Интерполимерные комплексы нуклеиновых кислот с белками тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК O-virí !Л ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ЫНСПП У г ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИИ

?г§ од

I ü 1Л1

! ЯДНОВА ; ¡";:ua Юрьевна

S i H ТЕРНОЛИМ EPI ILÍ E КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С БЕЛКАМИ

•к.-л» - ХИМИ*: BMCOKG.WWIC'CVJISpiIblX u;«í,"::t.V-:¡;:.

АВТОРЕФЕРАТ дчесеръ-иши. па соискание ученой спсчтени кандидата хим;;"есккх наук

Саикг-Петербур!

2000

Работа выполнена!; Институте высокомолекулярных ..' ..чтении РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук Л.К. ШАТАЕВА

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор В.Х. ХАВИНСОН Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Г.П. ВЛАСОВ доктор физико-математических наук А.Л. ТИМКОВСКИЙ

Ведущее учревдение:

Санкт-Петербургский государственный университет, физически)! фа куль кафедра молекулярной биофизики.

Защита диссертации состоится '¿ЦЭ " 2000 г. и 10'"' ч;

на заседании диссертационного совета Д 002.72.01 и Инети; высокомолекулярных соединений РАН (199004, Санкт-Петербург. Васильеве остров, Большой проспект, д. 31.).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Икс и•.,

высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан _ _ 2000 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук

Н.П.КУ ледова

Р ЩА М1 • М} о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Создание медицинских препаратов нового жоления, способных усиливать защитные функции организма, корректировать ;таболизм и управлять длительностью клеточного цикла, является шоритетным направлением для большинства современных наук и, в частности, [мии высокомолекулярных соединений. В настоящее время в качестве таких »епаратов, влияющих на клеточный цикл, используют различного рода стракты из тканей животных, содержащие биорегуляторы белковой природы: :йропептиды, факторы роста, иммуностимуляторы. Использование таких ществ в виде высокоочищенных препаратов при решении медицинских и ронтологических задач не всегда является успешным из-за короткого времени из ни этих белков в плазме крови и цитоплазме.

Как известно, один из способов пролонгирования действия гормона или :гуляторного вещества и его целенаправленного транспорта в организме •стоит в том, что его включают в интериолимерный комплекс (ИПК), при этом 1иболее надежными носителями являются линейные полиэлектролиты. С одной ороны, нуклеиновые кислоты (НК) - ДНК и РНК - относятся к группе сильных шейных полиэлектролитов, которые несут постоянный избыточный заряд на эсфатных группах и могут быть использованы в качестве полимера-носителя. С )угой стороны, участие ДНК в ИПК стабилизирует ее структуру, защищает от (сщепления клеточными нуклеазами и обеспечивает транспорт такого »мплекса в цитоплазму и в ядро клетки. Поэтому исследование особенностей »млексообразования ДНК и белков представляет большой теоретический и мктический интерес.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в получении и (учении комплексов ДНК с глобулярными неядерными белками для абилизации макромолекулы ДНК, а также выделения и изучения природных :анеспецифических препаратов, перспективных для перорального применения.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие дачи:

1. Оценить обратимость комплексообразования нативной ДНК с глобулярными белками, отличающимися изоэлектрическими точками и количеством заряженных групп при рН 8.0±0.1 (физиологические условия) в диапазоне ионной силы - 0.1 -s-0.5 н.

2. Определить коэффициенты связывания глобулярных белков с ДНК при разных концентрациях и сравнить полученные закономерности с взаимодействием ДНК с ядерным тканеспецифическим регулятором пептидной природы, входящим в состав хроматина.

3. Оценить изменеirae конформации природного полиэлектролита-носителя -ДНК при взаимодействии с белками и сравнить морфологию природных и модельных нуклеопротеиновых комплексов (НПК) с морфологией нативной ДНК.

4. Определить тканеспецифичность природных и модельных комплексов

ДНК с белками.

Научная новизна. Целенаправленные усилия современной биохимии I генетики направлены на поиск селективных центров (сайтов) взаимодействи: ДНК с регуляторными белками, входящих в состав хроматина, а также изучении конформационных изменений ДНК при таких взаимодействиях. Однако, да начала представляемой работы не проводилось физико-химически: исследований закономерностей связывания НК с глобулярными неядерным] белками. Это и определяет научную новизну представляемой работы. В работе впервые:

1. Разработан метод фракционирования нативной ДНК микрофильтрацией н; трек-мембранных модулях.

2. Изучено связывание ДНК с неядерными глобулярными белками, которые отличаются кислотно-основными характеристиками, исследован; устойчивость полученных комплексов в интервале ионной силы 0.1+0.5 н 1 построены изотермы связывания ДНК с белками инсулином, цитохромом С пепсином и кортексином при ионной силе раствора 0.3 н.

3. Вискозиметрически определена характеристическая вязкость модельны: НПК при различном заполнении макромолекулы ДНК цитохромом С инсулином, пепсином и кортексином. Показано, что при образованш интерполимерных комплексов наблюдается значительная компактизаци: молекулы ДНК, что подтверждено электронно-микроскопическш сравнением морфологии природной ДНК и ее комплексов с цитохромом С ] кортексином.

4. Методом аффинной хроматографии показано, что модельные и природные НПК полипептидов мозга обладают повышенной селективность» связывания с сорбентом, содержащим иммобилизованные мембраны клето] коры головного мозга, по

сравнению с другими исследованными белками и их комплексами. Эт( свидетельствует о тканеспецифичности НПК, которая определяется белковь» компонентом

5. Тканеспецифическое действие НПК мозга и печени подтверждено ] органотипической культуре ткани.

Практическая значимость. Значимость выполненной работь определяется тем, что закономерности нековалентного связывания белков с ДН1 могут быть использованы для создания новых пролонгированных фор]\ лекарственных препаратов. Результаты исследований выполненных в рамка: представляемой работы, были использованы при разработке промышленной регламента и технических условий на выделение органопрепаратов новоп поколения - цитаминов. На их основе в настоящее время выпускаются лечебно профилактические препараты (биологически активные добавки к пщце).

Связь с основным планом НИР института. Работа является часть» плановыхисследований по теме X научных исследований ИБС РАН "Экохро» 95-98" - программы по созданию новых полимеров, в том числе для мембранной

зхнологии, решения экологических задач и развития новых хроматогра-ических методов а также касается разработки научных основ создания олимерных систем, обладающих биологически активным направленным гйствием для целей медицины и биологии.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на аутом семинаре Российского Химического общества им. Д.И. Менделеева по роматографии (март 1999 год), на международной конференции "Фармация в XI веке: инновации и традиции" (С-Петербург, апрель 1999), на 2-й сероссийской конференции с международным участием "Актуальные роблемы экспериментальной и клинической фармакологии" (С-Петербург, юнь, 1999 год), на конкурсе молодых специалистов ИВС РАН (декабрь 1998 ад).

'о теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 научные статьи.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 124 страницах ашинописного текста, включая 31 рисунок и 7 таблиц; состоит из введения, эех глав, выводов и приложения. Библиографический указатель включает 156 сточников (7% отечественных и 78 зарубежных).

Во введении сформулирована цель работы, основные положения, ыносимые на защиту, показана актуальность, научная новизна и практическая тачимость работы.

В первой главе приведен краткий обзор существующих представлений о груктуре и свойствах ДНК, а также ее комплексов с заряженными эединениями различной природы.

Во второй главе описаны объекты исследования и изложены основные етодические подходы, которые были применены для изучения особенностей эмиле ксообразования и свойств модельных и природных нуклеопротеиновых омплексов, в том числе методика фракционирования ДНК при икрофильтрации растворов НК на трек-мембранных модулях.

В третьей главе представлены результаты экспериментальных сследований взаимодействия ДНК с модельными белками, природных НПК, осуждение полученных зависимостей, а также обсуждение практической тачимости полученных результатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы природный жесткоцепной полиэлектролит - ДНК з селезенки крупного рогатого скота, глобулярные белки: пепсин, цитохром С, нсулин, различающиеся кислотно-основными характеристиками; полиамин -ротамин и комплекс полипептидов мозга - кортексин. Основные арактеристики белков, включенных в модельные комплексы представлены в аблице 1. Кроме модельных комплексов ДНК исследовали также природные уклеопротеиновые комплексы, выделенные из головного мозга, тимуса и ечени крупного рогатого скота.

Все эксперименты проводили с растворами веществ в фосфатном буфере,

Таблица 1. Основные характеристики модельных белков

Белок р! ММ, Да Количество ионогенных групп Суммарны йзаряд при

кислые основные рН= 8.0

Пепсин 2,0 36 400 42 6 36"

Инсулин 5,4 11 500 6 4 2"

Цитохром С 10,6 13 000 20 24 4+

Кортексин 9,5 10 000 4 6 2+

Протамин 11,5 7 000 30-32 30-32+

рН=8.0±0.1. Для гель-хроматографии в работе использованы Сефадексы производства фирмы "Pharmacia" (Швеция): G-50 superfine, G-150 medium, G-200 superfine. Концентрации ДНК и белков в пробах контролировали аналитическими методами - НК по оптической плотности при 260 и 280 нм, белок измеряли по методу Лоури.

