Иммобилизация липолитических и протеолитических ферментов и сульфамидных лекарственных препаратов на полимерных носителях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ
Краюткина, Елена Николаевна
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Львов
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
2000
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.06
КОД ВАК РФ
|
||
|
НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ “ЛЬВІВСЬКА ПОЛІТЕХНІКА”
Краюткіна Олена Миколаївна
Г* '\
. і •^ V/ •» *
і о
^ дсих 2ШІ УДК 541.64:577.156
ІММОБІЛІЗАЦІЯ ЛІПОЛ1ТИЧНИХ І ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ ТА СУЛЬФАМІДНИХ ЛІКАРСЬКИХ ПРЕПАРАТІВ НА ПОЛІМЕРНИХ НОСІЯХ
02.00.06 - хімія високомолекулярних сполук
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук
Львів - 2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Національному університеті “Львівська політехнік. Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор ЧУЙКО Леонід Сидорович,
Національний університет “Львівська політехніка”, професор кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
СОЛТИС Михайло Миколайович,
Львівський національний університет
ім. Івана Франка, професор кафедри фізичної
і колоїдної хімії
доктор хімічних наук, професор ТУРОВСЬКИЙ Анатолій Антонович,
Відділення фізико-хімії і технології горючих копали Інституту фізичної хімії ім. Л. В. Писаржевського, завідувач відділу
Провідна установа: Київський національний університет
ім. Тараса Шевченка Міністерства освіти і науки України, кафедра хімії високомолекулярних сполук, м. Київ.
Захист відбудеться «2.0» грудня 2000 р. о год. на засідаш
спеціалізованої вченої ради Д 35.052.01 у Національному університет “Львівська політехніка” за адресою: 79013, Львів-13, пл. Св. Юра, Ул, ауд.24(
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного універсі тету “Львівська політехніка” (Львів-13, вул. Професорська,1).
Автореферат розісланий « » листопада 2000 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 35.052.01 кандидат хімічних наук, доцент
Скорохода В. Й.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. Ферменти, як специфічні каталізатори біохімічних хімічних процесів, широко використовуються в харчовій та легкій про-исловостях, в біотехнології, медицині та інших галузях. Однак використання ітивних ферментів як біокаталізаторів має певні обмеження, обумовлені їх іастивостями. В цьому плані іммобілізація ферментів дозволяє реально :унути ці недоліки, а саме забезпечити високу стійкість та інші їх корисні іастивості, що мають виняткове значення при практичному використанні ерментів, переважно в промисловому виробництві. З відомих методів [мобілізації, найбільш перспективним є хімічна модифікація (ковалентна [мобілізація) ферментів на полімерних носіях.
В цьому плані особливого інтересу заслуговує хімічна модифікація політичних та протеолітичних ферментів, а саме ферментного препарату пази “ліполактину” (ЛП) і протеолітичного ферменту протеази “С” (Пр“С”) і полімерних носіях. Як відомо, ліполактин використовується в :хнологічних процесах ферментативного гідролізу відходів олієжирової зомисловості з метою одержання жирних кислот та гліцерину, а протеаза “С” іаходить застосування як лікарський засіб для лікування опікових ран.
З іншого боку досить перспективним є процес одержання біологічно стивних полімерів медичного призначення шляхом співіммобілізації зотеолітичних ферментів та антимікробних речовин із метою створення карських препаратів поліфункціональної дії. При цьому такі лікарські зепарати набувають особливих властивостей, які пов’язані з їх полімерною зиродою, а саме збільшується термін дії препарату (пролонгація), змен-ується токсичність тощо.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
исертаційна робота виконана у відповідності з державними науково-їхнічними програмами “Нові хімічні речовини і матеріали малотонажного іробництва для заміни імпортованих” (проект № 2.11), “Нові екологічно їзпєчні лікувальні засоби” (проект № 03.06.01/001-95,03.07/02441).
Мета і задачі досліджень. Метою дисертаційної роботи є ковалентна (мобілізація ліполітичних і протеолітичних ферментів та сульфамідних ікарських препаратів на полімерних носіях; синтез і вивчення біологічно стивних полімерних носіїв та фермент-полімерних комплексів (ФПК), а ікож пошук шляхів використання синтезованих біологічно активних злімерів як ефективних каталізаторів та лікарських препаратів.
Для досягнення поставленої мети необхідним було:
- синтезувати біологічно активні сульфамідні мономери (СМ) і визначити знстанти їх співполімеризації з вінільними мономерами та склади бінарних і
трикомпонентних співполімерів, а також створити на їх основі полімерні ні з біологічно активними сульфамідними групами для іммобілізації ферментів
- вивчити іммобілізацію протеази “С” на синтезованих сульфаміді полімерних носіях;
- розробити методи сумісної іммобілізації протеази “С” з антимікр ними речовинами на синтезованих полімерних носіях та співполімері стирі з малеїновим ангідридом - стиромалі (СМА);
- показати можливість використання одержаних співіммобілізоваї систем як полімерних лікарських препаратів комбінованої дії;
- дослідити процес хімічної модифікації СМА ліполактином синтезувати ФПК з прищепленими фрагментами ЛП та вивчити їх властивос
- вивчити кінетику одночасного струкіурування та іммобіліз; трикомпонентної системи: СМА - ЛП - л*-фенілендіамін (лі-ФДА) і структ тривимірної просторової сітки, яка при цьому утворюється;
- вивчити синтезовані ФПК на основі ліполактину як каталізат< процесів тотального гідролізу жирів.
Об’єкт дослідження - одержання біологічно активних полімерії фрагментами протеолітичних і ліполітичних ферментів та сульфаміді лікарських препаратів.
Предмет дослідження - ковалентна іммобілізація протеолітичний ліполітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів синтезованих біологічно активних полімерних носіях і стиромалі.
