Исследование низкотемпературной динамики белков методом выжигания провалов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ СПЕКТРОСКОПИИ

На правах рукописи

ПОНКРАТОВ Владимир Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ДИНАМИКИ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ВЫЖИГАНИЯ ПРОВАЛОВ

Специальность 01.04.05 - Оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Троицк 2005 г.

Работа выполнена в Институте спектроскопии Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Харламов Борис Михайлович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Ведущая организация: Научно-технологический центр уникального

приборостроения РАН

Защита состоится « 23 » июня 2005 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета 002.014.01 при Институте спектроскопии РАН по адресу: 142190, Московская обл., г. Троицк, Институт спектроскопии РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института спектроскопии РАН

КОРОТАЕВ Олег Николаевич

кандидат физико-математических наук

ТЕРПУГОВ Евгений Львович

Автореферат разослан 2005 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор физ.- мат. наук

Попова М.Н.

В последние десятилетия интерес к исследованиям биологических объектов возрос не только в связи с развитием и потребностями медицины и биотехнологии, но и потому, что эти объекты обладают уникальными физическими и химическими свойствами.

Изучение структуры белков выявило, что они обладают как упорядоченной трехмерной структурой, так и определенной степенью беспорядка, проявляющегося, в частности, в существовании множества конформационных состояний [1]. Эти состояния имеют сходную структуру, но имеют небольшие отличия в положении атомов. Переходы между конформационными состояниями, т.е. динамические процессы в белках определяются структурой их потенциальной поверхности, или энергетическим ландшафтом. Исследование релаксационных процессов в белковых растворах при физиологических температурах выявило много общего между динамикой белков и динамикой стеклующихся жидкостей [2].

Исследование термодинамических и диэлектрических характеристик белков при криогенных температурах показало, что белки проявляют свойства низкотемпературных стекол и при этих температурах [3]. Одним из свойств белков при низких температурах, делающим их похожими на стекла, является проявление в них релаксационных процессов с чрезвычайно широким спектромвременрелаксации . Для исследования релаксационных процессов в белках при низких температурах активно используются спектроскопические методы. Среди них можно выделить метод выжигания стабильных спектральных провалов [4], получивший широкое распространение при изучении сравнительно медленных релаксационных процессов (как правило, в шкале времен от десятков секунд до недель и даже месяцев) путем измерения так называемого эффекта спектральной диффузии (СД) [5,6]. В оптических спектрах этот эффект проявляется в уширении с течением времени спектрального провала, выжженного в неоднородно уширенном контуре поглощения хромофора. Предполагается, что в белке СД

обусловлена "прыжками" частоты поглощения хромофора, вызванными переходами между его конформационными состояниями [7]. Таким образом, измерение СД с помощью метода выжигания провала позволяет исследовать релаксационные процессы в белках при гелиевых температурах с высокой чувствительностью во временной шкале, недоступной другим методам.

Для теоретического описания динамики белка важное значение имеет ряд физических аспектов, связанных со свойствами самого белка и его взаимодействием с растворителем, кратко перечисленных ниже. При физиологических температурах существенное влияние на кинетические и динамические свойства белков оказывает растворитель [8]. Исследование СД при низких температурах позволяет разделить вклад от различных конформационных движений, связанных с взаимодействием белок-растворитель. Сравнительные исследования на молекулах белка, внедренных в разные растворители, позволяют, в принципе, разделить вклад в конформационную динамику, вносимый собственно молекулой белка и растворителем, исследовать влияние специфических свойств растворителя на конформационную динамику белка. Изучение механизмов влияния растворителя на СД в белках при низких температурах является одним из методов решения этой задачи. В представленной работе начаты систематические сравнительные исследования СД в белках, внедренных в разные растворители, их результаты сопоставляются с результатами исследования СД на тех же хромофорах, внедренных в «чистые» растворители.

Второй аспект, определяющий конформационную динамику в белке, это иерархическая организация конформационных состояний и коллективное движение отдельных структурных элементов белка. Наличие множества конформационных состояний в белке и взаимодействие белка с растворителем приводят к неоднородному уширению в оптических спектрах. Конформационная динамика в белках отражается как в спектральной

диффузии частоты поглощения хромофора, так и в трансформации всей оптической полосы поглощения. В связи с этим изучение связи между неоднородным уширением и спектральной диффузией представляет собой также актуальную задачу и может помочь при разработке теоретических моделей, ориентированных на описание конформационной динамики в белках на основе более общего подхода, связанного с понятием энергетического ландшафта. В представленной работе начато изучение этой связи и обнаружены явные корреляции между СД и неоднородным уширением.

Коллективный характер конформационных движений в белке является важной особенностью его функциональных свойств. Функциональные свойства белка реализуются только при определенной структурной организации белка. В связи с этим изучение связи структуры белка с характером релаксационных процессов в нем является также исключительно важной задачей. В представленной работе начаты систематические исследования СД в белке, находящемся в разных структурных состояниях.

Основные задачи, поставленные в диссертационной работе связаны с исследованием описанных выше проблем.

Основные задачи работы

1. Проведение экспериментальных исследований релаксационных процессов в твердых белковых растворах при низких температурах с целью выявления механизмов влияния стеклующейся матрицы на СД.

2. Проведение сравнительных исследования СД в белках, находящихся в разных структурных состояниях.

3. Экспериментальные исследования специфических особенностей энергетического ландшафта в белках в области малых энергий.

Исследование формы провала, уширенного спектральной диффузией, с целью проверки предсказаний имеющихся теоретических моделей низкотемпературных релаксаций в белках.

Научная новизна результатов

1. Установлено, что спектральная диффузия в твердых белковых растворах в значительной степени определяется релаксационными процессами в стеклообразной матрице. Обнаружена связь между температурой стеклования растворителя и пространственной структурой белка с одной стороны, и характеристиками СД с другой стороны.

2. Обнаружена и интерпретирована корреляция между величиной неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора в белке и скоростью диффузионного уширения провала. Предложена модель неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора, отражающая структурное состояние белка.

3. В исследуемых белках экспериментально обнаружены специфические энергетические барьеры, предположительно связанные с участием водородных связей в движении аминокислот между конформационными состояниями.

4. Обнаружены изменения формы спектрального провала в ходе тепловых циклов. В качестве возможной причины наблюдаемого эффекта предложена гипотеза, связывающая эти изменения с дисперсией скорости спектральной диффузии в образце.

Практическая значимость

1. Обнаруженное влияние релаксационных процессов в стеклообразной матрице на спектральную диффузию в твердых

белковых растворах существенно меняет представление о низкотемпературной динамике в белках.

2. Установленная корреляция между спектральной диффузией и структурным состоянием белка дает важную информацию для построения более совершенной теории релаксационных процессов в белках и других неупорядоченных и частично упорядоченных системах.

3. Характеристики обнаруженных в исследованных белках специфических энергетических барьеров являются исключительно важным источником информации при анализе структуры этих белков и конформационных движений в них.

Положения, выносимые на защиту

1. Показано, что спектральная диффузия в твердых растворах белков с гем-группой в аморфных матрицах при низких температурах определяется как динамическими свойствами самого белка, так и динамическими процессами в матрице.

