.3, N11, Research 0063; PMID: 12429062 PubMed indexed for MEDLINE.

41. Xiao X., Kinter A., Broder C.C., Dimitrov D.S. Interactions of CCR5 and CXCR4 with CD4 and gpl20 in human blood monocyte-derived dendritic cells. // Exp. Mol. Pathol. 2000, v. 68, N 3, p. 133-138.

42. Соловьев В.Д., Хесин Я.Е., Быковский А.Ф. Очерки по вирусной цитопатологии. // М.: Медицина. 1979,323 с.

43. Koshiba Т., Chan D.C. The prefusogenic intermediate of HIV-1 gp41 contains exposed C-peptide regions. II J. Biol. Chem. 2003, v. 278, N 9, p. 7573-7579.

44. Freed E.O. HIV-1 replication. Somat // Cell. Mol. Genet. 2001, v. 26, N 1-6, p. 13-33.

45. Петров P.B. Иммунология. // M.: Медицина. 1987,415 с.

46. Яршин А.А. Основы иммунологии. // М.: Медицина. 1999,608 с.

47. Галактионов В.Г. Иммунология. // М.: РИЦ МДК. 2000,488 с.

48. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. // М.: Мир. 2000. 592 с.

49. Фрейдлин И.С. Структура, функции и регуляция иммунной системы. // В сб. Иммунодефицитные состояния. Санкт-Петербург. «Фолиант». 2000. гл. 1, с. 17-90.

50. Yawalkar N., Brand C.U., Braathen L.R. GM-CSF mRNA and protein in human skin-derived lymph. II Arch. Dermatol. Res. 1996, v. 288, p. 637-640.

51. LenhofF Stig Granulopoietic growth factors: Cytokine and cellular regulation of GM-CSF and G-CSF production. // Dissertation Abstracts International 2001, v. 61, N02:0487.

52. Ping D. Structure-function studies of human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF, CSF-1). // Dissertation Abstracts International. 1997, v. 57, N 05:3140.

53. Kedzierska K., Rainbird M.A., Lopez A.F., Crowe S.M. Effect of GM-CSF on HIV-1 replication in monocytes / macrophages in vivo and in vitro: a review. // Veterinary Immunology and Immunopathology. 1998. v. 63, p. 111-121.

54. Nagata S., Tsuchiya M., Asano S., Yamamoto O., Hirata Y., Kubota N., Oheda M., Nomura H., Yamazaki T. The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor. // EMBOJ. 1986, v. 5, N 3, p. 575-581.

55. Henderson C.W. Single dose of GM-CSF may improve HBV vaccination efficacy. // Immunotherapy Weekly. 2000, p. 7-8.

56. Кетлинский C.A., Симбирцев A.C., Воробьев A.A. Эндогенные иммуномодуляторы. // М.: СПб Гиппократ. 1992,256 с.

57. Цыган В.Н. Роль апоптоза в регуляции иммунного ответа. // Актуальные проблемы иммунологии. Санкт-Петербург. Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова РАН. 2004, гл. 1., с. 3-32.

58. Wang, Н. М. The interleukin 2 receptor: Functional consequences of its biomolecular structure. // Dissertation Abstracts International. 1991, v. 51, N 05:2341.

59. Yanga J., Liua C.-Q. Molecular modeling on some human interleukins sharing gc of interleukin-2 receptor, and structure-function relationships. II J. Mol. Str. (Theochem). 2000, v. 532, p. 1-10.

60. Eizenberg O., Faber-Elman A., Lotan M., Schwartz M. Interleukin-2 transcripts in human and rodent brains: possible expression by astrocytes. II J. Neurochem. 1995, v.64, N 5, p. 1928-1936

61. Takamoto M., Sugane К. Synergism of IL-3, IL-5, and GM-CSF on eosinophil differentiation and its application for an assay of murine IL-5 as an eosinophil differentiation factor. // Immunol. Lett. 1995, v. 45, N 1-2, p. 43-46.

62. Snouwaert J. N. Structure-function analysis of human interleukin-6. // Dissertation Abstracts International. 1992, v. 52, N 07:3442.

63. Boulanger M. J., Chow D., Brevnova E.E., Garcia K.C. Hexameric structure and assembly of the interleukin-6/IL-6 alpha-receptor/gpl30 complex. IIScience. 2003, v. 300, N 5628, p. 2101.

64. Sumikawa H., Fukuhara K., Suzuki E., Matsuo Y., Nishikawa K. Tertiary structural models for human interleukin-6 and evaluation by a sequence-structure compatibility method and NMR experimental information. // FEBS Lett. 1997, v. 404, p. 234-240.

65. Holmes W.E., Lee J. Structure and functional expression of a human interleukin-8 receptor. // Science. 1991, v. 253, N5025, p. 1278-1280.

66. Heaton M.P., Chitko-McKown C.G., Grosse W. M., Keele J.W., Keen J.E., Laegreid W.W. Interleukin-8 haplotype structure from nucleotide sequence variation in commercial populations of U.S. beef cattle. // Mammalian Genome. 2001, v. 12, p. 219-226.

67. Biron Ch., Gazzinelly R. Effects of IL-12 on immune responses to microbial infections: a key mediator in regulating disease outcome. // Current Opinion in Immun. 1995, v. 7, p. 485-496.

68. Eisenmesser E.Z., Horita D.A., Byrd R.A. Secondary structure and backbone resonance assignments for human interleukin-13. II J. Biomol. NMR. 2001, v. 19, p. 93-94.

69. Isaacs A., Linderman J. Virus interference I. The Interferon. // Proc. Roy. Soc., Ser. B. 1957, v. 147, p. 256.

70. Ершов Ф.И., Новохатский A.C. Интерферон и его индукторы. // М.: Медицина, 1980

71. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. // М.: Медицина, 1998,192 с.

72. Immunobiology: The immune system in health and disease. Ed by Janeway C.A., Travers Jr, Travers P. // Garland Pub. London NY. 1996.

73. Hardy M.P., Owczarek C.M., Jermiin L.S., Ejdeback M., Hertzog P.J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. // Genomics. 2004, v. 84, N 2, p. 331345.

74. Derynck R., Content J., DeClercq E., Volckaert G., Tavernier J., Devos R., Fiers W. Isolation and structure of a human fibroblast interferon gene. II Nature. 1980, v. 285, N 5766, p. 542-547.

75. Taya Y., Devos R., Tavernier J., Cheroutre H., Engler G., Fiers W. Cloning and structure of the human immune interferon-gamma chromosomal gene. // EMBO J. 1982, v. 1, N 8, p. 953-958.

76. Huang Y., Paxton W. A., Wolinsky S. M., Neumann A. U., Zhang L., He Т., Kang S., Ceradini D., Jin Z., Yazdanbakhsh K., Kunstman K., Erickson D., Dragon E., Landau N. R., Phair J., Ho

77. D. D., Koup R. A. The role of a mutant CCR5 allele in HIV-1 transmission and disease progression. IINature Medicine. 1996, v. 2, p. 1240-1243.

78. Berger E. HIV entry and tropism: the chemokine receptor expression. // AIDS 1997, v. 11, (A), p. 3-16.

79. Signoret N., Pelchen-Matthews A., Mack M. et al. Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5. II J. Cell. Biol. 2000, v. 151, N6, p. 1281-1294.

80. Baccetti В., Benedetto A., Collodel G., Crisa N., di Caro A., Garbuglia A.R., Piomboni P. Failure of HIV-1 to infect human oocytes directly. II J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1999, v. 21, N 5, p. 355-361.

81. El Messaoudi K., Thiiy L., Van Tieghem N., Liesnard C., Englert Y., Moguilevsky N., Bollen A. HIV-1 infectivity and host range modification by cathepsin D present in human vaginal secretions. И AIDS. 1999, v. 13, N 3, p. 333-339.

82. Prakash M., Kapembwa M.S., Gotch F., Patterson S. Higher levels of activation markers and chemokine receptors on T lymphocytes in the cervix than peripheral blood of normal healthy women. II J. Reprod. Immunol. 2001, v. 52, N 1 -2, p. 101 -111.

