Оптические методы исследования интегральных и локальных параметров голографических дифракционных структур тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

На правах рукописи

Горяинова Ирина Валерьевна

ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИНТЕГРАЛЬНЫХ И ЛОКАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ГОЛОГРАФИЧЕСКИХ ДИФРАКЦИОННЫХ СТРУКТУР

01.04.05 - оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

ЧУМ№

Москва 2008

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии «Всероссийский научно - исследовательский институт оптико-физических измерений» (ФГУП «ВНИИОФИ»)

Научный руководитель: доктор технических наук,

профессор Г.Г. ЛЕВИН

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Г.И. ВАСИЛЕНКО

кандидат физико-математических наук, Т.В. ЯКОВЛЕВА

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего

профессионального образования "Московский государственный институт радиотехники, электроники и автоматики (технический университет)"

Защита состоится « 21 » мая 200В г. в 15 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д308.006.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте оптико-физических измерений по адресу: 119361, г. Москва, ул. Озерная, 46

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ВНИИОФИ» Автореферат разослан « 4 » 0 4_20(Э^г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук

Г.Н. ВИШНЯКОВ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГДС - голографические дифракционные структуры

ГОЭ - голографические (или голограммные) оптические элементы

ДЭ - дифракционный элемент

ГЗУ - голографические запоминающие устройства

ТМГ - точечно-матричная голография

ЭЛЛ - электронно-лучевая литография

ОГ - оптическая голография

ФИМ - флуоресцентно-интерференционный микроскоп ФЭУ - фотоэлектронный умножитель

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В данной диссертации разрабатываются оптические методы исследования локальных и интегральных параметров голографических дифракционных микроструктур

Голограммы и топографические дифракционные структуры находят широкое применение в различных областях науки и техники Они используются для создания голо-графической памяти, измерения деформации поверхности различных изделий, коррекции аберраций оптических систем, создания различных оптических элементов, измерений параметров быстропротекающих процессов Также топографические дифракционные структуры различных типов используются для маркировки документов и товаров с целью защиты от подделки

Широкое использование голографических дифракционных структур привело к необходимости разработки методов регистрации их параметров, в том числе характеризующих микроструктуру Среди них важное место занимают оптические методы исследования, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с неоптическими, например, зондовыми методами Этими преимуществами являются неразрушающее воздействие оптического излучения на исследуемый объект, возможность проникновения оптического излучения внутрь исследуемого объекта, а также возможность исследовать с помощью оптического излучения физико-химические свойства материала объекта Поэтому в организациях, связанных с изготовлением голограмм или экспертизой их подлинности, используется такое оптическое оборудование как спектрометры, гониометры, лазеры, а также оптические микроскопы различных типов

В то же время, применение оптических методов для исследований субмикронных объектов, к которым относятся топографические дифракционные структуры, связано с рядом трудностей, обусловленных тем, что длина волны оптического излучения видимого диапазона близка к характерным размерам таких структур В ряде случаев это не позволяет с требуемой точностью определять локальные параметры субмикронных объектов

Кроме того, исследование массивов оптических микроструктур, к которым относятся дифракционные оптические элементы и голограммы, показало, что полное описание их оптических свойств не может быть получено на основе данных об их локальных параметрах Поэтому для совершенствования технологии расчета, синтеза и контроля качества таких объектов, необходима разработка методов, позволяющих определять микрохарактеристики их структуры по результатам измерений интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения

Широкое распространение голографических дифракционных структур, используемых для защиты документов и ценных бумаг, требует разработки соответствующей нормативной базы, поскольку не существует ГОСТов, определяющих требования к голо-графическим дифракционным структурам В начале 80-х годов XX века была начата разработка проекта ГОСТа «Голографические измерения Термины и определения», но она не была закончена В настоящее время в России нормативы на защитные голограммы ограничиваются руководящими документами государственных лицензирующих органов Данные документы классифицируют голограммы по ряду параметров, заявляемых изготовителем, но не предполагают контроль этих параметров Тем более в этих документах не указаны методики анализа и их аппаратурное обеспечение

Разработка методов и аппаратуры, которые позволили бы определять и рассчитывать параметры, характеризующие визуальные свойства голографических дифракционных структур, как на стадии производства, так и при экспертизе подлинности, представляется весьма актуальной

Развиваемые в работе методы исследования и контроля голографических дифракционных элементов могут быть применены для исследования трехмерных дифракционных структуру другой природы, например, биологических клеточных структур и живой клетки Результаты исследований, получаемые этими методами, могут быть использованы в области биотехнологий для решения задачи исследования динамики транспорта лекарственных препаратов внутри живой клетки и их воздействия на органеллы клетки

Таким образом, задача разработки оптических методов исследования локальных и интегральных параметров голографических дифракционных структур, решаемая в данной диссертационной работе, представляется весьма актуальной

Цель работы

Целью диссертационной работы является разработка методов, установок и программного обеспечения, предназначенных для исследования оптических свойств ГДС на основе анализа их микроструктуры и интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения, а так же распространение разработанных методов на исследование трехмерных субмикронных структур биологического происхождения

Достижение данной цели требует решения следующих научно-технических задач

1 Разработка математической модели взаимодействия оптического излучения с ГДС, проведение математического моделирования процесса его распространения и установление связи между его интегральными и локальными параметрами

2 Определение характеристик, описывающих оптические свойства голографиче-ских дифракционных структур, и установление их связи с параметрами их микроструктуры и параметрами взаимодействовавшего с ГДС оптического излучения

3 Разработка методов и создание аппаратуры для получения изображений микроструктуры ГДС и регистрации интегральных и локальных оптических параметров ГДС

4 Разработка методов расчета параметров ГДС по изображениям их микроструктуры и создание программного обеспечения для автоматизации процессов регистрации и обработки изображений микроструктуры

5 Разработка методов расчета параметров ГДС по полученным интегральным и локальным характеристикам взаимодействовавшего с ГДС оптического излучения, включающая в себя математическое моделирование и создание программного обеспечения для автоматизации процесса регистрации данных, обработки изображений и проведения расчетов

6 Разработка методов и создание аппаратуры для получения изображений живых клеток с различными типами контраста и создание программного обеспечения для расчета распределения параметров внутри биологических объектов путем совместной обработки полученных изображений

Научная новизна

Научная новизна заключается в том, что впервые была разработана совокупность оригинальных методов и средств для регистрации и обработки изображений ГДС и биологических микрообъектов, а так же для расчета их параметров по полученным изображениям К основным результатам относятся

1 Критерий выбора шага дискретизации для математической модели распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа с учетом распределения фазы волнового фронта лазерного излучения вдоль оси распространения

2 Метод регистрации распределения мощности в сечении лазерного пучка путем томографической реконструкции по одномерным проекциям, полученным в результате поперечного сканирования пучка интегрирующим приемником излучения - оптическим световодом

3 Автоматизированная установка, которая позволяет проводить количественное определение совокупности параметров ГДС характеризующих их визуальное качество

4 Установка для регистрации и расчета одновременно 3-х и более оптических параметров ГДС в автоматическом режиме

5 Метод повышения контраста изображений микроструктуры ГДС с прозрачным защитным слоем за счет одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения

6 Экспериментальный образец флуоресцентно-интерференционного микроскопа, позволяющий получать изображения биологического объекта - живой клетки с малым временем регистрации и с различными видами контраста, в том числе с фазовым и флуоресцентным, без перемещения исследуемого биологического объекта

Практическая значимость работы

1 Предложенный томографический метод измерения интенсивности в сечении лазерных пучков при помощи сканирования оптическим световодом,может быть использован для создания дистанционного малогабаритного датчика параметров пучков мощных технологических лазеров Полученные в ходе диссертационной работы результаты использовались в научно-исследовательской работе по совершенствованию методов измерения параметров пучков (шифр «Фокус»), проводившейся во ФГУП ВНИИОФИ. в 20042006 гг

2 Разработанная автоматизированная установка, моделирующая восприятие изображения ГДС экспертом - наблюдателем, позволяет проводить автоматизированную идентификацию ГДС по визуальным параметрам, создавать базы данных визуальных параметров различных ГДС, осуществлять контроль качества и износостойкости ГДС, а так же является аппаратурным обеспечением для разработки стандартов качества ГДС Принципы построения данной автоматизированной установки использовались в ходе исследований системных вопросов проектирования аппаратуры для обеспечения контроля визуального качества голограмм в НИИ «Гознак» - Филиал ФГУП «Гознак»

3 Разработанная автоматизированная установка для измерения параметров оптических ГДС может использоваться при исследовании оптических свойств и конструировании широкого круга оптических элементов, основанных на ГДС В фирме «Крипто-Принт» проводились исследования защитных меток типа Фурье-голограмм, что позволило усовершенствовать метод синтеза микроструктуры меток данного типа и привело к повышению их оптических характеристик

4 Предложенный в работе метод повышения контраста изображения микрообъектов путем применения одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения позволяет расширить возможности современных металлографических микроскопов

5 Флуоресцентно-интерференционный микроскоп позволяет получать изображения живой клетки с различивши видами контраста и малым временем регистрации, что даст возможность изучать динамику внутриклеточных процессов, в частности транспорт и воздействие лекарственных препаратов на органеллы клетки При помощи флуоресцентно-интерференционного микроскопа были исследованы легочные макрофаги, инфицированные палочкой Коха Исследования проводились в НИИ фтизиопульмонологии ММА им И М Сеченова, в Институте Ревматологии РАМН

Апробация работы

Основные результаты и положения данной диссертационной работы докладывались на следующих семинарах

- Международной конференции «Оптическая диагностика живых клеток» (Сан-Хосе, США,2001),

- XV Научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» (Москва, 2005),

- Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом Наука и практика» (Москва, 2006),

- XVI Научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» (Москва, 2007)

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 4 работы опубликованы в научных журналах и тематических сборниках

Структура диссертационной работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы Структура диссертационной работы отражает цели и решения поставленных задач

Общий объем составляет 157 страницы, включая 33 таблиц и 66 рисунков и список использованных источников из 106 наименований

Научные положения, выносимые на защиту

1 При численном моделировании дифракции оптического излучения на топографических дифракционных структурах шаг дискретизации пространственного распределения определяется из соотношения

_ Р1 "тт £ Я'

где £> - поперечный размер волнового фронта, Л - длина волны излучения, Ь - расстояние от выходной апертуры излучателя до исследуемого сечения

2 Мощность излучения, выходящего с торца световода, введенного в исследуемый пучок, перпендикулярно его оси, описывается интегралом Радона от искомого распределения интенсивности в сечении пучка

3 Совместная обработка угловых и спектральных характеристик изображений, создаваемых оптическими голограммами, позволяет полностью определить параметры схемы записи таких голограмм

4 Коэффициент корреляции между фазовым и флуоресцентным изображениями живой клетки позволяет определить распределение концентрации флуорофора в живой клетке

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Во введении приводится литературный обзор существующих ГДС, методов исследования их визуальных параметров и параметров микроструктуры при помощи современных методов исследования, а также рассматриваются существующие в настоящее время методы обработки оптической информации Проведен аналитический обзор, посвященный методами исследования живых клеток в биологии и медицине Рассмотрены методы для измерения параметров лазерного излучения, которое необходимо для исследования локальных и интегральных параметров ГДС и биологических структур

Во введении обоснована актуальность темы, определены цели и задачи, отмечена научная новизна и практическая значимость диссертации, сформулированы положения, выносимые на защиту

Первая глава

Первая глава посвящена теоретическим и экспериментальным методам исследования дифракции оптического излучения на микроструктурированной поверхности голо-графических дифракционных структур с целью последующего исследования их интегральных характеристик

Для понимания процессов распространения излучения после взаимодействия с амплитудно-фазовыми структурами, которыми являются ГДС, возникла задача моделиро-

вания процесса распространения лазерного пучка при известных пространственных распределениях интенсивности и фазы волнового фронта лазерного излучения в одном произвольном сечении, перпендикулярном оси распространения

Для описания лазерных пучков широко используются приближенные методы решения уравнений для электромагнитных полей в свободном пространстве с соответствующими граничными условиями Одним из таких методов является метод Кирхгофа с учетом фазы волнового фронта Поэтому, возникла идея моделирования процесса распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа

На первом этапе моделирования был проведен эксперимент по регистрации распределения интенсивности и интерферограмм волнового фронта лазерного излучения Для этих целей была разработана экспериментальная установка, которая позволила сформировать астигматический пучок с перетяжками и зарегистрировать распределения интенсивности и интерферограммы волнового фронта в произвольном сечении пучка

Регистрация сечений проводилась через каждые 20 см на протяжении 5 м Первое сечение было зарегистрировано на расстоянии 33 см от выходной апертуры лазера В результате эксперимента было зарегистрировано 2 перетяжки лазерного излучения первая перетяжки на расстоянии 223 см, вторая - на расстоянии 432 см от выходной апертуры лазера

Второй этап моделирования состоит в расшифровке и обработке полученных изображений распределений интенсивности и интерферограмм волнового фронта лазерного излучения

Для расшифровки и обработки, полученных интерферограмм, использовался программно-аппаратный комплекс "ФАСТ", в основе которого лежит метод фазовых шагов

Для моделирования распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа используются численные методы При этом граничные условия задаются в виде сетки дискретных значений Эта сетка соответствует размерности ПЗС - матрицы, с помощью которой регистрируются распределения интенсивности и интерферограммы в поперечном сечении пучка

Введение дискретных источников в интеграл Кирхгофа приводит к возникновению дифракционных эффектов, обусловленным наличием резких границ В связи с этим большое значение имеет выбор шага дискретизации изображений распределений интенсивности и интерферограмм волнового фронта Если шаг дискретизации выбран не правильно, то возникает компьютерный аналог эффекта Тальбота В связи с этим необходим критерий для выбора шага дискретизации

При рассмотрении на дискретных отсчетах, математическую модель описания лазерных полей методом Кирхгофа можно рассматривать, как модель дифракционной решетки Тогда ход лучей представлен на рисунке 1

1 порядок А А

Ъ

Г)

1 1 о

© / -К+

Рисунок 1 - Ход лучей в дифракционной решетке

Из рисунка 1 видно, что расстояние от выходного отверстия лазера до исследуемой плоскости лазерного пучка £ =—, где О - поперечный размер пучка и угол расходи-

&

мости 0„ =—, а так как заложено условие, что порядки не перекрываются, то должно вы-

полняться условие (2)

£1 ' ЬЯ

(2)

где п - число дискретных отсчетов на линейном размере О, й - линейный размер изображения, X - длина волны лазерного излучения

Из численного анализа следует, что на заданном расстоянии Ь получить описание пучка можно только при условии п > пт,„, где «„„„- минимальное число разбиений, вычисленное по формуле (2) Следовательно, зная число дискретных отсчетов, которое требуется для получения описания процесса распространения лазерного пучка, можно провести процедуру моделирования процесса распространения

Шаг дискретизации изображений распределений интенсивности и интерферо-грамм волнового фронта, рассчитанный по формуле (2), был использован при численном моделировании процесса распространения лазерного излучения В процессе моделирования были получены 2 набора пространственных распределений на расстояниях Ь = 173 -

593 см от выходной апертуры лазера, для двух начальных сечений взятых на расстояниях 33 см и 53 см соответственно Для каждого набора были определены ширины лучей с1ах, Аа> На рисунках 3 и 4 представлены зависимости ширины луча , с1ау в зависимости от расстояния от лазера до расчетной плоскости, для двух наборов распределений, соответственно

3002503001501000'

-доя рвспрц&тния!

173 ИЗ 253 283 333 373 413 453 53! «83 I, счраккммеотлаэчя

Рисунок 3 - Зависимость ширины луча с1ах от расстояния I до исследуемого сечения

Рисунок 4 -Зависимость ширины луча от расстояния Ь до исследуемого сечения

Полученные в процессе моделирования результаты сравнивались с экспериментальными данными В результате было установлено, что, независимо от того, какое сечение вдоль оси распространения лазерного пучка берется в качестве базового для моделирования процесса распространения пучка, для экспериментальных и расчетных данных фокусное расстояние по каждой из осей пучка совпадает, и совпадают ширины пучка в фокусе

Следовательно, для определения характера распространения лазерного пучка достаточно получить распределение интенсивности и интерферограммы волнового фронта лазерного излучения в одном произвольном сечении пучка перпендикулярно его оси и провести математическое моделирование методом Кирхгофа с учетом фазы волнового фронта на требуемые расстояния

Другим методом определения интегральных параметров лазерного излучения является томографический метод Целью предлагаемого метода является возможность получения распределения интенсивности по сечению пучка при помощи точечного приемника излучения, который является более точным по сравнению с применением ПЗС- камеры, обладающей неравномерностью чувствительности по площади регистрации

В основе математического аппарата томографии лежит интегральная геометрия, и в первую очередь преобразование Радона Поэтому, предлагаемый в работе томографический метод основан на интеграле от распределения энергии в сечении пучка пр выделенному направлению

В предлагаемом методе исследуемый лазерный пучок сканируется оптическим световодом, изготовленным из материала, обладающего высокой лучевой стойкостью, например, стекла, кварца или лейкосапфира При рассеянии излучения на неоднородностях поверхности световода часть излучения рассеивается внутрь него и «запирается» вследствие полного внутреннего отражения Предполагается, что коэффициент такого рассеяния а одинаков по всей длине палочки и вследствие этого мощность излучения, высвечивающегося с торца световода пропорциональна мощности излучения, падающего на его поверхность

Нетрудно показать, что эта величина пропорциональна интегралу Радона от распределения интенсивности по сечению пучка, взятому по линии проходящей через ось световода

Здесь Р(Х) - мощность излучения, рассеянного поверхностью световода и «запертого» в нем, хну- ортогональные координаты в плоскости, перпендикулярной оси лазерного пучка, ось х горизонтальна, /(х,у) - распределение интенсивности излучения, еЬ - приращение длины вдоль прямой Ь

Зависимость величины Р{1) от положения световода представляет собой одномерную томографическую проекцию от распределения интенсивности по сечению пучка Получив набор таких проекций при разных углах направления движения световода сквозь

(2)

£

пучок можно осуществить томографическую реконструкцию распределения интенсивности в сечении лазерного пучка

В качестве световода использовалась стеклянная палочка диаметром 2 мм и длиной 150 мм

Для проверки предположения о постоянстве коэффициента а были проведены исследования оптических свойств световода, результаты представлены на рисунке 6 По оси абсцисс 5 отложена линейная координата вдоль оси световода, отсчитываемая от торца По оси ординат - АР относительная мощность, излучаемая с торца волновода, пропорциональная току ФЭУ

£ ММ

Рисунок 6 - Зависимость относительной мощности АР, излучаемой с торца волновода, от координаты центра лазерного пучка

Из полученных результатов следует, что при позиционировании лазерного пучка на расстояние более 75 мм от торца световода отклонение значений тока ФЭУ, пропорционального мощности излучения, выходящего с торца не превышало 12% относительно среднего значения Именно эта область поверхности световода использовалась для томографических измерений распределения энергии в сечении лазерного пучка Полученную величину отклонения тока ФЭУ от среднего значения можно принять в качестве величины амплитудной погрешности проекционных данных, что считается вполне приемлемым в оптической малоракурсной томографии Таким образом, была подтверждено предположение о том, интенсивность излучения, выходящего из торца использованного световода, пересекающего лазерный пучок, пропорциональна интегралу Радона вдоль световода от распределения интенсивности в исследуемом пучке

В качестве исследуемого пучка использовался расширенный пучок гелий-неонового лазера, пропущенный через непрозрачный транспарант с двумя отверстиями,

так чтобы имитировать пучок с несимметричной по радиусу пучка модовой структурой, схема представлена на рисунке 7

1 -сечение исследуемого лазерного пучка, 2 -зондирующий световод, 3 -ФЭУ

Рисунок 7

Трехмерное изображение сечения пучка представлено на рисунке 8

Рисунок 8 - Профиль интенсивности в поперечном сечении пучка, изображение, полученное цифровой камерой с матированной поверхности стекла

В ходе эксперимента путем поворота зондирующего световода в плоскости, перпендикулярной оси исследуемого пучка было получено б проекций сечения пучка под углами <р, соответственно, 0, 30, 60,90,120 и 150 градусов

Обработка экспериментальных результатов и томографическое восстановление изображения объекта проводилось при помощи программного пакета «Томо» Пакет предназначен для решения 2-мерной томографической задачи восстановления функции 2-х координат по одномерным томографическим проекциям В основе программы лежат метод Фурье-синтеза и итерационный алгоритм Гершберга, что, в принципе, позволяет использовать эту программу при ограниченном наборе данных

Для определения погрешности реконструкции, обусловленной конечностью набора проекционных данных, было проведено математическое моделирование, в ходе которого проводилась томографическая реконструкция распределения интенсивности по одномерным модельным проекциям Получение модельных проекций проводилось при помощи численного преобразования Радона от цифрового массива, описывающего изображение сечения пучка

Реконструкция проводилась для двух наборов модельных проекций Первый набор состоял из 6 проекций, полученных под углами от 0 до 150 и соответствовал постановке реального эксперимента Второй набор состоял из 17 проекций, полученных под углами от 0 до 170 градусов

На рисунке 9 представлены результаты томографической реконструкции изображение сечения пучка по 6 экспериментальным проекциям

Рисунок 9 - Профиль интенсивности в поперечном сечении пучка, реконструированный по экспериментальным измерениям, 6 проекций

Из сравнения реконструированного изображения и реального изображения сечения пучка следует, что восстановленное изображение отражает основные характерные особенности распределения интенсивности в сечении пучка Результаты реконструкции позволяют однозначно определить модовую структуру пучка и соотношение интенсивности мод Погрешность реконструкции экспериментальных данных составляет 18%, а погрешность определения координат центров тяжести составляет 10%

Представленные в данной главе теоретические и экспериментальные методы исследования параметров оптического излучения позволили понять процесс распростране-

ния данного излучения после взаимодействия с топографическими дифракционными структурами и определить ряд задач для исследования их интегральных параметров

Вторая глава

Вторая глава посвящена описанию разработанных методов и установок для исследования интегральных характеристик изображений, создаваемых ГДС

Качество топографических дифракционных структур для внешнего наблюдателя определяется, прежде всего, их визуальными оптическими свойствами, которые могут быть охарактеризованы следующими оптическими параметрами

- яркость и ее равномерность по полю изображения при различных углах наблюдения,

- величина угла обзора в горизонтальной и вертикальной плоскостях,

- наличие объемности изображения,

- наличие кинематического эффекта (изменение формы изображения при изменении угла наблюдения),

- наличие участков изображения с различным цветом при одном; и том же угле наблюдения (наличие цветоделенных составляющих)

По совокупности вышеперечисленных свойств можно производить визуальную экспертную оценку топографических дифракционных структур

Указанные визуальные оптические свойства присущи практически всем гологра-фическим дифракционным структурам, только выражены они в разной степени, и зависят от их микроструктуры

Разработанные в рамках диссертационной работы алгоритмы и аппаратура для исследования интегральных параметров ГДС позволяют определять параметры для каждого сегмента голограммы, который имеет свою схему записи В среднем, для анализа параметров одной топографической дифракционной структуры требуется обработать порядка 200-300 изображений, создаваемых ГДС Таким образом, задача исследования интегральных параметров состоит в том, чтобы проводить съем изображений, создаваемых ГДС, в одних и тех же условиях, не зависимо от внешних источников излучения, и использовать одни и те же алгоритмы совместной обработки полученных изображений

Связь визуальных оптических параметров изображения, создаваемого топографической дифракционной структурой, и ее физическими макрохарактеристиками представлена в таблице 1

Таблица 1 18

Визуальные оптические свойства Физическая макрохарактеристика

Яркость изображения под разными углами наблюдения Дифракционная эффективность (ДЭ) и ее угловая зависимость

Равномерность яркости изображения Постоянство ДЭ по площади ГЗЗ

Угол обзора по горизонтали Диапазон углов горизонтального параллакса изображения

Диапазон радужного эффекта по вертикали Угол обзора по вертикали

Объемность изображения Наличие параллакса по горизонтали

«Чистота» цвета элементов изображения Спектральная дисперсия

Наличие участков изображения с различным цветом Наличие на ГДС участков с различным периодом решетки по вертикали

Изменение изображения при различных ракурсах наблюдения Наличие кинематических эффектов

Для исследования интегральных параметров ГДС была разработана автоматизированная установка и программное обеспечение «Контроль», которые позволяют регистрировать изображения, создаваемые ГДС, и проводить расчет параметров, представленных в таблице 1

Локальные параметры оптических ГДС, в связи с особенностями микроструктуры, могут быть определены только по исследованию интегральных параметров, взаимодействовавшего с ними оптического излучения Для этого необходимо частичное воспроизведение оптической схемы, по которой данные голограммы записывались

Параметры, характеризующие оптические ГДС, приведены в таблице 2 В рамках диссертационной работы была разработана автоматизированная установка для исследования локальных параметров оптических голограмм, которая представляет собой модифицированную установку для исследования интегральных параметров ГДС

Таблица 2

Тип голограммы 20 20 + 2Б ЗБ Мультиплексные Объемные

Параметр

Расстояние до щели £ I I I

Число щелей п п п п

Угол щели а„ а„ а„ а„

Ширина щели <4 <4. 4, 4.

Цвет зоны Хп л„ Лп л„

Форма 2 Б зоны & & & 5„

Глубина ЗБ сцены - АЬ„ Мп АЬп

Форма ЗВ объекта Ъ я. Ъ

Число ракурсов т м

Автоматизированная установка для исследования параметров оптических голограмм осуществляет частичное воспроизведение оптической схемы записи голографиче-ских дифракционных структур

Связь регистрируемых параметров оптического изображения, создаваемого ГДС с параметрами микрорельефа и физическим параметрами отраженного оптического излучения приведены в таблице 3

Принцип действия автоматизированной установки для измерения параметров оптических ГДС заключается в следующем

При освещении ГДС лазерным светом под упом 45° к плоскости ГДС, соответствующим условию наилучшего наблюдения, производится сканирование по углу наблюдения с помощью телекамеры При этом если угол между ракурсом наблюдения и падающим пучком совпадает с углом схождения пучков, который был при записи цветоделен-ной составляющей, то на поверхности ГДС наблюдается яркое изображение щели Производя сканирование по углу наблюдения и соответствующую регистрацию угловых значений, можно измерить такие параметры как число щетей п, угол схождения пуков при записи щели а„, ширину щели с1п При наблюдении ГДС в белом свете можно наблюдать изображение каждой цветоделенной составляющей в своем цвете

Измерение параметра цвета может быть осуществлено с помощью цветной телекамеры или черно-белой телекамеры, снабженной системой цветных светофильтров При освещении голограммы пучком, являющимся комплексно сопряженным по отношению к опорному пучку, восстанавливается мнимое изображение объекта, локализованное,

как правило, в плоскости самой голограммы, и действительное изображение щели При этом изображение щели можно наблюдать на матовом экране Расстояние между экраном и голограммой, при котором щель видна наиболее резко, соответствует значению параметра Ь Аналогичным образом может быть измерена величина АЬ„

Таблица 3

Измеряемый параметр Параметр микрорельефа Параметр отраженного оптического излучения

Ширина щели Разброс величины периода Ай АХ - сегмента

Угол щели Период штрихов цвет

Количество щелей Распределение периодов по фракталам Количество дискретных цветоделенных составляющих

Расстояние до щели Размер фрактала Не связано

Угол обзора по вертикали Параметры вертикальных штрихов и форма и размер фракталов Максимальный разброс в цвете

Угол обзора по горизонтали Параметры вертикальных штрихов и форма и размер фракталов Рассеяние в горизонтальной плоскости

Глубина сцены (параллакс) Сложно определить Пространственная составляющая излучения

30 форма Сложно определить Пространственная составляющая излучения

Разработанное программное обеспечение «Расчет параметров ОГ» позволяет определять геометрические параметры схемы записи оптических голограмм Основные параметры, приведенные в таблице 3, определяются методами, описанными ниже Угол обзора по горизонтали

Для расчета угла обзора по горизонтали а гор необходимо просмотреть все изображения, которые были сняты под различными углами наблюдения по горизонтали от -60° до 60° с заданным шагом При этом угол по вертикали должен быть равен 0° Расчет угла обзора по горизонтали по формуле (3)

ОС гор = а щах - ССтт (3)

Угол обзора по вертикали

Угол обзора по вертикали определяется аналогично углу обзора по горизонтали по формуле (4)

Для расчета угла обзора по вертикали а крт используются изображения, которые были сняты под различными углами наблюдения по вертикали от -60° до +60° с заданным шагом При этом угол по горизонтали должен быть равен 0° Глубина планов

Для 20/30 радужных голограммы существует параметр глубины трехмерной сцены ЛЬп - расстояние между 2Б- компонентами Для расчета данного параметра необходимо наличие двух изображений голограммы, которые были сняты при следующих условиях угол по вертикали а верт=0° углы по горизонтали щ,

Передний план является базовым планом, относительно которого будет проводиться расчет Расстояние ¿2, определяется между базовым и п-ым планами

На первом изображении голограммы выбирается точка соответствующая произвольному элементу Э1 первого плана А(хьУ0 и точка соответствующая произвольному элементу Э2 второго плана В (х2,у2)

На втором изображении голограммы выбираются те же точки, но он будут несколько смещены относительно друг друга, соответствующие элементу Э1 первого плана А' (хэ,уз) и элементу Э2 второго плана В' (Х4,у4>

Расстояние между планами Л? определяется по формуле (5)

где а 1 - угол, на котором снято первое изображение голограммы, а 2 - угол, на котором снято второе изображение голограммы, Хь Хг, х3, х4 - координаты точек Для расчета расстояние от базовой плоскости до п-го плана на первом изображении голограммы выбирается точка соответствующая произвольному элементу Э) первого плана А(х1,у0 и точка соответствующая произвольному элементу Э„ п-ого плана В (хг,у2) На втором изображении голограммы выбираются те же точки соответствующие элементу Э] первого плана А' (х3,у3) и элементу Э„ п-ого плана В' (Х4,у4) Далее проводится расчет по формуле (5)

Соотношение И.С:В

(4)

Бтфз;, -аг |)

(5)

Соотношение RGB позволяет охарактеризовать цвет элемента голограммы с одинаковым периодом решетки по вертикали Каждому элементу соответствует свой цвет Для этого при помощи мыши выделяется круглая область с центром в произвольной точке Проведя усреднение значения параметров R G В по данной области рассчитывается значение этих параметров соответствующее данному элементу

Параметры щелей

При освещении сегмента ГДС лазерным светом под углом 45° к плоскости ГДС и производя сканирование по углу наблюдения и соответствующую регистрацию угловых значений, можно измерить параметры схемы записи

- число щелей п,

- угол схождения пуков при записи щели ап,

- ширину щели d„

Число щелей п определяется сканированием по углу наблюдения, и соответствующее изображение записывается в компьютер По данному изображению рассчитывается ширина щели

Для расчета ширины d „ и угола схождения пуков при записи щели а„, осуществляется фильтрация изображения для отсекания шумов и рассчитывается центр массы изображения Через него проводится горизонтальная и вертикальная линии Пересечение границ щели с горизонтальной линиией определяет ширину щели Зная координаты точки центра изображения (Хц.„,уци), координаты точки центра масс изобоажения (xUil!yItM), расстояние L от телекамеры до матового стекла, на котором наблюдаются щели и угол а„ , на котором было снято изображение, можно определить угол щели по формуле (6)

а. = а. -2 arctg((6)

Данные параметры вычисляются для каждой щели, соответствующей одному сегменту голограммы

Таким образом, совместная обработка угловых и спектральных характеристик изображений, создаваемых оптическими голограммами, позволяет полностью определить параметры схемы записи таких голограмм

В рамках диссертационной работы были проведены исследования голограмм оптического типа на автоматизированной установке определения интегральных параметров оптических дифракционных элементов Полученные эксперементальные и расчетные данные совпадали с данными, полученными от производителей исследуемых голограмм

Так же в работе приводится описание разработанного программного обеспечения подготовки данных «Подготовка ОГ» для формирования оптических голографических дифракционных микроструктур С помощью программного комплекса оператор может выполнить следующие функции

1 При известной длине волны излучения определить соотношение RGB

2 Рассчитать длину волны отраженного от дифракционной решетки излучения

3 Сопоставить длину волны отраженного излучения соотношению RGB

4 Пересчитать угол схождения лучей для установки записи оптических голограмм

Период штрихов определяется по формуле (7)

sm45 ±sma„,

(7)

щели

где Ясч„ - длина волны считывающего лазера, ссщели - угол щели для исследуемого сегмента

Угол схождения лучей, необходимый для записи голограммы рассчитывается по формуле (8)

,0 5 Л.

аа =2 агсвтС-) (8)

п

где Я - длина волны записывающего лазера, п - период штрихов исследуемого сегмента

Методы, описанные в данной главе, позволяют определять параметры схемы записи оптических голограмм и интегральные параметры голограмм различных типов

Третья глава

Интегральные параметры ГДС, характеризующие их визуальные свойства, определяются методами, описанными в главе 2 Для определения локальных параметров с целью исследования визуальных свойств ГДС применяются методы, представленные в данной главе

ГДС могут быть изготовлены тремя основными методами оптическим, точечно-матричным и методом электронно-лучевой литографии

Каждый из перечисленных методов имеет свои достоинства и недостатки, но в комплексе позволяют получить практически всю гамму визуальных и скрытых эффектов Поэтому в некоторых ГДС используется тот или иной вид записи на различных участках голограмм, что создает сложную для анализа микроструктуру Рассмотрим методы изготовления ГДС подробнее

Оптический метод создания голограмм основан на ставших уже классическими методах записи голограмм по схемам Денисюка, Лейта или Бентона Для формирования мастер голограмм используются специализированные оптические стенды Этим методом легко достигаются объемный и радужный визуальные эффекты в восстановленном изображении Структура ГДС при этом имеет аналоговый характер с элементами спекл-структуры

Метод точечно-матричной голографии представляет собой синтез оптической лазерной записи мастер голограммы с по пиксельным заданием ее структуры Данный метод позволяет реализовать различные кинематические и радужные эффекты Структура ГДС, изготовленного по указанной технологии, достаточно своеобразна

Метод электронно-лучевой литографии базируется на цифровом синтезе структуры ГДС и записи мастер-голограммы или дифракционного элемента методом по пиксельной записи электронным лучом Данный метод очень удобен для создания кинематического эффекта и скрытых меток

Из практики производства ГДС известно, что зоны, выполненные по одной технологии и с одинаковыми параметрами записи, выделяются по визуальному критерию, т к при любых условиях просмотра такие зоны должны выглядеть одинаковыми для наблюдателя Легко заметить, что изменение одного из параметров при записи приводит к изменению визуального эффекта при наблюдении восстановленного голографического изображения

Для того чтобы исследовать локальные параметры голографических дифракционных структур, требуется установить, к какому типу относится исследуемая голограмма Для этих целей предлагается использовать установку, включающей в себя модифицированный для решения этой задачи микроскоп ЕС МЕТАМ РВ-21 (ЛОМО), в котором освещающее излучение направляется на голограмму перпендикулярно ее поверхности через тот микрообъектов, который используется для исследования голограммы Микроскоп снабжен телекамерой, связанной с компьютером

В данной главе приводится описание ЕС МЕТАМ РВ-21 (ЛОМО), входящего в состав установки и программного комплекса определения типа дифракционной решетки «Тип ГДС», который предназначен для определения типа дифракционной решетки по образцам

Изображение структуры голограммы воспринимается телекамерой и выводится на экран монитора Если увеличение, создаваемое микроскопом, недостаточно для анализа структуры голограммы, то используют - интерференционный микроскоп, позволяю-

щий исследовать микроструктуру голограммы с большим увеличением и получить кроме микроизображений также микроинтерферограммы элементов структуры голограммы.

В большинстве случаев оператор может полностью охарактеризовать измеряемый сегмент по определенной микроструктуре, частоте и ориентации интерференционных по-

С помощью программного комплекса «Тип ГДС» оператор может выбрать изображения участка ГДС, тип которого требуется определить, сравнить с образцом и сделать заключение о типе данного участка. Входными данными являются изображения участков ГДС.

Работа программного комплекса заключается в следующем. Оператор из набора изображений микроструктуры данной голограммы выбирает последовательно по одному изображению и сравнивает с образцами микроструктуры из имеющейся базы и присваивает соответствующий тип.

В данной главе представлены результаты исследований определения типа ГДС. На рисунке 10 представлены варианты микроструктуры топографических дифракционных структур изготовленных методом оптической съемки.

Рисунок 10 -Микроструктура оптических ГДС

На рисунке 11 приведены примеры микроструктуры топографических дифракционных структур изготовленных методом точечно-матричной голографии

Рисунок 11 -Микроструктура ГДС типа ТМГ

На рисунке 12 приведены изображения примеры микроструктуры ГДС типа ЭЛЛ.

Таким образом, в конце процедуры определения типа каждому сегменту ГДС присвоен определенный тип - ЭЛЛ, ТМГ или ОГ. После этого делается заключение о том какие сегменты ГДС, на какой аппаратуре следует исследовать для определения локальных параметров ГДС. Для ГДС оптического типа параметры микроструктуры можно определить только путем исследования их визуальных эффектов и сопоставления их с параметрами микроструктуры и ее исследование проводится на автоматизированной установке описанной в главе 2. Если ГДС изготовлено методами ТМГ или ЭЛЛ, то используется установка для измерения параметров микроструктуры, которая включает в себя:

- металлографический микроскоп для измерения геометрических размеров микроструктуры голограммы, периода и ориентации дифракционной решетки на различных сегментах голограммы;

- автоматизированный лазерный интерферометр для измерения формы и высоты профиля штрихов решеток.

Для определения геометрических размеров микроструктуры, периода и ориентации дифракционной решетки на различных сегментах голограммы разработан программно-аппаратный комплекс, включающий в себя автоматизированный металлографический микроскоп, созданный на базе металлографического микроскопа ЕС МЕТАМ РВ-21, и программное обеспечение.

Одной из модификаций металлографического микроскопа ЕС МЕТАМ РВ-21 является то, что он приспособлен для исследования объектов, у которых перед микрорельефом находится прозрачный защитный слой. Так как в этом случае регистрируется значительное количество света, отраженного от верхнего слоя, то снижается контраст изображения или не позволяет получить изображение объекта.

Для решения данной проблемы было передоложено совместить метод косого освещения и темного поля. При этом точечный источник света размещается в близи микрообъектива и самого объекта.

На рисунке 13 приведено изображение участка радужной голограммы, полученное на модифицированном металлографическом микроскопе МЕТАМ-РВ-21 с использо-

ванием светлого поля (а), темного поля (б) и одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения (в).

а) б) в)

а - метод светлого поля, б - метод темного поля, в - метод одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения Рисунок 13 - Изображения участка радужной голограммы.

Таким образом, данный метод позволяет повысить контраст изображения за счет одностороннего наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения.

Для регистрации микроструктуры ГДС, определения формы и высоты профиля штрихов решеток, создан программно-аппаратный комплекс, который состоит из автоматизированного лазерного микроинтерферометра, разработанного на базе микроинтерферометра Линника - МИИ-4М, и специального программного обеспечения. Данный комплекс предназначен для визуальной оценки и измерения параметров шероховатости отражающих объектов.

Важным достоинством автоматизированного лазерного микроинтерферометра является возможность работы с широким источником пространственно-некогерентного монохроматического излучения. Это свойство приводит к значительному уменьшению когерентных шумов и улучшению, по сравнению с интерферометрами с точечными источниками света, качества получаемых изображений.

В основе принципа действия установки для регистрации микроструктуры ГДС заложена реализация алгоритма фазовых шагов. Этот алгоритм позволяет измерять параметры микрорельефа исследуемой поверхности путем расшифровки интерферограмм полученных от этой поверхности для различной разности хода опорного и предметного пучков. Данный метод реализован в программном комплексе «ФАСТ». Достоинства алгоритма фазовых шагов в том, что он позволяет получать интерферограммы поверхности даже при наличии высокого уровня шумов, не требует для своей реализации большого количества интерференционных полос, работает при низком контрасте исследуемого объекта. Недостатком является то, что требуется некоторое время для выполнения «шагов».

Для расчета таких параметров, как угол наклона решетки во фрактале и период решетки во фрактале был разработан комплекс программный измерения геометрических параметров дифракционной решетки "Параметры дифракционной решетки", который предназначен для определения оператором вручную части параметров микрорельефа сегментов где.

В рамках данной работы приводилось исследование двумерной голограммы «Спецзнак», записанной методом ЭЛЛ. На рисунке 11 приведены фотографии различных участков голограммы. Фотографии получены на микроскопе модифицированном автоматизированном микроинтерферометре на базе МИИ-4. В результате исследования было установлено следующее: размер кадра 100x100 мкм2, фрактальная структура записи, голограмма разбита на квадратные подобласти размером около 12 мкм, в которых записаны решетки различной ориентации, период решетки 1 мкм. На рисунке 116 в правой части четко видны квадраты с наклонными штрихами, расположенными под углом 45 градусов к горизонтальной оси. В левой части этого рисунка - решетки различной ориентации расположены в шахматном порядке. На рисунке 11в белым цветом отображена область, в котором не записана никакая решетка. Форма рельефа решетки - синусоидальная.

а) б) в)

а - первый участок; б - второй участок; в - третий участок; . Рисунок 14 - ЭЛЛ голограмма «Спецзнак»

Профиль рельефа решетки в одном из квадратов в нижней части участка голограммы, изображенной на рисунке 14а представлен на рисунке 15.

В нижней и левой части рисунка - одномерные профили поверхности вдоль горизонтальной и вертикальной прямых. Справа - шкала высот поверхности в микронах.

Рисунок 15 - двумерная карта поверхности дифракционной решетки

Методы и программно-аппаратные комплексы, разработанные и описанные в данной главе, позволяют получить количественную информацию о совокупности параметров микроструктуры ГДС, характеризующих их визуальное качество.

Четвертая глава

В данной главе приводится описание разработанных методов и аппаратуры для исследования трехмерных дифракционных структуру другой природы, например, биологических клеточных структур и живой клетки.

Одной из важных задача современной биохимии клетки является исследование процессов поглощения и накопления лекарственных препаратов в живой клетке, а также изучение их воздействия на органеллы клетки. Воздействие лекарства приводит к изменению концентрации белка в клеточных органеллах, влияет на периоды синтеза и распада белка и его внутриклеточный транспорт.

Топографические дифракционные структуры представляют собой амплитудно- фазовые структуры. С точки зрения физической оптики живая неокрашенная клетка - фазовый объект. В связи с этим, методы исследования для топографических дифракционных структур могут применяться и для исследования живых клеток.

Для исследования живых клеток, так же как и для топографических дифракционных структур применяются оптические методы исследования, которые обладают свойством «неразрушающего проникновения», что особенно важно для живых биологических структур.

Внутренняя структура живой клетки описана трехмерным пространственным распределением показателя преломления п(х, у, г) и коэффициента поглощения. Значения

этих величин определяются различными физическими параметрами клеток, например, плотностью белка и концентрацией различных веществ внутри клетки Таким образом, распределение показателя преломления позволяет определить сухой вес белка в клетке, а также распределение плотности сухого вещества Точки локализации инородного вещества, например, лекарственных препаратов, также могут быть определены по распределению показателя преломления

Так как при этом в клетку не вводится никаких красителей, а также не осуществляется никаких воздействий, то клетка остается живой Поэтому можно наблюдать динамику процессов жизнедеятельности клетки, в частности процессы синтеза и распада белка Естественно, морфометрические параметры клеток могут быть также определены из интерференционных данных

Для решения таких задач был разработан флуоресцентно-интерференционный микроскоп, в котором объединены флуоресцентный и интерференционный каналы получения изображения объекта исследования Флуоресцентное изображение дает информацию о местоположении и концентрации лекарственного препарата или флуоресцентных антител в органеллах клетки Интерференционное изображение дает возможность вычислить распределение показателя преломления и, таким образом, оценить сухую массу белка в органеяле клетки Получение и обработка обоих изображений для одной и той же клетки в динамике даст возможность изучить процессы транспорта и воздействия лекарства на органеллы клетки

В настоящей работе рассмотрен микроскоп Линника на базе модифицированного и автоматизированного МИИ-4 для количественных исследований фазовых объектов При этом были существенно расширены особенности данного микроскопа Микроскоп получил название «флуоресцентно-интерференционный микроскоп» и является дальнейшим развитием методов интерференционной и флуоресцентной микроскопии, сочетающих в себе возможность наблюдения флуоресценции, для определения распределения лекарственного препарата в клетке, и определение параметров клетки без изменения местоположения объекта исследования

Отличительные особенности ФИМ

- встроенная система автоматизированной расшифровки интерферограмм методом фазовых шагов,

- двухкоординатный предметный столик, управляемый от ПЭВМ,

- несколько режимов работы с одним и тем же объектом,

- возможность использования различных источников излучения,

- исследование объектов в иммерсионной жидкости,

- исследование объектов в реальном времени.

Для получения и обработки изображений, полученных на флуоресцентно-интерференционном микроскопе, применяется программный комплекс «ФАСТ». Далее изображения используются для решения задач исследования параметров клетки и процессов поглощения и накопления флуорофоров в живой клетке.

Для исследования зон локализации флуорофоров внутри клетки использовались корреляционный анализ и метод поиска максимумов.

Корреляционный анализ позволяет установить связь между фазовым и флуоресцентным изображениями живой клетки. В данной главе рассматривается корреляция между фазовым и флуоресцентным изображениями клетки эпителиального типа, полученного при помощи флуоресцентно-интерференционного микроскопа описанного выше и представленными на рисунке 16.

Корреляционная функция исследуется в пространственной области.

Максимальное значение взаимной корреляционной функции 0.851. Кроме того, максимум взаимной корреляционной функции значительно больше максимума первого бокового лепестка автокорреляционных функций. Следовательно, можно говорить о существовании связи между распределением лекарственного препарата в клетке и плотностью той же клетки. Так как значение корреляционной функции близко к 1, то можно сделать предположение, что клетка мертвая и белки абсорбируют лекарственный препарат.

а) б) в)

а - флуоресцентное; б - фазовое; в - амплитудный контраст Рисунок 16 - Изображения здоровой клетки эпителия рта человека с введенным в нее фотосенсем

Метод поиска максимумов позволяет анализировать области локализации флуорофоров в клетке. Зная места локализации лекарственного препарата путем сопоставления

фазового и флуоресцентного изображений, можно сравнить их с изображением с амплитудным контрастом, и определить каким органеллам клетки они соответствуют

Для автоматизации проведения корреляционного анализа изображений и определения точек локализации максимумов флуоресценции была разработана программа «Корреляция», которая позволяет оценить соответствие максимумов флуоресценции определенным точкам на фазовом изображении, максимальное расстояние между двумя максимумами (фазового изображения и флуоресценции) в мкм Программное обеспечение «Корреляция» представляет собой прикладную программу для исследования и анализа живых клеток при помощи флуоресцентно-интерференционного микроскопа

В рамках диссертационной работы были проведены эксперименты по получению и совместной обработке флуоресцентных и интерференционных изображений проводились и на культуре раковых клеток аденокарциномы гортаноглотки человека Нер-2 Культура клеток была предоставлена Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им П А Герцена Данные клетки эпителиального типа и имеют размеры около 50 мкм Толщина клетки около 10 мкм Клетки были инкубированы в среде лекарственного препарата - фотосенса, синтезированного в ГНЦ РФ «НИОПЙК» Наблюдение флюоресценции аденокарциномы Нер-2, инкубированной с фотосенсом, показывает, что только приблизительно 30-50% клеток имеют достаточно сильную флюоресценцию Анализ флуоресцентного и фазового изображений показал, что наблюдается значительная корреляция между плотностью белка и концентрацией лекарства

Также при помощи ФИМ были получены флуоресцентные и фазовые изображения легочного макрофага с находящейся внутри него туберкулезной палочкой Обычно, для наблюдения палочки внутри макрофага проводят сложную процедуру окрашивания палочки с помощью флуоресцентного красителя (родамин), которая существенно затрудняет изучение динамики поглощения палочки макрофагом

Исследование представленных изображений показывает, что местоположение палочки может быть определено по фазовому изображению, без применения флуоресцентных красителей

Проведение большого числа исследований клеток и сопоставлений их фазовых и флуоресцентных изображений, полученных при помощи автоматизированного флуоресцентно-интерференционного микроскопа, показывает, что у большинства клеток относительно большое положительное значение коэффициента корреляции Это свидетельствует о накоплении флуорофора в областях клетки с максимальной плотностью высокомолекулярных соединений (белка), т е накопление по абсорбционному типу

Исследование и совместная обработка изображений с различными видами контраста, полученных с помощью флуоресцентно-интерференционного микроскопа, позволяет решить задачу определения количества исследуемого флуорофора в клетке

В данной работе оценка количества флуорофора проводилась на примере противоопухолевого агента фотосенса - препарата для фотодинамической терапии Для ускорения и облегчения расчетов концентрации фотосенса в живой клетке была разработана программа «Концентрация» В результате проведения ряда исследований здоровых клеток эпителия ротовой полости человека, с введенным в них лекарственным препаратом -фотосенсом, было установлено, что среднее значение количества молекул в ядре, приходящееся на 1 мкм, в 13 раз превышает среднее значение количества молекул в цитоплазме и средняя внутриклеточная масса фотосенса составляет - 3 81 10"" г *

Таким образом, разработанный флуоресцентно-интерференционный микроскоп и специальное программное обеспечение позволяет в реальном времени получать изображения с различными видами контраста без изменения местоположения объекта исследования Полученная информация позволяет определять оптико-физические параметры внутри биологических объектов путем совместной обработки полученных изображений

Заключение

В заключении сформулированы основные результаты, полученные в диссертационной работе

1 Разработан критерий для выбора шага дискретизации распределений амплитуды и интерферограмм волнового фронта лазерного излучения при численном моделировании процесса распространения и проведено математическое моделирование распространения излучения лазерного пучка по методу Кирхгофа с учетом фазы волнового фронта вдоль оси распространения

2 Доказана возможность регистрации распределения мощности в сечении лазерного пучка путем томографической реконструкции по одномерным проекциям, полученным в результате поперечного сканирования пучка интегрирующим приемником излучения - оптическим световодом

3 Разработана и экспериментально опробована автоматизированная установка, которая позволяет проводить определение совокупности параметров ГДС характеризующих их визуальное качество

4 Разработана автоматизированная установка для регистрации и расчета одновременно 3-х и более оптических параметров ГДС в автоматическом режиме.

5 Разработан метод повышения контраста изображений микроструктуры ГДС с прозрачным защитным слоем за счет одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения

6 Создан экспериментальный образец флуоресцентно-интерференционного микроскопа, который позволяет получать изображения живой клетки с различными видами контраста и малым временем регистрации

7 Разработан метод и программное обеспечение для расчета распределения оптико-физических параметров внутри биологических объектов путем совместной обработки полученных изображений с различными видами контраста

8 Проведено экспериментальное определение количества фяуорофора в клетке эпителиального типа

9 Получен критерий для определения распределения флуорофора в живой клетке

Таким образом, в настоящей работе, решена актуальная научно-техническая задача разработки оптических методов исследования локальных и интегральных параметров голографических дифракционных структур, что имеет существенное значение для развития оптической голографии

Список печатных работ по теме диссертации

1 Алешин А А, Булыгин Ф В , Горяинова И В , Левин Г Г, Семенов Э Г Измерение параметров оптических топографических защитных знаков Тез докл Научно-практическая конференция «Голография в России и зарубежом Наука и практика» - Москва -2006-С 38-40

2 Алешин А А, Булыгин Ф В , Горяинова И В , Левин Г Г, Семенов Э Г Измерение визуальных параметров голограмм Тез докл Научно-практическая конференция «Голография в России и зарубежом Наука и практика» - Москва -2006-С 40-42

3 Булыгин Ф В , Горяинова И В , Калинин Е В , Левин Г Г Применение флуоресцентно-интерференционного микроскопа для изучения живых клеток// Измерительная техника -2002 -№4 -С 62-66

4 Булыгин Ф В , Горяинова И В , Ковалев А А, Марамзин К Д Измерение распределения интенсивности в лазерном пучке методом оптической томографии// Журнал технической физики -2007 -Т 77 -Вып 7- С 87-90

5 Горяинова И В Моделирование процесса распространения лазерного пучка с использованием метода// Измерительная техника -2006 -№6 -С 36-39

6 Горяинова И В , Ковалев А А , Левин Г Г Выбор шага дискретизации при численном описании лазерных полей методом Кирхгофа Тез докл XV Научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» - Москва-2005-С 97-99

7 Булыгин Ф В , Горяинова И В , Ковалев А А, Марамзин К Д Томографическая реконструкция распределения интенсивности в поперечном сечении лазерного пучка Тез докл Научно-техническая конференция XVI «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» - Москва -2007-С 146-148

8 Булыгин Ф В , Горяинова И В Методы визуального контроля качества голографи-ческих защитных знаков Тез докл Научно-техническая конференция XVI «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» - Москва -2007-С 152-154

9 Булыгин Ф В , Горяинова И В Оптические параметры радужных голограмм, синтезируемых методом физической съемки Тез докл Научно-техническая конференция XVI «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» - Москва -2007-С 149151

10 Bulygin Th V , Vishnyakov.G N, Goryamova IV , Kalmin, E V , Levm, G G Application of ûuoTescence-mterference microscope for momtonng of dry weight dynamics and drug distribution withm livmg cells Proc SPIE-Vol 4431 -2001 -P 329-334

Введение.

Глава 1 Исследование интегральных параметров оптического излучения взаимодействовавшего с голографическими дифракционными микроструктурами.

1.1 Метод Кирхгоффа с учетом фазы волнового фронта светового излучения.

1.1.1 Регистрация параметров лазерного луча.

1.1.2 Моделирование распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа.

1.1.2.1 Выбор шага дискретизации при численном описании лазерных полей методом Кирхгофа.

1.1.2.2 Результаты моделирование распространения лазерного пучка методом Кирхгоффа.

1.2 Метод оптической томографии.

1.2.1 Регистрация мощности излучения.

1.2.2 Получение томографических проекций.

1.2.3 Реконструкция распределения интенсивности.

Глава 2 Методы и установки для исследования интегральных параметров голографических дифракционных структур.

2.1 Интегральные параметры голографических дифракционных структур и их связь с параметрами микроструктуры.

2.2 Автоматизированная установка и программное обеспечение для исследования параметров оптических голографических дифракционных структур.

2.2.1 Установка для регистрации параметров оптических голографических дифракционных структур.

2.2.2 Программное обеспечение для расчета параметров схемы записи оптических топографических дифракционных структур.

2.2.3 Результаты исследований голограмм.

2.2.4 Программное обеспечение подготовки данных для формирования оптических топографических дифракционных микроструктур.

2.3 Автоматизированная установка и программное обеспечение для исследования интегральных параметров топографических дифракционных структур.

2.3.1 Установка для регистрации интегральных параметров топографических дифракционных структур.

2.3.2 Программное обеспечение для автоматизации регистрации и оценки интегральных параметров ГДС.

Глава 3 Методы и установки для исследования локальных параметров топографических дифракционных структур.

3.1 Классификация топографических дифракционных микроструктур по методу формирования мастер-голограмм.

3.2 Установка и программное обеспечение для определения типа топографических дифракционных структур.

3.2.1 Установка для определения типа топографических дифракционных элементов.

3.2.1.1 Описание микроскопа.

3.2.1.2 Метод повышения контраста изображения путем регистрации дифрагировавшего излучения.

3.2.2 Программное обеспечение для определения типа топографических дифракционных структур.

3.3 Установка и программное обеспечение для исследования локальных параметров топографических дифракционных структур.

3.3.1 Установка для исследования локальных параметров топографических дифракционных структур.

3.3.2 Программное обеспечение для расчета локальных параметров голографических дифракционных структур.

3.4. Исследование локальных параметров голографических дифракционных структур.

3.4.1 Голографические дифракционные структуры, изготовленные методом точечно-матричной голографии.

3.4.2 Исследование локальных параметров голографических дифракционных структур, синтезированных с помощью ЭЛЛ-установок.

Глава 4 Исследование локальных и интегральных параметров трехмерных дифракционных структур биологического происхождения.

4.1 Устройство и принцип действия автоматизированного флуоресцентно - интерференционного микроскопа.

4.2 Методы для анализа транспорта флуорофора в живой клетке.

4.2.1 Корреляционный анализ.

4.2.2 Метод поиска максимумов.

4.2.3 Программный комплекс «Корреляция».

4.2.4.Экспериментальное исследование локализации флуорофора в живой клетке.

4.3 Метод и программное обеспечение для определения концентрации флуорофоров в клетке.

4.3.1 Метод для определения концентрации флуорофоров в клетке.

4.3.2 Программное обеспечение для определения концентрации флуорофоров в клетке.

4.3.3 Экспериментальное определение количества вещества флуорофора.

4.4 Метод спектротомографии.

В данной диссертации разрабатываются оптические методы исследования локальных и интегральных параметров голографических дифракционных микроструктур.

Голографические дифракционные микроструктуры - это элементы, основанные на способности света изменять свои свойства при взаимодействии с мелко структурированной поверхностью, которая формируется с использованием принципов голографии. Данный эффект базируется на дифракции света на элементах структуры ГДС соизмеримых с длиной волны света и последующей интерференции дифрагировавших световых полей.

До развития голографии перечень оптических элементов, действие которых основано на явлении дифракции, ограничивался дифракционными решетками и зонными пластинками. Положение изменилось с появлением голографии.

Первая голограмма была получена в 1947 году Д. Габором в ходе экспериментов по повышению разрешающей способности электронного микроскопа. Он же придумал само слово "голография", которым он подчеркнул полную запись оптических свойств объекта. К сожалению, его голограммы отличались низким качеством. Получить качественную голограмму без когерентного источника света невозможно [1]. Д. Габор в 1971 г. за изобретение голографии был удостоен Нобелевской премии.

После создания в 1960 году красных рубинового (длина волны 694 нм, работает в импульсном режиме) и гелий-неонового (длина волны 633 нм, работает непрерывно) лазеров, голография начала интенсивно развиваться.

В 1962 году была создана классическая схема записи голограмм Э.Лейта и Ю. Упатниекса из Мичиганского Технологического Института (голограммы Лейта-Упатниекса) [2,3] , в которой записываются пропускающие голограммы (при восстановлении голограммы свет пропускают через фотопластинку, хотя на практике некоторая часть света от неё отражается и также создаёт изображение, видимое с противоположной стороны). Предложенный метод осуществлял запись голограмм в тонкослойной фотографической среде. Такого рода голограммы восстанавливают трехмерное изображение только в лазерном свете. Поэтому данный метод в технологии получения защитных элементов используется-только на подготовительном этапе для записи мастер голограмм.

В 1967 году рубиновым лазером был записан первый голографический портрет.

В результате длительной работы в 1968 году Ю. Н. Денисюк получил высококачественные (до этого времени отсутствие необходимых фотоматериалов мешало получению высокого качества) голограммы, которые восстанавливали изображение, отражая белый свет. Для этого им была разработана своя собственная схема записи голограмм. Эта схема называется схемой Денисюка, а полученные' с её помощью голограммы называются голограммами Денисюка. Метод Ю.Н. Денисюка основан на формировании дифракционной структуры в толстослойной фотографической эмульсии и позволяет наблюдать объемное изображение в белом свете. Этот метод используется в настоящее время для защиты документов при записи и тиражировании голограмм на фотополимерных носителях (пленках) [4]. Ю.Н. Денисюку за предложенный метод записи голограмм и последующие работы в области голографии в 1971 г. присуждена Ленинская премия.

В 1977 году Ллойд Кросс создал так называемую мультиплексную голограмму. Она принципиально отличается от всех остальных голограмм тем, что состоит из множества (от десятков до сотен) отдельных плоских ракурсов, видимых под разными углами. Такая голограмма, естественно, не содержит полную информацию об объекте, кроме того, она, как правило, не имеет вертикального параллакса (т.е. нельзя посмотреть на объект сверху и снизу), но зато размеры записываемого объекта не ограничены длиной когерентности лазера (которая редко превышает несколько метров, а чаще всего составляет всего несколько десятков сантиметров) и размерами фотопластинки. Мало того, можно создать мультиплексную голограмму объекта, которого вовсе не существует. Например, нарисовав выдуманный, объект с множества различных ракурсов. Мультиплексная голография превосходит по качеству все остальные способы создания объёмных изображений на основе отдельных ракурсов' (например, линзовые растры), однако она всё равно далека от традиционных методов голографии по реалистичности.

Наиболее широкое распространение при изготовлении голографических защитных элементов получила, одна из разновидностей голографии Лейта, т.н. «радужная» голография, которая была изобретена Бентоном [5] в 1976г. Метод, предложенный позволяет создавать голограммы, восстанавливаемые белым светом и, что не менее важно, эти голограммы могут быть легко механически размножены в любых требуемых количествах.Именно такие голограммы оказались пригодными для массового тиражирования путем тиснения на гибкую основу, сохраняя- при этом способность, формировать объемное трехмерное изображение при освещении белым светом.

Голография в России в 1970-х г.г.представляла собой новую науку и базы для ее развития практически не существовало.

В 1966 году во ВНИИОФИ была образована лаборатория голографии и когерентной оптики. Начальником лаборатории была назначена кандидат технических наук (с 1970 года доктор технических наук) Вера Моисеевна Гинзбург. В лаборатории были разработаны первые в стране универсальные серийные голографические установки - УИГ-1, предназначенные для исследований в области голографии с импульсными лазерами — мощный одномодовый рубиновый лазер с двумя каскадами усиления и оптической скамьей для крепления держателей оптических элементов, и УИГ-2, предназначенная для исследований в области голографии с лазерами непрерывного режима работы. Эти установки выпускались серийно до 1990 года и благодаря им развивалась голография в СССР, причем не только в крупных НИИ или на предприятиях, но и в учебных заведениях.

Под руководством В.М.Гинзбург начались исследования и в области неоптической голографии: в диапазоне СВЧ, в ультразвуковом излучении, исследования в цифровой голографии и в обработке результатов топографических измерений [6,7]. Результаты первых исследований и разработок вошли в монографию «Голография. Методы и аппаратура», выпущенную издательством Советское Радио в 1972 году [8] и ставшую настольной книгой всех, кто развивал в эти годы отечественную голографию.

Топографический метод изготовления оптических элементов и в настоящее время является весьма актуальным. К его достоинствам можно отнести, в частности, возможность изготовления оптических элементов, предназначенных для работы в пределах всего видимого диапазона, тиражирование прецизионных, в том числе и крупногабаритных, реальных объектов (физически существующих), возможность получения сложных оптических элементов за счет последовательного копирования отдельных составляющих на один и тот же участок регистрирующей среды и т.д. [9-11]

Голография изобретена не только как явление, не только как метод создания объемных изображений, но и как метод расчета полей, положивший начало цифровой голографии, о чем будет сказано ниже.

Голограммы, топографические дифракционные структуры, дифракционные оптические элементы находят широкое применение в различных областях науки и техники. Топографические (или голограммные) оптические элементы представляют собой голограммы, на которых записаны волновые фронты специальной формы. Топографические оптические элементы можно сконструировать для преобразования любого входного волнового фронта в любой другой выходной фронт независимо от параметров материала подложки, например, от кривизны или показателя преломления. С их помощью возможна коррекция аберрации оптических систем, в таком случае ГОЭ выступают как составные элементы сложных оптических приборов. ГОЭ используют и как самостоятельные оптические элементы в качестве линз, зеркал, дифракционных решеток, мультипликаторов и др. [12].

Способность голограмм Фурье хранить информацию успешно реализуется в голографических запоминающих устройствах [13]. При построении последних стандартным стало использование принципа страничной записи информации в виде матрицы голограмм с их адресацией лучом лазера. Преимущества оптической памяти состоят в большой емкости (и, соответственно, высокой плотности хранения информации) и высоком быстродействии, возможности параллельной-обработки информации, высокой надежности хранения, быстром доступе к массивам информации, отсутствии энергопотребления в статическом состоянии, а главное - большой помехоустойчивости голограмм. Все ГЗУ можно разделить на следующие основные типы: оперативные ГЗУ (на двумерных голограммах и трехмерных с трехкоординатной адресацией); массовые ГЗУ; - ГЗУ постоянного типа; - архивные ГЗУ. [14, 15].

Кроме этого голограммы, голографические дифракционные структуры используются для анализа формы радиосигналов [16-20], измерения формы поверхности различных изделий [21], коррекции аберраций оптических систем [20-23], создания различных оптических элементов [25-27] и систем связи [28], измерений параметров быстропротекающих процессов[29,30], в гидроакустике и гидрофизике [31].

Также голографические дифракционные структуры различных типов используются для маркировки документов и товаров с целью защиты от подделки.

Наиболее широкое распространение при изготовлении голографических защитных элементов получила одна из разновидностей голографии Лейта, «радужная» голография, которая была изобретена Бентоном [32] в 1976г. Именно такие голограммы оказались пригодными для массового тиражирования путем тиснения на гибкую основу, сохраняя при этом способность, формировать объемное трехмерное изображение при освещении белым светом.

Другой вид голографии, который нашел широкое применение при изготовлении оптических защитных элементов - цифровая голография [33], основанный на моделировании голографического процесса на ЭВМ. Цифровой синтез голограмм имеет ряд важных применений при создании дифракционных оптических элементов нового типа: мультипликаторы, сканаторы, с произвольным законом сканирования, фокусаторы и т.д. Разработка алгоритмов синтеза на ЭВМ голографических элементов, обладающих свойствами радужных и объемных голограмм, а также оригинальных дифракционных структур с визуальными эффектами выдвинула данный метод, как один из основных при создании оптических защитных меток.

Имеется ряд веских оснований для такого синтеза- голограмм и, в частности, то обстоятельство, что геометрические размеры голографического объекта в этом случае не ограничиваются такими факторами, как когерентность освещения, вибрация или турбулентность воздуха, и появляется возможность исследовать путем моделирования некоторые голографические эффекты.

Еще более существенным моментом, стимулирующим синтез голограмм с помощью компьютеров, является возможность создать оптический волновой фронт для такого объекта, который физически не существует. Потребность в формировании волнового фронта, соответствующего объекту, определяемому расчетным путем, возникает в любом случае, когда требуется визуально отобразить в трех измерениях результаты того или иного трехмерного исследования, например, при моделировании разрабатываемых конструкций. Иногда волновой фронт от синтезированной голограммы может служить интерференционным эталоном для контроля сложной оптической поверхности в процессе ее обработки. Другая область применения таких голограмм связана с экспериментами по пространственной фильтрации. В некоторых случаях изготовить фильтр с заданной функцией оптическими методами бывает затруднительно, в то же время компьютер решает подобные задачи сравнительно легко [34].

Для изготовления и тиражирования используются методы, аналогичные тем, что используются при производстве печатных плат в микроэлектронике.

Каждый микроскопический участок поверхности голограммы представляет собой дифракционную решетку в виде чередования светлых и темных полос. Эта совокупность может быть получена не только путем съемки реального объекта, но и путем синтеза из отдельных элементов. Под цифровыми методами синтеза (записи) голограмм обычно понимают такие методы записи, при которых голограмма записывается из отдельных элементов по предварительно заданной программе [35]. Цифровая голограмма может состоять как из отдельных элементарных голограмм, так и из отдельных элементов (штрихов) [36,37].

Синтез голограммного изображения осуществляется путем решения задачи, каково должно быть чередование полос для того, чтобы при его восстановлении получить требуемое изображение. Современное программное обеспечение позволяет рассчитать дифракционную структуру, при восстановлении которой может быть получено даже трехмерное изображение объекта.

В настоящее время наиболее распространены следующие технологии записи оригиналов голограмм: электронно-лучевая и точечно-матричная.

Электронно-лучевая технология основана на создании микрорельефа с заданными параметрами при помощи электронного луча, который можно сфокусировать в пятно размером несколько нанометров. Расчет параметров микрорельефа представляет собой решение обратной задачи синтеза изображения в оптическом диапазоне, что делает технологию чисто цифровой. Этот метод занимает особое место среди технологий записи по целому ряду причин:

- разрешающая способность электронно-лучевой технологии на два порядка величины превышает возможности оптических систем записи;

- на стадии изготовления оригинала голограммы в неё можно включить микротексты размером вплоть до нескольких микрон, элементы высокого разрешения и другие признаки, недоступные оптическим методам записи;

- оборудование для электронно-лучевой литографии является высокотехнологичным и дорогостоящим, требующим значительных интеллектуальных вложений.

Точечно-матричная технология базируется на аналоговой записи микроэлемента изображения (пикселя). При этом растровое изображение голограммы в целом, состоящее из миллионов пикселей, формируется компьютером. Такой метод записи является одновременно и аналоговым, и цифровым. Его также отличает относительная доступность и распространенность.

Широкое использование топографических дифракционных структур привело к необходимости разработки методов регистрации их параметров, в том числе характеризующих микроструктуру. Среди них важное место занимают оптические методы исследования, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с не оптическими, например, зондовыми методами. Этими преимуществами являются неразрушающее воздействие оптического излучения на исследуемый объект, возможность проникновения оптического излучения внутрь исследуемого объекта, а также возможность исследовать с помощью оптического излучения физико-химические свойства материала объекта. Поэтому в организациях, связанных с изготовлением голограмм или экспертизой их подлинности используется такое оптическое оборудование как спектрометры, гониометры, лазеры а также оптические микроскопы различных типов[38-41,6].

В то же время, применение оптических методов для исследований субмикронных объектов, к которым относятся голографические дифракционные структуры, связано с рядом трудностей, обусловленных тем, что длина волны оптического излучения видимого диапазона близка к характерным размерам таких структур. В ряде случаев это не позволяет с требуемой точностью определять локальные параметры субмикронных объектов.

Кроме того, исследования массивов оптических микроструктур, к которым относятся дифракционные оптические элементы и голограммы, показало, что полное описание их оптических свойств не может быть получено на основе данных об их локальных параметрах. Поэтому для, совершенствования технологии расчета, синтеза и контроля качества таких объектов, необходима разработка методов, позволяющих определять микрохарактеристики их структуры по результатам измерений интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения.

Широкое распространение голографических дифракционных структур, используемых для защиты документов и ценных бумаг требует разработки соответствующей нормативной базы, поскольку не существует ГОСТов, определяющих требования к голографическим дифракционным структурам. В начале 80-х годов XX века была начата разработка проекта ГОСТа «Голографические измерения. Термины и определения», но она не была закончена. В настоящее время в России нормативы на защитные голограммы ограничиваются руководящими документами государственных лицензирующих органов. Данные документы классифицируют голограммы по ряду параметров, заявляемых изготовителем, но не предполагают контроль этих параметров. Тем более в этих документах не указаны методики анализа и их аппаратурное обеспечение.

Разработка методов и аппаратуры, которые позволили бы регистрировать и рассчитывать параметры, характеризующие визуальные свойства голографических дифракционных структур, как на стадии производства, так и при экспертизе подлинности, представляется весьма актуальной.

Оптические методы исследования микрообъектов применяются с момента изобретения микроскопа А. Левенгуком. Создание теории микроизображений Э. Аббе, казалось бы, установило границу применимости оптических методов для исследования микрообъектов. Чтобы преодолеть этот предел и повысить разрешение при исследовании микрообъектов стали использоваться методы, основанные на иных физических принципах [42-44]. Появились электронные микроскопы и сканирующие зондовые микроскопы, обладающие пространственным разрешением близким к размерам атома.

Оптические методы обладают уникальными видами контраста, такими как поляризационный и фазовый контраст, что позволяет исследовать физико-химические свойства микрообъектов, а также они незаменимы при исследовании микроструктур, применяемых в качестве составных элементов оптических систем.

Развитие методов современной оптики, вызванное практическими потребностями, позволило существенно превзойти теоретический предел разрешения, рассчитанный Э. Аббе для традиционных оптических систем. Современные оптические микроскопы, основанные на новых физических принципах, позволяют превзойти теоретический предел разрешения Аббе. К ним относятся интерференционные, конфокальные, многофотонные, ближнепольные оптические микроскопы [45,46]. В ближайшем будущем ожидается появление микроскопа со сверхразрешением, основанного на применении суперлинз, изготовленных из оптических метаматериалов с отрицательным показателем преломления.

Кроме использования новых физических принципов для повышения разрешения оптических систем, а также для «извлечения» дополнительной информации об объекте исследования используются различные методы обработки оптической информации. Ряд методов основан на исследовании распределения не только интенсивности оптического изображения, но и его фазы (интерференционные методы) [47,48]. Другие методы основаны на решении обратной задачи распространения оптического излучения на основе результатов интегральных измерений. К ним относится оптическая томография, позволяющая вычислять локальные характеристики. по результатам интегральных измерений. Также широко применяется дифрактометрия, которая позволяет по анализу дифракционной картины вычислить локальные характеристики [48-59].

Развиваются методы, основанные на обработке результатов дистанционных измерений (обратные задачи распространения), методы, основанные на сопоставлении результатов измерений различных оптических контрастов.

Одним из передовых направлений современной науки и техники-являются нанотехнологии, основанные на широком внедрение нанострукутрированных материалов. Развитие и внедрение нанотехнологии неотъемлемо от развития методов измерений, основанных на электронной и зондовой микроскопии. Однако в ряде случаев возникает необходимость использовать оптические методы измерений. Применение оптических методов необходимо в нанобиотехнологиях, а также при исследовании' свойств оптических элементов, созданных на основе нанострукутрированных материалов.

Несмотря на изобретение и развитие большого количества новых методов исследования свойств микрообъектов, оптические методы исследования обладают большими преимуществами и продолжают развиваться. Развитие этих методов связано не только с внедрением новых физических принципов регистрации оптических сигналов, но и с развитием методов обработки результатов оптических измерений. К ним относятся методы обработки интегральных измерений (томография), методы, основанные на решении обратных задач (в том числе дифрактометрия), методы, основанные на сопоставлении различных видов оптических контрастов [60-68].

Ряд практических задач может быть решен только с помощью разработки новых методов получения и обработки результатов оптических измерений. К ним относится разработка методов исследования характеристик микроструктур и микрообъектов путем регистрации и обработки локальных и интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения.

Голографические дифракционные структуры бывают амплитудными и фазовыми, например, голограммы, выполненные на оптически прозрачных материалах, представляют собой рельефно-фазовые структуры. Поэтому методы исследования для голографических дифракционных структур могут применяться- и для исследования живых клеток.

Существующие в настоящее время методы исследования живых клеток позволяют наблюдать контуры объектов' исследования, изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ, судить о молекулярной- организации его структуры. Актуальным направлением» развития инструментария современной цитологии является расширение-числа количественно- измеряемых физических параметров живой клетки. Существующие приборы, позволяющие измерять несколько физических параметров внутри живой клетки, не позволяют полностью и достоверно изучать динамику внутриклеточных процессов. В микроскопии не решена задача сопоставления контрастов для биообъектов. А именно фазового и яркостного. Это позволило бы изучать динамику внутриклеточных процессов, в частности транспорт и воздействие лекарственных препаратов на органеллы живой клетки.

Живая клетка, с точки зрения оптики, представляет собой трехмерное распределение вещества с переменной плотностью, окруженное достаточно плотной оболочкой. Известно, что в видимой области спектра живые одиночные клетки практически не поглощают излучения: Основной физической величиной, определяющей прохождение оптического излучения через клетку, является показатель преломления, значения которого изменяются внутри клетки в существенных пределах. Так как в таких объектах изменяется только фаза света, то они получили название фазовых объектов.

Для исследования живых клеток, также как и для топографических дифракционных структур применяются оптические методы исследования, которые обладают свойством «неразрушающего проникновения», что особенно важно для живых биологических структур [69, 70].

Для исследования оптико-физических параметров ГДС и объектов со схожими свойствами, необходимо определять локальные и интегральные параметры оптического излучения после взаимодействия с микроструктурой поверхности объекта и отраженного от нее.

В 70-ые 80-ые годы в СССР была создана система стандартов для измерения параметров лазерного излучения. Эти стандарты были подкреплены соответствующей измерительной аппаратурой, методиками и эталонами. Например, ГОСТ 24453 - 80 "Измерение параметров и характеристик лазерного излучения" (термины, определения и буквенные обозначения величин). Данный ГОСТ описывает большое число параметров лазерного излучения. Существует несколько ГОСТов, устанавливающих методику измерения значительно- меньшего числа параметров лазерного излучения, чем описано в ГОСТе 24453-80. Например, ГОСТ 25918 - 83 "Методы измерения нестабильности частоты излучения лазеров непрерывного режима работы", ГОСТ 26086-84 "Методы измерения диаметра пучка и энергетической расходимости лазерного излучения", ГОСТ 25917-83 "Методы измерения относительного распределения плотности энергии (мощности) излучения".

Заметим, что ГОСТы, описывающие средства измерений, а также Государственные эталоны, имеются для энергии и мощности непрерывного и импульсного лазерного излучения (ГОСТ 8.275-94). Это связано с тем, что указанные параметры лазерного излучения считались важнейшими для большинства лазеров, применяемых в промышленности, медицине и т.д.

В конце 80-х годов в мировой лазерной науке возникло понимание того, что энергетических параметров явно недостаточно для описания лазерного пучка. На первый план вышла необходимость определять характеристики, отвечающие за качество лазерного пучка и особенности его распространения. Это связано с возрастающими требованиями к лазерам, применяемым в системах связи, информационных системах, медицине, приборостроении, а также с широким внедрением новых типов лазеров, таких как полупроводниковые, эксимерные и т.д.

Например, точность определения размеров и координат фокусного пятна лазера является важнейшим параметром, влияющим на плотность записи информации на оптических носителях, разрешение оптических лазерных приборов, точность изготовления изделий с помощью технологических лазеров и т.д.

В ходе работ по проекту CHOCLAB, которые начались в 1992 году, были разработаны, предварительные стандарты, определяющие требования как к широко» применяемым, так и к новым параметрам лазерного излучения и методам их измерения. К таким новым характеристикам лазерного пучка относятся в первую очередь те, которые определяются проектами стандартов ИСО 11146 - Диаметр пучка, угол расходимости и фактор распространения и ИСО 15367 - Распределение фазы.

При работе с лазерными пучками часто требуется иметь информацию о распределении интенсивности в их поперечном сечении. В частности, это необходимо для исследования структуры поперечных мод излучения лазера. В ряде случаев желательно измерять это распределение в поперечном сечении относительно мощного лазерного пучка, практически не ослабляя, или слабо искажая сам пучок. Попытки решить эту проблему тем или иным способом предпринимаются вплоть до настоящего времени [71-76].

Особый интерес представляют такие исследования при работе с мощными технологическими лазерами, когда бывает невозможно поместить на пути лазерного луча какой-либо регистратор или ответвитель, поскольку это приводит к его быстрому разрушению под воздействием высокоинтесивного лазерного излучения. Одним из методов решения данной проблемы является введение в лазерный пучок на короткое время объектов, обладающих высокой лучевой стойкостью и играющих роль ответвителей лазерного излучения [77,78]. Так в работе [77] было предложено быстро перемещать перпендикулярно оси пучка тонкую тугоплавкую проволоку -спицу, закрепленную на вращающемся диске, и по зеркальному отражению от нее с помощью пироэлектрического детектора регистрировать мощность излучения в локальных точках лазерного пятна.

Недостатками существующих методов регистрации распределения мощности излучения являются большие габариты системы регистрации, что не всегда позволяет регистрировать мощность излучения в труднодоступных ограниченных местах. Предложенный в работе метод регистрации интенсивности в сечении лазерных пучков может быть использован для создания дистанционного малогабаритного датчика параметров пучков мощных технологических лазеров.

Таким образом, задача разработки оптических методов исследования распределения локальных и интегральных оптико-физических параметров голографических дифракционных структур и других объектов, похожих на них, решаемая в данной диссертационной работе, представляется весьма актуальной.

Цель работы

Целью диссертационной работы является разработка методов, установок и программного обеспечения, предназначенных для исследования оптических свойств ГДС на основе анализа их микроструктуры и интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения, а также распространение разработанных методов на исследование трехмерных субмикронных структур биологического происхождения.

Основные задачи исследования

1. Разработка математической модели взаимодействия оптического излучения с ГДС, проведение математического моделирования процесса его распространения и установление связи между его интегральными и локальными параметрами.

2. Определение характеристик, описывающих оптические свойства голографических дифракционных структур, и установление их связи с параметрами их микроструктуры и параметрами взаимодействовавшего * с ГДС оптического излучения.

3. Разработка методов и создание аппаратуры для получения изображений микроструктуры ГДС и регистрации интегральных и локальных оптических параметров ГДС.

4. Разработка методов расчета параметров ГДС по изображениям их микроструктуры и создание программного обеспечения для автоматизации процессов регистрации и обработки изображений микроструктуры.

5. Разработка методов расчета параметров ГДС по полученным интегральным и локальным характеристикам взаимодействовавшего с ГДС оптического излучения, включающая в себя математическое моделирование и создание программного обеспечения для автоматизации процесса регистрации данных, обработки изображений и проведения расчетов.

6. Разработка методов и создание аппаратуры для. получения изображений живых клеток с различными типами контраста и создание программного обеспечения для расчета распределения параметров внутри биологических объектов путем совместной обработки полученных изображений.

Научная новизна

Впервые была разработана совокупность оригинальных методов и средств для регистрации и обработки изображений ГДС и биологических объектов - живых клеток, а также для расчета их параметров по полученным изображениям.

К основным результатам относятся:

1. Критерий выбора шага дискретизации для математической модели распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа с учетом распределения фазы волнового фронта лазерного излучения вдоль оси распространения.

2. Метод измерения распределения мощности в сечении лазерного пучка путем томографической реконструкции по одномерным проекциям, полученным в результате поперечного сканирования пучка интегрирующим приемником излучения - оптическим световодом.

3. Автоматизированная установка, которая позволяет проводить количественное измерение совокупности параметров ГДС характеризующих их визуальное качество.

4. Установка для регистрации и расчета одновременно 3-х и более оптических параметров ГДС в автоматическом режиме.

5. Метод повышения контраста изображений микроструктуры ГДС с прозрачным защитным слоем за счет одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения.

6. Экспериментальный образец флуоресцентноинтерференционного микроскопа; позволяющий получать изображения биологического объекта - живой'клетки с малым временем регистрации: и с различными видами контраста, в том числе с фазовым и флуоресцентным, без перемещения исследуемого биологического объекта.

Практическая значимость

1. Предложенный томографический метод измерения интенсивности в сечении лазерных пучков при помощи сканирования оптическим световодом, может быть использован? для создания дистанционного малогабаритного датчика параметров! пучков мощных технологических лазеров.

Полученные в ходе диссертационной работы результаты: использовались в научно-исследовательской работе по совершенствованию методов измерения параметров пучков (шифр «Фокус»), проводившейся во ФГУП ВНИИОФИ в 2004-2006 гг.

2. Разработанная автоматизированная установка, моделирующая восприятие изображения ГДС экспертом — наблюдателем, позволяет проводить автоматизированную идентификацию ГДС по визуальным параметрам, создавать базы данных визуальных параметров различных ГДС, осуществлять контроль качества и износостойкости ГДС, а так же является аппаратурным обеспечением для разработки стандартов качества ГДС.

Принципы построения данной автоматизированной установки использовались в ходе исследований системных вопросов проектирования аппаратуры для; обеспечения контроля визуального качества голограмм в НИИ «Гознак» - Филиал ФГУП «Гознак».

3. Разработанная автоматизированная установка для измерения параметров оптических ГДС может использоваться при исследовании оптических свойств и конструировании широкого круга оптических элементов, основанных на ГДС. В фирме «Крипто-Принт» проводились исследования защитных меток типа Фурье-голограмм, что позволило усовершенствовать метод синтеза микроструктуры меток данного типа и привело к повышению их оптических характеристик.

4. Предложенный в работе метод повышения контраста изображения микрообъектов путем применения одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения позволяет расширить возможности современных металлографических микроскопов.

5. Флуоресцентно-интерференционный микроскоп позволяет получать изображения живой клетки с различными видами контраста и малым временем регистрации, что даст возможность изучать динамику внутриклеточных процессов, в частности транспорт и воздействие лекарственных препаратов на органеллы клетки.

При помощи флуоресцентно-интерференционного микроскопа были исследованы легочные макрофаги, инфицированные палочкой Коха. Исследования проводились в НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова, в Институте Ревматологии РАМН.

Апробация работы

Основные результаты и положения данной диссертационной работы докладывались на следующих семинарах:

- Международной конференции «Оптическая диагностика живых клеток» (Сан-Хосе, США,2001);

- XV Научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» (Москва, 2005);

- Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика» (Москва, 2006);

- XVI Научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» (Москва, 2007).

Материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 3 работы опубликованы в научных журналах и тематических сборниках.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы.

Заключение

В заключении выделим основные результаты, полученные в рамках выполнения диссертационной работы.

1.Разработан критерий для выбора шага дискретизации распределений амплитуды и фазы- волнового фронта лазерного излучения? при численном моделировании процесса распространения и проведено математическое моделирование распространения излучения лазерного пучка по методу Кирхгофа с учетом фазы волнового фронта вдоль оси распространения.

2. Доказана возможность регистрации распределения мощности в сечении лазерного пучка путем томографической реконструкции по одномерным проекциям, полученным в результате поперечного сканирования пучка интегрирующим приемником излучения - оптическим световодом.

3.Разработана и экспериментально опробована, автоматизированная установка, которая позволяет проводить определение совокупности параметров ГДС характеризующих их визуальное качество.

4.Разработана автоматизированная установка для регистрации и расчета одновременно 3-х и более оптических параметров ГДС в автоматическом режиме:

5.Разработан метод повышения контраста изображений микроструктуры ГДС с прозрачным защитным слоем за счет одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения.

6. Создан экспериментальный образец флуоресцентно - интерференционного микроскопа, который позволяет получать изображения живой клетки с различными видамиконтраста и малым временем регистрации.

7.Разработан метод и программное обеспечение для расчета распределения оптико-физических параметров»внутри биологических объектов путем совместной обработки полученных изображений с различными видами контраста.

8.Проведено экспериментальное определение количества флуорофора в клетке эпителиального типа.

9.Получен критерий для определения распределения флуорофора в живой клетке.

1. Gabor D. A new microscopic principle // Nature.-1948.-V.l 61.-РР.777-778.

2. Leith E. N., Upatnieks J. Wavefront reconstruction with diffused illumination and three-dimensional'objects // J. Opt. Soc. Am.—1964.—V. 54.—P. 1295.

3. Лейт Э., Упатниекс Ю. Фотографирование с помощью лазера // Успехи физических наук.-1965.-Вып. 11.-С.521-538.

4. Денисюк Ю. Н., Суханов В. И. Голограмма с записью в трехмерной среде как наиболее совершенная форма изображения // Успехи физических наук.-1970.-Вып. №6.

5. Кольер Р., Беркхард К., Лиин Л. Оптическая голография. М.; Мир.1973. 450 с.

6. Гинзбург В.М., Степанов Б.М. Оптическая голография. Практические применения.-М.: Сов.1 радио. 1978.

7. Гинзбург В.М., Степанов Б.М. Голографические измерения.- М.: Радио и связь. -1981.

8. Гинзбург В. М. Голография методы и аппаратура.- М.: Сов: Радио.1974. -376 с.

9. Оптическая голография / Под ред. Г. Колфилда.- М.: Мир. 1982.- Т. 1,2.

10. Сороко Л.М. Основы голографии и когерентной оптики.- М.: Наука. 1971.

11. Сойфер В.А. Компьютерная оптика //Соросовский образовательный журнал.-1999.№4.-С. 110-115.

12. Островский Ю.И. Голография и ее применение М: Наука.- 1976 г.

13. Пен Е.Ф., Родионов М.Ю. Влияние брэгговской расстройки на искажения восстановленного изображения страницы данных в голографической памяти/Юфициальные материалы Третьего Международного Форума «Голография Экспо -2006» М.- 2006.- С.78-80.

14. Марков В.Б. Топографическая- память, основанная на угловой спекл-селективности объемных голограмм // Письма в ЖТФ. — 1998.-Т.24.-№7. — С.88-93.

15. Дзюбенко А.Г. Применение голографии в технике М: «Знание».-1976.

16. Карпенко В.И., Фещенко А.Б., Мазанов В.Г. Способы фокусирования СВЧ-излучения и принципы построения голографических устройств оптической обработки радиосигналов в оптоуправляемых антеннах.// Радиотехника.- №6.- 2001.- С. 38-42.

17. Нечаев C.G., Понькин В.А., Телков А.Ю. Алгоритм обработки результатов радиоголографических измерений в условиях искажения облучающего поля элементами конструкции сканирующей системы // Радиотехника.-.^,- 2001.- С. 91-96.

18. Андреев Г.А., Гладышев Г.А., Журавлев А.В. Моделирование голограммы и восстановление изображения при подповерхностном зондиро-вании//Радиотехника.- №7.- 2007.

19. Interferometric radar for remote monitoring of building deformations. / Pier-accini M., Tarchi D., Rudolf H., Leva D., Luzi G., Atzeni C. // Electron. Lett. 2000. 36, № 6, C. 569-570.

20. Сафронов Г.С. Определение формы, спектра и поляризации радиосигналов радиоголографическими методами.//Всесоюзная научно-техническая конференция "Измерение параметров формы и спектра радиотехнических сигналов" Тез. докл.- Харьков- 1981. С.227-229.

21. Карпеев С.В., Павельев B.C. Безопасная передача информации по BOJIC на основе ДОЭ, согласованных с поперечными модами // Материалы международного форума по голографии Експо-2004 Москва.-2004.-С.58-59.

22. БажановЮ.В. Коррекция аберраций голограммных дифракционных решеток, записанных в астигматических пучках// «Оптический журнал»,-2004.-Том 71,- № 1.-С.12-16.

23. Карпеев С.В. Улучшение характеристик волоконно-оптических датчиков на основе селекции поперечных мод с помощью ДОЗ // Материалы, международного форума по голографии Експо-2004.- Москва.-2004.- С.60-61.

24. Лукин A. Bt Комплекс прецизионных методов и устройств контроля-оптических элементов и многокомпонентных центрированных систем на основе осевых синтезированных голограмм. : Дис. д-ра1 техн. наук : 05.11.13-Казань.-2002.

25. Almazov А.А., Khonina S.N., Koltyar V.V. Multi-vortex laser beams: generation and detection phase, diffractive optical elements // Proceedings of Topical Meeting on Optoinformatics.- St.Petersburg. 2004,- P.51-52.

26. Алмазов А.А., Хонина C.H. ДОЭ для одновременного формирования нескольких световых пучков с заданным, орбитальным,угловым моментом // Материалы международного форума'по голографии Експо-2004.- Моск-ва.-2004,- С.56-57.

27. Сойфер В.А., Котляр В.В., Хонина С.Н., СкидановР.В! Дифракционные оптические элементы для оптического манипулирования микрочастицами // Материалы международного форума по голографии Експо-2004.-Москва.-2004.- С.62-63.

28. Довольнов Е. А. Голографические дифракционные структуры для оптических систем связи на основе фотополимерных материалов : Дис: канд. техн. наук : 01.04.05 Томск.- 2005.

29. Вест Ч: Голографическаяинтерферометрия -М.; МИР,- 1982,- 278с

30. Никитин А.К. Плазмонная оптометрия. -Автореф: дис. д.т.н. М.-Научно-технологический центр уникального приборостроения РАН.-2002 €.28.

31. Сильвестров И.С. Обнаружение источников отраженного сигнала с использованием методов голографии и методов решения задачи^ оптимизации.// 8 Международная конференция "Прикладные технологии гидроакустики и гидрофизики".- СПб .:Наука- -2006. С. 391 - 395.

32. S.A. Benton US Pat. No 3633989,1968.

33. Рябухо В.П., Горбатенко Б.Б., Максимова JI.A. Метод цифровой безопорной Фурье голографии. //Информационные технологии в науке, производстве и социальной сфере. - Сб. науч. тр./ под ред. Акад. Ю.В. Гуляева.- Саратов- «Научная книга»,- 2005 -С.266-273.

34. Балтийский С.А., Гуров* И.П., Де Никола С., Коппола Д., Ферраро П. Современные методы цифровой голографии/ В кн.: Проблемы когерентной и нелинейной оптики/ Под ред. Гурова И.П, Козлова -G.A. СПб:СПбГУ-ИМТО.- 2004.- С.91-117.

35. Ярославский Л.П. Цифровая обработка полей в оптических системах. Цифровая оптика. //Сб. «Новые физические принципы оптической обработки информации» / Под ред. С.А. Ахманова и М.А. Воронцова, М.: Наука, гл. ред. физ.-мат. лит.- 1990, 400 с.

36. Хуанг Т. Цифровая голография //Сб. «Применение голографии»/ Под ред. Дж.Гудмена,- М.: Мир;- С.65-78.

37. Ярославский Л.П., Мерзляков Н.С. Методы цифровой голографии -М.- Наука- 1977.

38. Гудмен Дж. Введение в Фурье-оптику М.- Мир - 1970.

39. Gallagher T.J. US Pat. No 4728377 ass. American Bank Note Сотр. 1988.

40. Mailloux D.R. US Pat. No 5066047, ass. Polaroid Corp. 1991.

41. Fabbiani B. US Pat. No 4889366.- 1989.

42. Принципы и цели световой микроскопии/ Под ред. А.Лейсли. М.: Из-дат-Школа .-1992.- с.200.

43. Бредбери С. Световая микроскопия в биологии: Методы М.- 1992.

44. Левин Г.Г., Вишняков Г.Н. Томографический микроскоп Линника для исследования оптически прозрачных объектов. Описание и технические характеристики. // Измерительная техника.- №1,- 1997,-с.46-48.

45. Вишняков Г.Н., Закарян К.С., Левин Г.Г.,Стрелецкая Е.А. Исследование оптически прозрачных объектов при помощи микроскопа Линника II Измерительная техника, №1, 1999, стр. 46-49.

46. Abdulkadyrov М. A., Belousov S. P., Ignatov A. N., Rumyantsev V. V. Non-traditional technologies to fabricate- lightweighted astronomical mirrors with high stability of surface shape.// Proceedings of SPIE, 3786, 1999, pp. 468-473.

47. Котов,О.И., Лиокумович Л.Б., Медведев A.B. Интерференционный метод измерения коэффициента экстинкции двулучепреломляющих волоконных световодов // Журнал технической физики. — 2007.-том 77.-вып. 9.-е.102-104.

48. Метелин В.Б., Минаев В.Л., Валов, А.Л., Конрадов А.А., Василенко И.А., Бабакова G.B.' Компьютерная фазово-интерференционная микроскопия в биологии и медицине // Сборник научных трудов. -2003'.- Красноярск.

49. Левин Г.Г., Ковалев А.А., Минаев В.Л., Сухоруков К.А. Оценка точности измерения сухой массы клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе //Измерительная техника.- 2004.- С.62-67.

50. Dunn G. A. Transmitted-light interference microscopy: a technique born before its time // Proceedings of the Royal Microscopical Society.- 1998.- 33.-P.189-196.

51. Сребницкая Л.К., Вишняков Г.Н., Нейман C.A., Рождественская З.Е. Мониторинг ориентации миозиновых мостиков по двумерным картам двулучепреломления в одиночных мышечных волокнах// Биофизика. — 2001. Т.47. - Вып. 4. - С. 686-690.

52. Левин Г.Г., Булыгин Ф.В., Вишняков Г.Н. Когерентные осцилляции состояния-молекул белка в живых клетках // Цитология. — 2005. Т.47. - №4. -G.348-356.

53. Стрелецкая Е.А., Цыба Н.Н., Козинец Г.И., Левин Г.Г., Вишняков Г.Н. Сопоставление интегральных характеристик лимфоцитов здоровых людей и больных хроническим лимфолейкозом // Клиническая лабораторная диагностика. 2000: - №4. - С.21-23.

54. Тычинский В. П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов //Успехи физических наук,- 2001.- Т.171.-№6.

55. Захарьевский А.Н., Кузнецова А.Ф. Интерференционные биологические микроскопы // Цитология.- 1961.- Т.З.- №2.- С.213-224.

56. Тычинский В.П. Компьютерный фазовый, микроскоп,- М.: Знание, 1989.- 64с.

57. Лежнев Э.И., Попова И.И., Кузьмин С.В., Слащев С.М. Конфокальная сканирующая микроскопия: принципы, устройство; применение (часть 1) //Научное приборостроение.-2001.-Т.11.-№2.- С.3-20.

58. Лежнев Э.И., Попова И.И., Кузьмин С.В., Слащев С.М. Конфокальная сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 2) //Научное приборостроение.-2001.-Т.11.-№3.- С.26-42.

59. Kawata S., Nakamura O., and Minami S. Optical microscope tomography. I. Support constraint. J.Opt.Soc.Am. A, 1987, v.4, pp.292-297.

60. Lauer V. Observation of biological objects using an optical diffraction tomographic microscope.// Proc. SPIE, 2000, vol. 4164, p. 122 133.

61. Dlugan A, MacAulay C., Lane P. MICROSCOPIC OPTICAL TOMOGRAPHY // 7th Congress of the European Society for Analytical Cellular Pathology, 1-5 April 2001, report Z003.

62. Vishnyakov G.N., Levin G.G., Zakerian C.S. Interferometric computed microtomography of 3D phase objects // Proc. SPIE.- 1997.- V.2984.- P.64-71

63. Vishnyakov G.N., Levin G.G. Optical tomography of living cells using phase-shifting Linnik microscope // Proc. SPIE.- 1998.- V.3568.- P.197-200.

64. Bussard J.W. US Pat. No 5455129.- 1995.

65. Микроскопы./Под ред. H. И: Полякова,- М., -1969.

66. Carol J. Cogswell, Kieran G.Larkin, Hanno U. Klemm Fluorescence micro-tomography: Multi-angle image acquisition and 3D digital reconstruction // Proc. SPIE.- 1996.- V.2655.- P.109-115.

67. Патент №2140661 (Россия). Способ конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии и конфокальный сканирующий томографический микроскоп. Левин Г.Г., Вишняков Г.Н:, Булыгин Ф.В., заявл. 19.03.99.

68. Кузьмичев В.М., Похилько С.Н. Методика измерения обобщенной площади сечения лазерного пучка. // Измерительная техника.- 2000.- № 3. С.

69. Соловьев А.П., Зюрюкина О.В., Перченко М.И.// Письма'в ЖТФ. 2000. Т. 26. №19. С. 72.

70. Иванов B.C., Котюк А.Ф., Либерман А.А., Овсик Я., Улановский М.В. Фотометрия и радиометрия оптического излучения. Книга 2. Энергетическая лазерометрия. М.: Полиграф сервис. -2000.-212 с.

71. Арутюнан С.Г., Васинюк И.Е., Добровольский Н.М., Маилян М.Г., Оганесян В.А., Синенко И.Г. Proc. Conference on Laser Physics. 2000: Ереван. C.81.

72. Бондарь И.И., Суран В.В., Бондарь Д.И.// Оптика и спектроскопия. 2004. Т. 96. № 4. С. 655.

73. Creath К. Phase-shifting specie interferometry //APPLIED OPTICS.- 1985.-Vol.24.-№18. -P3053-3058.

74. Борн M., Вольф Э: Основы оптики,- M.: Наука,-1970.

75. Виноградова М:Б., О.В!Руденко, А.П.Сухоруков, Теория волн, М.: Наука, 1990.

76. Бондарь И.И., Суран- В:В., Бондарь Д.И.// Оптика и спектроскопия. 2004. Т. 96. -№ 4.- С. 655.

77. Левин Г.Г., Вишняков Т.Н. Оптическая томография. -М.: Радио и связь, 1989.- 224 с.

78. Бутаков Е.А.,, Островский В.И., Фадеев И.П. Обработка изображений на ЭВМ. М: - «Радио и связь»,- 1987.

79. Szoplik Т., Burski М., Stepien P., «Criteria On Which A Judgement Of Optically Variable Security Marks May Be Based», Proc. Of SPIE, Vol. 2659, pp.181-186,-1996.

80. Оптическая голография //Под ред. Г.Колфилда, М., Мир, 2т.,735 с.

81. Власов Н.Г., Рябова Р.В., Семенов С.П. Голограммы Лейта, восстанавливаемые в белом свете// Сб. «Топографические методы исследова-ний»(Материалы X Всесоюзной школы по голографии), Л-д.,1978.

82. Lohmann A.W., Paris D.P. Binary Fraunhofer holograms, generated by computer // Appl.Opt., 1967 v.6, -No.10,- pp.1739-1748,.

83. Hamano Т., Yoshikawa H. Image-type CGH by means of e-beam printing// Proc. SPIE,- v.3293,- pp.2-14.

84. Iwata.F. Grating image technology// Proc. SPIE, 1995-v.2577, - pp.66-70,.

85. Staub R., Tompkin W.R. Self-referencing diffractive features for OVD's // Proc. SPIE,- 2000- v.3973,- pp.216-223.

86. Lancaster I.M. The future security application of optical holography// Proc.SPIE,- 1995- v.2577- pp.71-75:

87. Canny J. F. Finding edges and lines in images. Master's thesis, MIT.// AI Lab. TR-720,1983.

88. Павлидис Т. Алгоритмы машинной графики и обработки изображений М: Радио и связь, 1986.

89. Rafael С. Gonzalez and Richard Е. Woods. Digital Image Processing.// Addison-Wesley Publishing Company, -1992,- chapter 7.

90. Андерсон Т. Статистический анализ временных рядов. М.: Мир, 1976. 96»Бендат Дж., Пирсол А-. Применения спектрального и корреляционного анализа - М.: Мир, 1983.

91. Банди Б. Методы оптимизации. Вводный курс М.: Радио и связь, 1987, с.125.

92. Handbook of Biological Confocal Microscopy, //ed: J.B.Pawley, Plenum Publishing, -1990.

93. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток; мембран и липопротеинов, М.:Наука,-1989, -с.263.

94. Казачкина Н. И., Якубовская Р. И., и др. Скрининг и. медико-биологическое изучение отечественных фотосенсибилизаторов. М.: «Российский химик»- №5,- 1998,- с. 100.

95. Киселев Ф.А., Павлиш О.А., Татросян А.Г. Молекулярные основы канцерогенеза у человека. М.: Медицина,-1990,- с.276.

96. Кузнецов Н.А. Фотокаталитическая генерация активных форм1 кислорода в биологических средах в методе фото динамической терапии. М.: «Российский химический журнал»,- №4,- 1998,- с.37-41.

97. Лукьянец Е.А. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии.- М.: «Российский химический журнал»,- №4, -1998,- с.25-29.

98. Мельников Е.В.Флуоресцентные зонды в выявлении поврежденных клеток. Автореферат. Пущино,-1987.

99. Levin G.G., Bulygin T.V., Kalinin E.V., Vishnyakov G.N. 11 Proc. SPIE.-2001.-v.4260.-pp. 149-154.

100. Булыгин Ф.В., Левин Г.Г. // Оптика и спектроскопия.- 1998.- т.84.- № 6.- с.968.

101. Ford В.К., Volin С.Е., Descour M.R. et al.// Proc. SPIE.- 1998.- v. 3438.-pp.313-320.