Аналоги нуклеозидов, содержащие 1,2,4-триазольный фрагмент тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Матвеев Андрей Валерьевич

АНАЛОГИ НУКЛЕОЗИДОВ, СОДЕРЖАЩИЕ 1,2,4-ТРИАЗОЛЬНЫЙ ФРАГМЕНТ

02.00.10 - Биоорганическая химия

5 ДЕК 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2013

005542991

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, академик РАН Швец Виталий Иванович Официальные оппоненты:

руководитель лаборатории искусственного антителогенеза ФГБУН "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства", Позмогова

доктор химических наук, профессор Галина Евгеньевна

с.н.с лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБУ "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе" РАМН, Тевяшова

кандидат химических наук Анна Николаевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Защита состоится 23 декабря 2013 года в _ часов на заседании

Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова (119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86).

Автореферат разослан ноября 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

В терапии заболеваний, вызываемых РНК- и некоторыми ДНК-вирусами, широко используется рибавирин (1-р-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид). Среди этих вирусов, провоцирующих социально-значимые инфекции, вирус гепатита С (ВГС), вызывающий тяжелое поражение печени и других органов, коронавирусы, вызывающие острые бронхиты и пневмонии, особенно тяжелое течение которых наблюдается у детей в возрасте до года, парамиксовирусы, вызывающие тяжёлую инфекцию - респираторный синцитиальный синдром, флавивирусы, такие как: вирус жёлтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус лихорадки Денге и другие. Данный препарат известен уже 40 лет, однако, если для обоснования его биологической активности по отношению к РНК-вирусам существует ряд теорий, то его активность в отношении ДНК-вирусов до сих пор недостаточно объяснена. Одним из механизмов действия рибавирина считается его встраивание в вирусную РНК, реплицируемую вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой, или ингибирование данного фермента. Возможность такого встраивания вытекает из сходства структур рибавирина и гуанозина -компонента ДНК и РНК. Поиск зависимости между структурой нуклеозидных аналогов и их субстратной специфичностью в отношении вирусных ферментов является актуальной задачей медицинской химии, решение которой позволит разработать новые эффективные противовирусные агенты нукпеозидной природы.

Вариации структуры аналогов нуклеозидов могут быть осуществлены по

гетероциклическому основанию (рибавирин, вирамидин, кладрибин, 6-

арилпуриновые аналоги нуклеозидов), по фрагменту сахара (ацикловир,

зидовудин, гемцитабин, левовирин) или по обоим фрагментам (НЕРТ).

Изменение структуры сахарного фрагмента обычно радикально меняет

биологическую мишень препарата. Поиск аналогов рибавирина, также

являющихся субстратами вирусных ферментов, должен вестись среди

соединений, модифицированных по гетероциклическому основанию.

Возможностей для таких модификаций (если не рассматривать замену 1,2,4-

триазольного ядра на другой гетероцикл) немного - это видоизменение

карбоксамидной группы в положении 3 (именно этим путём был обнаружен

з

современный перспективный аналог рибавирина - вирамидин) и введение заместителей в положение 5 триазольного кольца. Из-за синтетических сложностей число работ, посвященных данной теме, невелико. К тому же, ранее считалось (на примере 5-метилрибавирина), что заместитель в 5-ом положении приводит к снижению активности соединения. Однако, в последние годы были обнаружены факты, противоречащие этому представлению. В частности, при введении этинил-арильных заместителей в 5 положение 1,2,4-триазольного кольца, аналоги рибавирина проявляют активность по отношению к ВГС, превосходящую активность рибавирина, а при восстановлении кратных связей в этинильной группировке происходит практически полная потеря биологической активности [Jinqiao Wan, Yi Xia, Yang Liu, Menghua Wang, Palma Rocchi, Jianhua Yao, Fanqi Qu, Johari Neyls, Juan L. lovanna, and Ling Peng "Discovery of Novel Arylethynyltriazole Ribonucleosides with Selective and Effective Antiviral and Antiproliferative Activity" // J. Med. Chem. 2009, 52, 1144-1155]. Таким образом, изучение связи между химической структурой и активностью синтетических аналогов рибавирина актуально на настоящий момент, а результатом такой работы должны стать новые знания о природе вирусных ферментов и, возможно, новые препараты для борьбы со многими социально значимыми вирусными инфекциями.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова по гранту РФФИ 10-04-01020а (2010-2011 гг. тема НИР 1Г-51-356) и государственному контракту П1085 от 31 мая 2010г. (2010-2012 гг., тема НИР 2Б-72-356).

Цели и задачи работы. Изучение способов получения и биологической активности аналогов нуклеозидов, содержащих 1,2,4-триазольный фрагмент, на примере 5-замещенных 1-Э-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамидов. Данный ряд соединений возможно получить двумя способами: химико-ферментативным или химическим.

Для ферментативного получения аналогов нуклеозидов было необходимо разработать синтез 5-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоксамидов и изучить субстратную специфичность ферментов, осуществляющих реакцию трансгликозилирования - генноинженерных

пуриннуклеозидфосфорилаз - по отношению к этим соединениям.

4

Для химического синтеза аналогов нуклеозидов оказалось необходимо получить ряд эфиров 5-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот и разработать методику гликозилирования.

Получив ряд аналогов рибавирина, модифицированных по 5-му положению триазольного кольца, следовало выяснить их активность по отношению к вирусу гепатита С.

Научная новизна. В ходе настоящего исследования разработан новый универсальный способ получения 5-алкил/арил-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот и их производных. Предложенный способ дает удобную возможность получения нового класса 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот и их производных с широким разнообразием заместителей в 5-положении триазольного кольца.

Синтезированы ряд новых производных 5-алкил/арил-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот.

Синтезировано 7 ранее не описанных аналогов рибавирина - 5-алкил/арил-замещенных 1 -(3-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-

карбоксамидов.

Изучены физико-химические и биологические свойства данных соединений, в частности их биологическая активность по отношению к вирусу гепатита С.

Практическая значимость. Определены возможности и ограничения химико-ферментативного способа синтеза новых 5-алкил/арил-замещенных структурных аналогов противовирусного препарата рибавирина. Показана невозможность получения данных аналогов нуклеозидов биотехнологическим способом с использованием генно-инженерных ферментов пуриннуклеозидфосфорилаз.