83. Kitchen S.G., Zack J.A. Distribution of the human immunodeficiency virus coreceptors CXCR4 and CCR5 in fetal lymphoid organs: implications for pathogenesis in utero. II AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999, v. 15, N2, p. 143-148.

84. Douglas G.C., Thirkill T.L., Sideris V., Rabieh M., Trollinger D., Nuccitelli R. Chemokine receptor expression by human syncytiotrophoblast. II J. Reprod. Immunol. 2001, v. 49, N 2, p. 97-114.

85. Athanassakis I., Papadimitriou L., Vassiliadis S. Murine ectoplacental cone-derived trophoblast cells express chemokine receptors. // J. Reprod. Immunol. 2001, v. 50, N 2, p. 105-119.

86. Rezaie P., Trillo-Pazos G., Everall I.P., Male D.K. Expression of beta-chemokines and chemokine receptors in human fetal astrocyte and microglial co-cultures: potential role of chemokines in the developing CNS. // Glia. 2002, v. 37, N 1, p. 64-75.

87. Van Der Meer P., Goldberg S.H., Fung K.M., Sharer L.R., Gonzalez-Scarano F., Lavi E. Expression pattern of CXCR3, CXCR4, and CCR3 chemokine receptors in the developinghuman brain. II J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2001, v. 60, N 1, p. 25-32.

88. Schweighardt В., Atwood W.J. HIV type 1 infection of human astrocytes is restricted by inefficient viral entry. II AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001, v. 17, N 12, p. 1133-1142.

89. Westmoreland S.V., Alvarez X., deBakker C., Aye P., Wilson M.L., Williams K.C., Lackner A.A. Developmental expression patterns of CCR5 and CXCR4 in the rhesus macaque brain. II J. Neuroimmunol. 2002, v. 122, N 1-2, p. 146-158.

90. Boutet A., Salim H., Leclerc P., Tardieu M. Cellular expression of functional chemokine receptor CCR5 and CXCR4 in human embryonic neurons. II Neurosci. Lett. 2001, v. 311, p. 105-108.

91. Lee В., Ratajczak J., Doms R.W., Gewirtz A.M., Ratajczak M.Z. Coreceptor/chemokine receptor expression on human hematopoietic cells: biological implications for human immunodeficiency virus-type 1 infection. II Blood. 1999, v. 93, N 4, p. 1145-1156.

92. Deichmann M., Kronenwett R., Haas R. Expression of the human immunodeficiency virus type-1 coreceptors CXCR-4 (fiisin, LESTR) and CKR-5 in CD34+ hematopoietic progenitor cells. // Blood. 1997, v. 89, N 10, p. 3522-3528.

93. Park I.W., Wang J.F., Groopman J.E. Expression and utilization of co-receptors in HIV and simian immunodeficiency virus infection of megakaryocytes. П AIDS. 1999, v. 13, N 15, p. 20232032.

94. Clemetson K.J., Clemetson J.M., Proudfoot A.E., Power C.A., Baggiolini M., Wells T.N. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. // Blood. 2000, v. 96, N 13, p. 4046-4054.

95. An S.F., Osuntokun O., Groves M., Scaravilli F. Expression of CCR-5/CXCR-4 in spinal cord of patients with AIDS. П Acta Neuropathol. (Berl), 2001, v. 102, N2, p. 175-180.

96. Gupta S.K., Pillarisetti K., Lysko P.G. Modulation of CXCR4 expression and SDF-lalpha functional activity during differentiation of human monocytes and macrophages. // J. Leukoc. Biol. 1999, v. 66, N1, p. 135-143.

97. Lapham C.K., Zaitseva M.B., Lee S., Romanstseva Т., Golding H. Fusion of monocytes and macrophages with HIV-1 correlates with biochemical properties of CXCR4 and CCR5. // Nat. Med. 1999, v. 5, N 3, p. 303-308.

98. Bruhl H., Wagner K., Kellner H., Schattenkirchner M., Schlondorff D., Mack M. Surface expression of CC- and CXC-chemokine receptors on leucocyte subsets in inflammatory joint diseases. // Clin. Exp. Immunol. 2001, v. 126, N 3, p. 551-559.

99. Sol N., Ferchal F., Braun J., Pleskoff O., Treboute C., Ansart I., Alizon M. Usage of the coreceptors CCR-5, CCR-3, and CXCR-4 by primary and cell line-adapted human immunodeficiency virus type 2. II J. Virol. 1997, v. 71, N 11, p. 8237-8244.

100. Di Marzio P., Tse J., Landau N.R. Chemokine receptor regulation and HIV type 1 tropism in monocyte-macrophages. H AIDS Res. Hum. Retrovir. 1998, v. 14, N2, p. 129-138.

101. Yi Y., Rana S., Turner J.D., Collman R.G. CXCR-4 is expressed by primary macrophages and supports CCR5-independent infection by dual-tropic but not T-tropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. // J. Virol. 1998, v. 72, N 1, p. 772-777.

102. Matsuda S., Miyata M. Chemokine receptor-usage of clinical HIV-1 isolates obtained from patients with HIV-1 infection in late clinical stages using PHA-blast. // Microbiol. Immunol 1999, v. 43, N10, p. 967-974.

103. Hung C.S., Pontow S., Ratner L. Relationship between productive HIV-1 infection of macrophages and CCR5 utilization. // Virology. 1999, v. 264, N 2, p. 278-288.

104. Trkola A., Matthews J., Gordon C., Ketas Т., Moore J.P. A cell line-based neutralization assay for primary human immunodeficiency virus type 1 isolates that use either the CCR5 or the CXCR4 coreceptor. II J. Virol. 1999, v. 73, N 11, p. 8966-8974.

105. Collman R.G., Yi Y., Liu Q.H., Freedman B.D. Chemokine signaling and HIV-1 fusion mediated by macrophage CXCR4: implications for target cell tropism. II J. Leukoc. Biol. 2000, v. 68, N3, p. 318-323.

106. Singh A., Yi Y., Isaacs S.N., Kolson D.L., Collman R.G. Concordant utilization of macrophage entry coreceptors by related variants within an HIV type 1 primary isolate viral swarm. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001, v. 17, N 10, p. 957-963.

107. Bakri Y., Amzazi S., Mannioui A., Benjouad A. The susceptibility of macrophages to human immunodeficiency virus type 1 X4 isolates depends on their activation state. // Biomed. Pharmacother. 2001, v. 55, N 1, p. 32-38.

108. Ayehunie S., Garcia-Zepeda E.A., Hoxie J.A., Horuk R., Kupper T.S., Luster A.D., Ruprecht R.M. Human immunodeficiency virus-1 entry into purified blood dendritic cells through CC and CXC chemokine coreceptors. // Blood. 1997, v. 90, N 4, p. 1379-1386.

109. Bleul C.C., Wu L., Hoxie J.A., Springer T.A., Mackay C.R. The HIV coreceptors CXCR4 and CCR5 are differentially expressed and regulated on human T lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, v. 94, N5, p. 1925-1930.

110. Annunziato F., Galli G., Cosmi L., Romagnani P., Manetti R., Maggi E., Romagnani S. Molecules associated with human Thl or Th2 cells. // Eur. Cytokine. Netw. 1998, v. 9, N 3, p. 1216.

111. Penn M.L., Grivel J.C., Schramm В., Goldsmith M.A., Margolis L. CXCR4 utilization is sufficient to trigger CD4+ T cell depletion in HIV-1-infected human lymphoid tissue. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, v. 96, N 2, p. 663-668.

112. Dejucq N. HIV-1 replication in CD4+ T cell lines: the effects of adaptation on co-receptor use, tropism, and accessory gene function. //J. Leukoc. Biol. 2000, v. 68, N 3), p. 331-337.

113. Jagodzinski P.P., Trzeciak W.H. Decreased susceptibility of Thl cells to infection with primary HIV-1 isolates is associated with lower expression of CXCR4 in these cells. // Folia Histochem. Cytobiol. 2001, v. 39, N 2, p. 123-124.

