Исследование фотоиндуцированных оптических явлений в биосистемах методами лазерной спектроскопии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

=н ^рвпнэзии ьч оьзпнэзиъ ъшиигигпнэзпн. ьрьоииь 'ПЬвимии чииишириь

РСшадф ЬршфиОрпЦ

ииивмр Ш-ыгииьарь инизии

Р^пЬшйшЦи^ЬрпиЗ фтяп^Опт^д^шб ощт^ш^шС Ьрип^рОЬр^ ЬЬтшчпшгшЗс ¡.шяЬрщфС ииф^трпи^пифиуЬ йЬргщОЬрт!

и.04.21 - |доЬрищ|Ф

ЭДсОДш-йшрЬйшифЦшЦшб сфтп цз)п ШО Ьр ^ рЬЦОшбпф сфшшЦшй шиифбиШ)! ЬицдйшО шшЬОш^пипца)шО

иьаштьр

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РА ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЛАААЯН АСАТУР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОИНДУЦИРОВАННЫХ ОПТИЧЕСКИХ ЯВЛЕНИЙ В БИОСИСТЕМАХ МЕТОДАМИ ЛАЗЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

ьгьаиъ - 2000

А04.21- лазерная физика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Ереван - 2000

U2tuuiinujCigQ ЦштшрЦЬ!. t biR ф^Циф фшЦтцлЬиф рфлйтифй

t|bljinpnGfrl|ujj|i uiüpfmünu] L "Liuqbpuij|iQ SbfuGfiljuj" <Ши-пи5 QjiimuliuiG гфЦшфир' ä>(iq.-£iiup. qfrin. рЫ{йш0ги, ryigbCin

h.Q. RtuprupjnLGjtuG 'ПшгтпОшЦшй QGrtfidiutmuGbp1 $pq.-duip. q{iin. ryiljmnp

'Ч.и. ilnrinujwG $[iq.-tiujp. qjim. ryiljmnp

U. Q. RtupnipjniGjuiü Uniugujimiip IjujqüujljbpujnipjnLQ QUU 3>fiqhL|LUljiuG hbintuqninnipjni.GGbpti

Миифитил oe

'Tliu^muituOrupiniGp иш1шйш|т t« У » «o^j» 2000p. dunJQ « / * » bphtuGfi 'ПЬиииЦшО Яшйш^шршйЬ 0491Гшийихфтш1{шй hjnphprtfi bfiumnui: ЗишдЬй' 375025, bpLuiG, U. UiuGnilijuiG ф., 1, Ь^ПЯ: UinbGuihJnurupjLuGQ ЦшрЬф t бшйпршрш^Ь^ПЗ чршг^шршйпиЗ: UiuuGuiqhtfiwljiJuG lunphprtfi 3>fiq.-üiup. qfiin. pbl)Gui6ru

qtiinuiljujG ршртпщшр' 4.0). euiLiuQpuipjiuG

Ukqdujqtipo шпщрЦшд t' «¿L» «¿Ц>у»> 2000p.

Работа вьшолнена в ЕГУ: на кафедре квантовой электроники физического факультета и НПО "Лазерная Техника" Научный руководитель: кандидат физ.-мат. наук, доцент

И.Г. Арупонян

Официальные оппоненты: доктор физ.-мат. наук

П.С. Погосян доктор физ.-мат. наук С. Г. Арупонян

Ведущая организация: Институт физических исследований HAH РА Защита состоится "М&Л " 2000г. в " Л2~" часов

На заседании Специализированного Совета 049 При Ереванском Государственном Университете По адресу: 375025, Ереван, ул. А. Манукяна 1, ЕГУ С диссертацией можно ознакомщьс^в^библиоггеке ЕГУ.

Ученый секретарь (rfy ¿/у- - - ? ^ кандидат физ.-мат. наук Специализированного Сов^ш/^t^ J В.П. Калантарян Автореферат разослан "2 Г" X^j/yTfi " 2000г.

ЛГЩ О

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Интенсивное развитие в последние годы оптических методов исследований биологических объектов, связанное в первую очередь с существенным прогрессом в области разработок лазерных источников с широким спектром управляемых параметров излучения, привело к формированию биомедицинской оптики, как нового научного направления, которая включила в себя лазерную хирургию, низкоинтенсивную терапию, фотодинамическую терапию, лазерную диагностику заболеваний, визуализацию биообъектов, оптику биотканей и. т.д.

В связи с этим, в настоящее время актуально детальное исследование характера и закономерностей протекания оптических процессов в биологических тканях. Особый интерес вызывают исследования флуоресцентно-спектральных особенностей биотканей, обусловленные развитием фуоресцентно-диагностических методов биомедицинской оптики.