Методи дослідження. Синтез полімерів проводили шляхом радикаль співполімеризації та реакціями полімераналогічних перетворень, кінеті співполімеризації досліджували дилатометричним методом, ск. співполімерів визначали елементним аналізом, властивості модифіковаї співполімерів вивчали диференційно-термічним і термогравіметричь методами; структуру мономерів та полімерів підтверджували спектроскопією, кінетику структурування ФПК вивчали мето; рівноважного набухання, ферментативні активності та масову долю бі. розчинних ферментів і синтезованих ФПК визначали спектрофотометричні та потенціометричними методами.
Наукова новизна одержаних результатів. Вивчена співполімериза синтезованих біологічно активних СМ з вінільними мономерами в бінарних трикомпонентних системах. Вперше визначені константи співполімериза СМ (гі та г2) із стиролом (С) і малеїновим ангідридом (МА) та склади бінарь співполімерів і терполімерів. На основі таких бінарних та трикомпоненті систем вперше синтезовані полімерні носії, які мають у своїй структ біологічно активні сульфамідні групи, а також високореакційнозда ангідридні групи, за рахунок яких відбувається ковалентна іммобіліза ферментів.
Вперше розроблені методи співіммобілізації Пр“С” з антимікробними човинами (норсульфазолом (НС) та стрептоцидом (СЦ)) на синтезованих алогічно активних полімерних носіях та стиромалі, в результаті чого нтезовані полімерні лікарські препарати поліфункціональної дії. Вивчено новні закономірності процесу іммобілізації цих систем та визначені ітимальні умови його проведення.
Вперше досліджено процес ковалентної іммобілізації ліполактину на VIA та синтезовані ФПК, які містять у бічних ланцюгах макромолекул носія чічно пов’язаний фермент. Вивчено властивості ФПК порівняно з нативним І і показано, що вони є більш стабільними, а температурний оптимум дії ПК є розширеним та зміщеним в область більш високих температур.
Досліджено процес одночасного структурування та іммобілізації икомпонентної системи: СМА - ЛП - л<-ФДА. Показано, що в даній системі ребігають одночасно дві конкуруючі реакції ацшповання з ковалентним іищепленням ферменту до полімерної матриці й утворенням поперечних ’язків між макромолекулами СМА в результаті зшивання їх структуруючим ентом - Л/-ФДА. Вивчено кінетику зшивання та структуру тривимірної юсторової сітки, і показано, що процес структурування залежить виключно ї концентрації jw-фенілендіаміну і не залежить від концентрації ліполактину. жазано, що синтезовані ФКП є каталізаторами процесів гідролізу жирів.
Практична цінність роботи. На основі співіммобілізації систем: рполімер (С - МА - СМ-ІІІ) - протеаза “С” та стиромаль - норсульфазол -ютеаза “С” створені ФПК із комбінованою дією, які можуть бути ікористані як біологічно активні полімери медичного призначення, в першу ргу для лікування опікових ран.
В результаті проведених досліджень одержані структуровані фенілендіаміном ФПК на основі ліполактину, ковалентно іммобілізованого СМА. Такі каталізатори мають поліпшену механічну міцність, стабільність активність і можуть бути використані в процесах тотального гідролізу іслинних олій з метою одержання жирних кислот та гліцерину за звідходною технологією, що підвищить екологічну чистоту виробництва.
Особистий внесок дисертанта полягає в безпосередній участі в істановці задачі, самостійному виконанні експериментальних досліджень та іробці даних експерименту, формулюванні основних положень і висновків ісертаційної роботи. Автором зроблений основний внесок у розробку іукових результатів, що виносяться на захист.
Апробація роботи. Основні результати роботи доповідались й обгово-эвались на шостій науковій конференції “Львівські хемічні читання - 97” [ьвів, 1997), на першій міжнародній конференції видавництва “Наука і віта-98” (Дніпропетровськ, 1998), на другій науково-технічній конференції-Іоступ в нафтогазопереробній та нафтохімічній промисловості” (Львів, 1999)
та щорічних науково-технічних конференціях ДУ “Львівська політехніка” 1996-1999 рр.
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 5 статей і 3 т доповідей.
Структура та об’єм роботи. Дисертаційна робота складається з встуг чотирьох розділів, висновків, списку використаних джерел. Матеріали робо викладені на 149 сторінках машинописного тексту, містять 24 рисунки і таблиць. Список літератури містить 185 найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У першому розділі дисертаційної роботи проведено аналіз літературні даних з питань ковалентної іммобілізації протеолітичних та ліполітичні ферментів на полімерних носіях різної природи через утворення амідного азідного зв’язків, а також з використанням реакцій ацилюваня, алкілувань біфункціональних реагентів тощо. Розглянуто особливості синтезу полімерні носіїв для ковалентної іммобілізацї шляхом співполімеризації відповідні мономерів з реакційноздатними групами чи з наступним введенні реакційноздатних груп у попередньо одержаний полімер реакція! полімераналогічних перетворень. Описано закономірності одержан полімерних носіїв на основі похідних стиролу, акрилової кислоти, поліамід полівінілового спирту тощо. Показана перспективність одержання біологіч; активних сульфамідних полімерів.
Обгрунтовані шляхи використання іммобілізованих систем в біотс нології, медицині, харчовій та легкій промисловостях.
У другому розділі розглянуті об’єкти і методи досліджень. Об’єктаї досліджень були вибрані як вихідні речовини: протеолітичний ферме протеаза “С” з ММ=40-50тис. та протеолітичною активністю (ПА) 80тис. од ферментний препарат ліпази “ліполактин” з ММ=30-50 тис. та ліполітичнс активністю (ЛА) 1600 од/г; антимікробні препарати - норсульфазол стрептоцид, загальної формули Н2ІЧ-С6Н4-802-№іХ, де Х=Н або —| полімерний носій - стиромаль загальної формули "''З'
^-СН-СН2-СН - СН^ з кислотним числом КЧ=524 КОН/г співполімеру т
<ЬбН5 о=£х <Ь=о п
О /==^-N112
ММ=100-110 тис.; структуруючий агент -лі-фенілендіамін: Н2М//; ацилюючі агенти - малеїновий ангідрид та метакрилоїлхлорид (МА) мономери - стирол та малеїновий ангідрид; ініціатор - динітрил азо-б ізомасляної кислоти (ДАК); а також синтезовані біологічно актиі сульфамідні мономери акрилатного та малеїнатного типів на основі НС та С за методиками, розробленими на кафедрі технології біологічно активи сполук фармації та біотехнології НУ “Львівська політехніка”.