114. Sato K., Kawasaki H., Nagayama H., Enomoto M., Morimoto C., Tadokoro K., Juji Т., Takahashi T. Chemokine receptor expressions and responsiveness of cord blood T cells. // J. Immunol. 2001, v. 166, N 3, p. 1659-1666.

115. Correa R., Munoz-Fernandez M.A. Viral phenotype affects the thymic production of new T cells in HIV-1-infected children.// AIDS. 2001, v. 15,N 15,p. 1959-1963.

116. Wakugawa M., Nakamura K., Kakinuma Т., Onai N., Matsushima K., Tamaki К. CC chemokine receptor 4 expression on peripheral blood CD4+ T cells reflects disease activity of atopic dermatitis. II J. Invest. Dermatol. 2001, v. 117, N 2, p. 188-196.

117. Inngjerdingen M., Damaj В., Maghazachi A.A. Expression and regulation of chemokine receptors in human natural killer cells. // Blood. 2001, v. 97, N 2, p. 367-375.

118. Burger J.A., Kipps TJ. Chemokine receptors and stromal cells in the homing and homeostasis of chronic lymphocytic leukemia В cells. Leuk. // Lymphoma. 2002, v. 43, N 3, p. 461-466.

119. Durig J., Schmucker U., Duhrsen U. Differential expression of chemokine receptors in В cell malignancies. // Leukemia. 2001, v. 15, N 5, p. 752-756.

120. Kitchen S.G., Zack J.A. CXCR4 expression during lymphopoiesis: implications for human immunodeficiency virus type 1 infection of the thymus. // J. Virol. 1997, v. 71, N 9, p. 69286934.

121. Zaitseva M.B., Lee S., Rabin R.L., Tiffany H.L., Farber J.M,. Peden K.W., Murphy P.M., Golding H. CXCR4 and CCR5 on human thymocytes: biological function and role in HIV-1 infection.IIJ. Immunol. 1998,v. 161,N6,p.3103-3113.

122. Berkowitz R.D., Alexander S., McCune J.M. Causal relationships between HIV-l coreceptor utilization, tropism, and pathogenesis in human thymus. II AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000, v. 16,N 11,p. 1039-1045.

123. Gujuluva C., Burns A.R., Pushkarsky Т., Popik W., Berger O., Bukrinsky M., Graves M.C., Fiala M. HIV-l penetrates coronary artery endothelial cells by transcytosis. // Mol. Med. 2001, v. 7,N3, p. 169-176.

124. Volin M.V., Joseph L., Shockley M.S., Davies P.F. Chemokine receptor CXCR4 expression in endothelium. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1998, v. 242 N 1, p. 46-53.

125. Han Y., Ventura C.L., Black K.P., Cummins J.E. Jr., Hall S.D., Jackson S. Productive human immunodeficiency virus-1 infection of epithelial cell lines of salivary gland origin. I/ Oral. Microbiol. Immunol. 2000, v. 15, N 2, p. 82-88.

126. Lapenta C., Boirivant M., Marini M., Santini S.M., Logozzi M., Viora M., Belardelli F., Fais S. Human intestinal lamina propria lymphocytes are naturally permissive to HIV-l infection. // Eur. J. Immunol. 1999, v. 29, N 4, p. 1202-1208.

127. Smith P.D., Meng G., Sellers M.T., Rogers T.S., Shaw G.M. Biological parameters of HIV-l infection in primary intestinal lymphocytes and macrophages. II J. Leukoc. Biol. 2000, v. 68, N 3, p. 360-365.

128. Dwinell M.B., Eckmann L., Leopard J.D., Varki N.M., Kagnoff M.F. Chemokine receptor expression by human intestinal epithelial cells. // Gastroenterology. 1999, v. 117, N 2, p. 359367.

129. Jordan N.J., Kolios G., Abbot S.E., Sinai M.A., Thompson D.A,. Petraki K., Westwick J. Expression of functional CXCR4 chemokine receptors on human colonic epithelial cells. // J. Clin. Invest. 1999, v. 104, N 8, p. 1061-1069.

130. Lavi E., Kolson D.L., Ulrich A.M., Fu L., Gonzalez-Scarano F. Chemokine receptors in the human brain and their relationship to HIV infection. II J. Neurovirol. 1998, v. 4, N 3, p. 301-311.

131. Gabuzda D., Wang J. Chemokine receptors and mechanisms of cell death in HIV neuropathogenesis. II J. Neurovirol. 2000, v. 6, N 1, p. 24-32.

132. Oh J.W., Drabik K., Kutsch O., Choi C., Tousson A., Benveniste E.N. CXC chemokine receptor 4 expression and function in human astroglioma cells. II J. Immunol. 2001, v. 166, N 4, p. 26952704.

133. Schweighardt В., Shieh J.T., Atwood W.J. CD4/CXCR4-independent infection of human astrocytes by a T-tropic strain of HIV-1. II J. Neurovirol. 2001, v. 7, N 2, p. 155-162.

134. Bajetto A., Bonavia R., Barbero S., Florio Т., Schettini G. Chemokines and their receptors in the central nervous system. // Front Neuroendocrinal 2001, v.22, N 3, p.147-184.

135. Kanmogne G.D., Grammas P., Kennedy R.C., Analysis of human endothelial cells and cortical neurons for susceptibility to HIV-1 infection and co-receptor expression. // J. Neurovirol. 2000, v. 6,N 6, p. 519-528.

136. Bakri Y., Mannioui A., Ylisastigui L., Sanchez F., Gluckman J.C., Benjouad A. CD40-Activated Macrophages Become Highly Susceptible to X4 Strains of Human Immu-nodeficiency Virus Type 1. II AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002, v. 18(2), p. 103-113.

137. Allison T.J., Winter C.C., Foumie J.J., Bonneville M., Garboczi D.N. Structure of a human gammadelta T-cell antigen receptor. И Nature. 2001, v. 411, N 6839, p. 820-824.

138. Stewart-Jones G.B., McMichael A.J., Bell J.I., Stuart D.I., Jones E.Y. A structural basis for immunodominant human T cell receptor Recognition. // Nat Immunol. 2003, v. 4, N 7, p. 657663.

139. Носик H.H. Цитокины в вирусных инфекциях. // Вопросы вирусологии. 2000, т. 45, № 1, с. 4-10.

140. Машковский М.Д. Лекарственные средства. // M.: Новая волна. 2002. Т.2,608 с.

141. Баренбойм Г.М., Маленков А.Г. Биологически активные вещества. Новые принципы поиска. // М.: Наука, 1986.

142. Арчаков А.И., Поройков В.В. Биоинформатика. Новые биомедицинские технологии. Обзор. // М.: НИИ биомедицинской химии РАМН, 1999.47 с

143. Граник В.Г. Лекарства: фармакологический, биохимический и химический аспекты. // М.: Вузовская книга. 2001. 408 с.

144. Индулен М. К., Полис Я. Ю., Калыня В. А., Рязанцева Г. М., Дзегудзе Д. Р., Этлите И. Э., Замятина Н. А., Канунникова Н. А., Фельдблюм Ф. J1. Антивирусная активность и механизм действия различных химических соединений. // Рига: Знание. 1979, с. 41-44.

145. Киселев О.И., Блинов В.М., Козелецкая К.Н., Ильенко В.И., Платонов В.Г., Чупахин О.Н., Стукова М.А., Карганов В.А. Молекулярный механизм действия противовиру-сных препаратов адамантанового ряда. // Вестник РАМН. 1993, № 3, с. 10-15,

146. Беликов В.Г. Синтетические и природные лекарственные средства. // М.: Высшая школа. 1993.720 с.

147. Jefferson Т.О., Demicheli V., Deeks J.J., Rivetti D. Amantadine and rimantadine for preventing and treating influenza A in adults. // Pharmacoeconomics 1999, v.l6(1), p.85-9.

148. Trappier В., Miyashiro A.M. Bupropion-amantadine-associated neurotoxicity. // J. Clin. Psychiatry. 2000, v. 61, N 1, p. 61-62.