В основу разработанного метода фракционирования ДНК положен известный факт ориентации жесткоцепных линейных макромолекул в гидродинамическом потоке; при этом степень ориентации будет пропорциональна напряжению сдвига. В представляемой работе мы впервые экспериментально использовали сдвиговые напряжения в щелевой камере концентрата при микрофильтрационном и в тангенциальном потоке. Были использованы микрофильтрационные модули плоского типа марки ПФМ, производимые АО "Микропор" (Россия), имеющие суммарную площадь фильтрующей поверхности 480 см2. В качестве фильтрующего материала в них применены лавсановые трековые мембраны (ТМ) с размером пор 0.3 мкм. Для отработки режимов микрофильтрации вязких растворов и их фракционирования использовали природный полисахарид - альгиновую кислоту. Разработанный метод фракционирования вязких растворов жесткоцепных макромолекул был использован для отделения низкомолекулярных фракций ДНК, содержащихся в исходном коммерческом препарате, от высокомолекулярной фракции ДНК, изучение комплексообразования которой с глобулярными белками являлось целью работы.

При микрофильтрации ДНК исследовали различный диапазон скоростей одачи раствора в камеру концентрата. При скоростях (0,4 - 6,0)-10"^ м^-ч"1 аблюдается линейная зависимость скорости фильтрации от скорости подачи сходного раствора. Причем за время эксперимента засорения мембраны и нижения скорости фильтрации не происходило. Для получения ысокомолекулярной фракции ДНК была подобрана такая скорость, что тделение концентрата в стационарном режиме микрофильтрации проходило ри практически постоянном напряжении сдвига. Растворы ДНК в 0,1 и растворе ¡аС1 прокачивали через ПФМ при разных скоростях и измеряли скорость птльтрапии в проточном и рециркуляционном режиме. Для расчета значений олекулярных масс компонентов в концентрате и фильтрате мы использовали астную форму уравнения Марка-Куна-Хаувинка для нуклеиновых кислот:

[Л]= 1,05 • 10"7- М ш (1)

де М - молекулярная масса компонента, Да, [г|] - характеристическая язкоеть, длт1 .

При длительной микрофильтрации в рециркуляционном режиме раствора [НК было достигнуто концентрирование в 5 раз и был получен препарат ДНК с арактеристической вязкостью 20 длт'1 и средневязкостной молекулярной ассой 1880 кДа, который впоследствии использовали для изучения физико-имических особенностей комплексообразования ДНК с модельными тобулярными белками. Этот метод оказался неэффективным при разделении ',НК с белками, т.к. значительная часть ДНК после образования уклеопротеинового комплекса не задерживалась в камере концентрата и опадала в фильтрат.

Для вычисления средней молекулярной массы фракций ДНК, получешплх ри микрофильтрации, проводили определение характеристической вязкости, тот же метод был использован нами для оценки изменения конформашт акромолекулы ДНК при комплексообразовании с модельными белками, арактеристическуто вязкость модельных 11ПК определяли после их выделения з равновесной смеси со свободным белком методом гель-хроматографии, определение относительной вязкости проводили методом последовательных азведений, используя вискозиметр Оствальда, с капилляром 0.73 мм при 20° С. змеряли время истечения термостатированных в течение 20 минут растворов НК с концентрациями 0.02^0.7 мгсм'\

Кинетику диффузии белков через пористые мембраны измеряли в зухкамерной ячейке с объемом камер 50 см' и окошком диаметром 2.65 см. Для иализа использовали сложенные вдвое трековые мембраны на основе лавсана злщиной 10 мкм, с диаметром пор 0.46 мкм.

о экспериментальной зависимости удельного потока белка 1° через мембрану тределяли коэффициент проницаемости Р индивидуального белка через )ековую мембрану по следующим формулам:

окошка [см], Ct - концентрация белка в приемной камере в момент t [мг-см"3].

где: L - толщина мембраны (см), С0- начальная концентрация белка в

В той же ячейке проводили аналогичный эксперимент, помещая в ресурсную камеру проинкубированную систему белок-ДНК. В приемной камере измеряли диффузию свободного белка из ресурсной камеры, рассчитывали удельный поток и концентрацию свободного белка, который находится в равновесии с

Результаты, полученные для модельных систем были использованы для разработки методов выделения и очистки природных НПК С помощью щелочного гидролиза были выделены и исследованы препараты из коры головного мозга, тимуса и из печени крупного рогатого скота. На всех последующих этапах работы для получения растворов НПК использовали только делипидизированные препараты; их растворяли в щелочных растворах с последующим доведением pH до 8.0. Для того, чтобы охарактеризовать компонентный состав природных НПК, использовали методы электрофореза, гсль-хроматографии, определения содержания липидов, белков (по аминокислотному анализу).

Электрофорез проводили в 16% полиакриламидном геле (ПААГ). В качестве свидетелей использовали стандартный набор белков фирмы "Serva" (Австрия) с разными молекулярными массами.

Ферментативный гидролиз препаратов природных НПК и модельного комплекса ДНК-инсулин проводили ДНКазой и трипсином (при соотношении ф е р м е нт: су б стр ат 1:10 по сухому весу. Для оценки глубины гидролиза смесь после гидролиза фракционировали на колонке с Сефадексом G-150, как и исходные препараты. Определяли содержание белка в НПК и его фракциях методом Лоури.

Для получения аффинного сорбента проводили пространственную иммобилизацию лиофилизированых клеточных мембран мозговой ткани. В качестве полимера-носителя использовали полиакрилонитрил. Полученный сорбент загружали в колонку, наносили пробу раствора и проводили элюцию фосфатным буфером. Коэффициент распределения при аффинной хроматографии определяли по формуле:

[cmv],

(3)

ресурсной камере при t=0 (мг-см"3).

НПК.

К

:: V - элюционный объем [мл], У0- свободный объем колонки [мл]. У5 - объем щионарной фазы [мл].

Биологическую активность природных НПК в работе исследовали на тест-:теме эксплантатов спинномозговых ганглиев и фрагментов коры головного зга. Критерием биологической активности служит индекс площади (ИП) -юшение площади всего ганглия вместе с зоной роста к исходной площади, стовериость различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с иошью ^критерия Стьюдента, р<0.05. Значения ИП выражали в процентах по гошепию к контрольному значению ИП.

Электронную микроскопию препаратов ДНК и НПК проводили в :ктронном просвечивающем микроскопе ЭМВ-100Л при ускоряющем тряжении 75 кВт и увеличении 40 ООО. Для каждого образца исследовали 25-30 1сй зрения. Микрофотографии получали способом контактной печати с гопластинок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Об изменении структуры ДНК при комплексообразовании с модельными ]ками качественно свидетельствует изменение УФ-спектра. В таблице 2 введена величина изменения оптической плотности при образовании лплексов ДНК с модельными белками, которую рассчитывали по следующей рмуле:

( Е 4

_ смеси__

V ^ДНК + ^ белка ]

х 100% (5)

блюдаемый для комплексов ДНК с белками инсулином, цитохромом С и 1Сином гииерхромный эффект свидетельствует о том, что происходит ленение конформании и структуры ДНК. Причем в случае взаимодействия [К с пепсином значение гиперхромного эффекта очень велико. Это говорит о

Злица 2. Изменение оптической плотности растворов ДНК при лплексообразовании с модельными белками * (длина волны 260 нм).

мплекс ДНК- ДНК- ДНК- ДНК- ДНК-

протамнн кортексин инсулин иитохром С пеисин

менение

гической - 34 % - 10% + 29 % + 15 % + 35 %

этности

Результаты представлены в процентах от оптической плотности растворов пивной ДНК в той же концентрации, суммированной с оптической ттостыо белка. Положительное значение соответствует гиперхромному фекту, а отрицательное - гипохромному.

том, что происходит практически полная утрата упорядоченной двухспирально] структуры нуклеиновой кислоты. Наличие гипохромного эффекта пр. комплексообразовании ДНК с протамином связано с переходом вторично! структуры ДНК в третичную, как это было показано в литературе. Появлени гипохромногозффекта при взаимодействии ДНК с кортексином представляющим собой комплекс основных пептидов, возможно являете; следствием образования надмолекулярных структур ДНК, как это происходит случае ее взаимодействия с гистонами.

Исследование взаимодействия ДНК с модельными белками методол гель-хроматографин. В работе мы изучали комплексообразование нативной

Е 04-1

Рис. 1. Гель-хроматографи; нуклеопротеинового комплекс; ДНК-пепсин (1=0.3 н). Е оптическая плотность раствор; при длине волны: (1) - 234 нм (2) - 260 нм, У-относительньн объем выхода, С - концентра ция белка (мг-см°).

Рис. 2. Гель-хроматографю комплекса ДНК-кортексш (1=0.3 н). Е - оптическа! плотность, V - относительны! объем выхода, С концентрация белка (мг-см"3). (а) гель-хроматографш

исходного раствора, (б рехроматография первого пик; хроматограммы (а)

ДНК с белковыми вешествами с различными изоэлектрическими точками (см. табл. 1). При этом ДНК рассматривали как природный полиэлектролит с одноосновными отрицательно заряженными фосфатными группами и не заряженными аминогруппами. В случае белков, выбранное для исследований значение рН 8.0±0.1 для лротамина, кортексина и цитохрома С определяет избыток положительных зарядов, тогда как для инсулина и пепсина при этом значении рН молекула несет избыточный отрицательный заряд.