Дослідження кінетики полі- та співполімеризиції проводили латометричним методом. Склад бінарних та трикомпонентних співполімерів значали елементним аналізом за вмістом сірки та азоту. 14 спектроскопічні слідження проводили на “Бресог(і-80М”. Кінетику зшивання вивчали за зноважним ступенем набухання (Ррсн), визначення якого проводили ваговим тодом при температурі 20°С, після витримки взірців полімеру протягом 48 ц в диметилформаміді (ДМФА). Характеристичну в’язкість синтезованих івполімерів визначали за допомогою віскозиметра Убелоде в бензолі при мпературі 25°С. Диференційно-термічні та термогравіметричні дослідження астивостей модифікованих співполімерів проводили з використанням иладу “БегіуаІо^арЬ (2-1500”. У роботі також використовувались ектрофотометричні та потенціометричні методи дослідження.
Наведені методики визначення основних властивостей розчинних :рментів та синтезованих ФПК, глибини гідролізу рослинних олій розчинним
іммобілізованим ліполактином, а також модифікації полімерних носіїв ірментними та лікарськими препаратами.
У кінці розділу приведені описи методик визначення ферментативних тивностей (протеолітичної і ліполітичної) та масової долі білка за Лоурі.
У третьому розділі наведені результати досліджень з питань тановлення кінетичних закономірностей синтезу біологічно активних лімерних носіїв для іммобілізації ферментів та вивчення їх властивостей, інтез біологічно активних полімерних носіїв проводили співполімеризацією нтезованих СМ (табл.1) з вінільними мономерами. Сульфамідні мономери .ержували взаємодією НС та СЦ з ацилюючими агентами різної природи та тивності МАХ та МА. Синтезовані СМ малеїнатного (СМ-І, СМ-ІУ) та рилатного (СМ-ІІ, СМ-ІІІ) типів є біфункціональними сполуками, тобто ни мають у своїй структурі одночасно подвійні зв’язки, за рахунок яких ни можуть вступати в реакції полі- та співполімеризації, та сульфамідні упи, що надають таким сполукам біологічної активності. Вивчення ілімеризації СМ-І та СМ-ІІ показало, що радикальна гомополімеризація \Л-І, на відміну від СМ-ІІ, не протікає, очевидно, за рахунок впливу еричного фактора, що є характерним для 1,2-заміщених малеїнатів.
В подальшому була вивчена кінетика бінарної співполімеризації щельної системи С-СМ-ІІ. Процес проводили в ДМФА при 70°С в іисутності ДАК (0,5 мас.%) в атмосфері аргону. Конверсію системи (8,%) ізначали дилатометричним методом. Показано, що швидкість івполімеризації дещо зростає із збільшенням концентрації СМ-ІІ, досягаючи іксимуму при 5%-ному вмісті СМ-ІІ. При вищих концентраціях остерігається деяке зменшення швидкості реакції. Неоднозначний вплив інцентрації (СМ-ІІ) на швидкість процесу, ймовірно пов’язаний із )жливістю участі тіазольного циклу мономера в реакціях передачі ланцюга, видкість співполімеризації бінарних систем С-СМ суттєво залежить від
природи подвійних зв’язків і природи сульфамідних фрагментів в моном (рис.1). Так, мономери акрилатного типу співполімеризуються значне більшою швидкістю, ніж малеїнатного типу. Це пов’язано з різною активніс спряженої системи кратних зв’язків.
Концентрація та характер розподілу сульфамідних груп в співполіме] буде визначати в певній мірі їх біологічну активність. Така інформація мс бути одержана тільки при наявності констант співполімеризації СМ вінільними мономерами. Тому була досліджена кінетика співполімеризації ( з вінільними мономерами і визначені константи співполімеризації та скл: бінарних систем (рис.2, табл.2). Показано, що відносна активність СМ співполімеризації суттєво залежить від природи співмономерів. Так в о( бінарних системах С-СМ-ІІ (1) та С-СМ-ІІІ (2), Г|<1 і г2<1. Виходячі добутку констант співполімеризації (гі»г2<1) цих систем, можна припусти що розподіл сульфамідних груп в них буде досить регулярним. При цьо відносна активність мономерів (М2) до співполімеризації із стиролом пада ряду ММА > СМ-ІІІ > СМ-ІІ.
Досліджено біологічну активність синтезованих сульфаміді співполімерів (С-СМ-ІІ) з різною кількістю біологічно активі функціональних груп і показано, що незалежно від того, де знаходит сульфамідний фрагмент: в лікарському препараті, в біологічно активне мономері чи в співполімері його антимікробна дія зберігається.
З метою синтезу біологічно активних полімерних носіїв із сульфаміднії групами та високореакційноздатними ангідридними групами, вивче
12
X, ГОД.
М, МОЛ.%
Рис.1 Залежність конверсії процесу співполімеризації бінарних систем від часу: 1 - стирол, 2 - С-СМ-ІІ, 3 - С-СМ-ІІІ, 4 - МА-СМ-ІУ, 5 - МА-СМ-І.
Рис.2 Залежність складу співполі
меру від складу вихідне суміші для бінарної системі 1 - С-СМ-ІІ, 2 - С-СМ-ІІІ.
