Использование пенициллинацилазы в водной среде для получения энантиомерно чистых аминосоединений и их производных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Кудрявцев Павел Александрович

Использование пенициллинацилазы для получения энантиомерно чистых аминосоединений и их производных

02.00.15 кинетика и катализ 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

тл^

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2010

2 4 0ЕВ 2011

4855792

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе биокинетики Государственного учреждения Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

профессор, д.х.н. Швядас В.К. ст.н.с., к.х.н. Гуранда Д.Ф.

Официальные оппоненты:

профессор, д.х.н. Кочетков К.А. к.фарм.н. А.В. Пихтарь

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 'V" ¿р^рЯс/^ 2011 г. в 16- часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан " ЯР" _ 20 ^"г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время большинство биокаталитических промышленных процессов получения энантиомерно чистых соединений основано либо на реакциях ферментативного гидролиза в водной среде, либо на реакциях ацильного переноса в безводных органических растворителях. Общим недостатком этих методов является возможность получения только одного энантиомера соединения. Существенными проблемами биокатализа в неводной среде, ограничивающими его применение на промышленном уровне, являются чрезвычайно низкая активность ферментов, дороговизна и сложность утилизации органических растворителей. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что возможности применения доступных гидролитических ферментов в естественной для них водной среде еще далеко не исчерпаны. Примером может служить предложенный в нашей лаборатории метод высокоэффективного и стереоселективного ацилирования аминов в водных растворах и интегральный биокаталический метод разделения энантиомеров, основанный на реакциях синтеза и гидролиза, катализируемых пенициллинацилазой (ПА) в водной среде. В этой связи дальнейшее развитие высокоэффективных и экологически безопасных биокаталитических методов препаративного получения энантиомеров различных подклассов первичных аминосоединений, основанных на ферментативных реакциях в водной среде, имеет важное научное и практическое значение. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение эффективности, хемо- и региоселективности ферментативного ацилирования в водной среде различных подклассов первичных аминосоединений, катализируемого ПА, подбор и оптимизация условий препаративного биокаталитического получения энантиомерно чистых полифункциональных производных аминотиолов и обоих энантиомеров первичных аминосоединений различных подклассов, а также разработка аналитического метода определения энантиомеров первичных аминов для характеристики оптической чистоты аминосоединений в ходе ферментативного расщепления рацематов и при выделении конечных продуктов. При достижении поставленных целей были решены следующие задачи:

1) Проведена оптимизация реакций ацильного переноса, катализируемых ПА в водной среде, с учетом растворимости компонентов с целью получения энантиомерно чистых соединений в препаративных количествах;

2) Изучена зависимость эффективности и хемоселективности ферментативного ацильного переноса при ацилировании аминотиолов различными ацильными донорами и возможность улучшения параметров биокаталитического процесса путем инженерии субстратов;

3) В препаративных количествах получены новые энантиомерно чистые тиолы и показано, что их применение позволяет провести количественное определение ряда энантиомеров первичных аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией орто-фталевым альдегидом (ОФА);

4) Проведена оптимизация условий препаративного получения обоих энантиомеров различных подклассов аминосоединений и аминоспиртов интегральным биокаталитическим методом. Научная новизна. Показана возможность проведения высокоэффективного и хемоселективного ацильного переноса на аминогруппы аминотиолов и аминоспиртов в водной среде, катализируемого ПА. Получены новые полифункциональные энантиомерно чистые N-ацильные производные цистеина и глутатиона, показана возможность количественного определения энантиомеров аминоспиртов и нефункционализированных аминов методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией при использовании синтезированных хиральных SH-реагентов. Оптимизирован интегральный биокаталитический метод для препаративного получения обоих энантиомеров различных классов аминосоединений, а именно a-аминокислот, аминоспиртов, гидрофобных аминов, основанный на реакциях гидролиза в водной среде.

Практическая значимость. Разработан высокоэффективный биокаталитический одностадийный метод препаративного получения энантиомерно чистых N-ацильных производных аминотиолов, основанный на хемо- регио- и стереоселективном ацильном переносе в водной среде, катализируемом ПА. Применение новых энантиомерно чистых функционализированных N-ацильных производных цистеина существенно расширяет возможности метода ВЭЖХ с предколоночной модификацией для хирального анализа первичных аминосоединений. Разработан универсальный метод определения оптической чистоты аминосоединений. Проведена оптимизация условий препаративного ферментативного получения полифункциональных N-ацильных производных аминосоединений. Разработаны методики препаративного разделения энантиомеров различных подклассов первичных аминосоединений интегральным биокаталитическим методом.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международных конференциях Биокатализ - 2002, 2005, 2007; 100 лет хроматографии, Биокатализ в нетрадиционных средах (2008), международных симпозиумах по биокатализу и боитрансформации BioTrans-2005, 2009; международном симпозиуме по соврменным методам органической химии (2006), международном биокаталитическом конгрессе (2007).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 1 патентная заявка и 10 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 184 ссылки. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 15 схем и 15 рисунков.

Основные результаты работы

Оптимизация реакций ацильного переноса, катализируемых пепициллинацилазой, с учетом растворимости компонентов

Е+Я

т

Е + Р,

Реакции ацильного переноса, катализируемые ПА, протекают в соответствии со следующей схемой.

Схема 2. Минимальная кинетическая схема

активированного ацильного переноса, катализируемого ПА. Е - фермент, 8, Рь Р2 и Р - субстрат, продукты гидролиза и синтеза, N -нуклеофил, Е8 и ЕР -комплексы фермента с субстратом и продуктом синтеза, ЕА - ацилфермент, ЕАЫ - комплекс

ацилфермента с нуклеофилом

Р1

ЕА1У

Е + Р

Уравнения, описывающие накопление продуктов реакции представлены ниже

йр _к2 Е Л К$ Е Г(5 + а-/>)-(1 + Д,-гЛГ)1

ж К* [ (1+/?0-(1+уН) ]

Еу, / \ [ к, ке) *3.(1+Д,-(1+гН) ) 4 / / К*

Накопление продукта ацильного переноса Р в рамках данной схемы проходит через кинетический максимум, поэтому для получения максимальной концентрации продукта ацильного переноса в общем случае реакцию необходимо останавливать в момент достижения им максимальной концентрации. Уравнение {с1Р/ск) = 0 не имеет аналитического решения, поскольку в его выражении присутствует концентрация Р2, которая неявным образом зависит от кинетических параметров. Тем не менее, в ряде частных случаев можно получить хорошую верхнюю оценку или даже точное выражение для выхода продукта ацилирования. В зависимости от растворимости всех компонентов реакций ацильного переноса на первичные аминосоединения (аминокислоты, аминоспирты, гидрофобные амины), катализируемые ПА в водной среде, на практике можно разделить на четыре группы (талица 1).

Таблица 1. Максимальный выход продукта ацильного переноса в расчете на нуклеофил.____ ___^_______

Растворимый продукт ацилирования Ограниченно растворимый продукт ацилирования

Растворимый ацильный донор " 1 А-». (1> а-Р 7 = 1 2 (2)

Ограниченно растворимый ацильный донор . а 7 В ' Б (3) Ро JJp = 1 а'Р"" (4) В -S -N Ио ^ sal '' 0

где Б и, и Рм( - растворимости ацильного донора и продукта ацилирования соответственно, ю = 50/Н0 - исходный избыток ацильного донора

Из полученных уравнений следует, что только в одном случае (ограниченно растворимый ацильный донор/растворимый продукт) максимально достижимый выход ограничен величиной меньшей 100%. В данном случае максимальный выход, достигаемый при условии насыщенной концентрации ацильного донора в момент его достижения, не зависит от общих концентраций реагентов, а значит и нет необходимости их повышения. В остальных трех случаях теоретически может быть достигнут выход продукта ацильного переноса равный 100%. При этом увеличение выхода продукта ацилирования происходит при увеличении концентрации нуклеофила. Наиболее эффективным повышение концентраций оказывается в случае растворимого ацильного донора и плохо растворимого продукта ацилирования. Эти выводы были использованы при планировании и проведении стадии ферментативного ацилирования с целью получения энантиомерно чистых соединений.

Получение энантиомерно чистых тиолов методом ферментативного хемоееле1Стивного ацилирования

Стремление к проведению селективных превращений, затрагивающих лишь определенную функциональную группу в молекуле комплексного субстрата, исключая тем самым протекание побочных реакций, является одной из основных тенденций тонкого органического синтеза. Традиционная химическая конденсация полифункциональных субстратов включает дополнительные стадии введения и последующего снятия защитных групп, что делает процесс трудоемким, существенно снижает выход и качество целевого продукта, в том числе за счет рацемизации или разрушения лабильных промежуточных соединений. В отличие от химических превращений, ферментативные реакции протекают в мягких условиях. Тонкая организация активного центра ферментов обеспечивает, наряду с высокими скоростями, исключительную структурную и стереоизбирательность их действия, обеспечивающего синтез сложных, полифункциональных соединений в одну стадию. Тем не менее, в настоящее время даже при использовании биокатализа проведение хемоселективного ацилирования аминогруппы в

присутствии меркаптогруппы является одной из сложных задач. По нашему мнению именно применение воды в качестве растворителя для ферментативных реакций позволяет достичь наиболее эффективной дискриминации по нуклеофильной реакционной способности между амино- и меркаптогруппами.

Для изучения хемоселективности и эффективности катализировать ацильный перенос в таких превращениях бы ли исследованы реакции ацилирования цистеина и глутатиона, катализируемые ПА из A.faecalis в водной среде. В условиях депротонирования аминогруппы (pH 10-10,5) ферментативное ацилирование цистеина протекает весьма эффективно, исключительно по аминогруппе. Накопление целевого продукта имеет кинетический максимум и за 15-120 минут, в зависимости от специфичности ПА к ацильному донору, выход продукта 82-95% (таблица 2).

В рассматриваемом ряду ацильных доноров наибольшая скорость синтеза достигается при использовании фенилацетамида (аналога природного субстрата), а так же амидов R-миндальной кислоты и R-фенилглицина. При этом высокий выход целевого продукта обеспечивается достаточно высоким отношением начальных скоростей синтеза и гидролиза (S/H). Примечательно, что в случае менее специфичных амидов феноксиуксусной и S-миндальной кислот - их близких струтурных аналогов, при общем замедлении реакции наблюдается увеличение эффективности ацильного переноса (S/H) и, соответственно, достигается больший выход продукта ацилирования. Аналогичные закономерности наблюдались и при ацилировании других аминокислот.