Благодаря оперативности, хорошей воспроизводимости результатов и, что особенно важно, высокой чувсвителъности к малым концентрациям исследуемого вещества, метод лазерного флуоресцентного анализа в последнее время стал активно применяться для решения широкого круга задач в области молекулярной биологии, цитологии, вирусологии, иммунологии, биофизики и биохимии мембран и т. д. В практической медицине указанный метод используется для диагностики важнейших физиологических процессов, для контроля за поступлением, превращением и выводом из организма лекарств, для диагностики большого числа заболеваний и т. д. В частности, в онкологии весьма актуальна задача неинвазивной оптической биопсии злокачественных опухолей на основе спектрально-флуоресцентного анализа. Однако проблема разработки эффективных оптико-диагностических методов и создания на их базе надежных клинических установок в полной мере еще не решена и требует активных исследований в данной области.

Уникальные достижения последних лет в области создания лазерных источников сверхкороткой длительности и развитие на их базе новых исследовательских методов, анализирующих дополнительные каналы взаимодействия свет-биообъект, инициируемых воздействием высокоинтенсивного лазерного излучения, открыли новые экспериментальные возможности для исследователей. Е настоящее время представляется весьма актуальной разработка и внедрение в практику более информативных лазерных спектроскопических методов исследования свойств биосистем, среди которых ключевую роль могут иметь нелинейно оптические методы. К примеру, использование многофотонных экспериментальных схем позволяет инициировать новые каналы возбуждения флуоресценции квантово-механически запрещенные правилами отбора в режиме однофотонного взаимодействия и, следовательно, добиться высокоселективного взаимодействия [1]. В многофотонных схемам возможно достижение высоких степеней локализации светового поля в требуемой области пространства и значительное снижение уровня фонов. В режиме нелинейного взаимодействия новые перспективы исследований биообъектов связаны также с анализом когерентны? эффектов генерации гармоник, преобразования частоты и т.д Указанные методы позволили экспериментально исследовать такое фундаментальное свойство живой природы как хиральность, то есп преимущественный выбор одного либо левого либо правого из двух возможных зеркальных изомеров одной и той же биомолекулы [2] Метод генерации второй гармоники (ГВГ) оказался эффективным I исследовании таких специфическим биосистем, как электрически ориентированные пурпурные мембранные пленки (ОПМП) и пленки Ленгмюра - Блоджета [3].

Между тем, нелинейные оптические эффекты в условиях неоднородной и сильно рассеивающей среды биотканей слабс изучены, что в настоящеее время является ограничительным фактором для их применения в задачах биомедицинской оптики.

Сформулированные выше нерешенные вопросы определили тем} и цели данной диссертационной работы.

Целью диссертационной работы является:

1. Создание лазерных источников с широким спектром управляемых выходных параметров для проведения спектрально-флуоресцентных исследований биотканей.

2. Исследование спектрального состава флуоресценции биотканей: определение вклада натуральных флуорофоров и инжектированных фотосенсибилизаторов.

3. Исследование физического механизма процесса тушения флуоресценции пиридиннуклеотидов (НАД*Н) в растворе и фотосенсибилизированных биотканях.

4. Исследование особенностей генерации второй гармоники в биотканях.

5. На основе проведенных исследований разработка комплекса линейно и нелинейно-оптических методов диагностики и терапии и изучение возможности их клинического применения в биомедицине.

Научная новизна.

1. Проведены первые экспериментальные исследования спектральных особенностей флуоресценции нормальной и опухолевой ткани при облучении на длинах волн 355 и 440нм. Состав и характерные формы спектров позволяют выделить пиридиннуклеотиды в качестве основных флуофоров. Получены значения параметра флуоресцентного контраста злокачественных и доброкачественных опухолей человека различной локализации, с применением фотосенсибилизирующего препарата флюренат. Показана эффективность применения флуоресцентного метода для оптической биопсии случаев опухолей желудочно-кишечного тракта и саркомы.

2. Впервые проведен экспериментальный и теоретический анализ явления тушения автофлуоресценции в биотканях. На основе рассчета эффективного радиуса переноса энергии электронного возбуждения в донор-акцепторных парах НАД*Н- флуоресцеин, НАД»Н - хлорин е6 а также исходя из экспериментальных результа-

тов выявлено формирование в биотканях концентрационных неоднородностей, обусловленных существованием центров локализации вводимых красителей. Показано влияние процесса переноса энергии на спектрально-однородное снижение уровня автофлуоресценции в фотосенсибилизированных тканях.

3. Впервые получены спектры флуоресценции фотосенсибилизаторов второго поколения хлорина е6 и 7л- тетрасульфофтало-цианина, при длине волны возбуждения ббОнм, расположенной в "оптическом окне" биотканей. Показана возможность лазерной биопсии в области максимальных оптически достигаемых глубин > 1см.

4. Предложен и на экспериментальной модели опухоли апробирован новый метод оптического диагнозирования, основанный на подборе лазерного возбуждения на двух длинах волн, для которых существенно различны коэффиценты поглощения биоткани. Данный метод дает возможность определить важный клинический параметр: проникновение опухоли вглубь тканей.

5. Впервые в оптически непрозрачных мышечных тканях показано наличие двухфотонной флуоресценции и каскадной двухэтапной фотодиссоциации туморотропных фотосенсибилизаторов при воздействии пикосекундного лазерного излучения.

