Интерференционные методы измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов

Минаев, Владимир Леонидович

Интерференционные методы измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

Минаев, Владимир Леонидович АВТОР

кандидата технических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2006 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.05 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Интерференционные методы измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов»

Автореферат диссертации на тему "Интерференционные методы измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов"

На правах рукописи

ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ ИНТЕГРАЛЬНЫХ И ЛОКАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ФАЗОВЫХ МИКРООБЪЕКТОВ

01.04.05-оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии «Всероссийский научно - исследовательский институт оптико-физических измерений» (ФГУП «ВНИИОФИ»)

Научный руководитель: доктор технических наук,

Г.Н. ВИШНЯКОВ

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Н.Г. ВЛАСОВ

кандидат физико-математических наук, В.В. АЛПАТОВ

Ведущая организация: НИИ Биомедицинской Техники

МГТУ им. Н.Э. Баумана

Защита состоится « / » ^л-р/па, 2006г. в 15-00 на заседании диссертационного совета Д308.006.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте оптико-физических измерений по адресу: 119361, г. Москва, ул. Озерная, 46

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ВНИИОФИ»

Автореферат разослан « /У» ¿7/_2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук С.И. Аневский

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ, ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы определяется недостаточностью разработки количественных методов исследования фазовых микрообъектов и измерения их интегральных и локальных параметров.

Фазовые микрообъекты, прозрачные для излучения видимого оптического диапазона, широко исследуются в науке, технике, промышленности, а также в биологии и медицине. К ним относятся различные полимерные пленки, кристаллы, микролинзовые растры, оптические волокна, и биологические микрообъекты - ткани, живые клетки и др. Такие объекты описываются трехмерным (ЗБ) пространственным распределением показателя преломления, с которым связаны другие физические параметры объекта, такие как, плотность, температура, концентрация.

При изучении фазовых объектов в первую очередь встает задача их визуализации, т.е. перевода фазового «изображения» в амплитудное. На сегодняшний день широко известны следующие методы: фазовый контраст (метод Цернике), дифференциально-интерференционный контраст (Е)1С, метод Номарского), метод темного поля, поляризационный контраст и пр. С помощью этих методов можно лишь наблюдать и оценивать различные геометрические параметры (площадь, периметр), но нельзя проводить измерения локальных и интегральных характеристик.

При исследовании фазового объекта исходным измеряемым параметром является оптическая разность хода (ОРХ). Это интегральная характеристика, так как ОРХ представляет собой интеграл от функции распределения показателя преломления вдоль луча или одномерную (Ш) луч-сумму. Двумерное (20) распределение ОРХ, полученное вдоль набора параллельных лучей является параллельной 20 проекцией, а вдоль набора лучей, пересекающихся в одной точке - конической 20 проекцией. Будем далее называть 20 распределение ОРХ фазовым изображением. По набору значений-ОРХ, измеренных при различных

РОС. НАЦИОНАЛЬНА) (

углах зондирования, можно реконс руир6*№ЯИ0Т?ВА пррстранственное

08 МК шяп

распределение показателя преломления п(х,у,г) - это локальный по пространству параметр. Зная ОРХ и ЗО распределение п(х,у,г) можно вычислить различные производные характеристики от этих величин, например, плотность, концентрацию, массу сухого вещества биологических клеток и др.

Количественные измерения интегральных характеристик фазовых микрообъектов можно проводить только с помощью интерференционных микроскопов. Только они позволяют измерять ОРХ с высокой точностью. Другие способы позволяют лишь визуализировать или качественно оценивать ОРХ, либо измерять производную по направлению от ОРХ (Б1С-контраст). Однако, широкому распространению интерференционных микроскопов препятствовало отсутствие автоматизированных методов расшифровки интерферограмм, что тормозило внедрение данных микроскопов в практику лабораторных исследований и рутинных измерений. Лишь в последнее время появились некоторые модели автоматизированных микроскопов.

Так, например, известен интерференционный микроскоп «Эйрискан», созданный под руководством профессора В.П. Тычинского. Его применение ограничено из-за большого времени сканирования. В этом микроскопе используются компенсационный метод реконструкции фазы и диссектор в качестве фотоприемного устройства, поэтому время съема данных прямо пропорционально зависит от числа отсчетов, в которых производятся измерения. Так за время одного телевизионного кадра (40 мс) удается зарегистрировать изображение только в 40 отсчетах. Интерференционный микроскоп Хорна (ОММАРЭ) также автоматизирован, но он сложен в эксплуатации, т.к. требует наличия двух идентичных оптических каналов, в которых находятся одинаково приготовленные препарат сравнения и исследуемый объект.

Для измерения локальных характеристик внутренних неоднородностей микрообъектов разработаны методы конфокальной микроскопии, оптической когерентной микроскопии, а также методы оптической проекционной томографии. Первый метод пригоден только для самосветящихся (флуоресцентных) объектов. Второй - для визуализации градиентов показателя

преломления сильно рассеивающих фазовых объектов. Оба метода используют аппаратные средства получения изображений внутренних сечений, и непригодны для измерения локального параметра п(х,у,г). Так как в микроинтерферометрии фазовых объектов измеряемым является интегральный параметр - ОРХ, то для реконструкции п(х,у,г) необходимо использовать принципы проекционной томографии.

Основная проблема оптической микротомографии - создание системы углового зондирования объекта, встроенной в микроскоп. Существующие методы микротомографии имеют недостатки, связанные с малым диапазоном углов зондирования и ограниченным выбором траекторий сбора проекций. Угол обзора обычно не превышает ±45° градусов. Возможны схемы с вращением объекта, помещенного в капилляр, в поле зрения микроскопа. В этом случае можно обеспечить угол обзора в ±90®. Однако, данный способ сложен в подготовке препарата с клеткой. Таким образом, исходя из вышеизложенного можно сформулировать цель диссертационной работы.

Цель и основные задачи диссертации

Разработка и исследование интерференционных методов измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов на основе оптической микроскопии и микротомографии, позволяющих автоматизировать измерения, повысить разрешающую способность и чувствительность измерений, сократить время съема данных, а также увеличить диапазон углов зондирования и расширить набор траекторий сканирования.

Цель предопределила основные задачи, решаемые в диссертационной работе:

1) Исследование принципа формирования изображения в интерференционном микроскопе Линника с широким источником монохроматического пространственно-некогерентного света.

2) Разработка и исследование автоматизированного интерференционного микроскопа. Определение точности измерения ОРХ.

3) Разработка метода вычисления интегральных параметров (массы сухого вещества клетки) по фазовым изображениям, полученным на интерференционном микроскопе.

4) Разработка и исследование схем интерференционных микротомографов:

- на базе микроскопа Линника;

- на базе конфокального микроскопа;

- на базе микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором.

Научная новизна работы

1) Впервые показано, что интерференционное изображение, формируемое в микроскопе Линника с источником пространственно-некогерентного света, является суммой интерферограмм от каждой пары предметного и опорного пучков, образующихся из одной и той же точки источника. Область локализации такой суммарной интерферограммы (контрастная интерференционная картина) наблюдается в плоскости фокусировки предметного и опорного зеркал.

2) Теоретически и экспериментально исследованы факторы, влияющие на случайную погрешность измерения массы сухого вещества клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе.

3) Разработана схема интерференционного томографического микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором, позволяющая получать проекционные данные в полярном угле 63° и диапазоне азимутального угла 0-360° с шагом 10°.

Практическая ценность и использование результатов работы

(МОНИКИ), на кафедре биофизики Биофака МГУ им. М.В. Ломоносова и в «Научно-исследовательском центре по изучению свойств поверхности и вакуума» («НИЦПВ»).

Апробация работы, публикации

Основные материалы, представленные в диссертации, были доложены на:

- «Научной сессии МИФИ 2003»;

- 7-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2003 г.;

- «Научной сессии МИФИ 2004».;

- Международной конференции «Microscience-2004»;

- Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2004г.;

- 15-ой научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», 2005 г.;

- 9-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2005 г.;

- Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2005г.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 8 тезисов докладов на отечественных и одной международной научно - технических конференциях, 3 статьи в журналах «Оптика и спектроскопия», «Измерительная техника» и «Microscopy and Analysis» (Англия).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы и приложения.