2. Обнаруженные специфические энергетические барьеры являются проявлением устойчивых характерных особенностей структуры конформационного пространства исследованных белков, играющих существенную роль в их динамике.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертационной работы были доложены на собрании немецкого научного общества Sonder Forschung Bereich 533 (2004 г.) во Фрайзинге (Германия) и международной конференции Dynamics of Proteins (2004 г.) во Фрайзинге (Германия), а также на научных семинарах Института спектроскопии РАН и Технического Университета Мюнхена. Список печатных работ по теме диссертации приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, списка рисунков, таблиц, литературы и раздела благодарностей. Диссертация содержит 100 страниц, включая 21 рисунок и 3 таблицы. Библиография содержит 118 наименований.

Краткое содержание работы Во Введении дана общая характеристика работы, обоснованы актуальность темы, научная и практическая ценность работы, сформулированы основные цели исследования, описана структура диссертационной работы.

Глава 1.

В данной главе рассмотрены основные модели низкотемпературной динамики в неупорядоченных средах, которые можно разделить на два класса: а) модель ДУС и б) модель диффузионного движения в фазовом пространстве конформационных состояний белка.

В пункте 1.1 представлен краткий обзор стандартной модели ДУС. В рамках данной модели низкотемпературные свойства неупорядоченной среды связаны с нестабильными конфигурациями групп атомов, переходы между которыми моделируются туннелированием в двухъямном потенциале с энергией расщепления нижайших уровней етс = ае = -Ja2 + Д20, где А

параметр асимметрии и A„=hQe'x— матричный элемент туннелирования. Макроскопические свойства низкотемпературных стекол определяются ансамблем ДУС, поэтому важное значение имеет форма функции распределения В стандартной модели ДУС используется простейший

закон распределения

В пункте 1.2 рассмотрено явление спектральной диффузии в оптическом спектре хромофора, внедренного в неупорядоченную матрицу, которое возникает за счет взаимодействия его с ансамблем ДУС. Диффузионное ядро имеет контур Лоренца при условиях: а) диполь-дипольного взаимодействия хромофор-ДУС, б) равномерного хаотического пространственного распределения ДУС и в) отсутствия сильной дисперсии взаимодействия хромофор-ДУС [11]. В стеклах наблюдаются равновесные (флуктуационные) и неравновесные (релаксационные) процессы. Для сценария быстрого охлаждения образца модель ДУС позволяет описывать вклад неравновесных процессов в СД за счет введения одного дополнительного параметра — «эффективной температуры», характеризующей неравновесную заселенность ДУС сразу после охлаждения. Для однофононного механизма релаксаций ДУС в рамках стандартных предположений ширина диффузионного ядра равновесной и неравновесной компонент СД выражаются формулами:

где - время, необходимое для выжигания и регистрации провала, - время наблюдения уширения провала после момента выжигания и - время, прошедшее от момента охлаждения до момента выжигания (время старения),

- эффективная температура неравновесных ДУС Релаксационный процесс связан с диссипацией энергии неравновесных ДУС, поэтому неравновесная компонента уменьшается с увеличением времени старения /д. Флуктуационные процессы вызваны «термализованными» ДУС, энергия которых в среднем совпадает с тепловой энергией фононной подсистемы. При основной вклад в спектральную

диффузию вносят релаксационные процессы.

В пункте 1.3 представлен краткий обзор экспериментальных результатов по исследованию спектральной диффузии в полимерах и белках при

/

(1)

гелиевых температурах, которые не могут быть объяснены в рамках модели ДУС: а) на основе стандартной функции распределения Р(д,д|))0с1/д() и б) для характеристик взаимодействия хромофор-ДУС, предложенных в [11]. Среди обнаруженных отклонений можно выделить степенную зависимость СД [13] и нелоренцеву форму провала [14].

В пункте 1.4 представлен другой концептуальный подход к явлению спектральной диффузии, которая описывается как диффузионный процесс в частотной области. В данной модели вероятность обнаружить частоту поглощения в момент времени / в заданном положении V имеет гауссову функцию распределения, которая определяет контур диффузионного ядра. Модель предсказывает степенную зависимость диффузионного уширения от времени, которая связана с неоднородным уширением соотношением [15]:

где - величина неоднородного уширения, - корреляционное время.

В пункте 1.5 представлена модель, связывающая диффузионное движение по одномерной случайной траектории в фазовом пространстве конформационных состояний белка с диффузионным процессом в частотной области. Механизм двойного диффузионного процесса приводит к степенной зависимости диффузионного уширения с показателем степени

Завершает первуюглаву (пункт 1.6) краткое сравнение предсказаний модели ДУС и диффузионной модели.

Глава 2.

Данная глава посвящена описанию экспериментальной установки и методик исследования процессов релаксации в белках, основанных на методе выжигания провалов.

В пункте 2.1 изложены основы метода выжигания стабильных спектральных провалов в неоднородно уширенном контуре поглощения белка, содержащего модифицированный хромофор. 10

В пункте 2.2 представлена стандартная методика изучения медленных флуктуационных и релаксационных процессов во временной шкале, основанная на методе выжигания провала.

В пункте 2.3 рассмотрен другой метод изучения СД, основанный на ее ускорении с помощью циклического изменения температуры. Активное температурное воздействие на образец оказывается мощным дополнительным средством исследования энергетического ландшафта и релаксационных процессов в белках.

В пункте 2.4 изложены методики исследования стабильности выжженых спектральных провалов.

Пункт 2.5 содержит краткие выводы.

Глава 3

В Главе 3 рассмотрены спектроскопические свойства модифицированного белка цитохром-с в различных состояниях в

стеклующихся матрицах. Представлены основные экспериментальные результаты исследований флуктуационных и релаксационных процессов, а также низкотемпературных реакций при гелиевых температурах для белка с различной пространственной структурой в сахарной матрице (трехалоза) и в смеси глицерин/вода.

Пункт 3.1. Важная информация о конформационных состояниях и степени структурного беспорядка в белках содержится в оптических спектрах. Взаимодействие хромофора белка с ближайшим окружением приводит к неоднородному уширению его спектра за счет различных конформационных положений аминокислот белка. В работе предложена простая модель, связывающая среднеквадратичное отклонение частоты хромофора со среднеквадратичным отклонением атомов в белке от их среднего положения:

1 Модификация заключается в замещении центрального атома железа гем-группы на 2 протона.

Индекс с означает вклад от конформационных состояний без учета динамической составляющей. В белках „замораживание" динамической составляющей <х2> происходит при температуре стеклования растворителя Tg. В гармоническом приближении получается зависимость ДvHeoOT. ~ .

Экспериментально наблюдаемое увеличение неоднородного уширения в белке, помещенном в сахарную матрицу (vH<:oaH. 250 см"1) по сравнению со случаем, когда в качестве матрицы использовалась смесь глицерин/вода (уиеодн.ю 150 см"1), может быть объяснено более высокой температурой стеклования (Tg « 330 К и Tg « 180 К соответственно).

В денатурированном состоянии белка неоднородное уширение возрастает по сравнению с белком с компактной структурой вследствие доступных конформационных состояний.

В пункте 3.2 представлены основные результаты исследования СД в различных состояниях белка, замороженного в стеклующихся матрицах. На Рис.1а показана временная зависимость диффузионного уширения провалов для белка в денатурированном состоянии, измеренная при В

данном случае наблюдаются: а) логарифмическая зависимость равновесной СД от времени 1т б) эффект старения, вызванный релаксационными процессами, вклад которых уменьшается с ростом t„. При денатурации белка происходит разрушение сгокомпактнойструктуры , и хромофор белка становится более чувствителен к процессам, протекающих в стеклообразной матрице. Аппроксимация данных по СД для денатурированного белка была проведена с использованием формул (1). Полученные значения эффективной температуры ТедгН скорости диффузионного уширеиия провала А совпадают с результатами для примесного стекла (смесь глицерин/вода) [17], свидетельствуя о том, что в денатурированном состоянии белка основной вклад в СД вносит низкотемпературная динамика матрицы.