с

-004

Рис. 3. Гель-хроматография НПК ДНК-инсулин при различной ионной силе раствора. Е - оптическая плотность, V -относительный объем выхода, С -концентрация белка (мг-см"3)

Методом гель-хроматографии исследовали образование и устойчивость интерполимерных комплексов ДНК с модельными белками, различающимися своим суммарным электростатическим зарядом, при ионной силе раствора 0.1, 0.3, 0.5 н. На рисунке 1 представлена гель-хроматография модельного комплекса ДНК-пепсин. Видно, что при смешивании растворов компонентов происходит связывание ДНК с белком. Об этом свидетельствует наличие белка в первом пике, содержащем ДНК и выходящем с объемом задержки колонки, в то время как свободный, не связанный белок выходит во втором пике. Для комплекса ДНК с кортексююм была проведена рехроматография пика, в котором содержится нуклеопротеиновый комплекс. На рисунке 2 представлены результаты экспериментов, которые свидетельствуют о том, что этот НПК практически не диссоциирует при рехроматографии и следовательно, является устойчивым в условиях экспериментов. Оценивали также устойчивость полученных комплексов при различной ионной силе раствора. На рисунке 3 представлены выходные кривые гель-хроматографии НПК ДНК- инсулин в интервале ионной силы раствора 0.1-0.5 н. Инсулин при выбранном значении рН имеет тот же знак суммарного заряда, что и молекула ДНК, однако увеличение ионной силы не увеличивает диссоциации комплекса. Иначе говоря, добавление низкомолекулярного электролита не приводит к диссоциации комплекса ДНК-инсулин, и распределение белка между ДНК и свободным раствором не зависит от ионной силы раствора. Вероятно, при образовании комплекса ДНК-инсулин происходит связывание основных аминокислотных остатков белка с полифосфогликозидной цепью ДНК с последующим их стерическим подстраиванием к парам гетероциклических оснований и частичным разрушением водородных связей между ними. Для комплексов ДНК-пепсин и ДНК-цитохром С можно предположить, что помимо взаимодействия карбоксильных групп белков с аминогруппамиоснований, происходит встраивание ароматических структур тирозина и порфириновой группировки в двухцепочечную спираль ДНК по механизму интеркаляции. При этом, как свидетельствует гиперхромный эффект, происходит частичное изменение структуры ДНК с возможным нарушением спаривания оснований.

Комплексообразование ДНК с модельными белками по данным метода мембранного диализа. Для того, чтобы исследовать количественные закономерности и построить изотермы связывания ДНК с модельными белками, исследовали комплексообразование этих веществ при различных весовых соотношениях компонентов в исходной смеси. При увеличении концентрации протамина при смешивании его с ДНК до соотношения 1:6, происходило образование нерастворимого комплекса, поэтому протамин не использовали в дальнейших экспериментах. При варьировании количественного соотношения компонентов в системе ДНК-белок, меняется концентрация свободного белка в ресурсной камере, что связано с разной степенью ассоциации белка с ДНК. В таблице 3 приведены основные характеристики взаимодействия белков с ДНК.связывания ДНК с исследованными белками. Изотермы связывания для

гаемых систем представлены на рисунке 4. Процесс комплексообразовання всех случаев описывается кооперативной изотермой. При взаимодействии ( с цитохромом С, кортексином и пепсином происходит резкое возрастание 1ени связывания после уровня концентрации свободного белка в растворе того 0,5 мг-см"3. Тогда как при связывании с инсулином линейный участок гермы наблюдается до концентрации белка 3,5 мг-см"3. Анализ полученных

12.0- иигохромС

Рис. 4. связывания белков с ДНК

Изотермы модельных

равновесная концентрация белка, мг-см"3 ¡лица 3. Основные характеристики интерполимерных комплексов ДНК:белок

Белок Весовое соотношение комп. Исходное молярное соотношение Молярное соотношение в комплексе Коэф-т связывания. п пг

а* б* а* б* кР

1:3 1 430 1 0.08 1 150 1 0.03 0.6 7 0.98

'сулин 1:6 1 900 1 0.16 1 230 1 0.04 0.8 6 1.53

1:17 1 2800 1 0.50 1 900 1 0.16 1.0 6 5.66

1:3 1 430 I 0.08 1 160 1 0.03 2.2 7 1.08

итохром С 1:6 1 870 1 0.16 1 850 1 0.15 6.8 7 5.68

1:16 1 1830 1 0.30 1 1800 1 0.32 18.2 3 12.36

1:3 1 150 1 0.03 1 18 1 0.003 0.8 313 0.35

:псин 1:6 1 310 1 0.06 1 150 1 0.03 5.0 40 2.75

1:16 1 830 1 0.15 1 470 1 0.08 6.4 12 9.0

эртексин 1:6 1 1290 1 0.25 1 550 1 0.10 5.3 7 4.17

1:14 1 2900 1 0.50 1 2070 1 0.37 19.0 3 11.0

а* - молярная концентрация ДНК и белка рассчитанная по молекулярным ссам

б* - молярная концентрация белка отнесена на звено (основание) ДНК п - количество звеньев ДНК, которое связано с молекулой белка, т -отношение количества связанного белка к количеству ДНК.

данных показывает, что образование устойчивых комплексов ДНК с белка происходит только при большом избытке белков, в частности, минималы изученное молярное соотношение составляло 1:150 для комплекса ДНК пепсином. Полученные данные позволяют построить изотермы

Вязкостные характеристики ДНК при взаимодействии с белками данной работе в качестве метода, косвенно свидетельствующего компактизаш-ш макромолекулы ДНК, использовали опенку измене} характеристической вязкости. На рисунке 5 представлен график определе} характеристической вязкости растворов модельных комплексов ДНК с белка! При взаимодействии нуклеиновой кислоты с белками различной приро; меняется угол наклона прямых к оси, что свидетельствует о различт морфологии комплексов. На рисунке 6 приведена зависимо! характеристической вязкости от количества звеньев ДНК, которые приходятся 1 молекулу белка (плотность заполнения молекулы ДНК молекулами бель Видно, что для комплексов ДНК со всеми модельными белками при увеличен весового содержания белка характеристическая вязкость уменьшается, причем

Рис. 5. Определен

характеристической вязкости (дл/г) растворов комплексов ДНК белками при количественн соотношении компонентов в раствс 1:6. (1) - цитохромом С, (2) инсулином, (3) - пепсином, (4) кортексином.

Пунктиром обозначена прямая д определения [ц]0

характеристической вязкое

свободной ДНК. С - концентрац ДНК в растворе (мг-см°).

Рис. 6. Зависимость характерист ческой вязкости нуклеиновой кислот [г|] (длт"1) от количества связанно белка: [r¡]0 - свободная ДН нуклеопротеиновые комплексы: (1) ДНК-цитохром С, (2) - ДНК-инсули (3) - ДНК-пепсин, (4) - ДН1 кортексин. п - количест) нуклеотидных. оснований ДН! связанных с молекулой белка.

¡начешш характеристической вязкости при максимальном заполнении белками молекулы ДНК очень близки для всех исследованных моделей. Однако, характер вменения этой величины различен. Можно сделать вывод, что процесс сомпактизации ДНК при взаимодействии с белками, отличающимися кислотно-юновными и фугаетескими свойствами, идет по-разному. При взаимодействии ДНК с инсулином происходит постепенное уплотнение структуры НК с юследующей суперспирализацией молекулы НПК, как это было показано для ¡заимодействия ДНК с гистонами. Более компактная структура комплекса ДНК-шсулин, возможно, обеспечивает прочность НПК при увелтении ионной силы »аствора, что было показано методом гель-хроматографии.

При связывании ДНК с цитохромом С процесс компактизэции протекает шмного интенсивнее. Даже при наличии небольшого количества белка, юзможно происходит образование нелинейных структур типа "ожерелье" и (альнейшее увеличение количества белка ведет к суперспирализации молекулы ЩК. В случае комплексообразования ДНК с пепсином, изменение :арактеристической вязкости НПК наблюдается только при высоком :оличественном содержании белка в комплексе. Очевидно, что вопрос 1еханизма образования комплексов ДНК с кислыми белками требует [альнейших исследований и расширения методических подходов.

Исследование природных нуклеопротеиновых комплексов, "ехнологический прием, положенный в основу получения природных [уклеопротеиновых комплексов, состоит в том, чтобы в условиях мягкого мелочного гидролиза - клетки сохранить структурные элементы хроматина, в

Таблица 4. Основные компоненты нуклеопротеиновых комплексов, ыделенных из коры головного мозга, тимуса и печени крупного рогатого скота.

'кань Липиды (до делипиди- зации), весовые % Белок(после делипидизации), весовые % НК (после делипидизации), весовые %

по Лоури по данным а/к состава

оловной мозг 23.0 50 58 20

имус 12.3 75.2 49 19

[ечень 18.6 54.3 62 18

Примечание: использование стандартных белков и ДНК для калибровок риводит к существенным расхождениям при анализе нестандартных смесей и омплексов, содержащих пептиды с пониженным содержанием ароматических чинокислот

которых эндогенные белки-регуляторы естественно объединены с соответствующими специфичными участками ДНК. Изучение растворимости препаратов НПК коры головного мозга, тимуса и печени в 0.1 н растворе хлористого натрия обнаружило, что исходные и делипидизированные препараты обладают минимальной растворимостью в области рН 5.5 - 6.0. После выделения НПК проводили трехкратную исчерпывающую делипидизацию сухого осадка хлороформом, который является универсальным растворителем для всех классов липидов. Биохимический состав нуклеопротеиновых комплексов из коры головного мозга, из тимуса и из печени приведен в таблице 4. В зависимости от типа ткани, из которой выделе}! НПК в препаратах содержится разное количество белков и липидов. Содержание нуклеиновых кислот практически одинаково во всех препаратах в связи с тем, что клетки всех дифференцированных тканей организма содержат одинаковых набор хромосомных нуклеиновых кислот. Анализ гель-хроматографических кривых НПК тимуса и печени показывает, что в препаратах содержатся высоко- средне-и низкомолекулярные фракции. НПК имеют примерно одинаковый порядокмолекулярных масс компонентов в пиках выходных кривых. Высокое содержание белка в высокомолекулярной фракции препарата коры головного мозга, вероятно, вызвано существованием прочных интерполимерных комплексов нуклеиновой кислоты со специфическими белками мозга, которые, как правило, имеют щелочную природу. Данные электрофореза природных НПК головного мозга, тимуса и печени крупного рогатого скота подтверждают результаты гель-хромато!рафии о том, что в полученных комплексных препаратах, содержатся белковые компоненты с широким молекулярно-массовым распределением. В препаратах НПК головного мозга присутствуют белки с молекулярными массами в области 5-10 и 20-24 кДа.

Для оценки устойчивости полученных природных препаратов НПК по отношению к ферментативному гидролизу в желудочно-кишечном тракте использовали энзиматичсскую обработку этих комплексов. На рисунке 7 представлены результаты гель-хроматографии препарата мозга до и после ферментативного гидролиза ДНКазой и трипсином. Обработка ДНКазой и трипсином способствует увеличению количества вещества в низкомолекулярной фракции, однако оценка содержания белка показывает, в первом высокомолекулярном пике содержится 20-25 % белка, связанного с ДНК и этот комплекс не подвергается полному ферментативному гидролизу. Таким образом, в работе было показано, что из головного мозга, тимуса и печени крупного рогатого скота можно выделить устойчивые НПК, не диссоциирующие при рН 8,0 и ионной силе 0.3 н. Проведенные исследования являются обоснованием для использования природных НПК в качестве пероральньгх лекарственных форм и диетических дополнений.

Исследование морфологии нуклеопротеиновых комплексов методом электронной микроскопии. Метод электронной микроскопии, который был

Рис. 7. Гель-хроматография исходного НПК мозга (а), препарата после

ферментативного гидролиза: ДНКазой (б), трипсином (в). Е - оптическая плотность, V -относительный объем выхода, С - концентрация белка (мг-см")

:пользован в работе, не позволял строго визуализовать отдельные молекулы 1К и позволил лишь качественно сопоставить НПК различного состава. На сунке 8 представлены микрофотографии нативной ДНК (а), комплекса ДНК -ртексин (б), комплекса ДНК - цитохром С (в) и природного НПК мозга (г). На ¡крофотографиях видно, что при взаимодействии кортексина с молекулой ДНК оисходит упорядоченная компактизация молекулы НК. Похожие структуры в це плотных агрегатов наблюдаются в случае НПК мозга (г): в связи с тем, что

Рис. 8. Электронная микроскопия. Микрофотографии нативной ДНК (а) комплекса ДНК - кортексин (б), комплекса ДНК - цитохром С (в) и природного НПК мозга (г). Увеличение 40 ООО.

зепарат содержит фракцию низкомолекулярных основных белков, происходит ормирование надмолекулярных структур (правый нижний угол фотографии). В знтральной части снимка видны квазиглобулярные структуры - возможно это енее компактные ассоциаты ДНК с нейтральными и кислыми белками. При тализе микрофотографии НПК ДНК-цитохром С видно, что этот белок лзывает в исследуемой системе декомпактизацию и разрыхление здмолекулярнон структуры НК. При этом можно различить как частично )мпактизованные участки, так и участки свободной ДНК.

Сравнение тканеспецифичности природных и модельных нуклео-ротеиновых комплексов. Метод аффинной хроматографии использовали в 1боте для сравнительной оценки селективности связывания природных и эдельных нуклеопротеиновых комплексов с рецепторами клеточных мембран эзговой ткани. На рисунке 9 представлена аффинная хроматография нативной НК (а), модельного комплекса ДНК - кортексин (б) и природного НПК,

Рис. 9. Аффинная хроматография: (а) -нативной ДНК, (б) - модельного комплекса ДНК - кортексин, (в) -природного нуклеопротеинового комплекса из коры головного мозга крупного рогатого скота. Е -оптическая плотность при 260 нм, V -относительный объем выхода.

выделепного из коры головного мозга крупного рогатого скота (в). Видно, чт( нативная ДНК обладает некоторой селективностью связывания ■ использованным сорбентом. НПК ДНК с кортексином связывается с аффинньм сорбентом сильнее, чем свободная ДНК. Пик природного НПК мозга элюируетс: позже, чем пик модельного комплекса ДНК- кортексин. По-видимом} природный НПК содержит не только белки, специфично связывающиеся клеточными мембранами мозговой ткани, аналогичные кортексину, но и други регуляторные белки хроматина. В таблице 5 приведены значения коэффициенте: распределения для исследованных белков и НПК. Анализ данных показывает что при включении неспецифического белка инсулина в комплекс с ДН1 повышается его селективность связывания с клеточными мембранами. Эт1 является определенным аргументом в пользу возможности ислользовани. комилексообразования неспецифических белков с ДНК для транспорта таки: белков в клетку, а возможно и в клеточное ядро. Сравнение коэффициенте распределения природных нуклеопротеиновых комплексов свидетельствует < том, что они обладают определенной ткансспецифичностью: НПК мозга боле селективно связывается с клеточными мембранами клеток мозга, чем НП1 печени.

Таблица 5. Значение коэффициентов распределения исследованных белков 1 НПК при аффинной хроматографии.

Система Концентрация компонентов, мг-см"3 Коэффициент распределенш к

Нативная ДНК 0.5 5.4±0.6

Инсулин 4.5 4.2±0.6

Кортексин 0.8 13.1±0.8

ДНК-инсулин 0.6/4.2 5.6±0.6

ДНК-кортексин 0.3/1.8 9.2±0.8

НПК мозга 10.0 14.4±0.8

НПК печени 10.0 8.8±0.8

ип,% 150

+

Рис. 10. Влияние природных нуклеопротеиновых комплексов на рост

100

эксплантатов: в культуре ткани спинномозговых ганглиев цыплят

50

0

1 - контроль, 2 - НПК головного мозга, 3 - НПК

печени крупного рогатого скота.

1

2

3

ИП - индекс площади, %.

* - р<0.05.

Оценка биологической активности природных НПК в культуре саней спинномозговых ганглиев цыплят. Помимо изучения ;анеспецифичности природных НПК методом аффинной хроматографии, мы ;следовали тканеспецифичность с помощью биологического тестирования, гот эффект позволяет оценить стимулирующее или угнетающее действие >епаратов НПК в отношении отдельных фрагментов центральной нервной [стемы, исключая реакции на эти препараты со стороны целостного организма, а рис. 10 представлены результаты биотестирования НПК мозга и печени, >торые демонстрируют стимулирующий эффект НПК мозга и его отсутствие 1я НПК печени. Это свидетельствует не только о биологической активности и щонеспецифичности НПК мозга, но и о тканеспецифичности таких )мплексов.

Обсуждение практической значимости полученных результатов.

сследование концентрационных закономерностей формирования ггерполимерных комплексов ДНК с белками и оценка их устойчивости в изиологических условиях и тканеспецифичности позволяют экстраполировать и закономерности на природные НПК, выделенные из разных тканей, рименение модельных или природных НПК в медицинских целях для )ррекции функций поврежденных или стареющих тканей облегчается из-за осокой устойчивости этих препаратов к действию гидролитических ферментов глудочно-кишечного тракта. В настоящее время такие препараты используются качестве пероральных биологически-активных добавок к пшце. В соответствии результатами исследования модельных систем представляется актуальным юдолжить изучение НПК ДНК-инсулин, а также исследовать сохранение юлогической активности инсулина, включенного в ИПК.

выводы

1. Методами гель-хроматографии, неравновесного мембранного диализа, УФ-спектрофотометрии, вискозиметрии и электронной микроскопш исследованы модельные и природные нукдеопротеиновые комплексы Установлено, что свойства изученных комплексов зависят от индивидуального компонентного состава.

2. Получены модельные НПК нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты с белками: протамином, инсулином, цитохромом С, пепсином и кортексинол при различных весовых соотношениях. Установлено, что в физиологическое области рН происходит образование необратимо связанны? нуклеопротеиновых комплексов. Полученные НПК устойчивы в диапазоне ионной силы раствора 0.1-Ю.5 н.

3. Показано, что изотермы связывания ДНК с белками имеют кооперативньп характер. Степень заполнения молекулы ДНК белком зависит от начальной соотношения компонентов в растворе и от индивидуальных физико химических характеристик белка. Максимальная селективность связыванш наблюдается для кортексина и цитохрома С.

4. Установлено, что характеристическая вязкость ДНК уменьшается npi образовании НПК, что свидетельствует об изменении конформацщ нуклеиновой кислоты. Показана корреляция между снижениел характеристической вязкости и увеличением степени заполнения ДШ белком. Максимальная компактизация наблюдается при связывании ДНК ( кортексином. Это подтверждают данные электронной микроскопш свободной ДНК и ее комплексов.

5. Биоспецифическую активность модельных и природных НПК оценивал] методами аффинной хроматографии и биологического тестирования i органотипической культуре ткани. Обнаружена наибольшая селективност: связывания с мембранами клеток коры головного мозга для кортексина j природного НПК мозга. Установлена тканеспецифичность биологической действия природного НПК мозга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Ряднова И.Ю., Чалисова Н.И. Биохимическая характеристика биологическ] активной добавки из мозга // Всеармейск. науч. конференции, посвященно] 40-летию научно-исследовательской лаборатории питания " Актуальны вопросы питания личного состава ВС РФ", С-Петербург, 16 мая, 1997: Те: докл.-СПБ, 1998.- С. 98.

Solovieva D., Kibardina М., Riadnova I., Abramov О. Comparative Study о Thymic Extracts - Thymalin and Thymusamine in Geriatric Practice // 16th Congi of the Int. Assoc. of Gerontology "Aging Beyond 2000. One World One Future' South Australia, 19-23 August, 1997: Abstr. - Adelaide, 1997. P. 267-268.

1.

Рялнова И.Ю. Физико-химические свойства цшаминов. - В сб. научных трудов.: Цитомедины, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). - Чита, ¡998. - Вып. Л1» 1. - С. ¡6-17. Ряднова И.Ю., Шатаева JT.K. Хроматографнпескпе методы фракционирования нуклеопротешювых комплексов // Всеросс. снмп. по теории и практике хроматографии и электрофореза, Москва, 13-17 апреля, 1998: Прогр. и тез. М., 1998. - С. 105.

Riadnova I. Physicochemical characteristics of the nucleoprotein complex produced from brain cortex // IVth Congr. of the Clinical Section, European Region, Int. Assoc. Of Gerontology: Progr. and abstr. Finland, 14-17 June, 1998. -Helsinki, 1998. - P. 38.

Нечаев A.H., Сергеев А.В., Васильев А.Б., Хохлова Т.Д., Ряднова И.Ю., Шагаева J7.K. Смачиваемость поверхности пор и адсорбционные свойства модифицированных трековых ультра- и микрофильтров // Всеросс. науч. конф. "Мембраны-98", Москва, 5-10 октября, 1998: Тез. докл. - М., 199S. - С.

\ Ряднова И.Ю., Шатаева Л.К. Создание новых лекарственных форм на основе нуклеопротеиновых комплексов // Междунар. конф. " Фармация в XXI веке: инковашш и традиции", С-Петербург, 7-8 апреля, 1999: Тез. докл. - СПб, 1Ч<)9. - С. 71.

I'/1,',vi к Г. А., Иванов М.В., Ряднова И.Ю. Применение биорегуляторов -шпаминов для профилактики возрастной патологии // Всерос. науч. конф. с междунар. участием "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии", Санкт-Петербург, 2-5 июня, 1999: Матер, конф. -СП б, 1999. -С.174.

>. Шатаева J1.K., Ряднова И.Ю., Хавинсон В.Х. Интерполимерные комплексы дезоксирибонуклеиновой кислоты с белками // Журн. прикл. химии. - 1999. -Т. 72, № 6. - С. 982-985.

10. Шагаева Л.К., Ряднова И.Ю., Потехина Т.С., Синицкая Н.С.. Зеликсон Б.М. «фракционирование макромолекул при мнкрофильтрацик вязких растворов // Журн. прикл. химии. - 1999. - Т. 72, № 1. - С. 152-156.

11. Шатаева Л.К., Ряднова И.Ю., Нечаев А.Н., Сергеев A.B., Чихачева И.П., Мчедлишвили Б.В. Особенности смачивания и адсорбционных свойств трековых мембран на основе полиэтилентерефталата // Коллоидн. журн. -

125.

2000.I,-С. 126-132

Бсспл:;'шо

Отпечатано в ИБС РАН методом рпзографни

Тпп;'"-.: ¡00 экз.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурная организация дезоксирибонуклеиновой кислоты.

1.2. Свойства ДНК в водных растворах.

1.3. Связывание ионов металлов с нуклеиновыми кислотами.

1.4. Интеркаляция.

1.5. Взаимодействие ДНК с пептидами и белками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 .Материалы исследования.

2.2.Методы исследования.

2.2.1. Гель-хроматография.

2.2.2. Метод определения белка по Лоури.

2.2.3. Метод фракционирования ДНК при микрофильтрации.

2.2.4. Вискозиметрия.

2.2.5. Метод мембранного диализа.

2.2.6. Метод выделения природных нуклеопротеиновых комплексов

2.2.7. Метод получения кортексина.

2.2.8. Электрофорез нуклеопротеиновых комплексов.

2.2.9. Ферментативный гидролиз.

2.2.10. Аффинная хроматография.

2.2.11. Электронная микроскопия.

2.2.12. Метод оценки биологической активности.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1.Исследование взаимодействия ДНК с модельными белками по спектральным характеристикам.

3.2.Исследование взаимодействия ДНК с модельными белками методом гель-хроматографии.

3.3.Микрофильтрация вязких растворов на трек-мембранных модулях

3.4.Комплексообразование ДНК с модельными белками по данным метода мембранного диализа.

3.5.Вязкостные характеристики ДНК при взаимодействии с белками.

3.6.Исследование природных нуклеопротеиновых комплексов.

3.7.Исследование морфологии нуклеопротеиновых комплексов методом электронной микроскопии.

3.8.Сравнение тканеспецифичности природных и модельных нуклеопротеиновых комплексов.

3.9.Обсуждение практической значимости полученных результатов.

ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Исследование процессов, протекающих в организме и создание препаратов, способных влиять на метаболические функции, является приоритетным направлением для большинства современных наук и, в частности, химии высокомолекулярных соединений.

В последние годы все большее внимание исследователей привлекает поиск новых веществ, которые позволяют направленно корректировать функциональную активность клеток. В медицинском аспекте этой проблемы целью является восстановление органов и тканей организма на клеточном уровне при их радиационном поражении или геронтологической дисфункции. В настоящее время в качестве таких препаратов, корректирующих клеточный цикл, используют различного рода экстракты из тканей животных, содержащие биорегуляторы белковой природы.

Известно, что в постоянно функционирующих органах высших организмов в состоянии митотического равновесия оптимальное соотношение между делящимися, функционирующими и отмирающими клетками поддерживается группой белков-регуляторов, связанных с ДНК. Такие белки являются специфическими эндогенными регуляторами как деления клеток, так и их последующей дифференциации. Однако, использование этих веществ для коррекции цикла клеточного развития при решении медицинских и геронтологических задач не было успешным из-за короткого времени жизни этих белков в плазме крови и цитоплазме, когда их вводили туда в очищенном виде.

Существует способ пролонгирования действия белка и его целенаправленного транспорта в организме путем включения его в интерполимерный комплекс (ИПК), при этом наиболее надежными носителями являются линейные полиэлектролиты. Нуклеиновые кислоты (НК) - ДНК и РНК - относятся к группе сильных линейных жесткоцепных полиэлектролитов, которые несут постоянный отрицательный заряд на фосфатных группах и образуют прочные комплексы с белковыми макромолекулами. При этом сохраняется тканеспецифическая регуляторная активность белковой молекулы, которая также защищена в комплексе от действия гидролаз (протеиназ). Участие ДНК в ИПК стабилизирует ее структуру, защищает от расщепления клеточными нуклеазами и обеспечивает трансмембранный транспорт комплекса в ядро клетки. Все это определяет перспективы использования подобных нуклеопротеиновых комплексов (НПК) в качестве тканеспецифических эндогенных регуляторов. Поэтому исследование особенностей комлексообразования ДНК и белков представляет большой практический интерес для создания пролонгированных форм лекарственных препаратов, направленно корректирующих функциональную активность организма на молекулярном уровне.

В работах школы академика В.А. Кабанова широко исследованы физико-химические особенности связывания ДНК с синтетическими полиэлектролитами и определены перспективы использования таких комплексов для доставки генетического материала в клетку. Наряду с этим, исследованы особенности образования интерполимерных комплексов белковых макромолекул с синтетическими или природными полимерами, несущими сульфо- и карбоксильные группы. Таким образом, в настоящее время развивается новое научное направление, посвященное созданию, исследованию и медицинскому применению ИПК ДНК с биологически активными лигандами. Однако, до начала представляемой работы не проводилось физико-химических исследований закономерностей связывания НК с неядерными белками и стабильности таких нуклеопротеиновых комплексов.

Цель работы состояла в получении устойчивых комплексов ДНК с глобулярными неядерными белками для стабилизации макромолекулы ДНК и защиты ее от расщепления нуклеазами при сохранении структуры и свойств молекулы белка. Получение подобных комплексов является существенным для проведения медико-биологических исследований. Для достижения поставленной цели было необходимо: оценить устойчивость комплексов нативной ДНК с глобулярными белками, которые различаются изоэлектрической точкой и количеством заряженных групп в физиологических условиях в достаточно широком диапазоне ионной силы - 0.1-7-0.5 н. Кроме того, необходимо было определить коэффициенты связывания модельных белков с ДНК и сравнить полученные закономерности с взаимодействием ДНК с ядерным тканеспецифическим регулятором пептидной природы, входящим в состав хроматина. В работе требовалось оценить изменение конформации природного высокомолекулярного полиэлектролита - ДНК при взаимодействии с белками и изучить морфологию природных НПК и комплексов ДНК с модельными белками.

Для оценки тканеспецифического биологического действия этих комплексов был использован метод аффинной хроматографии. В работе оценивали селективность связывания природных НПК с рецепторами клеток коры головного мозга в сравнении с коэффициентами связывания белков и модельных нуклеопротеиновых комплексов.

Научная новизна. В рамках темы X научных исследований ИВС РАН "Экохром 95-98" - программы по созданию новых полимеров, в том числе для мембранной технологии, решения экологических задач и развития новых хроматографических методов - был разработан метод фракционирования ДНК микрофильтрацией на трек-мембранных модулях.

Впервые изучены закономерности связывания ДНК с неядерными глобулярными белками, которые различаются электро-химическими характеристиками и исследована устойчивость полученных комплексов в интервале ионной силы 0.1-й).5 н.

Впервые получены изотермы связывания ДНК с белками инсулином, цитохромом С, пепсином и кортексином. Рассчитаны константы связывания и степень заполнения молекулы ДНК белком при различном количественном 7 соотношении компонентов в растворе. Показано, что при образовании интерполимерных комплексов наблюдается компактизация молекулы ДНК.

Впервые изучена селективность связывания с мембранами клеток коры головного мозга ДНК, препарата специфических полипептидов мозга -кортексина, инсулина, нуклеопротеиновых комплексов ДНК-инсулин, ДНК-кортексин, а также природных нуклеопротеиновых комплексов из мозга и печени крупного рогатого скота.

Впервые проведено микроскопическое исследование морфологии природного НПК мозга и нуклеопротеиновых комплексов ДНК с цитохромом С и кортексином.

Впервые проведены эксперименты по оценке тканеспецифичного действия НПК мозга и печени в культуре ткани.

Практическая значимость выполненной работы определяется тем, что результаты исследований модельных систем и природных НПК были использованы при разработке промышленного регламента и технических условий на выделение природных НПК для получения лечебно-профилактических препаратов (биологически активных добавок к пище).

ВЫВОДЫ

1. Методами гель-хроматографии, неравновесного мембранного диализа, УФ-спектрофотометрии, вискозиметрии и электронной микроскопии исследованы модельные и природные нуклеопротеиновые комплексы. Установлено, что свойства изученных комплексов зависят от индивидуального компонентного состава.

2. Получены модельные НПК нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты с белками: протамином, инсулином, цитохромом С, пепсином и кортексином при различных весовых соотношениях. Установлено, что в физиологической области рН происходит образование необратимо связанных нуклеопротеиновых комплексов. Полученные НПК устойчивы в диапазоне ионной силы раствора 0.1-Ю.5 н.

3. Показано, что изотермы связывания ДНК с белками имеют кооперативный характер. Степень заполнения молекулы ДНК белком зависит от начального соотношения компонентов в растворе и от индивидуальных физико-химических характеристик белка. Максимальная степень связывания наблюдается для кортексина и цитохрома С.

4. Установлено, что характеристическая вязкость ДНК уменьшается при образовании НПК, что свидетельствует об изменении конформации нуклеиновой кислоты. Показана корреляция между снижением характеристической вязкости и увеличением степени заполнения ДНК белком. Максимальная компактизация наблюдается при связывании ДНК с кортексином. Это подтверждают данные электронной микроскопии свободной ДНК и ее комплексов.

1. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. -М: Мир, 1976. -412 с.

2. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. -М.: Мир, 1987. -584 с.

3. Arnott S., Chondraserakan R., Hall L.H. Puigjaner J.K., Walker J.K., Wang M. DNA secondary structures: helices, wrinkles and junctions. -In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative biology. -1983. -V. XLVII. -P. 53-67.

4. Lilley D.M.J. Dynamic, sequence-dependent DNA-structures as exemplified by cruciform extrusion from inverted repeats in negatively supercoiled DNA. -In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative biology. -1983. -V. XLVII. -P. 101-113.

5. Strick T.R., Croquette V., Bensimon D. Homologous pairing in stretched supercoiled DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. -V. 95, № 18. -P. 1057910583.

6. Бреслер C.E. Молекулярная биология. -Л.: Наука, 1973. -577 с.

7. L. Cruzeiro-Hansson DNA bending due to sequence-induced torsional stress // J. Chem. Soc. Faraday Trans. -1997. -V. 93, № 14. -P. 2419-2425.

8. Новейшие методы исследования полимеров. Под ред. Б.Ки. -М.: Мир, 1966. -571 с.

9. Ю.Чанг P. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. -М.:

10. Мир, 1980. -662 с. 11.Моравец Г. Макромолекулы в растворе. -М.: Мир, 1967. -398 с.

11. Scott E. Osborne, Jens Volker, Shawn Y. Stevens, Kenneth J. Breslauer, Gary P. Click, design, synthesis and analysis of disulfide cross-linked DNA duplexes // J. Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118, № 48. -P. 11993-12003.

12. Scott E. Osborne, Robert J. Cain, Gary P. Click, structure and dynamics of disulfide cross-linked DNA triple helices // J. Am. Chem. Soc. -1997. -V. 119, № 6.-P. 1171-1182.

13. Павлова C.-C.A., Дубровина JI.B., Брагина Т.П. Изучение процесса ассоциации макромолекул методом рассеяния света // Высокомолек. Соед. Б. -1996. -Т. 38, № 12. -С. 2065-2073.

14. Ануфриева E.B., Краковяк М.Г. Динамика полимерных цепей в процессах структурных и химических превращений макромолекул // Высокомолек. Соед. -1984. -Т. 29, № 2. -С. 211-222.

15. Ануфриева Е.В., Некрасова Т.Н., Шевелева Т.В., Краковяк М.Г. Строение и структурные превращения макромолекул и люминесценция магниевой соли 8-анилиннонафталин-1-сульфокислоты // Высокомолек. Соед. А. -1994. -Т. 36, №3. -С. 449-452.

16. Фрисман Е.В., Воробьев В.Ю., Щагина JI.B., Яновская Н.К. Динамическое двойное лучепреломление в растворах дезоксирибонуклеиновой кислоты // Высокомолек. Соед. -1962. -Т. 4, № 5. -С. 762-768.

17. Штенникова И.Н., Филиппова Т.В., Даутценберг X. Влияние природы растворителя на динамооптические свойства молекулкарбоксиметилцеллюлозы в растворе // Высокомолек. Соед. Б. -1993. -Т. 35, № 9. -С. 1459-1464.

18. Цветков В.Н. Жесткоцепные полимерные молекулы. -Л.: Наука, 1986. -379 с.

19. Голуб Е.И., Дворкин Г.А., Назаренко В.Г. Об оценке жесткости молекул ДНК в растворе // Биохимия. -1963. -Т. 28, № 6. -С. 1048-1046.

20. Маршал Э. Биофизическая химия. Принципы, техника и приложения в 2-х томах. -М.: Мир, 1981. -820 с.

21. Kirchener J.J., Hopkins Р.В. Nitrous acid cross-links duplex DNA fragments through deoxyguanosine residues at the sequence 5'-CG // J. Am. Chem. Soc. -1991. -V. 113, № 23. -P. 4681-4682.

22. Wolf В., Hanlon S. Structural transitions of deoxyribonucleic acid in aqueous electrolyte solutions. II The role of hydration // Biochemistry. -1975. -V. 14, № 8. -P. 1661-1670.

23. Монтрель M.M., Сухоруков Б.И. Влияние водородных ионов на В-А переход в ДНК // Молек. биол. -1989. -Т. 23, № 3. -С. 699-707.

24. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. -М.: Химия, 1978. -582 с.

25. Бреслер С.Е. Введение в молекулярную биологию. М.-Л.: Наука, 1966. -514 с.

26. Переход спираль-клубок ДНК в щелочной среде / Ахрем А.А., Арутюнян С.Г., Асланян В.Н., Далян Е.Б., Ландо Д.Ю., Шпаковский А.Г. // Молек. биол. -1989. -Т. 25, № 2. -С. 518-525.

27. Frank-Kamenetskii M.D. Protonated DNA structures. -In Methods in enzymology. -V.211.-P. 180-191.

28. Gehring K., Leroy J.-L., Gueron M. A tetrameric DNA structure with protonated cytosine-cytosine base pairs //Nature. -1993. -V. 363, № 6429. -P. 561-565.

29. Кочетков H.K., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. -М.: Химия, 1970.-718 с.

30. Young М.А., Jayaram В., Beveridge D.L. Local dielectric enveronment of B-DNA in solutions results from a 14 ns molecular dynamics trajectory // J. Phys. Chem. B. -1998. -V. 102, №. 39. p. 7666-7669.

31. Merchie A.I.N., Lilley D.M.J. Supercoiled DNA and cruciform structures. -In Methods in enzymology. -1992. -V. 211. -P. 158-180.

32. Michelson A.M. The chemistry of nucleosides and nucleotides. -L. and N.-Y.: Academic Press, 1963. -622 p.

33. Фрисман E.B., Воробьев В.Ю., Щагина JI.B., Яновская Н.К. Динамическое двойное лучепреломление в растворах дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) // Высокомолек. Соед. -1963. -Т. 5, № 4. -С. 622-627.

34. Golub E.I. The method for estimation of chain macromolecule rigidity. Biopolymers. -1964. -V. 2, № 2. -P. 113-121.

35. Khan M.O., Jonsson B. Electrostatic correlations fold DNA // Biopolymers. -1999.-V. 49, №2.-P. 121-125.

36. Manning G.S. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic properties of polynucleotides // Quaterly reviews of Biophysics. -1978. -V. 11, № 2. -P. 176-246.

37. Pezzano H., Podo F. Structure of binary complexes of mono- and polynucleotides with metal ions of the first transition group // Chemical reviews. -1980. -V. 80, № 5.-P. 365-401.

38. Structure of B DNA cationic shell as revealed by an X-ray difraction study of Cs DNA / Bartenev V.N., Golovamov Eu.I., Kapitonova K.A., Mokulskii M.A., Volkova L.I., Skuratovskii I.Ya. // J. Mol. Biol. -1983. -V. 169, № 1. -P. 217-234.

39. Hanlon S., Brudno S., Wu T.T. Wolf B. Structural transitions of deoxyribonucleic acid in aqueous electrolyte solutions. I Reference spectra of conformation limits // Biochemistry. -1975. -V. 14, № 8. -P. 1648-1660.

40. Nucleic acid-metal interactions. Ed. Spiro T.G. -N.-Y.: 1980. -V. 1. -256 p.

41. Bellon S.F., Coleman J.H., Lippard S.J. DNA unwinding produced by site-specific intrastrand cross-links or the antitumor drug cw-diamminedichloroplatinum (II) // Biochemistry. -1991. -V. 30. -P. 8026-8035.

42. Kasyanenko N., Arikainen N., Frisman E. Investigation of DNA-complexes with iron ions in solution // Biophys. Chem. -1998. -V. 70, № 2. -P. 93-100.

43. Kasyanenko N., Zanina A., Plotnikova L., Simonenkova A., Deffrenney S. Study of the DNA packing caused by charged compounds of different nature in solution // Macromol. Symp.-1998.-V. 136, № l.-P. 25-31.

44. Patel D.J., Pardi A., Itakura K. DNA conformation, dynamics and interactions in solution // Science. -1982. -V. 216, № 4546. -P. 581-590.

45. Gopalakrishnan S., Liu X., Patel D.J. Solutions structure of the covalent sterigmatocystin-DNA adduct // Biochemistry. -1992. -V. 31, № 44. -P. 1079010801.

46. Sun D., Hansen M., Clement J.J., Hurley L.H. Structure of the altromycin B (N7-guanine)-DNA adduct. A proposed prototypic DNA adduct structure for the pluramycin antitumor antibiotics // Biochemistry. -1993. -V. 32, № 32. -P. 80688074.

47. Vogel H.J. (ed). Nucleic acid-protein recognition. -N.-Y.: Academic press. -1977. -587 p.

48. Von Hippel P.H., McGhee J.D. DNA-protein interactions // Ann. Review Biochem. -1972. -V. 41, № 1. -P. 231-300.

49. Van Dam L., Nardenskiold L. Interactions of polyamines with the DNA octamers d(m5CG)4 and d(GGAATTCC): A 'H-NMR investigation // Biopolymers. -1999. -V. 49, № 1.-P. 41-53.

50. Suzuki M., Yagi N. An in-the groove view of DNA structures in complexes with proteins // J. Mol. Biol. -1996. -V. 255, № 5. p. 677-687.

51. Church G.M., Sussman J.L., Kim S.-H. Secondary structural complementarity between DNA and proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1977. -V. 74, № 4. -P. 1458-1462.

52. Seeman N.C., Rosenberg J.M. Sequence-specific recognition of double helical nucleic acid by proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1976. -V. 73, № 3. -P. 804808.

53. Hassan M.A., Calladine C.R. Two distinct models of protein-induced bending in DNA //J. Mol. Biol. -1998. -V. 282, № 2. -P. 331-343.

54. Nekludova L., Pabo C.O. Distinctive DNA conformation with enlarged major groove is found in Zn-finger-DNA and other protein-DNA complexes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1994. -V. 91, № 15. -P. 6948-6952.

55. Structure of the CAP-DNA complex at 2.5 A resolution: a complete picture of the protein-DNA interface / Parkinson G., Wilson C., Gunasekera A., Ebright Y.W., Ebright R.E., Berman H.M. // J. Mol. Biol. -1996. -V. 260, № 3. -P. 395-408.

56. Klug A. Gene regulatory proteins and their interaction with DNA. -In DNA: the double helix. Perspective and prospective at forty years. Annals of the New York Academy of sciences. -1995. -V. 758. -P. 143-160.

57. Leonard D.A., Rajaram N., Kerppola Т.К. Structural basis of DNA bending and oriented heterodimer binding by the basic leucine zipper domains of Fos and Jun // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. -V. 94, № ю. -P. 4913-4918.

58. Kim J.L. Nikolov D.V., Burley S.K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element // Nature. -1993. -V. 365, № 6446. -P. 520-527.

59. Luisi В., Orozco M., Sponer J., Luque F. On the potential role of the amino nitrogen atom as a hydrogen bond acceptor in macromolecules // J. Mol. Biol. -1998. -V. 279, №5.-P. 1123-1136.

60. Романов Ю.А., Кетлинский C.A., Антонхин А.И., Окулов В.Б. Кейлоны и регуляция деления клеток. -М.: Медицина, 1984. -208 с.

61. Pellegrini L., Tan S., Richmond T.J. Structure of serum response factor core bound to DNA // Nature. -1995. -V. 376, № 6540. -P. 490-498.

62. Ruoslahti E., Yamaguchi Y., Hildebrand A., Border W.A. Extracellular matrix.growth factor interactions. -In Cold Spring Harbor symposia. -1992. -V. LVII. -P. 309-315.

63. Кетлинский С.А., Парфенова Е.В. Изучение биологической активности кейлонов, выделенных из нормальной и регенерирующей печени // Бюл. Экспер. Биол. -1981, № 7. -С. 96-98.

64. Якубов Л.А., Шестова О.Е., Андреева А.Ю., Власов В.В. Участие специфических белков клеточной поверхности в транспорте нуклеиновых кислот в клетки //Докл. АН. России. -1998. -Т. 361, № 4. -С. 550-553.

65. Лобов И.Б., Митчелл А.Р., Подгорная О.И. Белок ядерного матрикса, специфически связывающий сателлит мыши // Молек. биол. -1998. -Т. 32, № 6.-С. 1056-1061.

66. Malchy B.L. Studies on the reactive properties of histone amino groups: reactivities of free histones and histones in chromatin as a function of ionic strength // Biochemistry. -1977. -V. 16, № 17. -P. 3922-3927.

67. McGhee J.D., Felsenfeld G. Nucleosome structure // Ann. Rev. Biochem. -1980. -V. 49. -P. 1115-1156.

68. Zhou Y.-B., Gerchman S.E., Ramakrishnan Y., Travers A., Muyldermans S. Position and orientation of the globular domain of linker histone H5 on the nucleosome // Nature. -1998. -V. 395, № 6700. -P. 402-405.

69. Butler P.J.G., Thomas J.O. Dinucleosomes show compaction by ionic strength consistent with bending of linker DNA // J. Mol. Biol. -1998. -V. 283, № 3. -P. 401-407.

70. Wu Z., Murphy C., Wu C.-H.H., Tsvetkov A., Gall J.G. Snurposomes and coiled bodies. -In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. -1993. -V. 58, -P. 747-754.

71. Gurlie R., Duong T.N., Zakrzewska K. The role of DNA-protein salt bridges in molecular recognitions model study // Biopolymers. -1999. -V. 49. № 4. -P. 313327.

72. Dunaway M., Ostrander E.A. Local domains of supercoiling activate a eukariotic promoter in vivo //Nature. -1993. -V. 361, № 6414. -P. 746-748.

73. Rich A. The nucleic acid. -In DNA: the double helix. Perspective and prospective at forty years // Annals of the New York Academy of sciences. -1995. -V. 758. -P. 97-142.

74. Crothers D.M. Upsetting the balance of forces in DNA // Science. -1994. -V. 266. -P. 1819-1820.

75. Strauss J.K., Maher III J. DNA bending by asymmetric phosphate neutralisation // Science. -1994. -V. 266. -P. 1829-1834.

76. Wolffe A.P. Architectural transcription factors // Science. -1994. -V. 264, -P. 1100-1101.

77. Katan-Khaykovich Y., Shaul Y. RFX1, a single DNA-binding protein with a split dimerization domain, generates alternative complexes // J. Biol. Chem. -1998. -V. 273, №38. -P. 24504-24512.

78. Bell A., Kittler L., Lober G., Zimmer C. DNA binding properties of minor groove binders and their influence on the topoisomerase II cleavage reaction // J. Mol. Recognit. -1997. -V. 10, № 6. -P. 245-255.

79. Tanatani A., Fukutomi R., Ranuta H., Tomioka N., Itai A. Novel DNA minor groove binders with an aromatic layered structure // Nucleic acid Symp. Ser. -1998.-V. 39. -P. 31-32.

80. Cattau D., Bourgoin D., Joly M. Change of conformation of DNA by association with proteins // Eur. J. Biochem. -1969. -V. 8, № 4. -P. 541-546.

81. Панарин Е.Ф. Основные типы и принципы синтеза биологически активных полимеров. В сб.: "Синтез, структура и свойства полимеров" (ИВС АН СССР). Л.: Наука, 1989. -С. 187-198.

82. Simon M.I. Summary: the cell surface regulates information flow, material transport, and cell identity. In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative biology. -1992. -V. LVII. -P. 673-688.

83. Кабанов A.B., Кабанов B.A. Интерполиэлектролитные комплексы нуклеиновых кислот как средство доставки генетического материала в клетку // Высокомолек. Соед. 1994. -Т. 36, № 2. -С. 198-211.

84. Дебабов В.Г. ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзитной экспрессии нуклеиновых кислот в соматических клетках человека и животных // Молек. биол. -1997. -Т. 31, № 2. -С. 209-215.

85. Стеценко Д.А., Лубяко E.H., Потапов В.К., Ажикина Т.Л., Свердлов Е.Д. Синтез и свойства новых смешанных биополимеров, содержащих олигонуклеотиды и их полиамидные аналоги // Докл. АН России. -1995. -Т. 343, №6. -С. 834-837.

86. Розенкранц A.A., Ячменев C.B., Соболев A.C. Использование искусственных конструкций для селективного переноса генетического материала в клетки человека путем рецептор-опосредованого эндоцитоза // Докл. АН России. -1990. -Т. 312, № 2. -С. 493-494.

87. Хавинсон В.Х., Кузнецов C.B. Теоретические аспекты применения цитаминов // Междунар. симпозиум "Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма", Санкт-Петербург, 25-27 ноября, 1996: Тез. докл. -СПб.: Наука. -1996. -С. 87-88.

88. Tinoco I.Hypochromism in polynucleotides // J. Amer. Chem. Soc. -1960. -V. 82, № 18.-P. 4785-4790.

89. Мосолов B.B. Протеолитические ферменты. -M.: Наука, 1971. -414 с.

