Хроматографические и электрофоретические системы на основе сверхразветвленных полимеров и монолитных сорбентов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

48404ЭО

ПОЛИКАРПОВ НИКИТА АЛЕКСАНДРОВИЧ

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ СВЕРХРАЗВЕТВЛЕННЫХ ПОЛИМЕРОВ И МОНОЛИТНЫХ

СОРБЕНТОВ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат д;/ ссртации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 9 МАЙ 2011

Санкт-Петербург 2011

4846456

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в Институте аналитического приборостроения РАН.

Научный руководитель:

Доктор химических наук, профессор Карцова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Даванков Вадим Александрович (ИНЭОС РАН, Москва)

Доктор химических наук, профессор Родинков Олег Васильевич (Химический факультет, СПбГУ)

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

Защита состоится 9 июня 2011 г., в 15.00 ч.

На заседании совета Д 212.232.37 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43. Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 2011

Ученый секретарь

Диссертационного совета Панчук/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность. В последние годы отмечается повышенный интерес к полимерным материалам в связи с использованием их в хроматографических и элекгрофоретических методах разделения. К ним, в первую очередь, относятся полимеры для создания монолитных сорбентов - нового поколения стационарных фаз, а также дендримеры и сверхразветвленные полимеры.

Интерес к последним обусловлен их уникальными физико-химическими характеристиками; термическая стабильность, не зависящая от внешней среды мицеллоподобная структура, способность к образованию комплексов включения, высокая плотность терминальных функциональных групп и легкость их модификации, регулирующая растворимость и полярность. Применение дендритных полимеров в хроматографии и капиллярном электрофорезе позволяет существенно расширить аналитические возможности этих методов разделения.

Данная работа посвящена выявлению возможностей использования новых полимеров типа ядро-оболочка, состоящих из функционализированного дендритного ядра, окруженного оболочкой привитых низкомолекулярных соединений - водорастворимых производных полиэтиленимина, модифицированных мальтозой (PEI-Mal), в качестве компонентов хроматографических (высокоэффективная тонкослойная хроматография, ВЭТСХ) и элекгрофоретических (ЭКХ, КЭХ) систем на примерах разделения низко- и высокомолекулярных аналитов гидрофильной и гидрофобной природы (водо- и жирорастворимых витаминов, белков) и сопоставлению полученных результатов с использованием монолитных полимерных сорбентов в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ).

Потенциал, заложенный в таких полимерах уже обеспечил им использование в медицине в системах целевой доставки лекарств и химическом синтезе в качестве нанокатализаторов, однако до настоящего времени работ, посвященных их применению в хроматографии и электрофорезе нет.

Выявление способности этих полимеров, введенных в состав хроматографических и электрофорстических систем, влиять на миграционные характеристики аналитов, выступать в качестве модификатора стенок кварцевого капилляра и способствовать on-line концентрированию определяемых соединений позволит не только контролировать эффективность и селективность разделения компонентов сложных смесей, но и получить независимую информацию об этих новых материалах.

Работа поддержана грантами РФФИ 10-03-00902-а и РФФИ ННИО 11-03-91331_а.

Цель работы: Выявление влияния мальтозилированных сверхразветвленных полиэтилешшинов в качестве компонентов и модификаторов хроматографических и электрофоретических систем при определении биологически активных соединений.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Синтез монолитных колонок для разделения смесей белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ).

2. Выявление закономерностей влияния степени модификации и размера ядра дендритных полимеров типа ядро-оболочка в составе рабочего буфера на величину электроосмотического потока, эффективность и селективность разделения белков в режиме электрокинетической хроматографии, а также на процессы on-line концентрирования.

3. Подготовка полых колонок на основе полимеров PEI-Mal химическим и динамическим модифицированием поверхности кварцевого капилляра и выявление возможностей их использования для разделения и концентрирование модельных смесей белков в условиях капиллярной электрохроматографии.

4. Установление закономерностей влияния сверхразветвленных полимеров PEI-Mal, отличающихся массой ядра и содержанием терминальных мальтозных групп, в качестве модификаторов хроматографических фаз при различных значениях рН элюента на хроматографические характеристики гидрофильных и гидрофобных аналитов (водо- и жирорастворимых витаминов) в условиях ВЭТСХ и получение сравнительных оценочных характеристик при использовании других модификаторов - p-циклодекстрина и катионного детергента цетилтриметиламмоний бромида.

Научная новизна

Предложен вариант КЭХ, обеспеченный за счет динамического и ковалентного модифицирования поверхности кварцевого капилляра положительно заряженным мальтозилированным сверхразветвленным полиэтиленимином. Реализован вариант ЭКХ за счет введения в буферный электролит отрицательно заряженного или нейтрального полимера.

Выявлена зависимость хроматографических и электрофоретических характеристик (эффективности и селективность) изученных систем и характеристик аналитов (времена миграции и факторы удерживания) от размера ядра и степени модификации полимеров типа ядро-оболочка на примерах высокомолекулярных соединений - белков, и низкомолекулярных - водо- и жирорастворимых витаминов в методах ЭКХ, КЭХ и ВЭТСХ. Установлено, что при наличии ионных взаимодействий между полимером и

молекулами аналитов происходит существенное увеличение времен миграции в КЭХ и уменьшение величин Л/ аналитов в ВЭТСХ. При отсутствии этих взаимодействий (полимер и белок слабозаряжены или нейтральны) происходит резкое увеличение эффективности в ЭКХ.

Установлено, что лучшая селективность разделения белков реализуется при использовании монолитных колонок в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ), а максимальная эффективность - на капиллярных колонках, модифицированных дендритными полимерами, в режиме электрокинетической хроматографии (ЭКХ).

Предложена схема изготовления полых колонок на основе ковалентно привитого сверхразветвленного полимера, примененная для on-line концентрирования (стэкинг с большим объемом вводимой пробы) и уменьшения пределов обнаружения белков (до 70 раз по сравнению с КЗЭ в тех же условиях). Обоснована целесообразность использования исследованных сверхразветвленных полимеров в качестве модификаторов подвижной и неподвижной фаз в ВЭТСХ. Показано, что наличие водородных взаимодействий между исследованными аналитами (водорастворимыми витаминами) и PEI-Mal обеспечивает рост эффективности, в то время как ионные взаимодействия и образование комплексов гость-хозяин наоборот, приводит к уменьшению значений эффективности и параметров Rf аналитов.

Практическая значимость работы

Осуществлен синтез монолитных колонок на основе глицидилметакрилата, метилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (инициатор - азобисизобутиронитрил) с использованием в качестве порогенного растворителя системы пропанол-1 : формамид (10 : 50, соответственно) с последующей постфункционализацией бутилэтиламином для анализа белков.

Предложен вариант on-line концентрирования белков (с пределом обнаружения суммарной концентрации белков 0,12 мг/мл) на колонках, динамически модифицированных дендритным полимером.

Достигнуто снижение пределов обнаружения белков в 70 раз (до 0,008, 0,013, 0,005, 0,004 мг/мл для альбумина, миоглобина, лизоцима и инсулина соответственно) при использовании полых колонок на основе химически привитого полимера PEI-Mal и сохранении разрешения всех компонентов в условиях КЭХ по сравнению с КЗЭ на немодифицированных капиллярах в тех же условиях.

Использование импрегнированных сверхразветвленным полимером пластин для ВЭТСХ обеспечило увеличение эффективности при определении витамина В2 в 100 раз и В12 в 10 раз.

Методом ВЭТСХ с использованием пластин, модифицированных полимером PEI-Mal установлено, что в условиях ВЭТСХ исследованные полимеры взаимодействуют с водорастворимым витамином В2 и жирорастворимым витамином А, что вызывает резкое снижение параметров Rf на импрегнированных пластинах для этих аналитов. Установлено, что взаимодействие в системе PEI-Mal - рибофлавин зависит от молекулярной массы полиэтиленимина и степени его замещения мальтозой и объясняется образованием комплекса типа «гость-хозяин».

Положения, выносимые на защиту

1. Хроматографические характеристики сверхразветвленных полимеров, модифицированных мальтозой, в электрокинетической хроматографии (ЭКХ) и капиллярной электрохроматографии на полых колонках (КЭХ). Влияние молекулярной массы ядра и степени замещения на величину электроосмотического потока и миграционные характеристики альбумина, миоглобина, инсулина, лизоцима.

2. Разделение белков на капиллярных монолитных колонках в условиях капиллярной электрохроматографии, синтез монолитных колонок и факторы, влияющие на их пористость.

3. Зависимость хроматографических параметров водо- и жирорастворимых витаминов от присутствия сверхразветвленного полиэтиленимина, модифицированного мальтозой, в составе неподвижной фазы в (ВЭТСХ), сравнительные оценочные характеристики с ß-циклодекстрином, цетилтриметиламмоний бромидом.

4. Доказательство проявления эффекта модификации подвижной фазы в ВЭТСХ сверхразветвленным мальтозилированным полиэтиленимином на хроматографические характеристики витаминов группы В и витамина С.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 2 статьях и 11 тезисах докладов. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (2008, Клязьма, Россия); III Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (2008, Санкт-Петербург, Россия); 9ft European Meeting on Environmental Chemistry (2008, Girona, Spain); Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнология» (2009, Самара, Россия); VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 2009» (2009, Йошкар-Ола, Россия);

Международной конференции по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века» (2009, С.-Петербург, Россия); III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (2009, Краснодар, Россия); 10th European Meeting on Environmental Chemistry (2009, Limoges, France); Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (2010, Клязьма, Россия).

Структура н объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 3 глав с обсуждением полученных результатов, выводов, приложения и списка цитируемой литературы (206 наименований). Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 85 рисунков и 24 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении дано обоснование актуальности темы и сформулирована цель исследования.

1 -я глава (Обзор литературных данных) включает разделы, посвященные динамической и химической модификации кварцевых капилляров в электрохроматографии при разделении белков; использованию различных способов модификации ТСХ-пластин; применению дендримеров и сверхразветвленных полимеров в капиллярном электрофорезе (КЭ), мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), капиллярной электрохроматографии (КЭХ), твердофазной экстракции и ВЭЖХ при анализе сложных смесей низко- и высокомолекулярных соединений.

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов и методов исследования (ВЭТСХ с денситометрическим УФ-детектированием, дендримерная электрокинетическая хроматографии, КЭХ с УФ детектированием).

~ин

1

is*

5кДа 25 кДа

г

"г"

Якт

W N

Мальтоза ВНзИ'йриДин....._

NH

;

nh2

■ \ш

N5

MaV

\x_Sfr / HN-M

т

Структура А (PEI-Mal-A)

Структура В (PEI-Mal-B)

Структура С (PEI-Mal-C)

Рис. 1. Получение исследуемых производных сверхразветвленного полиэтиленимина, модифицированного мальтозой

Сверхразветвленные полимеры РЕ1-Ма1 представляют класс структур типа ядро-оболочка, где роль «ядра» играет сверхразветвленный полиэтиленимин (РЕ1-5к: М„ 5000 г/моль, М„ 3600 г/моль и РЕ1-25к: М» 25000 г/моль, Мп 9600 г/моль), а «оболочки» -мальтозные остатки, образованные после реакции восстановительного аминирования (Рис. 1). Символы 5к и 25к обозначают средневесовую молекулярную массу полиэтилениминового ядра.

В зависимости от степени замещенности мальтозой различают структуру А (полимеры РЕ1-5к-Ма1-А и РЕ1-25к-Ма1-А), в которой замещено большинство аминогрупп (90%); структуру В (полимеры РЕ1-5к-Ма1-В и РЕ1-25к-Ма1-В) - замещены ~ 50% аминогрупп; и структуру С (полимеры РЕ1-5к-Ма1-С и РЕ1-25к-Ма1-С) - присутствуют в значительном количестве незамещенные аминогруппы; общая степень замещения на мальтозные фрагменты ~ 20-25% (Табл. 1).