Синтезирован ряд новых аналогов рибавирина - 5-алкил/арил-замещенных 1 -р-О-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамидов, для которых установлено наличие противовирусной активностью по отношению к вирусу гепатита С.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, включенных в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных

результатов диссертаций ВАК. Получен 1 патент РФ.

5

Результаты, полученные в диссертационной работе, были доложены и представлены на следующих всероссийских и международных научных конференциях: XII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2008», Волгоград, 2008 год; Международном симпозиуме «Advanced Science in Organic Chemistry», Мисхор, Крым, 2010 год; XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2010», Суздаль, 2010 год; XIII молодежной школы-конференции по органической химии, Новосибирск, 2010 год.; Международной конференции с элементами научной школы для молодежи «Инновационные материалы и технологии в химической и фармацевтической отраслях промышленности», Москва, 2010 год. Положения, выносимые на защиту.

1. Новый удобный метод получения 5-замещенных производных 1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот.

2. Получение ряда этиловых эфиров и амидов 5-алкил/арил-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот.

3. Изучение возможных путей получения 5-алкил/арил-замещенных 1-(3-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамидов и их физико-химических свойств.

4. Результаты исследования противовирусной активности аналогов нуклеозидов из ряда 5-алкил/арил-замещенных l-p-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамидов по отношению к вирусу гепатита С.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 42 схем, 11 рисунков, (о таблиц и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы ( наименований).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Число исследований, посвященных структурным аналогам рибавирина, видоизмененным по гетероциклическому основанию, невелико. Ранее, на примере 5-метилрибавирина, считалось, что введение заместителей в 5-е положение 1,2,4-триазольного кольца снижает противовирусную активность

соединения. Тем не менее, 5-метилрибавирин имеет значительную активность по отношению к вирусу гриппа. Также существуют данные, что при введении арилэтинильных заместителей в 5-е положение 1,2,4-триазольного кольца, аналоги рибавирина проявляют активность по отношению к вирусу гепатита С, превосходящую активность рибавирина. В связи с этим значительный интерес вызывает зависимость противовирусной активности 5-замещенных аналогов рибавирина от структуры заместителя.

Получение рибавирина и его замещенных аналогов возможно двумя способами: ферментативным трансгликозилированием, осуществляемым ферментом пуриннуклеозидфосфорилазой (ПНФ), из синтетических 1,2,4-триазол-3-карбоксамидов и природных азотистых оснований или полностью синтетическим путем.

Основу биотехнологического подхода к синтезу рибавирина составляет реакция трансгликозилирования - ферментативная реакция переноса рибозы с природного азотистого основания (гуанина, гипоксантина и т.п.) на 1,2,4-триазол-3-карбоксамид. В отличие от ПНФ человека, бактериальный фермент способен воспринимать 1,2,4-триазол-З-карбоксамид и его структурные аналоги в качестве субстрата. Механизм реакции трансгликозилирования представлен на схеме 1.

Схема 1. Химико-ферментативный синтез аналогов рибавирина.

1. Синтез 5-замещенных производных 1.2.4-триазол-З-карбоновой кислоты.

Таким образом, для изучения возможности синтеза аналогов нуклеозидов ферментативным способом, стало необходимым получить ряд 5-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоксамидов, которые бы удовлетворяли нескольким требованиям:

о

но

■сомн-

• растворимость в воде;

• устойчивость заместителей в среде проведения трансгликозилирования (фосфатный буфер);

В качестве таких заместителей в 5-м положении триазольного кольца были выбраны галогены (С1,Вг,1), нитрогруппа, алкильные заместители (С2-С5) линейного, разветвленного и циклического строения и арильные заместители (фенил).

Введение 5-галоген- и 5-нитрогрупп осуществляли посредством реакции Зандмейера (схема 2). Исходным соединением служила 5-амино-1,2,4-триазол-З-карбоновая кислота (1). Из данной аминокислоты известным способом была получена диазониевая соль (2), которую затем обрабатывали соответствующими солями одновалентной меди. Полученные таким образом 5-галоген и 5-нитро-1,2,4-триазол-3-карбоновые кислоты этерифицировали в метаноле при помощи хлористого тионила и 5-галоген- и 5-нитро-1,2,4-триазол-3-карбоксамиды (3-6) получали обработкой соответствующих метиловых эфиров ЮМ аммиаком в метаноле.

М НС1 м м

Н N—N

Н

(1)

СиНа!

На! = С!, Вг, I

(3-5)

Схема 2. Получение амидов 5-галоген- и 5-нитро-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты.

Получение 5-алкил-1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот описано в литературе только для первого члена гомологического ряда - 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты (8). Примечательным стал факт получения

8

этилового эфира 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты термической циклизацией р-ацетиламидразона (7) (схема 4), однако даже для этилового эфира 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты (8) выход был весьма низким, а получить таким же способом другие члены гомологической последовательности не удалось.

Схема 3. Получение этилового эфира 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты.

Нами были опробованы пути подобной циклизации в различных растворителях, а также с удалением воды, однако выход целевого вещества по прежнему оставался неудовлетворительным. Однако, при циклизации соединения (7) в уксусном ангидриде, был получен этиловый эфир 5-метил-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты с выходом 70%.

о

ын-ын о

N1—N н

(7)

(8)

II

о

о

Е1

сн.

I

о

N—N

Н

N—N

Н

(10)

Схема 4. Циклизация /3-пропиониламидразона (9).

(Ц)

При попытке распространить данный способ синтеза на другие гомологичные р-ациламидразоны выяснилось, что уже из р-пропиониламидразона (9) преимущественно образуется этиловый эфир 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты (10) - 85%, а не этиловый эфир 5-этил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты (11), которого в продукте реакции обнаружено всего 15%. Данный факт дает возможность предположить механизм циклизации, представленный на схеме 4.

Опираясь на полученные данные, нами была разработана оригинальная методика получения 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот и их производных, заключающаяся в циклизации (3-ациламидразонов при нагревании до кипения в пиридине с хлорангидридами карбоновых кислот, соответствующих ацильным группам р-ациламидразонов.