^ 0,6-

и

< 0,4-

0,0

0,2-

1.2 1,0 0,8

10

100

1000 «ООО

глицерин/вода и—.........—........г—.........—

^/мин

б)

10 100 1000 10000 ^/мин

Рис.1 Временная зависимость уширения провалов для Н;-Сс при 4.2 К:

а) Денатурированное состояние. В качестве растворителя использовалась

смесь глицерин/вода с большой концентрацией химического депатуранта.

б) функциональное состояние, когда компактная структура белка сохранена.

Растворитель - смесь глицерин/вода.

Тонкие сплошные линии - модельные кривые, рассчитанные с

использованием неравновесной модели ДУС (см. текст).

На Рис.16 показана временная зависимость величины вклада СД в ширину провала от времени для белка в функциональном состоянии, когда хромофор экранирован от непосредственного влияния матрицы компактно расположенными вокруг него аминокислотами. В этом случае наблюдается: а) отклонение СД от логарифмической зависимости, б) значительное уменьшение скорости СД по отношению к денатурированному состоянию. Анализ показал, что аппроксимация данных по СД для белка в функциональном состоянии может быть выполнена в рамках модели ДУС с использованием модифицированной функции распределения

функции распределения приводит к корневой зависимости СД от времени. На коротком временном интервале степенная функция является аппроксимацией более сложной функциональной зависимости СД, которая может быть описана гауссовым распределением по параметру туннелирования «Аномальная» часть ансамбля ДУС явно связана с белком. Белки имеют сложную потенциальную поверхность, на которой

Дополнительный член в модифицированной

вполне возможно образование ДУС с нестандартной функцией распределения [18]. Возможной зоной образования специфических ДУС является также граница раздела белка и растворителя, насыщенная водородными связями. В то же время, значительная часть СД и для белка в функциональном состоянии связана с динамикой растворителя. Об этом, в частности, свидетельствует тот факт, что для белка и в функциональном и в денатурированном состояниях значение параметра совпадает с его значением в стекле.

Таким образом, экспериментальные данные по временной зависимости СД в белке могут быть успешно интерпретированы в рамках модели ДУС. К достоинствам модели ДУС можно отнести ее простоту, способность описывать как равновесную, так и неравновесную СД при минимальном наборе параметров, имеющих простой физический смысл. Недостатками модели являются ее чисто феноменологический характер и наличие температурных ограничений на ее применимость. В частности, модель явно не может быть использована при

гп|...................... ■ ........1— .........I...................I-1

10 100 1000 10000 10 100 1000 10000

I /мм I /м*4

Рис.2 а) Временная зависимость диффузионного уширения для Н2-Сс в смеси глицерин/вода при 4.2 К. Диффузионная компонента выделялась из экспериментального контура провала в предположении о гауссовом контуре диффузионного ядра.

б) Временная зависимость диффузионного уширения в НгСс в сахарной матрице и в смеси глицерин/вода после исключения вклада от релаксационных процессов. Сплошные кривые - степенная зависимость ~ /»г01, 0 2 < а < 0.5

Существует альтернативный взгляд на низкотемпературную динамику в белках, в рамках которого СД является результатом перехода белка из одних конформационных состояний в другие, описываемого как диффузионный процесс в фазовом пространстве конформационных состояний. Экспериментальные данные были проанализированы также в рамках и этого подхода. Результаты обработки данных в рамках модели диффузионного движения показаны на Рис.2а.

Анализ в рамках модели диффузионного движения дает следующие результаты. Для белка с компактной структурой: а) диффузионное уширение имеет степенную зависимость б) наряду с

флуктуационными процессами, некоторый вклад в СД дают и релаксационные процессы. Этот вывод совпадает с результатом анализа в рамках модели ДУС, однако количественная интерпретация данных в модели диффузионного движения затруднена отсутствием описания релаксационных процессов в ней. Методом, позволяющим оценить вклад релаксационных процессов в СД, является измерение СД как функции времени старения {„ при фиксированном времени наблюдения Полученная таким образом временная зависимость эффекта старения СД может быть аппроксимирована функцией ф(/а) ~ /дЛ Р = 0.07. Нормировка зависимостей для различных времен старения на пропорциональный коэффициент позволяет исключить вклад релаксационных процессов в СД на заданном временном участке. «Экстрагированная» таким способом временная зависимость для флуктуационных процессов представлена на Рис.2б. Согласно модели диффузионного движения, в белке с компактной структурой степенная зависимость СД является следствием диффузионного характера конформационной динамики белка. Полученные в результате описанного выше анализа значения показателя степени для сахарной матрицы (0.23) и для смеси глицерин/вода (0.29) близки к теоретическому значению а = 0.25. В рамках модели диффузионного движения резкое возрастание СД для белка

в сахарной матрице связано с увеличением доступного фазового пространства (неоднородное уширение), см. формулу (2). Увеличение неоднородного уширения связано с „замораживанием" белка в более широком наборе конформационных состояний за счет повышения температуры стеклования растворителя. В рамках данной модели влияние матрицы рассматривается через изменение фазового пространства конформационных состояний белка. Как видно, модель диффузионного движения тоже способна описать многие существенные особенности СД в белках. К достоинствам модели можно отнести: а) отсутствие явных температурных ограничений на ее применимость; б) экспериментально наблюдаемая степенная временная зависимость СД в белках возникает в ней на основе достаточно общих предположений о форме корреляционной функции. Недостатками модели являются отсутствие описания неравновесной СД и, как и в случае модели ДУС, ее чисто феноменологический характер.

Как видно, каждая из рассмотренных моделей имеет свои сильные и слабые стороны и сделать окончательный выбор между ними на основании имеющихся данных пока невозможно.

Пункт 3.3. С помощью термических циклов можно изучать энергетические барьеры, разделяющие конформационные состояния в белках. Термоиндуцированная СД обусловлена ускорением релаксаций за счет повышения температуры. На Рис.За представлена зависимость термоиндуцированного уширения провала для белка в сахарной матрице. Для сравнения показано термоиндуцированное уширение провала в примесном стекле (сахарная матрица). Можно видеть, что в белке наблюдается резкое изменение скорости уширения в области имеющее ступенчатый

характер.

т/к т/к

Рис3 Термоиндуцированиое уширение провала в ходе термических циклов: а) в белке Н^-Сс в сахарной матрице (трехалоза) и в примесном стекле (сахарный леденец с примесью гематопорфирина (НР)). Толстая сплошная линия моделирует компоненту уширения, связанную с преодолением узкого потенциального барьера (см. текст); б) в белке НгСс в денатурированном (•), дейтерированном (+) и функциональном состоянии (□). В качестве матрицы использовалась смесь глицерин/вода.

Тонкие сплошные линии - аппроксимация данных линейной комбинацией ступенчатой и степенной функций.

На Рис.36 показано термоиндуцированное уширение провала в различных состояниях белка. "Ступенчатое" поведение сохраняется, указывая на существование конформационных состояний в самом белке, разделенных специфическим энергетическим барьером с маленькой дисперсией его высоты. Высота барьера примерно соответствует энергии водородных связей. Данные состояния, возможно, связаны с движением аминокислот, в котором участвуют водородные связи.