При использовании в качестве ацильного донора амида D-фенилглицина, ферментативное ацилирования также протекает хемо- и региоселективно исключительно по аминогруппе цистеина. Свободная аминогруппа ацильного части образующегося продукта обладает низкой основностью. Это позволило в дальнейшем осуществить ее хемоселективное ацилирование химическим путем в водной среде в области pH близкой к нейтральной. Таким образом удалось избежать необходимости введения защитных групп.

Продукт Ацильныый Цистеин, Vo/Eo, с"1 (S/H) о Выход, %

донор, М М

NPC 0,25 0,2 131 20 75

NPOC 0,25 0,2 1,0 36 93

NPGC 0,3 0,2 501 23 89

R-NMC 0,3 0,2 553 22 83

S-NMC 0,3 0,2 52 67 95

-о-

(X1,X2,XJ) =

(0)„ NH2

(Н, Н, Н), п=0 (Н, Н, Н), п=1 (0Н,Н, Н), п=0 (Н, ОН, Н), п=0 (NH;, Н, Н),п=0 (Н, Н, ОН), п=0

У

HS

н

■С ООН

ПА из Afaecalis водная среда рШ0,25°С

(S)-Cys

pK,(-SH)=8.6 pK,(-NH,*)=10.5

>оон Xj-V V-(0)n nh-T

NPC - HS

NPOC R-NMC S-NMC NPGC p-OH-NPC

(выход 82-95%, ее > 99.9)

О"

вода/ацетон (l/I V/V) pH 8, 0-5 "С

pK,(-SH)=10.2 pK.(-NH,')=7.4

ООН

Схема 2. Получение N-ацильных производных S-цистеина.

Ферментативное ацилирование глутатиона, как и цистеина, проводили в водной среде (pH 10,5, 25°С). В качестве ацильных доноров использовали амиды фенилуксусной и отдельных энантиомеров миндальных кислот. В ходе реакции синтезируется исключительно N-ацильное производное глутатиона. Глутатион является менее специфичным нуклеофилом, по сравнению с цистеином (параметр S/H примерно в 10 раз меньше). Тем не менее, ферментативный ацильный перенос протекает достаточно эффективно. Выход целевого продукта составляет 65-80% в зависимости от ацильного донора. Следует отметить, что все рассмотренные реакции протекают очень быстро - начальные скорости накопления продуктов синтеза (приведенные к концентрации фермента) составляют сотни обратных секунд, и существенно превышают каталитические константы ферментативного гидролиза специфических субстратов с той же ацильной частью.

Таблица 3. Параметры синтеза N-ацильных производных глутатиона.

Продукт

Ацильный донор, М

Глутатион, М

S/H

выход, %

N-Phac-GSH N-R-Mac-GSH N-S-Mac-GSH

0,45 0,6 0,6

0,3 0,4 0,4

65 72 80

Полученные результаты свидетельствуют о высокой хемоселективности ПА в водной среде по отношению к аминогруппе в присутствии меркаптогруппы. Разработанный биокаталитический метод хемоселективного синтеза энантиомерно чистых Ы-ацильных производных цистеина и глутатиона характеризуется высокой эффективностью и позволяет получать соответствующие соединения в препаративных количествах.

Применение новых хиральных тиолов для определения энантиомеров первичных аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией

Наличие меркаптогруппы у новых N-ацильных производных цистеина и глутатиона (схема 3) определяет интерес к этим соединениям не только с точки зрения их потенциальной физиологической активности, но и с точки зрения применения в качестве хиральных SH-реагентов для количественного определения энантиомеров первичных аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией. Модификация первичных аминогрупп ОФА в присутствии тиола приводит к образованию изоиндольных аддуктов с характерным максимумом поглощения при 340 нм и флуоресцирующих при 450 нм. Образующиеся диастереомерные изоиндольные аддукты (схема 4) можно разделить на обычной (не хиральной) колонке, например, на фазе С18. Использование коммерчески доступных SH-реагентов (NAC и других гомохиральных соединений) для этих целей ограничено и позволяет анализировать в основном энантиомеры аминокислот. Более того, задача хирального анализа аминоспиртов и особенно нефункционализированных аминов как косвенными, так и прямыми метода является весьма сложной. Применение полученных новых энантиомерно чистых N-ацильных производных цистеина и глутатиона, содержащих дополнительный хиральный центр и функциональные группы, позволяет улучшить эффективность разделения и расширяет области использования данного метода для аминоспиртов и аминов.

о о

но о о

\—U HS Ч—ff HS

NPC

R-NMC

Ph

-NH О О

$4"а

«хс ^ч

NPPC

NPOC

Схема 3. Структуры новых энантиомерно чистых тиолов.

Было показано, что дериватизация аминогрупп ОФА и полученными в рамках данной работы функционализированными тиолами приводит к образованию изоиндолов с характерными спектральными свойствами. Были подобраны условия количественного определения первичных аминогрупп. При более чем двух кратном избытке ОФА и пятикратном избытке 5Н-реагента над

аминогруппами наблюдается насыщение по ним, а изменение оптической плотности происходит пропорционально концентрации аминогрупп (Рис. 1). Коэффициент молярного поглощения при 340 нм составляет порядка 6000 М"'см"'). Были подобраны оптимальные для хирального анализа условия хроматографирования на традиционной обращено-фазовой аналитической колонке С18 - скорость потока, состав элюента (рН, содержание ацетонитрила). В частности найдено, что лучшее разделение изоиндолов достигается при рН элюента 6,8. Образовавшиеся изоиндольные аддукты стабильны в течение нескольких часов в условиях ВЭЖХ анализа (таблица 4) - обязательном требовании количественного определения энантиомеров аминосоединений.

сно

сно

HN4^COOH

/*н

,.R> --r2 н

Схема 4. Реакция модификации рацемата Рисунок 1 Зависимость предельной оптическо'

аминосоединения с ОФА и хиральным плотности от концентрации лейцинола. Условия: 25

меркатосоединением с образованием С; боратный буфер рН 9,6; скас = 1 мМ; софа = 0,4 м1 диастереомерынх изоиндольных аддуктов

Структуры исследованных аминосоединений представлены на схеме 5.

1. 2-ЫарМЬу1- 8. Р(1-СН2- 13.

2. р-С1-РЬ- 9 р„.

3. РИ-СН2-СН2- 10. (Снз)2СН-СН2- ^ ^ "С00н

4. Р11-

5. (СН3)2СН-(СН2)3-

6. сн3-(сн2)4- 14'

7. (СН3)2СН(ОН)-(СН2)3-

Схема 5. Структуры исследованных аминосоединений

Ох

11. сн3-сн2

12. СН,-

Таблица 4. Стабильность в элюенте изоиндольных аддуктов, образованных при модификации с NAC и R-NMC_

1 2 3

ч NAC tf-NMC NAC ß-NMC NAC Ä-NMC

(±) R 5 (±) R S R 5 S R

0 100 100 100 100 100 100 100 100 ' 100 100

1 101 99 99 99 99 99 98 100 99 99

3 99 101 101 98 97 97 97 99 95 95

6 98 100 100 98 94 94 96 98 90 90

12 97 99 99 96 90 89 93 98 81 82

Таблица 5. Сравнение эффективности разделения энантиомеров аминосоединеш при использовании NAC и R-NMC

NAC Ä-NMC

V а R ЕС6 ki' а R EC°

1 26 1,00 0 30% 13 1,04 1,35 37%

2 16 1,00 0 27% 9.4 1,05 1,35 37%

3 31 1,00 0 27% 20 1,05 1,42 35%

4 15 1,00 0 25% 21 1,02 1,1 33%

5 46 1,00 0 27% 23 1,03 0,90 37%

6 49 1,02 0,45 27% 19 1,03 1,00 33%

7 2,7 1,23 3,47 30% 1,8 1,10 2,24 37%

8 17 1,04 0,86 25% 15 1,13 4,2 27%

9 13 1,03 0,81 25% 10 1,13 3,5 27%

10 19 1,05 1,34 22% 3,4 1,06 1,81 37%

11 3,0 1,11 1,61 25% 7,9 1,16 3,26 27%

12 3,8 1,13 2,40 20% 1,5 1,08 1,63 27%

13 2,3 1,13 2,16 25% 2,2 1,27 4,37 30%

14 26 1,06 1,76 27% 10 1,05 1,53 33%

а структуры представленные на схеме 3; ЕС ° содержание ацетонитрила (V/V) в подвижной фазе

Таблица 6. Сравнение эффективности разделения энантиомеров аминосоединений

№а NAC NPC NPOC R-NMC S-NMC NPPC

а R а R а R а R а R а R

1 1,00 0 1,00 0 1,04 0,71 1,04 1,32 1,05 1,50 1,03 1,22

3 1,00 0 1,03 1Д4 1,03 0,80 1,05 1,42 1,06 1,77 1,05 1,47

8 1,03 1,15 1,06 1,146 1,04 1,06 1,07 1,70 1,10 2,97 1,05 1,41

11 1,08 1,93 1,00 0 1,06 1,41 1,08 2,28 1,08 2,49 1,08 1,92

13 1,13 2,16 1,17 3,75 1Д2 3,00 1,27 4,37 1,59 9,45 1,26 2,76

О 20 40 60 SO 100 t {min)

50

t (min)

Рисунок 2. Сравнение эффективности разделения энантиомеров 2-амино-4-фенилбутана: А - с использованием NAC на колонке Luna С18, Б - на хиральном носителе CrownPack CR(+), В - при использовании R-NMC на колонке Luna С18.

Полученные результаты (таблицы 5 и 6) показывают, что хроматографическое разрешение образующихся диастереомерных изоиндольных аддуктов сильно зависит от природы аминокомпонента и SH-реагента. Лучшее разделение наблюдается в случае аминокислот, для аминоспиртов разделение лучше, чем для аналогичных нефункционализированных аминов. При использовании NAC и более гидрофобных гомохиральных NPC и NPOC в редких случаях удается добиться удовлетворительного разделения изоиндольных аддуктов энантиомеров аминоспиртов, а изоиндолы нефукционализированных

аминов совсем не разрешаются. В противоположность гомохиральным тиолам, применение диастереомерных R-NMC, S-NMC, NPPC значительно увеличивает разрешение изоиндолов для всех рассмотренных классов соединений. Применение S-NMC позволяет разрешить до базовой линии (R > 1,5) все испытуемые соединения (рисунок 2).

Хиральная дискриминация диастереомерных изоиндолов во многом обусловлена их конформационной жесткостью за счет внутримолекулярных взаимодействий. Высокая селективность в отношении производных аминокислот и аминоспиртов может быть объяснена специфическими внутримолекулрными взаимодействий между функциональными группами тиола и аминосоединения, в частности, водородной связью. Повышение селективности для диастереомерных R-NMC, S-NMC, NPPC-изоиндолов может быть обеспечена вовлечением дополнительного хирального манделил/фенилглицильного остатка во внутримолекулярные взаимодействия.