Исходные p-ациламидразоны получали двумя способами (схема 5): либо взаимодействием гидрохлорида иминоэфира (12), полученного из этилцианоформиата, с гидразидами карбоновых кислот (13 а-ж) в безводном этиловом спирте, с последующей обработкой полученного гидрохлорида р-ациламидразона (15 а-ж) водным раствором поташа, либо взаимодействием между этиловым эфиром тиооксамовой кислоты (14) и гидразидами карбоновых кислот (13 а-ж) в этиловом спирте.

\ ЕЮН \У/Н; Cl H2N~N\_ '-ЕЮН

EtO AcCl ЕЮ OEt O 2. KX03 / }l20

ЕЮ NH O

(12) (13 а-ж) ^—R

O NH-NH

O O pr O S H,N—NH CiOH

У^ PA> y^ + 2 yR irL (15 а-ж)

EtO NH2 EtO NH2 o

(14) (13 а-ж)

R = Et, n-Pr, i-Pr, c-Pr, i-Bu, t-Bu, Ph a 6 в г д еж

Схема 5. Получение ¡3-ациламидразонов (15 а-ж).

Полученную серию р-ациламидразонов (15 а-ж) вторично ацилировали соответствующими хлорангидридами карбоновых кислот в пиридине и, без

выделения, циклизовали в этиловые эфиры 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот (16 а-ж) нагреванием до кипения реакционной массы (схема 6). В реакционной смеси методами ТСХ и ВЭЖХ-МС было выявлено наличие как Ы-ацилированного, так и ЫН-свободного продукта (наличие в смеси ЫН-свободного продукта объясняется лабильностью Ы-ацильной связи в данном соединении и, по-видимому, частичным гидролизом указанной связи на силикагеле). На стадии выделения продуктов применялась промывка реакционной массы последовательно 5% раствором хлороводорода и 5% раствором гидрокарбоната натрия в воде. Структура и чистота полученных соединений (15 а-ж) подтверждена методами 1Н и 13С ЯМР-спектроскопии, а также ВЭЖХ и масс-спектрометрией высокого разрешения. Таким образом было показано, что при данном способе обработки происходит гидролиз Ы-ацильной группы, что, в свою очередь, приводит к образованию искомых соединений без дополнительной реакционной стадии. Также гидролиз имеет место и при попытке разделения исходной смеси методом колоночной хроматографии на силикагеле (элюент - хлороформ).

о ны.

К К

мн-ын о ( 15 а-ж)

Ь

Ру

О N. ОЕ1 >

мн-мн

и: к

14

л

N—N

л

N—N Н

(16 а-ж)

ЫН.

ОЕ1

Л

N—N

Н

(17 а-ж)

К = Е1, п-Рг, ¡-Рг, с-Рг, ¡-Ви, 1-Ви, РИ а б в г д еж

Схема 6. Получение эфиров 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот и их амидов.

Из серии этиловых эфиров 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот (16 а-ж) обработкой ЮМ метанольным раствором аммиака был получен ряд амидов (17 а-ж), на которых изучалась субстратная

специфичность генноинженерных пуриннуклеозидфосфорилаз и возможность биотехнологического получения аналогов рибавирина.

2._Оценка_возможности_химико-ферментативного

(биотехнологического) способа получения аналогов рибавирина с 5-замещенным 1.2.4-триазол-З-карбоксамидным фрагментом.

Химико-ферментативный способ синтеза рибавирина и некоторых его аналогов основан на реакции трансгликозилирования (схема 1), осуществляемой рекомбинантным термостабильным ферментом пуриннуклеозидфосфорилазой (КФ 2.4.2.1) из веоЬасШиз з1еаго№егторНИиз В-2194, ферменты были продуцированы в рекомбинантных штаммах Е. соН В1_21(0ЕЗ)/рЕРР11РННО1. Данный способ получения модифицированных нуклеозидов относительно прост, удобен и селективен: осуществляется в одну стадию, не требует введения защитных групп, приводит к образованию исключительно (3-аномерного продукта. В качестве исходных веществ используют природный нуклеозид - инозин, и амиды 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот.

Стандартные реакционные смеси содержали: контрольная - природный нуклеозид инозин, экспериментальная - модифицированное основание (5-алкил/арил-1,2,4-триазол-З-карбоксамид, либо 5-галоген-1,2,4-триазол-З-карбоксамид, либо 5-нитро-1,2,4-триазол-З-карбоксамид) и инозин в соотношении 1:2 по молям. В каждую реакционную смесь добавляли ПНФ. Степень конверсии исходных соединений контролировали с помощью ВЭЖХ.

Заключение о субстратной специфичности аналогов 1,2,4-триазола делали на основе сравнения количества гипоксантина (продукта ферментативного расщепления инозина) в экспериментальной и контрольной смесях, а также присутствия в реакционной смеси новых нуклеозидов (по данным ВЭЖХ и масс-спектрометрии). Одинаковое количество гипоксантина в контрольной и экспериментальной (содержащей модифицированное основание) смесях свидетельствует о том, что тестируемое основание не является ни субстратом, ни ингибитором нуклеозидфосфорилаз.

Ни одно из синтезированных 5-замещенных (соединения 3-6, 17 а-ж)

производных триазола не являются ни субстратами, ни ингибитором для

ПНФ. Введение объемных заместителей в 5 положение 1,2,4-триазол-З-

12

карбоксамида (больших по объёму, чем метил), возможно приводит к возникновению стерических затруднений при связывании основания с активным центром фермента (соединения 17 а-ж).

3. Химическое получение аналогов рибавирина с 5-замещенным 1,2.4-триазол-З-карбоксамидным фрагментом.

Нами было показано, что 1,2,4-триазол-З-карбоксамиды, содержащие в 5-м положении галоген и нитро-группу, не являются субстратами ПНФ. Получение аналогов рибавирина, содержащих в 5-м положении галогены и нитро-группу, и их биологическая активность описаны в литературе. Поэтому синтез таких нуклеозидных аналогов оказался нецелесообразным. Нашей задачей стала разработка способов получения и синтез 5-алкил/арилзамещенных аналогов рибавирина.