При Т > То термоиндуцированное уширение в белках имеет степенную зависимость А(01Г~То, где 1<а<3. „Гладкая" зависимость термоиндуцированного уширения провала от температуры вызвана широкой функцией распределения энергетических барьеров между конформационными состояниями в белке. Показатель степени а = 1.5 может быть получен с учетом активационного механизма преодоления барьеров между конформационными состояниями и функции распределения барьеров

[19]. Другой подход был предложен в работе [20], где было получено

следующее выражение для показателя степени - показатель

степени температурной зависимости теплоемкости обусловленной

вкладом от конформационных состояний.

Увеличение скорости термоиндуцированного уширения провала в белке в сахарной матрице по сравнению со смесью глицерин/вода коррелирует с увеличением термоиндуцированного уширения провала в соответствующих стеклах. Можно ожидать, что термоиндуцированная СД в белках также связана в основном с динамикой матрицы, однако изменение скорости термоиндуцированного уширения провала при денатурации (разрыв водородных связей) и дейтерировании (замена протонов на дейтроны) белка свидетельствует об участии его водородных связей в конформационной динамике.

В пункте 3.4 представлены результаты исследования формы диффузионно уширенного спектрального провала. Было обнаружено, что в дейтерированном белке наблюдается изменение формы провала в результате термического воздействия. Провал приобретает контур с более острым пиком и пологими крыльями, чем Лоренциан. Возможной причиной этих изменений может быть большая дисперсия величины диффузионного уширения для разных хромофоров в пространственно неоднородной стеклообразной матрице.

Пункт 3.5. В белках обнаружена фотореакция, характеризующаяся низкоэнергетическим барьером. Механизм данной фотореакции предположительно связан с туннелированием центральных атомов хромофора сквозь плоскость гем-группы. Обнаружен кинетический эффект старения, проявляющийся в том, что средняя скорость восстановления продукта в исходное состояние зависит от временного интервала между охлаждением образца и выжиганием провала Данный эффект, возможно, связан с релаксационными процессами в белке. 18

1

4?

В пункте 3.6 содержатся краткие выводы к главе.

Заключение содержит основные результаты работы:

• Исследована зависимость неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора в белке от свойств растворителя и структуры белка. Предложена простая модель неоднородного уширения, устанавливающая связь между структурным беспорядком в белке и величиной неоднородного уширения.

• Проведены исследования релаксационных процессов в белковых растворах, в ходе которых установлено существенное влияние низкотемпературной динамики стеклующейся матрицы на СД. В рамках имеющихся теоретических подходов обсуждены возможные механизмы влияния матрицы на характеристики СД в белках.

• В исследуемых белках обнаружены характерные низкоэнергетические барьеры, разделяющие конформационные состояния белка. Данные состояния, возможно, связаны с движениями аминокислот белка, в которых участвуют водородные связи.

• Обнаружено изменение формы спектрального провала в ходе термических циклов. Предложено качественное объяснение этого эффекта, учитывающее сильную неоднородность матрицы.

Публикации по теме диссертации

1. V.V. Ponkratov. J. Friedrich, J.M. Vanderkooi, Solvent Effect on Conformational Dynamics of Proteins: Cytochrome-c in a Dried Trehalose Film, J. Chem. Phys. 117,4594-4601 (2002)

2. J. Schlichter, V.V. Ponkratov. J. Friedrich, Structural Fluctuations and Aging Processes in Deeply Frozen Proteins, Fizika Nizkikh Temp. 29, 1049-1056 (2003)

3. V.V. Ponkratov. J. Friedrich, D. Markovic, H. Scheer, Spectral Diffusion Experiment with a Denatured Protein, J. Phys. Chem. B. 108,1109-114 (2004)

4. V.V. Ponkratov. J. Friedrich, J.M. Vanderkooi, A.L. Burin, Yu. A. Berlin, Physics of Proteins at Low Temperature, J. Low Temp. Phys. 137,289-317 (2004)

Литература

[1] H. Frauenfelder, F. Parak, R.D. Young, Ann. Rev. Biophys. Chem., v. 17, p.451 (1988)

[2] I.E.T. Iben, D. Braunstein, W. Doster, H. Frauenfelder, H.K. Hong, J.B. Johnson, S. Luck, P. Ormos, A. Schulte, P.J. Steinbach, A.H. Xie, R.D. Young, Phys. Rev. Lett., v.62, p.1916 (1989)

[3] G.P. Singh, H.J. Schink, H.v.Lohneysen, F. Parak, S. Hunklinger, Z. Phys.

5.v.55,p.23(1984)

[4] R.I. Personov in: Modern problems in condensed matter sciences, eds. V.M. Agronovich, A.A. Maradudin (North-Holland, Amsterdam, N. Y., Oxford), 1983

[5] J. Friedrich, D. Haarer in: Optical spectroscopy of glasses, ed. I. Zschokke-Granacher (Reidel, Dordrecht), 1986

[6] H. Maier, B.M. Kharlamov, D. Haarer in: Tunneling systems in amorphous and crystalline solids, ed. P. Esquinazi (Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-London-Paris-Tokio-Hong Kong-Barselona-Budapest), 1998

[7] P. Schellenberg, J. Friedrich in: Disorder effects on relaxation processes, eds. R. Richert, A. Blumen (Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, SpringerVerlag), 1994

[8] P.W. Fenimore, H. Frauenfelder, B.M. McMahon, F.G. Parak, PNAS, v.99, p. 16047(2002)

[9] P.W. Anderson, B.I. Halperin, CM. Warma, Phil. Mag., v.25, p.l (1972)

[10] W.A. Philips, J. LowTern. Phys., v.7, p.351 (1972)

[11] T.L. Reinecke, Sol. Stat. Comm., v.32, p.l 103 (1979)

[12] K. Fritsch, J. Friedrich, B.M. Kharlamov, J. Chem. Phys, v.105, p.1798 (1996)

[13] H. Maier, B.M. Kharlamov, D. Haarer, Phys. Rev. Lett., v.76, p.2085 (1996)

[14] J. Miiller, D. Haarer, O.V. Khodykin, B.M. Kharlamov, Physics Lett. A, v.255,p.331(1999)

[15] J.L. Skinner, J. Friedrich, J. Schlichter, J. Phys. Chem. A, v.103, p.2310 (1999)

[16] A.L. Burin, Yu. A. Berlin, A.Z. Patashinski, M.A. Ratner, J. Friedrich, Physica B, v.316-317, p.321 (2002)

[17] K. Fritsch, J. Friedrich, J. Vanderkooi, B.M. Kharlamov, Europhys. Lett., v.41,p.339(1998)

[18] A. Heuer, P. Neu, J. Chem. Phys., v.107, p.8686 (1997)

[19] W. Koehler, J. Friedrich, J. Chem. Phys, v.90, p.1270 (1989)

[20] J. Friedrich, DieAng. Makr. Chem., v.183 p. 115 (1990)

Благодарности

В заключение я хочу выразить благодарность своему научному руководителю Харламову Борису Михайловичу за постановку задачи, компетентные консультации и замечания к проведенным мною исследованиям, а также ценные методические советы, высказанные в процессе работы над диссертацией.

I would like to express my cordial gratitude to Prof. JosefFriedrich who introduced me to a fascinating world ofphysics ofbiological systems and gave me an opportunity to carry out the experimental work at his Chair (Lehrstuhl fur Physik, Weihenstephan TU Munchen in Freising (Germany)). I am grateful to him for his kindness to me as well for many fruitful discussions during my stay in his laboratory.