Таблица 1. Характеристики полимеров РЕ1-Ма1

Степень функционализации (%) М„ (г/моль) Pi Используемые обозначения

PEI-25K-Mal А 85 71 300 8,0 А25

РЕ1-25К-Ма1 В 35 34 800 9,1 В25

РЕ1-25К-Ма1 С 16 20 800 9,4 С25

PEI-5K-Mal А 89 28 200 8,8 А5

РЕ1-5К-Ма1 В 42 13 600 9,5 В5

РЕ1-5К-Ма1 С 21 8 100 9,8 С5

Структура и молекулярная масса полимеров были подтверждены данными элементного анализа и спектрами ЯМР. Изоэлектрическая точка устанавливалась по

результатам измерений дзета-потенциала при различных значениях рН.

Степень замещения мальтозой определяет свойства полимеров (гидрофильность, величина заряда поверхности, значение изоэлектртеской точки и т.д.) и характер их взаимодействия с молекулами аналитов Так, наличие плотной мальтозной оболочки полимеров со структурой А обеспечивает их взаимодействие с компонентами различной природы, в первую очередь, за счет межмолекулярных водородных связей; в случае же полимеров В и С доминирующую роль играют ионные взаимодействия с участием положительно заряженного полиэтилениминового ядра 2.

В качестве высокомолекулярных модельных соединений были выбраны диагностические маркеры многих заболеваний - миоглобин, инсулин, лизоцим, альбумин. Они характеризуются широким диапазоном молекулярных масс и значений изоэлектрических точек (Табл. 2), что принципиально при выявлении возможностей использования новых дендритных материалов в качестве компонентов электрофоретических систем для определения аналитов с различными свойствами.

Таблица 2. Молекулярные массы Мг и значения изоэлектрических точек. р! определяемых белков

Миоглобин Инсулин Лизоцим Альбумин

M„ г/моль 17800 5808 14300 66241

pi 7,0 5,5 11,0 4,7

В качестве низкомолекулярных аналитов использованы водо- (В1, В2, В6, В12 и С) и жирорастворимые витамины (А, Е, О, К). Разнообразие их структур (от ионных до слабо полярных) позволило бы методом ВЭТСХ получить дополнительную информацию о влиянии полимеров РЕ1-Ма! на хроматографическое поведение различных аналитов.

В 3-й главе обсуждается синтез монолитных колонок и их использование для разделения смесей белков.

Получение монолитной капиллярной колонки включало:

- травление внутренней поверхности кварцевого капилляра;

- силанизацию поверхности капилляра (для увеличения смачиваемости внутренней поверхности кварцевого капилляра раствором мономера с последующей прививкой к ней полимерного сорбента);

1 S. Boye, N. Polikarpov, D. Appelhans, A. Lederer. An alternative route to dye-polymer complexation study using asymmetrical flow field-flow fractionation//;. Chromatogr. A. 2010. V. 1217. P. 4841-4849.

2 N. Polikarpov, A. Kaufmann, J. Kluge, D. Appelhans, B. Voit. Investigation of dye-glycopolymer and glycopolymer-hydrogel interactions for development of multirelease system. J. Contr. Rel. 2010. V.148. P. E66-E68.

- полимеризацию в присутствии порогенных растворителей (Рис. 2);

- функционализация полимерной поверхности бутилэтиламином для создания электроосмотического потока (ЭОП) (Рис.3).

ОН ^

Рис. 3. Реакция постфункционализации монолита с N-этилбутиламином

Варьируя соотношение растворителей (Табл. 3), меняли пористость колонки. Синтезировано несколько монолитных колонок с бимодальным распределением пор: микро- (до 50 нм) и макропорами (от 50 до 500 нм). Расчет общей пористости £

. ^катиляр

проводился по формуле е =-, где ammilntp и амонотт - электрическая проводимость в

^монолит

кварцевом капилляре и монолитной колонке (См) соответственно. Распределение пор по размеру оценивалось в пакете прикладных программ для решения задач технических вычислений MATLAB 7.5 с использованием приложения Image Processing Toolbox.

Система растворителей Диэлектрическая проницаемость, г As Дипольный момент р, Д А р системы, д Система

1 Формам ид 110,0 +89,9 3,370 1,713 0-20%

Пропанол-1 20,1 1.657 60-40%

2 Бутандиол-1,4 32,7 +12,6 2,580 0,923 0-20%

Пропанол-1 20,1 1.657 60-40%

3 Этанол 24,3 +4,2 1.680 0,023 0-20%

Пропанол-1 20,1 1.657 6040%

4 Циклогексанол 15,0 -4,9 1,901 0,244 0-20%

Пропанол-1 20,1 1.657 6040%

5 Циклогексанол 15,0 +7,9 1,901 0,103 040%

Деканол-1 7,1 1,798 60-20%

На Рис. 4 представлены фотографии срезов монолитных колонок, синтезированных в смесях растворителей с различной полярностью. Для всех систем характерно снижение общей пористости с увеличением доли более неполярного растворителя. При увеличении доли пропанола-1 (снижении полярности системы) суммарная пористость уменьшается. Аналогичные закономерности наблюдались и для других систем.

Рис. 4. Влияние состава порогенной смеси растворителей на пористость метакрилатного монолитного сорбента

Фотографии получены на лазерном микроскопе Leica TCS SL.

(А) 0% пропанола-1, 60% формамида; (В) 4% пропанола-1, 56% формамида; (С) 10% пропанола-1, 50% формамида.

Максимальная суммарная пористость наблюдалась в системе формамид/пропанол-1, которая в дальнейшем и была использована нами в реакции полимеризации для получения монолитных колонок.

Отработана схема получения монолитных капиллярных колонок на основе глицидилметакрилата, метилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (инициатор -азобисизобутиронитрил; порогенный растворитель - система 10% пропанола-1 и 50% формамида, объемн.) с последующей постфункционализацей этилбутиламином с воспроизводимыми характеристиками пористости, проницаемости и величины электроосмотического потока (Табл. 4).

Таблица 4. Содержание макро- и микропор в монолитных колонках

Колонка (№) Содержание пор

Макро-М>50нм) Микро- ((1<50нм)

1 89,0% 11,0%

2 89,0% 11,0%

3 87,3% 12,7%

4 86,5% 13,5%

5 84,0% 16,0%

6 86,2% 13,8%

Среднее значение 87,0±5,7% 13±4,7%

Использование покрытия на основе бугилэтиламина позволило разделять аналиты при низких значениях рН (2,5-3), что существенно: в этом диапазоне и белки, и поверхность монолита заряжены положительно и их адсорбция на поверхности сорбента минимальна (Рис. 5).

Рис. 5. Электрохроматограмма смеси стандартов белков (1мг/мл) Рабочий электролит: 15 мМ раствор фосфорной кислоты : ацетонитрил (4: 1, объемы.). Элеирокинетический ввод пробы: -ЮкВ, 1с; -ЮкВ. Монолитная капиллярная колонка: Ь^фЯ^б^ 8,5/45 см. УФ-детектирование: 214 нм. 1 - альбумин, 2 - инсулин , 3 - миоглобин, 4 -лизоцим.

20О 400 600 800

Время миграции, с

В 4-ой главе обсуждаются основные результаты по применению сверхразветвленных полимеров PEI-Mal в качестве псевдостационарной и стационарной фаз в электрокинетической хроматографии (ЭКХ) и капиллярной электрохроматографии (КЭХ) на полых колонках для разделения белков.

Нами было высказано предположение, что степень модификации кварцевого капилляра полимерами PEI-Mal зависит от значений их изоэлекгрических точек. Для этого была поставлена серия специальных экспериментов при рН рабочего буфера 8,5 и 10,2. Отметим, что при рН 8,5 только полимер PEI-25k-Mal-A отрицательно заряжен. В более щелочном растворе (рН 10,2) все молекулы исследуемых полимеров (структуры А, В, С) существуют в форме анионов.

Так, при рН 8,5 введение в состав буферного электролита полимера PEI-25k-Mal-A (анионная форма) практически не влияет на величину ЭОП (Рис. 6). Однако, добавление даже незначительных количеств (1 мг/мл) полимера PEI-25k-Mal-B (катионпая форма) вызывает уменьшение ЭОП более, чем в три раза.

При более высоких значениях рН, когда оба полимера с различной степенью функционализации мальтозой - PEI-25k-Mal-A и PEI-25k-Mal-B - существуют в форме

анионов, ЭОП остается стабильным при введении значительных количеств (5-10 мг/мл) полимеров, и динамической модификации стенок кварцевого капилляра не происходит.

(а)

1

С 4.0я

(б)

7.0x10"' 6,0x10'

ё

5.0*10'

О «.ОиЮ'

0

С З.ОкЮ"

1 2,0x10'' ч

с ШЮ"1 0.0

-»-рНв,5 рН 10.21

Концентрация полимера (мг/мп)

Концентрация полимера (мг/мл)

Рис. 6. Зависимость электрофоретической подвижности ДМСО от концентрации дендритного полимера в буферном электролите полимеров РЕ1-25к-Ма1-А (а) и РЕ1-25к-Ма1-В (б)

В режиме электрокинетической хроматографии (реализуется при значении рН рабочего буфера 10,2 для всех структур и 8,5 - для структур А) взаимодействий сверхразветвленных полимеров и с аналитами, и стенками капилляра нет, а, значит, и нет влияния на миграционные характеристики аналитов.

Однако отмечено, что наличие нейтрального полимера РЕ1-5к-Ма1-А в буферном электролите вызывает значительный (более чем в три раза) рост эффективности для миоглобина: подобное влияние на альбумин и инсулин не обнаружено (Рис. 7).

-10 мг/мл | и "

-1 мг/мл I а . ■

-0 мг/мл | 1 } 1 . :

б о

X

ш ^

0} ■е-•в О

Миогтобин » Инсу/мн * - Альбумин

Время миграции (с)

Концентрация полимера (мг/мл)

Рис. 7. Электрофореграммы и эффективности смеси белков (миоглобин, инсулин, альбумин) при различной концентрации РЕ1-5к-Ма1-А в буферном электролите

Рабочий электролит: 75 мМ боратггьгн буферный раствор (рН 8.5). Электрокинстическпп ввод пробы: -ЮкВ, 1с. 20кВ. 1- миоглобин, 2- инсулин, З-альбумин.

В условиях капиллярной электрохроматографии при рН рабочего буфера 8,5 ситуация принципиально меняется. За счет динамической сорбции и образования ассоциатов полимер-протеин времена миграции всех белков возрастают. Так, в

присутствии полимера с меньшим размером ядра (РЕ1-5к-Ма1-В) еще удается зафиксировать аналитические сигналы белков в течение первых 11 мин (Рис. 8, а), а при добавлении полимера с большим ядром (РЕ1-25к-Ма1-В) - уже нет (Рис. 8, б). Отмеченные различия находятся в хорошем соответствии с описанными в литературе закономерностями, согласно которым при увеличении молекулярной массы ядра происходит усиление взаимодействий мальтозилированных сверхразветвленных полииминов с альбумином.

(а) (б)

Рис. 8. Электрофореграммы смеси белков при различной концентрации РЕ1-5к-Ма1-В (а) и РЕ1-25к-Ма1-В (б) в буферном электролите

Рабочий электролит: 75 мМ боратный буферный раствор (рН 8.5). Элеюрокинетический ввод пробы: -10кВ, 1с. 20кВ. 1 - миоглобин, 2 - инсулин, 3 - альбумин.

В кислой среде (рН 2.2) белки и полимеры протонированы и находятся в форме катионов, что предполагает отсутствие каких-либо взаимодействий между ними, однако не исключает их сорбции стенками кварцевого капилляра.

Динамическая модификация полимером РЕ1-25к-Ма1-А стенок кварцевого капилляра предотвратила сорбцию белков, что положительно сказалось на разрешении (Рис. 9) и эффективности. Однако, при увеличении концентрации сверхразветвленного полимера в рабочем буфере наблюдается заметный рост времен миграции аналитов, поскольку снижается величина ЭОП.

