Синтез, строение и интерферониндуцирующая активность азометиновых производных замещенных ароматических аминов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. АКАДЕМИКА САДЫКОВА A.C.

Р I 6 Oft ffa правах рукописи

\ I . r^V"- УДК 577.12.615.277.3.615.271.8.

^ О t. '■> i' ь. ^

МИРЗАЕВ Рахмонкул Туркманович

СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И ИНТЕРФЕРОНИНДУЦИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АЗОМЕТИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЗАМЕЩЕННЫХ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОВ

Специальность 02.00.10. - биоорганическая химия,

»

химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ташкент - 1995

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Ташкентского госуниверситета.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор АСЛАНОВ Х.А. доктор химических наук, профессор АУЕЛБЕКОВ С.А.

заседании специализированного совета Д 015.21.2! п Институте биооргаиической химии им. акад. Садыкова A.C. АН Республики Узбекистан (700143, Ташкент, ул. акад. Х.Абдуллаева, 83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБОХ АН РУз.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор ДАЛИМОВ Д.Н. кандидат химических наук, доцент ТАРАСОВ В.А.

Ведущая организация:

Ташкентский фармацевтический институт

Защита состоится

Ученый ci-Kpcnipi" спсиня.шшровпштго com-in А 015.21.21

ла.н.. профессор 3'TtfiCi',)' 11.11.1.Л1'\М

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем естествознания является раскрытие природы существования, развития и воспроизводства вирусов, которые занимают особое место в живом мире. Одним из основных направлений биоорганической химии, молекулярной биологии и генетики является выяснение строения, механизмов размножения этих опаснейших инфекций с целью создания профилактики против них.

Открытие индукторов, под воздействием которых организм или культура клеток вырабатывает собственный интерферон, явилось новой вехой в борьбе с вирусными заболеваниями. Интенсивные исследования, направленные на использование интерферона и его индукторов в борьбе с вирусными заболеваниями, привели к созданию препаратов "Мегосин", "Полигуацил", "Амексин", "Реаферон" и других, которые в настоящее время успешно применяются в медицинской практике. Однако отсутствие интерферонового ответа на повторное введение индуктора (гипореактив-ность к действию индукторов) является необходимой предпосылкой для создания набора индукторов различной природы, комбинированное применение которых приводит к преодолению данного явления.

Разработка и внедрение новых лекарственных средств этого типа требуют решения комплексной задачи, включающей целенаправленный синтез новых соединений, изучение их строения, проведения биологических и фармакологических исследований, синтеза радиоактивных аналогов наиболее перспективных препаратов, исследования влияния этих соединений на уровни биосинтеза важнейших клеточных компонент, изучение направления транспорта в определенные органы, ткани и органеллы клеток.

Синтез радиоактивных аналогов биологически активных веществ и их фармакокинетическое исследование приводит к выяснению движения лекарственных веществ в организме, изучению изменений концентраций'' препаратов в крови и органах,- а также к контролю распределения ве-.ществ метаболизма в интактных клетках и в целом организме.

Настоящая работа выполнена в соответствии с комплексной программой 0.74.05, раздел Н 6 "Изучить молекулярные основы синтеза и механизма действия интерферона и его индукторов", утвержденной постановлением Государственного комитета по науке и теадике, а также по плану НИР ТашГУ. утвержденному Минвузом и АН РУз Ш Госрегистрации 018(Ю059763) по теме: "Разработать методы синтеза и изучить.биологические свойства новых противовирусных и интерферониндуцирующих веществ на основе природных соединений".

Целью настоящей работы является I г с >г-г.|к:1 м»голов синтез;!, физико-химическая характеристика и иг/-

чение биологических свойств новых азометиновых производных ароматических аминов - индукторов интерферона и радиоактивного аналога препарата Саврац (продукт конденсации салициламина с окисленной водорастворимой ацетилцеллюлозой), внедряемого в медицинскую практику'в качестве противовирусного средства, исследование его фармакокинетики и изучение взаимодействия препарата с интактными клетками и внутриклеточными органеллами.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

- синтез, установление особенностей структуры новых азометиновых производных ароматических аминов; в качестве альдегидного компонента при синтезе азометиновых соединений была использована Оврац (окисленная водорастворимая ацетилцеллюлоза), так как многие азоме-тиновые соединения низкомолекулярных альдегидов не растворимы в воде;

- изучение интерферониндуцирующей активности синтезированных соединений;

- синтез, идентификация и оптимизация выхода Т-Оврац и Т-сали-циламина;

- синтез, установление структуры и оптимизация выхода Т-Саврац;

- исследование фармакокинетики Т-Саврац и определение влияния препарата на биосинтез клеточных макромолекул; изучение проникновения и распределения Т-Саврац- внутри клеток.