Таблиця 1
Характеристика синтезованих сульфамідних мономерів
Шифр моно- мера Чпї Формула СМ, де X =_і| " Я Вихід, % Тш, °С Елементний аналіз, % 14-спектри, см'1
знайдено розраховано С=0 С=0 с=с
С Н 8 N2 С Н 8 N2 -МН- -ОН
СМ-І Н00С-НС=СН-С(0)Ш-С6Н4-502-МНХ 75 210- 212 48,19 4,32 17,96 - 48,28 4,05 18,10 - 1660 1730 1640
СМ-ІІ СН2=С(СНз)-С(0)-ЫН-С6Н4-802-ННХ 60 220 48,21 4,45 19,92 - 48,29 4,02 19,84 - 1670 - 1640
СМ-ІІІ СН2=С(СНз)-С(0)-і'Щ-С6Н4-802-і'Щ2 65 - 49,87 5,11 13,16 11,58 49,99 5,03 13,35 11,67 1670 - 1640
СМ-ІУ Н00С-НС=СНС(0)МН-С6Н4-502-МН2 70 - 44,31 3,64 11,69 10,28 44,44 3,73 11,86 10,37 1660 1730 1640
Таблиця 2
Константи співполімеризації сульфамідних мономерів із стиролом і малеїновим ангідридом (Т=70°С)
Мономери Константи співполімеризації Гі • г2 Азеотропна суміш
М, М2 Гі Ґ2 [Мі], мол.% [М2], мол.% [М,]/[М2]
стирол СМ-ІІ 0,71 ±0,03 0,23 ±0,03 0,163 72,65 27,35 2,65
стирол СМ-ІІІ 0,60 ± 0,02 0,31 ±0,02 0,186 63,30 36,70 1,72
МА СМ-ІІ 0,00 0,72 ±0,01 0,0 - - -
МА СМ-ІІІ 0,00 1,13 ±0,01 0,0 - - -
співполімеризація бінарної системи МА-СМ. Як видно із визначених конста співполімеризації для обох бінарних систем МА-СМ-ІІ та МА-СМ-(табл.2), константа Гі—>0, тобто будуть утворюватися співполімери, в як ланки мономерів МА та СМ-ІІ, СМ-ІИ чергуються у співвідношенні 50:50.
Для одержання терполімерів з сульфамідними та ангідридними групаь було вивчено співполімеризацію системи: стирол - малеїновий ангідрид сульфамідний мономер. Процес проводили в умовах, аналогічних для бінарн систем С-СМ та МА-СМ. Показано, що в трикомпонентній систе С-СМ-МА спостерігаються ті самі кінетичні закономірності, що і в бінарн системах МА-СМ-ІІ і МА-СМ-ІІІ. Встановлено, що експерименталь знайдені і розраховані за константами співполімеризації склади терполіме{ (табл.З), є досить близькими за значеннями, що дає можливіс використовувати ці дані для оптимізації процесу синтезу поліфункціональн біологічно активних полімерних носіїв із реакційноздатними ангідриднш групами. За методом Хема розраховані добутки ймовірностей і добут констант співполімеризації трикомпонентних систем (табл.4), і одержг результати свідчать про задовільне експериментальне визначення конста співполімеризації для СМ. При цьому, синтез таких терполімерів мож проводити при низьких концентраціях МА.
Таблиця З
Склад сульфамідних терполімерів
Мономери Вміст мономерів у вихідній суміші, мол.% Вміст сірки у тер-полімері, % Склад терполімерів, мол.%
розрахований при початковій конверсії знайдений при конверсії (8=60%)
С 45,0 50,35 51,59
СМ-ІІІ 10,0 0,175 0,98 1,31
МА 45,0 48,67 47,10
С 40,0 50,12 51,22
СМ-ІІІ 20,0 0,344 2,33 2,58
МА 40,0 47,55 46,20
С 30,0 49,0 50,14
СМ-ІІІ 40,0 0,953 6,80 7,15
МА 30,0 44,20 42,71
С 10,0 34,09 34,65
СМ-ІІІ 80,0 6,027 44,13 45,22
МА 10,0 21,78 20,13
С 20,0 48,34 48,82
СМ-ІІІ 10,0 0,177 0,98 1,33
МА 70,0 50,68 49,85
Таблиця 4
Константи співполімеризації та добуток імовірностей для трикомпонентної системи
Мономери Константи співполімеризації Добуток імовірностей Добуток констант співполімеризації
Лі м2 М3 г12 Г21 ГіЗ гзі г2з г32 Рі2«Р2з*Рзі = -РіЗ’Рз2*Р2) Г13*Г21*Г32 = Гі2.Г2з«Гзі
-ч СМ-ІІ МА 0,71 0,23 0,043 0,018 0,72 0,0 0,0113 0,0099 ~ 0,0092
: СМ-ІІІ МА 0,60 0,31 0,043 0,018 1,13 0,0 0,0111 0,01333 = 0,0122
Структуру синтезованих трикомпонентних полімерних носіїв на основі іних елементного аналізу, 14 спектроскопії можна подати схемою:
-{СН2-СЩт і СН2-С(СН3)3-П{- СН -СЩк,
с=о \ ^
ООО
де Х=Н або
І
'бН4- Б02- МНХ
Таким чином, вперше синтезовані бінарні та трикомпонентні полімерні льфамідні носії для іммобілізації ферментів.
У четвертому розділі досліджено хімічну модифікацію синтезованих ологічно активних полімерних носіїв та промислового співполімеру -иромаля ферментними та сульфамідними препаратами реакціями шімераналогічних перетворень з утворенням ковалентного зв’язку.
Терполімер (С — СМ-ІІІ - МА) на основі стрептоциду, одержаний при ііввідношенні мономерів С:СМ-ІІІ:МА = 45:10:45, у складі якого було іайдено 47,1 мол.% фрагментів МА (табл.З), був вибраний як полімерна при ця для іммобілізації протеази “С” з метою створення лікарських >епаратів комбінованої дії. Необхідно відмітити, що склад вибраного рполімеру є близьким до складу азеотропної суміші. Процес взаємодії рполімеру з Пр“С” проводили при різній концентрації ферменту і )стійному перемішуванні реакційної маси протягом двох годин у розчині МФА при 25 °С. Ступінь модифікації ферменту терполімером оцінювали за ііною кислотного числа методом потенціометричного титрування. В ■лультаті було синтезовано біологічно активні полімери з фрагментами ютеази “С” та СМ-ІІ, структура яких підтверджена 14 спектроскопією.