200

Е

s о

J3 й

0,02 0,01

0,02 0,01

0,02 0,01

5 мг/мл Г

600 тт—

800 —I-1—

2

1000

- 0,5 мг/мл

- 0 мг/мл ¡ 1

3

200

400

600

1000

Время миграции (с)

Рис. 9. Электрофореграммы смеси белков при различной концентрации PEI-25k-Mal-A в буферном электролите

Рабочий электролит: 150 мМ фосфатный буферный раствор (рН 2.2). 20кВ. 1- альбумин, 2- миоглобин, 3-инсулин.

При использовании полимера с наименьшей модификацией мальтозой (PEI-25k-Mal-С) в концентрации 10 мг/мл наблюдается даже инвертирование ЭОП. Помимо увеличения времен миграции существенно возрастает эффективность (до 2 млн т.т./м), при этом наблюдается совместное элюирование белков (Рис. 10), что приводит к уменьшению пределов их суммарного обнаружения (0,12 мг/мл). Наблюдаемый эффект концентрирования (Рис. 11) может быть крайне полезен при анализе сложных систем для отделения белков и уменьшения «загруженности» электрофореграмм, а также при определении суммарного содержания белка в биологических жидкостях.

0.09 0,06

о

X 0.04

m s о

S 0.02

0,02 0.01

I-10 мг/мл | 1.2,3 I

|-8мг/мл| i;

Í-0 мг/мл! L

0 200 400 1000 1200 1400 1600 1800

Время миграции, с

Рис. 10. Электрофореграммы смеси белков при различной концентрации PEI-25k-Mal-C в буферном электролите

Рабочий электролит: 150 мМ фосфатный буферный раствор (рН 2.2). 20кВ. 1- альбумин, 2- миоглобин, 3-инсулин.

19 О ™ О

а в

зона пробы

С

пэоп

0

тзгтшзяяигазшяшвшпгшзшяшгптапг"

ф ф ф уЗ уЗ ^ ^ цЗф ^ ф ^ ффф ^ ^р Щ

□

зона пробы

Рис. 11 Схема концентрирования пробы белков

Матрица пробы электрокинетически вводится в капилляр.

После подачи положительного напряжения на концы капилляра буферный электролит движется от катода к аноду; положительно заряженные молекулы белков мигрируют в противоположном направлении; происходит

концентрирование.

Полые колонки на основе РЕ1-Ма1 получали прививкой соответствующего полимера к предварительно силанизированной глицидилметакрилатом поверхности капилляра (Рис. 12). За счет реакции нуклеофильного присоединения между привитыми эпоксигруппами и гидрокси- или аминогруппами РЕ1-Ма1 на поверхности кварцевого капилляра создавался положительно заряженный полимерный монослой, генерирующий отрицательный ЭОП (от катода к аноду) при низких значениях рН. Этот эффект был использован нами для концентрирования (стэкинг с большим объемом вводимой пробы) белков.

Рис. 12. Схема реакции прививки РЕ1-Ма1 к силанизированной поверхности капилляра Эффект концентрирования проиллюстрирован на Рис. 13.

Так, при увеличении времени ввода в 50 раз (с 2 с до 100 с) удалось снизить пределы обнаружения инсулина более, чем в 50 раз (с 0,2 мг/мл до 0,004 мг/мл), а по сравнению с КЗЭ при тех же условиях - в 70 раз (с 0,15 мг/мл до 0,004 мг/мл).

0,12 0,10

га с а

¡Е 0,08-X

£ о.об-

I 0.025

Рис. 13. Эффект времени ввода пробы на интенсивность аналитического сигнала

Полая колонка на основе РЕ1-25к-Ма1-В. Ввод пробы: 30 мбар в течение 2,25,40,100 с. 20 кВ; Х=214 нм. Рабочий электролит: 100 мМ фосфатный буфер {рН 2,2). 1 - альбумин, 2 - миоглобин, 3 - лизоцим, 4 - инсулин.

О 200 400 600 800 1000 1200 1400

Время миграции (с)

При сопоставлении полученных результатов обнаружено, что максимальная эффективность обеспечивается использованием полых колонок, динамически или ковалентно модифицированных сверхразветвленным полимером РЕ1-Ма1 (Табл. 5). КЭХ на монолитных колонках характеризуется максимальной селективностью (Табл. 6), но меньшей эффективностью.

Таблица 5. Значения эффективности N (т.т./м) при разделении белков

КЭХ КЭХ КЭХ ЭКХ

(монолитная (динамическая (ковалентная (РЕ1-5к-Ма1-А),

колонка) модификация модификация

РЕ1-25к-Ма1-А) РЕ1-25к-Ма1-В)

Альбумин 34 500 417 300 190 400 112 700

Инсулин 43 600 259 600 583 200 174 400

Миоглобин 33 700 646 800 381 400 213 300

Лизоцим 22 000 - 409 800 -

Таблица 6. Селективность разделения (а) на примере модельной смеси белков

КЭХ КЭХ КЭХ ЭКХ

(монолитная (динамическая (ковалентная (РЕ1-5к-Ма1-А),

колонка) модификация модификация

РЕ1-25к-Ма1-А) РЕ1-25к-Ма1-В)

Пик 2 / Пик 1 2,1 1,09 1,01 1,05

Пик 3/Пик 2 1,5 1,32 1,04 1,10

Пик 4/ Пик 3 1,5 - 1,2 1,43

Таким образом, выявлено влияние сверхразветвленных полимеров РЕ1-Ма1 в составе рабочего буфера на величины ЭОП, времена миграции, эффективность и селективность разделения высокомолекулярных аналитов (альбумин, инсулин, миоглобин, лизоцим) в условиях элсктрокинетической хроматографии (ЭКХ) и капиллярной электрохроматографии (КЭХ). Обнаружен эффект концентрирования белков на полых колонках, модифицированных РЕ1-Ма1.

В 5-ой главе рассматривается влияние полимеров РЕ1-Ма1 как компонентов хроматографических фаз на факторы удерживания аналитов гидрофильной и гидрофобной природы ( водо- и жирорастворимых витаминов) в условиях ВЭТСХ.

Эксперименты по импрегнированию сверхразветвленными полимерами пластин проводились в водной и водно-ацетонитрильной подвижных фазах. Серия специальных экспериментов была выполнена по модификации подвижной фазы - с использованием 10 мМ фосфатных буферных растворов при различных значениях рН: 2.0 (полимер заряжен положительно)', 7.5 {полимер практически нейтрален) и 11.5 ( полимер заряжен отрицательно) и дистиллированной воде.

Полученные результаты предполагалось сравнить с такими модификаторами хроматографических систем, как р-циклодекстрином и поверхностно-активными веществами (ПАВ). Первые, как и полимеры РЕ1-Ма1, состоят из сахаридных остатков, и возможные взаимодействия с аналитами, как и в случае электрофореза, могут быть обусловлены их участием. Вторые - имеют сходную с РЕ1-Ма1 мицеллярную внутреннюю и внешнюю топологию. Фундаментальное отличие состоит в том, что все терминальные группы полимера ковалентно связаны с ядром.

Установлено, что импрегнирование поверхности пластины различными модификаторами (РЕ1-Ма1, Р-циклодекстрином, цетилтриметиламмоний бромидом -ЦТАБ) приводит к значительному изменению факторов удерживания аналитов по сравнению с немодифицированным силикагелем. Показано, что по своему воздействию полимер подобен циклодекстрину, что следует из его влияния на факторы удерживания витаминов (Рис.14) - доминируют взаимодействия между аналитами и терминальными мальтозными группами.

Рис. 14. Влияние модификаторов неподвижной фазы на факторы удерживания витаминов

О (^модифицированный силикагель ■¿Г РЕ1-25к-Ма1-А

. ЦТАБ

\7 р-Циклодекстрин

тг £

о

л

о -к

ПФ - ацетонитрил:вода (3:2, объемн.)

О

По результатам хроматографических экспериментов аналиты условно можно подразделить на три группы:

1. Витамины, чьи хроматографические параметры не зависят от наличия РЕ1-Ма1 в подвижной или неподвижной фазе (В1, В6 и С).

2. Витамины, чьи параметры Я/ снижаются в присутствии РЕ1-Ма1 (В2).

3. Витамины, для которых характерно рост значений параметров Я/в присутствии РЕ1-Ма1 (В 12).

Рассмотрим это подробнее.

К первому типу можно отнести витамины В1, В6 и С.

Витамины В1 (тиамин, рК„ 4,0 и рКь 10,5) и В6 (пиридоксин, рКа 4,9 и рКь 9,6) при любых значениях рН не способны взаимодействовать с молекулами сверхразветвленного полимера из-за электростатических отталкиваний.

Тип 2. При рН <10 витамин В2 (рибофлавин; рК„ = 10урКь = -0,05 и -8,62) нейтрален, поэтому между ним и дендритным полимером РЕ1-Ма1 возможны взаимодействия с участием водородных связей между рибозным остатком витамина и аминогруппами полимера, возрастающих с понижением рН (протонирование аминогрупп).

Этим объясняется резкий рост эффективности (в 100 раз) на пластинах, модифицированных полимером с наибольшим количеством мальтозных фрагментов (Табл. 7).

Таблица 7. Влияние сверхразветвленного полимера на хроматографические параметры витамина В2

Подвижная фаза Эффективность, АГ,т.т./м

Дистиллированная вода 0,64 35

Дистиллированная вода + 0,5 мг/мл РЕ1-5к-Ма1-В 0,93 2215

Использование полимеров с меньшей степенью замещенности мальтозой (РЕ1-25к-Ма1-С) приводит к значительному снижению эффективности (Рис. 15).

Кислотно-основные свойства рибофлавина

""ОН рН>10

-i-.

Ч-........

i-,.

......i........ ^

• .......•

0 А25 А25 А25 А25 В25 B2S В25 В25 С25 С25 С25

0,01 0.» 05 0,85 0,01 0,25 0.5 0,85 0,01 0,3 0,8

5000 ~

4000 ¿ л

3000 g x

2000 | ю в-

100O

o

Концентрация полимера (мг/мл)

Рис. 15. Влияние добавки полимеров РЕ1-Ма1 в состав неподвижной фазы на факторы удерживания рибофлавина в условиях ВЭТСХ (подвижная фаза - вода)

Различное влияние полимеров на хроматографические характеристики рибофлавина можно связать с преобладанием водородных связей при образовании комплекса РЕ1-Ма1-А-аналит, и ионных - с образованием комплексов «гость-хозяин» в случае РЕ1-Ма1-В и С.

Тип 3 Витамин В12 (кобаламин, рКа = 2,8-3,5) обладает самой большой молекулярной массой среди исследованных витаминов, что не позволяет ему проникать в полости полимера и образовывать комплексы по типу «гость-хозяин».

Эффект модификатора на его хроматографические характеристики сходен с уже отмеченным выше для рибофлавина - возрастают эффективность, но факторы удерживания для различных полимеров сопоставимы (Рис.16).

1,0 0,80,6-

-i-и

• Эффективность

j т Л-

•—i—■—i-

i-I.....i

■е-■е-

0 А5 А5 А5 А5 В5 65 В5 BS С5 С5 С5 А25 А25 А25 А25 В25 В25 В25 В25 С25 C2S С25 0,01 0,25 0,5 0,85 0,01 0,25 0,5 0,85 0,01 0,3 0.8 0.01 0,25 0,5 0,85 0,01 0,25 0.5 0.85 0,01 0,3 0.8

Концентрация полимера (мг/мл)

Рис. 16. Влияние добавки полимеров PEI-Mal в состав неподвижной фазы на факторы удерживания кобаламина в условиях ВЭТСХ (ПФ - вода)

Использование импрегнированных PEI-Mal пластин и водной ПФ обеспечило

увеличение значений Rf с одновременным ростом эффективности витамина В12.

Сравнение результатов, полученных при использовании PEI-Mal в качестве

модификаторов с данными, опубликованными в литературе, показывает значительное

увеличение эффективности на аналогичных ВЭТСХ пластинах (Табл.8).