Использование N-ацильных производных глутатиона не дает преимуществ по сравнению с NAC для разрешения энантиомеров аминов, не смотря на наличие у трех хиральных центров и дополнительных функциональных групп в их молекулах. Это, возможно, связано с большим молекулярным размером этих соединений: в результате взаимодействие их остатков в изоиндолах с неподвижной фазой начинает доминировать в общем вкладе взаимодействия молекулы, что приводит к нивелированию вклада хирального остатка аминокомпонента.

Разработанный метод характеризуется высокой воспроизводимостью (sr 0,5— 1,0 %) и чувствительностью. Предел обнаружения энантиомеров первичных аминосоединений составляет 2-4 пмоль при спектрофотометрическом детектировании, и 0,6-2 фмоль при флюориметрическом. Исключением является нафтилэтиламин, флуоресценция которого на три порядка ниже по сравнению с другими аминами (предположительно из-за внутримолекурного тушения).

Таким образом, была разработана методология использования полифункциональных энантиомерно чистых N-ацильных производных цистеина для определения энантиомеров различных классов аминосоединений, включая аминоспирты и гидрофобные амины, методом ВЭЖХ с предколоночной модификации ОФА. Разработанный метод анализа оптической чистоты аминосоединений был в дальнейшем использован для определения энантиомеров в ходе протекания стереоселективных ферментативных реакций. Применение новых энантиомерно чистых функционализированных тиолов впервые позволило провести количественную характеристику стереоселективности реакций ферментативного ацилирования первичных аминосоединений и гидролиза их N-ацильных производных.

Разделение энантиомеров аминосоединений

Разработка биокаталитических методов препаративного получения энантиомеров различных подклассов первичных аминосоединений проводили в рамках общей схемы интегрального биокаталитического метода. Суть его заключается в последовательном проведении исчерпывающего стереоселективного

ацилирования активного энантиомера рацемата первичного аминосоединения (схема 1, стадия 1) и, после отделения, стереоселективного гидролиза >1-ацильного производного аминосоединения (схема 6, стадия 3), катализируемых ПА в водной среде.

I. Энантиоселективное ферментативное ацилирование

+ н2и

А1сиЦ%епе$ ПА

0_/

водная среда, рН 10 *-/

2%

+ Н2№

2. Разделение

3. Энантиоселективный ферментативнй гидролиз

Схема 6. Интегральный биокаталитический метод разделения энантиомеров аминов.

Практическая реализация интегрального биокаталитического метода разделения энантиомеров аминосоединений (аминокислот, аминоспиртов, аминов) на препаративном уровне различных классов стала одной из основных задач данной работы.

Разделение энантиомеров неприродных а-аминокислот

Стереоселективные реакции ацильного переноса на а-аминокислоты были исследованы на примере а-аминопентановой кислоты (норвалин) и а-аминогексановой кислоты (норлейцин). Для выбора оптимального ацильного донора было проведено исследование кинетических параметров ацилирования аминокислот различными ацильными донорами (таблица 7). Во всех исследованных случаях стереоселективность реакции ацилирования превышала 500.

t.m¡n t,m¡n

Рис. 2. Кинетические кривые ацилирования nor-Leu амидом R-миндальной кислоты (А) и ацилирования nor-Val амидом п-гидрокси-фенилуксусной кислоты (Б).

Таблица 7. Кинетические параметры ацилирования норвалина и норлейцина. Условия эксперимента: концентрации аминокислоты - 0,2 М, ацильного донора -

nor-Val nor-Leu

Ацильный донор S/H V,сек' S/H V,сек 1

PhAcNHj 5,6 615 7,9 558

R-MA 8,8 343 5,4 334

S-MA 58 109 18,8 112

PhOAcNH2 - - >40 11

p-OH-PhAcNH2 43 150 - -

Из приведенных данных следует, что наиболее эффективный ацильный перенос достигается при использовании амидов феноксиуксусной, Б- миндальной и пара-гидроксифенилуксусной кислот. Последние два амида характеризуются значительно более высокой растворимостью, чем первый, что способствует достижению более высокого выхода продукта ацилирования. Напротив, наряду с плохой растворимостью, феноксиацетамид является и медленным ацильным донором, что значительно увеличивает расход фермента. Учитывая низкую стоимость и доступность, пара-гидроксифенилацетамид является наиболее предпочтительным ацильным донором для ацилирования неприродных аминокислот.

Для достижения более полного разделения энантиомеров норлейцина была исследована интегральная кинетика его ацилирования в высококонцентрированном растворе при использовании иммобилизованного препарата ПА. Повышение концентрации в данном случае не ведет к повышению максимально достижимого выхода продукта ацильного переноса, но позволяет сократить необходимый для достижения максимального выхода избыток ацильного донора и существенно облегчить дальнейшее выделение аминокислоты из реакционной среды. Применение иммобилизованного фермента, с одной

стороны, уменьшает расход фермента, так как очень высокие концентрации реагентов приводят к существенной инактивации нативного препарата фермента, а, с другой стороны, благодаря высокой растворимости продукта ацильного переноса, позволяет останавливать реакцию в момент достижения кинетического максимума накопления продукта простым фильтрованием реакционной смеси. Полученный после фильтрования отработанный фермент содержит лишь незначительное количество нерастворенного ацильного донора, который можно удалить простым промыванием, после чего использовать препарат ПА как для последующей стадии гидролиза, так и для повторного проведения полного цикла интегрального биокаталитического метода.

Выход и оптическая чистота полученных энантиомеров норвалина представлены в таблице 8.

Таблица 8. Показатели препаративного разделения энантиомеров норвалина

Ацильный донор Продукт синтеза О-энантиомер

Стадия ацилирования гидроксифенилацетамид Выход 48% ее 99% Выход 51% ее 92%

Ь-энантиомер

Стадия гидролиза Выход 99%

ее >99%

Норвалин и норлейцин относятся к неприродным а-аминокислотам, поэтому для них нет дешевого микробиологического способа получения ни Ь-энантиомера, ни тем более Э-антипода. Описанный подход, основанный на двух ферментативных реакциях, катализируемых ПА в водной среде, позволяет получить в препаративных количествах из исходного рацемата аминокислот оба энантиомера высокой энантиомерной чистоты с высоким выходом.

Разделение энантиомеров аминоспиртов

С точки зрения возможных методов разделения энантиомеров аминоспирты можно разделить на две группы: аминоспирты, которые могут быть получены восстановлением аминокислот (с концевой ОН группой) и аминоспирты, которые получить таким образом нельзя (без концевой ОН группы).

При разделении аминоспиртов первой группы были выбраны следующие соединения: 2-аминобутанол (1), фенилаланинол (2), фенилглицинол (3).

Схема 7. Структура аминоспиртов.

Определение энантиоселективности ферментативного ацилировния аминоспиртов 1-3 амидами пара-гидроксифенилуксусной и миндальных кислот показало, что в данном ряду только фенилглицинол может быть препаративно разделен интегральным биокаталитическим методом (таблица 9).

Таблица 9. Стереоселективность ацилирования аминоспиртов с концевой ОН группой, катализируемого ПА из А./аесаИх._

Амин

Стереоселективность

16а

>200°

а - ацильный донор амид Я-миндальной кислоты 6 - ацильный донор амид пара-гидроксифенилуксусной кислоты

Разделение энантиомеров фенилглицинола было проведено препаративно при использовании в качестве ацильного донора пара-гидроксифенилацетамида и высоких концентраций реагентов. Выходы и оптическая чистота энантиомеров представлены в таблице 10.

Таблица 10. Показатели препаративного разделения энантиомеров

Стадия ацильного Продукт синтеза Я-энантиомер

переноса Выход 51% ее 97,8%

ее 99%

Стадия гидролиза Б-энантиомер

Выход >99%

ее 99%

Ввиду низкой стереоселективности ферментативного ацилирования, аминобутанол и фенилаланинол не могут быть напрямую стереоселективно ацилированы с помощью пенициллинацилазы. В качестве возможного способа увеличения стереоселективности ферментативного превращения было исследовано влияние тетрагидропиранильной модификации ОН группы (схема 8)

к ТоэОН 0

НзхКн + V" СНС|з Н>М'

Схема 8. Модификация гидрокисируппы аминоспиртов.

В результате такой модификации происходит существенное увеличение бокового радикала аминоспирта, что может положительно сказаться на эффективность дискриминации энантиомеров в активном центре фермента, а также на выход продукта ацилирования за счет снижения его растворимости (уравнение 4).

Проведенные исследования показали, что, несмотря на ожидания, введение ТГП модификации не позволяет увеличить стереоселективность (таблица 11).

Таблица П. Кинетические параметры ферментативного ацилирования 2-амино-1-

амин модификация форма УпС1 Ро, М-1 выход Е

Нет3 ± 120 21 70% 4,8(8)

НгЫ Есть6 Б 23 3,3 45% 1,2(8)

Есть6 Я 12 2,9 42%

( он Нет0 ± 65 15 80 16(8)

\ СНЗ Естьг ± 11 3,7 40 3,7(8)

Естьг Б 9,0 2,3 30

Естьг Я 4,5 1,5 17

:ло Нет3 Есть6 Есть6 ± Б К 100 24 11 11 2,0 -0,6 45% 75% 18% 2,3(11) -3-4(8)

а - 0,3 М фенилацетамид, 0,2 М (±)-амин, б - 0,2 М фенилацетамид, 0,1 М О-ТГП-амин, в - 0,3 М О-РОА, 0,2 М (±)-амин, г - 0,2 М Э-РОА, 0,1 М О- ТГП-амин

В качестве аминоспиртов из второй группы были исследованы реакции ферментативного ацильного переноса на аминогруппу следующих соединений.

но'

0Шг (X

Схема 9. Структура аминоспиртов.

Во всех исследованных случаях реакции ацильного переноса идут с достаточно высокой эффективностью, что может быть использовано для получения Ы-ацильных производных соответствующих аминоспиртов (таблица 12).

Таблица 12. Кинетические параметры ферментативного ацильного переноса с участием 11-амида миндальной кислоты и соответствующего аминоспирта.

аминоспирт Ро, М"1 Е

1 29 <5*

2 25 <10*

3(в) 35 1,5

3(1*) 20

4(5) 80 120

4® 0,67

Препаративное разделение энантиомеров транс-аминоциклогексанола в рамках интегрального био каталитического метода было проведено при использовании амида 11-миндальной кислоты в качестве ацильного донора. Выходы и оптическая чистота полученных энантиомеров представлены в таблице 13.

Таблица 13. Показатели препаративного разделения энантиомеров транс-аминоциклогексанола.