149. Морозов И.С., Петров В.И., Сергеева C.A. Фармакология адамантанов. // Волгоград, Волгоградская медицинская академия, 2001,7с.

150. Crumpacker C.S. Ganciclovir. IINew InglandJ. Medicine. 1996, v. 335, N 10, p. 721-729.

151. Krayevsky A. A. Molecular Bases of Drug Design for AIDS Treatment: Achievements and Prospects . //.Molecular Biology. 1999, v. 33, N 3, p. 295.

152. Craig C., Moyle G. The development of resistance of HIV-1 to zalcitabine. // AIDS. 1997, v. 11, p. 271-279.

153. Povinelly L., Fasce R., Hall H., Cox N., Klimov A. Global surveillance of influenza A strains for amantadine resistance. II Xlnt Int. Congr. of Virology. Sydney Australia. 1999. Abstr:,p. 311.

154. Платэ H.A., Васильев A E. Физиологически активные полимеры. // M.: Химия, 1986,296 с.

155. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификацииприродных соединений. // М.: Наука, 1998,281 с

156. Полимеры в фармации. // М.: Медицина. 1986.255 с.

157. ШтильманМ.И. Полимеры в биологически активных системах. //Химия. М.: 1998.

158. Кирш Ю.Э. Лекарственные композиции продленного действия на полимерной основе: состав, строение и формы применения. II Хим. Форм. Ж. 1985, № 9, р. 1105-1111.

159. Панарин Е.Ф., Ушакова В.Н. Сополимеры N-винилпирролидона как носители биологически активных веществ. // Сб. Полимеры медицинского назначения. М. ИНХС АН СССР. 1988, с. 66-94.

160. Торчилин В.П., Максименко А.В., Клибанов A.JI., Паписов М.И. Новые подходы к использованию полимеров в качестве носителей терапевтических и диагностических функций. // Сб. Полимеры медицинского назначения. М. ИНХС АН СССР. 1988, с. 95-110.

161. Soluble polymers as carriers of bioactive molecules. Ed. by Kopecek J., Duncan R. // J. Controlled release. 1990, v. 10, N 1 special issue

162. Иозеп A.A., Пассет Б.В. Модификация биологически активных веществ полиса-харидами. II 111 Росс. нац. конгресс "Человек и лекарство". Москва, 1996, с. 24.

163. Бессонова Н.К., Иозеп А.А., Пассет Б.В. Конструирование биополимеров на основе лекарств и карбоксиэтил-полисахаридов. И VРосс. нац. конгресс "Человек и лекарство". Москва, 1998, с. 548

164. Hoste К„ De Winne К., Schacht Е. Polymeric prodrugs. // Int. J. Pharm. 2004, v.277, N 1-2, p. 119-131.

165. Mandel B. Inhibition of Theilor's encephalomyelitis virus (GDVII strain) of mice by an intestinal muco-polysaccaride III. Studies on factors that influence the virus-inhibitor reaction. // Virology. 1957, v.3, p. 444.

166. Feltz E.T., Regelson W. . Ethylene maleic anhydride copolymers as viral inhibitors. // Nature. 1962, v. 196, N 4855, p. 642-647.

167. Агол В.И., Чумакова М.Я. Действие полианионов на репродукцию двух вариантов вируса полиомиелита. //Acta. Virolog. 1963, v. 7, N 2, p. 97.

168. Claes P., Billiau A., De Clercq E., Desmyter J., Schonne E., De Somer P. Polyacetal carboxylic acids: A new group of antiviral polyanions. II J. Virol. 1968, v. 2, p. 886.

169. Claes P., Billiau A., De Clercq E., Desmyter J., Schonne E., De Somer P. Polyacetal carboxylic acids: A new group of antiviral polyanions. II J. Virol. 1970, v. 5(3), p. 313-320.

170. Billiau A., Desmuter J., De Somer P. Antiviral activity of chlorite-oxidized oxyamilose, a polyacetal carboxylic acid. II J. Virol. 1970, v. 5, N 3, p. 821-828.

171. Billiau A., Muyembe J. J., De Somer P. Effect of chlorite oxidized oxyamylose on influenza virus infection in mice. IIAppl. Microbiol. 1971, v. 21, p. 580.

172. Тарасов B.H., Кропачев B.A., Трухманова Л.Б. Противовирусные и антитоксические свойства синтетических полимеров. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1970, № 11, с. 89-95.

173. Butler G.B., Dutler G.B., Hing Y., Gifford G.E., Flick D.A. Physical and biological properties ofcyclopolymers related to DIVEMA, ("Pyran Copolymer"). II Ann. NY Acad. Sci. 1985, v. 446, p. 149-159.

174. Richmond J.Y. Mouse resistance against foot and - mouth disease virus induced by injectios virus induced by injections of Pyran. II Infect. Immun. 1971, v. 3, p. 249.

175. Morahan P.S., Barnes D.W., Munson A.E. Relationship of molecular weight to antiviral and antitumor activities and toxic effects of maleic anhydride-divinyl ether (MVE) polyanions. Cancer Treat Rep. 1978, v. 62, N 11, p. 1797-803.

176. Ottenbrite R.M. Biological activity of Pyran and similar polycarboxylic acid polymers. // Polym. Mater. Sci. Eng. 1988, v. 58, p. 228-231

177. Башкатова C.T., Кренцель Б.А., Родин И.М., Вильнер J1.M. Исследование влияния молекулярной массы и состава сополимеров акриловой кислоты с малеиновым ангидридом на их противовирусную активность. // Хим. фарм. ж. 1978, № 7, с. 101-103

178. White R.F., Antoniw J.F., Carr J.P., Woods R.D. The effects of aspirin and polyacrylic acid on the multiplicationn and spread of tobacco mosaic virus in different cultivars of tobacco. // Phytopathol. J. 1983, v. 107, N 3, p. 224-232.

179. Merigan T.C. Induction of circulating interferon by synthetic anionic polymers of known composition. //Nature (London). 1967, v. 214, p. 416-417.

180. Merigan T.C., Finklestein M.S. Interferon stimulating and in vivo antiviral effects of various synthetic anionic polumers. // Virology. 1968, v. 35, p. 363-374.

181. De Sommer P., De Clercq E., Billiau A., Cchonne E., Claesen M. Antiviral activity ofpolyacrylic and polymethacrylic acids. Mode of action in vivo. II J. Virol. 1968, v. 2, p. 886-893.

182. De Clercq E., De Somer P. Protective effect of interferon and polyacrylic acid in newborn mice infected with a lethal dose of vesicular stomatits virus. // Life Sci. 1968, v. 7, p. 925.

183. De Clercq E., De Somer P. Effect of interferon, polyacrylic acid and polymethacrylic acid on tail lesions in mice infected with vaccinia virus. II Appl. Microbiol. 1968, v. 16, p. 1314.

184. Niblusk J.F. Interferon stimulation by low molecular weigh polyacrylic acids. // Ann. NY Acad. Sci. 1970, v. 173, p. 536.

185. Овсянникова H.B., Вильнер JI.M., Зейтленок H.A. Интерфероногенная активность синтетических полимерных веществ в культуре перитонеальных клеток мышей. // Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. 1971, т. 16, с. 356-360.

186. Hodnett Е.М. Polymers as anti-viral agents. // Cell. Immunol. 1973. v. 7, p. 290.

187. Вильнер Л.М., Финогенова E.B., Тихонова-Сидорова H.C., Родин И.М., Кропачев В.А. Влияние индукторов интерферона на развитие специфической резистентности к клещевому энцефалиту. // Вопросы вирусологии. 1976, № 1, с.70-75.

188. Muck К., Roily Н., Burg К. Herstellung und antivirale wirksamkeit von polyacrylsaure und polymethacrylsaure. // Makromol. Chem. 1977, v. 178, N 10, p. 2773-2784.

189. Nakajima Т., Teruoka Т., Shigematsu Т., Kasugal Н. Inhibitory activity of surfactants and polyelectrolytes against tobacco mosaic virus infection. // J. Pestic Sci. (Nihon Nogaku Gakkaishi). 1983, v. 8, N 4, p. 499-503.

190. De Clercq E., Nuwer M.R., Merigan T.C. The role of interferon in the protective effect of a synthetic double stranched polyribonucleotide against intranasal vesicular stomatitis virus challenge in mice.// J. Clin. Invest. 1970, v. 49, p. 1565.

191. Morahan P.S., Munson A.E., Regelson W., Commerford S.L., Hamilton L.D. Antiviral activity and side effects of polyriboinosinic cytidulic acid complexes a effected by molecular size. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972, v. 62, p. 842-846

192. Morahan P.S., Pinto A., Stewart D., Murasko D.M., Brinton M.A. Varying role of alpha/beta interferon in the antiviral efficacy of synthetic immunomodulators against Semliki Forest virus infection. II Antiviral Res. 1991, v. 15, N3, p. 241-254.

193. Cunliffe H.R., Richmond J.Y., Campbell C.H. Interferon inducers and foot-and-mouth disease vaccines: influence of two synthetic polynucleotides on antibody response and immunity in guinea pigs andswin е. II Can J Comp Med. 1977, v.41,N l,p. 117-121.

194. Merigan T.C., Regelson W. Interferon induction in man by polymers of defined composition. // New Eng. J. Med. 1967, v. 277, p. 1283-1287.

195. De Clercq E, Merigan T.C. Local and systemic protection by synthetic polyanionic interfe-ron inducers in mice against vesicular stomatitis virus. // J. Gen. Virol. 1969, v. 5, p. 359.

196. De Clercq E., Eckstein F., Merigan T.C. Structural requirements for synthetic polyanions to act as interferon inducers.//Лил NT. Acad. Sci. 1970, v. 173,N l,p.441.

197. De Clercq E. Nonpolynucleotide interferon inducers. // In book: Selective inhibitors of viral functions. Ed. by Carter W.A. C.R.C.Press. Clivlend Ohaia. 1973, p. 177-198.

198. Chirigos M.A., Turner W., Pearson J., Griffin W. Effective antiviral therapy of two murine leukemias with an interferon-inducing synthetic carboxylate copolymer. // Int. J. Cancer. 1969, v. 4, p. 267.

199. Billiau A., Muyembe J.J., De Somer P. Mechanizm of antiviral activity in vivo of poly-carboxylates which induce interferon production. II Nat. New Biol. 1971, v. 232, p. 183.

200. Billiau A., Muyembe J.J., De Somer P. Interferon inducing polycarboxylates: Mechanism of protection against vaccinia virus infection in mice. // Infect. Immun. 1972, v. 5, p. 854.

201. Levy H.B. Polymers as interferon inducers. // In book: Polymeric Drugs. Ed. By Donaruma L.G., Vogl O. Acad. Press. NY San Francisco - London. 1978, p. 305-329.

202. Suzuki S., Suzuki М., Chaki F. Interferon inducing activity of acidic polysaccharides. II. Induction of rabbit serum interferon by chemically phosphorylated polysaccharides. // Jap. J. Microbiol. 1972, v. 16, p. 1.

203. Бродская JI.H., Овсянникова H.B., Вильнер Л.М., Зейтленок Н.А. Противовирусная активность некоторых микробных и синтетических интерфероногенов. // Труды Инст. Полиомиелита и вирусных энцефалитов. 1971, т. 16, с. 332-338

204. Came P.E., Lieberman M., Pascale A., Shimonaski G. Antiviral activity of interferon-inducing synthetic polymer. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1969, p. 131:443.

205. Papas T.S., Pry T.W., Chirigos M.A. Inhibition of RNA depent DNA polymerase of avian myeloblastosis virus by Pyran copolymer. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1974, v. 71, N 2, p. 367-370.

206. Этлис B.C., Кутырева B.C., Дубовик Б.В., Богомазов С.Д. Сополимеры малеинового ангидрида синтетические активаторы системы комплемента. II Хим. Фарм. ж. 1978, т. 12, N3, с.130-133.

207. Baird L.G., Kaplan A.M. Immunoadjuvant activity of Puran copolymer. I. Evidence for direct stimulation of T-lymphocytes and macrophages. // Immunol. 1975, N 20, p. 107-176.

208. Baird L.G., Kaplan A.M. Effects of polyanion immunomodulators on the immune system. // In book Anionic polymeric drugs. John Willy Sons. NY-Chihester Brisbane - Toronto. 1980. Ch. 5, p. 185-211.

209. Kaplan A.M., Ruus K., Ottenbrite R.M. Macrophage activation and antitumor activity of cyclohexyl-l,3-dioxepin and 4-methyl-2-pentonyl maleic anhydride copolymers. // Annals NY Acad. Sci. 1985, v. 446, p. 169-184.

210. Ottenbrite R.M., Kuus R., Kaplan A.M. Macropphage activation by a series of unique polyanionic polymers. II J. Macromol. Sci., Chem. 1988, v. 25, N 5-7, p. 873-893.

211. Talmadge J.E., Maluish A.E., Collins M., Schneider M., Herberman R.B., Oldham R.K., Wiltrout R.H. Immunomodulation and antitumor effects of MVE-2 in mice. II J. Biol. Response Mod. 1984, v. 3, N 6, p. 634-652.

212. Атауллаханов Р.И., Губарев М.И., Гончаров В.В. Стимуляция лимфоцитов in vitro поликатионами. Сравнение адъювантной митогенной и поликлональной активности полимеров, различающихся по химической структуре. // Иммунология. 1985, № 2, с. 27-30.

213. Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И. Митогенное действие полиметакриловой кислоты на лимфоциты, кинетика пролиферации лимфоцитов Т- и В- субклассов. // Иммунология. 1982. ,№4, с. 30-32.

214. Bick Р.Н., Johnson A.G. Poly A:U-induced secretion of T-lymphocyte helper factors. // Scand. J. Immunol. 1977, v. 6, N 11, p. 1133-1144.

215. Liu D.C., Grun J.L., Maurer Р.Н. Differential effects of poly (Glu60, Phe40), (GPhe) on murine TH1 and TH2 cells. // Cell Immunol. 1991, v. 133, N 2, p. 420-433.

216. Кабанов B.A. От синтетических полиэлектролитов к полимер-субъединичным вакцинам. // Высокомол. Соед. Серия А. 2004, т. 46, № 5, с. 759-782.

217. Teitelbaum D., Sela М., Arnon R. Copolymer 1 from the laboratory to FDA. ///sr. J. Med. Sci. 1997, v. 33, N4, p. 280-284.

218. Teitelbaum D., Amon R., Sela M. Copolymer 1: from basic research to clinical application. // CellMol Life Sci. 1997, v. 53, N 1, p. 24-28.

219. Fellay В., Chofflon M., Juillard С., Paunier A.M., Landis Т., Roth S., Gougeon M.L. Beneficial effect of co-polymer 1 on cytokine production by CD4 T cells in multiple sclerosis. // Immunology. 2001, v. 104, N 4, p. 383-391.

220. Maes R.F., Vieira A., Gomes I., Auge de Mello P., Bernal Lopez C., Costa Freitas K. Potentiation of FMD vaccines with polycationic-nucleic acid complexes. II Arch Virol. 1977, v. 55, N4, p. 275-285.

221. Мериган Т. Невирусные индуценты интерферона и интерференция с невирусами. // Труды института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. 1971, т. 16, с. 13-22.

222. Kaplan A.M. Antitumor activity of synthetic polyanions. // In book:Anionic polymeric drugs. John Willy Sons. NY-Chihester Brisbane - Toronto. 1980, p. 227-252

223. Regelson W., Morahan P., Kaplan A. The role of molecular weight in pharmacologic and biologic activity of synthetic polyanions. // In: Polyelectrolytes and their applications/ Ed. By Rembaum A., Selegny R. Boston. Reidelpublishing Co. 1975. p. 131.

224. Зубова O.B. Полимеры в химиотерапии опухолей. // В сб.: Актуальные вопросы современной онкологии. М. Изд. МГУ. 1980, вып. 6, с. 62-88.