З метою подальшого вивчення співіммобілізованих систем: полімерний >сій - протеолітичний фермент - антимікробний препарат, були проведені >слідження по співіммобілізації Пр“С” і норсульфазолу на стиромалі. Для .ого, була вивчена хімічна модифікація стиромалем норсульфазолу в розчині МФА при температурі 50°С та синтезовано реакціями полімераналогічних
перетворень біологічно активний полімерний носій з фрагмента? антимікробної речовини.
Для визначення змін, які пов’язані з введенням сульфамідних біоцидн: фрагментів в СМА, були вивчені гідрофільні та термічні властиво( модифікованих стиромалем сульфамідних препаратів. Вивчення терм стабільності модифікованого стиромалем норсульфазолу за допомогою Д1 показало, що введення сульфамідного фрагменту в макромолекулу стирома не знижує його термічної стабільності, не змінює температурного режиму йо використання та обумовлені цими характеристиками експлуатацій властивості.
Дослідження біологічної активності полімерних плівок на оснс модифікованого стиромалем норсульфазолу, показали, що одержані полімер покриття мають антимікробну дію. Показано, що діаметр зон пригнічен росту мікроорганізмів на дослідних тест-культурах залежить від їх природи.
Виходячи з одержаних результатів, була розроблена технологія одержан на основі синтезованих біологічно активних полімерів, високоадгезійних еластичних плівкових покрить, які можуть бути використані як полімер лікарські препарати, а також як антисептики в клінічній практиці.
Наступним етапом роботи було вивчення процесу іммобілізаі протеолітичного ферменту протеази “С” на стиромалі. Реакцію ацилюван можна подати рівнянням:
ІСН-СН^СН -СН-^Н5 0=^
О '
+ Т^Н-фермент .
-<рн-сн2-сн-<рн-САН, о=с С=0 6 ' -
(
нсЬ НІ^-ферменг
Знайдено оптимальні умови перебігу процесу іммобілізації, які дозволи розробити метод співіммобілізації системи: СМА - НС - Пр“С”. Проц синтезу співіммобілізованого біологічно активного полімеру на основі таї трикомпонентної системи можна представити схемою 2:
-СН-СН2-СН-СН-СбН5 0=6 6=0
- хох -
-СН-СНг-СН-СНЯ -СбН5 0=0^ ^Ь=0 (п-к) ь О
-<^Н-СН2-^Н-^Н-
СбН5 о=
но №
+ ЫН2-фермент (Пр“С”)
С^-БОі^НХ
н^н-сн2-<^н-сн-с6н5 о=с с=о - Н0 Щл
де Х=Н або
ч-
бб^-БОг-ШХ
-СН -сн2-сн
СбН5 0=1 НО
фермент
(Пр“С”)
Показано, що послідовність ацилювання стиромалем ферменту норсульфазолу впливає на кінцевий результат. Так, активність одержан ФПК суттєво залежить від порядку введення складових компонентів
п
^акційну суміш. Отимальним виявилася така послідовність введення цих змпонентів у макромолекулу носія: спочатку проводиться модифікація гиромалем норсульфазолу при 50°С, а потім при зменшенні температури до 5°С по залишкових ангідридних групах носія проводиться прищеплення ротеази “С”. Хімізм перебігу процесу підтверджено даними по загальному місту карбоксильних та ангідридних груп у модифікованих ФПК. интезовані такі співіммобілізовані полімери, являють собою лікарські репарати нового типу, оскільки вони мають комбіновану біологічну дію, яка иіадається з терапевтичного ефекту ферменту та антисептичного характеру ітимікробної речовини (норсульфазолу або стрептоциду). Так, при лкористанні синтезованих біополімерів для лікування різних запальних роцесів, фрагменти протеази “С” будуть, очевидно, прискорювати лізис гкротичних субстратів опікових ран, а фрагменти норсульфазолу, в свою ;ргу, будуть проявляти антибактеріальну дію - тобто прискорювати процес ігоювання ран.
З іншого боку, з метою створення ефективних каталізаторів біохімічних та імічних процесів, була вивчена іммобілізація ліполітичного ферментного репарату “ліполактину” на промисловому полімерному носії - стиромалі. Для ього, дослідна партія ферментного препарату ліполактину була одержана в апівпромислових умовах ДП “Ензим” (м.Ладижин Вінницької області). Перш іж провести дослідження по іммобілізації ліполактину на полімерному носії, іочатку було вивчено властивості розчинного ферментного препарату, а імє: оптимальні умови дії, стабільність при зміні кислотності середовища та їмператури.
Ковалентна іммобілізація ліполак-іну на стиромалі відбувалася за рахунок гакції ацилювання аміногруп ферменту ігідридними групами СМА (схема 1). роцес проводили в розчині ДМФА при 5°С та постійному перемішуванні. В гзультаті знайдено оптимальне ііввідношення розчинного ЛП і СМА, гобхідне для процесу іммобілізації та тгимальний час перебігу реакції (рис.З). ри цьому, вміст білка в ФПК поступово )ільшується і процес іммобілізації, мовірно, протікає через стадію творення комплексів з переносом заряду СПЗ) з виникненням сорбційно-звалентного типу зв’язку між ігідридними групами СМА і аміно-)упами ферменту. По мірі перебігу
Т,П£»
Рис.З Залежність кількості білка (Б) в ФПК та активності іммобілізованого ліполактину (ЛА, мл 0,05 н №ОН) від часу реакції при ЛП/СМА: (0.5/1, г/г).