Автор благодарит коллег и друзей из Института спектроскопии РАН, в особенности, отдел молекулярной спектроскопии; и Кафедру Физики Технического университета в Мюнхене за всестороннюю поддержку и

Владимир Понкратов

Лицензия ЛР№ 071961 от 01.09.1999 г.

Подписано в печать 06.05.2005 г. Тираж 100 экз. Заказ N8 0518-6. Формат 60*84/16. Бумага офсетная.

Отпечатано в издательстве «Тровант». 142191 Московская обл. г. Троицк, микрорайон «В», д. 52.

Тел.334-09-67

* ¿ибл*зт«м j

11 ИЮЛ 2005

__^

1138

Введение.

Глава 1. Модели низкотемпературных релаксационных процессов в стеклах, полимерах и белках.

Модель двухуровневых систем (ДУС).

Модель диффузионного движения.

Одной из основных задач исследования белка является выявление связи между структурой, энергетическим ландшафтом, динамикой и его биологической функцией».

Г.Фрауенфельдер

В последние десятилетия интерес к биологическим объектам возрос не только в связи с развитием и потребностями медицины и биотехнологии, но и потому, что эти объекты обладают уникальными физическими и химическими свойствами. Физическая структура белков отличается от структуры классических объектов исследования физики конденсированных сред: кристаллов, жидкостей, стекол, и потому представляет специальный интерес для физических исследований.

Белки представляют собой биополимерные цепочки, состоящие из ограниченного набора аминокислот, последовательность которых задает первичную структуру белка. Число аминокислот в белках может насчитывать более сотни, а характерный размер и вес белков может варьировать в широких пределах. Одной из главных особенностей белков является компактная трехмерная структура, приобретаемая в процессе „схлопывания" биополимерной цепочки. Расположение атомов в такой структуре характеризуется упорядоченностью, которая может быть классифицирована как вторичная, третичная и четвертичная структура [1]. Одним из наглядных примеров вторичной структуры является спиралевидная форма белковой молекулы. Трехмерная атомная структура многих белков хорошо известна. Однако в масштабе меньше 0.2 А структура белка характеризуется беспорядком [2,3]. Упорядоченная структура белков ответственна за их биологическую функциональность, тем не менее, наличие беспорядка также имеет огромное значение и играет важную роль, к примеру, в процессе сворачивания биополимерной цепочки [4]. Именно такая специфичность: наличие порядка и беспорядка в белках выделяет их как отдельные объекты исследования, свойства которых лежат между кристаллическим и аморфным состоянием.

Изучение структуры биологических кристаллов выявило ряд особенностей, отличающих их от «обычных» кристаллов. Так, среднеквадратичное отклонение от равновесного положения <х2>, усредненное по одному и тому же классу атомов для разных аминокислот, сильно отличается [2,3]. С понижением температуры амплитуда колебаний <х2> уменьшается, однако даже при гелиевых температурах <х2> значительно больше величины, соответствующей квантовомеханическим колебаниям решетки. В пионерских работах по рентгеноструктурному анализу белковых кристаллов было высказано предположение, что при низких температурах среднеквадратичное отклонение <х2> определяется неупорядоченностью, вызванной существованием различных конформационных состояний белка [2,3]. Концепция конформационных состояний в белке также подтвердилась в кинетических исследованиях методом фотолиза [5]. Различные конформационные состояния отличаются друг от друга небольшой реорганизацией структуры белка за счет изменения взаимного расположения атомов. В каждом из таких состояний I белок способен выполнять биологическую функцию, скорость которой может варьировать. Конформационные состояния в белках образуют иерархическую структуру. Состояния, имеющие значительные структурные отличия, относят к уровню низкого (нулевого) порядка. К примеру, в СО - миоглобине такие состояния связаны с положением связи СО по отношению к плоскости гем - группы белка [6]. Число таких конформационных состояний невелико, конформеры разделены высокими энергетическими барьерами. Уровни высокого порядка характеризуются большим набором конформационных состояний, которые разделены более мелкими энергетическими барьерами [7]. На многомерной потенциальной поверхности (энергетический ландшафт) конформационные состояния белка образуют энергетические минимумы. Белок неотделимо связан с окружением, в котором он находится, поэтому энергетический ландшафт зависит не только от положения атомов в самом белке, но в него дает вклад и гидратационный слой, образованный за счет взаимодействия аминокислот белка с молекулами растворителя. Классификация конформационных состояний является важным шагом в понимании структуры энергетического ландшафта белка.

При физиологических температурах переходы между конформационными состояниями необходимы для протекания биологических процессов. По температурной зависимости среднеквадратичного отклонения <х2> можно анализировать конформационные движения в белке на временной шкале эксперимента. Методами мессбауэровской спектроскопии и нейтронного рассеяния был обнаружен динамический переход между гармоническим и л ангармоническим поведением <х > колебаний атомов белка [8,9] . Резкое возрастание <х > в области температуры Т«200 К связано с конформационным движением боковых групп в биополимерной цепочке и подвижностью молекул воды в гидратационном слое белковой молекулы. В исследованиях кинетических процессов в белках спектроскопическими методами при физиологических температурах была обнаружена широкая дисперсия скоростей релаксаций, характерная для стеклообразного состояния [10]. В ходе исследования фотоиндуцированных релаксационных процессов и релаксационных процессов, вызванных воздействием давления, в белках была обнаружена неэкспоненциальная временная зависимость конформационной динамики [11,12]. Детальные исследования релаксационных процессов в белках выявили также влияние свойств растворителя на динамику белка [13,14].

Понижение температуры приводит к замедлению релаксационных процессов в белках и „замораживанию" конформационной динамики. Такое „замораживание" релаксационных процессов служит весьма эффективным средством исследования сложных систем, каковыми являются белки, и широко используется в их изучении. Температурная зависимость релаксационных процессов в замороженных белках может быть, аналогично температурах белки также проявляют аномальные свойства, аналогичные свойствам стекол. Например, в кристалле миоглобина была обнаружена линейная зависимость теплоемкости от температуры [15]. В оптических спектрах белков было обнаружено явление спектральной диффузии, которое является также и одним из характерных свойств низкотемпературных примесных стекол.

Спектральная диффузия (СД) - это проявление в оптических спектрах примесей (хромофоров) процессов структурных релаксаций, идущих в стеклообразных матрицах. Эффективные исследования СД, а с нею и низкотемпературных релаксаций в стеклах, полимерах, а также и в биологических объектах, стали возможны в результате появления методов селективной спектроскопии, в первую очередь метода выжигания провалов [16-21]. Метод выжигания провалов в неоднородно уширенных спектрах поглощения хромофоров получил широкое распространение и интенсивно используется, в частности, для изучения явления спектральной диффузии в неупорядоченных и частично упорядоченных примесных молекулярных системах [22,23]. Он весьма эффективен при изучении медленных релаксационных процессов во временной шкале, покрывающей интервал от секунд до нескольких дней или недель.

СД, как и другие аномальные низкотемпературные свойства стекол, весьма успешно описывается моделью двухуровневых систем (ДУС) [24 - 26]. Но это описание, несмотря на его успешность, не является вполне стеклам, описана функцией

11]. При криогенных удовлетворительным по ряду причин. Во-первых, оно - чисто феноменологическое и ничего не говорит о микроскопической природе ДУС. Во-вторых, оно пригодно только для описания неупорядоченных систем при низких температурах (как правило, ниже 4 К). В этой связи интерес к созданию более общих теорий, описывающих поведение неупорядоченных систем в более широком диапазоне температур и учитывающих их микроскопическую структуру, сохраняется и реализуется время от времени в создании моделей, альтернативных модели ДУС. Одним из факторов, усложняющих создание теоретических моделей аморфных систем, является универсальность поведения стекол при низких температурах. Упрощая, можно сказать, что органические и неорганические стекла и полимеры при совершенно разной химической и даже физической структурах демонстрируют существенно схожие свойства, сильно отличающиеся от свойств кристаллов, как органических, так и неорганических.