Получение нуклеозидных аналогов химическим путем, по литературным данным, возможно осуществлять при помощи прямого гликозилирования эфиров 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот в присутствии кислых катализаторов. Ряд этиловых эфиров 5-замещенных 1,2,4-тразол-З-карбоновых кислот был получен в качестве промежуточных соединений на пути синтеза амидов. Поэтому нами был выбран данный путь синтетического получения аналогов нуклеозидов.

Подобный способ, согласно литературным данным, заключается во

взаимодействии 1,2,3,5-тетра-0-ацетил-0-рибофуранозы и NH-свободного

эфира 1,2,4-триазолкарбоновой кислоты в присутствии кислого катализатора

при температуре 140-160°С при пониженном давлении без растворителя.

[Witkowski, J. Т.; Robins, Roland К.; Sidwell, Robert W.; Simon, Lionel N. "Design,

synthesis, and broad spectrum antiviral activity of 1-6eTa-D-ribofuranosyl-1,2,4-

triazole-3-carboxamide and related nucleosides" // Journal of Medicinal Chemistry

(1972), 15(11), 1150-4, Naik, S. R.; Witkowski, J. T.; Robins, Roland K. Synthesis

of nucleosides of 5-substituted-1,2,4-triazole-3-carboxamides // Journal of

Heterocyclic Chemistry (1974), 11(1), 57-61, US patent 3798209, 3897415] Ha

стадии подготовки исходной смеси реагентов, подвергаемых в дальнейшем

термической обработке, по литературным данным, используется хлористый

метилен, в котором рекомендуется растворить все исходные компоненты, для

лучшей гомогенности смеси, а затем удалить его при пониженном давлении

13

на роторном испарителе. Гомогенизированную смесь реагентов нагревают при пониженном давлении, затем из реакционной смеси, посредством колоночной хроматографии на силикагеле, выделяют два аномера целевого 2',3',5'-ацетилированного аналога нуклеозида, причем а-аномер образуется в минорных количествах.

Для расширения данной методики синтеза аналогов нуклеозидов на эфиры 5-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот, нами при помощи стандартных методов (схема 7) была получена 1,2,3,5-тетра-0-ацетил-0-рибофураноза, после чего, была воспроизведена вышеприведенная методика. В качестве аналога основания был выбран этиловый эфир 5-этил-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты, а в качестве катализатора - бис-п-нитрофенилфосфат (схема 8). Использование хлористого метилена на стадии подготовки реагентов приводило к выходу целевого этилового эфира 1-(2',3',5'-три-0-ацетил)рибофуранозил-5-этил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты в 28%, что является неудовлетворительным.

Схема 7. Получение 1,2,3, Б-тетра-О-ацетил-О-рибофуранозы.

Варьирование таких параметров реакции как температура (в диапазоне 140-165°С) и время реакции (15-60 мин) ощутимого влияния на выход целевого продукта не оказывало. Замена же хлористого метилена на этиловый спирт, обеспечивает более высокую гомогенизацию смеси реагентов, что приводит к увеличению выхода целевого продукта до 54%. Таким образом нам удалось оптимизировать условия проведения реакции гликозилирования, увеличив выход целевого продукта почти в 2 раза.

АсО.

( 19 а-ж)

К = п-Рг; ¡-Рг; с-Рг; ¡-Ви; 1-Ви; Р11. а, б, в, г, д, е, ж.

Схема 8. Общая схема получения аналогов нуклеозидов, содержащих фрагмент 5-замещенного 1,2,4-триазол-З-карбоксамида.

При помощи вышеописанного модифицированного способа (схема 8), было получено семь аналогов нуклеозидов (соединения 19 а-ж), содержащих фрагмент 1,2,4-триазол-З-карбоксамида, шесть из которых ранее описаны не были.

Структура данных соединений подтверждена методами 1Н и 13С - ЯМР спектроскопии, а также ВЭЖХ и масс-спектрометрии высокого разрешения. Одинаковая аномерная конфигурация полученных соединений подтверждается похожими химическими сдвигами (5,73 - 5,92 м.д.) и константами спин-спинового взаимодействия (4,0 - 4,6 Гц) сигналов 1'Н протонов в 1Н-ЯМР спектрах всех полученных соединений. В случае 5-изопропил производного, из реакционной смеси удалось выделить оба аномера, причем а-аномер в минорных количествах, химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия сигналов 1'Н протонов в 1Н- ЯМР спектрах этих аномеров представлены на рисунке 1.

1'Н-а J=12.20 Ш

сн3

1'Н-р 5=4.53 т

но

ын2

5.8

5.7

5.6

5.5

5.4

СЬегГ||Сб (ррт)

Рис 1. Фрагменты 1Н- ЯМР спектров а и /З-аномеров 5-изопропил-1-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамида.

Для точного отнесения сигналов и доказательства аномерной конфигурации полученных аналогов нукпеозидов нами были применены такие методы двумерной ЯМР-спектроскопии как корреляционная спектроскопия 1Н,1Н-СОЗУ (рисунок 2) и 1Н,1Н-1\ЮЕ5У (рисунок 3) на примере 5-циклопропил-1 -р-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамида.

На спектре 1Н,1Н-1\ЮЕЗУ 5-циклопропил-1-р-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (рисунок 3) присутствуют сигналы соответствующие взаимодействию между протонами 1'Н и 2'ОН, 2'ОН и З'ОН, 1'Н и СН циклопропильного заместителя, кросс-пик же от взаимодействия 1'Н и 2'Н не прослеживается. Следовательно, протоны 1'Н, 2'ОН и З'ОН сближены в пространстве, а протоны 1'Н и 2'Н - удалены друг от друга, что подтверждает р-конфигурацию данного аналога нуклеозида.

1Н,ХН-СОвУ

А

7.5 7.С

6.5

6.0 5.5

5.0

4.5

4.0 3.5

3.0

Рис. 2 Записанный методом корреляционной спектроскопии ЯМР-спектр (1Н,1Н-СОБУ) 5-циклопропил-1-13-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида.