Общий объем составляет 151 страница печатного текста, в том числе 78 рисунков, 4 таблицы, 7 страниц списка литературы и 2 страницы приложения.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Изображение, формируемое в микроскопе Линника с пространственно-некогерентным источником света, является суммой интерферограмм волновых полей, исходящих из различных точек источника, поэтому контрастная интерференционная картина наблюдается в плоскости изображения предметного и опорного зеркал.

2) Среднеквадратическая погрешность измерения на автоматизированном интерференционном микроскопе Линника двумерного распределения оптической разности хода излучения, прошедшего через биообъект, составляет не более 1/150 от длины волны зондирующего излучения, что позволяет вычислять массу сухого вещества внутри клетки с относительной погрешностью, не превышающей двух процентов.

3) Освещение коническим пучком объекта с его сканированием в плоскости, перпендикулярной оптической оси микроскопа, и использование матричного фотоприемника, позволяет получать двумерные параллельные проекции объекта. При этом количество проекций равно числу элементов фотоприемника, геометрия их расположения определяет траекторию зондирования, а количество отсчетов в проекции равно числу шагов сканирования.

4) При использовании микрообъектива с числовой апертурой максимальный угол зондирования объекта, находящегося в среде с показателем

преломления пср, равен агсвт

при условии распространения излучения в конденсоре со средой, показатель преломления которой больше, чем ЫА.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ сформулированы актуальность проблемы, цель работы и определены основные научно-технические задачи, решаемые в диссертации.

В ПЕРВОЙ ГЛАВЕ представлен обзор существующих методов интерференционной микроскопии и оптической микротомографии.

Введено понятие фазового объекта, описываемого трехмерным пространственным распределением показателя преломления n(x,y,z), и показано, что для количественных измерений различных параметров фазовых объектов применимы лишь методы интерференционной микроскопии. Величиной, измеряемой на интерференционном микроскопе, является оптическая разность хода (ОРХ) Ф(х,у), которая несет информацию об объекте исследования в виде интеграла от трехмерного локального распределения вдоль одного направления. Ф(х,у) представляет собой двумерное распределение оптической разности хода, информация о которой содержится в фазе световой волны. Поэтому в дальнейшем Ф(х,у) называется фазовым изображением. Фазовое изображение несет ценную количественную информацию о различных интегральных характеристиках фазового объекта, а также может быть использовано для реконструкции внутренней структуры фазового объекта по набору фазовых изображений под различными ракурсами:

Ф(х,у;в,<р)= j(n(x-z-tgQ sin <р,у-z-tgd ■ cos <p,z)-n0)dz, (1)

где в,<р полярный и азимутальный углы зондирования, пд - показатель преломления окружающей среды.

Проанализированы различные типы фазовых объектов: трехмерных, осесимметричных и двумерных. Представлен обзор существующих интерференционных микроскопов, классифицированных по виду используемой интерференционной схемы:

1) интерферометры с совмещенными ветвями:

- с двойным фокусом - двухфокусный микроскоп (Smith, Baker, Захарьевский);

- с призмой Волластона - ширинг-микроскоп (Smith, Nomarski, Захарьевский, Лебедев);

- с дифракцией на точке - микроскоп с дифракционным разделением пучков (Лейкин, Поляков);

2) интерферометры бокового сдвига:

- на базе интерферометра Маха-Цендера - микроскоп Biolar Р;

- на базе циклического интерферометра Харихарана и Сена - микроскоп с обратно круговым ходом лучей Савина;

3)двулучевые интерферометры:

- на базе интерферометра Майкельсона - микроинтерферометр Линника;

- на базе интерферометра Маха-Цендера - микроскоп Хорна;

- на базе интерферометра Миро - микроскоп Дайсона;

4) многолучевой интерферометр (Osterberg, Smith).

В современных интерференционных микроскопах для автоматизированной расшифровки интерферограмм чаще всего используются следующие методы:

- метод дискретного фазового сдвига (метод фазовых шагов);

- фурье-алгоритм;

Рассмотрены конструктивные особенности микрообъективов-интерферометров (Майкельсона, Миро и Линника), используемых в составе современных интерферометров, а также конструктивные особенности микроскопов Maxim-3D ZYGO и WykoTopo WYKO, автоматизированного микроскопа Хорна, автоматизированного микроскопа Ямина-Лебедева, цифрового голографического микроскопа, микроскопа В.П. Тычинского («Эйрискан»).

Рассмотрено новое направление в оптической микроскопии - трехмерная микроскопия (ЗБ-микроскопия) или оптическая микротомография, позволяющая исследовать внутреннюю структуру микрообъектов. Методы ЗБ-микроскопии можно классифицировать по принципу получения информации о внутренней структуре:

- без численной реконструкции, чисто аппаратными средствами (конфокальная микроскопия, многофотонная микроскопия, когерентная микротомография и др.);

- с использованием цифровой реконструкции томограмм по проекциям (проекционная микротомография).

Только микротомография, использующая методы реконструктивной томографии, позволяет получать 3D пространственное распределение показателя преломления объектов.

Основой оптического микротомографа является система многоракурсного зондирования объекта и сбора проекционных данных. В настоящее время существуют следующие схемы зондирования (рис. 1):

- с поворотом пучка зондирующего излучения относительно неподвижного объекта;

- с вращением (наклоном) объекта относительно неподвижного пучка зондирующего излучения.

Схемы со сканированием объекта относительно неподвижного пучка (axial microtomography) реализованы для следующих вариантов вращения:

- вращение капилляра с находящимся внутри него объектом;

- наклон объекта, помещенного между двумя покровными стеклами.

Рис. 1 Схемы зондирования объекта в микроскопии: а-в) со сканированием пучка зондирующего излучения относительно неподвижного объекта; г, д) с движением объекта относительно неподвижного пучка зондирующего излучения. 1, 5 - передняя и задняя фокальные плоскости микрообъективов, 2, 4 -микрообъективы, 3 - объект, 6 - источник, 7 - держатель.

Рассмотрены особенности микротомографии в условиях ограниченного угла зондирования и показано, что погрешность реконструкции томограмм при

ограниченном угле зондирования зависит от траектории сканирования. Она минимальна, когда траектория сканирования двумерна, а направления зондирования равномерно распределены.

Приведенный обзор показал, что для проведения интерференционных измерений интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов на современном уровне необходимо обеспечить высокоточные автоматизированные измерения фазовых изображений с высокими пространственным разрешением и чувствительностью

Во ВТОРОЙ ГЛАВЕ рассмотрен автоматизированный интерференционный микроскоп Линника. В основе микроскопа лежит микроинтерферометр МИИ-4 (ЛОМО). Важным достоинством этого интерферометра является возможность работы с широким источником пространственно-некогерентного монохроматического излучения. Это приводит к значительному уменьшению когерентных шумов и улучшению, по сравнению с интерферометрами с точечными источниками света, качества получаемых изображений. Использование широкого источника в микроскопе Линника определяет особенности формирования и локализации интерференционной картины.

В микроинтерферометре Линника точечные источники, на которые можно разбить широкий источник света, некогерентны между собой. Поэтому интерферограмма 1(х,у) для такого пространственно-некогерентного источника света будет формироваться из набора элементарных интерферограмм:

I(х,у;в,<р,а) = И'-\ 1 + соб

(2)

где а - угол между предметным и опорным пучками для данного положения точечного источника. Здесь предполагается, что интенсивность обоих этих пучков одинакова и равна /'. Тогда для широкого источника необходимо просуммировать все такие элементарные интерферограммы. Для непрерывного набора источников можно записать:

I(x, у) = JJi(x, у, в, <p) • sin ШШ<р. (3)

Область интегрирования в (3) определяется угловыми размерами источника. Таким образом, изображение, формируемое в микроскопе Линника с пространственно-некогерентным источником света, является суммой интерферограмм волновых полей, исходящих из различных точек источника, поэтому контрастная интерференционная картина наблюдается в плоскости изображения предметного и опорного зеркал. Данное утверждение является первым научным положением.