реакції ацилювання КПЗ руйнується і поступово зростає кількість ковалентні зв’язків між полімерною матрицею і ферментом з утворенням ФПК (схема 1 що підтверджено 14 спектрами.
Вивчено властивості ФПК, одержані при оптимальних умовах процес іммобілізації, порівняно з розчинно ліпазою. Показано, що іммобілізовані ліполактин проявляє максимальї активність при рН=7,5-7,7, як і розчині ліпаза. Температурний оптимум і іммобілізованого ліполактину розширеним та зміщеним на 4-5 °С сторону вищих температур (42°-45°( порівняно з нативним ліполактинс (рис.4). Іммобілізована ліпаза втрач; активність повільніше, ніж розчинна, тобто іммобілізація призвела і одержання більш стабільних ФПК.
Синтезовані ФПК також були вивчені як каталізатори процесу гідролі: рослинних олій порівняно з нативним ліполактином. Вибрані оптималь умови проведення процесу гідролізу для нативної та іммобілізованої ліп
(вміст ферменту відносно маси жиру (1н-5%), співвідношення жирої
фаза:вода (1:2 за масою), рН - 7,5, температура 34-35°С, тривалість процесу 14 год, швидкість перемішування 600 об/хв. Показано, що синтезовані ФПК каталізаторами процесу гідролізу рослинних олій, хоча їх активність деп менша порівняно з нативною ліпазою. Цей недолік може бути компенсовані багаторазовим використанням іммобілізованих ліполітичних ферментів безперервному процесі, забезпечуючи практично повний гідроліз жирів.
Для поліпшення експлуатаційних властивостей одержаних ФПК, ; каталізаторів, досліджено процес одночасного структурування та іммобілізаі системи: стиромаль - ліполактин - .м-фенілендіамін. Ступінь структурувані ФПК вивчали методом рівноважного набухання. Розрахунок параметр просторової сітки проводили за рівнянням Флорі-Ренера. З досліджеі кінетики процесу структурування видно, що ступінь зшивання (1/Орсн) суттєі залежить від концентрації м-ФДА і зростає із її збільшенням (рис.5). Кр цього, концентрація активних ланцюгів досягає максимального значення 90-120 хв. Вивчення впливу концентрації ліполактину на процес зшивані макромолекул СМА показало також, що ступінь структурування системи і залежить від Слп і визначається виключно См.ФДа (рис.5). Тобто, в даній систе перебігають одночасно дві конкуруючі реакції ацилювання з ковалентні прищепленням ферменту до полімерної матриці і утворенням поперечні
т,°с
Рис.4 Залежність активності нативного (1) та іммобілізованого (2) ліполактину (ЛА, мл 0,05 н ЫаОН) від температури.
Гязків між макромолекулами стиромаля результаті зшивання їх структуруючим ентом - л<-ФДА, який є більш активним /бстратом відносно ангідридних груп МА, ніж ЛП. Вже на початку реакції рактично весь білок пов’язується з злімерною матрицею за рахунок творення КПЗ із виникненням зв’язку зрбційно-ковалентного типу, як у шадку з неструктурованою системою.
Параметри просторової сітки гиромаля, модифікованого ЛП та л<-ФДА <азують на те, що експериментально іайдені значення Мс для даної системи спадають 800-850 (С„.Фда=10%) (табл.5).
і значення є досить близькими до врахованих значень Мс за структурою росторової сітки (Мс=609-812).
Таблиця 5
Параметри просторової сітки стиромаля, модифікованого ліполактином (Слп =10%) тал<-фенілендіаміном
Вміст -ФДА, % Час структурування, т, хв Ступінь зшивання, 1/QpcH Об’ємна доля полімеру в набухлому гелі, Vr Концентрація активних ланцюгів в одиниці об’єму, \М0‘4 моль/см‘ Концентрація поперечних зв’язків, Nc.1019cm‘3 Молекулярна маса ланцюга між сусідніми зшивками, Мс
10,0 24 0,269 0,228 2,14 8,34 3785
10,0 40 0,419 0,295 5,04 15,90 1985
10,0 60 0,593 0,372 8,97 28,35 1115
10,0 70 0,693 0,409 11,72 37,20 850
10,0 125 0,726 0,419 12,64 39,30 793
5,0 30 0,151 0,131 0,76 2,40 13150
5,0 60 0,261 0,207 2,07 6,57 4850
5,0 125 0,276 0,216 2,19 6,93 4562
5,0 225 0,324 0,244 3,12 9,86 3206
5,0 300 0,354 0,261 3,75 11,82 2676
2,5 60 0,222 0,181 1,65 5,22 6060
2,5 120 0,260 0,206 2,06 6,51 4854
2,5 210 0,296 0,230 2,63 8,32 3802
2,5 375 0,316 0,240 2,92 9,23 3425
Тому, з деяким ступенем наближення можна стверджувати, що з кожними зома ангідридними групами стиромаля (при См.фдА=Т0%), проходить один акт рищеплення ферменту до макромолекули СМА та один акт зшивки
Т,хв
Рис.5 Залежність ступеня зшивання ФПК від часу структурування при С„.фда, %: 1 - 2,5; 2 - 5,0; З - 10,0; Слп = 10%, Т=20°С.
полімерних ланцюгів л<-ФДА. Одержані дані та аналіз 14 спектрів, дозволяїс тривимірну структуру ФПК представити схемою:
-[-СН-СН2-СН-СН-] - [- £Н - СН2 - СН - СН-]-
СбН5 ноос с=о с6н5 ноос 9=0
РШ-фермент НИ
фермент-І)Ш МН
С6Н5 0=С СООН СбН5 НООС С=0
-[-СН - СН2 - СН - СН -] - [- СН - СН2 - СН - СН-]-
Таким чином, вперше синтезовано просторово зшиті ФПК, що містяті полімерній матриці прищеплені фрагменти ліполактину. Вони були вивчені каталізатори процесу гідролізу рослинних олій порівняно неструктурованими ФПК і встановлено, що структуровані ФПК мак поліпшену механічну міцність, стабільність та активність, яка достатня для практичного застосування як каталізаторів процесів гідролізу відхо, олієжирової промисловості.