6. Впервые получена пикосекундная генерация ГВГ (532нм) в различных мягких тканях животных. Продемонстрирована корреляция эффективности ГВГ с содержанием фибриллярного белка коллагена.

Практическая ценность работы.

Разработанная в диссертации экспериментальная техника может быть использована для решения широкого класса спектроскопических задач оптики.

Проведенные в диссертационной работе исследования расширяют возможности оптических методов в биомедицине. Разработанные линейно и нелинейно-оптические методы и методики

могут быть использованы в практических задачах диагностики и терапии.

Предложенная волоконно-оптическая лазерная система на базе твердотельного УАС:Нс1 лазера может применяться в клинике для диагностики ряда онкологических заболеваний.

Применение лазерного возбуждения в "окне прозрачности" биотканей расширяет диагностические возможности до максимальных оптически достигаемых глубин, а предложенный многочастотный лазерный метод диагностики опухолей с разрешением по глубине может применяться для более информативного и достоверного клинического диагнозирования.

Данные полученные из исследования двухквантовых процессов в биотканях могут бьггь использованы для разработки новых методов диагностики и терапии опухолей.

Метод ГВГ может применяться для исследования конфор-мационных переходов спираль-клубок а также для экспресс анализа состояния биотканей содержащих макроструктуры молекул коллагена.

Защищаемые положения.

1. Реализован и экспериментально исследован пикосекундный режим генерации лазера на красителе с распределенной обратной связью (РОС): на основе исследования спектральных и энергетических параметров излучения выявлены характерные особенности процесса. Предложены и апробированы новые схемы лазера на красителе с РОС, обеспечивающие непрерывную перестройку пикосекундного излучения в широкой спектральной области (^>560-650нм), что превышает в три раза известный ранее результат.

2. Методом лазерно-возбуждаемой флуоресценции исследованы спектрально-флуоресцентные особенности биотканей. При облучении на длине волны 355 и 440нм, выявлено различие между спектрами флуоресценции нормальной и опухолевой тканей.

Экспериментально продемонстрирована применимость флуоресцентной диагностики случаев злокачественных опухолей человека с применением фотосенсибилизирующего препарата флюренат. На основе проведенных исследований создана волоконно-оптическая система для флуоресцентного анализа биотканей на базе многочастотного твердотельного YAG.Nd лазера.

3. На основе экспериментального и теоретического анализа выявлены условия процесса тушения автофлуоресценции в биотканях Показано наличие влияния процесса переноса энергии электронного возбуждения на явление спектрально-однородного снижения уровня автофлуоресценции в фотосенсибилизированных тканях. Выявлено наличие в биотканях центров одновременной локализации вводимых фотосенсибилизаторов и пиридиннуклео-тидов.

4. Получены и исследованы спектры флуоресценции фотосенсибилизаторов второго поколения при возбуждении на длине волны ббОнм. На примере хлорина е6 и Zn- тетрасульфофталоцианина показана и о пробирована возможность диагностики тканей в области максимальных глубин проникновения оптического излучения. Предложен новый многочасготный лазерный метод оптической диагностики опухолей с разрешением по глубине. С использованием лазерного возбуждения на двух длинах волн (355 и ббОнм) осуществлена апробация метода на модели опухоли (фантом).

5. Экспериментально исследованы явления двухфотонной флуоресценции и каскадной фотодиссоциации туморотропных фотосенсибилизаторов: производной гематопорфирина (lll'll) и хлорина е6 в оптически непрозрачных биотканях, в поле пико-секундного лазерного излучения. Получена и исследована пико-секундная генерация второй гармоники (ГВГ) Х=532нм в различных мягких тканях животных. Выявлена корреляция эффективности ГВГ с содержанием белка коллагена образующей в биоткани молекулярные квазикристаллы. Показана возможность нелинейно-оптического метода ГВГ для исследования фазовых (конфор-мационных) переходов спираль-клубок молекул коллагена в тканях.

Апробация

Результаты работы докладывались автором на международных конференциях по лазерной физике и и нелинейной оптике (Ашгарак, Армения 1995, 1996 гг.), на симпозиуме черноморского региона по прикладному электромагнетизму (Мецово, Греция, 1996), на международном симпозиуме по биомедицинской оптике Photonix West / BiOS97 (Сан Хосе, США, 1997), на седьмом всемирном конгрессе по фотодинамической терапии (Нант, Франция, 1998), научных семинарах кафедр биофизики и квантовой электроники физического факультета ЕГУ. Разработанный в диссертации пикосекундный перестраиваемый лазер на красителе " ПикоРОС-2" на всесоюзной юбилейной выставке (0ктябрь-70, ВДНХ, 1987) экспонировался в составе удостоенною золотой медали пнкосекундного комплекса "ЛП-2" - " ПикоРОС-2".

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 25 работ, список которых приведен в конце автореферата.

Личный вклад соискателя в работах по теме диссертации состоит в создании лазерных источников и экспериментальных установок, в постановке и проведении экспериментальных исследований, обработке данных и интерпретации результатов.

Структура и объем работы.

Диссертационной работа состоит из трех глав, введения и заключения. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок, библиографию, включающую 135 наименований, и приложение ( всего 136 листа).

2. КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В введении обоснована актуальность темы, освещено современное состояние флуоресцентных и нелинейно-оптических

исследований в биомедицине и сформулирована цель диссертационной работы.

Первая глава посвящена экспериментальной технике, в том числе описаны схемы перестраиваемых источников лазерного излучения. Приведена схема многочастотного наносекундного УАС:Ы(1 лазера с модуляцией добротности и с дискретным переключением длин волн (т„ =15 не, Я =1.064, 1.318 и 1.338 мкм) и соответствующие вторая и третья гармоники (532, 660, 670, 440 и 355 нм). На основе исследования спектральных и энергетических особенностей лазера на красителе с РОС выявлены характерные особенности пикосекундного режима генерации. Проведены разработки лазера на красителе с РОС, обеспечивающие пикосекундную генерацию перестраиваемою излучения, а также собраны наносекундные лазерные источники которые, в совокупности, предназначены для создания на их базе экспериментальных установок с широким спектром исследовательских возможностей. В частности, в разработанных схемах РОС лазера экспериментально реализована непрерывная перестройка пикосекундного излучения в широкой спектральном диапазоне 560-650нм, одновременно достигнуто значительное снижение уровня фонового усиленного спонтанного излучения.

Для исследования режима нелинейного взаимодействия лазерного излучения с биообъектами естественно применение пико-фемтосекундных лазеров, позволяющих достигнуть значительных плотностей мощности возбуждающего излучения без радиационного повреждения образцов. В связи с этим была собрана схема пикосекундного УАС:И(1 лазер с пассивной модуляцией добротности и синхронизацией мод (т„=ЗЗпс, А = 1.06мкм), излучение на фундаментальной длине волны преобразовывалось в нелинейных кристаллах во вторую и третью гармоники ( Л=0.532мкм и Л =0.355мкм).

В завершение главы приведен пример применения перестраиваемых лазеров на красителе в задаче исследования

пленения излучения в плотной атомарной среде паров натрия. Исследован процесс девозбуждения электронного состояния методом индуцированного вращения плоскости поляризации. Измерены эффективные времена жизни возбужденных ЗР1/2, ЗР3/2 состояний натрия, и в температурном интервале 300-340°С показано наличие эффекта их укорочения от 1650 до 900нс.

Вторая глава посвящена флуоресцентно-спектральным исследованиям биотканей животных и человека.

Собственно система флуоресцентно-спектрального анализа состоит из импульсного лазерного источника с длиной волны излучения соответствующей решаемой задаче, оптического волновода, где центральное волокно служит для подвода излучения, а шесть центрально-симметрично расположенных волновода для сбора флуоресценции и комплекса монохроматор-ФЭУ-персональный компьютер для регистрации и обработки сигнала флуоресценции. Были исследованы спектры автофлуоресценции различных органов лабораторных крыс и саркомы 45. Показано наличие статистически подтверждаемых характерных различий в спектральном составе тканевой автофлуоресценции при возбуждении на длинах волн 355 и 440нм. С целью увеличения флуоресцентного контраста между нормальной и злокачественной тканями исследованы спектры флуоресценции при фотосенсибилизации организма препаратом флюренат (динатриевая соль флуоресцеина). С использованием волоконно-оптической системы исследована фармакокинетика препарата в различных здоровых органах и саркоме 45. Показано увеличение спектральных различий при контрастно-максимальном накоплении красителя в опухоли ( при оптимальном временном интервале между вводом препарата и спектрально-флуоресцентным анализом).

Значительный интерес представляет исследование физического механизма тушения тканевой автофлуоресценции, которая при возбуждении на длине волны 355нм в основном обусловлена

коферментами НАД«Н и НАДФ*Н. Индуктивно- резонансный перенос энергии электронного возбуждения может явиться одним из механизмов для объяснения наблюдаемого в ряде онкологических заболеваний понижения уровня автофлуоресценции в синей области спектра. Характеристическое расстояние переноса энергии электронного возбуждения определяется теоретическим

выражением [4]:

9000 1п10 к2

V = -/ Р„(Х) £а(Х) X* 6Х

128 я5 N п

где к2 - фактор, описывающий взаимную ориентацию в пространстве дипольных моментов переходов донора и акцептора, фл -квантовый выход донора в отсутствии акцептора, N - число Авогадро, п - показатель преломления среды, | Еа(Х) X* с!А. -

интеграл перекрывания, отражающий степень спектрального перекрывания между испусканием донора и поглощением акцептора. Здесь РЙ(Я) - нормированная интенсивность флуоресценции донора в заданном спектральном диапазоне, еа(Я,) - коэффицент экстинкции акцептора. Вычисляя интеграл перекрывания и подставляя значение фа=0.017 для водного раствора НАД«Н и к = 2/3 для случая хаотической ориентации дипольных моментов, получено !*<,=2нм для пары НАД*Н - хлорин е6 и 1^=2.9 нм для пары НАД«Н -флуоресцеин.