ррт -1.0 -1.5 -2.0 -2.5 -3.0 -3.5 -4.0 -4.5 -5.0 -5.5 -6.0 -6.5 -7.0 7.5

2.5 2.0 1.5 1.0 ррт

Рис. 3 Фрагмент ЯМР-спектра (1H,1H-NOESY)

5-циклопропил-1 -ß-D-pu6o<fiypaHC>3un-1,2,4-триазол-З-карбоксамида.

4. Исследование биологической активности 5-замещенных аналогов рибавирина.

Противовирусная активность в отношении вируса гепатита С (ВГС) для полученных соединений (19 а-ж) была исследована на стабильной клеточной линии Huh7, содержащей люцифераза-кодирующий полноразмерный репликон ВГС (изолят Соп1). Цитотоксичность синтезированных аналогов рибавирина была исследована на неинфицированных клетках линии Huh7 при помощи стандартного МТТ-теста (Sigma). Результаты исследования противовирусной активности представлены в таблице 1.

Соединение R EC50a, MKM CC5o6, mkM SIB

Рибавирин Н 6,0 ±0,5 470 ± 14 78 ± 10

5-метилрибавирин Me 40,3 ± 1,8 >500 >12

19а Et 40,4 ± 1,1 >500 > 12

196 n-Pr 38,2 ± 1,7 > 500 > 13

19 в i-Рг 54,0 ± 8,3 > 500 >9

19 г cyclo-Pr >100 > 500 -

19 д i-Bu 99 ± 9,1 > 500 >5

19 е tert-Bu 32,1 ±0,9 > 500 > 16

19 ж Ph 19,0 ±0,7 > 500 > 26

Таблица 1. Противовирусная активность 5-замещенных аналогов рибавирина по отношению к вирусу гепатита С. а>концентрация соединения, на 50% подавляющая репликацию вируса; б> концентрация соединения, вызывающая гибель 50% культивируемых клеток; е> индекс селективности - отношение СС50/ЕС50.

По данным, приведенным в таблице 1, можно сделать вывод о наличии

у нового класса аналогов нуклеозидов, содержащих фрагмент 5-алкил/арил-

1,2,4-триазол-З-карбоксамидов, противовирусной активности в отношении

ВГС. С увеличением объема заместителя активность соединений 19 а-д

снижается ( в 16,7 раза для 19 г,д), однако соединения 19 е,ж, содержащие в

5-м положении трет-бутильный и фенильный заместители соответственно,

оказались всего лишь в 5,3 (19 е) и в 3,2 (19 ж) раза менее активными, чем

рибавирин, превосходя активность 5-метилрибавирина. Цитотоксичность всех

19

веществ исследуемого ряда оказалась ниже, чем у рибавирина. Индекс селективности наиболее активного соединения 19 ж уступает тому же показателю для рибавирина в 3 раза.

Таким образом, не наблюдается прямой зависимости между объемом и структурой заместителя в 5-положении триазольного кольца рибавирина и противовирусной активностью аналогов рибавирина в отношении ВГС.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый метод синтеза производных 5-алкил/арил-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот, получены семь производных 5-алкил/арил-замещенных 1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот, шесть из которых ранее не описаны.

2. Проведено изучение путей синтеза аналогов нукпеозидов, содержащих фрагмент 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, показано, что химико-ферментативный способ с ферментом ПНФ малоэффективен и данным способом возможно синтезировать только б-метил-1-p-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид.

3. Подобраны условия химического синтеза аналогов нуклеозидов, содержащих фрагмент 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида. Показано, что реакция протекает преимущественно с образованием р-аномеров с выходами, превышающими выходы исходной методики в 1,5-2 раза.

4. Получены семь аналогов нуклеозидов, содержащих в качестве гетероциклического основания 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоксамиды и изучены их физико-химические свойства. Шесть из них ранее не описаны в литературе.

5. Проведено изучение полученных аналогов нуклеозидов, содержащих фрагмент 5-алкил/арил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, на стабильной клеточной линии Huh7, содержащей полноразмерный репликон вируса гепатита С. Показано наличие у синтезированного ряда соединений противовирусной активности в отношении вируса гепатита С уступающей активности рибавирина в три и более раз.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. М.В. Чудинов, A.B. Матвеев, Н.И. Журило, В.В. Простакова, В.И. Швец Новые подходы к синтезу низкомолекулярных производных 1,2,4-триазола. // Вестник МИТХТ, 2011, t.VI, №2, 66-70.

2. И.Д. Константинова, М.В. Чудинов, И.В. Фатеев, A.B. Матвеев, Н.И. Журило, В.И. Швец, А.И. Мирошников Нуклеозиды 1,2,4-триазола -возможности и ограничения химико-ферментативного способа получения II Биоорганическая химия, 2013, т. 39, № 1, 61-80.

3. М.В. Чудинов, A.B. Матвеев, В.И. Швец Способ получения 5-замещенных 1-Н-1,2,4-триазолкарбоновых кислот и их производных // Патент РФ №2446163 от 27.03.2012.

4. A.B. Матвеев, М.В. Чудинов, В.И. Швец Изучение путей синтеза аналогов 1,2,4-триазол-З-карбоксамида // Тезисы XII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2008», Волгоград, 9-11 сентября 2008г., с. 136-137.

5. М.В. Чудинов, A.B. Матвеев, В.И. Швец Новый эффективный способ синтеза 5-алкил(арил)-замещенных 1 -Н-1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот // Тезисы конференции «Advanced Science in Organic Chemistry-2010», Украина, АР Крым, п. Мисхор, 21-25 июня 2010г., с. 237.

6. A.B. Матвеев, М.В. Чудинов, В.В. Простакова, В.И. Швец Новый способ получения Рибавирина // Тезисы конференции «Advanced Science in Organic Chemistry-2010», Украина, АР Крым, п. Мисхор, 21-25 июня 2010г., с. 141.

7. A.B. Матвеев, М.В. Чудинов, В.И. Швец Новый способ получения производных 1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты // Тезисы XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии», Суздаль, 28 июня - 2 июля 2010г., с. 220.