В этом отношении белки являются интересным объектом, как бы находящимся между стеклами и кристаллами. С одной стороны, белок имеет хорошо определенную структуру, с другой стороны, в нем проявляются динамические свойства неупорядоченных систем. Наличие порядка в белках делает их отличными от низкотемпературных стекол. I

Можно ожидать, что исследование низкотемпературных релаксаций в белках, их сравнительный анализ по отношению к стеклам могут помочь понять связь между микроскопической структурой объекта и его низкотемпературными свойствами, как для белков, так и для стекол. Весьма важным свойством белков является также влияние растворителя на их низкотемпературную динамику [27-29]. Исследование этого влияния может помочь в понимании микроскопических механизмов низкотемпературных релаксаций в белках, находящихся во взаимодействии с матрицей. В этой связи была поставлена первая задача диссертации, а именно: исследование влияния матрицы на спектральную диффузию в белках при низких температурах и анализ данных в рамках известных моделей.

В настоящее время существует несколько альтернативных моделей СД. Их экспериментально проверяемые предсказания во многом совпадают, что затрудняет сравнение этих моделей. Одним из экспериментально проверяемых предсказаний является «форма диффузионного ядра», которая отличается в разных моделях. Исследование формы спектральных провалов может дать важную информацию как о механизмах взаимодействия хромофора с белком и растворителем, так и помочь в выборе адекватной модели. В этой связи была поставлена вторая задача диссертационной работы - исследование формы провала, уширенного за счет спектральной диффузии.

Очень важную информацию о структуре и конформационных превращениях в белке можно получить из исследований его энергетического ландшафта. Низкотемпературные данные, дающие наиболее важную информацию об этой структуре вблизи энергетического минимума, весьма скудны на сегодняшний день. Третьей' задачей диссертации было: исследование с помощью спектральной диффузии, индуцированной термическими циклами, энергетического ландшафта некоторых белков.

Исследование низкотемпературных флуктуационных и релаксационных процессов в белках позволяет глубже понять низкотемпературную динамику в биологических объектах и ее связь с энергетическим ландшафтом. Выбранное направление исследований определяет актуальность диссертационной работы.

Научная новизна работы

1. Установлено, что спектральная диффузия в твердых белковых растворах в значительной степени определяется релаксационными процессами в стеклообразной матрице. Обнаружена связь между температурой стеклования растворителя и пространственной структурой белка с одной стороны и характеристиками СД с другой стороны.

2. Обнаружена и интерпретирована корреляция между величиной неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора в белке и скоростью диффузионного уширения провала. Предложена модель неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора, отражающая структурное состояние белка.

3. В исследуемых белках экспериментально обнаружены специфические энергетические барьеры, предположительно связанные с участием водородных связей в движении аминокислот между конформационными состояниями.

4. Обнаружены изменения формы спектрального провала в ходе тепловых циклов. В качестве возможной причины наблюдаемого I эффекта предложена гипотеза, связывающая эти изменения с дисперсией скорости спектральной диффузии в образце.

Практическая значимость

• Обнаруженное влияние релаксационных процессов в стеклообразной матрице на спектральную диффузию в твердых белковых растворах существенно меняет представление о низкотемпературной динамике в белках.

• Установленная корреляция между спектральной диффузией и структурным состоянием белка дает важную информацию для построения более совершенной теории релаксационных процессов в белках и других неупорядоченных и частично упорядоченных системах.

• Характеристики обнаруженных в исследованных белках специфических энергетических барьеров являются исключительно важным источником информации при анализе структуры этих белков и конформационных движений в них.

Структура и краткое содержание работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка рисунков, таблиц, литературы и раздела благодарностей.

Заключение

Проведены исследования низкотемпературной динамики в белках Н2 - Сс и гп-Сс при гелиевых температурах. Основные результаты могут быть сформулированы следующим образом:

1. Обнаружена корреляция между шириной оптических спектров и степенью структурного беспорядка в глобулярных белках. Предложена простая модель, объясняющая связь неоднородного уширения ДУнеодн. со структурным беспорядком в белках.

2. Обнаружено влияние низкотемпературной динамики растворителя на СД в „замороженных" белковых растворах. Установлено, что значительный вклад в СД в денатурированном белке вносит низкотемпературная динамика стеклующейся матрицы.

3. Обнаружена нелогарифмическая зависимость СД в глобулярных белках в функциональном состоянии. Возникновение степенной зависимости СД рассмотрено в рамках двух моделей: модели диффузионного движения и модели ДУС. В рамках диффузионной модели степенная зависимость СД связана с диффузионным характером низкотемпературных релаксаций в белке. В рамках модели ДУС степенная зависимость является следствием релаксаций ДУС с нестандартной функцией распределения по параметру туннелирования.

4. В исследуемых белках обнаружены характерные низкоэнергетические барьеры, разделяющие конформационные состояния белка. Данные состояния, возможно, связаны с движениями аминокислот белка, в которых участвуют водородные связи.

5. Обнаружено изменение формы провала в ходе термических циклов. Наблюдаемые изменения, предположительно, связаны с дисперсией диффузионных ширин линий хромофоров.

6. В белках наблюдаются сложные фотореакции. Обнаружены низкоэнергетические фотопродукты, предположительно связанные с туннелированием центральных атомов сквозь плоскость гем-группы белка. Обнаружен кинетический эффект старения, возможно, связанный с релаксационными процессами в белке.

1. С. A. Mathews, К.Е. van Holde, K.G. Ahem I I Biochemistry, an Imprint of Addison Wesley Longman, Inc. (2000)

2. H. Frauenfelder, G.A. Petsko, D. Tsernoglou // Nature, v.280, p.558 (1979)

3. H. Hartmann, F. Parak, W. Steigemann, G.A. Petsko, D. Ringe Ponzi, H, Frauenfelder// Proc. Nat. Acad. Sei. USA, v.79, p.4967 (1982)

4. K.A. Dill, H.S. Chan // Nat. Struct. Biol., v.4, p.10 (1997)

5. H. Frauenfelder, F. Parak, R. Young // Ann. Rev. Biophys. Chem., v. 17, p.451 (1988)

6. H. Frauenfelder, S.G. Sligar, P.G. Wolynes // Science, v.254, p. 1598 (1991)

7. H. Frauenfelder//Nat. Struct. Biol., v.2, p.821 (1995)

8. W. Doster, S. Cusack, W. Petry // Nature, v.337, p.754 (1989)

9. F. Parak, E.W. Knapp, D. Kuscheida // J. Mol. Biol., v.161, p. 177 (1982)

10. A. Ansari, J. Berendzen, S.F. Bowne, H. Frauenfelder, I.O.T. Iben, T.S. Sauke, E. Shyamsunder, R. Young // PNAS, v.82, p.5000 (1985)

11. I.E.T. Iben, D. Brauenstein, W. Doster, H. Frauenfelder, M.K. Hong, J.B. Johnson, S. Luck, P. Ormos, A. Schulte, P J. Steinbach, A.H. Xie, R.D. Young // Pys. Rev. Lett., v.62, p.1916 (1989)