Экспериментальные результаты по тушению в растворе и биотканях показывают наличие спектрально однородного тушения флуоресценции НАД»Н при низких концентрациях вводимого акцептора. Тушение становится неоднородным, при повышении концентрации акцепторов, то есть с повышением роли радиационного перепоглощения. Спектрально-однородное тушение в биотканях указывает на наличие в ткани центров одновременной локализации на дистанциях < для молекул НАД*Н и вводимых в ткань молекул красителя.

Исследованы спектрально- флуоресцентные особенности биотканей человека и продемонстрированы возможности клинической

флуоресцентной диагностики злокачественных опухолей человека с применением УАС:№3+ твердотельного лазера и препарата флюренат. Определен оптимальный временной интервал между вводом препарата и флуоресцентным анализом и получены значения параметра флуоресцентного контраста К=Аоп/Анорм для опухолей различной локализации при возбуждении на длинах волн 355 и 440нм. Для злокачественных опухолей желудочно -кишечного тракта и саркомы мягких тканей параметр флуоресцентного контраста принимает максимальные значения КагЗ.8 (с точностью до 25%), что указывает на то, что определяемый при флуоресцентном исследовании параметр К может служить достаточно надежным критерием для обнаружения малигнизи-рованных участков.

Исследованы спектры флуоресценции фотосенсибилизаторов второго поколения хлорина е6 и 2л- тетрасульфофталоцианина. Выявлена фармакокинетика хлорина ев в различных органах лабораторных крыс и привитой саркомы 45. Показана возможность диагностики тканей в области максимальных оптически достигаемых глубин, при использовании возбуждения на длине волны 660нм. Предложен, и для экспериментальной модели опухоли продемонстрирован новый метод диагнозирования с разрешением по глубине, с использованием лазерного возбуждения на двух различных длинах волн.

В третьей главе содержатся результаты экспериментального исследования процессов каскадной фотодиссоциации и двух-фотонной флуоресценции туморотропных красителей, а также генерации второй оптической гармоники в биотканях. Исследована фотодиссоциация тумороторопных сенсибилизаторов ПГП и хлорина е6 при облучении сенсибилизированных биотканей пикосекундным излучением на длине волны 532нм. Контроль динамики фотодиссоциации проводился одновременным флуоресцентным сканированием, с использованием наносекунд-ного пробного излучения с длиной волны 355нм. Начальная

скорость уменьшения флуоресценции квадратично зависит от интенсивности облучения, что указывает на двухквантовый характер процесса фотодиссоциации. Значительное снижение уровня сигнала флуоресценции происходило в течении 1 мин и достигало уровня 40% от первоначального, что свидетельствует о эффективном фоторазрушении молекул красителя.

Зарегистрирована двухфотонная флуоресценция и получены спектры флуоресценции окрашенных ПГП и хлорином ее мышечных тканей при нелинейном возбуждении цугом пикосекундных импульсов на длине волны 1.06мкм. Локализации максимумов в спектрах флуоресценции красителей совпадают со случаем однофотонного возбуждения на длине волны 532нм. Продемонстрировано, что в случае двухфотонного возбуждения практически отсутствует флуоресцентный фон. Это можно объяснить более эффективным по сравнению с эндогенными пигментами двух-фотонным поглощением введенного красителя. При использовании наносекундного излучения той же самой длины волны и плотности энергии спектры флуоресценции не были зарегистрированы, вследствие того, что поперечное сечение двухфотоного поглощения на несколько порядков ниже, чем при пикосекундном облучении.

Экспериментально исследована возможность генерации второй гармоники в различных тканях животных и растений. При пикосекундном облучении зарегистрирована эффективная генерация в животных тканях солдержащих значительное количество (50-70%) белка коллагена образующей в ткани молекулярные квазикристаллы. Так как характерные размеры упорядоченных, анизотропных структур в фибрилярных тканях животных и человека, ( фибриллярные волокна имеют размеры: диаметр » 3 мкм, длина 20-50 мкм), то есть имеют порядок длины когерентности, то в указанных тканевых структурах обеспечивается условие для эффективной ГВГ. Для оценки коэффицента нелинейности второго порядка (1 был использован прозрачный двулучепреломляющий образец фасции толщиной Ь=90мкм. Определялось отношение А= 12(0/ 12юК№ , где 12ш -

гатенсивность ВГ при нормальном падении на образец, I^kdp " гатенсивность ВГ в кристалле KDP длиной LKDp= Змм (взаимодействие оое) при той же интенсивности накачки, где выражения кдя 1М взяты из [6]. Подставляя экспериментально найденное шачение А= 9х10г4 , в сравнительное выражение для коэффи-}ентов нелинейности:

el = dKDPV Ап2/ HjKDP n,KDP L sin X)

где x = 2nL (n2-n,)/ > а также полагая sinx/x « 1, что имеет место в тонких образцах, получено значение d=0.3 d^p .

Исследована зависимость сигнала ГВГ от температуры для эбразца ткани сухожилия. В интервале температур 59-64°С, соответствующей температуре конформационного перехода спираль-клубок молекул каллвгена, зарегистрировано необратимое резкое уменьшение и срыв сигнала ГВГ.