Условия хроматографического анализа Эффективность, N (т.т./м)

ПФ: 0.01 мг/мл раствор РЕ1-5к-Ма1-А в воде НФ: немодифнцированный силикагель 3820

ПФ: вода НФ: пластина модифицирована 0,01 мг/мл РЕ1-5к-Ма1-А 480

ВЭТСХ в закрытом слое ПФ: вода : 24%-ный раствор ЫН3 (30 : 0,1, объемн.) НФ: немодифнцированный силикагель 980

При сохранении той же логики в постановке экспериментов с гидрофобными жирорастворимыми витаминами следует отметить наиболее интересный результат для пальмитата ретинола (витамина А): резкое уменьшение факторов удерживания на импрегнированных РЕ1-Ма1 пластинах, что может быть следствием комплексообразования витамина и полимера и независимо подтверждается литературными данными (Рис. 17).

Рис. 17. Схема комплексообразования между мальтозным остатком РЕ1-Ма1 и пальмитатом ретинола

Таким образом, выявлено влияние дендритных полимеров на хроматографические характеристики водо- и жирорастворимых витаминов, и обнаружено, что оно в значительной степени подобно полимера подобно влиянию циклодекстрина в качестве модификатора: доминируют взаимодействия между аналитами и терминальными мальтозными группами. Установлено, что введение РЕ1-Ма1 в состав подвижной или неподвижной фазы приводит к росту эффективности для витаминов В2 и В12.

выводы

1. Выявлена возможность использования мальтозилированных сверхразветвленных полиэтилениминов (РЕГ-Mal) с различной молекулярной массой ядра и степенью замещенности мальтозой в качестве компонентов хроматографических (ВЭТСХ) и электрофоретических (ЭКХ, КЭХ) систем на примерах разделения смесей высокомолекулярных аналитов - белков и низкомолекулярных - водо- и жирорастворимых витаминов.

2. Установлен факт динамической модификации стенок кварцевого капилляра катионными формами дендритных полимеров, что позволяет реализовывать различные варианты капиллярного электрофореза - ЭКХ или КЭХ.

3. Методом электрокинетической хроматографии выявлен эффект on-line концентрирования белков (предел обнаружения 0.12 мг/мл) с увеличением эффективности до 2 млн т.т./м, сопровождаемый обращением электроосмотического потока (ЭОП) при использовании в составе рабочего буфера (рН 2.2) дендритного полимера с наименьшей замещенностью мальтозой (PEI-Mal -С).

4. Показано, что использование полых колонок на основе сверхразветвленного полимера PEI-25k-Mal-B с использованием стэкинга с большим объемом вводимой пробы позволяет снизить пределы обнаружения белков (альбумин, миоглобин, инсулин, лизоцим) по сравнению с традиционным капиллярным зонным электрофорезом до 70 раз.

5. Предложен способ модификации сверхразветвленным полимером пластин для ВЭТСХ, обеспечивающий рост эффективности при определении витамина В2 в 100 раз и В12 в 10 раз.

Основные материалы работы опубликованы в следующих работах:

1. ЕЛ. Бессонова, H.A. Поликарпов, JI.A. Карцева, В.Е. Потолицына. Исследование возможностей новых сверхразветвленных полимеров в качестве псевдостационарных фаз в электрокинетической хроматографии при определении белков // Вести. С.-Петерб. Ун-та. 2011. Сер. 11. Вып. 1. С. 100-106.

2. Карцева Л „Л., Бессонова Е.А., Поликарпов Н.Л. Синтез метакрилатного монолитного сорбента для капиллярной электрохроматографии. Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Том 8. Вып. 5. С. 724-731.

3. Поликарпов H.A., Карцева Л.А., Бессонова Е.А. Мицеллы и дендримеры как псевдостационарные фазы в МЭКХ. Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнология» 6-10 июля 2009 г. Самара. Тезисы докладов.С.169.

4. Бессонова Е.А., Карцова Л.А., Поликарпов H.A., Потолицына В.Е. Определение белков в природных объектах методом капиллярной электрохроматографии. VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды. «Экоаналитика - 2009». 21-27 июня. 2009. Йошкар-Ола. Тезисы докладов. С. 38.

5. Бессонова Е.А., Карцова Л.А., Поликарпов H.A., Потолицына В.Е. Изучение возможностей электрофоретических методов при анализе белков в биологических объектах. III Всероссийская конференция «АНАЛИТИКА РОССИИ» с международным участием. Краснодар. 27 сентября - 3 октября 2009 г. Тезисы докладов. С. 56. '

6. А.Н.Вилкова, Карцова Л.А., Н.А.Поликарпов, Ю.Н. Мартыч. Высокоэффективная тонкослойная хроматография как метод изучения свойств сверхразветвленных полимеров. Аналитическая химия - новые методы и возможности. Съезд аналитиков России. Клязьма. 26-30 апреля 2010. Тезисы докладов. С.63 -64.

7. Карцова Л.А., Бессонова Е.А., Поликарпов H.A. Сверхразветвленные полимеры в электрокинетической хроматографии. Аналитическая химия - новые методы и возможности. Съезд аналитиков России. Клязьма. 26-30 апреля 2010. Тезисы докладов. С. 142.

8. Vilkova A., Kartsova L., Bessonova Е., Polikarpov N., Martych Yu. The determination of waterand fat-soluble vitamins, sugars and caffeine by Dendrimers High-Performance Thin-Layer Chromatography. Book of Abstracts. 10th European Meeting on Environmental Chemistry. Limoges, France. 02-05 December 2009. P.46.

9. Карцова Л.А., Бессонова E.A., Поликарпов H.A., Потолицына В.Е. Достоинства и ограничения электрофоретических методов определения белков в биологических объектах. Международная конференция по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века». С.-Петербург. 21-24 апреля 2009. С.209.

10. Поликарпов H.A., Карцова Л.А., Вилкова А.Н. Водорастворимые дендримерьг как компоненты хроматографических фаз. Международная конференция по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века». С.-Петербург. 21-24 апреля 2009. С.225.

11. Kartsova L., Bessonova Е., Polikarpov N. Electrophoretic methods (CE and CEC) for the trace analysis of biological substances (steroids and proteins) in human fluids (serum, urine). 9" European Meeting on Environmental Chemistry, 3-6 December 2008. Girona. Spain. Book of Abstracts. P.125.

12. Беленький Б.Г., Карцова Л.А., Бессонова E.A., Шмыков А.Ю., Поликарпов H.A. Оптимизация пористой структуры монолитных сорбентов на основе метакрилатов для капиллярной электрохроматографии белков и пептидов. Хроматография и хромато-масс-спектрометрия (к 100-летию со дня рождения профессора АБ.Киселева). Всероссийский симпозиум. Клязьма. 14-18 апреля 2008 г. Тезисы. С.158.

13. Беленький Б.Г., Карцова Л.А., Бессонова Е.А., Шмыков А.Ю., Поликарпов НА. Синтез и физико-химические характеристики монолитного сорбента для капиллярной электрохроматографии пептидов и белков. III Всероссийская конференция «Аналитические приборы». С.-Петербург. 22-26 июня 2008 г. Тезисы докладов. С.36.

Подтесано к г.ечати 78.04.11. Формат 60 х34 1/16. Бумага сонетная. Гашитура 1«бмс. Печет- цифровая. Печ. л. 1,0. Тграж ЮС 313. Заказ 5143. Отпечатано в Оды« оггергтквиой попиг^ал'чь Химического факультета СП6ГУ 193504, Санкт-Петербург, Старей Плт.'рп^, Университетский пр., 26 Тел.: (812) 428-40-42,423-69-19

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА5 В ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1115 Разделение белков ¿электрофрретическими методами.

111:1 Капиллярная электрохроматография на полых колонках (ОТ-КЭХ)Л

Динамическое модифицирование.

Физическая сорбция модификаторов на поверхности кварцевого капилляра.

Иммобилизация модификаторов на поверхности кварг\евого капилляра.

1.1.2 Капиллярная электрохроматография на монолитных колонках.

1.2 Применение дендримеров исверхразветвленных полимеров в хроматографии и электрофорезе.

1.2.1 Дендримеры в газовой хроматографии.

1.2.2 Использование дендримеров в мицеллярной электрокинетической i хроматографии.

1.2.3. Дендримеры в капиллярной электрохроматографии.

1.2.4' Применение дендримеров для твердофазной микроэкстракции.

1;2.5Ч Использование дендримеров для хирального разделения в режиме • ВЭЖХ.

1.3 Модификаторы в тонкослойной хроматографии (ТСХ).

1.3.1. Химическая модификация стационарных фаз.

1.3.2 Физическая модификация стационарных фаз.

1.3.3 Динамическая модификация неподвижных фаз.

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Аппаратура.

2.2 Реагенты.

2.2.1 Приготовление стандартных растворов определяемых веществ.

2.3 Синтез и характеристики сверхразветвленных мальтозилированных полиэтилениминов (PEI-Mal).

2.4 Приготовление рабочих.растворов.

2.5 Синтез монолитной.капиллярной колонки.

2.5.1 Травление кварцевого капилляра.

2.5.2 Силанизация кварцевого капилляра.

2.5.3 Синтез полиметакрилата in situ.

2.5.4 Постфункционализация монолитной колонки.

2.5.5 Получение «окна» детектирования.

2.5.6 Оценка пористости монолитного сорбента.

2.5.7 Оценка воспроизводимости процедуры синтеза монолитных капиллярных колонок.

2.6 Синтез«полых колонок на основе полимеров PEI-Mal.

2.6.1 Травление и силанизация кварцевого капилляра.

2.6.2 Функционализация капилляра полимером PEI-Mal.

2.7 Разделение белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ) на монолитных колонках.

2.7.1 Определение скорости электроосмотического потока (ЭОП).

2.7.2' Электрохроматографическое разделение смеси миоглобина, лизозима, инсулина и альбумина.

2.7.3 Определение эффективности в капиллярном зонном электрофорезе (КЗЭ) и капиллярной электрохроматографии (КЭХ).

2.8 Разделение белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ) на полых колонках.

2.8.1 Концентрирование смеси белков при использовании стэкинга с большим объемом вводимой пробы (large volume sample stacking, LVSS).

2.9 Разделение белков в условиях дендримерной электрокинетической хроматографии.

2.10 Разделение водорастворимых витаминов в режиме ВЭТСХ.

2.10.1 Разделение водорастворимых витаминов введением в подвижную фазу полимера PEI-Mal.

2.10.2 Разделение водорастворимых витаминов с использованием модифицированных пластин.

2.11 Разделение жирорастворимых витаминов в условиях ВЭТСХ на модифицированных PEI-Mal пластинах.

ГЛАВА 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОЛИТНЫХ КОЛОНОК ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСЕЙ БЕЛКОВ В РЕЖИМЕ КАПИЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИИ

3.1 Синтез монолитных колонок на основе метилметакрилата.

3.2 Разделение смеси белков на монолитных колонках в режиме КЭХ.

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ СВЕРХРАЗВЕТВЛЕННЫХ ПОЛИМЕРОВ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСЕЙ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХ ДЕНДРИМЕРНОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И КАПИЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИИ.

4.1 Динамическая модификация кварцевых капилляров полимерами PEI-Mal.

4.2 Капиллярная электрохроматография с использованием полых колонок на основе полимеров PEI-Mal.

ГЛАВА 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРОВ PEI-MAL ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ В УСЛОВИЯХ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

5.1 Импрегнированис ТСХ- пластин различными модификаторами.

5.1.1 Влияние модификаторов на факторы удерживания и эффективность водорастворимых витаминов.

5.1.2 Влияние полимера PEI-Mal на факторы удерживания и эффективность жирорастворимых витаминов.

5.2 Влияние полимера PEI-Mal в составе подвижной фазы на факторы удерживания и эффективность водорастворимых витаминов.

Актуальность. В последние годы отмечается повышенный интерес к полимерным материалам в связи с использованием их в хроматографических и- электрофоретических методах разделения. К ним,, в первуки очередь, относятся полимеры для создания монолитных сорбентов* — нового поколения стационарных фаз, а также дендримеры и сверхразветвленные полимеры.