Стадия Продукт синтеза Ы-энантиомер

ацильного Выход 52% Выход 47%

переноса ее 98% ее 92%

Стадия Б-энантиомер

гидролиза Выход >99%

ее 99%

Таким образом, было показано, что ферментативное ацилирование аминоспиртов, в ряде случаев является высоко и стереоселективным. Интегральный биокаталитический метод может быть использован для препаративного получения энантиомеров. Опыт с введением ТГП модификации ОН группы показал, что улучшения дискриминации энантиомеров аминоспиртов при модификации субстрата данным реагентом добиться не удается. Необходим либо подбор более подходящего модификатора, либо инженерия фермента. Следует подчеркнуть, что получение энантиомеров транс-циклогексаноламина не может быть проведено при восстановлении энантиомерно чистых аминокислот и возможно лишь прямое разделение. Разработанный метод разделения энантиомеров при помощи ПА является уникальным. Описанный в литературе метод разделения энантиомеров транс-циклогексаноламина с помощью липазы требует предварительной защиты аминогруппы, без введения которой стереоселективность мала (15-30), а ацилирование протекает как по ЫН2 группе, так и по ОН группе.

Разделение энантиомеров гидрофобных аминов

При разделении гидрофобных аминов интегральным биокаталитическим методом с целью получения обоих энантиомеров в качестве ацильного донора может быть использован только Б-фен ил глицинам ид. Это связано с тем, что продукты ацилирования данных соединений с помощью фенилацетамида и других нейтральнх ацильных доноров представляют собой очень гидрофобные, плохо растворимые в воде соединения. Вследствие этого проведение второй стадии интегрального метода разделения - гидролиза Ы-ацильного производного активного энантиомера - затруднено. Низкая растворимость соединений в воде приводит к низкой скорости гидролиза, сильному конкурентному ингибированию образующейся в ходе гидролиза кислотой и, возможно, неблагоприятной термодинамикой процесса. Ы-фенилглицильные производные имеют

преимущества по всем этим пунктам: они обладают достаточно высокой растворимостью в условиях гидролиза (рН 6-7), образующийся в ходе реакции фенилглицин обладает более высоким значением рК аминогруппы (10), чем амид (7,5), благодаря чему практически полностью находится в цвиттерионной форме во время гидролиза, которая не ингибирует фермент и не осложняет протекание гидролиза.

Возможности разделения энантиомеров гидрофобных аминов с помощью пенициллинацилазы были исследованы на примере производных 1-фенилэтиламина (схема 10).

СН3 МН2 0Ме NN2

I 2

6 7 8 9 10

Схема 10. Структуры исследованных гидрофобных аминосоединений.

Многие из перечисленных аминов являются частью давно используемых или новых фармацевтических препаратов. Параметры интрегральной кинетики ацилирования аминов 1-10 приведены в таблице 14.

Из полученных данных (таблица 14) следует, что введение небольших заместителей в бензольное кольцо (амины 1-4) не приводит к существенным изменениям эффективности ацилирования по сравнению с фенилэтиламином, однако в значительной степени снижает стереоселективность. Тем не менее, во всех четырех случаях стереоселективность достаточно высока для разделения энантиомеров интегральным биокаталитическим методом.

Существенно большее влияние на параметры реакции ацилирования оказывают заместители в алифатической части молекулы (соединения 5-10). Удлинение алифатического радикала на одну метиленовую группу или введение разветвления приводит к ухудшению как эффективности, так и стереоселективности ацилирования почти на порядок.

Таблица 14. Кинетические параметры интегральной кинетики ферментативного ацилирования аминов амидом Э-фенилглицина. Концентрация ацильного донора в

случае аминов 1-3 составила 0,25 М, в остальных случаях - 0,35 М.

Амин Концентрация амина, М Энантиомер У8о/ЕО, С1 Б/Н Е Выход3, %

1 0,2 И 300 35,9 66 54

Б 4,6 0,56

0,2 Я 189 13,8 165 52

2 Б 1,15 0,07

3 0,13 166 10,5 >150 53

4 0,17 108 6 >150 52

0,21 К 43 1,2 150 51

5 Б 0,29 0,0033

0,2 Я 20 0,44 107 26

6 Б 0,19 0,0041

7 0,15 0,23 н.о. 21

8 0,2 Я - 0,1 31 29

Б - 0,0032

9 0,2 1,7 0,06 н.о. 1,8

10 0,2 <0,05 <0,01 - <0,05

"выход в расчете на рацемат амина

В этом ряду высокое значение стереоселективности и эффективности ацильного переноса наблюдается только для фенилпропиламина (5). Разделение 5 было проведено препаративно. Показатели препаративного получения обоих энантиомеров 5 приведены в таблице 15.

Таблица 15. Показатели эффективности разделения энантиомеров фенилпропиламина.

Продукт синтеза Б-энантиомер

Стадия ацилирования Выход 52% Выход 47%

ее 96% ее 95%

Я-энантиомер

Стадия гидролиза Выход 95%

ее 99%

Несмотря на высокую стереоселективность ацилирования амина 6 и, вероятно, 7 и 9, низкая эффективность их ацилирования амидом Б-Рв недостаточна для количественного превращения активного энантиомера. Для таких аминов на стадии ацилирования невозможно добиться высокой оптической чистоты не вступающего в реакцию неактивного энантиомера. В то же время повышение выхода продукта ацильного переноса можно добиться за счет понижения его растворимости при использовании более гидрофобных ацильных доноров.

Таблица 16. Параметры ацилирования аминов с помощью фенилацетамида (0,35 М)._

Амин Концентрация амина, М Ум/Ео, с1 8/Н Растворимость, М Растворимость продукта, мМ Теор. Выход3, % Выход6, %

6 0,15 65 0,3 0,15 0,1 б4 49 52

7 0,15 19 0,11 0,25 1,0 40 23

9 0,15 8 0,05 0,14 0,16 44 29

"выход, рассчитанный по уравнению 4, в котором N0 принимали равным растворимости амина, деленный на два, для расчета на рацемат амина. Значение параметра а приняли равным двум, что является верхней оценкой для данных соединений, выход в расчете на рацемат амина

Применение в качестве ацильного донора амида ФУК вместо амида О-РС позволило существенно повысить выход продуктов ацилирования аминов 6 и 9, благодаря их низкой растворимости в воде. В случае амина 6 удалось провести близкое к количественному ацилирование активного энантиомера. Оптическая чистота оставшегося энантиомера амина превысила 90%. Таким образом, описанный метод может быть использован для получения Б-энантиомера соединения 6 и Я-энантиомера его фенилацетильного производного.

В случае ацилирования аминов 7 и 9 максимальный теоретический выход составляет около 45%, однако для его достижения необходимо использование не менее десятикратного избытка фенилацетамида над амином.

Таким образом, применение интегрального биокаталитического метода, основанного на реакциях, катализируемых ПА в водной среде, позволяет разделить рацематы первичных аминосоединений (аминокислот, аминоспиртов, гидрофобных аминов) на индивидуальные энантиомеры с высоким выходом и оптической чистотой. По своей эффективности и производительности описанный метод значительно превосходит известные из литературы методы разделения энантиомеров.

Список сокращений

Интегральный биокаталитический метод - метод получения энантиомеров

первичных аминов, включающий стадию ферментативного ацилирования и

гидролиза, катализируемых ПА.

ПА - пенициллинацилаза

ФУК - фенилуксусная кислота

D-PG - D-фенилглицин

S/H - отношение начальных скоростей синтеза и гидролиза ее - оптическая чистота, (cR-cs)/(cR+cs)

Е - стереоселективность, отношение начальных скоростей превращения

отдельных энантиомеров

NAC - N-ацетилцистеин

ОФА - орто-фталевый альдегид

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

R - разрешение пиков

а - коэффициент селективности

к - коэффициент емкости

PhAcNH2 - фенилацетамид

R,S-MA - R^S-миндальные кислоты

R,S-MAA - амиды R,S-MHW^bHbix кислот

PhOAcNHi - феноксиацетамид

p-OH-PhAcNH2 - пара-гидроксифенилацетамид

ТГП - тетрагидропиранил

Основные результаты и выводы

1. Показано, что ферментативный ацильный перенос на аминогруппы аминотиолов и аминоспиртов, катализируемый ПА из A.faecalis в водной среде, протекает хемо-, регио- и стереоселективно с высокой эффективностью. На основе этого были разработаны: одностадийный биокаталитический метод получения энантиомерно чистых N-ацильных производных цистеина и глутатиона; хемоэнзиматический метод получения энантиомерно чистых тиолов общей структуры К-ацил-(11)-фенилглицил-(11)-Суз.

2. Применение новых функционализированных энантиомерно чистых тиолов позволяет увеличить разрешение энантиомеров первичных аминосоединений при их высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной модификацией орто-фталевым альдегидом и делает возможным количественное определение энантиомеров ряда аминоспиртов и аминов.

3. Структура ацильного донора определяет эффективность, стереоселективность и полноту реакций ферментативного ацилирования первичных аминосоединений, катализируемых ПА из A.faecalis в водной среде. На основании этого были разработаны методики препаративного биокаталитического получения обоих энантиомеров ряда первичных аминосоединений. При получении энантиомеров а-аминокислот наиболее эффективными ацильными донорами являются амиды S-миндальной и пара-гидроксифенилуксусной кислот; при получении энантиомеров аминоспиртов - амиды пара-гидроксифенилуксной и R-миндальной кислот; при получении энантиомеров гидрофобных аминов - амид D-фенилглицина.

Список публикаций

1. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Khimiuk A.Y., Svedas V.K. Efficient chiral analysis of primary amines and amino alcohols by HPLC with precolumn derivatization using novel TV-^-mandelyl-^-cysteine. J. Chromatogr. A, 2005, 1095, p.89-93.

2. Cernobrovkin M.G., Shapovalova E.N., Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Svedas V.K. Shpigun O.A. Chiral high-performance liquid chromatography analysis of alpha-amino acid mixtures using a novel SH reagent-N-R-mandelyl-L-cysteine and traditional enantiomeric thiols for precolumn derivatization. J. Chromatogr. A, 2007, v. 1175, p. 89-95.

3. Гуранда Д.Ф., Кудрявцев П.А., Чернобровкин М.Г., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А., Швядас В.К. Способ определения энантиомеров первичных аминосоединений. Заявка на изобретение per. номер. 2006123123. Изобретения и полезные модели. Бюллетень №2, 20.01.2008.

4. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Khimiuk A.J., Pchelintsev N.A., Shapovalova I.V., Svedas V.K. New chiral thiols for HPLC determination of enantiomers of

primary amines after pre-column modification with o-phthaldehyde. Abstracts of Int. Conf. "Biocatalysis-2002: Fundamentals and applications". Moscow, Russia. 2002, p.88.