В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы:

1. Реализован и экспериментально исследован пикосекундный режим генерации лазера на красителе с распределенной обратной связью (РОС): на основе исследования спектральных и энергетических параметров излучения выявлены характерные особенности процесса. Предложены и апробированы новые схемы РОС лазера, обеспечивающие перестройку пикосекундного излучения в широкой спектральной области.

2. С применением перестраиваемых лазеров на красителе исследован процесс девозбуждения электронного состояния в плотных парах атомарного натрия методом индуцированного вращения плоскости поляризации. Измерены эффективные времена жизни возбужденных ЗР1/2, ЗР3/2 состояний натрия и в температурном интервале 300-340°С показано наличие эффекта их укорочения от 1650 до 900нс.

3. Собрана лазерно-волоконная установка, на которой исследованы спектральные особенности нормальных и опухолевых биотканей методом лазером индуцированной флуоресценции без и при фотосенсибилизации туморотропными красителями.

4. На основе экспериментального и теоретического анализа выявлены физические аспекты процесса тушения автофлуоресценции в биотканях. Выявлено влияние процесса переноса энергии электронного возбуждения на эффект снижения уровня автофлуоресценции в фотосенсибилизорованных тканях. Анализ переноса энергии позволяет оценить межмолекулярные расстояния и выявить наличие внутритканевых центров локализаций.

5. Продемонстрирована эффективность флуоресцентной диагностики для ряда злокачественных опухолей человека в клинических условиях с помощью УАС:Кс13+ твердотельного лазера и фото-сенсибилизирующего препарата флюренат. Исследованы спектры флуоресценции фотосенсибилизаторов второго поколения хлорина е6 и 2л тетрасульфофталоцианина, при этом показана возможность диагностики тканей в области максимальных оптически достигаемых глубин. Предложен, и на модели опухоли продемонстрирован новый метод диагнозирования с разрешением по глубине, с одновременным использованием лазерного возбуждения на различных длинах волн.

6. Исследована двухфотонная флуоресценция и каскадная фотодиссоциация фотосенсибилизаторов в оптически непрозрачных мышечных тканях под действием пикосекундного излучения.

7. Получена пикосекундная генерация второй оптической гармоники 532нм в различных мягких тканях животных. Выявлена корреляция эффективности ГВГ с содержанием белка каллогена, образующей в ткани молекулярные квазикристаллы. Исследована зависимость сигнала ГВГ от температуры. Показаны возможности метода ГВГ для исследования конформационных переходов спираль-клубок молекул каллогена в тканях .

Публикации по теме диссертации

1. Лалаян А.А, Папазян Т.А, Саркисян Е.М. "Перестраиваемый лазер с динамической распределенной обратной связью", авторское свидетельство о изобретении СССР #1604126 (1986)

2. Папазян Т.А, Саркисян С.М., Погосян Э.М., Лалаян АА, Мана-сян Г.С. "Перестраиваемый лазер с динамической распределенной обратной связью", авторское свидетельство о изобретении СССР #1507164 (1987)

3. Арутюнян В.М., Арамян АР.( Ишханян С.П., Лалаян АА, Папазян ТА "Исследование времен релаксации возбужденных 3Pnz^2 уровней в плотных парах атомарного поляриметрическим методом". Изв. АН. Арм. ССР, Физика, т. 21, В2, cip.101-103, (1986)

4. Лалаян АА, Папазян Т.А, Манасян Г.С., Погосян Э.М., Саркисян С.М., Снгрян Е.А "Перестраиваемый пикосекундный лазер на красителе "Пико - РОС-2", Квантовая Электроника, Т. 16, В1, (1989)

5. Лалаян АА, Папазян ТА, Саркисян С.М. "Пикосекундный РОС лазер с широкой областью перестройки", Изв. АН. Арм. ССР, Физика, т. 26, В1, стр.27-32, (1991)

6. Lalaian A.A., Hovanessian V.A. "Solid state laser system for fluorescence diagnosis of human malignant tumors", Book of Abstracts, Int. Conference on Lasers'94, Quebec, Canada, (1994)

7. Оганесян B.A, Лалаян АА, Айдинян Л.Э." Механизмы тушения автофлуоресценции тканей сенсибилизированных туморотроп-ными красителями", Биофизика, Т.40, В.6, стр. 1308-1312, (1995)

8. Hovanessian V.A., Lalayan A A "Nonlinear decompositions of tumor -seeking dyes in tissue upon picosecond laser excitation", Book of Abstracts, Int. Conference on Lasers'95, FF3, Charleston, USA (1995)

9. Лалаян АА, Оганесян B.A " Применение нелинейно-возбуждаемых флуоресценции и фоторазрушения тканей в диагностике и терапии опухолей". Сборник трудов конференции "Лазерная физика"-95", стр. 120-124, Аштарак,(1995)

10. Hovanessian V.A., Lalaian A.A., Aidinian " Chlorin es as photosensitizer for fluorescence detection of malignant tumors", Book of Abstracts, Int. Conference on Lasers'95, FF4, Charleston, USA, (1995)

И. Айдинян Л.Э., Галстян AM., Лалаян A.A., Оганесян В.А, Саакян AM. "Спектрально- флуоресцентные исследования злокачественных опухолей молочной железы и желудочно-кишечного тракта", Медицинская наука Армении, В. 3-4, стр. 98-103, (1996).