Область локализации интерференционных полос в микроскопе Линника с протяженным источником пространственно-некогерентного света совпадает с плоскостью изображения зеркал, предметного и опорного каналов. Только в этой плоскости элементарные интерференционные картины от каждого точечного источника будут суммироваться без поперечного смещения. Поэтому именно в данной плоскости будет наблюдаться наиболее контрастная интерференционная картина. В любой другой плоскости такие элементарные картины из-за расходимости пучков будут смещены друг относительно друга, и видность полос суммарной интерферограммы уменьшится.

В микроскопе реализована схема «на отражение», при этом исследуемый фазовый микрообъект размещается на зеркале и излучение дважды проходит через него. Поэтому ОРХ измеряется с большей чувствительностью, чем в микроскопах «на просвет». Для автоматической расшифровки интерферограмм в микроскопе Линника реализован метод дискретного фазового сдвига (метод фазовых шагов). Сдвиг вносится при помощи управляемого от компьютера зеркала на пьезоэлементе (далее пьезозеркала) в опорном плече микроинтерферометра. Интерферограммы при различных положениях пьезозеркала регистрируются с помощью двух ПЗС-телекамер, встроенных в окулярный или фотографический канал. Далее через плату ввода изображения поступают в персональный компьютер (ПЭВМ), где производится их автоматическая обработка. В результате работы программы восстанавливается

двумерное распределение оптической разности хода (ОРХ) или фазовое изображение Ф(х,у). Для управления вводом изображений, сдвигом пьезоэлемента и расшифровки интерферограмм разработано специальное программное обеспечение.

Для зондирования трехмерных объектов используется лазерного излучение, прошедшее через разрушитель пространственной когерентности (вращающееся матовое стекло). Из-за большой длины когерентности такого излучения значительно проще выравнивать оптическую длину пути предметного и опорного каналов. Позиционирование объекта, находящегося в поле зрения микроскопа, осуществляется с помощью двухкоординатного предметного стола с шаговыми двигателями, управляемыми от ПЭВМ. На рис. 2а представлена блок-схема прибора, а на рис. 26 - его внешний вид.

а б

Рис. 2 а- блок-схема автоматизированного микроскопа, б- внешний вид автоматизированного микроскопа: 1-автоматизированный двухкоординатный предметный стол; 2-опорное зеркало на пьезоэлементе (пьезозеркало); З-ПЗС-камера окулярного канала; 4-микроинтерферометр МИИ-4 ЛОМО; 5-ПЗС-камера фотографического канала; б-осветительный блок с разрушителем пространственной когерентности.

В главе представлены особенности реализации конструкции автоматизированного микроскопа, программно-аппаратного комплекса, используемого для расшифровки интерферограмм, лазерного осветителя с разрушителем пространственной когерентности и узла опорного канала с эталонным зеркалом на пьезоэлементе.

Таким образом, разработанный прибор обеспечивает измерение интегральных параметров фазовых микрообъектов с большой чувствительностью, а применение метода автоматизированной расшифровки интерферограмм позволяет достигнуть разрешающей способности измерения ОРХ Х/150, где А, -длина волны излучения, при времени измерения - 30 сек.

ТРЕТЬЯ ГЛАВА посвящена использованию автоматизированного интерференционного микроскопа для измерения интегральных параметров фазовых микрообъектов.

Фазовое изображение (рис. 3) несет количественную информацию о различных интегральных характеристиках фазовых микрообъектов. К ним относятся: морфометрические параметры, сухой вес клеток, инкремент показателя преломления и др. Измерения этих параметров можно производить как для стационарных, так и для динамических объектов.

Традиционные морфометрические параметры, которые могут быть получены из анализа фазовых изображений, - это число, положение и параметры формы клеток, площадь клетки или ядра клетки, периметр клетки, максимальное значение ОРХ, линейные размеры (эффективный радиус, диаметр и пр.), коэффициент вытянутости (отношение двух главных моментов), коэффициент формы (степень отличия от круга), отношение площади ядра клетки к площади цитоплазмы, объем.

Рис. 3 Фазовое изображение эритроцита. Размер кадра 20*20 мкм.

Известно, что по фазовому изображению может быть вычислен важный количественный параметр - масса сухого вещества клетки по следующей формуле:

М + {пм-п„)-У

(4)

100-а

где а - удельный инкремент (приращение) показателя преломления растворенного вещества, п,т- показатель преломления иммерсионной жидкости, М- нулевой момент фазового изображения, пш - показатель преломления водной фазы клетки, V- объем клетки.

Если показатель преломления иммерсионной среды подобран так, что он равен показателю преломления водной фазы клетки п,т=пи,, то выражение (4) для сухого веса Р становится более простым и не зависящим от объема клетки:

г--*- »,

100-а' '

В работе исследованы факторы, влияющие на погрешность измерения сухого веса на автоматизированном интерференционном микроскопе, а именно: изменение объема клетки, учет рефракции света на клетке, температурный дрейф, дефокусировка оптической системы.

Проведенные эксперименты позволили сформулировать второе научное положение. Среднеквадратическая погрешность измерения на автоматизированном интерференционном микроскопе Линника двумерного распределения оптической разности хода излучения, прошедшего через биообъект, составляет не более 1/150 от длины волны зондирующего излучения, что позволяет вычислять массу сухого вещества внутри клетки с относительной погрешностью, не превышающей двух процентов

Автоматизация позволяет проводить рутинные измерения интегральных параметров фазовых микрообъектов как стационарных, так и не стационарных во времени. В работе приводятся результаты экспериментов по измерению инкремента показателя преломления биологических клеток во времени. Они показали, что изменение этой величины носит периодический характер (рис. 4).

Икременг показателя преломления, мкм куб/г з ачо'

140»

11*ю' : 6-'.с®

О 30 40 И N 100 130 1*0 160 1«

Время, мин

Рис.4 График изменения инкремента показателя преломления клеточного вещества эритроцита. Длина волны зондирующего излучения 632 нм.

Исследована также стабильность работы микроскопа при помощи следующих тест-объектов:

- иммерсионная жидкость в кювете;

- прозрачные сферы размером 5мкм в твердом иммерсионном слое.

Таким образом, автоматизированный интерференционный микроскоп

может быть использован для измерения различных интегральных параметров фазовых объектов как стационарных во времени, так и нестационарных (динамических). Получаемое фазовое изображение несет важную количественную информацию о микрообъекте и может быть измерено с высокой точностью.

Фазовое изображение представляет томографическую проекцию и поэтому может быть использовано для реконструкции внутренней структуры и измерения локальных параметров. Для этого необходимо получить набор таких проекций под разными углами. Сбор проекций реализуется в микротомографе.

В ЧЕТВЕРТОЙ ГЛАВЕ приведено описание разработанных схем оптических микротомографов на базе микроскопа Линника, конфокального микроскопа и томографического микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором.

Вначале рассмотрена схема с микроскопом Линника. Для реализации схемы сканирования объекта типа «квадрат», когда проекции равномерно распределены в определенном телесном угле, предложено смещать точечный источник в плоскости апертурной диафрагмы микроскопа Линника (рис. 1а).

/ Л • \ Л V / \

V V \ ! 1 / г ЧУ (

Приведены результаты экспериментального опробования микротомографа, построенного по схеме Линника. В качестве фазового объекта была выбрана живая клетка крови - лимфоцит. Клетки находились в физиологическом растворе между тонким покровным стеклом и плоским зеркалом. Этот раствор выполнял также роль иммерсионной жидкости для фазового объекта. Была выбрана двумерная дискретная траектория «квадрат». В этом случае геометрическое место точек с угловыми координатами вектора зондирования на плоскости (б, ф) совпадает с узлами прямоугольной сетки. Шаг сетки по ср составил 30° в диапазоне 0°-150°. Диапазон изменения угла зондирования по углу 0 для 100-кратного иммерсионного микрообъектива с NA=1.25 составил ±45°. Точность установки угловых значений - 0.5 град. Всего было зарегистрировано 43 двумерные проекции на сетке 256x256, размер кадра 23x23 мкм.

Для восстановления фазовых изображений проекций был использован метод фазовых шагов, а для реконструкции томограммы комбинированный итерационный алгоритм с ART. На рис.5 приведена 3D реконструкция внутренней структуры лимфоцита в виде изображения трех изоповерхностей оптической плотности 22%, 50%, 82% от максимального значения. Реконструкция выполнена Пикаловым В.В. (Институт теоретической и прикладной механики СО РАН).

Рис. 5 ЗБ томограмма лимфоцита.