8. A.B. Матвеев, М.В. Чудинов, В.И. Швец Новый реагент для гетероциклического синтеза // Тезисы "XIII молодежной школы-конференции по органической химии", Новосибирск, 12-19 сентября 2010г., с. 141.

9. A.B. Матвеев, М.В. Чудинов, В.И. Швец Новый синтез рибавирина //

Тезисы Международной конференции с элементами научной школы

21

для молодежи «Инновационные материалы и технологии в химической и фармацевтической отраслях промышленности», Москва, 8-9 сентября 2010 г, с. 75-76.

Матвеев Андрей Валерьевич Аналоги нуклеозидов, содержащие 1,2,4-триазольный фрагмент Формат 60x90/16 Усл. п. л. 1.5 Тираж 100 экз. Подписано в печать 19.11.2013 Заказ № 140 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТОНКИХ ХИМИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

04201451881

На правах рукописи

МАТВЕЕВ АНДРЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

АНАЛОГИ НУКЛЕОЗИДОВ, СОДЕРЖАЩИЕ 1,2,4-ТРИАЗОЛЬНЫЙ ФРАГМЕНТ

Специальность 02.00.10. - Биоорганическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор, академик РАН

Швец В. И.

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список условных обозначений и сокращений.........................................4

1. Введение...............................................................................................5

2. Литературный обзор...........................................................................10

2.1 Синтез рибавирина и его аналогов..............................................10

2.1.1 Синтез производных 1Н-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты............................................................................................10

2.1.2 Способы образования гликозидной связи в молекуле рибавирина и его аналогов.............................................................18

2.1.2.1 Химическое рибозилирование........................................18

2.1.2.2 Химико-ферментативное рибозилирование...................22

2.1.2.3 Синтез на основе гидразидов рибозы.............................23

2.1.3 Возможные пути модификации молекулы нуклеозидного аналога....................................................................24

2.1.4 Пролекарственные формы рибавирина................................35

2.2 Биологическая активность рибавирина и его аналогов..............37

2.2.1 Рибавирин: механизм действия и побочные эффекты........38

2.2.2 Монотерапия и комбинированная терапия с помощью рибавирина......................................................................................41

2.2.3 Аналоги рибавирина...............................................................43

2.2.3.1 Вирамидин........................................................................43

2.2.3.2 Мизорибин........................................................................44

2.2.3.3 Этинилсодержащие аналоги рибавирина.......................45

2.2.3.4 Аналоги рибавирина с гидрофобными заместителями в гетероциклическом основании.......................46

2.2.4 Специфическая Таргетная Антивирусная Терапия ВГС (СТАТ-С)...........................................................................................47

2.2.5 Противовирусная активность рибавирина и его

аналогов...........................................................................................49

3. Теоретическая часть..........................................................................53

3.1 Синтез 5-замещенных производных 1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты............................................................................54

3.2 Оценка возможности химико-ферментативного (биотехнологического) способа получения аналогов рибавирина с 5-замещенным 1,2,4-триазол-З-

карбоксамидным фрагментом............................................................65

3.3 Химическое получение аналогов рибавирина с 5-замещенным 1,2,4-триазол-З-карбоксамидным фрагментом...........67

3.4 Исследование биологической активности 5-замещенных аналогов рибавирина..........................................................................76

4. Экспериментальная часть..................................................................78

5. Выводы..............................................................................................101

6. Публикации автора...........................................................................102

7. Благодарности..................................................................................104

8. Список литературы...........................................................................105

Список условных обозначений и сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

ВГС - вирусный гепатит С

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ДМСО - диметисульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИМФДГ - инозинмонофосфатдегидрогеназа

ПНФ - пуриннукпеозидфосфорилаза

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТФ - рибавиринтрифосфат

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

CDI - карбонилдиимидазол

1. Введение.

Ежегодно ВГС становится причиной смерти около 500 тыс. пациентов в мире. Для лечения пациентов, инфицированных ВГС, в настоящее время применяется сочетание двух препаратов -интерферона А и нуклеозидного аналога рибавирина, однако эффективность этой терапии крайне невысока. Она достигает 60 % при применении стандартной схемы лечения: пегилированный а-интерферон (ред1РМа) совместно с рибавирином [1]. Несмотря на интенсивные поиски других вариантов химиотерапии ВГС в последние годы, селективные и малотоксичные терапевтические агенты из других классов химических соединений предложены не были.

Вирус гепатита С - небольшой сферический РНК-содержащий вирус, покрытый капсидной оболочкой с размером вириона 55-65 нм. Известно, по крайней мере, 6 различных генотипов и более чем 30 подтипов этого вируса. Между подтипами различия нуклеотидной последовательности генома достигают 15%. Кроме того, геном вируса постоянно видоизменяется для обеспечения защиты от иммунной системы хозяина. В ходе постоянного мутационного процесса естественным путем отбираются штаммы, способные уклоняться от действия нейтрализующих антител. Скорость изменения генетической информации вируса настолько велика, что в организме одного и того же инфицированного индивидуума возникает множество вариантов, отличающихся от «родительского» возбудителя. Жизненный цикл ВГС также имеет особенности, которые позволяют ему уклоняться от иммунного надзора. Вирус способен к длительной персистенции в клетках хозяина без выраженного цитопатического эффекта и с минимальным уровнем присутствия в периферической крови.

Рибавирин - противовирусный препарат, является синтетическим аналогом природных нуклеозидов.

Рибавирин легко проникает в пораженные вирусом клетки и быстро фосфорилируется внутриклеточной аденозинкиназой в moho-, ди- и трифосфат. Эти метаболиты, особенно трифосфат рибавирина (2), обладают выраженной противовирусной активностью. Рибавирин ингибирует репликацию новых вирионов, что обеспечивает снижение вирусной нагрузки.

Рибавирин эффективен в отношении многих ДНК и РНК вирусов, не чувствительных к другим антивирусным препаратам. Наиболее чувствительные к рибавирину ДНК-вирусы - вирус простого герпеса, вирусы группы оспы, аденовирусы, цитомегаловирус, вирус болезни Марека; РНК-вирусы - вирусы гриппа А и В, аренавирусы, буньявирусы, ретровирусы, парамиксовирусы (парагриппа, эпидемического паротита, ньюкаслской болезни), реовирусы, онкогенные РНК-вирусы. Рибавирин угнетает репликацию вирусов-возбудителей особо опасных геморрагических лихорадок как in vitro, так и in vivo. Активен в отношении респираторно-синтициального вируса.