12. Hovanessian V.A., Lalaian А.А., Gyolkhandanian G. "Laser fluorescence investigation of chlorin e6pharmacokinetics", SPIE Proc.Vol. 2924 pp. 125129, (1996)

13. Yova D., Halkiotis K.N., Ouzunouglou N.K., Hovanessian V.A., Lalaian A.A. "Laser- inducid fluorescence of tissue by tumor- seeking dyes", Proc. of Int. Conference Lasers -96, pp. 41-49, Ashtarak, Armenia, (1996)

14. Hovanessian V.A., Lalaian A.A "Second harmonic generation in bioflber-containing tissues" Proc. of Int. Conference Lasers -96, pp. 107- 109, Portland, USA, (1996)

15. Hovanessian V.A., Lalaian A A "Application of multufrequency solid state laser for biomedicine", Proc. of Trans Black Sea Region Symposium on Applied Electromagnetism, BISY4, Metsovo, Greece, (1996)

16. Lalaian A.A., Hovanessian V.A. "Laser system with chlorin e6 for fluorescence diagnosis and photodynamic therapy of tumors" Proc. of Trans Black Sea Region Symposium on Applied Electromagnetism, BISY5, Metsovo, Greece, (1996)

17. Hovanessian V.A., Lalayan A.A. "Second harmonic generation in biological tissues", Book of Abstracts, 6 Int. conference on lasers application in life scienses, TL7-3, Jena, Germany, (1996)

18. Hovanessian V.A, Lalayan A.A. "Nonlinear decompositions and two-photon fluorescence of molecules in sensitized tissue", Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy VI, Thomas Dougherty; Ed., SPIE Vol. 2972, p. 179-182, (1997)

19. Aidinian L.E., Lalayan A.A., Galstian, H.M., "Multufrequency Nd:YAG Laserfor fluorescence diagnosis of human cancer", Opto-Contact: Workshop on Technology Transfers, Start-Up Opportunities,and Strategic Alliances, Robert J. Corriveau; M.J. Soileau; Michel Auger; Eds., Proc. SPIE Vol. 3414, p. 11-16, (1998)

20. Lalayan A.A., Aidinian L.E., " Fluorescent Sensitizers Detection in Different Depth of Tissue", Book of Abstracts , 7th Congress of International Photodynamic Association, RC205, Nantes, France, (1998)

21. A Lalayan, I. Harutyunyan "Laser Fluorescence Diagnosis of Cancer in Optical Depth by Methalophtalocyanines", Book of Abstracts, 5 ISABC, p.308, Corfu, Greece, (1999)

22. Harutyunyan I.G, HarutyunyanV.M., Ishkhanyan S.P., Lalayan A.A, Papa-2yanT.A "Applications of phenomena of polarization plane induced change ", Book of Abstracts, SPIE's 44th Annual Meeting, 3754-35, Denver, (1999)

23. A. Lalayan, I. Harutyunyan " Optical harmonic generation by native bio-polimers", Book of Abstracts, SPIE's 44th Annual Meeting, 3796-44, Denver, (1999)

24. A. Lalayan, I. Harutyunyan "Depth Resolved Optical Biopsy by Multufrequency Nd:YAG Laser ", Tech. prog., EOS/SPIE Int. Conf. On Industrial Lasers and Inspection, p.25, Munich, Germany, (1999)

25. Lalayan A.A., Harutyunyan I.G., «Picosecond distributedfeedback dye laser in near infrared and visible spectral range», Int. Conf. on LASERS'99, Quebec, Canada, TG8, (1999)

Цитированная литература

1. Тихонов E.A., Шпак M.T., Нелинейные оптические процессы в органических соединениях. Киев, "Наукова Думка", 1979.

2. Коротеев Н.И. Новые схемы нелинейной оптической спектроскопии растворов хиральных биологических макромолекул. ЖЭТФ, Т.106, В. 5(11), с. 1260-1277, 1994.

3. Sharkov A.,Gillbro Т. Second harmonic generation in oriented purple membrane films under picosecond light excitation. Thin Solid Films,Vol.202, pp. 9-14,1991.

4. Лакович Д Основы флуоресцентной спекгроскопии.М. Мир, 1986.