225. Mota I., Perini A. The effect of a synthetic double-stranded RNA on IgC 1 and IgE production by guinea-pigs. A comparative study with lipopolysaccharide. // Immunology. 1975, v. 29, N 2, p. 319-326.

226. Nicklin S., Atkinson H.A., Miller K. Adjuvant properties of polysaccharides: effect of iota-carrageenan, pectic acid, pectin, dextran and dextran sulphate on the humoral immune response in the rat. // Food Addit. Contam. 1988, v. 5, N 4, p. 573-580.

227. Норимов А.Ш., Некрасов A.B., Сивук H.E., Завгородний С.Г., Берестецкая Т.З., Хаитов P.M. Влияние молекулярной . массы сополимеров акриловой кислоты и N-винилпиррлидона на их иммуноадыовантную активность. // Иммунология. 1984, № 6, с. 24-27.

228. Hilgers L.A., Nicolas I., Lejeune G., Dewil E., Strebelle M., Boon B. Alkyl-esters of polyacrylic acid as vaccine adjuvants.// Vaccine. 1998, v. 16, N 16, p. 1575-1581.

229. Hilgers L.A., Ghenne L., Nicolas I., Fochesato M., Lejeune G., Boon B. Alkyl-poly-acrylate esters are strong mucosal adjuvants. // Vaccine. 2000, v. 18, N 28, p. 3319-3325.

230. Brown W., Regelson W., Yajima Y., Ishizuka M. Stimulation of antibody formation by Pyran copolymers. II Proc. Soc. Exp. Biol Med. 1970, v. 133, p. 171-175.

231. Lin Y.C. Studies on immunological effects of pyran. 1. Enhancement of antibody production in mice. // Zhonghua Mm Guo Wei Sheng Wu Ji Mian YiXue la Zhi. 1987, v/ 20, N 1, p. 89-92.

232. Payne L.G., Jenkins S.A., Woods A.L., Grund E.M., Geribo W.E., Loebelenz J.R., Andrianov A.K., Roberts B.E. Polydi(carboxylatophenoxy)phosphazene. (PCPP) is a potent immunoadjuvant for an influenza vaccine. // Vaccine. 1998, v. 16, N 1, p. 92-98.

233. Newman M.J., Actor J.K., Balusubramanian M., Jagannath C. Use of nonionic block copolymers in vaccines and therapeutics. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998, v. 15, N 2, p. 89-142.

234. Nicholson J.J. 3rd, Hill S.L., Frondoza C.G., Rose N.R. Silicone gel and octamethylcyclotetrasiloxane (D4) enhances antibody production to bovine serum albumin in mice. И J. Biomed. Mater. Res. 1996, v. 31, N 3, p. 345-353.

235. Mead J.R., Burger R.A., Morrey J.D., Warren R.P., Oklebeny K.M., Sidwell R.W. Effect of immunomodulators in the hu-PBL-SCID mouse model. // Biotechnol. Ther. 1993, v. 4, N 1-2, p. 133-143.

236. Лернер P.A. Синтетические вакцины. // В мире науки. 1983, № 4, с. 4-14.

237. Либкин О. Искуственные вакцины. // Химия и жизнь. 1984, № 6, с. 11 -20.

238. Кабанов В.А., Петров Р.В., Хаитов P.M. Новый принцып создания искусственных иммуногенов. НЖВХО им. Д.И Менделеева. 1982, т. 27, № 4, р. 417-428.

239. Петров Р.В., Хаитов P.M. Искусственные антигены нового типа. IIЖ. микробиол. 1982, № 12, с. 22-28.

240. Абраменко Т.В., Виноградов И.В., Кабанов В.А., Мустафаев P.M., Петров Р.В., Хаитов P.M., Филатова Е.Д. Иммуногенность конъюгата бычьего сывоторочного альбумина с полиакриловой кислотой. IIЖ. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1983, № 11, с. 83-89.

241. Петров Р.В., Хаитов P.M. Конъюгированные полимер-субъединичные иммуногены и вакцины. II Вести. Росс. Акад. Наук. 2003, № 1, с. 10-15.

242. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Фомина JI.A., Лиознер А.Л., Сидорович И.Г. Синтетичес-кие пептидные антигены ВИЧ при изучении СПИД. // Иммунология. 1988, № 3, с. 21-25.

243. Панарин Е.Ф., Афиногенов Г.Е. Макромолекулярные антимикробные вещества и лекарственные препараты. ИЖХО Менделеева 1985, т. 30, № 4, р. 378-386.

244. Дезинфекционные средства. // М.: Хризостом. 2000.160 с.

245. Panarin E.F., Solovskij M.V., Zaikina N.A., Afinogenov G.E. Biological activity of cationic polyelectrolytes. // Makromol.Chem. 1985, N 9, c. 25-33.

246. Афиногенов Г. E., Панарин E. Ф. Антимикробные полимеры. II СПб.: Гиппократ 1993, 263 с.

247. Панарин Е.Ф., Афиногенов Г.Е. Полимерные производные поверхностно-активных веществ, их биологические и лечебные свойства. // Сб. Полимеры медицинского назначения. М. ИНХС АН СССР. 1988, с. 35-65.

248. Donaruma L.G, Brierley J.A., Hatch М., Martin D., Mercogliano R., Lockwood S., Depinto J.V.,

249. Anufrieva E.V., Panarin E.F., Pautov V.D., Kirpach A.B., Krakovyak M.G., Luschik V.B., Solovskij M.V. Polymer complexes of dimethylbenzylalkylammonium chlorides. // Makromol. Chem. Phys, 1997, v. 198, c. 3871-3881.

250. Gyotoku Т., Aurelian L., Neurath R. Cellulose acetate phthalate (CAP): an 'inactive' pharmaceutical excipient with antiviral activity in the mouse model of genital herpesvirus infection. // Antiviral. Chem. Chemotherapy 1999, v. 10, p. 327-332.

251. Manson K., Wyand M., Miller C., Neurath R. Effect of cellulose acetate phthalate topical cream on vaginal transmission of simian immunodeficiency virus in rhesus monkeys. // Antimicrob Agents Chemother 2000. v. 44, p. 3199-3202.

252. Neurath A., Strick N., Li Y-Y., Debnath A. Cellulose acetate phthalate, a common pharmaceutical excipient, inactivates HIV-1 and blocks the coreceptor binding site on the virus envelope glycoprotein gpl20. И BMC Infectious Diseases. 2001, v. 1, p. 17.

253. Zhu P., Olson W.C., Roux K.H. Structural flexibility and functional valence of CD4-IgG2 (PRO 542): potential for cross-linking human immunodeficiency virus type 1 envelope spikes. // J. Virol. 2001, v. 75, N 14, p. 6682-6686.

254. StephensonJ. Researchers Explore New Anti-HIV Agents. II JAMA 2002, v. 287, N 13,p. 16351637.

255. Baba M., Pauwels R., Balzarini J., Arnout J., Desmyter J., De Clercq E. Mechanism of inhibitoiy effect of dextran sulfate and heparin on replication of human immunodeficiency virus in vitro. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988,v. 85,N 16, p. 6132-6136

256. Mitsuya H., Looney D.J., Kuno S., Ueno R., Wong-Staal F., Broder S. Dextran sulfate suppression of viruses in the HIV family: inhibition of virion binding to CD4+ cells. // Science. 1988, v. 240, N 4852, p. 646-649.

257. Moulard M. et al. Selective interactions of polyanions with basic surfaces on human immunodeficiency virus type 1 gpl20. II J. Virol. 2000, v. 74, p.1948-1960.

258. Jansen R.W., Schols D., Pauwels R. et al. Novel, negatively charged, human serum albumins display potent and selective in vitro anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. // Mo I.

259. Pharmacol 1993, v. 44, N 5, p. 1003-1007.

260. Kuipers M.E., Huisman J.G., Swart P.J. et al. Mechanism of anti-HIV activity of negatively changed albumins: biomolecular interaction with the HIV-1 envelope proteine gpl20. // J. AIDS Hum. Retrovir. 1996, v. 11, N 5, p. 419-429.