Нечувствительные к рибавирину ДНК-вирусы - Varicella zoster, вирус псевдобешенства, натуральной коровьей оспы; РНК-вирусы -энтеровирусы, риновирусы, вирус энцефалита леса Семлики.

Трифосфат рибавирина является субстатом полимеразы вируса, и его включение в цикл репликации приводит к возникновению летальных для ВГС мутаций. Кроме того, этот трифосфат является ингибитором хеликазы вируса, и наконец, у рибавирина есть и третий механизм действия - ингибирование инозинмонофосфатдегидро-геназы клеток, что понижает количество гуаниновых нуклеотидов и отрицательно сказывается на репликации различных вирусов. Какой из механизмов действия является основным, на данный момент неясно.

Данные клинических исследований показывают, что применение рибавирина как единственного терапевтического средства при гепатите С, в том числе при его хронической форме, неэффективно.

о О

НО—

N—N

N1+

И

ОН он

(1)

О II о II О II

II Р—о- II -Р—о- II -р—

I он I он I он

он он он он

(2) (4)

Рисунок 1. Структура рибавирина и его аналогов.

Однако комбинированное лечение рибавирином и а-интерфероном больных гепатитом С, имевших рецидив заболевания на фоне монотерапии а-интерфероном, оказалось в 10 раз более эффективно, чем монотерапия а-интерфероном и примерно в 3 раза более эффективно у больных, ранее не лечившихся а-интерфероном [1]. Механизм, посредством которого рибавирин в комбинации с а-интерфероном проявляет свое противовирусное действие против вируса гепатита С, до конца неизвестен. Предполагается, что накапливающийся по мере фосфорилирования рибавирин трифосфат конкурентно подавляет образование гуанозин трифосфата, тем самым снижая синтез вирусных РНК. Считается также, что механизм синергетического действия рибавирина и а-интерферона против вируса гепатита С обусловлен усилением фосфорилирования рибавирина а-интерфероном.

Побочные эффекты рибавирина, особенно со стороны кроветворной системы, вынуждают искать альтернативные, более безопасные терапевтические агенты. Последние перспективные разработки в этом направлении - аналоги рибавирина: левовирин и вирамидин.

Левовирин (3) - 1_-энантиомер рибавирина, который обладает подобной рибавирину иммуномодулирующей активностью, но не подвергается фосфорилированию и поэтому не вызывает гемолиз эритроцитов.

Вирамидин (тарибавирин) (4) - аналог рибавирина, в котором карбоксамидная группа замещена на амидиновую, он выступает как пролекарство рибавирина, трансформируется в активную форму в печени и не накапливается в эритроцитах, тем самым существенно снижая токсическое действие фармакофора.

Молекула рибавирина состоит из остатка О-рибозы и гетероциклического основания. Возможные модификации включают замену (в том числе на ациклические структуры) сахарного остатка или его функционализацию, замену карбоксамидной группы в 3-м положении или введение заместителя в 5-м положении гетероциклического основания. Также возможно изменение структуры гетероцикла (например, замена 1,2,4-триазола на 1,2,3-триазол, имидазол или тетразол), введение других гетероатомов или изменение положения рибозильного остатка. В той или иной степени, все указанные типы модификации были опробованы ранее.

Замена сахарного остатка или его функционализация, так же как замена гетероциклического основания ведёт к изменению специфичности биологического действия, поэтому эти типы модификации будут исключены из рассмотрения.

Синтез нукпеозидов и их аналогов, как правило, включает стадию гликозилирования - образования химической связи между

гетероциклическим основанием и сахарным остатком. Структурные модификации молекулы, необходимые для получения новых аналогов, возможны либо на предыдущей стадии - в процессе построения гетероцикпа, либо на более поздней - при введении функциональных групп в молекулу нуклеозида.

Таким образом, литературный обзор будет посвящен анализу известных способов синтеза производных 1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты (гетероциклического синтона) и способов образования гликозидной связи, а также известных путей функционализации гетероциклического основания молекулы нуклеозида.

2. Литературный обзор.

2.1. Синтез рибавирина и его аналогов.

2.1.1. Синтез производных 1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой

кислоты.

При всём разнообразии известных способов синтеза производных 1,2,4-триазола, количество возможных путей получения МН-свободных 1,2,4-триазолов, содержащих в положении 3 карбоксильную группу или её производное или аналог и функционализованных по положению 5, весьма ограничено.

Ранние источники [2-4] описывают получение 1,2,4-триазол-З- (5) карбоновых кислот при окислении соответствующих алкил-1,2,4-триазолов перманганатом калия в щелочной среде (схема 1). При этом выделение их из реакционной массы иногда весьма затруднительно и связано с большими потерями. К тому же, этот способ относительно эффективен только в случае монозамещённого триазола (К=Н). При необходимости получения 5-замещённых производных возникает проблема селективного окисления.

Схема 1. Окисление метилтриазолов.

Позднее были предложены [5-7] способы получения 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты (7) и некоторых её производных (8-11) через легкодоступную 5-амино-1,2,4-триазол-З-карбоновую кислоту (5) (схема 2). Способ [6] до настоящего момента используется в промышленном синтезе рибавирина, несмотря на существенные

О

N—N Н

N—N Н

недостатки, такие как взрывоопасность и неустойчивость промежуточных продуктов.

НО

О

Л

О

+ нм

ОН

ын-ын^

ЫНо

Ч №N0, N N

восстановление р-ция Зандмейера

*- (6) --

Си+ГГ

НО но

01, Вг, Ы02, сы (8) (9) (10) (11)

Схема 2. Синтез триазолкарбоновой кислоты и её производных.

Для получения 5-галогензамещённых производных единственный альтернативный реакции Зандмейера путь - обменные реакции, которые подразумевают в качестве субстрата также галоген-или нитропроизводные. Таким путём, реакцией метилового эфира 5-нитро-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты с жидким фтороводородом при 150°С, был получен метиловый эфир 5-фтор-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты с выходом 70% [8] (схема 3).