Научная новизна. Впервые синтезированы новые азометиновые производные -ароматических аминов с Оврац и два типа радиоактивных аналогов препарата Саврац с введением метки в различные положения молекулы методом термической активации трития. Показано, что синтезированные соединения являются индукторами интерферона. Разработаны способы очистки и методы оптимизации условий получения радиоактивных аналогов препарата. Исследовано проникновение, внутриклеточное распределение препарата и впервые показано, что индуктор интерферона Саврац взаимодействует с наружной мембраной человеческих клеток, не проникая в внутриклеточное пространство, . что позволяет предположить возможность рецепторного запуска биосинтеза интерферона.

Практическое значение работы состоит в следующем: среди вновь синтезированных соединений обнаружены вещества, обладающие интерферониндуцирующей активностью и ингибирующие рост опухолевых клеток и репликацию вирусов. Разработан метод введения изотопной метки в различные положения молекулы высокомолекулярного индуктора интерферона

Саврац методом термической активации молекулярного трития в мягки* условиях. Метод может быть использован при синтезе радиоактивных униформ высокомолекулярных индукторов интерферона. Разработаны ради ометрические методики исследования биотрансформации индукторо'в интерферона. Полученные в работе фармакокинетические данные вошли в материалы, подготовленные в Фармкомитет России для получения разрешения на клиническое испытание активности Саврац в качестве антихла • мидиозного препарата и материалы представлены в Фармкомитет Республики Узбекистан для получения разрешения на проведение клинических испытаний против вирусного гепатита.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на научной конференции молодых ученых и профессорско-преподавательского состава ТашГУ /1989-1992/. на Всесоюзной конференции "Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицинской и микробиологической промышленности" /Москва - 1989/, III Региональном совещании республик Средней Азии и Казахстана по химическим реактивам /Ташкент-1990/, IV Всесоюзном совещании по химическим реактивам /Баку-1991/, на научной конференции профессорско-преподавательского состава Термезско-го государственного университета (Термез - 1993.1994), на Научно-практической конференции "Синтез химических реактивов и их производство", посвященной 75-летию ТашГУ.

Синтез, физико-химические характеристики и биологические свойства азометиновык производных замещенных ароматических аминов

Нами разработаны методы синтеза и получены новые производные ароматических аминов - 4-бутоксианилина, 4-нонилоксианилина. 2,5-ди-4 метоксианилина. 3.4-диметокси-1-р-аминоэтилбензола, 3-карбок-си-4-гидроксианилина, 2-аминометилпиридина, 3-аминометилпиридина, 4-аминометилпиридина".

Такой подбор производных аминов позволяет варьировать нуклео-Фильность атакующего атома азэта аминогруппы, изменяет зарядовые и гидрофобные взаимодействия, влияющие на специфику»мемсранотропного действия, связанного с интерферониндуцирующей активностью синтезированных соединений.

Окисленную Врац (водорастворимая ацетилцеллюлоза) получали из Врац путем окисления йодной кислотой:

HJOu

ti

ïl

104-110 * ™ n = 100-104

Для подтверждения образования альдегидных групп в образцах после окисления йодной кислотой были сняты ИК-спектры контрольных и окисленных образцов!" Так как полоса поглощения карбоксильных групп близка к полосе поглощения карбонильных, то для доказательства образования альдегидных групп производили гидролиз окисленных образцов Врац. Омыление последних проводили в 0,5 Н.растворе метилата натрия в безводном метаноле, обеспечивающие полное отделение ацетильных групп.

Производные Оврац. содержащие фрагменты 4-бутоксианилина (I). 4-нонилоксианилина (II), 2.5-диметоксианилина (III)/ 3,4-диметок-cn-l-ß-аминоэтилбензола (IV), З-карбокси-4-гидроксианилина (V). 2-аминометшширидина (VI), 3-аминометилпиридина (VII), 4-аминометил-пиридина (VIII) получали по следующей схеме в водной среде:

аум

itjco

где R-. (i); ^>ос,н19 (и); -Q (

оси»

и

-<2>-0н (v); -снг-/5 (vj); -снг/3 mi -¿»¿о (y11i).

ЧООН — ^-и

Для нахождения максимального выхода целевого продукта производные Оврац синтезировали при различных pH реакционной среды, температурах и продолжительности реакции. Количество азота, определенное микроанализом, в продукте конденсации Оврац с ароматическими аминами указывает, что присоединение замещенных аминов зависит от условий проведения реакции. Так, в кислой среде (pH =4) при температуре 40°С в реакцию вступает 77% альдегидных групп. Количество присоединившихся ароматических аминов при одном и том же значении pH зависит от температуры реакционной массы. Так, при pH = 9 (температура реакционной смеси 40°С) в реакцию вступает 33% альдегидных групп. Увеличение температуры реакцчонной среды по 55°С (рН=9) сопровождается ■ 'Образцы Д.1Й1 сравнения любезно были предоставлены проф. Рахман-(к рдленик I'.