261. Swart P.J., Sun C.S., Kuipers M.E., Asuncion C., Josephs S., Smit C., Meijer D.K. The in vitro anti-HIV efficacy of negatively charged human serum albumin is antagonized by heparin. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1997, v. 13, N 8, p. 677-683.

262. De Clercq E. New anti-HIV agents and targets. // Med. Res. Rev. 2002, v.22(6), p.531-565.

263. Neurath A.R., Stride N., Li Y.Y. Anti-HIV-1 activity of anionic polymers: a comparative study of candidate microbicides. // BMC Infect Dis. 2002, v. 2, N 1, p. 27.

264. Dey В., Lerner D., Lusso P., Boyd M., Elder M., Berger E. Multiple antiviral activities of cyanovirin-N: blocking of gpl20 interaction with CD4 and coreceptor, and inhibition of diverse enveloped viruses. // J. Virol. 2000, v. 74, p. 4562- 4569.

265. Zacharopoulos V., Phillips D. Vaginal formulations of carrageenan protect mice from herpes simplex virus infection. // Clin. Diagn. Lab. Immun. 1997, v. 4, p. 465-468.

266. Krumbiegel M., Dimitrov D.S., Puri A., Blumenthal R. Dextran sulfate inhibits fusion of influenza virus and cells expressing influenza hemagglutinin with red blood cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1992, v. 1110, N 2, p. 158-164.

267. Amornrut C., Toida Т., Imanari Т., Woo E.R., Park H., Linhardt R., Wu S.J., Kim Y.S. A new sulfated beta-galactan from clams with anti-HIV activity. // Carbohydr. Res. 1999, v. 321, N 1-2, p. 121-127.

268. Aoki Т., Kaneko Y., Stefanski M.S., Nguyen Т., Ting R.C. Curdlan sulfate and HIV-1.1. In vitro inhibitory effects of curdlan sulfate on HIV-1 infection. II AIDS Res. Hum. Retroviruses 1991, v. 7, N4, p. 409-415

269. Mauck C. Single and multiple exposure tolerance study of cellulose sulfate gel: a Phase I safety and colposcopy study. // Contraception 2001, v. 64, p. 383-391.

270. KJotman M., Scordi-Bella L., Keller M., Hogarty K., Jarvis G., Anderson R., Waller D,

271. Zonenveld L.J.D., Profy A., Herold B.C. Spectrum of HIV-1 inhibitory activity of sulfonated polumers, candidate topical microbicides. // Int. Conf. Microbicides 2004. London. 2004, Abstr. p. 19.

272. Mesquita P.M., Herold В., Stattock R.J. SAMMA blocks HIV-1 and HSV-2 infection in cellular and human cervical tissue models. // Microbicides 2004. London. 2004, Abstr. p.74

273. Ueki M., Watanabe S., Saitoh T. et al. Synthesis and chain length-anti-HIV activity relationship of fully N- and O-sulfated homooligomers of tyrosine. // Bioorg. Med. Chem. 2001, v. 9, N 2, p. 487-492.

274. Bourne N., Bernstein D., Ireland J., Sonderfan A., Profy A., Stanberry L. The topical microbicide PRO 2000 protects against genital herpes infection in a mouse model. // J. Infect. Dis. 1999, v. 180, p. 203-205.

275. Stafford M. et al. A placebo-controlled, double-blind prospective study in healthy female volunteers of dextrin sulphate gel: a novel potential intravaginal virucide. // J. Acquir Immune Defic.Syndr. 1997, v. 14, p. 213-218.

276. McClure M., Moore J., Cook G., Keynes R., Weber J., Weiss R. Investigations into the mechanism by which sulphated polysaccharides inhibit HIV infection in vitro. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992, v. 7, p. 3-16.

277. The International Working Group on Vaginal Microbicides. Recommendations for the development of vaginal microbicides. II AIDS. 1996, v. 10, p. 1-6.

278. Greenhead P., Hayes P., Watts P., Laing K., Griffin G., Shattock R. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. // J. Virol. 2000/v. 74, p. 5577-5586.

279. Hill R., Ryan J., Stone A., Fransen L. Vaginal microbicides for the prevention of HIV /AIDS:assessment of the potential market. II Int. J. Pharm. Med. 2000, v. 14, p. 271-278.

280. Coggins C. et al. Preliminary safety and acceptability of a carrageenan gel for possible use as a vaginal microbicide. H Sex. Transm. Infect. 2000, v. 76, p. 480-483.

281. Hiebert L.M., Wice S.M., Jaques L.B., Williams K.E., Conly J.M. Orally administered dextran sulfate is absorbed in HIV-positive individuals. II J. Lab. Clin. Med. 1999, v. 133, N 2, p. 161170.

282. Herold B.C. Topical microbicides for the prevention of genital herpes: a major co-factor for HIV infection. // Microbicides 2004. London, 2004, Abstr., p. 12.

283. Rosenberg Z., Van Damme L., Mauck C. for the International Working Group on Microbicides: Recommendations for the clinical development of topical microbicides: an update. // AIDS 2001, v. 15, p. 857-868.

284. Trkola A., Ketas T.J., Nagashima K.A. et al. Potent, broad-spectrum inhibition of human immunodeficiency virus type 1 by the CCR5 monoclonal antibody PRO 140. II J. Virol. 2001, v. 75, N2, p. 579-588.

285. LaBranche C.C., Galasso G., Moore J.P. et al. HIV fusion and its inhibition. I/Antivir. Res. 2001, v. 50, p. 95-115.

286. Zhang Y. J., Moore J. P. Will multiple coreceptors need to be targeted by inhibitors of human immunodeficiency vims type 1 entry? II J. Virol. 1999, v. 73, N. 4, p. 3443-3448.

287. Proudfoot A.E., Buser R., Borlat F. et al. Amino-terminally modified RANTES analogues demonstrate differential effects on RANTES receptors. // J. Biol. Chem. 1999, v. 274, N 45, p. 32478-32485.

288. Townson J.R., Graham G.J., Landau N.R. et al. Aminooxypentane addition to the chemokine macrophage inflammatory protein-1 alpha P increases receptor affinities and HIV inhibition. // J. Biol. Chem. 2000, v. 275, N 50, p. 39254-39261.

289. Brandt S.M., Mariani R., Holland A.U. et al. Chemokine-mediated block to HIV entry is associated with CCR5 internalization efficiency. II J. Biol. Chem. 2002, v. 277, N 19, p. 17291-17299.

290. Rimsky L.T., Shugars D.C., Matthews T.J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 resistance to gp41-derived inhibitory peptides. II J. Virol. 1998, v. 72, N 2, p. 986-993.

291. Root M.J., Kay M.S., Kim P.S. Protein design of an HIV-1 entry inhibitor. // Science. 2001, v. 291, p. 884-888.

292. Kolocouris N., Foscolos G.B., Kolocouris A., Marakos P., Pouli N., Fytas G., Ikeda S., De Clercq E. Synthesis and antiviral activity evaluation of some aminoadamantane derivatives. // J. Med. Chem. 1994. v. 37, p. 2896-2902.

293. Guyader M., Kiyokawa E., Abrami L., Turelli P., Trono D. Role for human immunodeficiency virus type 1 membrane cholesterol in viral internalization. II J. Virol. 2002, v.76, N 20, p. 1035610364.

294. Del Real G., Jimenez-Baranda S., Lacalle R.A., Mira E., Lucas P., Gomez-Mouton C., Carrera A.C., Martinez-A. C., Manes S. Blocking of HIV-1 infection by targeting CD4 to nonraft membrane domains. II J. Exp. Med. 2002, v. 196, N 3, p.293-301.

295. Nguyen D.H, Taub D. CXCR4 function requires membrane cholesterol: implications for HIV infection. II J. Immunol 2002, v.168, N 8, p. 4121-4126.

296. Narayan S., Barnard R.J., Young J.A. Two retroviral entry pathways distinguished by lipid raft association of the viral receptor and differences in viral infectivity. // J. Virol. 2003, v. 77, N 3, p. 1977-1983.