Основной недостаток схемы микротомографа по схеме Линника связан с усложнением объекта реконструкции, т.к. зондирующий луч дважды проходит через объект под разными углами. Для решения этой проблемы была разработана схема с однократным прохождением излучения сквозь объект на основе конфокального микроскопа.

В конфокальном микроскопе объект зондируется конусным (веерным) пучком. Для простоты, предположим, что движение совершает не объект, а источник зондирующего излучения вместе с регистратором (рис. 6).

Рис.6 Формирование параллельных проекций в конфокальном томографическом микроскопе.

В одномерном случае источник и регистратор движутся по прямой относительно неподвижного объекта, а на регистраторе формируется набор веерных пленарных проекций. При зондировании объекта веерным пучком всегда можно выделить те лучи, которые зондируют объект под одним и тем же углом. Выделив из всех веерных проекций наборы таких лучей можно получить проекции в параллельных пучках (рис.6). Каждый луч в веерном пучке, зондирующий объект под определенным углом, попадает на один и тот же фотоэлемент матрицы (пиксель). Таким образом, количество углов зондирования или количество проекций определяется числом пикселов на фотоприемнике. А количество отсчетов в каждой проекции равно числу шагов сканирования.

Описанная система сбора проекционных данных легко реализуется в конфокальном микроскопе. Для получения конусных проекций необходимо лишь заменить точечный фотоприемник матрицей фотоэлементов. Как правило, для реконструкции используется не более 100 проекций, т.е. число элементов фотоприемника должно быть равно 100 (матрица 10x10). Такое небольшое число элементов позволяет использовать матрицу из различных фотоприемников, например, фотодиодов, комбинаций световод-ФЭУ и т.п.

Источн"*

Объект

Плоскость _,

регистратора /

Параллельное проекции

Плоско-параллельное сканирование в зоне конусного пучка представляет еще один способ сбора проекционных данных наряду со схемами, использующими вращение или наклон объекта относительно пучка. Преимущество данного метода в том, что:

- объект не выходит из фокуса во время сканирования;

- его легко можно реализовать в микроскопе, поместив объект на предметный сканирующий столик.

В данной схеме траектория сбора данных определяется геометрией расположения элементов фотоприемника, т.е. можно обеспечить любую траекторию, в том числе и «квадрат», использовав матрицу фотоприемников.

Таким образом, освещение коническим пучком объекта с его сканированием в плоскости, перпендикулярной оптической оси микроскопа, и использование матричного фотоприемника, позволяет получать двумерные параллельные проекции объекта. При этом количество проекций равно числу элементов фотоприемника, геометрия их расположения определяет траекторию зондирования, а количество отсчетов в проекции равно числу шагов сканирования. Это третье научное положение, выносимое на защиту.

Па ос;;ове представленного метода сбора проекций была разработана оптическая схема конфокального томографического микроскопа. В предметном канале микроскопа реализована схема конфокального микроскопа (рис. 7а). Но, в отличие от классической схемы, перетяжка пучка находится вне объекта, а на фотоприемнике 14 строится его изображение. Сам объект располагается между двумя покровными стеклами, которые расположены между двумя идентичными иммерсионными объективами 8,9 с большой числовой апертурой ЫА=1.3, х 100. Прохождение излучение через такую систему показано на рис. 76. Был достигнут угол зондирования ±50°. Для реконструкции ОРХ использовался алгоритм фазовых шагов.

а б

Рис. 7 а- оптическая схема конфокального томографического микроскопа: 1- лазер, 2,3,4 - расширитель пучка, 5, 10 - светоделители, 6- пьезозеркало, 7-призма, 8, 9 - микрообъективы, 11 - поляризатор, 12 -объектив, 13 - точечная диафрагма (пинхол), 14 — ПЗС - камера; б - схема зондирования объекта.

На рис.8 представлены экспериментальные проекции и результаты томографической реконструкции волосков тычиночных нитей традесканции, полученным на данном микроскопе. Для реконструкции томограммы использовался алгоритм Гершберга-Папулиса.

27 5° 18.9° 9.1° ! -0 8»

шя ци Щ Щ

-6.8° -20.0« -28.5° | -38.1°

11 1 ¡9 Ц

Рис. 8 а - экспериментальные проекции традесканции; б- Ю томограмма.

Для увеличения угла зондирования объекта в настоящей работе предложено использовать иммерсионный конденсор. При использовании иммерсионного объектива с числовой апертурой ЫА, угол зондирования аг (рис. 9) для объекта, находящегося в среде с показателем преломления пср= п^ будет равен:

' ООКрОМО*

0 ' * стаю

гъ

7-—Т~

х\

\ ч

иммерсионный

Рис. 9 Схема зондирования объекта.

Для №4=1.3 и п2=1.33 (физ. раствор), максимальный угол зондирования а2 достигает 78°. В микроскопе излучение источника проходит по воздуху (и/=1) и попадает в среду («¿>1). Основным является вопрос о том, как обеспечить такой угол зондирования в среде п2■ В работе показано, что для решения этой задачи излучение должно проходить через среду и; с показателем преломления большим 1. Действительно, с учетом (6) для и/справедливо соотношение (7)

щ-ьЩь) ЫА

л, =—-— =--(7)

вш^) эт^)' так как 5т(а[) лежит в диапазоне 0... 1, то и¡>ИА.

Таким образом, при использовании микрообъектива с числовой апертурой 1ЧА>1 максимальный угол зондирования объекта, находящегося в

среде с показателем преломления л^,, равен агс5Ш

/ л ИА

\п<р

, при условии

распространения излучения в конденсоре со средой, показатель преломления которой больше, чем НА. Это четвертое научное положение.

В работе была разработана конструкция и изготовлен макет зеркального иммерсионного конденсора (рис. 106), в котором плоские зеркала помещены в иммерсионную среду с показателем преломления п2 (рис. 10а). Для иммерсии в виде дистиллированной воды («¿=1.33) угол зондирования а3=63°. Конденсор был включен в состав схема интерференционного томографического микроскопа (рис. 11). Для получения опорного волнового фронта, пучок, прошедший через объект

и распространяющийся вдоль оптической оси проходил через точечную диафрагму 10 (point diffraction interferometer).

Г п=1

fi, У Пе

lis п 1

а б

Рис.10 а - углы преломления луча при прохождении через различные среды конденсора, б - конструкция зеркального иммерсионного конденсора: 1- плоское зеркало; 2,4- защитные стекла; 3- иммерсия; 5- корпус.

Так как в схеме сложно обеспечить фазовый сдвиг, то расшифровка интерферограмм производилась фурье-методом.

а б

Рис 11. а - оптическая схема инетерференционного томографического микроскопа. Сплошная линия - боковой пучок. Прерывистая линия -центральный пучок. 1- Не-Ые лазер, 2,3,4 - коллиматор с пространственным фильтром , 5- поворотное зеркало, 6 сканирующее поворотное устройство, 7-зеркальный иммерсионный конденсор, 8- микрообъектив, 9- объектив, 10- маска с точечной диафрагмой, 11-плоскость регистратора. О-плоскость предмета, 0'-плоскость промежуточного изображения, О"- плоскость изображения; б -проекция эритроцита (угол зондирования 63°).

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процессе выполнения диссертационной работы были получены следующие результаты:

1) Проведен обзор работ по интерференционной микроскопии и интерференционным микроскопам, а также микротомографии. Рассмотрена возможность автоматизации некоторых типов интерференционных микроскопов.

2) Исследован механизм образования контрастной интерференционной картины в микроскопе Линника с широким источником пространственно-некогерентного света и показано, что область ее локализации наблюдается в узкой зоне вблизи плоскости фокусировки предметного и опорного зеркал микроскопа.

3) Рассмотрены факторы, влияющие на погрешность измерения массы сухого вещества клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе по схеме Линника. Показано, что суммарная среднеквадратическая погрешность вычисления сухого веса клетки не превышает двух процентов.

4) На автоматизированном интерференционном микроскопе Линника проведены эксперименты по измерению следующих интегральных характеристик биообъектов:

- веса сухих веществ эритроцита, среднее значение составило 28 пг, что хорошо согласуется с табличным значениями для сухого веса (27-35 пг);

- изменение инкремента показателя преломления эритроцита во времени, обнаружена периодичность изменения этой величины со средним периодом 25 минут и амплитудой 5% от среднего значения.