90. Fruton J.S. Pepsin. In The enzymes. Ed. Boyer P.D., 3-d ed. -N-Y, London: Academic Press. -1970. V. 3, -P. 120-165.

91. Фердман Д.Л. Биохимия. M.: Высшая школа, 1966. -644 с.

92. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. -М.: Медицина, 1983. -750 с.

93. Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology. -Oxford Univ. Press, 1997. p. 447.

94. Кортексин. ВФС 42-3311-99.

95. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25 летний опыт экспериментальных и клинических исследований. -СПб.: Наука, 1998. -310 с.

96. Биохимический справочник. -Киев.: Издательство Киевского университета "Вища школа", 1997. -С. 25.

97. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М.: Наука, 1985.-536 с.

98. Lowry О.Н., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. -1951. -V. 193, № 1. -P. 265-275.

99. Шатаева JI.K., Ряднова И.Ю., Потехина T.C., Синицкая Н.С., Зеликсон Б.И. Фракционирование макромолекул при микрофильтрации вязких растворов // Журн. приклад, химии. 1999. -Т. 72, вып. 1. -С. 152-156.

100. Мчедлишвили Б.В., Флеров Г.Н. Ядерные фильтры: новый класс микрофильтрационных мембран в прецизионном разделении коллоидных растворов // Рос. Хим. Журн. -1987. -Т. 32, № 6. -С. 641-647.

101. Особенности смачивания и адсорбционных свойств трековых мембран на основе полиэтилентерефталата / Шатаева JI.K., Ряднова И.Ю., Нечаев А.Н., Сергеев A.B., Чихачева И.П., Мчедлишвили Б.В. // Журн. коллоидн. химии. 2000. - № 1.-С. 126-132.

102. Радченко И.Г., Пономаренко М.Н., Глазова Н.В., Иозеп И.И. Исследование полимерных комплексов, включающих ферменты и растворимые полимеры // Журн. приклад, химии. -1997. -Т. 70, № 6. -С. 1040-1043.

103. Рожанская Т.И., Дмитренко Л.В., Самсонов Г.В. Исследование межмолекулярных взаимодействий по кинетике диализа // Высокомолек. Соед. Б. -1972. -Т. 14, № 5. -С. 370-373.

104. Диффузионная проницаемость трековых мембран / Тищенко Г.А., Мчедлишвили Б.В., Грушка Э., Тырачкова В., Попович A.M., Шашков Б.В., Шатаева Л.К. // Докл. АН. СССР. -1989. -Т. 308, № 3. -С. 655-658.

105. Crank J. The mathematics of diffusion. -Oxford.: Claredon Press. -1975. P. 51.

106. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе гликопротеинов клеточного микроокружения // Рос. Хим. Журн. -1998. -Т. 62, № 3. -С. 85-90.

107. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Способ получения белковой пищевой добавки. Пат. 2075944 РФ от 27.03.1997. БИ. 1997, № 9.

108. Препаративная биохимия липидов. -М.: Наука, 1981. -256 с.

109. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Писарев O.A. Выделение из тимуса и изучение природы фактора, стимулирующего иммуногенез // Докл. АН СССР. -1977. -Т. 233, №3. -С. 491-494.

110. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. -1970. -V. 227, № 5259. -P. 680-685.

111. Аффинная хроматография. Методы. Под ред. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф. -М.: Мир, 1988.-278 с.

112. Власов В.В., Грачев М.А., Лаврик О.А. Аффинная модификация полимеров. -Новосибирск.: Наука, 1983. 241 с.

113. Грушка 3., Тырачкова В., Тищенко Г.А., Шатаева Л.К. Структура и проницаемость композиционных карбоксильных мембран на основе полиакрилонитрила // Collection Czechoslovak Chem. Commun. -1988. -V. 53.-P. 3089-3095.

114. Chernova I.A., Gurevich K.Ya. Structure and sorption characteristics of bioaffinity membranes // J. Membr. Sci. -1996. -V. 113, № 1. -P. 161-167.

115. Бараш A.H., Зверев М.П., Литовченко Г.Д., Костина Т.Ф. Влияние природы второго компонента на процесс гидразидирования сополимеров акрилонитрила // Высокомолек. Соед. Б. 1984. -Т. 26, № 9. -С. 687-691.

116. Dunn В.М., Chaiken I.M. Quantitative affinity chromatography. Determination of binding constants by elution with competitive inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1974. -V. 71, № 6. -P. 2382-2385.

117. Магонов C.H. Сканирующая силовая микроскопия полимеров и родственных материалов // Высокомолек. Соед. Б. 1996. -Т. 38, № 1. -С. 143-182.

118. Киселев Н.А. Электронная микроскопия биологических макромолекул. -М.: Наука, 1965.-147 с.

119. Levi-Montalchini R. Developmental neurobiology and the natural history of NGF // Ann. Rev. Neurosci. -1982. -V. 5, -P. 341-356.

120. Хавинсон B.X., Морозов В.Г., Чалисова Н.И., Окулов В.Б. Влияние пептидов головного мозга на клетки нервной ткани in vitro // Цитология. -1997. -Т. 39, № 7. -С. 571-576.

121. Мартынкина Jl.П., Семенов Т.Е., Венгеров Ю.Ю. Электронно-микроскопическое изучение компактизации индивидуальных молекул ДНК в пленках при взаимодействии с гистоном HI // Молек. биол. -1991. -Т. 25, №5.-С. 1338-1343.

122. Процессы ассоциации-диссоциации в растворах нестехиометричных полиэлектролитных комплексов / Харенко О.В., Изумрудов В.А., Харенко A.B., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Высокомолек. Соед. -1980, № 1.-С. 218-223.

123. Радзявичюс К.И. Взаимодействие пористых карбоксильных сетчатых полиэлектролитов с макромолекулами белков. -Дис. канд. хим. наук. -Л., 1982.-153 с.

124. Шатаева Л.К., Радзявичюс К.И., Самсонов Г.В. Влияние кислотности ионогенных групп сетчатого полиэлектролита на прочность белково-полимерного комплекса // Высокомолек.Соед. А. 1985. -Т. 27, № 4. -С. 702-706.

125. Степченко А.Г., Поляновский О.Л. Взаимодействие Oct-белков с ДНК // Молек. биол. -1996. -Т. 30, № 3. -С. 503-513.

126. П. де Жен. Идеи скейлинга в физике полимеров. -М.: Мир, 1982. -368 с.

127. Desoye G. Error analysis in equilibrium dialysis: evaluation of adsorption phenomena // J. Biochem. Biophys. Meth. -1988. -V. 17, № 1. -P. 3-16.

128. Складчикова Г.Ю. Выделение, физико-химическая характеристика и идентификация новой группы кислоторастворимых белков головного мозга млекопитающих. -Дис. канд. биол. наук. -Санкт-Петербург, 1994. -134 с.

129. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины и их роль в регуляции физиологических функций // Успехи совр. биол. -1995. -Т. 115, № 3. -С. 353-367.

130. Климов П.К., Барашкова Г.М. Эндогенные пептиды как единая система регуляторных веществ // Физиол. Журн. -1993. -Т. 79, № 3. -С. 80-87.

131. Dodson M., Echols H. Electron microscopy of protein-DNA complexes. -In Methods of enzymology. -1991. -V. 208, -P. 168-196.

132. Кульберг А.Я. Рецепторы клеточных мембран. -M.: Высшая школа, 1987. -104 с.

133. Kabanov A.V., Kabanov V.A. DNA complexes with polycations for the delivery of genetic material into cells // Bioconjugate Chem. -1995. -V. 6, № 1. -P. 7-20.

134. Teng C.S., Teng C.T., Allfrey V.G. Studies of nuclear acidic proteins // J. Biol. Chem. -1971. -V. 246, № 11. -P. 3597-3609.

135. Власов Г.П., Изварина Н.Я., Илларионова Н.Г., Денисов И.Г., Малышев Д.А. Влияние полимерной модификации инсулина на его ферментативный гидролиз и конформационные свойства // Прикл. биохим. и микробиол. -1988. -Т. 24, № 1.-С. 56-61.122

136. Валуев И.Л, Валуев Л.И., Платэ Н.А. О механизме действия препаратов иммобилизованного инсулина для перорального применения // Докл. АН России. -1998. -Т. 360, № 1. -С. 57-60.

137. Глебов Р.Н. Эндоцитоз и экзоцитоз, сер. Биохимия мембран. -М: Высшая школа, 1987. -96 с.

138. Willeman T.m Harding С., Ftahl Rh. Receptor-mediated endocytosis // Biochem. J. -1985. -V. 232, № 1. -P. 1-14.

139. Protein targeting. A practical approach, ed. A.I. Magee and T. Willeman, IRL. -Oxford: Oxford Univ. Press, 1993.-315 p.и1. Утверждаюм1. Чайка О.В.медицинскихн1999 г.1. АКТ

140. Полученные характеристики использованы для стандартизации технологии получения препаратов НПК, выделенных из различных тканей.

141. Масштабирование лабораторных методов выделения НПК из тканей мозга продемонстрировало хорошую воспроизводимость метода при переходе к обработке 50 и 100 кг исходного сырья.1. Начальник цеха1. Старший мастер1. Аспирант

142. САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИСТИТУТ БИОРЕГУЛЯЦИИ И ГЕРОНТОЛОГИИ СЗО РАМН МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д.З, тел. 230-00-49, 230-68-86

143. Заключение о полезности проведенных исследований

144. Заместитель директора по научной работе 71. V Л 1

145. Заместитель директора главный технолог (О?доктор мед. наук Морозов В.Г.кандидат мед. наук Рыжак Г.А.