ОТ

ОМе

ОМе

Схема 3. Синтез 5-фтор-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты.

Незамещённые и 5-алкил(арил) замещённые производные 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты (12-15) могут быть получены, исходя из различных С2-компонентов, таких, как гидразид оксамовой кислоты [9] (схема 4), эфиры оксикарбонилформимидной [10] или оксикарбонилтиоформимидной [11] кислоты (схема 6).

НЫ,

ЫН-

Н2Ы

о

г

4

о

ын-ын.

ын

N4 (12)

СН3,

о-сн3

Схема 4. Синтез из гидразида оксамовой кислоты.

(13а) (136)

Также имеются сведения о возможности получения 3,5-гетероцикл-замещенных 1,2,4-триазолов при помощи вышеуказанного способа. Например взаимодействием оксазол-2-карбогидразида и гидрохлорида пиримидин-2-карбамидина в этаноле при кипении может быть получен 2-[5-(оксазол-2-ил)-1,2,4-триазол-3-ил]пиримидин. (схема 5) [12]. Есть основания полагать, что данным способом можно получить и 5-гетероцикп-замещенные производные 1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты.

Схема 5. Получение 5-гетероциклзамещенных производных 1,2,4-триазола

Сходным образом из гидразида цианформимидной кислоты был получен 1,2,4-триазол-З-карбонитрил (16), который может быть легко превращен в другие производные 1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты или непосредственно использован в химическом синтезе рибавирина и вирамидина [13]. Однако синтез 5-замещённых карбонитрилов этим способом оказался неэффективным, даже 5-метилпроизводное было выделено только с выходом 25% [14]. Другой способ [7] получения соединения (16) - термическое декарбоксилирование 5-циано-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты (11) (схема 7).

ЕЮ

Н3С

н,с

=0

С2Н5ОН

о

о

НС1

о

г

г

-й

[МНоС!

о

н,с

о-

N (14)

сн

о

3Н3Ц

N (15)

ЫН-МН,

1) Нов

О 1МН2 ВР4~

2) Е130+ВР4

/Г

О Б-

сн.

Схема 6. Синтез на основе цианоформимидной кислоты

Нужно отметить, что традиционный способ получения нитрилов дегидратацией амидов в случае 1,2,4-триазол-З-карбоксамида (12) малоэффективен, повидимому вследствие исключительно низкой растворимости в органических средах (в том числе, обычно используемой хлорокиси фосфора) и высокой температуры плавления [15-16].

М2Н4

Ы:

Схема 7. Синтез из дициана

ЫН

(ЕЮ)3СН

ЫН-ЫК

110°С

\

N

\\ // (16)

N

Дегидратации 1,2,4-триазол-З-карбоксамида, по-видимому, препятствует и ЫН-незамещенное положение триазольного кольца, поскольку в научной литературе имеются примеры дегидратации 1-(2',3',5'-три-0-ацетил-(В-0-рибофуранозил)-1,2,4-триазол-З-карбоксамида хлорокисью фосфора в присутствии триэтиламина и 5-хлор-1-(2',3',5'-три-0-ацетил-(3-0-рибофуранозил)-1,2,4-триазол-З-карбоксамида фосгеном в присутствии пиридина на холоду (схема 8) [17].

АсО.

ОН Н

N—N

ОАс ОАс

О

N4,

РОСк

ТЭА

АсО^

-О.

N

* И

N—N

Ч Н Н У

N_И

ОАс ОАс

АсО„

Ск

-О,

N—N

V н н >

N_И,

ОАс ОАс

О

ЫН,

соси

Ру

Ск

АсО.

-О,

N—N

Vм н >>

Н^_[/А

ОАс ОАс

Схема 8. Дегидратация карбоксамидной группы аналогов нуклеозидов

Единственным описанным способом проведения данной реакции с приемлемым выходом на 1\1Н-свободном субстрате является дегидратация 1,2,4-триазол-З-карбоксамида трифторуксусным ангидридом в пиридине на холоду (схема 9) [18].

о

(СР3С0)20

Ру

Схема 9. Дегидратация 1,2,4-триазол-З-карбоксамида

Существуют общие подходы к синтезу Ы-незамещённых 1,2,4-триазолов. Наиболее универсальным можно считать способ, по которому триазолы получают взаимодействием свободных оснований иминоэфиров с гидразидами кислот (схема 10) [19].

1ЧН о

■К + Ак

О-СН, Н^-N14 ^

Я

N4 О N4—N4

N—N Н

Схема 10. Синтез из иминоэфиров и гидразидов кислот

Именно таким или сходным образом были проведены описанные ранее синтезы соединений (12-15). Из этих примеров видно, что использование этого подхода к синтезу производных [1Н]-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты ограничено набором синтонов, содержащих карбонильный остаток.

Способ получения 5-замещённых амидов [1 Н]-1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты описан в патенте [20] (схема 11).

РО

о

Г

4

о

Г

РГС(ОРГ)3

о

СЖ 2> мн2|^н2 о ын-ын2

о

Г X /

К"

0^"

N—N

н

-РГ

Схема 11. Синтез из замещенных гидразидов оксамовой кислоты

Аналогичным образом, реакцией семиоксамазида с формамидом, получали 1 [Н]-1,2,4-триазол-З-карбоксамид (12) [21].

Кроме того, существуют некоторые вариации двух последних методов получения 3,5-замещенных-1,2,4-триазолов. Суть данных способов, как и двух предыдущих, сводится к термической циклизации Р-ациламидразонов, получение которых производится разными способами.

Так, например, эфиры 5-замещенных-1,2,4-триазол-З-карбоновых кислот, либо соответствующие амиды получали взаимодействием тиоиминоэфиров с моногидразидом метилоксалата или семиоксамазидом нагревая до кипения в пиридине (схема 12). [22].

о

н

К = Ме; Вг1; р-1\Ю2Вг1.

Схема 12. Синтез из тиоиминоэфиров

Получение 3,5-замещенных-1,2,4-триазолов возможно �