5) Рассмотрен метод получения параллельных томографических проекций в интерференционном микроскопе и показано, что для его осуществления необходимо двумерное сканирование микрообъекта в зоне конического пучка.

6) Разработан макет конфокального томографического микроскопа и проведены эксперименты по получению проекций и реконструкции томограмм для клеток волосков тычиночных нитей традесканции и эритроцитов. Угол зондирования составил ±50°.

7) Рассмотрен метод увеличения угла зондирования микрообъекта в микроскопе и показано, что для этого необходимо использовать иммерсионные объективы (№4>1), а зондирующее излучение должно проходить через среду с показателем преломления большим,чем NA.

8) Разработан макет интерференционного томографического микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором и проведены эксперименты по получению проекций эритроцитов. Для дистиллированной воды в качестве иммерсионной жидкости угол зондирования достигал ±63°.

Таким образом, в настоящей работе решена актуальная научно-техническая задача разработки интерференционных методов измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов, что имеет существенное значение для оптической микроскопии и микротомографии трехмерных фазовых объектов.

4. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Вишняков Г.Н., Левин Г.Г., Минаев В.Л. Томографическая микроскопия трехмерных фазовых объектов в пространственно-некогерентном свете// Оптика и спектроскопия. - 2003.- том 95.- №1. - С. 131-135.

2) Минаев В.Л. Конфокальный микроскоп для интерференционной томографии фазовых объектов: Тез. докл. Научная сессия МИФИ-2003.- М.,

2003.- С. 210-211.

3) Минаев В. Л., Сухоруков К.А. Реализация метода динамической фазовой микроскопии: Тез. докл. Седьмая международная научно-техническая конференция «Оптические методы исследования потоков».-М., 2003.- С. 75.

4) Левин Г.Г., Ковалев A.A., Минаев В.Л., Сухоруков К.А. Оценка точности измерения сухой массы клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе//Измерительная техника.- 2004. - №4.- С.62-67.

5) Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. Tomographic interference microscopy of living cells // Microscopy and Analysis.-

2004.-Vol. 87.-P. 19-21.

6)Вишняков Г.Н., Левин Г.Г., 'Минаев В.Л. Томографическая интерференционная микроскопия живых клеток: Тез. докл. Научно-практическая конференция «Голография в России и за рубежом. Наука и практика». -М., 2004,- С. 70.

7)Levin G.G, Vishnyakov G.N., Minaev V.L. Tomographic interference microscopy of living cells // International Conférence and Exhibition MicroScience-

2004,- 2004.- P.26.

8) Минаев В.Л. Автоматизированный интерференционный микроскоп Линника: Тез. докл. Пятнадцатая научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение». -М., 2005,- С. 100.

9) Вишняков Г.Н., Левин Г.Г., Минаев В. Л. Использование многоракурсного зеркального конденсора для интерференционного томографического микроскопа: Тез. докл. Девятая международная научно-техническая конференция «Оптические методы исследования потоков».-М.,

2005.- С. 124.

10) Минаев В.Л. Улучшение качества интерференционных томографических проекций: Тез. докл. Девятая международная научно-техническая конференция «Оптические методы исследования потоков».-М., 2005.- С. 498.

И) Минаев В.Л., Вишняков Г.Н., Левин Г.Г. Автоматизированный интерференционный микроскоп: Тез. докл. Научно-практическая конференция «Голография в России и за рубежом. На> ка и практика». -М., 2005.- С. 71.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата технических наук, Минаев, Владимир Леонидович

Введение.

Глава 1 Интерференционная микроскопия и микротомография фазовых объектов

• 1.1 Интерференционная микроскопия фазовых объектов.

1.2 Схемы интерференционных микроскопов.

1.3 Современное состояние интерференционной микроскопии.

1.4 Оптическая микротомография.

1.5 Выводы.

Глава 2 Автоматизированный интерференционный микроскоп Линника

2.1 Формирования интерференционного изображения в микроскопе Линника с широким источником пространственно-некогерентного света.

2.2 Исследование контраста и области локализации интерференционной картины в микроскопе Линника.

• 2.3 Функциональная схема автоматизированного микроскопа.

2.4 Оптическая схема автоматизированного микроскопа.

2.5 Выводы.

Глава 3 Измерение интегральных параметров фазовых микрообъектов с помощью автоматизированного интерференционного микроскопа Линника

3.1 Измерение интегральных характеристик стационарных фазовых микрообъектов.

3.1.1 Морфометрия по фазовым изображениям.

3.1.2 Измерение массы сухих веществ клетки.

• 3.2 Измерение интегральных характеристик нестационарных фазовых микрообъектов.

3.2.1 Динамическая фазовая микроскопия.

3.2.2 Измерение инкремента показателя преломления (массы сухих веществ) живой клетки во времени.

3.3 Выводы.

Глава 4 Измерение локальных параметров фазовых микрообъектов методами оптической микротомографии

4.1 Микротомограф на основе интерференционного микроскопа Линника.

4.2 Конфокальный томографический интерференционный микроскоп.

• 4.3 Интерференционный томографический микроскоп с зеркальным иммерсионным конденсором.

4.4 Выводы.

Введение диссертация по физике, на тему "Интерференционные методы измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов"

Фазовые микрообъекты, прозрачные для излучения. видимого оптического диапазона, широко распространены как в промышленности, так и в биологии и медицине. К ним относятся различные полимерные пленки, кристаллы, оптические микродетали, оптоволоконные изделия, и, наконец, биологические микрообъекты - клетки и др. Эти объекты описываются трехмерным (ЗБ) пространственным распределением показателя преломления п(х,у,г), с которым связаны плотность, температура, концентрация и другие физические параметры объекта [1].

При изучении фазовых объектов сразу встает задача их визуализации. На сегодняшний день она решена, широко известны следующие методы: фазовый контраст (метод Цернике), интерференционный контраст, дифференциально-интерференционный контраст (метод Номарского, ШС), метод темного поля, поляризационный контраст и пр [2]. Однако в настоящее время при исследовании фазовых микрообъектов требуется не только наблюдать и оценивать различные геометрические параметры (площадь, периметр), но и проводить измерения их локальных и интегральных характеристик.

Исходным измеряемым параметром фазового микрообъекта является оптическая разность хода (ОРХ). Это интегральная характеристика, так как ОРХ представляет собой интеграл от функции распределения показателя преломления вдоль луча или одномерную (Ш) луч-сумму. Двумерное (2Б) распределение ОРХ, полученное вдоль набора параллельных лучей является параллельной 2Б проекцией, а вдоль набора лучей, пересекающихся в одной точке - конусной 2Т> проекцией. Будем далее называть 2Б распределение ОРХ фазовым изображением.

По набору значений ОРХ, измеренных при различных углах зондирования, можно реконструировать 3D пространственное распределение показателя преломления n(x,y,z) - локальный по пространству параметр фазового объекта. Из ОРХ и 3D распределения n(x,y,z) можно вычислить различные производные характеристики от этих величин:

- плотность [1];

- концентрацию [1];

- морфометрические характеристики, например, объем, средний радиус, площадь клетки и т.п. [3];

- массу сухих веществ биологической клетки [4]. Devis и Wilkins [5] показали связь между оптической разностью хода света, прошедшего через клетку, и массой ее сухого вещества, a Barer [6,7] - возможность ее измерения с помощью интерференционного микроскопа;

- величину двулучепреломления (ДЛП). Традиционно измеряемый поляризационными методами, показатель ДЛП может быть измерен интерференционно-поляризационным методом. Этот метод выгодно отличается от аналогичных поляризационных методов отсутствием необходимости измерения толщины исследуемого объекта [8,9].

Показатель преломления связан с поляризуемостью белковых структур клетки, следовательно, фазовое изображение несет ценную диагностическую информацию о состоянии биологического микрообъекта. Поэтому с помощью интерференционного микроскопа можно вести мониторинг состояния как отдельной клетки [10-13], так и целой популяции клеток [14]. Это может быть использовано, например, для диагностики состояния системы крови [14].

Корреляция между различными процессами, происходящими в живой клетке, и величиной ОРХ позволяет использовать фазовое изображение также для исследования этих динамических процессов [15, 16].