Интерес к последним обусловлен их уникальными физико-химическими характеристиками: термическая стабильность [1], не зависящая от внешней среды мицелл оподобная структура [2], способность к образованию комплексов включения, высокая плотность терминальных функциональных групп и легкость их модификации, регулирующая растворимость и полярность. Применение дендритных полимеров в хроматографии и капиллярном электрофорезе позволяет существенно расширить аналитические возможности этих методов разделения [3-7].

Данная работа посвящена выявлению возможностей использования новых полимеров типа ядро-оболочка, состоящих из функционализированного дендритного ядра, окруженного оболочкой привитых низкомолекулярных соединений (Рис. 1) — водорастворимых производных полиэтиленимина, модифицированных мальтозой (РЕ1-Ма1), в качестве компонентов хроматографических (высокоэффективная тонкослойная хроматография, ВЭТСХ) и электрофоретических (ЭКХ, КЭХ) систем на примерах разделения низко- и высокомолекулярных аналитов гидрофильной и гидрофобной природы (водо- и жирорастворимых витаминов, белков) и сопоставлению полученных результатов с использованием монолитных полимерных сорбентов в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ).

Потенциал, заложенный в, таких полимерах уже обеспечил им использование в медицине в системах целевой доставки лекарств и химическом синтезе в качестве нанокатализаторов, однако до настоящего 7 времени работ, посвященных их применению в хроматографии и электрофорезе нет.

Полимер «ядро-оболочка» (core-shell) олигосахаридная оболочка

Ядро - обеспечение ионных и слабых гидрофобных взаимодействий; Оболочка - обеспечение гидрофильных взаимодействий.

Рисунок 1 — Схематическое изображение используемых полимерных

Выявление способности этих полимеров, введенных в состав хроматографических и электрофоретических систем, влиять на миграционные характеристики аналитов, выступать в качестве модификатора стенок кварцевого капилляра и способствовать on-line концентрированию определяемых соединений позволит не только контролировать эффективность и селективность разделения компонентов сложных смесей, но и получить независимую информацию об этих новых материалах.

Работа поддержана грантами РФФИ 10-03-00902-а и РФФИ ННИО 1103-91331 а. сверхразветвленных полиэтилениминов в качестве компонентов и модификаторов хроматографических и электрофоретических систем при определении биологически активных соединений.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1. Синтез монолитных колонок для разделения смесей белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ). сверхразветвленный полиэтиленимин структур

Цель работы: Выявление влияния мальтозилированных

2. Выявление закономерностей влияния степени модификации и размера ядра дендритных полимеров типа ядро-оболочка в составе рабочего буфера на величину электроосмотического потока, эффективность, и селективность, разделения" белков, в, режиме электрокинетической хроматографии, а также на,процессы on-line концентрирования.

3. Подготовка полых колонок на основе полимеров PEI-Mal химическим? и динамическим модифицированием поверхности кварцевого капилляра и выявление возможностей их использования для разделения- и концентрирование модельных смесей белков в условиях капиллярной электрохроматографии.

4. Установление закономерностей влияния сверхразветвленных полимеров PEI-Mal, отличающихся массой ядра и содержанием терминальных мальтозных групп, в качестве модификаторов хроматографических фаз при различных значениях рН элюента на хроматографические характеристики гидрофильных и гидрофобных аналитов (водо- и жирорастворимых витаминов) в условиях ВЭТСХ и получение сравнительных оценочных характеристик при использовании других модификаторов — Р-циклодекстрина и катионного детергента цетилтриметиламмоний бромида.

Научная новизна

Предложен вариант КЭХ, обеспеченный за счет динамического и ковалентного модифицирования поверхности кварцевого капилляра положительно заряженным мальтозилированным сверхразветвленным полиэтиленимином. Реализован вариант ЭКХ за счет введения в буферный электролит отрицательно заряженного или нейтрального полимера.

Выявлена зависимость хроматографических и электрофоретических характеристик (эффективности и селективность разделения) изученных систем и характеристик аналитов (времена миграции и факторы удерживания) от размера ядра и степени модификации полимеров' типа ядро-оболочка на примерах высокомолекулярных соединений — белков, и низкомолекулярных — водо- и жирорастворимых витаминов в методах ЭКХ, КЭХ и ВЭТСХ. Установлено, что при наличии ионных взаимодействий между полимером и молекулами аналитов происходит существенное увеличение времен миграции в КЭХ и уменьшение величин Rf аналитов в ВЭТСХ. IIpHt отсутствии, этих взаимодействий (полимер и белок слабозаряжены или нейтральны) происходит резкое увеличение эффективности в ЭКХ.

Установлено, что лучшая селективность разделения белков-реализуется при использовании монолитных колонок в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ), а максимальная эффективность — на капиллярных колонках, модифицированных дендритными полимерами, в режиме электрокинетической хроматографии (ЭКХ).

Предложена схема изготовления полых колонок на основе ковалентно привитого сверхразветвленного полимера, примененная для on-line концентрирования (стэкинг с большим' объемом вводимой пробы) и уменьшения пределов обнаружения белков (до 70 раз по сравнению с КЗЭ в тех же условиях). Обоснована целесообразность использования исследованных сверхразветвленных полимеров в качестве модификаторов подвижной и неподвижной фаз в ВЭТСХ. Показано, что наличие водородных связей между исследованными аналитами (водорастворимыми витаминами) и PEI-Mal обеспечивает рост эффективности, в то время как ионные взаимодействия и образование комплексов гость-хозяин наоборот, приводят к уменьшению значений эффективности и параметров Rf аналитов.

Практическая значимость работы

Осуществлен синтез монолитных колонок на основе глицидилметакрилата, метилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (инициатор — азобисизобутиронитрил) с использованием в. качестве порогенного растворителя« системы пропанол-1 : формамид (10 : 50, соответственно) с последующей постфункционализацией бутилэтиламином для анализа белков.

Предложен вариант on-line концентрирования белков (с пределом обнаружения суммарной концентрации белков 0,12 мг/мл) на колонках, динамически модифицированных дендритным полимером.

Достигнуто снижение пределов обнаружения* белков в 70 раз (до 0,008, 0,013, 0,005, 0,004 мг/мл для альбумина, миоглобина, лизоцима и инсулина соответственно) при использовании полых колонок на основе химически привитого полимера PEI-Mal и сохранении разрешения всех компонентов5 в условиях КЭХ по сравнению с КЗЭ на немодифицированных капиллярах в тех же условиях.

Использование импрегнированных сверхразветвленным полимером пластин для ВЭТСХ обеспечило увеличение эффективности при определении витамина В2 в 100 раз и В12 в 10 раз.

Методом ВЭТСХ с использованием пластин, модифицированных полимером PEI-Mal установлено, что в условиях ВЭТСХ исследованные полимеры взаимодействуют с водорастворимым витамином В2 и жирорастворимым витамином А, что вызывает резкое снижение параметров Rf на импрегнированных пластинах для этих аналитов. Установлено, что взаимодействие в системе PEI-Mal — рибофлавин зависит от молекулярной массы полиэтиленимина и степени его замещения мальтозой и объясняется образованием комплекса типа «гость-хозяин».

Положения, выносимые на защиту

1. Хроматографические характеристики сверхразветвленных полимеров, модифицированных мальтозой, в электрокинетической хроматографии (ЭКХ) и капиллярной электрохроматографии на полых колонках (КЭХ). Влияние молекулярной массы ядра и степени замещения на величину электроосмотического потока и миграционные характеристики альбумина, миоглобина, инсулина, лизоцима.

2. Разделение белков на капиллярных монолитных колонках в-условиях капиллярной электрохроматографии, синтез монолитных колонок и факторы, влияющие на их пористость.

3. Зависимость хроматографических параметров водо- и жирорастворимых витаминов от присутствия сверхразветвленного полиэтиленимина, модифицированного мальтозой, в составе неподвижной фазы в (ВЭТСХ), сравнительные оценочные характеристики с (3-циклодекстрином, цетилтриметиламмоний бромидом.

4. Доказательство проявления эффекта модификации подвижной фазы в ВЭТСХ сверхразветвленным мальтозилированным полиэтиленимином на хроматографические характеристики витаминов группы В и витамина С.

выводы

1. Выявлена возможность использования мальтозилированных сверхразветвленных полиэтилениминов (PEI-Mal) с различной молекулярной^ массой ядра и степенью замещенностИ( мальтозой в качестве компонентов хроматографических (ВЭТСХ) и электрофоретических (ЭКХ, КЭХ) систем на примерах разделения смесей высокомолекулярных аналитов - белков и низкомолекулярных — водо- и жирорастворимых витаминов.

2. Установлен факт динамической модификации стенок кварцевого капилляра катионными формамим дендритных полимеров, что позволяет реализовывать различные варианты капиллярного электрофореза - ЭКХ или КЭХ.

3. Методом электрокинетической хроматографии выявлен эффект on-line концентрирования белков (предел обнаружения 0.12 мг/мл) с увеличением эффективности до 2 млн т.т./м, сопровождаемый обращением электроосмотического потока (ЭОГГ) при использовании в составе рабочего буфера (рН 2.2) дендритного полимера с наименьшей замещенностью мальтозой (PEI-Mal -С).

4. Показано, что использование полых колонок на основе сверхразветвленного полимера PEI-25k-Mal-B с использованием стэкинга с большим объемом вводимой пробы позволяет снизить пределы обнаружения белков (альбумин, миоглобин, инсулин, лизоцим) по сравнению с традиционным капиллярным зонным электрофорезом до 70 раз.

5. Предложен способ модификации сверхразветвленным полимером пластин для ВЭТСХ, обеспечивающий рост эффективности при определении витамина В2 в 100 раз и В12 в 10 раз.

1. N. Tanaka, H. Iwasaki, T. Fukutome, K. Hosoya, T. Araki. Starburst dendrimersupported pseudostationary phases for electrokinetic chromatography // Hire-Journal of High Resolution Chromatography. 1997. V. 20. PI 529-538.

2. H. Ma, B.Q: Chen, T. Sassa, L.R. Dalton, A.K.Y. Jen. Highly efficient andthermally stable nonlinear optical dendrimer for electrooptics // Journal" of the American Chemical Society. 2001. V. 123. PI 986-987.

3. J.L. Haynes, S.A. Shamsi, J. Dey, I.M. Warner. Use of a new diaminobutanedendrimer in electrokinetic capillary chromatography // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 1998. V. 21. P. 611-624.

4. C.Q. Shou, C.L. Zhou, C.B. Zhao, Z.L. Zhang, G.B. Li, L.R. Chen. Preparationand evaluation of non-bonded hyperbranched polymer-coated columns for capillary electrophoresis // Talanta. 2004. V. 63. P. 887-891.

5. M.L. Chen, X.W. Chen, J.H: Wang. Functionalization of MWNTs with

6. Hyperbranched PEI for Highly Selective Isolation of BSA // Macromolecular Bioscience. V. 10. P. 906-915.

7. B.T. Mathews, A.E. Beezer, M.J. Snowden, M.J. Hardy, J.C. Mitchell. Evaluationof novel dendrimer chiral stationary phases using HPLC // Chromatographia. 2001. V. 53. P. 147-155.

8. Y.F. Huang, C.C. Huang, C.C. Hu, H.T. Chang. Capillary electrophoresis-basedseparation techniques for the analysis of proteins // Electrophoresis. 2006. V. 27. P. 3503-3522.

9. J.W. Jorgenson, R.D. Lukacs. Capillary Zone Electrophoresis // Science. 1983. V.222. P. 266-272.

10. C.Z. Wang, C.A. Lucy. Mixed cationic/anionic surfactants for semipermanentwall coatings in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 825-832.

11. Y. Li, R. Xiang, J.A. Wilkins, C. Honrath. Capillary electrochromatography ofpeptides and proteins // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 2242-2256.

12. F.A. Chen, L. Kelly, R. Palmieri, R. Biehler, H. Schwartz. Quenching ofelectroosmotic flow in capillary electrophoresis via zwitterions // J. Liquid Chromatogr. 1992. V. 15. P. 1143-1150.