12. M. Lim, T.A. Jackson, P.A. Anfmrud//PNAS, v.90, p.5801 (1993)

13. P.W. Fenimore, H. Frauenfelder, B.H. McMahon, F.G. Parak// PNAS, v.99, p. 16047 (2002)

14. D. Vitkup, D. Ringe, G.A. Petsko, M. Karplus // Nat. Stuct. Biol., v.7, p.34 (2000)

15. G.P. Singh, H.J. Schink, H.v. Löhneysen, F. Parak, S. Hunklinger // Z. Phys. B, v.55, p.23 (1984)

16. R.I. Personov, in Spectroscopy and Excitation Dynamics of Condensed Molecule Systems, Eds. V.M. Agranovich, R.M. Hochstrasser, Amsterdam, North Holland (1983)

17. J. Freidrich, D. Haarer, in Optical Spectroscopy of Glasses, Ed. Zschokker, D. Reidel Publishing Company (1986)

18. H. Maier, B.M. Kharlamov, D. Haarer, in Tunneling Systems in Amorphous and Crystalline Solids, Ed. P. Esquinazi, Springer (1998)

19. R. Jankowiak, J.M. Hayes, G.J. Small // Chem. Rev., v.93, p. 1471 (1993)

20. P. Schellenberg, J. Friedrich, in Disorder effects on relaxation processes, eds.: R. Richert, A. Blumen, Springer, Berlin (1994)

21. J. Friedrich, W. Köhler, in Dynamical Processes in Condenced Matter Systems, Eds. J. Klafter, J. Jortner, A. Blumen, (1989)

22. J. Schlichter, J. Friedrich, M. Parbel, H. Scheer // Pho. Sei. News, v. 100, p. 100 (2001)

23. B.M. Kharlamov // Phot. Sei. News, v.100, p.l 11 (2001)

24. P.W. Anderson, B.I. Halperin, C.M. Varma// Philos. Mag., v.25, p.l, (1972)

25. W.A. Phillips // J. Low Temp. Phys. v.7, p.351 (1972)

26. T.L. Reinecke // Sol. Stat. Comm., v.32, p.l 103 (1979)

27. J. Schlichter, J. Friedrich, L. Herenyi, J. Fidy // Biophys. J., v.80, p.2011 (2001)

28. J. Schlichter, J. Freidrich, M. Parbel, H. Scheer // J. Chem. Phys., v. 114, p.9638 (2001)

29. J. Schlichter, J. Friedrich, L. Herenyi, J. Fidy // J. Phys. Chem. B, v. 106, p.3510 (2002)

30. R.C. Zeller, R.O. Pohl // Phys. Rev. B, v.4, p.2029 (1971)

31. B. Golding, M.v. Schickfus, S. Hunklinger, K. Dransfeld // Phys. Rev. Lett., v.43, p.1817 (1979)

32. H. Maier, R. Wunderlich, D. Haarer, B.M. Kharlamov, S.G. Kulikov // Phys. Rev. Lett., v.74, p.5252 (1995)

33. R. Wunderlich, H. Maier, D. Haarer, B.M. Kharlamov // J. Phys. Chem.B, v.102, p.10150 (1998)

34. A. Nittke, S. Sahling, P. Esquinazi, in Tunneling Systems in Amorphous and Crystalline Solids, Ed. P. Esquinazi, Springer (1998)

35. J. Zimmermann, G. Weber // Phys. Rev. Lett., v.46, p.661 (1981)

36. K. Fritsch, J. Friedrich, B.M. Kharlamov // J. Chem. Phys., v. 105, p. 1798 (1996)

37. H. Maier, B.M. Kharlamov, D. Haarer // Phys. Rev. Lett., v.76, p.2085 (1996)

38. A.L. Burin, Yu. Kagan//JETP, v.80, p. 761 (1995)

39. P. Neu, D.R. Reichman, R.J. Silbey// Phys. Rev. B, v.56, p.5250 (1997)

40. A. Heuer, P. Neu // J. Chem. Phys., v. 107, p.8686 (1997)

41. B.M. Kharlamov, J. Mueller, O.V. Khodykin, D. Haarer // J. Luminescence, v.86, p.235 (2000)

42. B.M. Kharlamov // J. Luminescence, v.94-95, p.695 (2001)

43. J. Müller, D. Haarer, B.M. Kharlamov // Physics Letters A, v.281, p.64 (2001)

44. B.M. Kharlamov, G. Zumofen // J. Chem. Phys. v.l 16, p.5107 (2002)

45. J.L. Skinner, J. Friedrich, J. Schlichter // J. Phys. Chem. A, v.103, p.2310 (1999)

46. A.L. Burin, Yu.A. Berlin, A.Z. Patashinski, M.A. Ramer, J. Friedrich // PhysicaB, v.316-317, p.321 (2002)

47. R. Zwanzig // Proc. Nat. Acad. Sei. USA, v.85, p.2029 (1988)

48. R.G. Palmer, D.L. Stein, E. Abrahams, P.W. Anderson // Phys. Rev. Lett., v.53, p.958 (1984)

49. V. Finkelstein, O.V. Galzitskaya // Phys. Life Rev., v.l, p.23 (2004)

50. A. Ansari, C.M. Jones, E.R. Henry, J. Hofrichter, W.A. Eaton // Biochem., v.33,p.5128 (1994)

51. G.M. Sastry, N. Agmon // Biochemstry, v. 36, p.7097 (1997)

52. J. Friedrich, D. Haarer // Angew. Chem. Int. Ed. Engl., v.23, p.l 13 (1984)

53. R.I. Personov, B.M. Kharlamov // Laser Chemistry, v.6, p. 181 (1986)

54. I.S. Osad'ko, In Spectroscopy and excitation dynamics of condensed molecular systems, Eds. V.M. Agranovich, R.M. Hochstrasses, Amsterdam, North Holland (1983)