Количественные исследования характеристик фазовых микрообъектов можно проводить только с помощью интерференционных микроскопов [17]. Только они позволяют измерять ОРХ. Другие способы позволяют лишь визуализировать, либо измерять производную по направлению от ОРХ (DIC). Однако, широкому распространению интерференционных микроскопов препятствовало отсутствие автоматизированных методов расшифровки интерферограмм, что тормозило внедрение данных микроскопов в практику лабораторных исследований и рутинных измерений.

Для проведения измерений в основном используют микроскопы, в основе которых лежат различные схемы двулучевых интерферометров Майкельсона, Маха-Цендера и Миро [17]:

- схема деления пучков Майкельсона используется в микроинтерферометре академика В.П. Линника (1933). Микроскоп Линника позволяет работать с микрообъективами больших числовых апертур. Для исследования фазовых микрообъектов, они должны размещаться на зеркале, расположенном в предметном канале. В этом случае излучение дважды проходит сквозь них (схема на отражение) [17,21].

- схема деления пучков Маха-Цендера используется в микроскопе Хорна (Horn, 1950). В своем составе он имеет две идентичные ветви, в которых располагаются исследуемый препарат и препарат сравнения. Излучение проходит через исследуемый микрообъект один раз (схема на просвет) [17, 5].

- схема деления пучков по Миро используется в микроскопе Дайсона (Dyson, 1950; Pfeiffer, 1954). Пучок сравнения формируется из той части предметного пучка, которая не прошла через исследуемый объект Недостатком этой схемы является значительная потеря света и рассеянный свет, возникающие вследствие многих отражений. Данная схема также предназначена для исследования фазовых микрообъектов на просвет [17].

Одной из тенденций современной интерференционной микроскопии является создание самостоятельных оптических узлов с микрообъективами, реализующих тот или иной вид интерференционной схемы (микрообъектив-интерферометр). Известны такие схемы, реализованные для интерферометров Физо, Миро, Майкельсона и Линника.

Традиционно расшифровка интерферограмм, полученных на таких микроскопах, производилась вручную. Только в последние десятилетия были предложены и освоены алгоритмы автоматической расшифровки интерферограмм, которые впоследствии были применены и в интерференционных микроскопах. Этому способствовало появлением быстрых ПЭВМ, систем захвата и обработки изображений, высоко чувствительных ПЗС-камер.

Впервые автоматизированный вариант интерференционного микроскопа Линника МИИ-4 был разработан профессором В.П. Тычинским (1989) и назван «Эйрискан» [15] [18]. В качестве фотоприемного устройства в этом микроскопе используется диссектор. Изображение объекта получается путем развертки. Для реконструкции фазы реализован компенсационный метод (метод временных интервалов [19]). Значение фазы в выбранной точке пропорционально нормированному временному интервалу между моментами регистрации двух минимальных значений интенсивности на фотоприемнике при сдвиге зеркала опорного канала на половину длины волны излучения (л). Время съема данных прямо пропорционально зависит от числа отсчетов, в которых производятся измерения и составляет 1мс/пиксель. Т.е. за время одного телевизионного кадра (40мс) регистрируется изображение размером 40 пикселей.

Известен также автоматизированный вариант микроскопа Хорна (Zicha и Dunn, 1995) [5]. В этом микроскопе используется метод фазовых шагов [20]. Дискретный фазовый сдвиг обеспечивается поперечным перемещением компенсационного клина, управляемого от шагового двигателя. Данный метод получил название DRIMAPS (digitally recorded interference microscopy with automatic phase shifting - цифровая интерференционная микроскопия с автоматическим фазовым сдвигом). Схема микроскопа Хорна сложна в эксплуатации и настройке, так как требует наличия двух идентичных каналов с одинаково приготовленными препаратами: исследуемого препарата и препарата сравнения.

Среди всех схем наиболее предпочтительна схема интерферометра Линника [21]. Ее преимущества в том, что она позволяет обеспечить:

- высокое пространственное разрешение, вследствие возможности использования микрообъективов большой числовой апертуры;

- повышенную чувствительность в измерении ОРХ из-за двойного

• прохождения света (схема на отражение).

Отсюда следует, что, несомненно, актуальной является тема разработки и исследования методов интерференционной микроскопии, позволяющих автоматизировать измерения, повысить разрешающую способность и чувствительность, а также сократить время съема данных для измерения ОРХ как статических, так и динамических объектов при большом числе отсчетов.

Для измерения локальных характеристик внутренних неоднородностей микрообъектов разработаны методы конфокальной сканирующей микроскопии [22-24], оптической когерентной микроскопии [25, 26], а также методы, использующие томографическую реконструкцию. В конфокальном микроскопе

• изображения внутренних сечений формируются за счет сканирования и пространственной фильтрации излучения. Данный метод пригоден лишь для исследования самосветящихся- (флуоресцентных) объектов. Оптическая когерентная микроскопия основана на принципах оптической когерентной томографии и представляет метод оптической локации с использованием низкокогерентного излучения [27]. Изображение сечения получается за счет интерференции света, рассеянного в тонком слое внутри объекта, и опорной волны. Толщина слоя определяется длиной когерентности источника. Метод пригоден для визуализации градиентов показателя преломления сильно рассеивающих фазовых объектов и слоистых структур. Так как в

• микроинтерферометрии фазовых объектов измеряемым является интегральный параметр - ОРХ, то для реконструкции п(х,у,г) необходимо использовать только принципы томографии [28].

Известен микроскоп, подобный конфокальному, с реконструкцией по томографическим алгоритмам [29]. Вместо точечного детектора использовался матричный фотоприемник, на котором регистрировались суммарные изображения и решалась обратная задача. Недостаток этого метода состоит в необходимости сканирования по всем трем направлениях и регистрации большого объема данных.

Особенность интерференционной вычислительной микротомографии заключается в решении технически сложной задачи встраивания системы сбора проекционных данных в интерференционный микроскоп [30]. Зондирование объекта может осуществлять либо параллельным пучком света либо расходящимся (коническим). В первом случае формируются параллельные проекции, а во втором - конические.

Возможные следующие варианты зондирования:

- поворот пучка зондирующего излучения относительно неподвижного объекта;

- вращение (наклон) объекта относительно неподвижного пучка зондирующего излучения.

Схемы с поворотом пучка относительно неподвижного объекта различаются по траектории, которую описывает зондирующий пучок относительно объекта, или области (сетке), на которой регистрируются проекции. Известны следующие подходы:

- внеосевая вращающаяся точечная диафрагма в плоскости апертурной диафрагмы микрообъектива [31]. Траектория зондирования - окружность;

- одномерное смещение точечного источника в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и получение наклонного освещения [32]. Траектория зондирования - прямая (1D);

- использование матрицы микрозеркал DMD (Digital Micromirror Devices), помещенных в апертурной диафрагме микрообъектива, для создания наклонного освещения [33]. Схема может быть использована только для небольших объектов. Траектория зондирования - любая двумерная (2D);

- двумерное смещение точечного источника в плоскости апертурной диафрагмы микрообъектива и получение наклонного освещения [34-36]. Траектория зондирования - любая двумерная (2D).

Среди этих схем наибольшее предпочтение имеют схемы, обеспечивающие двумерную траекторию. Все подходы имеют общий

• недостаток, заключающийся в том, что угол зондирования объекта ограничен числовой апертурой микрообъектива и не превышает ±45°.

Схемы со сканированием объекта относительно неподвижного пучка (micro-axial tomography) реализованы для следующих вариантов вращения:

- вращение капилляра с находящимся внутри него объектом [37-39];

- наклон объекта, помещенного между двумя покровными стеклами.

Эти схемы обеспечивают большой угол зондирования. Однако для их реализации необходимо, чтобы ось вращения проходила через объект, иначе при вращении он выйдет из области фокусировки. Т.е. необходимо создавать сложные поворотные механизмы, обеспечивающие выравнивание

• микрообъекта относительно оси вращения.

Таким образом, из всего вышеизложенного следует, что в области интерференционной микроскопии актуальной является также проблема разработки методов оптической микротомографии фазовых объектов, обеспечивающих большой угол зондирования, различные траектории сканирования и большое число проекций.