ВИСНОВКИ
1. Вивчено співполімеризацію синтезованих біологічно активи
сульфамідних мономерів з вінільними мономерами в бінарних трикомпонентних системах. Вперше визначені константи співполімериза СМ От та г2) із стиролом і малеїновим ангідридом та склади бінарн
співполімерів і терполімерів. На основі таких бінарних та трикомпонентн
систем вперше синтезовано полімерні носії, що мають у своїй структ; біологічно активні сульфамідні групи та високореакційноздатні ангідрщ групи, за рахунок яких відбувається ковалентна іммобілізація ферментів.
2. Встановлено основні закономірності процесу іммобілізації протеолітичі го ферменту протеази “С” на синтезованому терполімері (С - СМ-ІІІ - М/ вперше одержано співіммобілізовані полімери, що містять в бокон ланцюгах макромолекул полімерного носія ковалентно прищепл сульфамідні та ферментні групи різної біологічної дії.
3. Досліджено хімічну модифікацію серійним стиромалем норсульфазол синтезовано реакцією полімераналогічних перетворень біологічно активі полімерний носій з фрагментами антимікробної речовини. Вивчено так іммобілізацію протеолітичного ферменту протеази “С” на стиромалі. основі одержаних даних вперше розроблений метод сумісної іммобіліз; протеази “С” та норсульфазолу на стиромалі. Синтезовані такі пс функціональні біологічно активні полімерні системи також можуть бути користані як лікарські препарати комбінованої дії.
. Вперше проведено систематичні дослідження процесу ковалентної іммобілізації ферментного препарату ліпази ліполактину на співполімері стиролу з малеїновим ангідридом і синтезовано ФПК, які містять в бічних ланцюгах макромолекул носія хімічно пов’язані ферментні фрагменти. Вивчено властивості ФПК порівняно з нативним ліполактином і показано, що вони є більш стабільними, а температурний оптимум дії ФПК є розширеним та зміщеним в область більш високих температур. Встановлено, що синтезовані ФПК є каталізаторами процесу гідролізу рослинних олій, але їх активність дещо зменшується порівняно з нативним ліполактином.
. Досліджено процес одночасного структурування та іммобілізації трикомпонентної системи: стиромаль - ліполактин - ж-фенілендіамін. Показано, що в даній системі перебігають одночасно дві конкуруючі реакції аци-лювання з ковалентним прищепленням ферменту до полімерної матриці й утворенням поперечних зв’язків між макромолекулами стиромаля в результаті зшивання їх структуруючим агентом — jw-ФДА. Вивчено кінетику зшивання та структуру тривимірної просторової сітки, і показано, що процес структурування залежить виключно від концентрації jw-фенілендіаміну і не залежить від концентрації ліполактину.
. Встановлено, що структуровані ФПК, порівняно з неструктурованими, мають поліпшену механічну міцність, пролонговану дію, стабільність та активність і можуть бути використані в процесах тотального гідролізу рослинних олій з метою одержання жирних кислот та гліцерину за безвідходною технологією.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ ВИКЛАДЕНО У РОБОТАХ:
. Чуйко Л.С., Ткачук В.О., Алексеенко С.І., Краюткіна О.М., Карплюк Ю.Я. Розробка методів одержання біологічно-активних полімерів з
сульфамідними та “ліполактинними” групами // Вісник ДУ“ЛП”. - 1997. -№ 332. - С.204-207.
. Чуйко Л.С., Краюткіна О.М., Мартинюк Н.Б. Ковалентна іммобілізація ферментного препарату ліполактину на співполімері стиролу з малеїновим ангідридом // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. В.Гнатюка. Серія: Хімія. - 1998. - № 2. - Вип.6. - С.63-68.
. Чуйко Л.С., Краюткіна О.М., Болаховська В.А., Мартинюк Н.Б. Іммобілізація ферментного препарату ліпази “ліполактину” на полімерному носії // Вісник ДУ“ЛП”. - 1998. - № 339. - С.95-97.
. Краюткіна О.М., Чуйко Л.С. Вивчення процесу одночасного
структурування та іммобілізації системи фермент-полімерний носій // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. В.Гнатюка. Серія: Хімія. - 2000. - Вип.4. - С.35-39.
5. Чуйко Л.С., Карплюк Ю.Я., Ткачук В.О., Алексеенко С.І., Краюткіна 0.> Синтез та дослідження полімерів з біологічно активними функціональнм групами II Укр. хім. журнал. - 2000. - Т.66 - №4. - С. 121-125.
6. Краюткіна О.М., Чуйко Л.С., Болаховська В.А. Дослідження процеї іммобілізації ферментного препарату ліпази ліполактину на полімерні носіях // Тези доп. шостої наук. конф. “Львівські хімічні читання”. - Льві
- 1997.-С.151.
7. Чуйко Л.С., Краюткіна О.М., Ткачук В.О., Алексеенко С.І. Синтез 1 дослідження біологічно-активних полімерів поліфункціональної дії // Те: доп. другої н-т конф. “Поступ в нафтогазопереробній та нафтохімічн промисловості”. - Львів. - 1999. - С.151.
8. Чуйко Л.С., Краюткіна О.М. Вивчення ковалентної іммобілізаі ферментного препарату ліпази “ліполактину” на полімерному носії // Те: доп. першої міжнар. конф. видавництва “Наука і освіта-98”. - Том! (Хімія). - Дніпропетровськ. - 1998. - С.19.
АНОТАЦІЯ
Краюткіна О.М. Іммобілізація ліполітичних і протеолітичних фермент та сульфамідних лікарських препаратів на полімерних носіях. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук спеціальністю 02.00.06 - хімія високомолекулярних сполук. Національні університет “Львівська політехніка”, Львів, 2000.
