ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА, ХИМИИ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГГИББЕРЕЛЛИНОВ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Серебряков, Эдуард Прокофьевич
АВТОР
|
||||
|
доктора химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1979
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
АКАДИШ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОРГАНИЧВСКОЙ ш вменк Н.Д.ЗШМСК0Г0
изслвдование еиосштеза, химии и физиолотивской активности 1жбервллиное
02.00.10 - Биоорганическая хяшш,
химия природных и фиэиологичэоки активных веществ
'1
На правах рукописи
СЕРШШЗВ Эдуард Прокофьева
Автореферат'
диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
*
Москва - 1979
\
ї&бота выполнена в Институте органической хиьши имени . Н. Д. Зелинского АН СССР. -
' Официальные оппонента:
доктор химических наук, профессор Н.Н.СУВОРОВ, доктор химических наук, профессор Е.Д.КАВЕРЗНЕВА, доктор химических наук М. Я. ЮШИЙСКИЙ
Ведущее предприятие - Новосибирский институт органической химии СО АН СССР. ^ - "
Запита состоится " № " 1980 г. в 10 час.'
на заседании Специализированного совета ДС02.62.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук при №ституте органической химии ш. Н.Д, Зелкнского АН СССР, Москва, ІІ79ІЗ, Ленинский проспект, 47.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ АН СССР.
I . . " . .; = -
Автореферат разослан " ^ * _ УЗ&О г.
Ученый с екретарь Совета кандидат химических наук
Г. И. ЛЕВИ
ОЩАЯ Х4РАКГЕИСТИКД. РАБОТЫ
Актуальность проблемы» Изучение ростовых гормонов тесно связано с проблемой химической регуляция жизнедеятельности растений в имеет важное значение для современной сельскохозяйственной ватки. Получение, превращения я механизм действия фнтогормонов - это вопроса, исследование которых необходимо для разработки химических основ повышения продуктивности культурных растений. •
Тйббереллина являются нормальными продуктами жизнедеятельности растений, окавывапцнии воздействие на их рост я резню|е. Применение гиббереллинов в растениеводстве позволяет значительно повышать урожай бессемянных сортов винограда, повышать стойкость плодов у цитрусовых культур, ускорять прорастание клубней картофеля, увеличивать выгод волокна конопли. В ряде зарубежных стран гнббереллнны используется дяя ускорения образования солода, что дает значительную вкономию в пивоваренном производстве. Промышленное получение гиббереллинов дня ,нужд народного хозяйства в СССР и за рубежом осуществляется только ■ микробиологическим путем щи глубинном культивировании грввй" тив&пиш шоп111£огям* Стоимость выпускаемого в СССР препарата "Гвббереллнн" постепенно снижается (в 1966 г. - 8200, в 1979 г. - 2400 руб. за"1-кг), однако все еще довольно высока дня его широкого применения в сельскохозяйственной производстве. Поэтому актуальны исследования по оптимизации микробиологического синтеза гибб ереллинов.
Известно, что ростостимулирухщая активность индивидуальных гиббереллинов сильно зависит как от их строения, так я от вида обрабатываемых растений. Углубление знаний о зависимости между химическим строением гиббереллинов и их действием на различные
растения способствовало бы разработке оптимальных рекомендации по применению гиббереллинов в растениеводстве. 1фоме того, эта зависимость тесно связана с проблемами передвижения, рецепции и метаболических превращений гиббереллинов в растениях. Шяснение указанной зависимости способствует лучшему пониманию общих закономерностей гормональной регуляции у растений и потому является актуальной задачей.
Задачи исследования. Ввиду практической в теоретической важности комплексного изучения химии габбереллинов настоящая работа посвящена (I) выяснению химических аспектов их микробиологического производства и (2) поиску зависимости между строением гиббереллинов и их физиологической активностью.
Первая задача заключалась в изучении влияния условий микробиологического синтеза гиббереллинов на общий метаболизм дитерпе-
НОНДОВ В культуре F.moniIiforme. ТаКОЙ ПОДХОД ПОЗВОЛЯВ? ВЫЯСНИТЬ
химические причины стимуляции биосинтеза гиббереллинов и способствует подбору оптимальных условий их микробиологического производства* Поскольку в культуре гриба наряду с гиббередлинами образуется также другие родственные им, но физиологически неактивные дитерпеноиди» то оптимизация биосинтеза сводится к отыскана» условий, при которых общий метаболизм дитерпеноидов интенсифицируется, а доля неактивного "балласта* сокращается.
Вторая задача заключалась в изучении молекулярных основ рос-тостимулирупцей активности гиббереллинов и решалась путем целена-пращенного синтеза и биотестнрования модельных соединений, выбранных на основании гипотезы о взаимодействии гиббереллинов со специфическими рецепторами в растениях. Предполагалось, что результаты биотестирования синтезированных моделей помогут выяснить
зависимость физиологической активности от структур! молекулы.
Самостоятельную задачу. представляла разработка эффективных физико-химических методов установления структура н стереохимии гиббереллинов и родственных им дитерпеноидов, без которой успешное решение поставленных вше задач было невозможно. Основное внимание при этом было уделено масс-спектрометрическоыу методу, допщему ценную информацию о структуре и требупяему лишь малое количество вещества. Отдельную химическую задачу представляла также разработка синтетических методов, позволяицих. проводить ре— гиоселективную модифакагщю сложной и лабильной гиббереллиновой молекулы в мягких условиях, в связи с чем подробно изучены фотохимические превращения габбереллднов. -
Нстчная новизна, (I). Впервые проведено сравнительное изучение влияния условий культивирования Т.пеМЩошю (природы штамма, состава питательной среды, данамырж ферментации) на общий метаболизм дитерпеноадов в культуре гриба, установлен конкурент ней характер двух направлений этого метаболизма и показано, что интенсификация биосинтеза гиббереллинов сопряжена с относительным угнетением биосинтеза других датерленоидов. (2). Надвинута гипотеза об • определяющей роли контакта Сгиббереллинов со специфическими рецепторами растений в проявлении физиологической активности и получены экспериментальные данные, согласующееся с этой гипотезой. Для выяснения зависимости активности гиббереллинов от их строения впервые предложен подход, замечающийся в направленном синтезе специально выбранных модельных соединений. (3). Впервые для изучения структуры гиббереллинов и родственных ' им веществ использован метод осколочной масс-спектрометрии и детально изучены закономерности фрапдентации;- в настоящее время этот метод (й сочетании с 1X1) в мировой научной практику стал
основным средством иденпфжадш габбереллннов в различных при— родных источниках. (4). Предложены и разработаны фотохимические методы синтеза как средство избирательной модификации гибберел-линов, Фотохимическим путем синтезированы ранее неизвестные и недоступные иянми способами фенольше аналоги габбереллинов. Выявлено влияние конформационной жесткости на характер фотохимнчес-jm-f превращений шестичленних цикжчесшпс кетонов. ■ С5). Иійледова-на и разработана неизвестная ранее реакция окислительной лакто-низации гиббереллинов и показан ее общий характер; вперше изу^ чены гомогенно-каталитические реащии гиббереллшов в присутствии соединения палладия. (6). Предложен способ определения конфигурации заместит ел ей путем корреляции данных спектров ШР и спектров кругового дихроизма. (7). Впервые проведено подробное изучение липидаого состава иицелиальшх клеток У.люоНАГогте и установлено строение семи ранее неизвестных метаболитов гриба.
п^дитчрюс^оа значение. Закономерности, установленные при. изучении зависимости ({изиологической активности габбереллинов от их строения, ииевг важное вначекие дня понимания иолекулярных основ гормональной регуляции у растений, данные по метаболизму дитерпеноидов в культуре г .moni llf ora® даит основу для биохимически рационального подбора оптимальных условий микробиологического производства гиббереляивов и частично использованы при отработке его технологического режима. Шроко вошедший в исследовательскую практику метод масс-с пектрометрического анализа гиббереллшов способствует успешному развитию биохимии растений. Научпое значение работ по этим вопросам отражено в отечественных и зарубежных монографиях и обзорах. Для тонкого органического синтеза представляет практическую ценность изученный в дассерта-
ш способ аадиты карбоксильной группы в виде фотсяабшсыщх р-метоксифенациловых эфиров.
Апробация -работы. По материалам диссертации сделают доклады с публикацией тезисов на УП (йгаДЭТО) и ЭТА (Дели,1972) Международных симпозиумах ИШАК по химии природных соединений, на I Всесоюзном совещании по фотохимическому синтезу (Москва,1972), на Международном симпозиуме по биохимии и химии регуляторов роста растений (Коттбус С1ДР),1974>, на УТ Международном симпозиуме по химии изопреноидов (Торунь (ПИР), 1975) и на Г Советеко^инддй-ском симпозиуме по химии природных соединений (Ереван, 1978). Материалы по первой главе диссертации, экспонировались на ВДНХ СССР в 1971 году.'
Структура работы. Диссертация состоит из введения,-трех глав и выводов и содержит 26 рисунков и 41 таблицу. В главе I рассматривается биосинтез гиббереллинов в культуре топ! иг опое. Глава II посвящена химическим превращениям гиббереллинов и поиску связи между их строением и физиологической активностью. В главе Ш приводятся данные по масс-спектрометрии гибберелшнов и родственных им дятерпеноидов. В каждой главе содержится соответствующий литературный обзор, обсуждение результатов и экспериментальная часть. Список цитируемой литературы содержит 435 названий. Основной материал диссертации изложен в 34 научных работах автора, список которых приводится в конце автореферата.
I. ИЗУЧЕНИЕ БИОСИНТЕЗА ГИЕБЕРЕШШНОВ В КУЛЬТУРЕ ПИБА ГОЗАЙИШ МОШЫРОЕИВ
До начала наших исследований не имелось данных о влиянии условий культивирования гриба-продуцента на общий метаболизм
синтезируемых им дитерпеноидов. Между тем, поскольку гибберелли-ны и физиологически неактивные датерпеноиды гриба образуются из общих предшественников. то в стимуляции или угнетении отдельных стадий в общем метаболизме дитерпеноидов могли быть найдены дополнительные возможности повышения выхода целевого продукта -гиббереллина А3 (ГА3). Важную задачу представляло изучение влия-ши природы штамма и условий ферментации на выход и композицию образующейся смеси гиббереллинов. Ввиду гидролитической неустойчивости ГА3 црактическое значение тлеет такте вопрос об образовании из него неактивных артефактов, эагрязняпцих целевой-продукт. Для биохимической характеристики гриба-продуцента были подробно изучены не исследовавшиеся ранее лишщные метаболиты из клеток его мицелия.
1.1. Влияние условий культивирования Р.топ111£огЕое на метаболизм дитерпеноидов
Для анализа гиббереллинов и других дитерпеноидов,полученных ври глубинном культивировании г.шоиНИ'огие, культуралькые фильтраты экстрагировали бутанолом при рК 2,5, кислые продукты извлекали из экстракта 5%-ншл раствором КНС03 и бутанольный слой азеотропно упаривали до постоянного веса сухого остатка {"нейтральная фракция"). Еикарбонатную вытяжку подкисляли до рН 2,5, экстрагировали этилацетатом и экстракт упаривали до постоянного веса ("кислая фракция"). Содержание метаболитов определяли по выходу хроматографически однородных веществ при колоночной хроматографии на силикагеле. йяя количественной оценки компонентов, образующих трудноразделимые смеси, дополнительно использовались поляриметрия, спектроскопия ПМР, ПК и масс-спектрометрия.
а) Влияние природы штаммаА При культивировании в стандарт-
тсс условиях идти штаммов ï .monilifo^me и качественном сравнении их по шести дитерпеноидным компонентам оказалось, что доми-нирупвдм дитерпеноидом у всех штаммов является ГАд, которому сопутствует его гидролитический артефакт изо-ГА3, (I). У штаммов ï-2, 5-6 и v-3 образуются заметные количества гибсЗереллюа А^ (ГА^) или его смеси с гиббереллином А^ (ГА4). У штаммов F-124 и Pg-7 , содержание дГ-ненасшценных гиббереллшов СА3 и Ar.) несколько понижено, В культуре F-2 содержится значительно больше нейтральных дитерпеяоидов - 13-эпи-(-)-маиоилоксида (2) и фудже-наля (3), чем у остальных штаммов. Определение суммарного веса всех экстрагируемых бутаколом метаболитов и соотношения кислых и нейтральных продуктов в культуральшсс фильтратах дало следующие результаты:
Штамм Содержание сухого , Соотношение кислой
продуцента остатка (,сумма, мг/л) и яейтр. фракций
F-2 600-650 1,3:1
F-6 950-1000 4,5:1
ï'-8 "950-1000 3,5:1
F-124 790-830 4,0:1
Pg-7 900-950 4,2:1
По этим показателям наиболее перспективными для производства ГАд оказались штампы F-6 и Pg-7. При отнесении веса выделенных из культуры F-6 хроматографинески однородных Сна сили ка-геле) фракций к объему фильтрата содержание гийбереллина Аэ<ГАд) составило 5 мг/л, смеси ГА^/ГАг, - 85-90 мг/л, а смеси ГА3, изо-ГАд (!) и гиббереялина Aj (PAj) - 650-680 мг/л после 12 суток Ориентации. По данным спектров ПМР, внутри фракций соотношение ГА^:ГАл, составило е»3:7, а соотношение ГА^:ГАз:1 (Злизко к Ï:8;I (откуда следует, что первоначально соотношение ГАд-:ГАд составляет го 1:9). Таким образом, для шс око продуктивно го штамма ï-6
характерно преобладание ¿^-ненасыщенных гиббереллинов СА3 и Ау) и самое низкое содержание нейтральных метаболитов, а снижение выхода гиббереллинов у штамма Р-2 коррелирует с усиленным образованием нейтральных дитерпеноидов 2 л 3,
ГА3 (Ни ОН) ГА1 (Х=У=ОН) изо-ГАд (I), В =0Н
ГАу (Е = Н). ГА4 (МН; У=Н) изо-ГА? [7),К = Н
ГАд (Х=У=Я)
3 СН = Н) | (И = Ш)
ПЕЮцес£е_^рментации изучалась для штамма р-6 на среде, где источниками С и N служили лиры (подсолнечное масло) и нн4И0,. Цредварительно было специально доказано, что выделенный из культуры изо-ГАд (I) не является нативным метаболитом гриба, а образуется из ГА3 иеэнзиматическим путем при рЦгоЭ; были текже выделены и идентифицированы продукты дальнейших гидролитических превращений ГА3: трйоксидакарбоиовая кислота (4), гцббереленовая кислота (5) и аллогибберовая кислота (§). Образование выделенного из кулиурального фильтрата изо-ГА^ (7) аналогично образованию I из ГАд. В ходе ферментации периодически определяли суммар-
ную концентрацию гиббереллинов (фотоколориметртчески) и рН среды, за накоплением артефактов 5 и 6 следили с помощью хроматография на бумаге, а за динамикой образования смесей ГА4+ГА^, ГА3+ГА^+1 и 4 + 5 следили по выходу хроматографичееки однородных фракций при хроматографии на силикагеле. Полученные результаты представлены в Таблице I.
Таблица I
Динамика образования 3р-окси-С ^д-гиббереллшов и артефактов гиббереялина Ад в культуре штамма р-6^'
■ ■■- — ;
Показатели |-І
Продолжительность ферментации, сутки
3 6 9 12 15 18
94 307 571 794 770 785
3,4 4,2 4,3 4,3 4,1 4 Д
33,4 42,3 42,7 42,8 40,8 41,1
+ + + + +
46 73 90 87 36' II
++ +++ . +++ +++ +++
+ ++ ++ ++ ++
30 210 390 660 670 695
+ + + + + +
+ ' + ++ ++ +++
5 20 • 26. 46 53 67
Общая концентрації^ рН среда
Содержание мицелия,г/л
Содержание кислот Л"' %
ГА^+ГА^ (суша) ГА^+ГАд
ГА^+ГАд+£ (сумма) 5 4
4 .+ £ (сумма)
(а) Питательная среда:' подсолнечное масло (8,5$) + мн^ко, (О.ЗІЇ), исходный рН 5,1. Температура 26°.
(б) Перечислены в порядке убывания % на бумаге в системе бута-нол - І.бН.ИН^ОН. Интенсивность Проявления ПЯТЄИ 70Й-НОЙ Н2304; (4-м-) - оч. сильная; (++) - средой, (+) - слабак, (±) - оч. слабая, (-^проявления нет. Цифрн соответствуют содержанию в фильтрате (мг/л).
- 10 -
Из данных таблицы следует, что лучшее время для обработки культуры и выделения гибберсллшюЕ приходится на двенадцатые сутки ферментации. Позже этого срока содержание смеси ГА3+ГА| увеличивается очень глло, тогда как содержание другого физиологически активного компонента - смеси ГАу к ГА^ - резко снижается, а балласт неактивных кислот 4 и 5 продолжает расти.
соон ноос соон 1 соон^
£ £ %
в) Влияние состава" питательной При сравнении каче-
стверного состава гиббереллипов, продуцируемых на благоприятной жировой среде с различны;.® источниками азота, наибольшее число кислых компонентов с гкббере-плиповой активностям наблю-дгигось на среде с тартратом аммония. При pH 5,5 на среде с соевой ¡.-укой образуется больше 13-дезоксигиббереллинов СГАд и ГА^+ГА^), чем при pH 3,5.
Подробная количественная оценка содержания гиббереллипов, их гидролитических артефшегов и родственных датерпеноидных кислот проводилась для трех вариантов питательных сред. Среда I (с редл іусзаО известна как о^иа из лучпкх для биосинтеза гкб-б ере лл ішов. Среда Z (жировал среда ¡.ІурошеЕа-^'бовсй) по с равно-г^к со средой I дает значительно луча^Е виход ГА^. Таи кап .r,:iüa-/j:]üi ферментации на средах Г и 2 не одинакова, то бил исследовал еле один вариант, где источник углерода-сахароза -Сил тот же, что и в среде I, но ввода-лея постепенно (среда 3). Дгеїа-.иіка іГермеатаяии на средах 2 и 3 была очень сходной. Такой віиіор сред позволял установить влияние природа субстрата и ха-
ряктера его' потребления грибом на биосинтез гиббереллинов. После стандартной обработки культурального фильтрата кислые продукты хродат ографировали на силикат еле и выделяемые вещества идентифицировали по константам и спектрам. Строение ранее не
зои ее диметилового эфира из 3. При отнесении веса индивидуальных кристаллических соединений я объему культурального фильтрата были получены данные, приводимые в Таблице 2.
1!ак видно из таблицы, наилучший средой для получения препарата ТисбереАпш" является жировая среда 2, где выход чистого ГА^ максимален (о55£ от суг.аш кислых продуктов). Наибольшее число кислых дитерпеноидов дает среда 3. На обеих углеводных средах (I и 3) повивается содержание кислот 8 и 9, относящихся к "балластному" направлению метаболизма. На среде I с исходным рН 3,5 увеличивается содержание примесей 5 и а на средах 2 и 3 (исходный рН 5,5) появляются 3-дезоксигиббе-реллины ГА^), возрастает выход ГАд и фратии ГА^/ГА^ и
ускоряется образование изо-ГА3 {£) и изо-ГА^ (7).
описанной каслоты фудаеналя (9) было доказало встречным синте-
Тяґіжптя 2
Содержание кислых дитерпеаоидоБ в кудьтуральном фильтрате штамма г-6 при трех вариантах ферментации
Вещества | Содергание в фильтрате (мг/л)
<в порядке алкши) | Среда х среда ~ Среда 3
Сумма кислот ГАэ га15
Фудженовая кислота (8) Аллогибберовая кислота (£) Франция ГА^/ГА?-в том числе: изо-ГА? (7)
га4
ГА^
Кислота йгдаеналя (9)
ГА24 Фракция ГА^ГАз в том числе;
ГА1 ГАд
иэо-ГА3 (I) Пйббереллековая кислота (5)
га42
480 1080 865
0,6 3,7 1,6
- ■ + 0,8
- - 2,1
X 6 5
п 36 26
_ 7.5 6
+ I.» 2
8,4 25 14
19 13,6 27
- 0,6
246 740 560
15 55 52
184 590 425
+ ++ -н-
19 Ю 18
+ + 18,5
- - 0,4
Среда I. Сахароза (5?), соевая мука (ВД, (нн^нро^. (0,04%), (нн^)^Од, (0,01735). Ферментация 7 суток. Исходный рн 3,5; конечный рН 2,5.
Среда 2: Подсолнечное масло (8^), кн^но^ (0,3?). Ферментация
15 суток. Исходив рН 5,5; конечный рН 4,3.
Среда 3. Сахароза + 7 х нн4но3 (0,3^). Ферментация
15 суток. Исходный рН 5,5; конечный їй 3,5.
Обозначения: (-) - Вещество не обнаружено: (+) - вещество обнаруживается методами ЕХ,1Сі яли 152; (++) - вещество присутствует в заметном количестве, но не выделено Б чистом виде-
- 13 -
г) Дивергенция Метаболизма дитешеноидов в культуре F.mo-nlHforme и эффект питательно» r-pomi. Стимуляция биосинтеза
ГА3 на среде с эмульгированными жирами может быть объяснена как физико-химическими особенностями ферментации в гетерогенной среде, так и высокой эффективностью жиров в качестве источника энергии и биогенетических изопреновых единиц. Однако из данных по влиянию природы штамма на синтез гиббереллинов следовало, что возможен еще один механизм стимуляции: снижение интенсивности биосинтеза нейтральных дитерпеноадов и "переключение" приходящегося на их долю метаболического фонда на образование гиббереллинов. Для выяснения этой возможности было иэ;,"чено образование нейтральных дитерпеновдов на трех средах. Штамм Р-6 культивировали на средах I, 2 и 3 до момента максимального накопления ГА3 и нейтральные продукты выделяли зеро-матогра^ированием на силикагеле. При сравнении трех вариантов сред выявились заметные количественные различия в содержании нейтральных дитерпеноидов (см.Таблицу 3).
На средах, где источником С является сахароза, образование кауренолидов 12 и 13 выражено сильнее, чем на жировой среде 2. Суммарная концентрация высокоокислепных датерпеноидов (3, J2, 13) на них выше, чем на среде 2. К тому же суммарная концентрация кислот 8 и 9 на них тоже выше (см. Таблицу 2). Из сравнения сходных по динамике ферментации сред 2 и 3 видно, что на среде 2 увеличение содержания ГА3 сопровождается ослаблением биосинтеза высокоокисленных датерпеноидов 3, В, 12 и ¡3. В то же Bpet.-л на средах 2 и 3 образуется больше (-)-кауре-на (10), чем на среде I. Концентрация эгапланоилоксида (2) всюду одинаково низка.
Сходная картина выявилась при сравнении содержания нейт-
ральных дитерпеноидов в смолах - отходах промышленного производства гиббереллинов у штамма Ге-7» культиванного на среде I и на среде с каиалотовым жиром и КШ4И0^ (аналог среды 2).
Таблица 3
Содержание гиббереллинов и нейтральных днгерпеноидов в нультуре штамма у-в на трех питательных средах
| Содержание в культуральном Метаболиты I фильтрате к кончу опыта (глг/л)
, Среда I Среда 2 Среда 3
Еиббереллины (сумма) 400 790 700
(-)-Каур-16-ен (10) 2-3 12 20
Эпиманоилоксид (2) 1-2 2 1-2
(-)-Кауран-16оС.-ол (Ц) - 2 3
7р-Оксикауренолид (12) 1-2 - 1-2
18-Диоксикауренолчд (13) 3 0,5 30-32
Фудженаль (3) 20 16-17 0-10
Состав сред:см. Таблицу 2. Продолжительность ферментации на среде 1-7 суток* на среде 2-12 суток, на среде 3-15 суток, Суммарное образование гиббереллинов определено фотоколо-раметрически с реактивом Фолша-Чиокальто.
Полученные результаты можно интерпретировать с помощью приводимой ниже схемы метаболизма дитерпеноидов в культуре F.moniliforme (см.Схему I), содержащей несколько точек разветвления метаболического потока. Условия ферментации {осмотическое давление, pfí, р02, скорость усвоения субстрата и т.д.) могут влиять на распределение потока в этйх точках. Первой точкой разветвления является циклизация геранил-гераншпщро-фосфата в каурен (10) или в эпиманоилоксид (2). Среды с посте-
пенно усваиваемым субстрат и,: (среда 2 и 3) способствуют смещения метаболизма в сторону образования тетрациклической структуры. Второй точкой разветвления является образование С^д-гиб-береллинов, В-секо-кислоты |и кауренолида 12 из общего предшественника - (-)-каур-16-ен-19-овоЙ кислоты (14). На углеводных средах I и 3 доля метаболического потока, направленного на биосинтез гиббереллинов, меньше, чем на жировых.
Схема Г
......он
С 2р-Г11б 6 ереллшгы £
С2д-Гиббер еялины
- 16 -
Подтверждение этому было получено в опытах по включению радиоактивной метки иэ [эй|-каурена в ГАд и в даоксикауренолид 13 при культивировании штамма Р-б на жировой среде 2 и углеводной среде 3. Меченый по методу йиьцбаха каурен вносили в : культуру в момент исчерпания источника азота (96 ч ферментации), инкубацию продолжали до максимума накопления гибберелли-нов в культуральном фильтрате и после обычной обработки выделяли каурен (13), даоксикауренолид (13) и ГАд, очищенный в виде метилового эфира (м.э. ГА^). Клетки мицелия отплывали от культурального фильтрата, экстрагировали спиртом и выделяли дополнительное количество каурена; ни ГАд, ни ІЗ в экстракте не содержались. После очистки всех продуктов до постоянной радиоактивности были получены следующие данные (см.Таблицу 4).
Таблица 4
Метаболизация [9н]-(-)-каурёна на двух средах
Среда Вещество Общая активность (Ю5имп/сек) Мольная активность'
* 2 ІЗ 0,013 1,0
(жировая) ІЗ 0,002 4,3
м.о.гАд 3,682 6,8
А 3 10 0,011 0,5
(сахароза, дробное ІЗ 0,024 - 0,9
внесение) м.э. ГА3 0,902 1,7
* В условных единицах. Мольная активность исходного [Зн]~ каурена (22,06 кюри/моль) принята за 1000. Продолжительность инкубации на среде 2-8 суток, на среде 3 - IX суток.
Сильное снижение радиоактивности в ходе инкубации говорит об интенсивном биосинтезе на обеих средах, приводящем к разбавлению [Зн] -каурена. Если биосинтез 10 рассматривать формально как реакцию 1-го породка:
Предшественник — «- |0 скорость которой V = к [ Предаественния^ , то из уравнения
мольной радиоактивности для 13 можно определить кгсо З.б-КГ^ч-*
__2 —I
и ч - формальные константы скорости образова-
ния каурена на средах 2 и 3; показывакщие, что совокупность реальных констант скорости, входящих в цепь биогенеза 10, на среде 2 благоприятнее для синтеза каурена, чем на среде 3.
В то же время сравнение общих активностей 13 и м.э.ГАд показывает, что на среде 2 в сторону образования ГАд направляется гораздо больше каурена, чет* на среде 3. Это согласуется с предположением о том, что стимуляция одной из ветвей метаболизма кауреновой кислоты (14) сопряжена с относительным угнетением другой. Сочетание интенсивного биосинтеза каурена с подавлением биосинтеза кауренолидов приводит к максимальному выходу ГАд на жировых средах.
1.2. Химическая характеристика лишщов Р.тоо111£огше
а) ГиОбереллины, их артефакты и родственные им датерпено-иды в культуральном фильтрате и -в смолах-отходах
Из 500 л культурального фмьтрата штамма г6-7» выращенного на среде Фуски, помимо известных жатерпеноядов 3 1 &-13, были выделены четыре новых датерпеноидных метаболита: 16ы.-окси-(-)-кауран-19-аль (15), Хбл-окси- (- )-каурая-1&-овая кислота (1§), ,13-диоксикауренолид Щ) л 7Р ,16л-диокси-кауранолид (18). Их строение доказано по данным Ж*, ПМР- и
масс-спектров и химическими превращениями, при которых 15 и 16 были скорректированы кевду собой и с известными соединениями П, 14 и И, кауренолид Ш ~ с кетоном 20, а каурежшід 18 - с ка-уренолидом К (см. Схему 2), С биогенетической точю; зрения оксиальдегид Ц интересен как гкдратная форма (-)-наур-Іб-ен--19-аля, являмцегося промежуточным продуктом при превращении 10 в 14 у растений. Выделен::© 15 показало, что такая же последовательность реакций существует У Р.топііііогтв.
Схема 2
- 19 -
В смол&х - отходах от выделения ГА3 содержится значительное количество высокоактивных гиббереллинов А4 и Аг, от веса кислой фракции смолы).
0) Липиды мицелия
Отфильтрованный и промытый мицелий (штамм среда
Фуски),экстрагировали спиртом, экстракт упаривали, водный остаток экстрагировали эфиром и этилацетатом и органический слой последовательно экстрагировали растворами НаНСОз', На2со-з и Иаон. Получили три кислых и одну нейтральную фракцию, не содержавшие высокополярных соединений (ГА^, ГА^, ГА^, ГА3, 13). Доминиругашми дитерпеноидами мицелия являются каурен (с\>Е(Е от веса всего мицелиального экстракта) и эпиманошюксид. В гораздо меньшем количестве выделена Ц, 16 ж 3; присутствие 14 обнаружено только с помощью ШХ. Таким образом, дитерпенощда мицелия соответствуют только ранним этапам биогенеза гибс ерелли-
Другим направлением метаболизма изойреноидов в клетках мицелия является образование С^д-стеринов, из которых два были
идентифицированы как экдоперекись эргостерина (21) и цереви-стерин (22). Строение третьего стерина (83) следует из его спектральных свойств Ї ^макс 232 ЕШ* V 1659 и 1640 си-1) И превращения в известный стерин 2£ при частичном гидрировании. В кислой фракции экстракта содержатся лауряковая, миристнновая, пальмитиновая (са405ь от веса всего экстракта), стеариновая, олеиновая, линолевая, азелаиновая и субериновая кислоты. Кроме них выделена ранее неизвестная дсдекан-4-он-1,12-диовая кислота (25), строение которой определено по спектральным свойствам ее эфира (25а).
II. ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ШББЕРЕШШНА А3 И ГОЖК СВЯЗИ МЕЩДУ СТРОЕНИЕМ И ФШИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИШОСТЫ)
Сложный характер зависимости гормональной активности гиббереллинов от их структуры делает необходимым рассмотрение ее таксономического, метаболического и клеточного аспектов. Недавно появились надежные доказательства обратимого связывания гиббереллинов с находящимися в цитоплазме тканей-мишеней специфическими рецепторними белками; наиболее активные гибберел-лины (Л|, Ад) проявляют высокое сродство к рецептору. Таким образам, имеются основания душ рассмотрения зависимости . "структура - активность" в молекулярном аспекте.
Анализируя литературные данные по ростостимулирукщей активности гиббереллинов и их производных в четырех характерных биотестах - на эндосперме ячменя, на проростках карликового гороха и на гшюкотилях огурца и салата, мы пришли к следукщим выводам: (а) Шсоку® активность проявляют лишь те С^д-геббе-реллины, для которых возможен плотный контакт с молекулой,.специфического рецептора; (б) Активность С^д-гиббереллинов опре-
делается их способность» к превращению в активные С^д-гиббе-реллины в тканях растеши иш к имитации ах структуры;
(в) В биотесте на горохе оптимальная дня контакта с рецептором
' ' і
геометрия молекулы реализуется в случае ГАд (см, йю. Іа), а в биотесте на "огурце - в случае ГА^ (рис. 16). Эти вывода и схематические модели контактов ыедду гормоном г рецептором по существу представляют собой гипотезу о первостепенном значении таких контактов дая проявления гормональной активности.. Данная гипотеза была предложена.наш после рассмотрения и оценки различных факторов» вяшотцихна соотношение между структурой и активностью гиббереллшов, 1 ' ■
Рас. I. Схематическое изображение предполагаемого оптимального контакта "гормон-рецептор" лая биотеста на карликовом горохе (а) и огурце (б). I - Облигатное связывание. И - Вспомогательное связывание. Ш - Гидрофобный участок. Связывание с -^-лактоном и ОН-групдами - эа счет водородных или л&бшгьных сложно эфирных связей
Для проверка »той гипотезы был избран путь направленной мо£и|икац[П1 молекулы высокоактивного ГАд с.цомощыо превращений,
мешнэдих его структуру только в одном оаределенном участке. При выборе объектов синтеза до пользовались моделями контакта "гормон-рецептор". Предполагалось, что результаты биотестирования полученных соединений позволят оценить пригодность этих моделей душ прогнозирования ростостимулирувдей активности гиббереллинов,
II.I. Химические превращения гиббереллинов
По^чрльку ГАд является самым доступным и оде нал из .наиболее активных гиббереллинов, то большинство превращений проведено с ГАд и его произво- пит. Из последних наиболее подробно был изучен 3-дегвдро-шббереллин Ад (26), у которого, благодаря присутствию группировки ei.^-енона, значительно расширяется круг реакций, возможных в основном а возбужденном состояниях; кроме того, образование в дальнейшие превращения 2g могут быть одним из путей инактивации ГАд в растениях.
а) Сштез_блтаДщта_аяалсгов гиббереетшм^Ад. Так как при этерификации карбоксильной группы таббереллиноа их физиологическая активность резко снижается, а кислотный или щелочной гидролиз эфиров ГА3, ГАд,, TAj и ГА^ приводит к деградации или к перегруппировке в малоактивные соединения, то для получения пригодных для Оиоиспытаний аналогов ГАд надо было использовать такие синтетические схемы, которые обеспечивали бы сохранность свободной COOS группы.
Дня выяснения роли СООН группы в проявлении физиологической активности был синтезирован 7-гомо-гиббереллин А3 (2р. Ключевое стадией синтеза была фотоиндуцированная перегруппировка Больфа (см. Схему 3).
Дня выяснения роли спиртовых груш их заменяли на СН30-группировку (вероятность расщепления которой ферментами расте-
ний мала), чтобы исключить возможность образовании водородной или лабильной сложноэфирной связи с рецептором- При синтезе 0-метилъных аналогов- гиббереллина Ад ш использовали не применявшийся ранее в многоетадийном синтезе способ защиты кислот в виде фотолабпльных р-метоксифенациловых эфиров (см. Схему 4). Регенерация С0011 группы из этих эфаров может быть осуществлена двумя способам: (а) при фотолизе в абс. этаноле; (б) при восстановлении гп.-пылью в лед. СН^СООН. Первый способ особенно удобен при наличии в молекуле кислотолабилъных группировок.
Фотолитическое удач а 1ш с р-метоксифенацильной группы протекает однозначно. Ни в одном случае не было обнаружено продуктов декарбоксидирования, возможных при фрагментации карбокси-радика-ла. Однако для получения удовлетворительных выходов кислот при фотолитическомснятии защиты необходимы строго безводные условия. Кроме того, р-метоксифенациловые эфиры чувствительны к основаниям С АкОН в недостаточно высушенном Ае201 следа!* диметил-амлна в ДМФА), а.потому для стадии алкилирования растворитель и ^рО должны быть тщат?.\вно высушены. Наиболее удобным раствори-
Med
Me О
Шс
ГЧМс.
•ОАс
*С_о1
R0 1 11 " ЭШф" * " COOR "" " COOR
39 (Я»Мв, В'= И> Щ <R=H) <В*Ю
за (Й=Н, = tóe) (B=ite> ä5s
Реагенты: і. Лс20/^у; іЦШВг - ЖС^д/ДОМ, вых. 46~tm.
ni. CHjJ—Agg"» вых. 48-79a; lv. tn> /adc,С2Н50Н,вьік.ЗЄ-62%.
v. an-АсОН,вых.50-7Q£; vi, О,О2н.И*Ше/МЬ0Н,ВНХ.54-57#. ms ■= -cH¿coc6ii4OMe-p
телем при метилировании оказался абс. ТГФ. Метилирование даоксв-эфгра наряду с диметиловым производным 36 дает смесь монометиловых цроизводанх 39 и 40, в которой преобладает ДЗ-О-иетилъныЯ изомер 40; метилирование третичного гидрокоила в тоже протекает легче, чем метилирование вторичного гшфоксила в 35.
С помощью р-метоксифенацияьной запиты карбоксила были синтезированы все три возможных О-нетилъных аналога гиббередлина А^
44, 45). Аналогичным путем из р-метоксифенацияового эфира шббереллияа Ау (46) был получен З-О-метилгиббереллзш А^ (№).
Этот же способ защиты карбоксила был использован для получения других производных ГА3. При конденсации афиров 33 и 35 с тетраацетил-е^-бром- » -глюкозой к AgjO в абс. ДМ5А в первом случае образуется смесь 3-0- и 13-0-тетраадетзлглюкоэидрв (4£) и (§0), в которой преобладает последний» а во втором - индивидуальный продукт (51). Фотолиз в айс. этаноле приводит к соответствующей кислоте (52) с выходом 4И5, тогда как при действии Zn /СН3СООН образуется преимущественно ÍK, т.е. происходит расщепление глино-зидаоб связи. Этот пример показывает предпочтительность фотооптической регенерации при наличии в молекуле кислот стабильных группировок. Деацетилирование 5£дает 3-0^-D-глюкопиранозил-ГА3(53), идентичный о природным образцом (см.Схему 5).Защитная р-метоксифе-надильная группа не затрагивается при окислении 33 до 3-дегидро-производяого (М).Однако синтез циклопропанавого аналога 3-дегид-РО-ГАд
- 26 -
(55) не удался из-за глубокого разложения шразолина 56 при фотолизе или термолизе.
Схема 5
С00Ш1Ф -
СООПЫФ
ЕЙ™
САс О^^УТ^'^Н
С ООН
СН2ОАО
' соон (В=х, в'= Ао> (Е=1, н'= Ю-
1>и\ VII 2)111 ч-
X =
САс
КО1
ГА? + 3
vi.il
сн2 ОН
■X =
иг,к * сн^асен4оме-р
Реагента: 1. Ацетилбромглюкоза + Ай^0'
И. ЬУ/С2Н50Н; 111. НаСМе/МеОЯ]
iv. мпог1 v. (с5е5ыи]сгозс1/снгс121
^111. Целлшаза,
- 27 -
При попытке получить циклопропановый аналог ГА3 (£2) прямым взаимодействием ££ с в присутствии диацетата палладия вместо делаемого продукта была получена смесь четырех соединений. Основным продуктом (выход 55-60?)'является э$ир З^; это превращение дозволяет получать кислоту 45 из ГАд в три статей вместо шести. Побочно образуется соединения ££ и 59, относящиеся к ряду изо-ГА3. Снятие защиты с 58 приводит к 3-0-метил-изо-ГА3 (60), В отсутствие диацетат палладия не вызывает изомеризации 33 —или 39 —вероятно, катализатором ее служат следы коллоидного палладия, образующиеся при восстановлении р<1(ОАо)г диазомеганом. При действии комплекса
нуль-валентного палладия ра(ЕРИ3)4. на или 22 они быстро и
с высоким выходом превращаются в 59 или в-|8 (ом. Схему 6).
Схема 6
реагенты: і. СН2К2/Р'і(0Ао)2! іі- гп/АсОН; ііі. Ы(РРЬз>4_
Легкую изомеризацию системы ГАд в систему изо-ГАд под действием можно объяснить двухстадийным механизмом, когда лактонный мостик сначала играет роль уходящей группы, а затем -внутреннего нуклеофила.
С целью получения 3-дезоксигибйереллина А3 (£1) было изучено гомогенно-каталитичес кое разлояекие 3-моноформиата ГА^ <62) а присутствии РД(0Ао)2, Однако вместо 61 основным продуктом реакции (выход оказалась дикарбоновая кислота (63) с Лмакс 275,5 нм (С 3900), Побочно образуются эшаллогибберо-вая кислота (64) и З-форьщат И30-ГД3 (65), Строение (§3) под-тверкдается ее превращением в гиббереллин А^ (ГА^), Последовательность реакций ГА3 —-— —■ ГА5 представляет собой кратчайший и наиболее эффективный способ получения труднодоступного ГА5 (см. Схему 7).
Схема 7
111. СТ3С0СН/СНгС12, 0-5°
- 29 -
(5) Окислительная лактони задня гиббереллжнов
При отработке условий препаративного получения З-дегидро--ГА3 (26) из ГА3 наилучшие выхода 26 (до 56%) были достигнуты при окислении ГА3 щелочной двуокисью марганца, приготовленной по Аттенборо. Если же проводить окисление ГА3 нейтральной Мп02, полученной по методике Манеера, то выход 26 составляет всего 5-б£, а возврат ГА3 даже после 200 ч экспозиции превышает 50$. Наряду с этим образуются три нейтральных вещества: нор-кето-лактоя (66), нор-диоксалактон (67) и дклактон (6§).
Основным продуктом реакции является дилактон (выход 9-13$). В ИК-спектре его даацетата (663) проявляются две полосы ^-лактонного поглощения при 1780 и І7С5 см"1, а положение нового лактовного цикла определяется по наличию в ПМР-спектрах 68 и ^^ однопротонного сигнала при 5,61 или 5,37 м.д., расщепленного за счет адлильного ССІЗ с олефиновыми протонами при С-17. При селективном гидрогенолизе в присутствии шшеридана, ин-гибирухщего восстановление д1е-связи, была, получена лактокислота (§9), охарактеризованная в виде метилового эфира (69а), а окисление диацетата ГА3 (2§) нейтральной ЫпОг дает 68а. Рассмотрение молекулярных моделей показывает, что в дилактоне 68 асимметрический центр С-15 может иметь только 15-(к ^конфигурации.
Строение 67 вытекает из спектральных данных (в спектре ПЫР синглет Ш при 5" 5,66 м.д., ИТ* 300); при действии нейтральной Нв02 из 67 образуется енон 66 ( V 1690 и 1610 см-1, А макс 233 нм). Поскольку §8 при контакте с Мп02 не превращается в 87, то образование 67 и §§ представляет собой два параллельно протекающих превращена ГА3. При окислении ГА3 влажной Мп02 с выходом со956 была получена аморфная триоксикислота (70)» оха-
- зо -
растеризованная в виде эфгра (70а). Как ТО, так и очень неустойчивы и легко образуют 68,
Схема 8
ііі. ас20-^р7) iv. Н2/Р(1(С5а11ЇГ)і V. 011^2
Общий характер обнаруженных превращений был показан при взаимодействии нейтральной ШО- с ГА^ и ГА^. Окисление ГА^ приводит к нор-диоксилактону (7І) и к дилактону (22) • структура которых была скоррелирована со структурами ^ и про селективном гидрировании последних. Окисление ГА^ протекает ана-
логично и дает нор-производное (23) и дилактон Для про-
текания окислительной лэдстонизации необходимо наличие Д16-связи, поскольку ари реакции тетрагидро-ГАз (75) с нейтральной Мп02 единственным продуктом является нор-яиоксилактон
Схема 9
Дялактоны 68 и 72 устойчивее к кислому гидролизу, чем их аналоги - ГА3 а ГА|. В условиях., когда ГА^ претерпевает перегруппировку Вагнера-Иеервейна с образованием гиббереллина С (ГС), дилактон 72 остается без изменений. В отличие от ГА3, легко образующего при квелом гидролизе аллогибберовую кислоту
(£) • дилактон ¿2 дает при гидролизе диеновую лактокислоту (77), а пооочно - триоксикислоту 70 и диендикарбоновую кислоту (78), но не склонен к гидролитической ароматизации. Считается (Прайс, 1974), что ГАд превращается в 6 с промежуточным образованием ¿> и далее три«новой кислоты (79). Рассмотрение молекулярных моделей показывает, что образование аналогичной триеновой системы (80) из 22 конформ^ционно затруднено вследствие создаваемого лактошшм циклом напряжения.
Цр* окислении 68 щелочной Ка0г с выходом 60^ образуется енонгдилактоа (&р.
в) Превращения З-дегидро-ГАд и его метилового эфира Для оценки влияния конфигурации при С—3 на физиологическую активность был получен З-эпи-гиббереллин а3 (82). Наилучший вы-
-ЗЗ-
ход §2 (35Я достигается при реакции 2в с избытком Навн4 в метаноле; побочно образуются ГА3 (14$), ГА£ и З-эпи-ГА^ (83, выходеч>6#). Восстановление метолового эфира 3-дегидро-ГА3 (2ба) комплексными гидридами сильно зависит от условий (си. Таблицу 5), однако основными продуктами вскду являются метиловые эфира 82а и ^За, соответствующие атако из ^-области, а минорными - м.э, ГАд и ГАр
СО
КаВН,,
И
ОК ■
СООЙ
Ш оьн)
2£а (к=Ме)
но^
н
ооок 82<Е=Н)
ГА3 ( й=Н) М.Э.ГА3 ( К=Ме)
■он
соол 82СК=Й) а;а(К=Ме)
ГА£ (В=н) м, э.ГА]|( Е»Ме)
Таблица 5 Стереохимия восстановления эфира 26я
Реагент
Мольное соотношение
енон:гидрид
! 'Основные про-
I Растворитель !дукта, выход,Я
\Ш
ЛаБНд. ГГаЕН^ ЫБЯ^
1,08 1,05 1,25 І.5СІ
Диоксгш-іуї СІГ3ОП абс.П^ абс.ТГФ -Эфир
I? 10
24
12
20 50 25
В качестве моделей инактивации гиббереллшюв Ад и А-щ в растениях, приводящей к фарбитовой кислоте (84) и гиббереллину Л33, были изучены реакции 26 и 26^. с водой и Ь-цистеином,
Гйдраташм 26 в пиридине при 20° стереоспецифично приводит к о ки икетокислот е (85) - аналогу ГА33. Реакция с Ь-цгштеи-
ном б слабощелочной среде дает о выходом 60& си:есь днух 1:1 ад-
дуктов, главный компонент которой (65) выделен в чистом виде.
Нрл обрабогке 86 Шфовююградной кислотой при 40° был получек
кет о л , являющийся близким аналогом Щ. Реакции 26 и ¿&3 с
комплексными гидридами, водой и ь-цкетешюм (нуклесфигьное
присоединение) протелсакгг предпочтительно с -сторопи слоновой
При реакции 2&-1 с триэтилйоранои в ТИ (радикальный
реагент) в качестве основного продукта тагоке образуется 1/5 -
этил-З-кетоэфпр (89), огненный чэрез ддол ($0).
= Схема 10
- 35 -
г) Фотохимия 3-кеТОГИббереЛ.чиноб
Под действием УФ-оСлучения в полосе а, I) к -перехода кето-группы эфир 26а претерпевает следующие превращения: (а) злиминя-'рованле лактонного мостика с одновременной ароматизацией кольца А; (б) восстановительную ароматизацию с разрывом кольца В; (в) восстановление С^-связи; {г) присоединение молекулы растворителя; <д) циклодшерипашда и полимеризацию. Процессы (а) и (д) имеют место во всех растворителях, остальные - только в среде радикальных доноров водорода.
При облучении 26а, в трет-С^ПдОН или бензоле образуется тетрациклический фенол (91), охарактеризованный производными 91а и 91£ и превращением в кислоту 9§. Стереохимия. при С-6 и С-Э была доказана его превращением в тржщклический кетодиэфир (94), кривая ДОВ которого почти совпадает с кривой ДОВ его известного 3-дезокси-аналога (95), но отличается от кривых ДОВ трех других стереоизомеров этого аналога (см.Схему И). Такая' яе ароматизация происходит при фотолизе метилового &$ира 3-дегид-ро-ГАу (§6) и кетодшгактояа 21 в трет-С4НдОН, приводя к фенолам 97 и 9§. Шхода 22 и составляют 30-42%.
Образование 91 не ингибируется добавками 02 или 2,3-диме-тид^1,3-бутадиена (ДНЕ) и, следовательно, протекает через синг-летное возбужденное состояние в,,. Сохранение исходное конфигурации при С-6 и С-9 говори* в пользу согласованного механизма элиминирования - ароматизации, которому должна способствовать геометрия кольца А в еноке 26а и сильное перекрывание аксиальных; б -связей лактона с ТГ -системой енона.
П{я фотолизе 26а в бензиловом спирте, являющемся хорошим донором водорода, с выходом 41% образуется трицикдическнй фенол (99), охарактеризованный производными 99а и 996. Побочно обра-
зуются известный метиловый эфир З-дешдро-rAj (ICQ) и следа фенола 91. Анализ ЖР-спектров 99 и 9&J показывает, что бензиль-ный протон фенола 99 (С-часть системы ADC, JAB +JAC = 6,5 гц)_ в предпочтительной конформавди имеет ^-ориентацию, т.е. что и в этом случае фотолиз не приводит к инверсии при С-9. Поскольку 91 при облучении в бензилово« спирте не превращается в У9, то очевидно, что последний образуется по особому механізму.
Схема II
2§й Ofc=0H) Si (¿Н, Х-ОН) ш
2S а = Н) ' у 21a (ibiie, х*ан)
gig (¿АС, X.CH),
/ 2Z ( н=х=н)
Реагенты: і. ВД /трет-С^ІІдОН; іі.н-С^ІдБІА/Гексаметапол; ill. ОвОці lv. ИаБ±03і v. СН2ІГ2 Фотолиз 26а в алифатических спиртах (см.Схему 12) проте-
Схема 12
^ ■+■ Ґо
^ I—І""1011 ■ О'
С ООМе
Ш. Н
"чпон
ССОМе 100
СООМе соош
юг
і-РгО
СООМе
т
н
юг ТбС1/Р7, г™ і
ї'О о
Ь^ с Сг(еп)2(ОАс)гг
5
н 10^
Н" 10?
кает более сложно» В этаноле из 26а образуются аддукты с растворителем: О-аддукт (101) и С-адцукт (102). Стереохимия при С—I у авдуктов 101 и ¡0§ определялась по спектрам ПМР и КД (см.ннже); в случае 102 она подтверждена превращением в
Ioí. -этил-З-кетопроизводное (105). эпимерное с кетоном И. Фо-
I
толиэ 26а в изопропаноле дает качественно такой же результат.
Изученная нами реакция фотоароматизаиии гиббереллиновых І-ен-3-ойов представляет собой короткий и пока единственный путь синтеза фенольних аналогов гиббереллинов, необходимых дяя изучения взаимосвязи между структурой и физиологической активностью. Попытки; зарубежных исследователей получить их'с помощью обычных методов синтеза приводили только к феї; о лам с перегруппированной системой колец C/D,
Фотоароматизация зпоксихетона ІШ в диоксане приводит к тетрациклическому резорцину (103). образование которого представляет собой результат известной для сС-отоксикетонов фото-перегрупаировки в- р -дакетон, который затем д елакт снизуе т с я в своей енольной форме. При фотолизе Щ6 прд 100° выход 109 не изменяется, но побочпо образуется известный скм; кето эфир 85а.
Схема 13
т
НО ;
СООМе _ „.
ослиз. в^ io2(R=h)
I09a(R=He)
І.іехакизма всех вышеописанных фотопревращений выяснены в опытах по влиянию добавок тушителей триплетних состояний (Og,
ДИБ) на скорость реакций, При всех вариантах фотолиза 26а выход продуктов циклодимеризации и полимеризации, образушцихся по триплетному механизму, составляет 40-60$. В диссертации подробно рассмотрены механизмы фотохимических реакций 26а и 108 и дана их единая схема.
При фотоциклоприс о единении енонов 26 или 26а к ацетилену под действием УФ-сиета с А г 330 км с невысоким выходом образуются loi ,2л-этено-3-дегкдро-ГА-^ (ЦП) или его эфир (110а). Стереохимия циклоадцуктов НО и ІІРа доказала спектром КД ( [0і296 = -З&^О0 Для 110а) и ну. про ¿вращением в известные 1л , 2<¿-этано-аналоги III и tila при селективном гидрировании. Боли инициировать циклоприеоединение светом с Л ^ 330 им, то вместо индивидуальных аддуктов образуется трудиораздолпмая смесь последних с их Ifi ,¿(З -стсреоизотерамк (II;; ш II2a). Такая же-смесь образуется при облучения IIОд спетом с Л ^ 330 нм. Это результат известной для JS, ^"-отгонов фотоперегруппировки.
Ранее ни С-прксоедшюч::е craípTOD к шестичленним Ы., JÎ-ено-нам, ни 1,3-ацилыщй сдвиг в бщшкло[4,2,ojокт-?-ен-3-онових системах не наблюдались. Обнаруженные нами превращения отражают влияние конформаці:ош-гой жесткости кольца на реакционную способность фотовозбуяьетшх циклических кетонов. Следует отметить, что С-лрисоединенке этанола и шкзо присоединение ацетилена к 26а, протекамщие через триллетное возбужденное состояние, происходят как атака из ot-области енопа.
д) Определение конфигурации заместителей при С-І
Рассмотрение молекулярных моделей I-замещенных 3-кетогиб-береллинов показывает, что кольцо А у всех leí.-замещенных, а также у IJÏ-замещенных, содержащих заместители с - 4
1,7 ккал/моль, должно находиться предпочтительно В креслоойраз-
гг
н
соон 2|(К=Н) 26а(И=Ме)
Ч<0Н
11
"»ОН
соов 110а(1Ы£е)
Схема 14
СООй
он
гн(к-н)
111а(К=Ме)
НО**"
Реагенты: 1. Ш=СН, Л > 330 нм;
II. а^/тй (ру)!
III. КаБН4(
iv. А > 300 нм.
• но1
'ИОН
11 П2(Ы) Н2а(н=11е)
'(ОН
ной конформации. Для соединений с гетероатог.шым заместителем при С-1 его конфигурация определяется методом МР до виду X-части системы АШ, образуемой протонами при С-1 и С-2. Для соединений с углеродным заместителем (например, 89 или 102) определение конфигурации методом ПИР затруднительно. Стереохимия таки? соединений была определена путем эмпирической корреляции данных дугового дихроизма (Щ) с данными спектров ШР соединений, имеющих при С-1 гетероатомный заместитель.
В качестве .эталонов были использованы незамещенный летон 1Ш и два эпимерных метоксикетона (115) и (116). Результаты корреляции представлены в Таблице 6, На основании проведенной корреляции кетону приписывается Iji -конфигурация, а соединениям 102 и 105 - lot-конфигурация.
Olle
НЪУ 4L
■КОН
н
тон
СООМе
СООМе
Таблидош-6
Корреляция между данными спектров IMP и КД
Кетон JAX + JBX (ГЦ) НД кетогруппы (град) Ориентация заместителя (C-I) по ПИР но КЦ
IQ0 _ +II800 +144 _ _
115 7 +1200 +146.8 а( ß ) a(Jl )
т 7 +10800 +132 а( ß ) a( ß )
§й 7 +11400 +138 а(ß ) a( ß )
89 - + 7500 +91,5 - a( ß> )
Ш 7 +I3I50 +148 a(jä ) a( ß )
116 12 +14800 +I8Ó e(oL ) e( ot )
14 +13700* +167* e(ot ) e(oL )
ш +14400 +175,8 - e(oC )
105 - +14600 +178 - . e(cC )
Вещество содержит 2QS эпшерного кетона 86 (данные ПИР).
II. 2. Фкзиологическая активность шдифжшрованннх гиббереллинов
Испытания физиологической активности полученных аналогов
ГА3, ГА-£ и ГАг, проводили в стандартной системе бу.отеотов на удлинение эпикотилеЕ карликового гороха и типокотилей огурца и салата. Для корректного сравнения"результатов, полученных в разное время, и сведения к минимуму колебаний, связанных с' природой биологического материала, в каждой серия испытаний рассматривались графики "доза - ответная реакция" зля испытуемого соединения и для гиббереллина, проявляющего 'максимальную активность в данном биотесте (ГА^ для гороха л ГАг, дай огурца; для салата активности ГА3 и ГА^ имеют один порядок). При таком подходе гиббереллины и их аналоги можно подразделить на пять групп с различными порядками активности: (I) Максимальная активность в данном биотесте - 4 баяла; (2) Активность ^ ОД от максимальной - 3 балла; (3) активностью 0,01 от максимальной - 2 балла; ■ С4) Активность ^ 0,001 от максимальной - I балл; (5) Активность ниже 0,001 от максимальной - 0 баллов. Такая шкала оценки легко может быть скоррелировала со шкалами, использовавшимися Брайеном о сотр. (1907) Я Кроэъе с сотр. (1970).
.Кля оценки сродства к биофазе ближайших синтетггюс1сгЕХ аналогов ГА^ были определены коэффициенты их распределения мелду фосфатным буфером и этилацетатом (см.Таблицу 7). Результаты биоиспытаний представлены в Таблице 8 (для соединений оо свободным карбоксилом) и в Таблице 9 (для соединений, не содержащих С00И). . Таблица 7
Коэффициенты распределения (Р) аналогов ГА^
рН
р " °1Г21>/с этил ацетат
га3 гау ; i 41 ¿4
6.4 9,64 0,52 9,85 0Д9 0,95 0,76 9,20 9,90 <ГО 9,90
3.5 0,18 0,02 0,20 0,00 ОДО 0,09 0,30 0,22 0 Д6 0,25
Таблица 8
Сравнительная флзпологиче с зал активность кислот -аналогов ГА^ (по кривш "доза - ответная реакция")*
Соединение 1 1 Виотест
I горох огурец салат
ГА3 4 2 4
ИЗО-ГАд (I) 2 2 2
ГА? 3 4 4
изо-ГАу (7) 2 3 3
3-депщро-ГАу (26) 2 0 2
3-эгт-ГА3 сш> ■2 I 2
1р -ОН-Э-дегидро-тГА1 (85) I' 0 I
Фенолокислота (93) 0 0 0
Хос.йл-Циклоаддукт (110) 0 - 0
?-гомо-ГЛ3 (§?) I 0 2
7-гомо-диацетат (30) 0 0 -I
Лнацетат ГА3 (28) 3 2 4
13-0-ацетат ГА3 (33) 4 2 4
3-0-ацетат ГА3 (21) 3 2 4
3,13-0-даметил-ГА3 (41) I . 2 2
13-0-метил-ГА3 (&) 3 3 3
3-0-метил-ГАд (45) 2 I I
Лактокислота (77) 2 0 I
3-0-м§тил-изо-ГА3 (60) I 0 I
1(10), 3-даен (63) I 0 0
3-0-метил-ГА? (48) . 2 3 2
ГА13 0 0 I
* Диапазон доз в испытаниях на горохе и салате от 1СГ4 до 10° мкг/растеиие, на огурце - 10~3- ю° мкг/растение.
Тагілипа 9
Активность нейтральных аналогов (доза I мкг/растение>*
| Биотест
Соединение — . ■ I—II .. ■■
i горох огурец салат
Метиловые вфиры:
М.Э.ГАд 167,7 (I) 112,5 (I) 133,3 (I)
к.э.ГА^ 168,8 (Г) 153,0 (2) 149,0 (I)
3-дегидро-ГАд (26а) 102,8 (0) 109,2 (0) 100,5 (0)
Э-эпи-ГА3 (82а) 108,7 (0) 104,4 <0> 95,1 (0)
ip -ОН-З-дегидро-rAj (Щ) 96,8 (0) 100,5 (0) 100,1 (0)
Ij3 -цис*еял-3-дегидро-ГА2 ^ 86 ^ 95,8 <0) . 100,2 (0) 103,5 (0)
I $ -этил-ГАj (Ш) 83,0 Í-) 101,9 (0) Ы0,6( 0)
Фенол (91) 96,5 (0) 100,1 (0) ІОЄ.О (0)
Секо-фенол (gg) 167,1 (0) 107,2 (0) 139,7 (I)
Резорцин (109) 88,0 (-) .98,0 СО) 95,2 (0)
1^,2^-Эгеш-З^-ол (Щ) 97,3 (0) 101,1 (0) 100,0 (0)
Дилактоны:
68 175,7 (I) 107,2 (0) I4S.2 (X)
м 159,2 ÍI) 104,2 (0) 129,5 (0)
7-нор- Л -ены: (0)
5Z 99,4 109,2 (0) 98,3 (0)
71 97,5 (0) 102,3 (0) 101,2 (0)
* В %% от контроля (вода); в скобках - относительная активность в баллах. Эталоны сравнения - м.э.ГА3 и м.э.ГА^.
Как видно из таблиц 8 и 9, любое отклонение от "оптимальных" структур ГА3 и ТАу при центрах C-I, С-2, С-3, С-7, C-I3 и C-I5 приводит к снижению активности на порядок и более (исключение - ацетаты 2§, 31 и Щ, для которых возможно деадетилирование in vivo. Так как до величине Р кислоты I, ЭТ, 82 а 65 близки в
ГАд, а кислоты 41, и - к ГА?, то снижение активности, вероятно, связано не с изменением сродства к беофазе, а о отклонением от оптимальной геометрии контакта гормона с рецептором. Особо примечательно резкое падение активности при переходе от ГА3 к 7-гомо-ГА3 (27); это первое указание на то, что контакт ГАд с рецептором на участке, комалементарвом кольцу в, также весьма ст ереоспегофічен. Из двух О-метклгиббереллинов А^ изомер со свободным гидроксилом щи С-3 активнее изомера как в биотесте на горохе (структура кольца А у я у ГА3 одинакова), так и в биотесте на огурце (участок арі С-ІЗ у ^ более гидрофобный, чем у или ГАд); это согласуется с прогнозом, вн-текашгаа из моделей контакта (см.Рис. I). Чем сильнее отклонения от оптимальноЯ для контакта с рецептором структуры, тем резче падение активности.
Из нейтральных аналогов наиболее активными на горохе и салате оказались дилактоны 68 и 7^, где отклонения от структуры и. з-ГА3 минимальны. Заметно активен тркциклическай фенол 99, строение которого имеет сходство со строением другого природного регулятора роста растений - гельминтоснорола.
Ш. ШСС-СПЕГОШЕГГОЧЕСКОЕ ИЗЭТШШВ ХИШ5ИШДИШВ И РОДОТВШНЬВС Ш СОЕДИНЕНИЙ
Дня идентификации малых количеств габбереллиноэ и родственных им датерпеноидов в культуре Р.вопШГогав, а также для характеристики продуктов ХИМИЧвСКИХ превращение гиббереллинов мы предложили использовать метод осколочной масс-спектрометрии.
а) йіббереішаш_и_іа про взводные. Сравнение масс-спектров метилешх эфиров ГА^, ГА3, ГА^. ГА^ к ГАдо показало, что основные пути распада втих соединений сходны. Фрагментация начинаете«
с образования ионов M-HgO, M-MeOH, М-ЯСООМе. Серия последовательных отщеплений функциональных групп проводит к диагности-
13-деэокси-аналогам й и в случае ГА4, ГА13 и ГА^. В спектре м.Э.ГАд самым интенсивным является пик иона в. с ш/е 136; в спектрах эфиров 41а и 44а соответствующий пик появляется при ш/е I5U. Происхождение большинства характеристических ионов подтверждено изучением фрагментации этиловых эфиров и дейтеро-аналогов. В диссертации рассмотрена последовательность образования этих ионов из метиловых эфиров TAj, ГА3, Г A4, ГА^ и ГА13 а их аналогов.
Изучение масс-спектров позволяет надежно отличать эфира ГА3 и ГАу от эмиров изо-ГА3 и иэо-ГАу; дм последних характерно элиминирование иэ молекулярного иона вода и лактонного моста с атомом Н (М-Н20-С00Н). В спектрах 3-кетопроизводяых, за исключением еноаов 2ва и 96, даицих интенсивный пик M-COg, наблюдайся характерные пики при т/е 304 Сион je). обусловленные элиминированием фрагмента Cj-Cg-CyO из молекулярного иона.
а. (m/e239)tX=0H £'<т/е237);х=ан & ( т/е136) ;R*H X (в/еЗС»)
б, <т/е22Э)(Х=Н б,' (т/е221)(Х=В ъ' (т/е137>}Й=Ю
б) Вроизводнне gajpgaa. Фрагментация кауреновой кислоты i 14) к ее метилового эфира (14а) характеризуется легким отщеплением заместителя от С-4 и разрывом кольца В по двум направлениям, приводящий к ионам с m/e 123 и 121 (путь а) а с ш/е
чески ценным скелетным ионам а и а' в случае TAj и ГА3 или к их
¿"(т/ві^іВ^е
148 и 109 (путь б). Спектры эфиров эпимерных 7-оксикауреновых кислот отличаются от спектра 14а семейством пиков от иона M-HgO, причем у 7р-эпимера (117) соотношение интенсивноетей ионов M-HgO и Ii* в II раз выше, чем у 7л-эпимера (П8). Для 117. 118 и эфира 7-оксокауреновоЙ кислоты (119) характерен разрыв по связи С-5/С-6 и образование ионов с к/с 149 шш 147.
8С
' tu/e 123 І m/я
ROOC^lö
I4(fi=H) I4a(R=Me )
MeOOC4^
m/e 1A9 (X = СНОН) m/e 14? (X = CO)
МеООС^І 177 X ИС-ОЙ ( £ ) ЩІ = НС-ОІЇ ( ос ) ЇІ9 X = СО
Д,ія группы кауран-16-олов наиболее характеров ионы соответствуют отшєплєішю кольца з в виде фрагмента С^Н^О, а природа эаместите.чя при с-4 легко определяется по конам м-Н,і:-ії-й?о и М-СдК^О-в. Ход фрагментации выяснен по спектрам высокого разрешения и при изучении дейтероаналогов.
ж"
- с5н6°
R = сн3, СНО, ССШе. соон, сн2он е'= сно или он; rf'= он или ck-, (с:
Фрагментация кауренолидов протекает преимущественно по кольцу В. Наиболее интенсивные ионы соответствуют локализации положительного заряда на кислородных атомах лактонного цикла, что доказано спектрами высокого разрешения и иетастабильшаи переходами. Дня всех яауренолвдов» не имеадих заместителя в кольце А, характерен ион с ш/е 109, например:
В настоящее время .закономерности ыасс-свектрометрической фрагментации гиббереллинов и дитерпеноидов грушш кауреиа широко используится щж их идентификации в природных источниках методом ИК-1С,
ВЫВОДЫ
1. Проведено комплексное исследование химических закономерностей микробиологического синтеза и физиологической активности гиббереллянов - важных гормональных регуляторов роста и развития растений.
2. Изучено влияние условий микробиологического синтеза гиб береллшов В культуре граба 5Ч1еат1ит топ111£огае ва общий метаболизм продуцируемых им дитерпеноидов. Показано, что наилучше выходы высокоактивных гиббереллинов Ад и А^ достигаются на средах с постепенно усваиваемым источником углерода при угнетении биосинтеза других дитерпеноидов, особенно кауренолидов,
3. Вшшута и обоснована гипотеза о том, что определяющую роль в проявлении гормональной активности играет контакт
Сдо-гкдбереллннов со специфическими рецепторами в растениях. Дут ем направленного синтеза и биотестирования модифицированных гиббереллинов получены данные, согласупциеся с этой гипотезой.
. 4. Разработаны и введены в химию гиббереллинов фотохимические методы получения модифицированных гиббереллинов, сочетающие мягкость условий с высокой структурной избирательность». С их помощью синтезированы недоступные иными путями фенолыше аналоги гиббереллинов в другие труднодоступные соединений.
5. Шервне изучены фотохимические реакции 3-кетоцроизвод-ных гиббереллинов Ад и А? в различных условиях (фотоароматизация, восстановление, О-присоеданение и С-присоединение растворителя, дамезжзация, цяклоприсоеданение) и выяснен их механизм. Показано влияние информационной жесткости на направление фотохимических реакций циклических кетонов,
6. Исследованы новые реащии гиббереллинов: (а) Окислительная 7 —ч—15 лактониэация и окислительное декарбоксилиро-вание под действием нейтральной двуокиси марганца; (б) гомогеы-но^каталитическая изомеризация и восстановление кольца А в присутствии соединений палладия. Показан общий характер первой реащии и осуществлен эффективный к кратчайший синтез труднодоступного гиббереллина А5.
7. Предложен способ определения конфигурации замещенных 3-КЄТОГИбб ередливов путем эмпирической корреляции ДЯЮГШГ спектров кругового дихроизма с данными спектров ПМР.
8. Віз работай и введен в химию гиббереллинов метод масс-спектрометричесяого определения структуры гиббереллинов и родственных юл детерпеноидов группа (-)-каурана. Детально научены закономерности фрагментации метиловых эфиров важнейших гиббереллинов (ар ад, а4> а?, а13) к их производных, а также харак-
черные пути распада кауран-16-олов, кауренолидов и производных кауреяовой кислоты.
9. Проведено химическое изучение лшшдных метаболитов в культуре- F.moniiiforoe. Установлено строение семи ранее неизвестных метаболитов и сходство промежуточных этапов биогенеза гиббереллинов у гриба и у ^астений. Показано, что среди ли-пвдов мицелия не содержится вы 'ополярных гиббереллинов и ди-терпеноидов.
10. Цутем изучения динамики образована гиббереллина А^ и его гидролитических артефактов в культуре F .moniliformis определен оптимальный срок ферментации для получения препарата ■Ч^ббереллин".
Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:
1. Серебряков Э.П., {^гчеров В.Ф., %роодев Г.С,, йделение некоторых метаболитов Fusarium moni Ii forme. - Хим. Природа, соед., 1966, I, с.55-58.
2. Агнистикова В.Н., Дубовая Л.П., Лекарева Т.А., Лупова Л.М., Муромце® Г.С., Дучеров В.Ф., Серебряков Э.П., ПккЗередлины и гиббереллжноподобные вещества из культуральной жидкости Fusarium monilifonne. - Микробиология, 1966, ХХХУ, 6, C.I037-ID42.
3. Муромцев Г,С., Агнистикова В.Н., Лупова Л.М., Дубовая Л.П., Лекарева Т.А., Серебряков Э.П., Кучеров В.Ф., 0 наличии апологически активного изомера гибб ерелловой кислоты в культуральной жидкости Fusarium oonilifoxme.. - Хим.природа, соед. , 1966, 2, с.114^120.
4. ItypoweB Г.С., Агнистикова В.Н. , Лекарева Т.А., Кучеров В.Ф., Серебряков Э.П., Анализ состава гиббереллинов в природных объектах. - В ed.: Метода определения регуляторов роста и гербицидов. U.: Щука. 1966, с.109-116.
5. Серебряков Э.П.. Самолов A.B., Кучеров В.Ф., Муромцев Г.С.» Дубовая Л. Л., Сравнительное изучение образования нейтральных метаболитов Fusarium monlllform« на различных ферментационных средах. - Хим.природа.соед., 1969, 3, с.156-163.
6. Симодин A.B., Серебряков Э.П., %черов В.Ф., Ваковский НС., йаделенив гиббереллинов и родственных им веществ ив отходов промышленного биосинтеза гиббереллиня. — Іим. природа, соед., 1969, 3, С.163-169..
7. Налиновский А.И., Серебряков Э.П., Симолип A.B., І^черов
і '
Б.Ф., Чихов О.С., Масо-спекуроыетрическое изучение проиэ-водных каурена: (-)-Каурен и метиловые эфирн каурешеарбоно-
вых кислот. - Ьш.природи.соад., 1971, 3, с.281-286.
і.
6. Серебряков Э.П., Кобрина Н.С., Возынов Б.В., Цасс-спектро-метрия гиббереллинов. С Особенности фрагментации З^-оксн-и 3-кетопроизводных гиббереллзшового ряда. - їим.природа, соед., 1975, 4, с.486-490.
9. Серебряков Э.П., Исагулянц Г. В., Грейш A.A., Кучеров В.Ф., Агнистикова В.Н., Муромцев Г.С., Сравнительное изучение метаболизма 3В- (-)-каурева в культуре Fusarium топ 1X1 forma Sheld. на различных питательных средах. - Дота. АН СССР, 1973, 213, 4, 0.977-979.
10. Агнистикова В.Н., Вобрина Н.С., Кучеров В.Ф., Серебряков Э.П., Физиологическая активность некоторых синтетических производных гкббереллина А3. - Дорл. АН СССР, 1974, 218, 4, о. 967-969.
11. ХУрвич Н.А., Иобрива В.С., Серебряков Э.П., Кучеров В.Ф., Фотохимические превращения в ряду гиббереллннов. - Изв. АН СССР, Сер.хим., 1969, 10, с.234^-2343.
12. Еурвич И.А.. Кобрина Н.С., Серебряков Э.П., Цучеров В.«., 1Мбереялинн и родственные им вещества: фотохимическая ароматизация кольца А с образованием фенолов. - Изв. АН СССР, Сер.хим., 1971, 9, с.2037-2040.
13. Кобрина Н.С., Серебряков Э.П., Цучеров В.Ф., Фотолиз метилового эфгра 1/3 -эпокси-З-кетопроизводного гиббереяли-ва Аз* - Изв. АН СССР, Сер.хим., 1972, 2, с.459-461.
14. Калкновский А.И., Серебряков Э.П., Кучеров В.Ф., Чкжов О.С., Масс-спектрометрическое изучение произвол-"чх кауре-на: (-)-Каурендиолн-16си ,17. - Изв. АН СССР, Сер.хим., 1972, 3, с.567-569.
15. Серебряков Э.П., Кобрина Н.С., Кучеров В.Ф., Определеше кон^сгурации заместителей при С-1 в ряду З-кетопроизводкых гиббереллина А3, - Изв. АН СССР, Сер.хим., 1972, 12,
■ с.2902-2803.
16. Серебряков Э.П., Кобрина Н.С., Фойгт £., Получение и гидратация 3-дегидрогиббереллина А3. - Изв. АН СССР, Сер. хим., 1974, И, с.2644-2645.
17. Серебряков Э.П., Цучеров В.Ф., Фотолайкльная защита карбоксильной грушш гиббереллинов. - Изв. АН СССР, Сер.хим., 1974, 12, С.2872-2873.
18. Серебряков Э.П., Кучеров В.Ф., Адам Г., Стереохимия цикло-присоелннения ацетилена к З-дегидрогиббереллину А^ я его метиловому аферу. - Изв. АН СССР, Сер.хим., 1977, б,
с. 1831-1835.
19. Серебряков Э.Д., Лшевскн и., Ада» Г., Частичный синтез 7-
гомо-гнСИереллина a3. - Ию. АН СССР, Сер.ihm« , 1978, 9, с.2181-2183.
20. wulfson S.S., Zaretsldi 7*1., Р»регюа;)а I.B., Serebryakov E.P., Kucberov TT.F., Паев Spectrometry'of Gibberelllne. — Tetrahedron Letters, 1965, p.4209-4216. 21* ^rebryakor B.P., Kobrina Я.Б., Simolin A.V., Kucberov V.F., 16A -flydrojy-(—)-fcauran-19-al and 16л -hydro:*y-(-) -kauran-19-oie acid from Fusarium aonillfome Sheld., — Chea.and
ind.\ 196a, 25, p.1770-1771»
22. Zaretekil V.l., Wulfeon H.S., Paperaaja I.B., Gurvicti I.A., Eucherov V.i., Ullstein I.H., Serebryakov Б.Р., Simolin
A.V., Каев Spectrometry o£ Gibberelliae. - II. The Location. of the Double Bond In the Gibbane System. - Tetrahedron, 1968, 24, 11, p. 2327-2337.
23* Serebryakov B.P., Simolin A.V., Kucberov V.F., Rosynov
B.V., Sew Metabolites of Fusarium moalllforme She Id. -Tetrahedron, 1970, 26, 22, p.5215-5223.
24« Gurvicb I.A., Kobrina U.S., Serebryakov S.P., Kucberov
V.F., Photochemical Transformations of Gibberellia A-j Derivatives! Aromatization of Hing A* - Tetrahedron, 1971, 27, 23, p.5901-5909. 25* Serebryakov Б.Р., Kobrina S.S., Eucberov V.F., Adam 0.,
Schreiber E«, Photochemical Transformatione of Glbberellin ky Derivatives* The Addition of Hydrogen-Donating Solvents to a strained Cyclohexenone. - Tetrahedron, 1972« 28» 14, p.3019-3826. 26. Kobrina N.S., Serebryakov Б.Р., Kucherov V.F., Adam G,, Voigt В., Different oxidation pathways-with various ito02
■typest Anomalous reaation with gibberellic acid. - Tetrahedron 1973, 29. 21, p.3*25-3429.
27. Serebryakov E.P., Kucherov V.F., The reaction of gibberelllns A1 and Ay with neutral Manganese dioxide. - Tetrahedron, 1976, 32, 19, p.2599-^601.
28. Serebryakov E.P., Sualova L.U., Kucherov V.F., Photosensitive protection of eaibosyl group and the synthesis of threi- O-me-
■ y'. '
thyl derivativ»» of gittere Hin ky - Tetrahedron, 1973. 3*. 3, p.345-351. '
29. Kalinovski A.I., Serebryakov E.P., Zolotarev B.W., Simolin A.V Kucherov V.F., Cbizhov O.S,, Itass spectrometry of kaurene derivatives. — I, The mass epeotra of some i-) —kauran—16-ols.-Org. Bass Spectroia., 1970, 3, 11, p.1393-1400.
30. Kalinovski A.I., Serebryakov E.P., Simolin A.V., Kucherov V.F. Chtzhov O.S., Mass Spectrometry of kaurene derivatives, II. Kaurenolides and related systems. Org.Mass Spectroa., 1971,
5, 1, p.33-39.
31. Voigt B,, Adam Q., Serebryakov E.P., Kobrina N.S., Intramolekulare Photosromatisierung eines ei,fl-ungesätilgten 3-Keto-Gib-berelllnderivats. - Z.Chem., 1975, 15, 3, 3.103-104.
32. Voigt B., Adam G., Kobrina-N.S., Serebryakov E.P., Uber die Darstellung von 3-epl—Gibbere1lin A^. - Z.Chem., 1977, 17, 10, S. 372-37*.
33. Voigt B., Adaa G,, Serebryakov E.P,, Säurekatalysierte Hydrolyse von 15cC-hydroxy-Gibberellinsäure {7—15)-lactoa. - 2, Chem., 1977, 17, 10, S.374-375.
34. Agnistikova V.M., Kobrlna N.S., Kucherov V.F., Serebryakov e.p,, Sobs aspects of the structure-activity relationship in
the field of gibberellill». - In: Biochemistry and Chemistry
of plant growth regulators (Edited by K.Schreiber, H.-K. Schütte and G.Sembdoer), Academy of Sciences of the GBR, Halle (Saale), G№, 197*, p.63-77.
Заказ № 115.Подписано к печати- I8/X-79r. Т-1Ш40. Ойьем 2.5 уч.-кзд.л. Тираж 150.
Ротапринт ОЭП Ш.^Са