Цель работы

Основные задачи исследования

4) Разработка и исследование схем интерференционных микротомографов:

- на базе микроскопа Линника;

- на базе конфокального микроскопа;

- на базе микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором. Научная новизна

1) Впервые показано, что интерференционное изображение, формируемое в микроскопе Линника с источником пространственно-некогерентного света, является суммой интерферограмм от каждой пары предметного и опорного пучков, образующихся из одной и той же точки источника. Область локализации такой суммарной интерферограммы контрастная интерференционная картина) наблюдается в ограниченной узкой зоне.

3) Разработана схема интерференционного томографического микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором, позволяющая получать проекционные данные в полярном угле ±63° и диапазоне азимутального угла 0360° с шагом 10°.

Практическая ценность и использование результатов работы

Разработанные методики могут быть применены для создания автоматизированных интерференционных микроскопов и интерференционных томографических микроскопов, для автоматизации существующих интерференционных микроскопов. Изложенные методики получения фазовых изображений, измерения интегральных параметров (морфометрических параметров, массы сухих веществ) и динамической фазовой микроскопии реализованы для автоматизированного интерференционного микроскопа Линника (ВНИИОФИ), а также для автоматизированных интерференционных микроскопов Центра Аналитической Микроскопии (Пущино), Московского Областного Научно-Исследовательского Института им. Владимирского (МОНИКИ), кафедры биофизики биофака МГУ им. М.В. Ломоносова и «Научно-исследовательского центра по изучению свойств поверхности и вакуума» («НИЦПВ»).

Апробация работы, публикации

Основные материалы, представленные в диссертации, были доложены на:

- «Научной сессии МИФИ 2003»;

- 7-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2003 г.;

- «Научной сессии МИФИ 2004»;

- Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2004г.;

- 15-ой научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», 2005 г.;

- 9-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2005 г.;

- Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2005г.

Структура и объем работы

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 7 тезисов докладов на отечественных научно - технических конференциях, 3 статьи в журналах «Оптика и спектроскопия», «Измерительная техника» и «Microscopy and Analysis» (Англия).

Основные положения, выносимые на защиту

4) При использовании микрообъектива с числовой апертурой ИА> 1, максимальный угол зондирования объекта, находящегося в среде с показателем преломления пср, равен агС5Ш и , при условии распространения излучения в конденсоре со средой, показатель преломления которой больше, чем ИА.

Заключение диссертации по теме "Оптика"

4.4 Выводы

Таким образом, для измерения локальных параметров фазовых микрообъектов были разработаны и прошли экспериментальную апробацию микротомографы: » - на основе микроскопа Линника;

- на основе конфокального микроскопа;

- на основе интерферометра с дифракцией на точке с зеркальным иммерсионным конденсором.

Схема микротомографа на основе микроскопа Линника имеет высокую чувствительность измерения ОРХ, объект неподвижен, угол зондирования -90°, траектория зондирования - «квадрат», обеспечивающая минимальную ошибку реконструкции. Однако, при реконструкции по «зеркальным» проекциям объект дополняется своим зеркальным двойником, поэтому необходимо обеспечивать разделение объекта и его отражения, что вносит . дополнительные сложности в оптическую схему.

Микротомограф на основе конфокального микроскопа решает проблему усложнения объекта, так как использует схему «на просвет» с однократным. прохождением излучения. К основным достоинствам схемы относятся: возможность использования фотоприемников с малым числом элементов (матрица ФЭУ), больший угол зондирования - ±50°, траектория зондирования -«квадрат», реализована схема со сканированием объектом, при этом объект не выходит из фокуса, для получения параллельных проекций использован специальный алгоритм. Однако данная схема имеет меньшую чувствительность измерения ОРХ, а особенности зондирования объекта (он располагается между ' двумя покровными стеклами), требует использования иммерсионных объективов с большим рабочим отрезком.

Обе представленные схемы имеют угол зондирования не превышающий ±50°. Для значительного увеличения угла зондирования, был реализован микротомограф с зеркальным иммерсионным конденсором, имеющий максимальный угол зондирования ±63°. Получение фазовых изображений осуществлялось с помощью схемы интерферометра с дифракцией на точке, а реконструкция интерферограмм производилась фурье-методом.

Заключение

В процессе выполнения диссертационной работы были получены следующие результаты:

1)Проведен обзор работ по интерференционной микроскопии и интерференционным микроскопам, а также микротомографии. Рассмотрена возможность автоматизации некоторых типов интерференционных микроскопов.

3)Рассмотрены факторы, влияющие на погрешность измерения массы, сухого вещества клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе по схеме Линника. Показано, что суммарная среднеквадратическая погрешность вычисления сухого веса клетки не превышает двух процентов.

- изменение инкремента показателя преломления эритроцита во , времени, обнаружена периодичность изменения этой величины со средним периодом 25 минут и амплитудой 5% от среднего значения.

7) Рассмотрен метод увеличения угла зондирования микрообъекта в микроскопе и показано, что для этого необходимо использовать иммерсионные объективы (7У/1>1), а зондирующее излучение должно проходить через среду с показателем преломления большим чем ЫА.

Таким образом, в настоящей работе решена актуальная научно-техническая задача разработки интерференционных методов измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов, что имеет существенное значение для оптической микроскопии трехмерных фазовых объектов.

Список источников диссертации и автореферата по физике, кандидата технических наук, Минаев, Владимир Леонидович, Москва

1. Вест Ч. Голографическая интерферометрия. М.: Мир, 1982.-504 с.

2. Скворцов Г.Е., Панов В.А., Поляков Н.И., Федин JI.A. Микроскопы. -Машиностроение.- Ленинград.- 1969г.- 512 с.

3. Метелин В.Б., Минаев В.Л., Валов А.Л., Конрадов А.А., Василенко И.А., Бабакова С.В. Компьютерная фазово-интерференционная микроскопия в биологии и медицине // Сборник научных трудов. -2003.- г. Красноярск. -С. 10.

4. Левин Г.Г., Ковалев А.А., Минаев В.Л., Сухоруков К.А. Оценка точности измерения сухой массы клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе //Измерительная техника.- 2004.-№4 С.62-67.

5. Dunn G. A. Transmitted-light interference microscopy: a technique born before its time // Proceedings of the Royal Microscopical Society.- 1998.- 33.-P.189-196.

6. Barer R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells//Nature.- 1953.-172. P.1097-1098.

7. Barer R., Joseph S. Refractometry of living cells. I. Basic principles// Quart.J.Microscop.Sci. 1954.-95.-P. 399-423.

8. Вишняков Г.Н., Левин Г.Г. Оптические методы измерения двулучепреломления мышечных волокон // Биофизика. 2002. - Т.47. - №4. -С.659-662.

9. Левин Г.Г., Булыгин Ф.В., Вишняков Г.Н. Когерентные осцилляции состояния молекул белка в живых клетках // Цитология. 2005. - Т.47. - №4. -С.348-356.

10. Levin G.G., Bulygin T.V., Kalinin E.V., Vishnyakov G.N. Application of computerized interference microscope for monitoring oscillations of dry cell weight and morphology of the living cells // Proc. SPIE. 2001. - V.4260. - P. 149-154.

11. Levin G.G., Kozinets G.I., Novoderzhkina I.K., Streletskaya E.A., Vishnyakov G.N. Blood cells research using methods of microinterferometry // Proc.SPIE.-1997. -V.2982. -P.490-495.

12. Вишняков Г.Н., Закарян K.C., Левин Г.Г., Стрелецкая Е.А. Исследование оптически прозрачных объектов при помощи томографического микроскопа Линника // Изм. Техника.- 1999.- №1 .-С.46-49.

13. Стрелецкая Е.А., Цыба Н.Н., Козинец Г.И., Левин Г.Г., Вишняков Г.Н. Сопоставление интегральных характеристик лимфоцитов здоровых людей и больных хроническим лимфолейкозом // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. - №4. - С.21-23.

14. Тычинский В. П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов // Успехи физических наук.- 2001.- Т.171.-№6.

15. Тычинский В.П. Компьютерный фазовый микроскоп.- М.: Знание, 1989.-64с.

16. Тычинский В.П. Измерение дробной доли интерференционной полосы методом временных интервалов // Измерительная техника.- 1977.- №12, 39.