5. Guranda D.T., Kudtyavtsev P.A., Khimiuk A.J., Svedas V.K. Determination of enantiomers of primary amines by HPLC with pre-column modification with o-phthaldehyde. Abstracts of Int. Conf. "100 Years of Chromatography". Moscow, Russia. 2003, P-276, p. 388.

6. Kudryavtsev P.A., Baranov M.S., Panin N.V., Alekseev R.S., Ulanovskaya M.A., Guranda D.T. Chemo-enzymatic synthesis of polyfunctionalized thiols and their application for chiral HPLC analysis. Abstracts of the Int. Conf. "Biocatalysis-2005". St. Petersburg, Russia. 2005, p.87.

7. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Ulanovskaya M.A., Alekseev R.S., Svedas V.K. Polyfunctionalized thiols as novel SH-reagents for chiral HPLC analysis of primary amino compounds and monitoring of stereoselective biocatalytic transformations. Abstracts of the VII Int. Symp. on biocatalysis&biotransformations "BioTrans-2005". Delft, The Netherlands. 2005, p.309.

8. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Sidorova A. V., Svedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillin acylase in aqueous medium. Int. Symp. Advanced Science in Organic Chemistry. Sudak, Crimea, Ukraine. 2006, C-043.

9. Kudryavtsev P.A., Guranda D.T., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Godina A.F., Svedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillin acylase in aqueous medium. Abstracts of the Int. Conf. "Biotechnology-2007". Moscow, Russia. 2007, p.60.

10.D.T. Guranda, P.A. Kudryavtsev, N.V. Panin, V.K. Svedas, Synthesis of novel functionalized thiols catalyzed by penicillin acylase in aqueous medium. Their application as effective SH-reagents for chiral HPLC analysis of primary amino compounds, Int. Conference Biocatalysis-2007, Moscow-St.Petersburg, June 1724, 2007, Abstracts, p.60-61.

11.Kudryavtsev P.A., Guranda D.T. Synthesis of functionalized thiols catalyzed by penicillin acylase in aqueous medium, and their application for chiral HPLC analysis. Abstracts of the Int. Conf. "Biocatalysis in non-convential media". Moscow, Russia. 2008, p.33.

12.Guranda D., Kudryavtsev P., Godina A., Svedas V. Synthesis of functionalized thiols catalyzed by penicillin acylase in aqueous medium and their application for chiral HPLC analysis. Abstracts of the Int. Symp. "BioTrans". Bern, Switzerland. 2009, p.323.

13.D. Guranda, P. Kudryavtsev, A. Godina, G. Ushakov, V. Sedlyarov, V. Svedas, Penicillin acylase-catalyzed resolution of amino compounds in aqueous medium, Proceedings of the International Conference "Enzyme Engineering XX", Groningen, The Netherlands, September 20-24, 2009, p. 131-132.

Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1066 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Пенициллинацилаза.

1.1.1 Общие свойства и механизм катализа.

1.1.2 Субстратная специфичность и стереоспецифичность.

1.2 Пенициллинацилаза в реакциях ферментативного гидролиза.

1.2.1 Получение ядер антибиотиков.

1.2.2 Высокоспецифичный гидролиз фенилацетильных производных амипосоединений.

1.3 Пенициллинацилаза в реакциях ферментативного синтеза.

1.3.1 Реакции активированного ацильного переноса.

1.3.2 Реакции прямой конденсации.

1.4 Применение гидролаз в синтетических целях.

1.4.1 Способы увеличения выхода продукта синтеза при использовании гидролаз.

1.4.2 Получение Ы-ацильных производных аминов.

1.4.3 Получение энантиомеров спиртов и аминов.

1.4.4 Хемо- и региоселективность гидролаз в реакциях синтеза.

1.5 Химические методы хемо- и региоселективного синтеза амидной связи.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы.

2.2 Методы.

2.2.1 Определение активности пенициллинацилазы.

2.2.2 Определение компонентов реакционной смеси методом ВЭЖХ.

2.2.3 Определениеэнантиомерной чистоты аминосоединений.

2.2.4 Получение М-ацильных производных Б-цистеина и глутатиона методом фермен тативного ацильного переноса.

2.2.5 Химическое фенилацетилирование N-R.-PG-R.-Cys.

2.2.6 Разделение энантиомеров фенилглицинола.

2.2.7 Разделение энантиомеров 1-фенилпропиламина.

2.2.8 Разделение энантиомеров транс-2-амино-циклогексанола.

2.2.9 Разделение энантиомеров норвалина.

2.2.10 Получение медного комплекса З-ЬуБ.

2.2.11 Ферментативное получение е-Ы-РИас-З-Ьуз.

2.2.12 Получение ТГП-производных аминоспиртов.

2.2.13 Снятие ТГП-защиты с производных аминоспиртов.

2.2.14 Химический синтез ароматических кетонов по реакции Фриделя-Крафтса.

2.2.15 Восстановительное аминирование кетонов.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Кинетические закономерности реакций фермептативого ацилирования.

3.1.1 Эффективность и стереоселективность ферментативного активированного ацильного переноса.

3.1.2 Синтез амидной связи с помощью реакции прямой конденсации.

3.2 Хемоселективная конденсация полифункциональных субстратов, катализируемая нснициллинацилазой в водной среде.

3.2.1 Синтез хиральных ]^-ацильных производных цистеина.

3.2.2 Синтез хиральных Т^-ацильных производных глутатиона.

3.2.3 Региоселективное ацилирование лизина.

3.3 Разработка метода определения оптической чистоты первичных аминосоединений на основе впервые полученных 8Н-реагентов.

3.3.1 Новые 8Н-реагенты для хирального ВЭЖХ анализа с предколоночной модификацией

3.3.2 Разработка метода ВЭЖХ анализа энантиомеров первичных аминосоединений.

3.3.3 Реакция модификации в условиях избытка аминокомпонента: новый способ анализа энантиомеров тиолов.

3.4 Реакции ацильного переноса на аминокислоты и их производные.

3.4.1 Реакции ацилирования валина и его эфиров.

3.4.2 Реакции ацилирования а-аминопентановой и а-аминогексановой кислот.

3.5 Реакции ацильного переноса на аминоснирты.

3.5.1 Стереоселективное ацилирование аминоспиртов с концевой ОН группой.

3.5.2 Стереоселективное ацилирование аминоспиртов с неконцевой ОН группой.

3.6 Реакции ацильного переноса на амины.

Актуальность проблемы. В настоящее время большинство биокаталитических промышленных процессов получения энантиомерно чистых соединений основано либо на реакциях ферментативного гидролиза в водной среде, либо на реакциях ацильного переноса в безводных органических растворителях. Общим недостатком этих методов является возможность получения только одного энантиомера соединения. Существенными проблемами биокатализа в неводной среде, ограничивающими его применение на промышленном уровне, являются чрезвычайно низкая активность ферментов, дороговизна и сложность утилизации органических растворителей. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что возможности применения доступных гидролитических ферментов в естественной для них водной среде еще далеко не исчерпаны. Примером может служить предложенный в нашей лаборатории метод высокоэффективного и стереоселекгивного ацилирования аминов в водных растворах и интегральный биокаталический метод разделения энантиомеров, основанный на реакциях синтеза и гидролиза, катализируемых пенициллинацилазой (ПА) в водной среде. В этой связи дальнейшее развитие высокоэффективных и экологически безопасных биокаталитических методов препаративного получения энантиомеров различных подклассов первичных аминосоединений, основанных на ферментативных реакциях в водной среде, имеет важное научное и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение эффективности, хемо- и региоселективности ферментативного ацилирования в водной среде различных подклассов первичных аминосоединений, катализируемого ПА, подбор и оптимизация условий препаративного биокаталитического получения энантиомерно чистых полифункциональных производных аминотиолов и обоих энантиомеров первичных аминосоединений различных подклассов, а также разработка аналитического метода определения энантиомеров первичных аминов для характеристики оптической чистоты аминосоединений в ходе ферментативного расщепления рацематов и при выделении конечных продуктов. При достижении поставленных целей были решены следующие задачи:

1) Оптимизация реакций ацильного переноса, катализируемых ПА в водной среде, на основе учета растворимости компонентов с целью получения энантиомерно чистых соединений в препаративных количествах;

2) Изучение эффективности и хемоселсктивности ферментативного ацильного переноса при ацилировании аминотиолов различными ацильными донорами и возможность улучшения параметров биокаталитического процесса путем инженерии субстратов;

3) Получение новых функционализированных энантиомерно чистых тиолов и их применение для количественного определения энантиомеров первичных аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией орто-фталевым альдегидом (ОФА);

4) Оптимизация условий препаративного получения обоих энантиомеров различных подклассов аминосоединений интегральным биокаталитическим методом.

Научная новизна. Показана возможность проведения высокоэффективного и хемоселективного ацильного переноса на аминогруппы аминотиолов и аминоспиртов в водной среде, катализируемого ПА. Получены новые полифункциональные энантиомерно чистые Ы-ацильные производные цистеина и глутатиона; показана возможность количественного определения энантиомеров аминоспиртов и нефункционализированных аминов методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией при использовании синтезированных хиральных 8Н-реагентов. Оптимизирован интегральный биокаталитический метод для препаративного получения обоих энантиомеров различных классов аминосоединений, а именно а-аминокислот, аминоспиртов, гидрофобных аминов, основанный на реакциях ацилирования и гидролиза, катализируемых ПА в водной среде. Практическая значимость. Разработан высокоэффективный биокаталичический одностадийный метод препаративного получения энантиомерно чистых 1Ч-ацильных производных аминотиолов, основанный на хемо- регио- и стереоселективном ацильном переносе в водной среде, катализируемом ПА. Применение новых энантиомерно чистых функционализированных Ы-ацильных производных цистеина существенно расширяет возможности метода ВЭЖХ с предколоночной модификацией для хирального анализа первичных аминосоединений. Разработаны методики препаративного разделения энантиомеров различных подклассов иервичных аминосоединений интегральным биокаталитическим методом.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1 Разработан универсальный метод хирального ВЭЖХ анализа первичных аминосоединений с помощью предколоночной модификации с о-фталевым альдегидом и новыми полифункциональными меркаптосоединениями. Подобраны условия хирального анализа широкого набора аминосоединений из классов аминокислот, аминоспиров, гидрофобных аминов. Определены метрологические характеристики разработанного метода, показана его высокая чувствительность (1-2 фмоль) и воспроизводимость (¿у 0,5-1,0 %). Показано, что при использовании избытка аминокомпонента метод может быть использован для количественного анализа тиолов.

2 Проведен детальный анализ кинетической схем ацильного переноса, катализируемый пенициллинацилазой, выявлены факторы влияющие на эффективность синтеза. Показано, что наиболее эффективным способом повышения выхода продукта ацильного переноса, обладающего ограниченной растворимостью является повышение общих концентраций реагентов. В то же время повышение концентраций в случае образования хорошо растворимого продукта не приводит к увеличению его выхода, но позволяет уменьшить необходимый избыток ацильного донора.

3 Подобраны условия и проведено препаративное разделение энантиомеров ряда аминосоединений из классов аминокислот, аминоспиртов и гидрофобных нефункционализированных аминов интегральным биокаталитическим методом, сочетающим две последовательные стереоселективные реакции — ацилирование одного из энантиомеров в рацемате и снятие введенной защиты после выделения продукта первой реакции из реакционной смеси.

4 Показана высокая хемоизбирательность пенициллинацилазы по отношению к аминогруппе в присутствии меркаптогруппы в цистеине и глутатионе. На основе этого разработан метод высокоэффективного хемоселективного синтеза, катализируемого пенициллинацилазой в водной среде и с помощью его получены в препаративных количествах новые полифункциональные Ы-ацильные производные цистеина и глутатиона.

5 Разработан метод региоселективного хемо-энзиматического получения полуфункциональных Е-Тч[-ацильных производных ЬиО лизина.

1. Miguel A., Raquel T.-G., Jesús T.-B. Biotechnology Letters 2002, 24, 1045-1048. Chromogenic analogues of penicillin dihydroF and penicillin K for the continuous spectrophotometric determination of aliphatic penicillin acylase activity.

2. Cole M. Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem.J., 1969, 115, 733-739.

3. Barbero J. L., Buesa J.M., Buitrago, G.G., Mendez, E.,Perez-Aranda, A., and Garcia, J. L.: Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Gene, 1986, 49, 69-80.

4. Klei H. E., Daumy G. O., and Kelly J. A. Purification and preliminary crystallographic studies of penicillin G acylase from Providencia rettgeri. Protein Sci., 1995, 4, 433-441.

5. Verhaert R.M. D., Riemens A. M., Laan J., Duin J., and Quax W. J. Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63, 3412-3418.

6. Ohashi II., Katsuta Y., Nagashima M., Kamei T., and Yano M.: Expression of the Arthrobacter viscosus penicillin acylase gene in Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55,351-356.

7. Chiang C. and Bennett R. E. Purification and properties of penicillin acylascs from Bacillus megaterium. J. Bacteriol., 1967, 93, 302-308.

8. Rajcndhran J., Krishnakumar V., and Gunasekaran P. Optimization of a fermentation medium for the production of penicillin G acylase from Bacillus sp. Lett. Appl. Microbiol., 2002, 35, 523-527.

9. Prieto M. A., Diaz E., and Garcia J. L. Molecular characterization of the 4-hydroxyphenylacetate catabolic pathway of Escherichia coli W: engineering a mobile aromatic degradative cluster. J. Bacteriol., 1996, 178, 111-120.

10. Oh S.-J., Kim Y.-Ch., Park Y.-W., Min S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in E.coli. Gene. 1987, 56, 87-97.

11. Bock A., Wirth R., Schmid G., Schumacher G., Lang G. and Buckel P. The penicillin acylase from E.coli ATCC11105 consists of two dissimilar subunit. FEMS Microbiol. Lett. 1983, 20, 135-139.

12. Bock A., Writh R., Schmid G., Schumacher G., Lang G. and Buckel P. The two subunits of penicillin acylase are processed from a common precursor. FEMS Microbiol. Lett. 1983, 20, 141-144.

13. Schumacher G., Sizmann D., Haug H., Buckel P. and Bock A. Penicillin acylase from E.coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acid. Res. 1986, 14, 5713-5727.

14. Sizmann D., Keilmann C. and Bock A. Primary structure requirements for the maturation in vivo of penicillin acylase from E.coli ATCC 11105. Eur. J. Biochem. 1990, 192, 143-151.

15. Lindsay C.D. and Pain R.H. The folding and solution conformation of penicillin G acylase. Eur. J. Biochem. 1990, 192, 133-141.

16. Lindsay C.D. and Pain R.H. Refolding and assembly of penicillin acylase, an enzyme composed of two polypeptide chains that results from proteolytic activation. Biochemistry. 1991, 30, 9034-9040.

17. Brannigan J. A., Dodson G., Duggleby H. J., Moody P. C., Smith J. L., Tomchick D. R., and Murzin, A.G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature, 1995,378,416-419.

18. Duggleby H. J., Tolley S. P., Hill C. P., Dodson E. J., Dodson G., and Moody P. C. Penicillin aeylase has a single-amino-acid catalytic centre. "Nature, 1995, 373, 264—268.

19. McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., Wilson K.S., Brannigan J.A. Crystal structure of penicillin aeylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism. J. Mol. Biol. 2001, 313:139-150.

20. Чилов Г.Г., Сидорова A.B. и Швядас B.K. Исследование механизма каталитического действия N-концсвых гидролаз методами квантово-химического моделирования, Биохимия (Biokhimiya) 2007, 72(5), 615-621.

21. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и A lea Iigei i es faecal is. Канд. дисс. Москва. 2000.

22. Cole M. Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escherichia coli. Nature. 1964, 203(4944), 519-520.

23. Chiang D. and Bennet R.E. Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaterium. J. Bacteriol. 1967, 93, 302-308.

24. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I. and Guranda D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1996, 799, 659-669.

25. Yiming Y., Jim J. L. Unexpected enantioselectivity and activity of penicillin aeylase in the resolution of methyl 2,2-dimethyl-l,3-dioxane-4-carboxylate. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003, 22, 55-59

26. Charles F. and Wiin J Q. Improved b-lactam acylases and their use as industrial biocatalysts. Current Opinion in Biotechnology. 2004, 15, 349-355.

27. Morilas M., Mcvey C.E.2,3, Brannigan J.A.4,Ladurner A.G.,Forney L.J.and Virden R. Mutations of penicillin aeylase residue B71 extend substrate specificity by decreasing steric constraints for substrate binding. Biochem. J. 2003, 371, 143-150.

28. Wang J.-L., Li X., Xie H.-Y., Liu B.-K., Lin X.-F. Hydrolase-catalyzed fast Henry reaction of nitroalkanes and aldehydes in organic media. Journal of Biotechnology 2010, 145, 240-243.

29. Wu W.-B., WangN., Xu J.-M., Wu Q., Lin X.-F. Penicillin G aeylase catalyzed Markovnikov addition of allopurinol to vinylester. Chem.Commun., 2005, 2348-2350

30. Wu W.-B., Xu J.-M., Wu Q., Lv D.-S., Lin X.-F. Promiscuous Acylases-Catalyzed Markovnikov Addition of N-Heterocycles to Vinyl Esters in Organic Media. Adv. Synth. Catal. 2006, 348, 487^192.

31. Wcissenburger H.W.O., Van der Hoeven M.G., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 1970, 89, 1081-1084.

32. Warburton D., Dunnil P., Lilly M.D. Conversion of benzylpenicillin to 6-aminopenicillanic acid in a batch reactor and continuous feed stirred tank reactor using immobilized penicillin amidase, Biotechnol. Bioeng. 1973, 15, 13-25.

33. Svedas V.K., 1. Yu. Galaev, Yu. A. Semiletov, G. A. Korshunova. Bioorg. Chem. 1983, 9, 1139-1141.

34. Waldmann H., Sebastian D. Enzymic Protecting Group Techniques. Chem. Rev. 1994, 94, 911-937; Waldmann H., Sebastian D. Enzymic Protecting Group Techniques. Chem. Rev., 2001, 101 (11), 33673396.

35. Soloshonok V.A., V. K. Svedas, V.P. Kukhar, I.Yu. Galaev, E.V. Kozlova, N.Yu. Svistunova. Bioorg. Khim. 1993, 19(4), 478-483.

36. Soloshonok V.A., A.G. Kirilenko, N.A. Fokina, I.P. Shinina, S.V. Galushko, V.P. Kukhar, V.K. Svedas, E.V. Kozlova. Tetrahedron Asymmetiy 1994, 5(6), 1119-1126.

37. Soloshonok V.A., N.A. Fokina, A.V. Kubyakova, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, A.E. Sorochinsky, V.P. Kukhar, V.K. Svedas, M.V. Savchenko. Tetrahedron Asymmetry 1995, 6(7), 1601-1610.

38. Didziapetris R., Drabnig В., Schellenberger V., Jakubke I.-D., Svedas V. Penicillin acylase-catalyzdc protection and deprotection of amino groups as a promosing approach in enzymatic peptide synthesis. FEBS 1991,287,31-33.

39. Svedas V.K., Beltser A.I. Totally Enzymatic Synthesis of Peptides: Penicillin Acylase-Catalyzed Protection and Deprotection of Amino Groups as Important Building Blocks of This Strategy. Annals of the New York Academy of Sciences 1998, 864, 524-527.

40. Brtnik F, Barth T, Jost К. Use of phenylacetyl group for protection of the lysine N-epsilon-amino group in synthesis of peptides. Collect. Czech. Chem. Commun. 1981; 46: 1983-1989.

41. Wang Q.C., Fei J., Cui D.F., Zhu S.G., Xu L.G. Application of an immobilized penicillin acylase to the deprotection ofN-phenylacetyl insulin. Biopolymers 1986, 25, 109-114.

42. Zakov L., Zyka D., Jezek J., Hanclova I., Sanda M., Brzozowski A.M., Acek J.I. The use of Fmoc-Lys(Pac)-OH and penicillin G acylase in the preparation of novel semisynthetic insulin analogs. J. Pept. Sei. 2007, 13, 334-341.

43. Строганов O.B. Изучение субстратной специфичности пенициллинацилазы методами молекулярного моделирования. Канд. дисс. Москва. 2007.

44. Baldaro E., Faiardi D., Fuganti C., Grasselli P., Lazzarini A. Phenylacetyloximethylene: A Carboxyl Protecting Group Removanle with Immobilized Penicillin Acylase, Useful in Benzyl Penicillin Chemistry. Tetrahedron Letters, 1988, 29, 4623-4624.

45. Sagi A., Segal E., Satchi-Fainaro R., Shabat D. Remarkable drug-release enhancement with an elimination-based AB3 self-immolative dendritic amplifier. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2007, 15, 3720-3727.

46. Cole M. Factors affecting the synthesis of ampicillin and hydroxypenicillins by cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115, 757-764.

47. Anisimova V. V., Filippova I. Y., Lysogorskaya E. N., Oksenoit E. S., Kolobanova S. V., Stepanov V. M. Int. J. Proteinase-catalyzed peptide synthesis in concentrated solutions of urea and other denaturing agents. Pept. Protein Res. 1996, 47, 28.

48. Alkema W. B. L., Dijkhuis A., De Vries E., and Janssen D. В.: The role of hydrophobic active-site residues in substratespecificity and acyl transfer activity of penicillin acylase.Eur. J. Biochem., 2002, 269, 2093-2100.

49. Alkema W. B. L., Prins A.K., De Vries E., and Janssen D. B. Role of Argl45 and Arg263 in the active site ofpenicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 2002, 365, 303-309.

50. Ospina S., Barzaua E., Ramirez O.T., Lbpez A. Munguia Effect of pH in the synthesis of ampicillin by penicillin acylase. Enzyme Microb. Technol., 1996, 19, 465.

51. Svedas V.K., Margolin A.L., Borisov I.L. and Berezin I.V. Kinetics of the enzymatic synthesis of benzylpenicillin. Enzyme Microb. Technol. 1980, 2, 313-317.

52. Svedas V.K., Margolin A.L. and Berezin I.V. Enzymatic synthesis of ß-lactam antibiotics: a thermodynamic background. Enzyme Microb. Technol. 1980, 2, 138-144.

53. Березин И.В., Клесов A.A., Марголин А.Л., Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.К. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: pH-зависимости константы равновесия ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(6), 519-523.

54. Марголин А.Л., Швядас В.-Ю.К., Ныс П.С., Кольцова Э.В., Савицкая Е.М., Березин И.В. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: pH-зависимость константы равновесия ферментативного гидролиза ампициллина. Антибиотики. 1978, 2, 114-118.

55. Швядас В.-Ю.К., Марголин А.Л., Березин И.В. Термодинамические особенности ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков. ДАН СССР. 1979, 248(2), 479-481.

56. Березин, И.В., Марголин, A.J1., Швядас, В.К., Ферментативный синтез антибиотиков. Исследование реакции гидролиза-синтеза цефапотина, катализируемой пенициллинамидазой, Докл. АН СССР, 1977, 235, 961-964.

57. Семенов, А.Н. Мартинек, К., Швядас, В.К., Марголин, А.Л, Березин, И.В, Ферментативный синтез бензилпенициллина в двухфазной водноорганической системе, Докл. АН СССР, 1981, 258(5), 1124-1126.

58. Fernandez-Lafuente R., Rossel С. М., Guisan J. М., Enzyme reaction engineering: synthesis of antibiotics catalysed by penicillin G acylase in the presence of organic cosolvents, Enzyme Microb. Technol., 1991, 13,898-905.

59. Fernandez-Lafuente R., Alvaro G., Blanco R. M., and Guisan J. M., Equilibrium controlled synthesis of cephalothin in cosolvent water systems by stabilized penicillin G acylase, Appl. Biochem. Biotechnol., 1991,27, 277-290.

60. Fernandez-Lafuente R., Rossel С. M., Piatkowska В., and Guisan J. M. Synthesis of antibiotics (cephaloglycin) catalysed by penicillin G acylase: evaluation and optimization of different synthetic approaches, Enzyme Microb. Technol., 1996, 19, 9-14.

61. Topgi R.S., Ng J.S., Landis В., Wang P., Behling J.R.Use of Enzyme Penicillin Acylase in Selective Amidation/Amide Hydrolysis to Resolve Ethyl 3-amino-4-pentynoate Isomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7, 2221-2229.

62. Kuntz I.D. in: Proteins at Low Temperatures, Advances in Chemistry Series, No. 180, O.Fennema, Ed., 27-33, ACS, Washigton 1979.

63. Hansler M., Jakubke H.-D. Nonconventional Protease Catalysis in Frozen Aqueous Solutions. J. of Peptide Science, 1996, 2, 279-289.

64. Kidd R.D., Sears P., Huang D.-H., White K., Wong C.-H., Farber G. K. Protein Sci. Directed evolution of Pseudomonas aeruginosa lipase for improved amide-hydrolyzing activity. 1999, 8, 410.

65. Mozhaev V. V., Khmelnitsky Y. L., Sergeeva M. V., Belova A.B., Klyachko N. L., Lcvashov A. V. Eur. J. Biochem. Catalytic activity and denaturation of enzymes in water/organic cosolvent mixtures. 1989, 184,597-602.

66. Martinek K., Semenov A. N., Beresin A. N. Dokl. Akad.Nauk, SSSR 1980, 254, 121.

67. Kuhl P., Konnecke A., Doring G., Daumer H., Jakubke H.- D. Enzyme-catalyzed peptide synthesis in biphasic aqueous-organic systems. Tetrahedron Lett 1980, 21, 893.

68. Wubbolts M. G., Favre-Bulle O., Withhold B. Biosynthesis of synthons in two-liquid-phase media. Biotechnol.Bioeng. 1996, 52, 301.

69. Khmelnitsky Y. L., Levashov A. V., Klyachko N. L., Martinek K. Engineering biocatalytic systems in organic media with low water content. Enzyme Microb. Technol. 1988, 10, 710.

70. Barbaric S., Luisi P. L. Micellar solubilization of biopolymers in organic solvents. Activity and conformation of .alpha.-chymotrypsin in isooctane-AOT reverse micelles. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 4239.

71. Luethi P., Luisi P. L. Enzymic synthesis of hydrocarbon-soluble peptides with reverse micelles J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 7285.

72. Menger F. M., Yamada K. Enzyme catalysis in water pools./. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 6731.152

73. Jorba X., Clapes P., Xaus N., Clavet S., Torres J. L., Valencia G.; Mata. Optimization and kinetic studies of the enzymatic synthesis of Ac-Phe-Leu-NH2 in reversed micelles J. Enzyme Microb. Techno!. 1992, 14, 117.

74. Serralheiro M. L. M., Prazeres D. M. F., Cabrai J. M. S. Continuous production and simultaneous precipitation of a dipeptide in a reversed micellar membrane reactor. Enzyme Microb. Technol. 1999, 24, 507.

75. Vinogradov A.A., Kudryashova E.V., Levashov A.V., van Dongen W.M. Solubilization and refolding of inclusion body proteins in reverse micelles. Anal Biocliem. 2003, 320, 234.

76. Clapes P., Espelt L., Navarro M. A., Solans C. Highly concentrated water-in-oil emulsions as novel reaction media for protease-catalysed kinetically controlled peptide synthesis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2001,2, 1394.

77. Wescott C. R., Klibanov A. M. Biochim. The solvent dependence of enzyme specificity. Biophys. Acta 1994, 1206, 1.

78. Carrea G., Ottolina G., Riva S. Trends Biotechnol. Role of solvents in the control of enzyme selectivity in organic media. 1995, 13, 63.

79. Ebert C., Gardossi L., Linda P., Vesnaver R., Bosco M. Influence of organic solvents on enzyme chemoselectivity and their role in enzyme-substrate interaction. Tetrahedron 1996, 52, 4867.

80. Rubio E., Fernandez-Mayorales A., Klibanov A.M., Effect of the solvent on enzyme regioselectivity JACS 1991, 113,695-696.

81. Ke T. Wescott C. R. Klibanov A. M. Prediction of the Solvent Dependence of Enzymatic Prochiral Selectivity by Means of Structure-Based Thermodynamic Calculations J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3366.

82. Zaks A., Klibanov A.M. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82,3192-3196.99 van Rantwijk F., Lau R.M., Sheldon R.A. Biocatalytic transformations in ionic liquids. Trends Biotechnol. 2003,21, 131-138.

83. Yang Z, Pan WB: Ionic liquids: green solvents for nonaqueous biocatalysis. Enzyme Microb. Technol. 2005, 37, 19-28.

84. Tao G.; He L.; Liu W., Xu L.; Xiong W.; Wang T.; Kou Y. Preparation, characterization and application of amino acid-based green ionic liquids. Green Chem. 2006, 8, 639.

85. Ito Y., Sugimura N., Kwon O. H., Imanishi Y. Enzyme modification by polymers with solublities that change in response to photoirradiation in organic media. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 73.

86. O'Brien A.M., Smith A.T., Fagain C.O.: Effects of phthalic anhydride modification on horseradish peroxidase stability and activity. Biotechnol Bioeng 2003, 81, 233-240.

87. Song H.Y., Yao J.H., Liu J.Z., Zhou S.J., Xiong Y.H., Ji L.N. Effects of phthalic anhydride modification on horseradish peroxidase stability and structure. Enzyme Microb Technol 2005, 36:605611.

88. Okahata Y., Mori T. Lipid-coated enzymes as efficient catalysts in organic media. Trends Biotechnol. 1997,15,50.

89. Okazaki S., Kamiya N., Goto M. How Is Enzymatic Selectivity of Menthol Esterification Catalyzed by Surfactant-Coated Lipase Determined in Organic Media. Biotechnol. Prog. 1997, 13, 488.

90. Secundo F., Spadaro S., Carrea G. Optimization of Pseudomonas cepacia lipase preparations for catalysis in organic solvents. Biotechnol. Bioeng. 1999, 62, 554.

91. Lindsay JP, Clark DS, Dordick JS: Combinatorial formulation of biocatalyst preparations for increased activity in organic solvents: salt activation of penicillin amidase. Biotechnol Bioeng 2004, 85, 553-560.

92. Anisimova V. V., Filippova I. Y., Lysogorskaya E. N., Oksenoit E. S., Kolobanova S. V., Stepanov V. M. Int. J. Proteinase-catalyzed peptide synthesis in concentrated solutions of urea and other denaturing agents. Pept. Protein Res. 1996, 47, 28.

93. Unen D.-J., Engbersen F. J., Reinhoudt D. N. Sol-gel immobilization of serine proteases for application in organic solvents Biotechnol. Bioeng. 2001, 75, 154.

94. Wahlgren M., ArnebrantT. Protein adsorption to solid surfaces. Trends Biotechnol. 1991, 9, 201.

95. Wehtje E., Adlerreutz P., Mattiasson B. Improved activity retention of enzymes deposited on solid supports Biotechnol. Bioeng. 1993, 41, 171.

96. Kise H., Hayakama A., Noritomi H. J. Biotechnol. Protease-catalyzed synthetic reactions and immobilization-activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents. 1990, 14, 239.

97. Kuptsova S., Markvicheva E., Kochetkov K., Beleokon Y., Rumish L., Zubov V. Biocatal. Biotrans. 2000, 18, 133.

98. Huang W., Wang J., Bhattacharyya D., Bachas,L. G. Improving the Activity of Immobilized Subtilisin by Site-Specific Attachment to Surfaces. Anal. Chem. 1997, 69, 4601.

99. Beck-Piotraschke K., Jakubke H.-D. Protease-catalysed synthesis of peptides containing histidine and lysine. Tetrahedron: Asymm. 1998, 9, 1505.

100. Gill I., Lopez-Fandino R., Vulfson E. Enzymic Oligopeptide Synthesis Using a Minimal Protection Strategy: Sequential Assembly of a Growing Oligopeptide Chain J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 6175.

101. Clapes, P.; Torres, J.-L.; Adlercreutz, P. Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 245.

102. Jackson, D. Y.; Burnier, J. P.; Wells, J. A. Enzymic Cyclization of Linear Peptide Esters Using Subtiligase J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 819.

103. Fernandez M. M., Margot A. O., Falender C. A., Blanch H.W., Clark D. S. Enzymatic synthesis of peptides containing unnatural amino acids. Enzyme Microb. Technol. 1995, 17, 964.

104. Krix G., Eichhorn U., Jakubke H.-D., Kula, M.-R. Protease-catalyzed synthesis of new hydrophobic dipeptides containing non-proteinogenic amino acids. Enzyme Microb. Technol. 1997, 21, 252.

105. Clapes P., Moran C., Infante M. R. Enzymatic synthesis of arginine-based cationic surfactants. Biotechnol. Bioeng. 1999, 63, 333.

106. Carea G., Danieli B., Palmisano G., Riva S., Santagostino M. Lipase-mediated resolution of 2-cyclohexen-l-ols as chiral buildingblocks en route to eburnane alkaloids. Tetrahedronc: Asymmetry 1992,3,775-784.

107. Inagaki M., Hiratake J., Nishioka Т., Oda J., One-pot synthesis of optically active cyanohydrin acetates from aldehydes via lipase-catalyzed kinetic resolution coupled with in situ formation and racemization of cyanohydrins. JOC 1992, 57, 5643-5649.

108. Brand S., Jones M.F., Rayner C.M. The first examples of dynamic kinetic resolution by enantioselective acetylation of hemithioacetals: An efficient synthesis of homochiral a-Acetoxysulfides. Tetrahedrone lelt. 1995,36, 8493-8496.

109. Van Rantwijk F. and Sheldon R.A. Enantioselective acylation of chiral amines catalysed by serine hydrolases. Tetrahedron 2004, 60, 501-519.

110. Maugard Т., Remaud-Simeon M., Monsan P. Kinetic study of chemoselective acylation of amino-alditol by immobilized lipase in organic solvent:effect of substrate ionization. Biochimica et Biophysica Acta 1998, 1387, 177-183.

111. Therisodt M. and Klibanov A.M. Facile Enzymatic Preparation of Monoacylated Sugars in Pyridine. J. Am. Chem. Soc., 108, 1986, 5638-5640.

112. Xiao-fengLi & Min-huaZong & Guang-leiZhao. Highly regioselective enzymatic synthesis of 5'-0-stearate of l-(3-D-arabinofuranosylcytosine in binary organic solvent mixtures. Appl Microbiol Biotechnol (2010) 88: 57-63.

113. Chen X.-Y., Zong M.-H., Lou W.-Y., Wu H. Highly Efficient Regioselective Synthesis of 5'-0-lauroyl-5-azacytidine Catalyzed by Candida antarctica Lipase B. Appl Biochem Biotechnol 2008, 151: 21-28.

114. Quintana P.G., Baldessari A. Lipase-catalyzed regioselective preparation of fatty acid esters of hydrocortisone. Steroids 2009, 74, 1007-1014.

115. Zhang D.-HL, Bai S., Dong X.-Y., Sun Y. Optimization of Lipase-Catalyzed Regioselective Acylation of Pyridoxine (VitaminB6). J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4526-4531.

116. Oger C., Marton Z., Brinkmann Y., Bultel-Ponce V., Durand Т., Graber M., Galano J.-M. Lipase-Catalyzed Regioselective Monoacetylation of Unsymmetrical 1,5-Primary Diols. J. Org. Chem. 2010, 75, 1892-1897.

117. Amblard M., Fehrentz J.-A., Martinez J., Subra G. Fundamentals of Modern Peptide Synthesis. Methods in Molecular Biology 2005, 298, 3-24.

118. Isidro-Llobet A., Alvarez M., Albericio F. Amino Acid-Protecting Groups. Chem. Rev. 2009, 109, 2455-2504.

119. France S., Guerin D.J., Miller S.J., Lectka Т. Nucleophilic Chiral Amines as Catalysts in Asymmetric Synthesis. Chemical Reviews, 2003, 103, 8, 2985-3012.

120. Gregory C. Fu Asymmetric Catalysis with "Planar-Chiral" Derivatives of 4-(Dimethylamino)-pyridine. Acc. Chem. Res. 2004, 37, 542-547.

121. Препаративная органическая химия. Москва, Госхимиздат, стр. 304, 305.

122. R.F. Borch, M.D. Bernstein, H.D. Durst. The Cyanohydridoborate anione as a selective reducing agent. JACS 1971, 93(12), 2897-2904.

123. Юшко М.И. Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в гомогенных, гетерогенных и твердофазных системах. Канд. дисс. Москва. 2000.

124. Gololobov М. Yu., Borisov L., Belikov V. M., Svedas V. К. Acyl Group Transfer by Proteases Forming Acyl-Enzyme Intermediate: Kinetic Model Analysis. Biotechnology and Bioengineering, 1988, 32, 866-872.

125. Gololobov M.Yu., Borisov I.L., Svedas V.K. Acyl group transfer by proteases forming an acylenzyme intermediate: kinetic model analysis (including hydrolysis of acylcnzyme-nucleophile complex). J. Theor. Biol. 1989, 140, 193-204.

126. Svedas V., Guranda D., Van Langen L., Van Rantwijk F., Sheldon R. Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett., 1997, 417, 414-418.

127. De Vries N, De Flora S. N-Acetyl-L-Cysteine. J Cell Biochem 1993;17F, 270-277.

128. Buck R.H., Krummen K. Resolution of amino acid enantiomers by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatisation with a chiral reagent. J. Chromatogr., 1984, 315, 279.

129. Gurentsova O.I., Savchenko M.V., Sumbatyan N.V., Korshunova G.A. and Svedas V.K. Detection of enantiomers of nucleoamino acids by HPLC with premodification with o-phthalic aldehyde. Bioorg. Khim., 1997,23, 877.

130. Simons S.S., Johnson D.F. Reaction of o-phthalaldehyde and thiols with primaiy amines: formation of l-alkyl(and aryl)thio-2-alkylisoindoles J. Org. Chem. 1978, 43, 2886.

131. Швядас В.-Ю. К., Галаев И. Ю., Березин И. В. Взаимодействие аминокислот с о-фталевым альдегидом: спектрофотометрический метод количественного определения продукта реакции. Биоорганическая химия 1978,4, 1.

132. Svedas V.-J. К., Galaev I.J., Borisov I.L., Berezin I.V. The Interaction of Amino Acids with o-Phthaldialdehyde: A Kinetic Study and Spectrophotometric Assay of the Reaction Product. Anal. Biochem. 1980, 101, 188-195.

133. Aswad D.W., Determination of D- and L-aspartate in amino acid mixtures by high-performance liquid chromatography after derivatization with a chiral adduct of o-phthaldialdehyde, Anal. Biochem. 1984, 137,405-409.

134. Buck R.H., Krummen K., Resolution of amino acid enantiomers by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatisation with a chiral reagent, J. Chromatogr. 1984, 315,279-285.

135. Bruckner H., Wuttner R., Godel H., Automated enantioseparation of amino acids by derivatization with o-phthaldialdehyde and N-acylated cysteines, J. Chromatogr. 1989, 476, 73-82.

136. Jegorov A., Trnka Т., Stuchlik J., High-performance liquid chromatographic detection of enantiomeric amino alcohols after derivatization with o-phthaldialdehyde and various thiosugars, J. Chromatogr. 1991,558,311-317.

137. Duchateau A.L.L., Boesten J.M.M., Coussens B.B. High-Performancc liquid chromatographic separation and molecular modelling of diastereomeric isoindole derivatives of amino compounds, Chirality 1995, 7, 547-555.

138. Jacobs W.A., Leburg M.W., Madaj E.J. Stability of o-phthalaldehyde-derived isoindoles. Anal. Biochem. 1986, 156,334-340.

139. Lindner W., Indirect Separation of Enantiomers by Liquid Chromatography, Eds. M. Zief, L.J. Crane. Chromatographic Chiral Separations. Chromatographic Science Series. V. 40, New York: Marcel Dekker. 1988, 116.

140. Desai D.M., Gal J., Enantiospecific drug analysis via the ortho-phthalaldehyde/homochiral thiol derivatization method, J. Chromatogr. 1993, 629, 215-228.

141. Florancc J., Galdes A., Konteatis Z., Kosarych Z., Langer K., High-performance liquid chromatographic separation of peptide and amino acid stereoisomers, J. Chromatogr. 1987, 414, 313322.

142. Brent A. Neuschwander-Tetri, F. Joseph Roll. Glutathione Measurement by Hihg-Performance Liquid Chromatography Separation and Fluorometric Detection of the Glutathione-Orthophtalaldehyde Adduct. Analytical Biochemistry 1989, 179, 236-241.

143. Швядас В.-Ю. К., Галаев И. Ю., Березин И. В. Спектрофотометрический метод количественного определения эфиров аминокислот в смеси, содержащей свободные аминокислоты. Биоорганическая химия 1978,4, 1.

144. Gentilucci L, Tolomelli A, Squassabia F. Peptides and peptidomimetics in medicine, surgery and biotechnology. Curr Med Chem. 2006;13(20):2449-66

145. A.Maestro, C.Astorga, V.Gotor. Enzymatic resolution of (±)-trans-2-aminocyclohexanol and (±)-trans-2-aminocyclopentanol. Tetrahedron: Asymmetry, 1997, 8, 18, 3153-3159.

146. Orsat В., Alper P.B., Moree W.,Mak C.-P., Wong С. H. Homocarbonates as Substrates for the Enantioselective Enzymatic Protection of Amines. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 712 713.

147. Химюк А.Я. Ацилирование аминосоединений в водной среде под действием пенициллинацилаз. Канд. дисс. Москва. 2005.

148. Laumen К., Kittelman М., Ghisalba О. Chemo-enzymatic approaches for creation of novel chiral building blocks and reagents for pharmaceutical applications. J. Mol. Cat.: Enzymatic 19-20 (2002) 5556.

149. Patel, R.N. Biocatalysis: Synthesis of Chiral Intermediates for Pharmaceuticals. Curr. Org. Chem. 2006, 10, 1289-1321.

150. Faber, K.; Kroutil, W. New enzymes for biotransformations Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, 9, 181187.

151. Pesti J.A., Di Cosimo R. Recent progress in enzymatic resolution and desymmetrization of pharmaceuticals and their intermediates. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 2003, 6, 884-901.