13. W.M.A. Niessen, U.R. Tjaden, J. Vandergreef. Capillary Electrophoresis Mass

14. Spectrometry // Journal of Chromatography. 1993. V. 636. P. 3-19.

15. M.A. Moseley, J.W. Jorgenson, J. Shabanowitz, D.F. Hunt, K.B. Tomer.

16. Simultaneous Separation of Acidic and Basic Proteins Using Open Tubular Capillary Electrochromatography //Analytical Chemistry. V. 82. Pi 3997-4005.

17. C.A. Luces, S.O. Fakayode, M. Lowry, I.M. Warner. Protein separations usingpolyelectrolyte. multilayer coatings with molecular micelles- in open' tubular capillary electrochromatography // Electrophoresis. 2008: V. 29. P. 889-900:

18. Y. Wu, J. Xie, F: Wang, Z.L. Chen. Electrokinetic separation of peptides andproteins using a polyvinylamine-coated capillary with UV. and ES1-MS detection:// Journal of Separation Science; 2008. V. 31. P: 814-823:

19. C.P. Kapnissi-Christodoulou, X.F. Zhu, I.M'. Warner. Analytical separations inopen-tubular capillary electrochromatography // Electrophoresis. 2003". V. 24. P. 3917-3934.

20. M.N. Albarghouthi, T.M. Stein, A.E. Barron. Poly-N-hydroxyethylaciylamide asa novel, adsorbed coating for protein separation by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2003. V. 24. P. 1166-1175.

21. J.J. Pesek, M.T. Matyska, G.B. Dawson, J.I.C. Chen, R.I. Boysen, M.T.W.

22. Heam. Open tubular capillary electrochromatography of synthetic peptides on etched chemically modified columns // Analytical Chemistry. 2004. V. 76. P. 23-30.

23. N.E. Baryla, J.E. Melanson, M.T. McDermott, C.A. Lucy. Characterization ofsurfactant coatings in capillary electrophoresis by atomic force microscopy // Analytical Chemistry. 2001. V. 73: P. 4558-4565.

24. J.F. Liu, W.A. Ducker. Surface-induced phase behavior of alkyltrimethylammonium bromide surfactants adsorbed to mica, silica, and graphite//Journal of Physical Chemistry B. 1999. V. 103. P. 8558-8567.

25. A.M; MacDonald, C.A. Lucy. Highly efficient protein separations in capillaryelectrophoresis using a supported bilayer/diblock copolymer coating // Journal of Chromatography A. 2006. V. 1130. P. 265-271.

26. E. Ostuni, R.G. Chapman, R.E. Holmlin, S. Takayama, G.M. Whitesides. Asurvey of structure-property relationships of surfaces that resist the adsorption of protein // Langmuir;. 2001. V. 17. P. 5605-5620.

27. J.M. Cunliffe, N.E. Baryla, C.A. Lucy. Phospholipid bilayer coatings for theseparation of proteins in capillary electrophoresis // Analytical Chemistry. 2002. V. 74. P. 776-783.

28. I. Reviakine, A. Brisson. Formation of supported phospholipid bilayers fromunilamellar vesicles investigated by atomic force microscopy // Langmuir. 2000. V. 16. P. 1806-1815.

29. J:F. Yin, W.L. Song, Z.X. Wang, H.L. Wang. Fabrication and fluorescenceimaging of human low-density lipoprotein coatings for highly efficient capillary electrophoresis separation of basic proteins // Electrophoresis. 2009. V. 30. P. 1362-1371.

30. S.A. Shamsi, B;C. Valle, F. Billiot, I.M. Warner. Polysodium N-undecanoyl-Lleucylvalinate: A versatile chiral selector for micellar electrokinetic chromatography //Analytical Chemistry. 2003. V. 75. P. 379-387.

31. E. Hardenborg, A. Zuberovic, S. Ullsten, L. Soderberg, E. Heldin, K.E.

32. Markides. Novel polyamine coating providing non-covalent deactivation and reversed electroosmotic flow of fused-silica capillaries for capillary electrophoresis // Journal of Chromatography A. 2003. V. 1003. P. 217-221.

33. N. Gonzalez, C. Elvira, J. San Roman, A. Cifuentes. New physically adsorbedpolymer coating for reproducible separations of basic and acidic proteins by capillary electrophoresis // Journal of Chromatography A. 2003. V. 1012. P. 95-101.

34. A J. Wang, J. Witos, L. D'Ulivo, K. Vainikka, M.L. Riekkola. Noncovalentpoly(l-vinylpyrrolidone)-based copolymer coating for the separation of basic proteins and lipoproteins by CE // Electrophoresis. 2009. V. 30: P: 3939-3946.

35. A.J. Wang, K. Vainikka, J. Witos, L. D'Ulivo, G. Cilpa, P.T. Kovanen, K. Oorni,

36. M. Jauhiainen, M.L. Riekkola. Partial filling affinity capillary electrophoresis with cationic poly(vinylpyrrolidone)-based copolymer coatings for studies on human lipoprotein-steroid interactions // Analytical Biochemistry. V. 399. P. 93-101.

37. Q.S. Qu, D.P. Liu, D. Mangelings, C. Yang, X.Y. Hu. Permanent goldnanoparticle coatings on polyelectrolyte multilayer modified: capillaries for open-tubular capillary electrochromatography // Journal of Chromatography A. V. 1217. P. 6588-6594.

38. H.Y. Koo, W.S. Choi, J.H. Park, D.Y. Kim. Polyelectrolyte multilayer-mediatedgrowth of gold nanoparticle films with tunable loading density and nanoparticle shape // Macromolecular Rapid Communications. 2008. V. 29. P. 520-524.

39. R. Haselberg, GJ. de Jong, G.W. Somsen. Capillary electrophoresis of intactbasic proteins using noncovalently triple-layer coated capillaries // Journal of Separation Science. 2009. V. 32. Pi 2408-2415.

40. M. Weinbauer, H. Stutz. Successive multiple ionic polymer layer coatedcapillaries in the separation of proteins Recombinant allergen variants- as a case study//Electrophoresis. V. 31. P. 1805-1812.

41. D. Bohoyo, I. Le Potier, C. Riviere, H. Klafki, J. Wiltfang, M. Taverna. Aquantitaive CE method to analyse tau protein isoforms using coated fused silica capillaries //Journal of Separation Science. V. 33. P. 1090-1098.

42. C.Q. Shou, NJ. Song, Z.L. Zhang. Synthesis of Hyperbranched Poly(3-methyl-3hydroxymethyloxetane) and Their Application to Separate Basic Proteins by Adsorption Coated Column // Journal of Applied Polymer Science. 2010. V. 116. P. 2473-2479.

43. C.Q. Shou, Z.L. Zhang. Preparation and Characterization of Hyperbranched

44. Polyester Capillaiy Columns Used for the Separation of Basic Proteins // Journal of Applied Polymer Science. 2009. V. 111. P. 2141-2147.

45. R.M. Yang, Y.H. Uu, Y.M. Wang. Hydroxyethylcellulose-graft-poly (4-vinylpyridine) as a novel, adsorbed coating for protein separation by CE // Electrophoresis. 2009. V. 30. P. 2321-2327.

46. J. Bernal, I. Rodriguez-Meizoso, C. Elvira, E. Ibanez, A. Cifuentes. Fast and easycoating for capillary electrophoresis based on a physically adsorbed cationic copolymer//Journal of Chromatography A. 2008. V. 1204. P. 104-109.

47. Y.Z. Yang, R.I. Boysen, M.T. Matyska, J.J. Pesek, M.T.W. Hearn. Open-tubularcapillary electrochromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry for peptide analysis // Analytical Chemistry. 2007. V. 79. P. 4942-4949.

48. W. Jiang, J.N. Awasum, K. Irgum. Control of electroosmotic flow and wallinteractions in capillaiy electrophosesis capillaries by photografted zwitterionic polymer surface layers // Analytical Chemistry. 2003. V. 75. P. 2768-2774.

49. C. Viklund, K. Irgum. Synthesis of porous zwitterionic sulfobetaine monolithsand characterization of their interaction with proteins // Macromolecules. 2000. V. 33. P. 2539-2544.

50. J. Li, H.F. Han, Q. Wang, X. Liu, S.X. Jiang. Poly(N-vinylimidazole)-graftedcapillary for electrophoresis prepared by surface-initiated atom transfer radical polymerization//Journal of Separation Science. 2010. V. 33. P. 2804-2810.

51. E.F. Hilder, F. Svec, J.M.J. Frechet. Polymeric monolithic stationary phases forcapillary electrochromatography // Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 3934-3953.

52. F. Svec, T.B. Tennikova. Polymeric Separation Media for Chromatography of

53. Biopolymers in a Novel Shape Macroporous Membranes // Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 1991. V. 6: Pi 393-405.

54. D: Josic, J. Reusch, K. Loster, 0. Baum, W. Reutter. High-Performance

55. Membrane Chromatography of Serum and Plasma-Membrane Proteins // Journal of Chromatography. 1992. V. 590. P. 59-76.

56. W. Li, D.P. Fries, A. Malik. Sol-gel stationary phases for capillary electrochromatography // Journal of Chromatography A. 2004. V. 1044. P. 2352.

57. X.L. Dong, R.A. Wu, J. Dong, M.H. Wu, Y. Zhu, H.F. Zou. Recent progress ofpolar stationary phases in CEC and capillary liquid chromatography // Electrophoresis. 2009. V. 30. P. 141-154.

58. P. Jandera, J. Urban, D. Moravcova. Polymetacrylate and hybrid interparticlemonolithic columns for fast separations of proteins by capillary liquid chromatography // Journal of Chromatography A. 2006. V. 1109. P. 60-73.

59. Q. Zhao, X.F. Li, X.C. Le. Aptamer-modified monolithic capillary chromatography for protein separation and detection // Analytical Chemistry. 2008. V. 80. P. 3915-3920.

60. A.D. Ellington, J.W. Szostak. Invitro Selection of Rna Molecules That Bind

61. Specific Ligands //Nature. 1990. V. 346. P. 818-822.

62. X.L. Sun, R. Liu, X.W. He, L.X. Chen, Y.K. Zhang. Preparation of phenylboronic acid functionalized cation-exchange monolithic columns for protein separation and refolding // Talanta. 2010. V. 81. P. 856-864.

63. J.X. Liu, Q.L. Deng, K.G. Yang, L.H. Zhang, Z. Liang, Y.K. Zhang. Macroporous molecularly imprinted monolithic polymer columns for protein recognition by liquid chromatography // Journal of Separation Science. 2010. V. 33. P. 2757-2761.

64. S. Currivan, D. Connolly, E. Gillespie, B. Paull. Fabrication and characterisationof capillary polymeric monoliths incorporating continuous stationary phase gradients // Journal of Separation Science. 2010. V. 33. P. 484-492.

65. D. Bandilla, C.D. Skinner. Protein separation by monolithic capillary electrochromatography // Journal of Chromatography A. 2003. V. 1004. P. 167179.

66. K. Matyjaszewski, T.P. Davis, Handbook of Radical Polymerization, Wiley1.terscience, 2002 P.936

67. J.A. Pojman, J. Willis, D. Fortenberry, V. Ilyashenko, A.M. Khan. Factors

68. Affecting Propagating Fronts of Addition Polymerization Velocity, Front Curvature, Temperature Profile, Conversion, and Molecular-Weight

69. Distribution // Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry. 1995. V. 33. P. 643-652.

70. R.Y. Zhang, L. Qi, P!Y. Xin, G.L. Yang, Y. Chen. Preparation-of macroporousmonolith with three dimensional bicontinuous skeleton structure by atom transfer radical polymerization for HPLC // Polymer. 2007. V. 51. P: 17031708.

71. S. Eeltink, E.F. Hilder, L. Geiser, F. Svec, J.MJ. Frechet, G.P. Rozing, P.J.

72. Schoenmakers, W.T. Kok. Controlling the surface chemistry and chromatography properties of methyacrylate-ester-based monolithic capillary colums via photografting // Journal of Separation Science. 2007. V. 30. P. 407413.