17. Creath К. Phase-shifting speckle interferometry // APPLIED OPTICS.-1985.-Vol. 24.- № 18.- P. 3053-3058.

18. Линник В.П. Прибор для интерференционного исследования отражающих объектов под микроскопом ("микроинтерферометр") // ДАН СССР.- 1933.- №1.- С. 18-23.

19. Handbook of Biological Confocal Microscopy.-Edited by J.B.Pawley Plenum Press.- New York and London.- 1990.

20. Лежнев Э.И., Попова И.И., Кузьмин C.B., Слащев С.М. Конфокальная сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 1) // Научное приборостроение.-2001 .-Т. 11.-№2.- С.3-20.

21. Лежнев Э.И., Попова И.И., Кузьмин С.В., Слащев С.М. Конфокальная сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 2) // Научное приборостроение.-2001.-Т.11.-№3.- С.26-42.

22. Laude В., Martino A. De, Drevillon В., Benattar L., Schwartz L.Three-dimensional microscopy through white light interferometry // Proc.SPIE.-2002. -V.4621. -P.l-7.

23. Masahiro Akiba, Kin Pui Chan, Naohiro Tanno En-face optical coherence imaging for three-dimensional microscopy // Proc.SPIE.-2002. -V.4621. -P.8-15.

24. Власов Н.Г. Получение изображений на основе использования когерентных свойств зондирующего излучения. // ЖНПФ.- 1999. т.4. - №5. -С.67-74.

25. Вишняков Г.Н. Трехмерные отображающие свойства оптических систем. Тезисы докладов VI школы по оптической обработке информации, Фрунзе,1986, ч. I, с.198-199.

26. Тихонов А.Н., Бочикашвили П.Н., Гончарский А.В., Матвиенко А.Н., Pay Э.И., Савин Д.О., Степанов В.В. Микротомография слоистых сред в конусных пучках//ДАН.- 1987.- Т.296.-№5.- С. 1095-1097.

27. Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. Tomographic interference microscopy of living cells //Microscopy and Analysis.-2004.-87.-p. 19-21.

28. Kawata S., Nakamura O., and Minami S. Optical microscope tomography. I. Support constraint. J.Opt.Soc.Am. A, 1987, v.4, pp.292-297.

29. Vincent Lauer. Observation of biological objects using an optical diffraction tomographic microscope. Proc. SPIE, 2000, vol. 4164, p. 122 - 133.

30. Dlugan A, MacAulay C, Lane P. MICROSCOPIC OPTICAL TOMOGRAPHY // 7th Congress of the European Society for Analytical Cellular Pathology, 1-5 April 2001, report Z003. http://www.bccrc.ca/ci/qmO 1 main.html

31. Vishnyakov G.N., Levin G.G., Zakerian C.S. Interferometric computed microtomography of 3D phase objects // Proc. SPIE.- 1997.- V.2984.- P.64-71.

32. Vishnyakov G.N., Levin G.G. Optical tomography of living cells using phase-shifting Linnik microscope // Proc. SPIE.- 1998.- V.3568.- P.l97-200.

33. Carol J. Cogswell, Kieran G.Larkin, Hanno U. Klemm Fluorescence microtomography: Multi-angle image acquisition and 3D digital reconstruction // Proc. SPIE.- 1996.- V.2655.- P.109-115.

34. Kozubek M., Skalnikova M., Matula Pe., Bartova E., J. Rauch Automated microaxial tomography of cell nuclei after specific labeling by fluorescence in situ hybridization // Micron.-2002.-33.-655-665.

35. Matula P., Kozubek M., Staier F., Hausmann M. Precise 3D image alignment in micro-axial tomography// Journal of Microscopy.-2003.-V.209., P.126-142.

36. Бекетова A.K. и др. Топографическая интерферометрия фазовых объектов. JL: Наука, 1979.-232 с.

37. Малакара Д. Оптический производственный контроль.— М.: Машиностроение, 1985.42.http://www.optics.arizona.edu/jcwyant/Optics513/ChapterNotes/Chapter05/ PrintedVersionPhaseShiftingInterferometry.pdf

38. Васильев В.Н., Гуров И.П. Компьютерная обработка сигналов в приложении к интерферометрическим системам СПб.:БХВ-Санкт-Петербург, 1998.

39. Takeda M., Mutoh К. Fourier transforms profilometry for the automatic measurement of 3D object shapes. Applied Optics, 22, 1983, 3977-3982.

40. Патент №922816 (СССР). Устройство для обработки изображений. Левин Г.Г., Э.Г. Семенов, заявл. 15.08.78.

41. Левин Г.Г., Вишняков Г.Н. Оптическая томография. М.: Радио и связь, 1989.-224 с.

42. Проблемы когерентной.и нелинейной оптики. Под ред. Гурова И.П., Козлова С.А. СПб, 2004.

43. Вишняков Г.Н., Левин Г.Г., Минаев В.Л. Томографическая микроскопия трехмерных фазовых объектов в пространственно-некогерентном свете// Оптика и спектроскопия. 2003.- том 95.- №1. - С. 131-135.

44. Патент №2140661 (Россия). Способ конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии и конфокальный сканирующий томографический микроскоп. Левин Г.Г., Вишняков Г.Н., Булыгин Ф.В., заявл. 19.03.99.

45. Минаев В.Л. Конфокальный микроскоп для интерференционной томографии фазовых объектов: Тез. докл. Научная сессия МИФИ-2003.- М., 2003.-С. 210-211.

46. Вишняков Г.Н., Левин Г.Г., Лихачев А.В., Пикалов В.В. Фазовая томография трехмерных биологических микрообъектов: численноемоделирование и экспериментальные результаты. Опт. и спектр., 1999, т.87, №3, с.448-454.

47. Линник В.П. Прибор для интерференционного исследования отражающих объектов под микроскопом ("микроинтерферометр"). ДАН СССР, 1933, №1, с.18-23.

48. Борн М., Вольф Э. Основы оптики. М.: Наука, 1970.-856 с.

49. Ковалев А.А., Сухоруков К.А. Восстановление формы волнового фронта при больших изменениях фазы // Измерительная техника. 2004. - № 4 -С. 17-19.

50. Пятницкий A.M., Соколинский Б.З. Методика и применение автоматизированной эритроцитометрии. Литературный обзор// http://mecos.ru.62. http://www.promix.ru/articles/02.html

51. Вышенская Т. В., Кретушев А.В. и др. Квазипериодические изменения фазовой высоты отдельно взятой митохондрии, индуцированные работой мембранных протонных насосов//Биологические мембраны.- 2002.- Т.19, №6, 491-498.

52. Barer R., Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in livinq cells. Nature, -1953. -172. P. 1097-1098.

53. Barer R., Joseph S., Refractometry of living cells. I. Basic principles. Quart.J.Microscop.Sci. -1954. 95. - P. 399-423.

54. Введение в количественную цитохимию. Пер. с англ./Ред. В.Я. Бродский-М.: Мир, 1969.-439с.

55. Минаев В. Л., Сухоруков К.А. Реализация метода динамической фазовой микроскопии: Тез. докл. Седьмая международная научно-техническая конференция «Оптические методы исследования потоков».-М.,2003.- С. 75.

56. Bekker A.M., Levin G.G. Tomographic study of objects with reflecting surfaces //Proc. SPIE. 1991. V.1843. P.31-40.

57. Вишняков Г.Н., Левин Г.Г. Томографический микроскоп Линника для исследования оптически прозрачных объектов // Изм. техника. 1998. - №10. -С. 18-22.

58. Патент №2145109 (Россия). Способ оптической томографии трехмерных микрообъектов и микроскоп для его осуществления. Левин Г.Г., Вишняков Г.Н., заявл. 09.03.99.71. http://www.itam.nsc.ru/lab 17/WIN/rw-pick.htm

59. Ландсберг Г.С. Оптика//М.- «Наука».-1976.-928 с.

60. Medicki Н., Tejnil Е., Goldberg К., Bokor J. Phase-shifting point diffraction interferometer// OPTICS LETTER.- 1996.- V.21.-No.l9.-P.1526-1528.

61. Минаев В.Л. Улучшение качества интерференционных томографических проекций: Тез. докл. Девятая международная научно-техническая конференция «Оптические методы исследования потоков».-М.,2005.- С. 498.