Дисертація присвячена вивченню ковалентної іммобілізації ліполітичнш протеолітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів і синтезованих біологічно активних полімерних носіях та стиромалі. Вивче] співполімеризацію синтезованих біологічно активних сульфамідних мономер з вінільними мономерами в бінарних та трикомпонентних системах, а такс визначені константи їх співполімеризації та склади бінарних співполімерів терполімерів. На основі таких систем створені полімерні носії з біологічі активними сульфамідними групами для іммобілізації ферментів. З мете створення лікарських препаратів поліфункціональної дії розроблені мето; співіммобілізації протеази “С” з антимікробними речовинами (норсул фазолом та стрептоцидом) на синтезованих біологічно активних полімерні носіях та стиромалі. Вивчено основні закономірності процесу іммобілізації визначені оптимальні умови його проведення.
Синтезовано фермент-полімерні комплекси на основі ліполактш ковалентно іммобілізованого із стиромалем, вивчено їх властивості порівняі з нативною ліпазою. Вивчено кінетику утворення тривимірної просторої сітки при одночасному структуруванні та іммобілізації системи: стиромаль ліполактин - лі-фепілендіамін. Встановлено можливість використан фермент-полімерних комплексів на основі ліполактину як каталізатор тотального гідролізу відходів олієжирової промисловості, а одержан:
івіммобілізованих систем як полімерних лікарських препаратів комбінованої і.
Ключові слова: співполімеризація, сульфамідні мономери, ковалентна мобілізація, співполімер, терполімер, фермент-полімерний комплекс, алогічна активність.
АННОТАЦИЯ
Краюткина Е.Н. Иммобилизация липолитических и протеолитических :рментов и сульфамидных лекарственных препаратов на полимерных їсителях. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по ециальности 02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений,
щиональный университет “Львивська политехника”, Львов, 2000.
Диссертация посвящена изучению ковалентной иммобилизации политических и протеолитических ферментов, и сульфамидных карственных препаратов на синтезированных биологически активных лимерных носителях и стиромале. Изучена сополимеризация нтезированных биологически активных сульфамидных мономеров с нильными мономерами в бинарных и трехкомпонентных системах, а также ределены константы их сополимеризации и составы бинарных сополимеров терполимеров. На основе таких систем созданы полимерные носители с ологически активными сульфамидными группами для иммобилизации :рментов.
Установлены основные закономерности процесса иммобилизации отеолитического фермента протеазы “С” на синтезированном терполимере основе стрептоцида. Впервые получены соиммобилизированные полимеры, ковые цепи которых содержат ковалентно связанные сульфамидные и :рментные группы различного биологического действия.
Исследована химическая модификация серийным стиромалем рсульфазола и синтезирован реакцией полимераналогичных превращений ологически активный полимерный носитель с фрагментами антимикробного щества. Изучена также иммобилизация протеолитического фермента отеазы “С” на стиромале. С целью создания лекарственных препаратов лифункционального действия разработан метод соиммобилизации протеазы
и норсульфазола на стиромале. Установлены основные закономерности іоцесса соиммобилизации и определены оптимальные условия его
'ОВЄДЄНИЯ.
Синтезированы фермент-полимерные комплексы (ФІЖ) на основе полактина, ковалентно иммобилизованного со стиромалем, а также ределены их свойства по сравнению с нативной липазой, а именно: тимальные условия действия, стабильность при изменении кислотности еды и температуры.
Изучена кинетика образования трехмерной пространственной сетки п] одновременном структурировании и иммобилизации системы: стиромаль липолактин - .м-фенилендиамин. Установлено, что структурированные ФП по сравнению с неструктурированными, обладают повышенной механичесю прочностью, пролонгированным действием, стабильностью и активностью.
Найдена возможность использования ФПК на основе липолактина качестве катализаторов процесса тотального гидролиза жиров, а полученш соиммобилизированных систем как полимерных лекарственных препарат комбинированного действия.
Ключевые слова: сополимеризация, сульфамидные мономер
ковалентная иммобилизация, сополимер, терполимер, фермент-полимерш комплексы, биологическая активность.
SUMMARY
О.М. Krayutkina. Immobilization of lipolytic and proteolytic enzymes a sulfumide drugs on polymeric carriers. - Manuscript.
Thesis for a scientific degree of Chemical Sciences in speciality 02.00.06 chemistry of high-molecular substances. Lviv Polytechnic National Universi Lviv, 2000.
The dissertation deals with the analysis of the covalent immobilization lipolytic and proteolytic enzymes, and sulfumide drugs on the synthesiz biologically active polymeric carriers and stiromal. The copolymerization synthesized biologically active monomers, based on sulfumides, with vii monomers in binary and three-component systems was studied, and also t constants of their copolymerization and compositions of binary copolymers a terpolymers were determined. On the basis of such systems the polymeric carrii with biologically active sulfumide groups for the immobilization of enzymes we created. With the purpose of creation of polyfunctional drugs the methods copolymerization of a protease “C” with antimicrobial substances (norsulfazoli and streptocidum) on the synthesized biologically active polymeric carriers a stiromal were worked out. The basic regularities of the process of an immobilizati were investigated and the optimal conditions of its conducting were defined. T enzyme-polymer complexes (EPC) including in macromolecules of stiromal I covalent linkage lipolactyn fragments have been produced, their properties wt determined in comparison with dissoluble lipase. The kinetics of formation of three-dimensional grid was studied with simultaneous structuring a immobilization of a system: stiromal - lipolactyn - w-phenylendiamine. T possibility of using of EPC on the lipolactyn basis was proved to be catalysts i total hydrolysis wastes of butter-fat industry, while obtained copolymerized syste: to be polymeric drugs of the combined activity.
Keywords: copolymerization, sulfumide monomers, covalent immobilizati* copolymer, terpolymers, enzyme-polymer complexes, biological activity.