73. D. Sykora, F. Svec, J.M.J. Frechet. Separation of oligonucleotides on novelmonolithic columns with ion-exchange functional surfaces // Journal of Chromatography A. 1999. V. 852. PI 297-304.

74. B. Gu, Y. Li, M.L. Lee. Polymer monoliths with low Hydrophobicity for strongcation-exchange capillary liquid chromatography of peptides and proteins // Analytical Chemistry. 2007. V. 79. P. 5848-5855.

75. E.C. Peters, M. Petro, F. Svec, J.M.J. Frechet. Molded rigid polymer monolithsas separation media for capillary electrochromatography. 1. Fine control of porous properties and surface chemistry // Analytical Chemistry. 1998. V. 70. P. 2288-2295.

76. J. Krenkova, A. Gargano, N.A. Lacher, J.M. Schneiderheinze, F. Svec. Highbinding capacity surface grafted monolithic columns for cation exchange chromatography of proteins and peptides // Journal of Chromatography A. 2009. V. 1216. P. 6824-6830.

77. H.J. Fu, C.H. Xie, J. Dong, X.D: Huang, H.F. Zou. Monolithic column withzwitterionic stationary phase for capillary electrochromatography // Analytical Chemistry. 2004. V. 76: P: 4866-4874.

78. H.W. Zhong, Z. El Rassi. Neutral polar methacrylate-based monoliths for normalphase nano-LC and CEC of polar species including N-glycans // Journal of Separation Science. 2009: V. 32. P. 10-20.

79. Z.F. Pan, H.F. Zou, W.M. Mo, X.D. Huang, R.N. Wu. Protein A immobilizedmonolithic capillary column for affinity chromatography // Analytica Chimica Acta. 2002. V. 466. P. 141-150.

80. J. Krenkova, N.A. Lacher, F. Svec. Control of Selectivity via Nanochemistry:

81. Monolithic Capillary Column Containing Hydroxyapatite Nanoparticles for Separation of Proteins and Enrichment of Phosphopeptides // Analytical Chemistry. 2010. V. 82. P. 8335-8341.

82. T. Kawasaki. Hydroxyapatite as a Liquid-Chromatographic Packing // Journal of

83. Chromatography. 1991. V. 544. P. 147-184.

84. P. Gagnon. Monoclonal antibody purification with hydroxyapatite // New

85. Biotechnology. 2009: V. 25. P. 287-293.

86. M: Seiler. Hyperbranched polymers: Phase behavior and new applications in thefield of chemical engineering // Fluid Phase Equilibria. 2006. V. 241. PI 155174.

87. E. Buhleier, W. Wehner, F. Vogtle. Cascade-Chain-Like and Nonskid-Chain1.ke Syntheses of Molecular Cavity Topologies // Synthesis-Stuttgart. 1978. V. P. 155-158.

88. Z.B. Shifrina, N.V. Kuchkina, P.N. Rutkevich, T.N. Vlasik, A.D. Sushko, V.A.1.umrudov. Water-Soluble Cationic Aromatic Dendrimers and Their Complexation with DNA // Macromolecules. 2009. V. 42. P. 9548-9560.

89. P.J. Flory. Molecular size distribution in three dimensional polymers. I. Gelation

90. Journal of the American Chemical Society. 1941. V. 63. P. 3083-3090.

91. D.A. Tomalia, H. Baker, J. Dewald, M. Hall, G. Kallos, S. Martin, J. Roeck, J.

92. Ryder, P. Smith. A New Class of Polymers Starburst-Dendritic Macromolecules//Polymer Journal. 1985. V. 17. P. 117-132.

93. G.R. Newkome, Z.Q. Yao, G.R. Baker, V.K. Gupta. Micelles .1. Cascade

94. Molecules a New Approach to Micelles - a 27 -Arborol // Journal of Organic Chemistry. 1985. V. 50. P. 2003-2004.

95. B. Voit. New developments in hyperbranched polymers // Journal of Polymer

96. Science Part a-Polymer Chemistry. 2000. V. 38. P. 2505-2525.

97. B. Voit. Hyperbranched polymers All problems solved after 15 years ofresearch? // Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry. 2005. V. 43. P. 2679-2699.

98. C.J. Hawker, J.M.J. Frechet. Preparation of Polymers with Controlled Molecular

99. Architecture a New Convergent Approach to Dendritic Macromolecules // Journal of the American Chemical Society. 1990. V. 112. P. 7638-7647.

100. G.H. Jiang, W.X. Chen, W. Xia. Environmental-sensitive hyperbranched polymers as drug carriers // Designed Monomers and Polymers. 2008. V. 11. P. 105-122.

101. D. Appelhans, H. Komber, M.A. Quadir, S. Richter, S. Schwarz, J. van der Vlist,

102. Z.J. Zhao, J.H. Li, X.P. Chen, P. Lu, Y. Yang. Fluorescent conjugateddendrimers with fluorinated terminal groups: nanofiber formation and electroluminescence properties // Organic Letters. 2008. V. 10. P. 3041-3044.

103. M.S. Rajadurai, Z.B. Shifrina, N.V. Kuchkina, A.L. Rusanov, K. Muellen. Rigidaromatic dendrimers // Uspekhi Khimii. 2007. V. 76. P. 821-838.

104. S J. Xu, Y. Luo, R. Haag. Structure-transport relationship of dendritic core-shellnanocarriers for polar dyes // Macromolecular Rapid Communications. 2008. V. 29. P. 171-174.

105. S J. Xu, Y. Luo, R. Graeser. A. Warnecke, F. Kratz, P. Hauff, K. Licha, R. Haag.

106. Development of pH-responsive core-shell nanocarriers for delivery of therapeutic and diagnostic agents // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2009. V. 19. P. 1030-1034.

107. K.R. Gopidas, A.R. Leheny, G. Caminati, N.J. Turro, D.A. Tomalia. Photophysical Investigation of Similarities between Starburst Dendrimers and Anionic Micelles // Journal of the American Chemical Society. 1991. V. 113. P. 7335-7342.

108. N. Tanaka, T. Tanigawa, K. Hosoya, K. Kimata, T. Araki, S. Terabe. Starburst Dendrimers as Carriers in Electrokinetic Chromatography // Chemistry Letters. 1992. V. P. 959-962.

109. G.R. Newkome, K.S. Yoo, A. Kabir, A. Malik. Synthesis of benzyl-terminated dendrons for use in high-resolution capillary gas chromatography // Tetrahedron Letters. 2001. V. 42. P. 7537-7541.

110. K. Grob, G. Grob. Comprehensive, Standardized Quality Test for Glass Capillary Columns // Journal of Chromatography. 1978. V. 156. P. 1-20.

111. S. Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando. Electrokinetic Separations with Micellar Solutions and Open-Tubular Capillaries // Analytical Chemistry. 1984. V. 56. P. 111-113.

112. S. Terabe, K. Otsuka, T. Ando. Electrokinetic Chromatography with Micellar Solution and Open-Tubular Capillary // Analytical Chemistry. 1985. V. 57. P. 834-841.

113. S.A. Kuzdzal, C.A. Monnig, G.R. Newkome, C.N. Moorefield. A study of dendrimer-solute interactions via electrokinetic chromatography // Journal of the American Chemical Society. 1997. V. 119. P. 2255-2261.

114. H.C. Chao, J.E. Hanson. Dendritic polymers as bonded stationary phases in capillary electrochromatography // Journal of Separation Science. 2002. V. 25. P. 345-350.

115. A. Kabir, C. Hamlet, K.S. Yoo, G.R. Newkome, A. Malik. Capillary microextraction on sol-gel dendrimer coatings // Journal of Chromatography A. 2004. V. 1034. P. 1-11.

116. R. Doong, S. Chang, Y. Sun. Solid-phase microextraction for detemnining the distribution of sixteen US Environmental Protection Agency polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples // Journal of Chromatography A. 2000. V. 879. P. 177-188.

117. B. Cancho, F. Ventura, M.T. Galceran. Determination of aldehydes in drinking water using pentafluorobenzylhydroxylamine derivatization and solid-phase microextraction // Journal of Chromatography A. 2002. V. 943. P! 1-13".

118. B.T. Mathews, A.E. Beezer, M.J. Snowden, M.J. Hardy, J.C. Mitchell. The synthesis of immobilised chiral dendrimers // New Journal of Chemistry. 2001. V. 25. P. 807-818.

119. S.H. Huang, S.R. Li, Z.W. Bai, Z.Q. Pan, C.Q. Yin. Dendrimer-like chiral stationary phases derived from (1R, 2R)-(+)-l, 2-diphenylethylenediamine and 1,3,5-benzenetricarbonyl trichloride // Chromatographia. 2006. V. 64. P. 641646.

120. J. Sherma, B. Fried, Handbook of Thin-Layer Chromatography, CRC Press, 2003 P. 1048

121. M. Ericsson, L.G. Blomberg. Modification of HPTLC-plates by in situ chemical bonding with non-polar and polar organosilanes // Journal of High Resolution Chromatography. 1980. V. 3. P. 345-350.

122. W. Jost, H.E. Hauck. High-Performance Thin-Layer Chromatographic Precoated Plates with Amino Modification and Some Applications // Journal of Chromatography. 1983. V. 261. P. 235-244.

123. J.D. Vasta, M. Cicchi, J. Sherma, B. Fried. Evaluation of Thin-Layer Chromatography Systems for Analysis of Amino Acids in Complex Mixtures // Acta Chromatographics 2009. V. 21. P. 29-38.

124. S. Pasilis, V. Kertesz, G. Van Berkel, M. Schulz, S. Schorcht, in Analytical and Bioanalytical Chemistry, Springer Berlin / Heidelberg, 2008, p. 317-324.

125. K.B. Wang, Z.H. Liu, J.A. Huang, D.H. Fu, F. Liu, Y.S. Gong, X.S. Wu. TLC Separation of Catechins and Theaflavins on Polyamide Plates // Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modern Tic. 2009. V. 22. P. 97-100.

126. Z.H. Xie, Y.T. Dou, S.Z. Ping, M. Chen, G.Y. Wang, C. Elmerich, IVLLin. Interaction between NifL and NifA in the nitrogen-fixing Pseudomonas stutzeri A1501 // Microbiology-Sgm. 2006. V. 152. P. 3535-3542.

127. U.A. Madden. H.M. Stahr. Reverse-Phase Thin-Layer Chromatography Assay of Vitamin-K in Bovine Liver // Journal; of Liquid Chromatography. 1993: V. 16. P. 2825-2834.

128. CI Cimpoiu; A;. Hosu, RLBnciu;. V. MiclauS; Monitoring the : origin of "wine by reversed-phase thin-layer chromatography // Jpc-Journal; of Planar Chromatography-Modern Tic. 2007. V. 20. P: 407-410.

129. I. Fecka.-Development of Chromatographic Methods for Determination of Agrimoniin and Related Polyphenols in Pharmaceutical Products // Journal of Aoac International. 2009: V. 92. P: 410-418.

130. B:D. Kabulov, D.S. Shakarova, O.A. Shpigun, S.S. Negmatov. Chitosan-silica nanocomposite sorbent for thin-layer chromatography of alkaloids // Russian Journal of Physical Chemistry A. 2008. V. 82. P. 924-927.

131. X. Liu, T. Kubo, H. Diao, J. Benjamas, T. Yonemichi, N. Nishi. DNA/polyvinyl alcohol interpenetrating polymer network as stationary phase for thin layer chromatography // Analytical Biochemistry. 2009. V. 393: P. 67-72.

132. E. Stahl (E. StahI),E. Stahls), Thin Layer Chromatography: A Laboratory Handbook, Springer, 1969.

133. A. Mirzaie, A. Jamshidi, S.W. Husain. Quantitative ion-exchange TLC of p-hydroxybenzoic acid in the presence of preservatives // Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modern Tic. 2007. V. 20. P: 303-306.

134. A. Mirzaie, A. Jamshidi; S;W. Husain. TLC quantification of methylparaben on an inorganic ion-exchanger in the presence of other food additives // Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modern Tic. 2007. V. 20. P. 141-143 .

135. J.-L. Sebedio, W.M.N. Ratnayake, Analysis of Trans Mono- and Polyunsaturated Fatty Acids, Blackwell Publishing Ltd, 2008 P:102-13T

136. Z. Hassankhani-Majd, V. Ghoulipour, S:W. Husain. Chromatographic behavior of performance-enhancing drugs on thin layers of bismuth silicate ion exchanger//Acta Chromatographica. 2006. V. 16. P. 173-180:

137. H. Khan, in Chromatographia, Vieweg Verlag, 2006, p. 423-427.

138. R. Bhushan, C. Agarwal, in Chromatographia, Vieweg Verlag, 2008, p. 10451051.

139. R. Bhushan, C. Agarwal. Direct resolution of six beta blockers into their enantiomers on silica plates impregnated with L-Asp and L-Glu // Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modern Tic. 2008. V. 21. P. 129-134.

140. G. Grygierczyk. Chromatographic analysis of organic compounds on impregnated chemically bonded stationary phases, part 1 // Acta Chromatographica. 2006. V. 17. P. 302-313.

141. E.G. Sumina, S.N. Shtykov, S.V. Dorofeeya. Ion-pair reversed-phase thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography of benzoic acids //Journal of Analytical Chemistry. 2002. V. 57. P. 210-214.

142. N. Salama. Validated Densitometric TLC Method for Analysis of (R)- and (S)-Bupivacaine, Using Cyclodextrin Derivatives as Chiral Selectors // Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modern Tic. 2008. V. 21. P: 441-446.

143. J. Krzek, M. Starek, D. Jelonkiewicz. RP-TLC determination of S(+) and R(-) ibuprofen in drugs with the application of chiral mobile phase and UV densitometric detection// Chromatographia. 2005. V. 62. P. 653-657.

144. M. Dabrowska, J. Krzek. Chiral Separation of Diastereoisomers of Cefuroxime Axetil by High-Performance Thin-Layer Chromatography // Journal of Aoac International. V. 93. P. 771-777.

145. J. Flieger, M. Tatarczak. Influence of inorganic mobile phase additives on the retention and separation efficiency of selected amino acids in thin-layer chromatography on cellulose layers // Journal of Chromatographic Science.2008. V. 46. P. 565-573.

146. D.W. Armstrong, J.H. Fendler. Differential Partitioning of Transfer-Rnas between Micellar and Aqueous Phases Convenient Gel-Filtration Method for Separation of Transfer-Rnas // Biochimica Et Biophysica Acta. 1977. V. 478. P. 75-80.

147. A. Mohammad, V. Agrawal. Separation of amino acids on alumina layer developed with oil-in-water microemulsion II Indian Journal of Chemistry Section a-Inorganic Bio-Inorganic Physical Theoretical & Analytical Chemistry. 2001. V. 40. P. 1130-1134.

148. D.W. Armstrong. Pseudophase Liquid-Chromatography Applications to Tic // Journal of Liquid Chromatography. 1980. V. 3. P. 895-900.

149. A. Mohammad, V. Agrawal, H. Shahab. Cetylpyridinium chloride micelle-mediated mutual separation of zinc, cadmium, and mercury ions by thin-layer chromatography // Acta Chromatographica. 2007. V. 19. P. 185-196.

150. A. Mohammad, S. Sharma. Separation of Co-Existing Paracetamol and Diclofenac Sodium on Silica Gel 'H' Layers Using Surfactant Mediated Mobile Phases: Identification of Diclofenac Sodium from Human Urine // Farmacia.2009. V. 57. P. 201-211.

151. D. Tian, H.Q. Xie. Influence of microemulsion conditions on the thin layer chromatographic behavior of amino acids // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2008. V. 31. P. 763-771.

152. M. Rosen, Surfactants and Interfacial Phenomena, Wiley-VCH, 1989 P.796156

153. A. Mohammad, R. Gupta. Mobility behaviour of amino acids on silica static phase: Micelles activated separations // Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 2008. V. 65. P. 166-171.

154. L. Kartsova, O; Koroleva, in Journal of Analytical Chemistry, MMK Nauka/Interperiodica distributed exclusively by Springer Science+Business Media LLC., 2007, p. 255-259.

155. J.Y. Guo, Y. Lu. Metal Ion Interactions with Sugars: Crystal Structure and FT-IR Study of the EuC13-Ribose Complex // Journal of Carbohydrate Chemistry. V. 29. P. 10-19.

156. A. Mohammad, S. Hina. Simultaneous separation of nitroaniline isomers with a water-in-oil microemulsion // Acta Chromatographica. 2005. V. 15. P. 238-246.

157. L.A. Kartsova, E.G. Strel'nikova. Separation of exogenous and endogenous steroid hormones by micellar high-performance thin-layer chromatography // Journal of Analytical Chemistry. 2007. V. 62. P. 872-874.

158. A. Mohammad, S. Laeeq. Mixed Surfactants enable separation of lysine from other essential amino acids in TLC on silica gel // Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modern Tic. 2007. V. 20. P. 423-427.

159. M. Bedair, Z. El Rassi. Recent advances in polymeric monolithic stationary phases for electrochromatography in capillaries and chips // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 4110-4119.

160. Л.Д. Павлова, K.B. Маерле, M.M. Ильин, B.A. Даванков. Новый тип сорбционной монолитной фазы на основе TV-алкилированного 4-винилпиридина для капиллярной электрохроматографии // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8. Вып. 5. 707-716.

161. M.M. Robson, M.G. Cikalo, P. Myers, M.R. Euerby, K.D. Bartle. Capillary electrochromatography: A review// Journal of Microcolumn Separations. 1997. V. 9. P. 357-372.

162. J. Jiskra, H.A. Claessens,. C.A. Cramers. Stationary and mobile phases in capillary electrochromatography (CEC) // Journal of Separation Science. 2003. V. 26. P. 1305-1330.

163. Z.B. Zhang, R.A. Wu, M.H. Wu, H.F. Zou. Recent progress of chiral monolithic stationary phases in CEC and capillary LC // Electrophoresis. V. 31. P. 14571466.

164. A.A. Тагер. // Физикохимия полимеров. M., Химия. 1978. 544 с.

165. М. Shima, М. Sato, М. Atsumi, К. Hatada. Dipole-Moments of Isotactic and Syndiotactic Poly(Methyl Methacrylate) and Their Temperature-Dependence // Polymer Journal. 1994. V. 26. P. 579-585.

166. D.R. Lide, Handbook of Chemistry and Physics, 87th Edition, CRC Press, 2006 P.2608

167. I. Gusev, X. Huang, C. Horvath. Capillary columns with in situ formed porous monolithic packing for micro high-performance liquid chromatography and capillary electrochromatography // Journal of Chromatography A. 1999: V. 855. P. 273-290.

168. C. Horvath, W. Melander. Liquid-Chromatography with Hydrocarbonaceous Bonded Phases Theory and Practice of Reversed Phase Chromatography // Journal of Chromatographic Science. 1977. V. 15. P. 393-404.

169. A. Vailaya, C. Horvath. Solvophobic theory and normalized free energies of nonpolar substances in reversed phase chromatography // Journal of Physical Chemistry B. 1997. V. 101. P. 5875-5888.

170. R.L. Chien, D.S. Burgi. Sample stacking of an extremely large injection volume in high-performance capillary electrophoresis // Analytical Chemistry. 1992. V. 64. P. 1046-1050.

171. P. Moreno, V. Salvado. Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography // Journal of Chromatography A. 2000. V. 870. P. 207-215.

172. L.F. Russell, in L.M.L. Nollet (Editor), Food analysis by HPLC, 2000, p. 403476.

173. M.Goodarzi, G. T. Spectrophotometric determination of acidity constants of Thiamine in water, water-Triton X-100 micellar media solutions // Iran. J. Chem. Chem. Eng. 2008. V. 27. P. 15-20.

174. P. Hemmerich, C. Veeger, H.C.S. Wood. Fortschritte in Chemie und Molekularbiologie der Flavine und Flavocoenzyme // Angewandte Chemie. 1965. V. 77. P. 699-716.

175. D:E. Lynch; J. Lad, G. Smith; S. Parsons. Molecular complexes of 3-hydroxypyridine with nitro-substituted aromatic and heterocyclic carboxylic acids-// Crystal'Engineering. 1999: V. 2. P: 65-77.

176. K.L. Brown, J.M. Hakimi, D:W. Jacobsen. Heteronuclear Nmr-Studies of Cobalamins .3. P-31 Nmr. of Aquocobalamin and Various Organocobalamins // Journal of the American Chemical Society. 1984. V. 106: P. 7894-7899.

177. G.T. Bratt, H.P.C. Hogenkamp. C-13 Nuclear Magnetic-Resonance Studies of Cobalamins//Biochemistry. 1984. V. 23. P." 5653-5659.

178. E.G.C. Clarke, in A.C. Moffat (Editor), Clarke's Isolation and Identification of Drugs: In Pharmaceuticals, Body Fluids and Post Mortem Material, Pharmaceutical Press, p. 1200.

179. S.N. Shtykov, E.G. Sumina, E.V. Smushkina, N.V. Tyurina. Dynamic and static modification of stationary phases with surfactants in TLC: A comparative study // Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modem Tic. 2000. V. 13. P. 182-186.

180. D.K. Roy, N. Deb, B.C. Ghosh, A.K. Mukherjee. Inclusion of riboflavin in beta-cyclodextrin: A fluorimetric and absorption spectrometric study // Spectrochimica Acta Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2009. V. 73. P. 201-204.

181. I.V. Terekhova, G.K.E. Scriba. Study on complex formation of biologically active pyridine derivatives with cyclodextrins by capillary electrophoresis // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007. V. 45. P. 688-693.

182. C. Garnero, M. Longhi. Study of ascorbic acid interaction with hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and triethanolamine, separately and in combination // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007. V. 45. P. 536-545.

183. C. Garnero, M. Longhi. Development of HPLC and UV spectrophotometric methods for the determination of ascorbic acid using hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and triethanolamine as photostabilizing agents // Analytica Chimica Acta. V. 659. P. 159-166.

184. W. Ouyang, M. Muller, D. Appelhans, B. Voit. In Situ ATR-FTIR Investigation on the Preparation and Enantiospecificity of Chiral Polyelectrolyte Multilayers // Acs Applied Materials & Interfaces. 2009. V. 1. P. 2878-2885.

185. S. Boye, N. Polikarpov, D. Appelhans, A. Lederer. An alternative route to dye-polymer complexation study using asymmetrical flow field-flow fractionation // Journal of Chromatography A. 2010. V. 1217. P. 4841-4849.

186. U.V. Lay Ma, J.D. Floros, G.R. Ziegler. Formation of inclusion complexes- of starch with fatty acid esters of bioactive compounds // Carbohydrage Polymers. 2011. V. 83. P. 1869-1878.

187. R.R. Williams, V.H. Cheldelin. Destruction of Riboflavin by Light // Science. 1942. V. 96. P. 22-23.

188. M.Y. Jung, Y.S. Oh, D.K. Kim, H.J. Kim, D.B. Min. Photoinduced Generation of 2,3-Butanedione from Riboflavin // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007. V. 55. P. 170-174.

189. E. Silva, C. Almarza, D. Berndt, L. Larrondo, E. Lissi. Photoreactions of riboflavin with spermine and their role in tryptophan photoconsumption induced by riboflavin // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 1993. V. 21. P. 197-201.

190. K.H. Jung, Oxidation mechanism of riboflavin destruction and antioxidant mechanism of tocotrienols. PhD thesis. Ohio State University, Ohio, 2007, 175 p.

191. V.G. Berezkin, E.V. Kormishkina. Study of a New Version of Classical Thin-Layer Chromatography with a Closed Adsorbent Layer. J. Planar Chrom. 2006. V. 19. P. 81-85

192. N. Polikarpov, A. Kaufmann, J. Kluge, D. Appelhans, B. Voit. Investigation of dye-glycopolymer and glycopolymer-hydrogel interactions for development of multirelease system. J. Contr. Rel. 2010. V.148. P. E66-E68.