1 04

резким повышением числа вступающих в реакцию альдегидных групп до 87%. Наиболее оптимальной средой образования целевого продукта являются слабокислые значениях рН(рН = 5,0-5,5) при температуре реакционной среды 38-42°С (табл. 1).

Таблица 1

Физико-химические свойства синтезированных соединений

И

п * 100-104

¿И

и

н-я

N И Выход,% СП] ^ах-НМ

1 92,8 0,754 235

2 3 -©-069Н)9 н,йо ■0 95,0 76,4 0, 805 0.743 260 238

4 78.6 0,714 242

5 ^Соон 95.7 0,814 300

6 '«¿О 91,2 0,642 266

7 86.3 0,615 269

8 -<%СН 89.5 0,685 258

Следует отметить, что образцы производных ароматических аминов могут различаться молекулярно-весовым и конформационным распределением. содержанием сложноэфирных. диальдегидннх, моноальдегидных, по-луацетальных и замещенных нуклеофилышми агентами форм, количеством

Нг0 и т.д.. т.е. зависят от условий проведения синтеза. Поэтому мы считаем, что наиболее целесообразно проведение анализа структурных данных по определению строения и состояния молекулы следующим образом: структурно-химический анализ состояния высокомолекулярной подсистемы альдегидо-ацетилцеллюлозы, замещенной ароматическими аминами; определение состояния и химических превращений отдельных фрагментов полимерной основы; изучение структуры присоединенных фрагментов в производных и их состояния в полймерной матрице.

Поэтому прежде всего рассмотрим спектр образца Оврац в инфракрасной области, полученный нами и используемый в дальнейшем.для получения производных ароматических аминов (рис. 1). В области 1800-1600 см"1 обнаруживаются две широкие полосы при 1750 см"1 и 1660 см*1 с перегибом около 1750-1730 см"1. Вторая полоса относится к симметричным деформационным колебаниям Н20 (она обычно используется для контроля за степенью увлажнения целлюлозы), что согласуется с наличием высокочастотных колебаний 6 области 3800-3600 см"1. Как минимум двойная полоса при 1750-1730 см"1 соответствует, во-первых, поглощению, соответствующему валентным колебаниям С=0 сложноэфирной группы ацетильных остатков, а также С=0 альдегидной группы (меньшей интенсивности 1740-1720 см"1). Подтверждением последнего отнесения является обнаружение, группы полос меньшей интенсивности в области 2950-2850 см"1 (валентные колебания С-Н связи при альдегидной группе). Таким образом, приведенный анализ показывает, что в полученном нами образце действительно присутствуют альдегидные группы. Однако наличие значительного поглощения в области 1440-1220 см"1 указывает на наличие полуацетальных форм фрагментов Оврац.

При взаимодействии 2-аминометилпиридина с Оврац (VI). судя по инфракрасным спектрам в полимерной цепи, наблюдаются следующие структурные изменения: наблюдается узкая полоса поглощения свободной ОН-группы при 3620 см"1, широкая полоса большой интенсивности 3600-3100 см"1 - валентные колебания ОН-групп связанных разнообразными типами водородных связей. Уширенная полоса валентных колебаний С.-Н (середина при 2900..см"1) свидетельствует о значительном разнообразии С-Л групп, и обусловленными не только поглощением в пиранозных подсистемах, но информационным состоянием каждого звена. Присутс-

твие полосы при 1640 см"' средней интенсивности указывает на наличии Нг0. Полоса валентных колебаний С=0 интенсивна и состоит как минимум из двух полос 1750 см"1 и 1740 см"1 равной интенсивности. Отнесение последней к валентным колебаниям С=0 альдегидных групп не корректно, так как в области 2-110 см"' наблюдается слишком слабое поглощение валентных колебаний С-Н-связи альдегидной группы. Поэтому следует считать, что раздвоение полосы валентных колебаний С=0 обусловлено различиями в состояниях соседних (неацетилированных) фрагментов . звеньев. В области 1400-1100 см"1 имеются две полосы большой интенсивности 1240-1060 см"1, 1370-1250 см"1 и ряд полос средней интенсивности 1440 см"1. 1310 см"1, 1300'см"1. 1160 см"1 и т.д. Интенсивная полоса при 1250 см"1 . соответствует, асимметричным колебаниям С—С(=0)—0 ацетильных групп, что свидетельствует о высокой этерифика-ции исходного продукта Оврац. Наиболее интенсивной полосой в области 2900-2500 см"1 является поглощение при 1060 см"1, соответствующее разнообразным типам валентных колебаний С-0, характерных для вторичных и третичных (полуацеталей) спиртовых групп. На основании вышеизложенного приходим к выводу, что в условиях данной реакции происходит существенное увеличение полуацетальных форм Оврац. которые сильно гидратированы. Химические структуры других синтезированных соединений также подтверждаются их ИК-спектрами (рис. 1).

Следует отметить, что в ИК-спектрах (в силу малой чувствительности) четко не обнаруживаются внеплоскостные колебания данных ароматических заместителей в области 850-7Q0 см"1 (III, IV. V). Поэтому ■ для доказательства образования соответствующих производных с Оврац изучены их электронные спектры в ближней ультрафиолетовой области. При образовании несопряженной- C=N связи должна появляться очень интенсивная полоса в области 220-230, нм (t>10000), соответствующая к разрешенному я-л' переходу (это. в частности, проявляется в спектре «"«ртшового прпичпппнплл пиридина и анилина) (таблица 1). Как видно, в спектре имеется интенсивный максимум при X = 225-235 нм. Если сравнить спектры исходных аминов и кх высокомолекулярных производных, то образование азометиновой группировки проявляется в появлении очень интенсивного поглощения в области 230-300 нм JK-noj,oca). Эти данные, а также результаты гель-фильтрации, радиоактивных производных (2-оксибензиламина с Оврац), доказывают, что определенное количество исходных аминов при взаимодействии с Оврац присоединилось к полимерной матрице за счет образования азометиновой связи. .

<J

s

Рн

к

И vy

щ ГЧЛ

а 1

а о О , ....... ! , , 1

ю ко V / » -i—> . .... i—..... ' А

itoo Moo

Ы'

РвсД.ИК-спектры поглощения образцов: а) - Оврац; продукты конденсации Овраи с соединен'/пж: б) - ¿-шжнокетилшфида-ном;.б) - бутокспшшлгндк; г) - ^-шлшометилпиридином; д) - З-карбокси-й-гвдроксиашшшом. - ■

Изучение токсичности и противовирусной активности синтезированных соединений свидетельствует, что они являются слаботоксичными веществами для культур клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Максимальная переносимая доза для культур клеток составляет более 2500 мкг/мл -и незначительно меняется в зависимости от природы радикала (табл. 2).

Таблица 2

Цитотоксичность и противовирусная активность синтезированных соединений

9«

н-*

100-104

N II Цитотоксичность, мкг/мл Противовирусная ак-тивн. .доза мкг/мл

1 зооотзгоо 1600

2 2800-3100 1400 ,

3 осн5 3050-3300 1350-1550

4 06М3 3200-3400 1450-1500

5 -О-т соон 2600-2750 250-300

6 2350-2400 1020-1050

7 3250-3350 1000-1050

8 -<5нг-0» 2600-2800 950-1000

Противовирусная активность в культуре клеток большинства синте-

зированных соединений проявляется в концентрациях в 2-3 раза ниже токсической дозы и составляют 1000-1600 мкг/мл. Соединение V, содержащее остаток З-карбокси-4-гидроксианилина, обладает сравнительно высокой противовирусной, активностью. Минимальная доза проявляющей активности составляет 250-300 мкг/мл. Увеличение концентрации препарата в растворе приводит к увеличению резистентности клеток к действию вируса.

Растворимость соединения V в воде и проявление противовирусной активности в культуре клеток в концентрации в 10 раз ниже токсической делают перспективным данное соединение в качестве ингибитора, действующего на быстрореплицирующие системы - репликацию вирусов и размножение опухолевых клеток.

Сравнительное изучение интерферониндуцирующей активности синтезированных соединений с другими производными бензиламина. 4-оксибен-зиламина и 2,4-диоксибензиламина показало, что последние индуцируют интерферон с активностью 20-80 ИЕ/мл и обладают низкой противовирусной активностью.

Интерферониндуцирующие свойства синтезированных соединений изучены в культуре клеток трансформированных фибробластов мышей (L-929) при различных концентрациях препаратов и продолжительности контакта их с культурой клеток. Большинство синтезированных соединений (I.III. V, VI-VIII) индуцируют образование интерферона в дозе 16 мкг/мл, где активность интерферона составляет 64-128 ИЕ/мл. Увеличение дозы препарата приводит к повышению активности интерферона. Так. в дозе 125 мкг/мл соединение I индуцирует интерферон с активностью 256 ИЕ/мл. Активность-образовавшегося интерферона под воздействием других соединений (III, VI-VIII) составляет величину 128-256 ИЕ/мл. Наиболее высокая активность интерферона наблюдается для соединения V, которое в дозе 125 мкг/мл индуцирует интерферон с активностью 512-640 ИЕ/мл. Производное З-карбокси-4-гидроксианилина (V) представляет интерес для последующего углубленного исследования, так как соотношение минимальной токсической дозы к минимальной эффективной дозе (химиотерапевтический индекс) составляет 90 и более.

Синтез, очистка и физико-химическая '

■характеристика Т-Саврац

Для изучения фармакокинетики и .проницаемости препарата внутрь

клеток нами синтезированы и охарактеризованы радиоактивные аналоги высокомолекулярного индуктора интерферона Саврац: меченый по всей молекуле и меченый по ароматйческой части исследуемого вещества.

С целью оптимизации процесса введения трития в препарат мы изучали" относительное распределение метки между молекулой Саврац и примесями, в зависимости от суммарного времени обработки мишени атомарным тритием. Для этого после каждого цикла мечения отбирали аликвоты соединений и анализировали с помощью гель-фильтрации.

Из-за хорошей растворимости препарата Саврац в воде, наилучшие результаты получены нами при использовании гельфильтрации, где в качестве элюента использована вода. При этом полностью отделяется лабильная метка и примеси.

Использование подобранных систем полностью решило проблему очистки; радиохимическая чистота Т-Саврац после очистки была не ниже 95%. что является весьма высоким показателем для радиоактивных препаратов (табл. 3).

Таблица 3

Радиоактивность Т-Саврац

кол-во активность активность удельная удельная

циклов аликвоты. образца, обьемная молярная

мкКи/мкл мКи/мг активность. активность.

мКц/мл мКи/ммоль

1 ' 17 5 0,25' 176

2 35 9,5 0,49 350

3 51 15 0..74 530

Вероятными обменоспособными группами в. молекуле Саврац под воздействием термически активированного трития являются фенильная гядроксильная группа, расположенная во втором положении ароматического ядра, гидроксильные группы в пиранозном кольце мономерного звена полисахарида и водороды фенильного радикала. По данным литературы более обменоспособными группами являются: -С00Н, >N11 , - ОН, -ЗН и протоны ароматического ядра. Менее обменоспособной группой в органической молекуле, вероятно, является С-Н группа.

- 14 -

ЛТ Л? г

КЬйой^ Снгот

о

от а

I

СМ,

4

о-

л

ч • 10 0-104

ОТ

Синтез Т-Саврац. меченого по протонам ароматической части молекулы, осуществляли взаимодействием Т-2-оксибензиламина с Оврац.

2-0ксибензиламин был синтезирован нами из соответствующих окси-альдегидов по следующей схеме:

_,ои , _.¿н=нон , ,сн

г-\т /ш /-Ч^2

,енг«яг

Т-2-оксибензиламин нами синтезирован методом термической активации молекулярного трития по следующей схеме:

<2>-он Г

ет2итг от

Используя Т-2-оксибензиламин в качестве аминокомпонента, синтезированы азометиновые сЬединения, содержащие остатки радиоактивных ароматических оксиаминов по следующей схеме:

он сн

°н * п = 100-104

100-104

-ОТ

Для надежности идентификации сравнивали спектры поглощения в УФ-области немеченых и меченых образцов. Отмечалось практически полное совпадение формы спектров и сохранение основных спектральных характеристик.

Таким образом, синтез Т-Саврац. осуществленный методом термической активации трития, позволил получить радиоактивное соединение с высокой удельной активностью. Преимуществом метода является возможность химического анализа образца и получение специфично меченого соединения.

Влияние Саврац на синтез клеточных макромолекул культивируемых клеток и исследование фармакокинетики Т-Саврац

Одним из подходов к установлению механизмов действия индукторов интерферона является изучение влияния препаратов на биосинтез клеточных макромолекул, прежде всего нуклеиновых кислот.

С использованием метода включения в культивируемую клетку меченых предшественников биосинтеза белка (Т-лейцин) и нуклеиновых кислот (Т-уридин и Т-тимидин) нами сравнительно изучено состояние биосинтеза клеточных макромолекул в клетках L-929 и ФЭК при индукции интерферона при действии Саврац с последующим определением радиоактивности в кислотанерастворимой части клеток по сравнению с культурой клеток, не обработанных препаратом.

При обработке клеток препаратом 'Саврац в течении 24 ч в дозе • 250 мкг/мл биосинтез белка подавляется на 30%. Биосинтез РНК заметно снижается при одновременном внесении препарата Саврац в концентрации 250 мкг/мл и Т-уридина?; Незначительное ингибирование биосинтеза ДНК наблюдается при обработке монослоя препаратом Саврац в концентрации 250 мкг/мл как при контакте монослоя с препаратом на 24 часа, так и на 4 часа. В концентрациях 62 и 125 мкг/мл препарат не влияет на биосинтез белка и нуклеиновых кислот. .

Для выявления взаимосвязи между продукцией интерферона и состоянием биосинтеза клеточных макромолекул нами изучен^ ин'герферонинду-цирующая активность препарата в культурах клеток различного происхождения. Степень участия эпителиоидной ткани в интерфероновом ответе организма оценивали по способности препаратов индуцировать синтез интерферона в перевиваемой культуре фибробластов человека М-19 и трансформированной линии мышиных фибробластов L-929. Максимальная

продукция интерферона зависит от дозы индуктора, . от присутствия поликатионов, от времени его контакта с клетками и других факторов. Основываясь на этих данных, мы провели ряд экспериментов, посвященных определению оптимальной дозы препарата в присутствии поликатиона ДЭАЭ-декстрана и без него. Стимуляция интерферонобразования препаратов Саврац в культуре клеток L-929 в дозе 16 мкг/мл приводит к образованию 64 ед/мл. интерферона. При дозе 250 мкг/мл титры интерферона, индуцированного препаратом, достигают значений 256 ед/мл.

В перевиваемой клеточной линии человека М-19 Саврац проявляет наиболее высокую активность. Препарат в концентрациях 16 - 250 мкг/мл приводит к стимуляции образования интерферона с активностью 256 ед/мл. Индукция интерферона в культуре клеток М-19 препаратом в сочетании с поликатионом (ДЭАЭ-декстраном) увеличивает синтез интерферона до 1280-2048 ед/мл.

Подученные результаты показывают, что для препарата Саврац эффективной концентрацией индукции интерферона для двух линий культур клеток фибробластного типа является 250 мкг/мл:

Таким образом, препарат обладает сравнительно высокой интерфе-рониндуцирующей активностью в культурах клеток и в дозах, вызывающих образование интерферона, оказывают незначительное влияние на биосинтез клеточных макромолекул.

Воздействия препарата Саврац на клеточный метаболизм свидетельствуют, что данное соединение ингибирует синтез нуклеиновых кислот (исключая биосинтез РНК при контакте клеток с препаратом Саврац в течение 24 ч.). Так, при обработке исследуемыми препаратами повреждается, в основном, синтез клеточной ДНК. Наиболее интенсивно подавляется биосинтез белка. Отмечена также прямо пропорциональная зависимость интерферониндуцирующей активности и уровня подавления синтеза клеточных макромолекул от дозы препарата Саврац. Незначительное подавление наблюдается при всех описанных случаях в дозе препарата, равной 250 мкг/мл.

Для выяснения метаболизируемости препарата- в организме изучали распределение радиоактивного аналога в органах и .тканях белых беспородных мышей-самцов весом 20 г. Работа проведена в'Институте химической физики АН России. ■ •

Анализ полученных данных показывает, что после перорального введения Т-Саврац основная часть радиоактивной метки остается в желудочно-кишечном тракте (желудок, тонкий кишечник),.часть быстро по-

падает в кровь, печень, костный мозг и мочу. Стремительное и значительное по количеству накопление радиоактивности в желчи и моче свидетельствует о том, что препарат или продукты его метаболизма быстро выводятся из организма. При этом основная часть радиоактивности сохраняется в организме в течение первых суток. Обращает на себя внимание, что с мочой радиоактивные продукты выводятся в значительном количестве в первые 6 ч после введения препарата.

Максимальная концентрация радиоактивной метки в крови регистрируется через 30 мин. после введения и сохраняется на уровне 50% от максимальной в течение 96 ч наблюдения, причем отмечается два пика накопления радиоактивной метки - через 30 мин. и 24 часа после введения препарата.

Большое количество радиоактивной метки в желудке сохраняется в первые 24 часа после введения, тогда как в тонком кишечнике наибольшее количество метки отмечалось через 30 мин. а в толстом кишечнике - через 6 ч после введения. По всей вероятности, радиоактивная метка в кровь поступает через стенки желудка и тонкого кишечника и дальше разносится по всему организму.

Анализируя величины площадей под кривой распределения радиоактивной метки и время полувыведения можно видеть, что в тканях селезенки почках, легких, сердцах и в мышцах сам препарат или продукты его метаболизма накапливаются приблизительно в одинаковом количестве, но скорость выведения радиоактивной метки из этих органов раз-, лична: быстрее всего от радиоактивности освобождается ткань печени, очень долго метка задерживается в мышцах. .

Представленные данные свидетельствуют, что препарат Саврац или продукты его метаболизма после перорального введения неравномерно распространяются по всему организму; основная часть от введенной радиоактивности задерживается в желудочно-кишечном тракте. ,

Для определения возможности проникновения препарата внутрь клетки'монослой культуры клеток фибробластов эмбрионов кур обрабатывали радиоактивными аналогами Саврац, мечеными по фенильному радикалу или в целом по°молекуле.

Подсчет радиоактивности в субклеточных структурах и мембранах клетки свидетельствует, что в условиях индукции интерферона наибольшая активность ■локализуется в питательной среде, используемой для культивирования клеток. Увеличение времени контакта препарата с монослоем культур клеток фибробластов эмбрионов кур не приводит к су-

щественному изменению радиоактивности питательной среды.

В культурах клеток фибробластов эмбрионов человека и на лейкоцитах донорской крови Саврац индуцирует образование интерферона, активность которого зависит от дозы препарата и от времени его контакта с культурой клеток. В последующих исследованиях изучали взаимодействие Т-Саврац с Лимфоцитами донорской крови человека. Связывание определяли по методике РгокеБ!!, где рассчитывали соотношение концентраций субстанции, связанной с клеточным осадком (внутриклеточная концентрация) и концентрации субстанции во внематочной среде. Полученные данные свидетельствуют, что Т-Саврац,в основном, сорбируется на поверхности клеток. Увеличение продолжительности инкубации увеличивает количество молекул, сорбированных на ее поверхности (табл. 4).

Таблица 4

Связывание исследуемого препарата лейкоцитами периферической • крови человека (дано соотношение уровней концентрации препарата внутри клеток и во внеклеточной среде)

Продолжительность инкубации субстанции с клетками

5 мин 120 мин

лимфоциты нейтрофилы лимфоциты нейтрофилы

0,45 0,94 1,50 1,13

0.81 0,61 1,44 2,5

0, 37 0, 22 1,36 1,09

0.29 0.54 1,82 1,82

0,90 0.57 1,97 1,03

0,84 0, 46 2,03 ' 1,52

Таким образом, индуктор интерферона Саврац не обладает свойством проникновения внутрь клетки. Биологический эффект достигается при адсорбции препарата на поверхности интерферониндуцирующих клеток.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые азометиновые производное окисленной водорастворимой ацетилцеллюлозы и 4-бутоксианилина, 4-нонилоксианили-на. 2,5-диметоксианилина,- 3,4-диметокси-1-р-аминоэтилбензола, 3-кар-бокси-4-гилроксиданилина. 2-аминометилпиридина, 3-аминометилпириди-на, 4-аминометилпиридина, изучены их физико-химические свойства и установлены особенности структуры полученных веществ. Показано, что состояние полимерной матрицы производных Оврац зависит от структуры

присоединенного основания.

"'2. Установлено, что для реакции конденсации замещенных амиш.а и пиридинов с окисленной водорастворимой ацетилцеллюлозой наиболее ои тимальным является рН 4,0-5,5 и температура 38-42°С. Выход целево. с. продукта от кислотности среды имеет колоколообразный характер, ч.и связано с наличием двух реакционных форм реагентов, концентрации ко торых определяют эффективную скорость реакции.

3. Для синтезированных соединений выявлена определенная зависимость между интерферониндуцирующей активностью и- химическим строением; наличие и расположение фенольного гидроксила в фенилыюм радикале оказывает существенное влияние на биологическую активность: наибольшей противовирусной активностью обладает- производное Оврац с З-карбоксн-4-гидроксианилином. индуцирующее интерферон с активностью 512-840 ИЕ/мл в дозе 125 мкг/мл.

4. Разработан способ получения радиоактивного аналога противовирусного препарата и индуктора интерферона Саврац, меченого тритием с удельной объемной активностью 530 мКи/моль и с удельной молярной активностью 0,74 мКи/мл. Впервые получен меченый тритием аналог 2-оксибензиламина методом термической активации трития с удельной объемной активностью 2.4 мКи/мл.

5. Изучены закономерности уровня интерферонообразования и биосинтетических процессов в клетках, обработанных Саврац. Показано, что при этом, в основном, повреждается синтез клеточных белков и нуклеиновых кислот. Максимальное образование интерферона происходит при обработке клеток дозой Саврац, незначительно повреждающей синтез клеточных макромолекул. Исследованием фармакокинетики Т-Саврац установлено, что после перорального введения препарата основная часть радиоактивной метки задерживается в желудочно-кишечном тракте. Время полувыведения составляет 36-48 часов.

6. Полученные результаты явились составной частью материалов, переданных в Фармкомитет МЗ РУз для получения разрешения на проведение клинических испытаний препарата Саврац по отношению к хламидиоз-ной инфекции и вирусного гепатита. *

<№

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих статьях:

1. Аманова С.Х., Мирзаев Р. Т.. Мухамаджанов М., Асланов X. А., Мухамедкаримо^а М.Г. Синтез и биологическая активность производных

водорастворимой ацетилцеллюлозы. Всесоюзная конференция "Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицинской и микробиологической промышленности". Тезисы докладов. - Ташкент. 1989, С. 59.

2. Мирзаев Р.Т.. Ауелбеков С.А.. Асланов Х.А. Синтез и исследование свойств производных ароматических оксиальдегидов. Третье региональное совещание республик Средней Азии и Казахстана по химическим реактивам. Ташкент, 1990, С. 161.

3. Мирзаев Р.Т., Аманова С.Х., Ачилова Г.Ш.. Асланов Х.А. Окси-альдегиды. Основы для синтеза индукторов интерферона. Третье региональное совещание республик Средней Азии и Казахстана по химическим реактивам. Тезисы докладов и сообщений. Органические реактивы. Ташкент. 1990. С. 328.

4. Мирзаев Р.Т., Саиткулов A.M..Ауелбеков С.А. Влияние индукторов интерферона растительного происхождения на биосинтез клеточных макромолекул. Четвертое Всесоюзное Совещание по химическим реактивам. Тезисы докладов и сообщений. Баку. 1991. С. 71.

5. Мирзаев Р.Т., Ауелбеков С.А., Рахманбердиев Г.. Асланов Х.А. Синтез и фармакокинетика 3Н-Саврац. ДАН РУз . Ташкент, 1993. - С. 35-37.

6. Мирзаев Р.Т.. Аманова С.Х. Синтез и характеристика производных водорастворимой аминоацетилцеллюлозы. Сборн. ТашГУ. Ташкент. 1992. - С. 61-63.

7. Мирзаев Р.Т., Ауелбеков С.А. Изучение проницаемости 3Н-Сав-рац в клетки. Тезисы докладов на XXVI Научно-теоретической конференции, посвященной 40-летию образования Термезского государственного университета. Термез. 1994. С. 162.

8. Мирзаев Р.Т.. Аманова С.Х., Маулянов С.А., Рахманбердиев Г., Асланов X.А. Синтез' и строение производных водорастворимой аминоацетилцеллюлозы. Узб. хим. журн. Ташкент, 1994. N1. - С. 13-16.

9. Мирзаев Р.Т., Маулянов С.А., Ауелбеков С.А. Синтез и характеристика 3Н-Саврац. Узб.хим. кури. Ташкент, 1995. N 2. С. 47 _ 49

10. Саиткулов A.M.. Мирзаев Р. Т., Ачилова Г.Ш., Холмуратов X. А., Ауелбеков С. А. Интерферониндуцирующзя активность, производных феноль-ных соединений ин витро и влияние их на биосинтез клеточных макромолекул. Узб.биол.журн. Ташкент.1994. N6. с. 3-6. • •

- 21 -

Ароматик аминларнинг азометин ^осилаларини синтези. тузилиши ва интерферон ^осил цилиш активлиги

Диссертация иши интерферон индукторлари - ароматик аминларнинг сувда эрувчан оксидланган ацетилцеллюлоза асосида янги азометин до-силаларини синтез к,илиш услубларини ишлаб чи^иш, уларнинг тузилиши-ни, физик-кимёвий тавсифини ва биологик хоссаларини урганишга, тиб-биёт амалибтига вируслар ва хламидиялар ривожланишига к;аршилик кур-сатувчи ю^ори активликда интерферон х,осил килувчи восита сифатила ^улланиш арафасида турган, сувда эрувчан оксидланган ацетилцеллюлоза ва 2-оксибензиламиннинг узаро конденсацияланиш реакцияси махсулоти -Саврац препаратининг нишонланган намунасини синтез цилиш, тузилишини урганиш. ва биологик хусусиятларини текширишга баришланган.

Синтез ^илинган ароматик аминларнинг янги азометин ^осилаларшш тузилиши УБ- ва ИК-спектрлари ёрдамида исботланди ва улардан 3-кар-бокси-4-гидроксианилиннинг ^ужайра учун кам захарлилиги ва юк.ори интерферон з^осил цилиши хамда вирусларга щарши активлилиги анщланди.

Тритийни термик активлаш услубидан фойдаланиб Саврац препаратининг нишонланган ^осиласи синтез килинди ва физик-кимевий тавсифлари урганилди.

Текширишлар натижасида Саврац препаратининг кам захарлилиги ва унинг ^ужайра макромолекуласининг биологик синтезига таъсир курсати-ши аницланди. Нишонланган Саврац препаратидан фойдаланиб, препарат-нинг фармакокинетикаси ва ^ужайрага таъсири урганилди. Олинган нати-жалар фармакологик цумита учун тайерланган. "Саврац препаратини хла-мидия ва гепатит ю^умли касалликларига царши ишлатиш" ^ужжатига ки-ритилди.

Mlrzaev R.T.

Synthesis, structure and interferonlnductIon activity of some azomethin derivatives of aromatic amins

New azomethin derivatives of aromatic amins with oxydlzed wa-tersoluble acetylcellulose have been synthesized. Their strue turf was proved by help of modern methods of physico-chemical analysis It was.shown that obtained compounds can Induce an Interferon forma -tlon, moreover 3-carboxy-4-hydroxyanlllne derivative has the iarges' activity.

Some radioactive analoges OVJSAC (oxidated water-soluble acetyl-cellulose) and Interferon Inductor Sovraz having an activity to the khlamidic Infection and gepatit virus were synthesized. Method of purification of synthesized compounds was developed and their some physico-chemical parameters were established. Properties of the azo-rnetin bond in some model systems and biological synthesis of the cellular rnacromolecules under action of the interferon inductor Sovraz were investigated. The method of Introduction of the Isotoplc mark in an different parts of molecular of the interferon inductor by the thermic activation of the molecular tritium in mild conditions was developed. It v/as shown that in conditions of interferon induction (6-8 hours at the concentration 110-125 mkg/ml) Sovraz did njt penetrate in cell, but sorbed at the receptors of the cellular surface. It was established by the investigation of pharmakokinetics of 3H-Sovraz that main part radioactivity was removed from the organism during a first days.

Пидпискмо к печати ¡dú.O't. ЭЬг. Заказ № 73 Тираж 60 экз. Обь«« I п/л. Отпечатаю на ротапринт« ИЗ Ali Республика Узбекистан г.Таикент ул. М/минина I)