55. I.S. Osad'ko // Phys. Rep, v.206, p.45 (1991)

56. B.M. Kharlamov, R.I. Personov, L.A. Bykovskaya // Optics Communications, v. 12, p. 191 (1974)

57. A.A. Gorokhovskii, R.K. Kaarli, L.A. Rebane // JETP Lett, v.20, p.216 (1974)

58. Persistent spectral hole-burning: Science and application, Ed. W.E. Moerner, v.44, Springer, Berlin (1988)

59. S. Völker // Ann. Rev. Phys. Chem, v.40, p.499 (1989)

60. O.N. Korotaev, R.I. Personov // Оптика и спектроскопия, v.32, p.900 (1972)

61. K.H. Соловьев И.Е. Залесский, B.H. Котло, С.Ф. Шкирман // Письма в ЖЭТФ, т.17, с.463 (1973)

62. S. Völker, J.H. Van der Waals // Mol. Phys. v.32, p.1703 (1976)

63. J. Fidy, J.M. Vanderkooi, J. Zollfrank, J. Friedrich // Biophys. J, v.61, p.381 (1992)

64. L. Herenyi, J. Fidy, J. Gafert, J. Friedrich // Biophys, J, v.69, p.577 (1995)

65. W. Köhler, W. Breinl, J. Friedrich // J. Phys. Chem. v.89, p.2473 (1985)i

66. H. de Vries, D.A. Wiersma // J. Chem. Phys. v.72, p.1851 (1980)

67. L.R. Narasimhan, K.A. Littau, D.W. Pack, Y.S. Bai, A. Elschner, M.D. Fayer // Chem. Rev, v.90, p.439 (1990)

68. Yu. Vainer, M.A. Kol'chenko, A.V. Naumov, R.I. Personov, S.J. Y.Zilker // J. Luminescence, v.86, p.265 (2000)

69. K. Fritsch, J. Friedrich // Physica D, v.107, p.218 (1997)

70. G.W. Bushneil, G.V. Louie G. D. Brayer//J. Mol. Biol, v.214, p.585 (1990)

71. J. Pahapill, L. Rebane // Chem. Phys. Lett, v.158, p.283 (1989)

72. J.H. Crowe, L.M. Crowe, D. Champan // Science, v.223, p.701 (1984)

73. C. Branca, S. Magatu, G. Maisano, F. Migliardo, P. Migliardo, G. Romeo // J. Phys. Chem. B, v. 105, p.10140 (2001)

74. C. Branca, S. Magazu, G. Maisano, P. Migliardo // J. Chem. Phys., v.Ill, p.281 (1999)

75. T. Chen, A. Fowler, M. Toner // Cryobiol., v.40, p.277 (2000)

76. W.W. Wright, J.C. Baez, J.M. Vanderkooi // Anal. Biochem., v.307, p. 167 (2002)

77. E.S. Manas, W.W. Wright, K.A. Sharp, J. Friedrich, J. Vanderkooi // J. Phys. Chem. B, v. 104, p.6932 (2000)

78. A.D. Kaposi, W.W. Wright, J.M. Vanderkooi // J. Fluorescence, v. 13, p.59 (2003)

79. D. Thom-Leeson, O. Berg, D.A. Wiersma // J. Phys. Chem., v.98, p.3913 (1994)

80. G. Cottone, G. Ciccotti, L. Cordone //J. Chem. Phys., v.l 17, p.9862 (2002)

81. L. Cordone, P. Galajda, E. Vitrano, A. Gassmann, A. Ostermann, F. Parak // Eur. Biophys. J. v.27, p.173 (1998)

82. L. Cordone, M. Ferrand, E. Vitrano, G. Zaccaai // Biophys. J., v.76, p. 1043 (1999)

83. K. Shamagl, private communication

84. B. Zelent, A.D. Kaposi, N.V. Nucci, K.A. Sharp, S.D. Dalosto, W.W. Wright, J.M. Vanderkooi // J. Phys. Chem. B, v.108, p.10317 (2004)

85. S.Yeh, D.L. Rousseau // J. Biol. Chem., v.274, p.17853 (1999)

86. N.V. Prabhu, S.D. Dalosto, K.A. Sharp, W.W. Wright, J.M. Vanderkooi // J. Phys. Chem. B, v. 106, p.5561 (2002)

87. S.J. Hagen, J. Hofrichter, W.A. Eaton // J. Phys. Chem., v.100, p.12008 (1996)

88. F. Librizzi, C. Viappiani, S. Abbruzzetti, L. Cordone // J. Chem. Phys., v.l 16, p. 1193 (2002)

89. V.V. Ponkratov, J. Friedrich, J.M. Vanderkooi, Solvent effect on Conformational Dynamics of Proteins: Cytochrome-c in a Dried Trehalose Film, J.Chem. Phys., v.l 17, p.4594 (2002)

90. J. Schlichter, V.V. Ponkratov, J. Friedrich, Structural Fluctuations and Aging Processes in Deeply Frozen Proteins, Fizika Nizkih Temp., v.29, p. 1054 (2003)

91. V.V. Ponkratov, J. Friedrich, D. Markovic, H. Scheer, J. Vanderkooi, Spectral Diffusion Experiment with a Denatured Protein, J. Phys. Chem. B, v.108, p.l 109 (2004)

92. V.V. Ponkratov, J. Friedrich, J.M. Vanderkooi, Yu. A. Berlin, A.L. Burin, Physics of Proteins at Low Temperature, J. Low Temp. Phys, v. 13 7, p.289 (2004)

93. H. Keller, P.G. Debrunner // Phys. Rev. Lett., v.45, p.68 (1980)

94. G.P. Singh, F. Parak, S. Hunklinger, K. Dransfeld // Phys. Rev. Lett., v.47, p.685 (1981)

95. M.Tarek, D.J. Tobias // Phys. Rev. Lett., v.88, p.138101-1 (2002)

96. I.S. Yang, A.C. Anderson // Phys. Rev. B, v.34, p.2942 (1986)

97. J. Müller, H. Maier, G. Harming, O.V. Khodykin, D. Haarer, B.M. Kharlamov// J. Chem. Phys., v.l 13, p.876 (2000)

98. B.M. Kharlamov // J. Luminescence, v.86, p.225 (2000)

99. K. Fritsch, A. Eicker, J. Friedrich, B.M. Kharlamov, J.M. Vanderkooi // Europhys. Lett., v.41, p.339 (1998)

100. J. Zollfrank, J. Friedrich, J. Vanderkooi, J. Fidy // J. Chem. Phys., v.95, p.3143 (1991)

101. Y.S. Bai, K.A. Littau, M.D. Fayer // Chem. Phys. Lett., v.162, p.449 (1989)

102. Б. M. Харламов, Д. Xaapep, С. Ян // Оптика и спектроскопия, т.76, с.337 (1994)

103. О.В. Ходыкин, Н.И. Улицкий, Б.М. Харламов // Оптика и спектроскопия, т.80, с.489 (1996)

104. W. Köhler, J. Zollfrank, J. Friedrich // Phys. Rev. В, v.39, p.5414 (1989)

105. D.Thom-Leeson, D.A. Wiersma, K. Fritsch, J. Friedrich // J. Phys. Chem. B, v.101, p.6331 (1997)

106. J. Gafert, H. Pschierer, J. Friedrich // Phys. Rev. Lett., v.74, p.3704 (1995)

107. J. Friedrich // Angew. Makr. Chem., v.183, p.l 15 (1990)

108. T. Reinot, G.J. Small // J. Chem. Phys., v.l 14, p.9105 (2001)

109. D.W. Pack, L.R. Narasimhan, M.D. Fayer // J. Chem. Phys., v.92, p.4125 (1990)

110. A.V. Naumov, Y.G. Vainer// J. Phys. Chem. B, v.107, p.2054 (2003)

111. Ю.Г. Вайнер, A.B. Наумов // Оптика и Спектроскопия, опубликована в ближайшем номере

112. Y. Shibata, А. Kurita, Т. Kushida // J. Chem. Phys., v.104, p.4396 (1996)

113. W. Breinl, J. Friedrich, D. Haarer// Chem. Phys. Lett., v.106, p.487 (1984)

114. L. Kümmerl, H. Kliesch, D. Wöhrle, D. Haarer // Chem. Phys. Lett., v.227, p.337 (1994)

115. P. Schelenberg // Диссертация, Universität Bayreuth (1994)

116. W. Köhler, J. Friedrich // Phys. Rev. Lett., v.59, p.2199 (1987)

117. W. Koehler, J. Friedrich, H. Scheer // Phys. Rev. A, v.37, p.660 (1988)

118. L. Herenyi, J. Fidy, J. Gafert, J. Friedrich // Biophys. J., v.69, p.577-582 (1995)1. Благодарности

119. Автор благодарит коллег и друзей из Интститута спектроскопии РАН, в особенности, отдел молекулярной спектроскопии; и Кафедру Физики Технического университета в Мюнхене за всестороннюю поддержку и проявленный интерес к проделанной работе.

120. Троицк, Москва, Фрайзинг Владимир Понкратов2000-2005)