297. Soldaini E., Wack A., D'Oro U., Nuti S., Ulivieri C., Baldari C.T., Abrignani S. T cell costimulation by the hepatitis С virus envelope protein E2 binding to CD81 is mediated by Lck.

298. Eur. J. Immunol. 2003, v. 33, N 2, p. 455-464.

299. Shi S.T., Lee K.J., Aizaki H., Hwang S.B., Lai M.M. Hepatitis С virus RNA replication occurs on a detergent-resistant membrane that cofractionates with caveolin-2. // J. Virol. 2003, v. 77, N 7, p. 4160-4168.

300. Lee G.E., Church G.A., Wilson D.W. A subpopulation of tegument protein vhs localizes to detergent-insoluble lipid rafts in herpes simplex virus-infected cells. // J. Virol. 2003, v. 77, N 3, p. 2038-2045.

301. Zhang J., Pekosz A., Lamb R.A. Influenza virus assembly and lipid raft microdomains: a role for the cytoplasmic tails of the spike glycoproteins. II J. Virol. 2000, v. 74, N 10, p. 4634-4644.

302. Coffin W.F. 3rd, Geiger T.R., Martin J.M. Transmembrane domains 1 and 2 of the latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus contain a lipid raft targeting signal and play a critical role in cytostasis. II J. Virol. 2003, v. 77, N 6, p. 3749-3758.

303. Ashbourne Excoffon K.J., Moninger Т., Zabner J. The coxsackie В virus and adenovirus receptor resides in a distinct membrane microdomain. // J. Virol. 2003, v. 77, N 4, p. 2559-2567.

304. Waarts B.L., Bittman R., Wilschut J. Sphingolipid and cholesterol dependence of alphavirus membrane fusion. Lack of correlation with lipid raft formation in target liposomes. II J. Biol. Chem .2002, v. 277, N 41, p. 38141-38147.

305. Рзаев Х.К. Полимеры и сополимеры малеинового ангидрида. // Элм. Баку. 1984,159с.

306. Кабанов В.А., Зубов В.П., Семчиков Ю.Д. Комплексно-радикальная полимеризация. // М.: Химия. 1987.254 с.

307. Butler G.B. Recent developments in polymerization by an alternating intra-intermolecular mechanism. II J. Polum. Sci. 1960, v. 48, N 2, p. 279-289.

308. Butler G.B. Synthesis, characterisation and biological activity of Pyran copolymers. II In: Anionic polumeric drugs. Ed. by Donaruma L.G., Ottenbrite R.M., Vogl O. NY Chichester - Brisbane -Tororonto. John Wiley. 1980. p. 123.

309. Butler G.B. Synthesis and antitumor activity of "Pyran copolymer". II J. Chem. Phys. 1982-1983, v. C22,N l,p. 86-180.

310. Kunitake Т., Tsukino M. Radical cyclopolymerization of divinyl ether and maleic anhydride. A 13C-NMR study of the polymer structure. II J. Polym. Sci, Chem. Ed. 1979, v. 17, N 3, p. 877888.

311. Samuels R.J. A quantative evaluatiom of the structure and properties of the divinyl ether maleic anhydride 1:2 copolymer. II Polymer. 1977, v. 18, N 5, p. 452-466.

312. Горшкова М.Ю., Лебедева Т.Д., Стоцкая Л.Л., Слоним ИЛ. Исследование структуры сополимера дивинилового эфира с малеиновым ангидридом спектральными методами. // Высокомол. Соед. Сер. А. 1996, т. 38, № 10, с.1683-1686.

313. Butler G.B., Badgett J.T., Sharabash М. Characterisation of the charge transfer complex from fiiran and maleic anhydride and the alternating copolymer. // J. Macromol. Sci. Chem. 1970, v. A4, N l,p. 91.

314. Gaylord N.G. Donor-acceptor complexes in copolymerization. XXXVI. Alternating diene-dienophile copolymers. 4. Copolymerization of furan and 2-methyl-fiiran with maleic anhydride. II J. Macromol. Sci.-Chem. 1972, v. A6, N 8, p. 1459-1480.

315. Gaylord N.G. Donor-acceptor complexes in copolymerization. XXXVIL. Alternating diene-dienophile copolymers. 4. Copolymerization of furan and 2-methyl-fiiran with maleic anhydride. II J. Macromol. Sci.-Chem. 1972, v. A6, N 8, p. 1481-1498.

316. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. Физико-химические свойства, методики, библиография. //М. Мир. 1976.541 с.

317. Бочков А.Ф., Афанасьев В А., Заиков Г.Е. Углеводы. // М.:Наука 1980

318. Krentsel L., Chaubel F., Rebrov A., Champion J., Ermakov I., Bittoun P., Fermandjian S., Litmanovich A., Plate N., Jozefonvicz J. // Carbohydr. Polym. 1997, v. 33, p. 63.

319. Петров P.B., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины. // М.: Медицина, 1988,288 с.

320. Aoyagi J., Shinohara I. Esterification of styrene maleic anhydride copolumer by mixed alcohols. II J. Appl. Polum. Sci. 1972, v. 16, N 2, p. 449-460.

321. Heilman W.J. Process for the preparation and recovery of esterified copolymers containing maleic anhydride.//US Pat. 3741940,1973, (Р.Ж.Хим. 1974.9C 424П).

322. Bouvier J.M., Brunev C.M. Etude cinetique, sur modelles, de la reaction de pontage de copolymeres ethylene anhydride maleique a basse teneur en anhydride maleique. // Bull. Soc.

323. Chim. Fr., 1977, v. 11-12, N 1, p. 1093-1098.

324. Багрий Е.И. Адамантаны. // М.: Наука. 1989,284 с/

325. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия. // М.: Медицина, 2002, 656 с.

326. Маковецкий K.JL, Горбачева Л.И., Голенко Т.Г., Островская ИЛ. Полимеризация норборнена с катализаторами на основе соединений никеля. // Высокомол. соед., сер. А. 1996, т. 38, №3, с. 435-441.

327. Монаков Ю.Б., Сабиров З.М., Уразбаев В.Н., Мударисова Р.Х, Яхина Э.З. Струк-турно-кинетическая схема реакции роста цепи при метатезисной полимеризации норборнена под действием RuCh ЗН2О. // Высокомол. соед., сер. Б. 1999, т. 41, № 4, с. 730-733.

328. Смирнова Н.Н., Лебедев Б.В. Термодинамика метатезисной и аддитивной полимеризациинорборнена, дициклопентадиена и их производных. // Высокомол. соед., сер. Б., 2001, т. 43, №11, с. 2023-2044.

329. Valuev I.L., Chupov V.V., Valuev L.I. Chemical modification of polymers with physiolo-gically active species using water-soluble carbodiimides. // Biomaterials, 1998, v. 19, p. 41-43.

330. Chabot D.J., Broder C.C. Substitutions in a homologous region of extracellular loop 2 of CXCR4and CCR5 alter coreceptor activities for HIV-1 membrane fusion and virus entry. // J. Biol. Chem. 2000, v. 275, N 31, p. 23774-23782.

331. Dragic T. An overview of the determinants of CCR5 and CXCR4 co-receptor function. II J. Gen. Virol. 2001, v. 82, N 8, p. 1807-1814.

332. Pontow S., Ratner L. Evidence for common structural determinants of human immunodeficiency virus type 1 coreceptor activity provided through functional analysis of CCR5/CXCR4 chimeric coreceptors. II J. Virol. 2001, v. 75, N 23, p. 11503-11514.

333. Babcock G.J., Mirzabekov Т., Wojtowicz W., Sodroski J. Ligand binding characteristics of CXCR4 incorporated into paramagnetic proteoliposomes. И J. Biol. Chem .2001, v. 276, N 42, p. 38433-38440.

334. Doranz B.J., Orsini M.J., Turner J.D., Hoffman T.L., Berson J.F., Hoxie J.A., Peiper S.C., Brass

335. F., Doms R.W. Identification of CXCR4 domains that support coreceptor and chemokine receptor functions. // J. Virol 1999, v. 73, N 4, p. 2752-2761.