5. Zemike F., Midwinter J., Applied Nonlinear Optics, John Wiley, New York, 1973

" P|inhujüujl|ujpqbpnLLÍ фтлгфйфи^дфид ои)1лЬ^ш1|Шй bpLrujpGbph hbunuqntnruún luiqbpuijhG uu|bljinpnuljnuj|iuijb йЬрпг^йЬрпЦ. " ииФПФиаьр

UmbGujfriiuni.pjniûD йЩ1рЦш0 t pfinhiuCiujl|ujpqbpni.i5 фп1лп|1йгуи1(д1|ш< оицпЭДшЦшй bpUujpübph hbinuiqninûiuûo lujqbpuijhü ^uninpbugbOghuijh, |iQ¿uibi Guilt n¿ qóiuj[iü ui4bljinpnuL|nu{|iuijh йЬрпг^йЬрпЦ: U2fuujinujü£ruú ишшд1|Ь[ bû hbrnLjuiL uiprijntüßübpo.

bptul)uiQiugilbi. Li hbmmqnui4bL t GbpljujQjrupujjliD, ЬЬшшгцирб рш2|и(ш0 Цшицш Lmqbph u)hljnilujjpljjuiûui|)iG qhGbpuigliuijh пЬфЗо: lluibliinpaiL Ь. tûbpqbmhl pûnipiuqpbph hbuiiuqnimluiû hfiúuiü фш Ú2iu44bL ЬО luiqbpiujhû nbqnûuiinnp|i ûn| ufubùuiûbp, npnüg шщшЬпЦпиЗ bû juijû uujbljinpuJL infiprujpnui ЦЬршцирЦш 6umujquijpruú' uMrHliujpljjujGujjhG inLnnriLpjuiúp:

Rbuiiuqnmilbi. Ьй ¿шрпршЦ L uinnrip 1|Ьйг)шйш1^шй hjni.uiluiô£ûbp[i ищЬЦтрш huuiljnLpjnLúübpD' шпшйд ubGuhpfiÜiquigtiuujfi U úbpliuuújrupujjfiú ubGuhpfiiMu. innpObph uinIjujjnLpjiuG iniujúiüúúbpruú: Srnjg t трфиб фиптрЬидЬйииифй úbpnql IjlipimbLfinipjiuGo úiupiyii. ¿uipnpuilj runrugfiGbph ЦфОЬЦшЦшй ощш(1Цш1(ш1 ш^ллпрп2йшО ОицшшшЦпЦ uifiGniîUipùGiJUjhû Nd:YAG |iuqbpfi U фипшрЬОшь фпшпиЬйи[1р|1^шд[1пй щрЬщшршиф hiuúuimbri 1фршшЗшй (КийшйшЦ:

Rbinujqninilbi. t t|bl|uipnQiujhü qpqnúmü tûbpqfiuijh фп|ишОдйшй bpUujp Г|п0пр-ш1)дь1ц1ппр mitfinit [niórujpmú U pfinhjruuiliuógruú: Snijg t шрЦшб iujr)uj)iu úbfuuiQfiqúh lurcliiujnLßjruüG иЬйфрЬФчшдФ^ hjruuLlujágGbpruú, |ilJ¿h üfigngn ф^^шЦшО ûbL)ûiupuuGni.pjnLÛ t uinuigbL ¿uipnpuilj runnigßGbpruü шфлг фишпрЬидЬйд|1Ш][1 huiútuubn GiluiqbgúuiG hiujinGh bplinLjpQ:

Pfinhjniu^ôfiûbpnuî hbmuqnimlbL bû fainpfiû ее U дЬй1|-1пЬ1пршиги|.фпф1ли ingfiuiGfiG' ЬрЦрпрп. ubpGrtfi фтлпиЬйи|1рЬ|Мш1лпрСЬрЬ uu|bljmpiu|. hiuuiljni pjruüübpQ.- 8пцд t трЦшд Lwqbpuijhû iufuinnpn2ÚujQ йЬрпгф tifipujnrupjui hümpm4npnipjniGD úbpáúuil|bpünij|iujjhú оицт^илцЬи ИшишйЬф funprupjiu ифрпцрпиЗ:

ипшгшр^Цшб U runrugpfi únr>b[fi htudiup фпрйш^фид t ßuw ЬршЦшбд hjnpiupjtuû ш[и1лпрп2<3шй ûnp ùbpnrç, про hfiúGiJujá t iiuqbpuijfiG 6iunuiqiujpúiu ЬрЦт тшррЬр mjjißh bpljuiprupjni.GGbph úhuidtuúuiúuil) oqinuiqnpótfuiG Црш:

Uljiuûtuihû hjnш^шйрйbpnlú ицЬЦп1|ш]р1ишйш](1й |uiqbpiujhG ôiunuiqujjpùui iquijdujGübpniú qpiuGgt|bL Ьй runrugßiujhü фптпиЬОиЬрММштпрйЬрЬ фптг r^ungfiuigfiuJjfi L Ьр^фпшпО фиптрЬидЬйд|шцЬ bpbnLjpGbpQ:

Siuppbp фшфгиЦ ЦЬйг^шйш1|шй phnhjruut{uiógúbpruú uiniugtjbL t 1.064 úl] wtfiph bpl|iupnipjujúp uifiliniliujplijujGujjfrü Lwqbpiujiiû tíujnuiqiujpúuiú bpltpnp hmpiînû|ilih qbûbpuighui: Siujg t трЦшб, np bpL(pnpq ИшрйпйЬЦЬ ОЬршдЬш]

t hjmuiluJôgnLÙ ljiu¡nqbO uuj|iinuljnLgfi ¿шйш^д: